CN114807076B - 白藜芦醇-3-糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白藜芦醇‑3‑糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用。所述白藜芦醇‑3‑糖基转移酶包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。本发明还构建了一个用于筛选白藜芦醇糖基转移酶的酵母底盘细胞，并以此为宿主，能直接验证糖基转移酶的功能。本发明提供的白藜芦醇‑3‑糖基转移酶能够用于虎杖苷的合成，为工业化大规模发酵生产或酶转化方法生产虎杖苷奠定基础。

Description

白藜芦醇-3-糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及白藜芦醇-3-糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用。

背景技术

虎杖苷(3-糖基白藜芦醇)(结构如下所示)是传统中草药虎杖有效成分，被广泛用于治疗心血管疾病和癌症。白藜芦醇的3位糖基化是虎杖苷的主要结构特点。在植物天然产物的生物合成过程中，糖基化是糖基转移酶(glycosyltransferase)通过催化糖基从供体分子如UDP-葡萄糖、UDP-木糖、UDP-鼠李糖、UDP-葡萄糖醛酸转移到受体分子的过程，从而形成各种具有生物活性的糖苷类化合物。这一类酶具有较广的底物谱。

虎杖苷主要是从廖科植物虎杖(Polygonum cuspidatum)的根茎提取获得，但是虎杖植株的生长极易受气候、地理环境和虫害的影响。近年来，随着生物技术的不断进步，合成生物学的快速发展有效的解决了植物提取法面临的困难。微生物合成法不仅具有操作简便、自然资源破坏少的优点，并且能克服化学合成法存在的环境污染问题。但是，目前尚无虎杖来源的白藜芦醇-3-糖基转移酶(Resveratrol-3-glycosyltransferase,R3GAT)的相关报道，因此本领域迫切需要筛选到相应的R3GAT并开发一种生物法合成虎杖苷的方法。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供了一种白藜芦醇-3-糖基转移酶及其编码基因与应用。

本发明另一个目的是提供一种底盘细胞及其制备方法以及利用此底盘细胞筛选白藜芦醇-3-糖基转移酶的方法。

本发明再一目的是提供一种生产虎杖苷的底盘细胞。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明的第一方面，提供一种具有催化白藜芦醇3-羟基糖基化活性的蛋白质，其包括：

(a)具有如SEQ ID NO.1、2、3所示任一氨基酸序列的蛋白；或

(b)含有(a)的融合蛋白；或

(c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；或

(d)将SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的，并具有催化白藜芦醇3-羟基糖基化活性的衍生蛋白；或

(e)与(a)-(d)任一项所述的蛋白同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，并具有催化白藜芦醇3-羟基糖基化活性的衍生蛋白。

在另一优选实施方案中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列(包括His标签、GST标签、可溶性标签等)、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

本发明的第二方面，提供一种编码上述蛋白质的基因。

优选地，上述基因包括：

(a)具有如SEQ ID NO.4、5、6任一所示核苷酸序列；或

(b)翻译后可以生成如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的核苷酸序列；或

(c)在SEQ ID NO.4、5、6所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列，且编码具有催化白藜芦醇3-羟基糖基化活性的蛋白质的DNA分子；或

(d)与(a)或(b)或(c)限定的DNA序列具有90％、95％、98％、99％以上同源性，且编码具有催化白藜芦醇-3-位羟基化活性的蛋白质的DNA分子；或

(e)在严格条件下与(a)或(b)或(c)或(d)限定的DNA序列杂交且编码具有催化白藜芦醇3-羟基化活性的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明第三方面，提供一种含有上述基因的重组表达载体或表达盒。

本发明中，所述重组表达载体包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。适用于本发明的载体包括但不限于：穿梭质粒载体；在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体等。只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。优选质粒载体，如穿梭质粒载体。

本发明第四方面，提供一种宿主细胞，其包括一种、两种或两种以上编码上述蛋白质的多核苷酸的重组载体或表达盒。

在本发明中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选的实例包括酵母。

本发明第五方面，提供上述蛋白质作为白藜芦醇-3-糖基转移酶的应用。

本发明第六方面，提供上述蛋白质、含有上述基因的重组表达载体、含有上述基因的表达盒、含有上述基因的宿主细胞在催化芪类化合物的合成中的应用；优选地，所述芪类化合物为虎杖苷。

本发明第七方面，提供一种底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产UDP-葡萄糖能力的基因。

优选地，所述底盘细胞是用于生产UDP-葡萄糖的真核菌株，能同时表达PGM1、PGM2和UGP1。

优选地，所述底盘细胞是在该真核菌株的基因组中整合表达PGM1、PGM2和UGP1；该整合为整合在该真核菌株的基因组的多拷贝位点。

在本发明中，所述PGM1为磷酸葡萄糖变位酶1，参与糖原合成途径，将葡萄糖-6-磷酸转变为葡萄糖-1-磷酸。

在本发明中，所述PGM2为α-磷酸葡萄糖变位酶，是PGM1的同工酶。

在本发明中，所述UGP1为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，催化葡萄糖-1-磷酸与UTP反应，形成UDP-葡萄糖。

在本发明中，所述表达PGM1的基因、所述表达PGM2的基因、所述表达UGP1的基因既可以是野生型的也可以是变异的，只要其表达产物保留该酶的活性即可。

优选地，本发明提供的真核菌株中，该真核菌株为酵母菌。在本发明的一些实施例中，该真核菌株为酿酒酵母。在本发明的另外一些实施例中，为酿酒酵母W303-1B。

优选地，本发明提供的真核菌株中，该多拷贝位点为YORWΔ17位点。

在本发明的一些实施方案中，本发明提供的真核菌株中，表达PGM1的基因是参考Genbank ID:853732报道的序列信息，经过密码子优化获得。

在本发明的另一些实施方案中，该表达PGM1的基因具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，本发明提供的真核菌株中，表达PGM2的基因是参考Genbank ID:855131报道的序列信息，经过密码子优化获得。

在本发明的另一些实施方案中，该表达PGM2的基因具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，本发明提供的真核菌株中，表达UGP1的基因是参考Genbank ID:853830报道的序列信息，经过密码子优化获得。

在本发明的另一些实施方案中，该表达UGP1的基因具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

优选地，本发明提供的真核菌株中，上述PGM1、PGM2、UGP1基因以表达盒的形式整合到基因组中，表达盒包括基因、启动子、终止子；所述启动子选自：pTEF1、pTPI1、pHXT7、pPGK1、pPYK1、pTPII、pGPM1、pADH1、pTDH3、pTEF2；所述终止子选自：tTDH2、tENO2、tPGT1、tCPS1、tIDP1、tPRM5、tHIS5、tFBA1、tPDC1、tRPS2。

进一步优选地，本发明提供的真核菌株中，利用Gibson组装方法将表达PGM1的基因和表达PGM2的基因构建到T3载体，PGM1和PGM2分别在启动子pADH1、pTDH3和终止子tFBA1、tPDC1的控制下，表达UGP1的基因构建到T4载体，UGP1在启动子pTEF2和终止子tRPS2的控制下。T3和T4载体两端分别带有同源臂L3和L4，L4和L5；用引物L3-F/L4-R，L4-F/L5-R分别扩增L3-T3-L4(包含PGM1和PGM2基因)、L4-T4-L5(包含UGP1基因)，选用酿酒酵母YORWΔ17作为整合位点，并用His标签作为筛选标记，筛选标记模块和整合同源臂模块也被扩增(Y17site1-His-L3，L5-Y17site2)，利用常规转化方法将L3-T3-L4，L4-T4-L5，Y17site1-His-L3，L5-Y17site2片段转化入酿酒酵母宿主菌W303-1B中的YORWΔ17位点，产生工程菌株PC1。

第八方面，提供一种底盘细胞，是在第七方面的底盘细胞的基础上还含有提高所述底盘细胞生产白藜芦醇能力的基因。

优选地，所述底盘细胞能同时表达AtPAL2、AtC4H、At4CL2和VvVST1。

优选地，所述底盘细胞是在该真核菌株的基因组中整合表达AtPAL2、AtC4H、At4CL2和VvVST1；该整合为整合在该真核菌株的基因组的多拷贝位点。

在本发明中，所述AtPAL2为来源于拟南芥的苯丙氨酸解氨酶，参与苯丙烷代谢途径，催化苯丙氨酸形成反式肉桂酸。

在本发明中，所述AtC4H为来源于拟南芥的肉桂酸4-羟化酶，催化反式肉桂酸形成4-香豆酸。

在本发明中，所述At4CL2为来源于拟南芥的4-香豆酸辅酶A连接酶，催化4-香豆酸形成对香豆酰辅酶A。

在本发明中，所述VvVST1为来源于葡萄的白藜芦醇合酶，催化1分子对香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A合成白藜芦醇。

在本发明中，所述表达AtPAL2的基因、所述表达AtC4H的基因、所述表达At4CL2的基因、所述表达VvVST1的基因既可以是野生型的也可以是变异的，只要其表达产物保留该酶的活性即可。

优选地，本发明提供的真核菌株中，所述多拷贝位点为YORWΔ15位点。

在本发明的一些实施方案中，所述表达AtPAL2的基因具有如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述表达AtC4H的基因具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述表达At4CL2的基因具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述表达VvVST1的基因具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。

优选地，本发明提供的真核菌株中，上述AtPAL2、AtC4H、At4CL2、VvVST1基因以表达盒的形式整合到基因组中，表达盒包括基因、启动子、终止子；所述启动子选自：pTEF1、pTPI1、pHXT7、pPGK1、pPYK1、pTPII、pGPM1、pADH1、pTDH3、pTEF2；所述终止子选自：tTDH2、tENO2、tPGT1、tCPS1、tIDP1、tPRM5、tHIS5、tFBA1、tPDC1、tRPS2、tTPI1、tPGI、tCYC1、tADH1。

进一步优选地，在本发明第八方面产生的工程菌株PC1中，利用Gibson组装方法将表达AtPAL2的基因和表达AtC4H的基因构建到T1载体，AtPAL2和AtC4H分别在启动子pTEF1、pPGK和终止子tTPI1、tPGI的控制下，表达At4CL2的基因和表达VvVST1的基因构建到T2载体，At4CL2和VvVST1分别在启动子pPGK、pTEF1和终止子tCYC1、tADH1的控制下；T1和T2载体两端分别带有同源臂L1和L2，L2和L3；用引物L1-F/L2-R，L2-F/L3-R分别扩增L1-T1-L2(包含AtPAL2和AtC4H基因)，L2-T2-L3(包含VvVST1和At4CL2基因)，选用酿酒酵母YORWΔ15作为整合位点，并用Leu标签作为筛选标记，筛选标记模块和整合同源臂模块也被扩增(Y15site1-Leu-L1，L3-Y15site2)，利用常规转化方法将L1-T1-L2，L2-T2-L3，Y15site1-Leu-L1，L3-Y15site2片段转化入工程菌株PC1中的YORWΔ15位点，产生工程菌株PC2。

本发明第九方面，提供上述底盘细胞在筛选白藜芦醇-3-糖基转移酶中的应用，所述应用中，基于上述底盘细胞直接验证白藜芦醇-3-糖基转移酶的方法，包含如下步骤：

(1)将含有待验证功能的基因的重组表达载体转化到上述只含有提高所述底盘细胞生产UDP-葡萄糖能力的基因的底盘细胞；

(2)以外源白藜芦醇为底物，将步骤(1)获得的重组底盘进行发酵培养；

(3)发酵结束后，反应产物进行HPLC-MS鉴定，能够产虎杖苷的酶即为白藜芦醇-3-糖基转移酶；

或者，

(1)将含有待验证功能的基因的重组表达载体转化到上述同时含有提高所述底盘细胞生产UDP-葡萄糖能力的基因和提高所述底盘细胞生产白藜芦醇能力的基因的底盘细胞；

(2)将步骤(1)获得的重组底盘进行发酵培养；

(3)发酵结束后，反应产物进行HPLC-MS鉴定，能够产虎杖苷的酶即为白藜芦醇-3-糖基转移酶。

优选地，所述底盘细胞为PC1或PC2。

本发明第十方面，一种合成虎杖苷的方法，其包括以下步骤：采用本发明所述的白藜芦醇-3-糖基转移酶进行催化的步骤。

在本发明的一些实施方案中，所述生产虎杖苷的方法，包含如下步骤：

(1)将一种、两种或更多种含有白藜芦醇-3-糖基转移酶的基因的重组表达载体转化到上述只含有提高所述底盘细胞生产UDP-葡萄糖能力的基因的底盘细胞；

(2)以外源白藜芦醇为底物，将步骤(1)获得的重组底盘进行发酵培养；

(3)发酵结束后，分离、收集虎杖苷即得；

或者，

(1)将一种、两种或更多种含有白藜芦醇-3-糖基转移酶的基因的重组表达载体转化到上述同时含有提高所述底盘细胞生产UDP-葡萄糖能力的基因和提高所述底盘细胞生产白藜芦醇能力的基因的底盘细胞；

(2)将步骤(1)获得的重组底盘进行发酵培养；

(3)发酵结束后，分离、收集虎杖苷即得。

优选地，所述白藜芦醇-3-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步优选地，所述底盘细胞为PC1或PC2。

本发明的有益效果：

本发明构建的底盘细胞能实现直接在酵母体内验证糖基转移酶的功能，为芪类化合物糖基转移酶的筛选奠定了基础。由此筛选到了三种白藜芦醇-3-糖基转移酶(R3GAT)，具有良好的催化合成虎杖苷的活性。目前，本发明已成功在摇瓶中生产虎杖苷，产量达70mg/L，为工业化大规模发酵生产或酶转化方法生产糖基化白藜芦醇奠定了基础。

附图说明

图1为重组质粒Y33-RGAT的质粒图谱示意图。

图2为重组质粒T3-PGM1+PGM2的质粒图谱示意图。

图3为虎杖来源的糖基转移酶在UDP-葡萄糖底盘的宿主催化以白藜芦醇为底物合成虎杖苷的HPLC-MS分析图。

图4为酿酒酵母工程菌株从葡萄糖合成虎杖苷的HPLC分析图。

图5为白藜芦醇为底物在白藜芦醇-3-糖基转移酶的作用下生成虎杖苷的示意图。

具体实施方式

本发明公开了一种白藜芦醇-3-糖基转移酶，构建的底盘细胞能实现直接在酵母体内验证糖基转移酶的功能，及利用白藜芦醇-3-糖基转移酶及本发明构建的底盘细胞制备虎杖苷的方法。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该糖基转移酶及重组菌株，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

定义与说明：

本文所用的术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

本文所用的术语“融合蛋白”为将所述蛋白与蛋白标签融合得到的蛋白质。蛋白标签可位于蛋白的N端，也可位于蛋白的C端。蛋白和蛋白标签之间还可以具有间隔氨基酸残基，具体可具有10个以下间隔氨基酸残基。

本文所用的术语“重组表达载体”包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。适用于本发明的载体包括但不限于：穿梭质粒载体；在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体等。只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。优选质粒载体，如穿梭质粒载体。

本文中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的具有白藜芦醇-3-糖基转移酶活性的多肽、编码多肽的多核苷酸或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组微生物”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。例如，适用于本发明的宿主细胞包括但不限于埃希氏菌属、棒杆菌属，优选大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，更具体的是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067。

本文中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

如本文所用，术语“底盘细胞”“宿主细胞”“工程细胞”可以互换使用，指合成生物学中一种可搭配不同的功能模块从而生产所需产品或实现所需功能的宿主细胞。这种细胞可以是天然来源的生物细胞，也可以是在天然来源的生物细胞基础上经过了一定改良操作得到的细胞，如基因元件的增减和优化。

本文的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

有关宿主细胞表达可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液，可通过凝胶电泳技术进行鉴定。

本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

本文所用的选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

本文所用的术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。

本文所用的术语“自然状态”是指微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对序列1、2或3所示氨基酸序列进行突变，并检测突变体的相关活性。此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology ofThe Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

因此，对本发明的白藜芦醇-3-糖基转移酶作进一步突变而得到仍具备相应功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。因此，本发明应包括在本发明基础上得到的保守性突变。

术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。

如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。

如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于序列2所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在序列1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于序列2所示氨基酸序列的第40位就可能是第46位。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例所用培养基、储存液：

LB培养基：称取5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，加单蒸水定容至1L，121℃灭菌20min，固体LB培养基另加15g琼脂粉。

完全极限省却成分(CM)液体培养基：6.7g YNB w/o AA，0.83g Dropout powder，其他营养成分(0.05g腺嘌呤，0.05g尿嘧啶，0.1g组氨酸，0.1g亮氨酸，0.1g色氨酸)根据实验所需省去相应的氨基酸，加单蒸水定容至950mL，加1mol/L NaOH调至pH5.6，121℃灭菌20min，灭菌后待稍冷却加入50mL 40％的葡萄糖溶液至终浓度为2％。

Dropout powder组成成分：0.15g/L苏氨酸，0.03g/L酪氨酸，0.15g/L缬氨酸，0.03g/L赖氨酸，0.1g/L谷氨酸，0.15g/L丝氨酸，0.1g/L天冬氨酸，0.02g/L甲硫氨酸，0.05g/L苯丙氨酸，0.03g/L异亮氨酸，0.02g/L精氨酸。

CM固体培养基：在完全极限省却成分(CM)液体培养基中另加琼脂粉(购自索莱宝生物科技有限公司)，其终浓度为1.5％，调pH为6.5。

40％葡萄糖溶液：称取葡萄糖200g，加水定容至500mL，115℃灭菌15min。

1mol/L NaOH：称取2g NaOH，加水定容至50mL，室温保存。

实施例所用试剂：琼脂糖(索莱宝科技有限公司)、琼脂粉(索莱宝科技有限公司)、胰化蛋白胨(英国Oxoid公司)、酵母抽提物(英国Oxoid公司)、葡萄糖(Sigma)、乙腈、甲醇、甲酸。

T1-T4载体为本实验室保存(具体参见：1、Liu,X.,et al.,Engineering yeastfor the production of breviscapine by genomic analysis and synthetic biologyapproaches.Nat Commun,2018.9(1):p.448；2、Jiang,C.,et al.,Raising theproduction of phloretin by alleviation of by-product of chalcone synthase inthe engineered yeast.Sci China Life Sci,2020.63(11):p.1734-1743.)。T1载体的终止子为tTPI1和tPGI，用启动子pPGK1和pTEF1替换T1载体上的双向启动子；T2载体的终止子为tADH1和tCYC1，用启动子pPGK1和pTEF1替换T2载体上的双向启动子；T3载体的双向启动子为pADH1和pTDH3，终止子为tFBA1和tPDC1；T4载体的双向启动子为pTEF2和pPGK1，终止子为tRPS2和tTDH1。

实施例所用的方法：

1、酿酒酵母工程菌株种子液培养

选用CM培养基(购自索莱宝生物科技有限公司)(配方：YNB w/o AA(0.67％)，葡萄糖(2g/L)，Dropout powder(0.083％)，其中Dropout powder中含有(mg/L)：苏氨酸150，酪氨酸30，缬氨酸150，赖氨酸30，谷氨酸100，丝氨酸150，天冬氨酸100，甲硫氨酸20，苯丙氨酸50，异亮氨酸30，精氨酸20；其它营养成分(mg/L)：腺嘌呤50，尿嘧啶50，组氨酸100，亮氨酸100，色氨酸100(氨基酸))，液体培养基调pH为5.6，固体培养基加1.5％琼脂粉(购自索莱宝生物科技有限公司)，调pH为6.5。分别在平板上挑取单克隆到含有3mL灭过菌的培养基的24孔板中，于30℃、550rpm条件下对酿酒酵母工程菌株进行过夜培养。

2、发酵生产

将种子液以1:50的接种比例接种到灭菌后的24孔板中，加入终浓度为1mM的相应底物，在30℃、800rpm条件下发酵培养4天。

3、反应产物的HPLC-MS鉴定

3.1发酵结束后，取900μL样品，加入等体积的无水甲醇，用超声清洗仪进行超声30min。12000rpm离心15min，上清液做高效液相分析。

3.2HPLC、LC-MS检测条件

HPLC分析：

仪器：岛津高效液相色谱仪1200

色谱柱：Kinetex H15-168747(4.6×250mm)，紫外检测器，检测波长290nm。

流动相：A相为0.1％甲酸；B相为乙腈；C相为甲醇

起始浓度：A:73％B:22％C:5％。

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测器：PDA检测器

梯度洗脱程序：(浓度为B相百分比)

LC-MS分析：

质谱仪：Bruker-micrOTOF-II：

ESI离子源，正离子模式

核质比(m/z)：50-1000

氮气流速：6.0升/分钟

温度：180℃

雾化器压力：1bar

探头电压：14.5KV。

实施例1：白藜芦醇-3-糖基转移酶及其编码基因的发现

文献报道虎杖苷主要存在虎杖根中(Le,T.K.,et al.,Highly regioselectivehydroxylation of polydatin,a resveratrol glucoside,for one-step synthesis ofastringin,a piceatannol glucoside,by P450 BM3.Enzyme Microb Technol,2017.97:p.34-42.)，对虎杖根和叶的转录组进行比较，根据表达量挑选在根中表达较高的10个基因，对其进行合成(金斯瑞合成)。以穿梭质粒YCPlac33-PE为载体，利用Gibson组装方法在启动子PGK后插入外源序列进行重组载体构建(图1)。

实施例2：筛选白藜芦醇-3-糖基转移酶酿酒酵母宿主菌的构建

从NCBI上查找合成UDP-葡萄糖且为酿酒酵母来源的三个基因PGM1、PGM2、UGP1，以酿酒酵母菌株W303-1B基因组为模板，扩增PGM1、PGM2、UGP1的片段，以T3和T4为载体，利用Gibson组装方法将PGM1和PGM2构建到T3载体(图2)，UGP1构建到T4载体。PGM1、PGM2、UGP1分别在启动子pADH1、pTDH3、pTEF2和终止子tFBA1、tPDC1、tRPS2的控制下，T3和T4载体两端分别带有同源臂L3和L4，L4和L5；用引物L3-F/L4-R，L4-F/L5-R分别扩增L3-T3-L4(包含PGM1和PGM2基因)，L4-T4-L5(包含UGP1基因)，选用酿酒酵母的YORWΔ17作为整合位点，并用His标签作为筛选标记，筛选标记模块和整合同源臂模块也被扩增(Y17site1-His-L3，L5-Y17site2)，利用常规醋酸锂转化方法将L3-T3-L4，L4-T4-L5，Y17site1-His-L3，L5-Y17site2片段转化入酿酒酵母宿主菌W303-1B中的YORWΔ17位点，产生工程菌株PC1。将实施例1中所述的包括在根中表达较高的10个基因的重组载体转化入工程菌株PC1中，挑取可以在组氨酸和尿嘧啶缺陷的完全(CM)培养基上长出的克隆，以浓度为1mM的白藜芦醇为底物发酵生产虎杖苷。

发酵结束后，取900μL样品，加入等体积的无水甲醇，用超声清洗仪进行超声30min。12000rpm离心15min，上清液做高效液相分析。

经过HPLC检测结果显示，Pcus_431159、Pcus_170158、Pcus_182264可以催化白藜芦醇生成新产物(图3A)，出峰时间为4.7min，与虎杖苷标品相一致，质谱结果显示(图3B)该新产物分子量为m/z,391.1387[M+H]⁺，这与虎杖苷标品的分子量一致，确定该物质是虎杖苷。Pcus_431159、Pcus_170158、Pcus_182264对应的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示，其中Pcus_182264的催化活性最优，将Pcus_182264命名为PcR3GAT。

实施例3：从葡萄糖产虎杖苷酿酒酵母宿主菌的构建

从NCBI上查找合成白藜芦醇的四个基因AtPAL2、AtC4H、At4CL2、VvVST1(Engineering yeast for high level production of stilbenoid Antioxidants)，以T1和T2为载体，根据实施例2中的载体构建方法将AtPAL2和AtC4H构建到T1载体，At4CL2和VvVST1构建到T2体。AtPAL2在启动子pTEF1的控制下，终止子为tTPI1；AtC4H在启动子pPGK1的控制下，终止子为tPGI；VvVST1在启动子pTEF1的控制下，终止子为tADH1；At4CL2在启动子pPGK1的控制下，终止子为tCYC1。T1和T2载体两端分别带有同源臂L1和L2，L2和L3；用引物L1-F/L2-R，L2-F/L3-R分别扩增L1-T1-L2(包含AtPAL2和AtC4H基因)，L2-T2-L3(包含VvVST1和At4CL2基因)，选用酿酒酵母YORWΔ15作为整合位点，并用Leu标签作为筛选标记，筛选标记模块和整合同源臂模块也被扩增(Y15site1-Leu-L1，L3-Y15site2)，利用常规转化方法将L1-T1-L2，L2-T2-L3，Y15site1-Leu-L1，L3-Y15site2片段转化入实施例2中工程菌株PC1的YORWΔ15位点，产生工程菌株PC2，将实施例2筛选到的具有白藜芦醇-3-糖基转移酶催化活性的Pcus_431159、Pcus_170158、Pcus_182264基因对应的实施例1中的重组载体转化入工程菌株PC2中，挑取可以在亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶缺陷的完全(CM)培养基上长出的克隆。分别在平板上挑取单克隆到含有3mL灭过菌的培养基的24孔板中，于30℃、550rpm条件下对酿酒酵母工程菌株进行过夜培养。

将种子液以1:50的接种比例接种到灭菌后的24孔板中，加入终浓度为1mM的相应底物，在30℃、550rpm条件下发酵培养4天。

将PcR3GAT的重组载体转入包含白藜芦醇底盘的工程菌株PC2中，发酵四天，经过HPLC检测结果显示，PcR3GAT可以直接利用葡萄糖生成新产物(图4A)，出峰时间为4.7min，与虎杖苷标品相一致，质谱结果显示(图4B)该新产物分子量为m/z,391.1387[M+H]+，这与虎杖苷标品的分子量一致，确定该物质是虎杖苷，根据标准品曲线得到从葡萄糖合成虎杖苷在摇瓶中的产量70mg/L，

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 白藜芦醇-3-糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)

<400> 1

Met Glu Thr Gly Ala Glu Leu Leu Leu Phe Ala Ala Pro Ala Val Gly

1 5 10 15

His Leu Leu Pro Gly Val Glu Leu Gly Arg Arg Leu Ile Ser Phe Asp

20 25 30

Ser Gln Ile Ser Ile Ala Ile Leu Ile Pro Lys Leu Pro Phe Pro Asn

35 40 45

Pro Lys Ile Asp Asp Phe Ile Arg Ser Leu Asn Ala Asp Leu Arg Arg

50 55 60

Asp Ser Gln Gln Arg Ile Ser Leu Val Glu Leu Pro Pro Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Val Pro His Asp Leu Ile Ser Pro Ala Ile Gln Val Leu Leu Ile Asp

85 90 95

His Leu Ala Ser Leu Ser Lys Pro Ala Val Lys Arg Ala Val Glu Glu

100 105 110

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ala Gly Ile Val Phe Asp Met Phe Cys

115 120 125

Thr Pro Met Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly Leu Pro Ser Tyr Leu

130 135 140

Leu Tyr Thr Ser Gly Ala Asn Met Leu Thr Leu Ser Leu Lys Met Glu

145 150 155 160

Ser Leu Ala Ala Asp Asn Leu Pro Ala Ile Phe Asn Gly Met Pro Pro

165 170 175

Glu Ser Thr Pro Val Asn Phe Pro Gly Phe Lys Asn Pro Val Pro Ile

180 185 190

Lys Val Trp Pro Asp Leu Phe Leu Asn Lys Glu Leu Ser Leu Ser Ala

195 200 205

Pro Phe Val Arg Phe Ala Cys Gln Tyr Arg Lys Ala Lys Gly Ile Leu

210 215 220

Val Asn Thr Phe Phe Glu Leu Glu Ser Asp Leu Leu Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Glu Asp Glu His Ile Pro Pro Val Tyr Ser Val Gly Pro Ile Leu His

245 250 255

Leu Ser Arg Asn Ser Asp Gly Asn Ser Asp Leu Thr Asp Ser Ser Arg

260 265 270

His Pro Ser Leu Ser Trp Leu Asp Gly Gln Pro Ala Gly Ser Val Val

275 280 285

Phe Leu Cys Phe Gly Ser Lys Val Gly Ser Phe Glu Lys Ala Gln Met

290 295 300

Glu Gln Leu Ala Ala Gly Ile Glu Arg Ser Gly His Arg Phe Leu Trp

305 310 315 320

Ser Val Arg Ala Pro Leu Asp Asp Val Leu Pro Glu Gly Phe Leu Asp

325 330 335

Arg Thr Ala Gly Val Gly Lys Val Ile Gly Trp Ala Pro Gln Thr Glu

340 345 350

Val Leu Gly His Val Ala Val Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp

355 360 365

Asn Ser Val Leu Glu Ser Leu Trp Phe Gly Val Pro Val Val Ala Trp

370 375 380

Pro Met Tyr Ala Glu Gln Gln Leu Asn Ala Phe Leu Leu Val Arg Glu

385 390 395 400

Leu Gly Leu Ala Val Glu Leu Lys Met Asp Tyr Thr Phe Asp Lys Val

405 410 415

Lys Arg Lys Gly Asn Val Val Val Glu Ala Ala Glu Val Glu Ala Ala

420 425 430

Ile Arg Arg Leu Met Glu Glu Glu Glu Gly Lys Ala Val Arg Lys Lys

435 440 445

Thr Lys Glu Met Ser Ala Arg Ala Lys Lys Ala Met Glu Val Asp Gly

450 455 460

Ser Ser Tyr Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Asp Asn Val Val Ser

465 470 475

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)

<400> 2

Met Asp Val Asp Asn Arg Thr His Ile Ala Val Ile Pro Asn Pro Gly

1 5 10 15

Thr Gly His Leu Ile Pro Met Ala Glu Phe Ala Arg His Leu His Leu

20 25 30

His Asn Pro Ser Leu Phe Phe Thr Phe Ile Leu Ile Pro Thr Ser Ser

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Val Thr Pro Ser Ala Leu Thr Val Leu Pro Ser Thr

50 55 60

Ala Phe His Val Ile His Leu Pro Pro Pro Ser Phe Pro Ser Ser Phe

65 70 75 80

Pro Asn Leu Ile Asp Glu Met Leu Thr Arg Val Leu Gln Ser Ile Asn

85 90 95

Gln Ser Leu Leu Pro Leu Arg Gln Thr Leu Leu Asp Met Thr Arg Gln

100 105 110

Arg Pro Val Ala Ala Leu Ile Val Asp Ile Phe Ala Thr Glu Ile Ile

115 120 125

Pro Val Gly Ser Glu Leu Gly Ile Lys Ser Tyr Val Phe Tyr Ser Ser

130 135 140

Ser Gly Ile Ala Leu Ser Met Phe Leu His Leu Pro Glu Thr Thr Leu

145 150 155 160

Ser Ile Asp Glu Trp Val Pro Asp Lys Pro Leu Gln Phe Pro Gly Cys

165 170 175

Pro Val Leu Gln Val Lys Asp Leu Pro Asp Leu Val His Asp Arg Ser

180 185 190

Ser Ala Tyr Phe Lys Trp Phe Val Asp His Cys Lys Arg Phe Gln Ser

195 200 205

Ala Asp Ala Ile Val Leu Asn Ser Phe Leu Ala Leu Glu Glu Glu Ser

210 215 220

Ile Arg Ala Leu Thr Thr Gly Pro Thr Ala Ser Ser Lys Leu Pro Val

225 230 235 240

Tyr Val Thr Gly Pro Leu Val Arg Thr Gly Ser Asn Asn Asn Asp Ala

245 250 255

Glu Asn Glu Asp Asp Pro Ser Gly Cys Leu Arg Trp Leu Asp Glu Gln

260 265 270

Pro Leu Glu Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Gly Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Thr Asp Gln Val Thr Glu Leu Ala Phe Gly Leu Glu Leu Ser Glu

290 295 300

Gln Arg Phe Leu Trp Val Val Arg Ser Pro Asn Asp Ser Ile Ser Phe

305 310 315 320

Gly Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Glu Lys Met Asp Pro Leu Gly Phe Leu

325 330 335

Pro Thr Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys Gly Arg Gly Phe Val Val Gln

340 345 350

Ser Trp Ala Pro Gln Val Lys Ile Leu Gly His Val Ser Thr Gly Gly

355 360 365

Phe Met Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu Gly Ala Val Asn

370 375 380

Gly Val Gly Phe Ile Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln Tyr Met Asn

385 390 395 400

Ala Ile Val Leu Val Asp Lys Gly Glu Val Ala Leu Arg Ala Glu Lys

405 410 415

Asn Lys Asn Gly Val Val Gly Arg Asp Glu Ile Ala Lys Val Val Lys

420 425 430

Ala Leu Met Lys Gly Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Glu Lys Met Arg

435 440 445

Ile Ile Lys Gly Glu Ala Asp Arg Thr Met Ser His Asp Gly Leu Ser

450 455 460

Ser Val Thr Leu Ser Lys Leu Ala His Met Cys Asn Asn Ser Ser Ile

465 470 475 480

Thr

<210> 3

<211> 437

<212> PRT

<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)

<400> 3

Met Ala Ala Arg Arg Val Val Leu Phe Pro Leu Pro Met Lys Gly His

1 5 10 15

Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Thr Met Leu His Ser Lys Gly Ile

20 25 30

Ser Ile Ser Ile Ile Cys Thr Glu Phe Asn Ser Pro Asp Pro Ser Lys

35 40 45

His Pro Glu Phe Thr Phe His Thr Ile Ser Asp Gly Leu Ser Gln Phe

50 55 60

Glu Val Ser Cys Glu Asn Asp Thr Ala Phe Phe Thr Thr Leu Asn Lys

65 70 75 80

Lys Cys Glu Val Pro Phe Lys Glu Cys Leu Ser Arg Leu Val Ser Thr

85 90 95

Asp Lys Glu Leu Val Thr Cys Val Ile Thr Asp Ala Phe Trp Tyr Phe

100 105 110

Thr Arg Ala Val Ala His Ser Leu Lys Leu Arg Val Ile Val Leu Ile

115 120 125

Pro Phe Asn Leu Ser Cys Phe His Thr Phe Leu Thr Phe His Gly Thr

130 135 140

Asn Glu Tyr Leu Ser Met Gln Asp Lys Glu Val Val Val Pro Glu Leu

145 150 155 160

Ser Pro Leu Arg Ile Lys Asp Ile Pro Lys Met Asn Met Gln Asp Pro

165 170 175

Thr Gln Leu Glu Glu Leu Met Ile Ser Ile Arg Arg Glu Ile Lys Asn

180 185 190

Ser Asp Gly Ile Ile Leu Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Thr Pro Ala

195 200 205

Leu Ala Lys Leu Glu Lys Gln Leu Thr Ile Pro Ile Phe Pro Cys Gly

210 215 220

Pro Phe His Val Phe Asp Arg Lys Ser Pro Ser Ser Asn Pro Glu His

225 230 235 240

Gln Lys Cys Met Ser Trp Leu Asp Lys Gln Thr Ala Asn Ser Val Leu

245 250 255

Tyr Ile Ser Leu Gly Thr Val Val Ser Ile Asp Lys Ser Glu Phe Leu

260 265 270

Glu Leu Ser Trp Gly Ile Ala Lys Ser Asn Gln Pro Phe Leu Trp Val

275 280 285

Val Arg Pro Gly Leu Val Arg Asp Ser Ser Asp Asp Lys Leu Leu Pro

290 295 300

Asp Glu Phe Met Ala Asn Glu Thr Gly Leu Val Val Gly Trp Ser Pro

305 310 315 320

Gln Leu Glu Val Leu Ser His Pro Ala Val Gly Gly Phe Leu Thr His

325 330 335

Gly Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu Ser Ile Tyr Thr Gly Val Pro Met

340 345 350

Ile Cys Met Pro Phe Leu Ser Asp Gln Met Ala Asn Ala Arg Tyr Val

355 360 365

Ser Glu Val Trp Arg Ile Gly Leu Tyr Phe Glu Glu Ser Met Asn Arg

370 375 380

Leu Pro Ile Gln Gln Ala Ile Lys Arg Leu Met Val Asp Lys Glu Gly

385 390 395 400

Asp Glu Ile Arg Asp Asn Ile Val Cys Leu Lys Lys Lys Val Glu Gln

405 410 415

Cys Leu Glu Val Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Thr Phe Glu Asn Leu Val

420 425 430

Asn Cys Val Ser Ile

435

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)

<400> 4

atggaaaccg gcgccgagct ccttctcttc gccgcccccg cggtgggcca cctcctccct 60

ggagtcgagc tcggccgcag actcatatcc ttcgactctc aaatctccat agccattctc 120

atccccaagc tccccttccc caaccccaag atcgatgact tcatccgatc cctcaacgcc 180

gacctccgcc gtgattccca gcagcgaatc tccctcgtcg agcttccccc actcgactac 240

gttccgcacg acttgatcag ccccgccatt caagtcctcc tcatcgacca cctagcgagc 300

ctctctaagc cggccgtcaa gcgcgctgtc gaggagcgcc ggcgccggcg aaggatcgcc 360

gggatcgttt tcgacatgtt ctgcacgccc atggtcgacc tggcggagga gctaggcctg 420

ccgtcgtact tgctctacac ctccggcgct aacatgctca ccttgagtct caagatggag 480

tcgctcgctg ctgacaatct gccggcgatc ttcaacggca tgccgccgga gtcaacgccg 540

gtcaacttcc ccggattcaa gaacccggtg ccaataaaag tctggcccga cctctttctt 600

aataaggagt tgtctttgtc ggcccccttt gtccgcttcg cctgtcaata tcgcaaagcc 660

aagggcattt tggtgaatac attctttgag ctggagtcgg atctcctcaa atccttatct 720

gaagacgaac atatccctcc agtatactcc gtgggaccca tcctccacct ctcccgtaac 780

agtgacggga acagcgattt aacagattca tctcggcatc cgagcttgag ttggttagac 840

gggcaaccgg cagggtcggt ggtgttcctc tgcttcggaa gcaaggtcgg gagctttgag 900

aaggctcaga tggagcagct cgccgccggg atcgagcgga gcggccatcg attcctctgg 960

tcggtgcggg cgccgttgga tgacgttctc ccggaggggt ttctggatcg gacagcgggg 1020

gtggggaagg tgatcgggtg ggccccacag acggaggtgt tgggacacgt ggcggtagga 1080

gggtttgttt ctcactgcgg gtggaactcc gtgctggaga gtctttggtt cggggtgccg 1140

gtggtggcat ggccgatgta cgccgagcag cagctgaacg cgtttctgtt ggtgagggag 1200

ctgggcttgg cggtggaatt gaagatggac tacacgtttg ataaggtgaa gagaaagggg 1260

aacgtggtgg ttgaagcggc ggaggttgag gcggccatac ggcggctgat ggaggaggag 1320

gaaggtaagg cggtgaggaa gaagacgaag gagatgagtg cgcgggccaa gaaggctatg 1380

gaagtcgatg ggtcttccta tgcgtctctt tctagatttg ttgataacgt cgttagttaa 1440

<210> 5

<211> 1446

<212> DNA

<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)

<400> 5

atggatgtcg acaatcgtac ccacatcgcc gtgatcccaa atcccggcac cggccacctc 60

atcccgatgg cagagtttgc ccgccacctc cacctccaca acccctctct tttcttcacc 120

ttcattctca tccccacctc ttcctccacc tccaacgtta ctccctccgc tctaaccgtc 180

ctaccttcca ccgccttcca cgtcatccac ctcccaccgc cttccttccc ctcctccttc 240

cccaacctca tagacgagat gttgacccgt gtccttcaat ccatcaacca atccctcctc 300

cctctccgcc aaaccctctt agacatgaca cgtcagcgcc ccgtggcggc cttgatagtc 360

gacatcttcg ccaccgaaat catccccgtc ggatcggaac tcgggatcaa gtcctacgtg 420

ttctactcct cctccggcat agccttgtcc atgttcctcc accttcctga aacgacgttg 480

tcgattgatg agtgggttcc ggataaaccc ttgcaatttc ccggatgccc tgttctgcaa 540

gtcaaggatc ttcccgacct ggttcatgac cggtccagtg cttacttcaa gtggtttgtc 600

gatcattgca agcggttcca atcagccgat gccattgtgc tcaacagctt ccttgctttg 660

gaggaggagt ccattcgggc tttgacaacg ggccccacag cttcgagcaa gctgccggtc 720

tacgtgacgg ggccgcttgt tcggaccggt tcaaacaaca atgacgccga gaacgaggac 780

gacccgtccg ggtgtctaag gtggttagat gagcaacctc tagagtccgt actatacgtg 840

agtttcggga gtggtgggac cctctccact gaccaagtga ctgagctagc attcgggctt 900

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ctagaaagga ccaaagggcg aggtttcgtg gtgcagtcat gggccccaca agtcaagatc 1080

cttggccacg tgtcaacggg cgggttcatg acacactgtg gttggaattc aattttggag 1140

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gcgatagtgc ttgtggataa gggtgaggtt gcgcttaggg ctgagaagaa taagaatggg 1260

gttgtgggga gggatgagat tgcgaaagtt gtaaaggcgt taatgaaagg tgaagaaggg 1320

aggaagatta gagaaaaaat gaggataatt aaaggtgaag cggataggac aatgagccat 1380

gatgggttgt ctagtgtcac actctccaaa ttggcccaca tgtgcaataa ttcatcgatt 1440

acctaa 1446

<210> 6

<211> 1314

<212> DNA

<213> 虎杖(Polygonum cuspidatum)

<400> 6

atggctgctc ggagagtggt gctttttccc ttgcctatga aaggccatat caaccccatg 60

ttacaacttg caaccatgct tcattcaaaa ggcatctcca tctctatcat ttgcactgaa 120

ttcaactcac cagatccttc aaagcacccc gagttcacat tccacaccat ctctgatggc 180

ttgtcacaat tcgaggtctc ctgcgaaaac gatactgcgt ttttcacaac actgaataag 240

aagtgtgaag tgccattcaa ggaatgctta tctcgcttgg tttcaaccga caaggagtta 300

gtaacatgtg taatcacgga tgcattttgg tacttcaccc gagccgttgc acatagtctc 360

aagctgcgcg taattgttct aataccgttt aatctatctt gtttccatac cttcctcact 420

tttcatggca ccaatgagta tctttccatg caagacaaag aggtggttgt accagagctt 480

tccccactta gaattaaaga cattcccaaa atgaatatgc aagatccaac acagctcgaa 540

gaactcatga ttagcataag aagagaaatc aagaactcag atggcattat cttgaattca 600

ttcaaagaac tcgaaactcc tgccttggct aaactcgaga agcaacttac aattcccatc 660

tttccatgcg gcccgttcca cgtatttgat cgtaagtcgc catcgagtaa tcccgaacat 720

caaaaatgca tgtcatggct tgataaacaa accgccaact ccgtcctata cataagcctg 780

gggactgtcg tttccataga caagtccgag tttcttgagc tatcatgggg aatagcaaaa 840

agcaaccaac cctttttgtg ggtggttcgt ccgggcttgg ttcgtgattc atcggacgac 900

aagttgttgc ctgacgagtt catggctaat gagacggggc tcgtcgttgg atggtcccca 960

caactagagg tgctttctca ccctgcagta ggaggattct tgactcatgg tgggtggaat 1020

tctattctcg agagtatcta tacaggggtg cccatgattt gtatgccttt cctctccgac 1080

cagatggcga atgctcggta tgtgagtgag gtttggagaa tcggattgta ctttgaggaa 1140

agcatgaata ggttgccaat acaacaggct ataaaaagat tgatggttga caaggaaggt 1200

gatgagatta gagataacat agtgtgttta aagaagaagg tagaacaatg cttagaggtt 1260

gggggctcct cctacgagac cttcgagaat ttagttaatt gtgttagtat ttaa 1314

<210> 7

<211> 1713

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 7

atgtcacttc taatagattc tgtaccaaca gttgcttata aggaccaaaa accgggtact 60

tcaggtttac gtaagaagac caaggttttc atggatgagc ctcattatac tgagaacttc 120

attcaagcaa caatgcaatc tatccctaat ggctcagagg gaaccacttt agttgttgga 180

ggagatggtc gtttctacaa cgatgttatc atgaacaaga ttgccgcagt aggtgctgca 240

aacggtgtca gaaagttagt cattggtcaa ggcggtttac tttcaacacc agctgcttct 300

catataatta gaacatacga ggaaaagtgt accggtggtg gtatcatatt aactgcctca 360

cacaacccag gcggtccaga gaatgattta ggtatcaagt ataatttacc taatggtggg 420

ccagctccag agagtgtcac taacgctatc tgggaagcgt ctaaaaaatt aactcactat 480

aaaattataa agaacttccc caagttgaat ttgaacaagc ttggtaaaaa ccaaaaatat 540

ggcccattgt tagtggacat aattgatcct gccaaagcat acgttcaatt tctgaaggaa 600

atttttgatt ttgacttaat taaaagcttc ttagcgaaac agcgcaaaga caaagggtgg 660

aagttgttgt ttgactcctt aaatggtatt acaggaccat atggtaaggc tatatttgtt 720

gatgaatttg gtttaccggc agaggaagtt cttcaaaatt ggcacccttt acctgatttc 780

ggcggtttac atcccgatcc gaatctaacc tatgcacgaa ctcttgttga cagggttgac 840

cgcgaaaaaa ttgcctttgg agcagcctcc gatggtgatg gtgataggaa tatgatttac 900

ggttatggcc ctgctttcgt ttcgccaggt gattctgttg ccattattgc cgaatatgca 960

cccgaaattc catacttcgc caaacaaggt atttatggct tggcacgttc atttcctaca 1020

tcctcagcca ttgatcgtgt tgcagcaaaa aagggattaa gatgttacga agttccaacc 1080

ggctggaaat tcttctgtgc cttatttgat gctaaaaagc tatcaatctg tggtgaagaa 1140

tccttcggta caggttccaa tcatatcaga gaaaaggacg gtctatgggc cattattgct 1200

tggttaaata tcttggctat ctaccatagg cgtaaccctg aaaaggaagc ttcgatcaaa 1260

actattcagg acgaattttg gaacgagtat ggccgtactt tcttcacaag atacgattac 1320

gaacatatcg aatgcgagca ggccgaaaaa gttgtagctc ttttgagtga atttgtatca 1380

aggccaaacg tttgtggctc ccacttccca gctgatgagt ctttaaccgt tatcgattgt 1440

ggtgattttt cgtatagaga tctagatggc tccatctctg aaaatcaagg ccttttcgta 1500

aagttttcga atgggactaa atttgttttg aggttatccg gcacaggcag ttctggtgca 1560

acaataagat tatacgtaga aaagtatact gataaaaagg agaactatgg ccaaacagct 1620

gacgtcttct tgaaacccgt catcaactcc attgtaaaat tcttaagatt taaagaaatt 1680

ttaggaacag acgaaccaac agtccgcaca tag 1713

<210> 8

<211> 1710

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 8

atgtcatttc aaattgaaac ggttcccacc aaaccatatg aagaccaaaa gcctggtacc 60

tctggtttgc gtaagaagac aaaggtgttt aaagacgaac ctaactacac agaaaatttc 120

attcaatcga tcatggaagc tattccagag ggttctaaag gtgccactct tgttgtcggt 180

ggtgatgggc gttactacaa tgatgtcatt cttcataaga ttgccgctat cggtgctgcc 240

aacggtatta aaaagttagt tattggccag catggtcttc tgtctacgcc agccgcttct 300

cacatcatga gaacctacga ggaaaaatgt actggtggta ttatcttaac cgcctcacat 360

aatccaggtg gtccagaaaa tgacatgggt attaagtata acttatccaa tgggggtcct 420

gctcctgaat ccgtcacaaa tgctatttgg gagatttcca aaaagcttac cagctataag 480

attatcaaag acttcccaga actagacttg ggtacgatag gcaagaacaa gaaatacggt 540

ccattactcg ttgacattat cgatattaca aaagattatg tcaacttctt gaaggaaatc 600

ttcgatttcg acttaatcaa gaaattcatc gataatcaac gttctactaa gaattggaag 660

ttactgtttg acagtatgaa cggtgtaact ggaccatacg gtaaggctat tttcgttgat 720

gaatttggtt taccggcgga tgaggtttta caaaactggc atccttctcc ggattttggt 780

ggtatgcatc cagatccaaa cttaacttat gccagttcgt tagtgaaaag agtagatcgt 840

gaaaagattg agtttggtgc tgcatccgat ggtgatggtg atagaaatat gatttacggt 900

tacggcccat ctttcgtttc tccaggtgac tccgtcgcaa ttattgccga atatgcagct 960

gaaatcccat atttcgccaa gcaaggtata tatggtctgg cccgttcatt ccctacctca 1020

ggagccatag accgtgttgc caaggcccat ggtctaaact gttatgaggt cccaactggc 1080

tggaaatttt tctgtgcttt gttcgacgct aaaaaattat ctatttgtgg tgaagaatcg 1140

tttggtactg gttccaacca cgtaagggaa aaggacggtg tttgggccat tatggcgtgg 1200

ttgaacatct tggccattta caacaagcat catccggaga acgaagcttc tattaagacg 1260

atacagaatg aattctgggc aaagtacggc cgtactttct tcactcgtta tgattttgaa 1320

aaagttgaaa cagaaaaagc taacaagatt gtcgatcaat tgagagcata tgttaccaaa 1380

tcgggtgttg ttaattccgc cttcccagcc gatgagtctc ttaaggtcac cgattgtggt 1440

gatttttcat acacagattt ggacggttct gtttctgacc atcaaggttt atatgtcaag 1500

ctttccaatg gtgcaagatt cgttctaaga ttgtcaggta caggttcttc aggtgctacc 1560

attagattgt acattgaaaa atactgcgat gataaatcac aataccaaaa gacagctgaa 1620

gaatacttga agccaattat taactcggtc atcaagttct tgaactttaa acaagtttta 1680

ggaactgaag aaccaacggt tcgtacttaa 1710

<210> 9

<211> 1500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 9

atgtccacta agaagcacac caaaacacat tccacttatg cattcgagag caacacaaac 60

agcgttgctg cctcacaaat gagaaacgcc ttaaacaagt tggcggactc tagtaaactt 120

gacgatgctg ctcgcgctaa gtttgagaac gaactggatt cgtttttcac gcttttcagg 180

agatatttgg tagagaagtc ttctagaacc accttggaat gggacaagat caagtctccc 240

aacccggatg aagtggttaa gtatgaaatt atttctcagc agcccgagaa tgtctcaaac 300

ctttccaaat tggctgtttt gaagttgaac ggtgggctgg gtacctccat gggctgcgtt 360

ggccctaaat ctgttattga agtgagagag ggaaacacct ttttggattt gtctgttcgt 420

caaattgaat acttgaacag acagtacgat agcgacgtgc cattgttatt gatgaattct 480

ttcaacactg acaaggatac ggaacacttg attaagaagt attccgctaa cagaatcaga 540

atcagatctt tcaatcaatc caggttccca agagtctaca aggattcttt attgcctgtc 600

cccaccgaat acgattctcc actggatgct tggtatccac caggtcacgg tgatttgttt 660

gaatctttac acgtatctgg tgaactggat gccttaattg cccaaggaag agaaatatta 720

tttgtttcta acggtgacaa cttgggtgct accgtcgact taaaaatttt aaaccacatg 780

atcgagactg gtgccgaata tataatggaa ttgactgata agaccagagc cgatgttaaa 840

ggtggtactt tgatttctta cgatggtcaa gtccgtttat tggaagtcgc ccaagttcca 900

aaagaacaca ttgacgaatt caaaaatatc agaaagttta ccaacttcaa cacgaataac 960

ttatggatca atctgaaagc agtaaagagg ttgatcgaat cgagcaattt ggagatggaa 1020

atcattccaa accaaaaaac tataacaaga gacggtcatg aaattaatgt cttacaatta 1080

gaaaccgctt gtggtgctgc tatcaggcat tttgatggtg ctcacggtgt tgtcgttcca 1140

agatcaagat tcttgcctgt caagacctgt tccgatttgt tgctggttaa atcagatcta 1200

ttccgtctgg aacacggttc tttgaagtta gacccatccc gttttggtcc aaacccatta 1260

atcaagttgg gctcgcattt caaaaaggtt tctggtttta acgcaagaat ccctcacatc 1320

ccaaaaatcg tcgagctaga tcatttgacc atcactggta acgtcttttt aggtaaagat 1380

gtcactttga ggggtactgt catcatcgtt tgctccgacg gtcataaaat cgatattcca 1440

aacggctcca tattggaaaa tgttgtcgtt actggtaatt tgcaaatctt ggaacattga 1500

<210> 10

<211> 2154

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 10

tcagcagata ggaataggag caccattcca ttctttcaag cagtccatca atggatcgat 60

caatttacct tcgcacatag cagtgaaaac cttatcgaat tcttcacctg gagaaacaac 120

cttttcaccg gtcaacaact tagtacctaa ttcttctcta acgaatctgt ataatgggta 180

ggatctgcat tctttgattc tatttggaat tggagcagta ccgttaccgt aagctgctct 240

agctgcttca acttcttttg gcaaaacggc cttcaattct tcttcgaaag caccaatctt 300

ttggaaaatg gaggtaacag cgttcttttc ggtttcacca ttagacaaag catgatcaac 360

gatgacttgt ctcaatcttt gcatcaatgg ataagtagca gaacatggat catcaacgta 420

ggtgaaaact tgttctctat caacgacctt caacaaatcc ttttcgcaga atctagatgg 480

atgcaattca ccgttaatac cggtggtcaa aactttctta gcaacttgtg aaacggtgtt 540

cttgacggtt tgtctcaagt tttcttccaa atgtctcaaa tcaacagctt ggcaaatacc 600

gaccaagaat gtagtagaca tcaacttcaa gatgtcaacg gcttcagaag tctttctaga 660

agagatcaaa cccaaggagt taacgtcttg attgtgttgt tcagcagatt gaacatgaga 720

ggtaactggg ttagccaagt attgcaattc agaacagtat gaagccatag caatttcagc 780

acccttaaaa ccgtaatcca atgatggatt agaagaagcg gtcaagttag aaggcaaacc 840

gttgttgtaa aaatcgttga ccaattcgga gaattgagcg aacatcaatt taccaatggc 900

agcaatagcc aatctagtgt tgtccataga aacaccaatt ggagtacctt ggaagttacc 960

accatgaata gctttgtttc tactgacgtc gatcaatggg ttgtcgttaa cagaattgat 1020

ttctctttcg atggacttgg tggcttgtct aataacttct atttgtggac ccaaccattg 1080

tggagaagtt ctcaaagcgt atctatcttg ttttggcttt tgcaatgggt ccatttcgtg 1140

aactttttga gccaacttca tgtaagagga accatccaag atatgttcca taattgcagc 1200

agcttcaatt tgacctgggt gatgtttcaa tctatgggtc aaatgatcag tgaattctgg 1260

cttaccggac ataacttcag caaaaatagc agacaaaact tcggccaaaa cagcttgaac 1320

gttagcttca aacaaaacca tagaagccat accagaacca acagctgtac cattaaccaa 1380

agccaaacct tctttaggtt gcaagtcgaa aaaaccagta gagataccag ccttttcaaa 1440

agcttcttta gcagtcaatg attcaccatc tggaccagta gctttagagt ttggtctacc 1500

agtcaacaaa ccagcaatat aagacaatgg aaccaaatca ccagaagcag taatagtacc 1560

tctcaatggc aaagatggag aaatgttatg gttcaacaag gaggtgatag cttccaaaat 1620

ttcgaatctg ataccggagt aaccttgcaa caaagtgtta actctaacca acatagcagc 1680

tctagtagca gattgtggca aggtatgaca agtttctttg gtgttaccga aaataccggc 1740

gttcaaaaat ctgatcaatt cggtttgcaa ggcagtacca ttcttagttc ttctatgaga 1800

agtagcacca aaacctgtag taacaccgta agaatcagta cccttgttca tagattccat 1860

aacccaatca gaagaagcct taacaccagc tctagaagtt tcagccaatt caaccttaac 1920

agaaccacca acagtagaaa tagcagcaac ttgaccaata gtcaaagttt caccacccaa 1980

attaacaact ggtcttctgt attcttcgac catcttcttg acttcatcca aatgagaacc 2040

cttcatttga tcagcagcca aaccccaatt caatggatcg gccaaggtct tagtagtaac 2100

agcaactttt gttttttcac caccaccaca caacatagct tcgatttgat ccat 2154

<210> 11

<211> 1518

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 11

atggacttgt tgttgttgga aaagtccttg attgctgttt tcgttgctgt tattttggcc 60

accgttatct ctaaattgag aggtaagaaa ttgaagttgc caccaggtcc aattccaatc 120

ccaatttttg gtaattggtt gcaagttggt gatgacttga accacagaaa cttggttgat 180

tacgctaaaa agttcggtga tttgttcttg ttgagaatgg gtcaaagaaa tttggtcgtt 240

gtttcctcac cagacttgac caaagaagtt ttgttgactc aaggtgtcga attcggttcc 300

agaactagaa atgttgtttt cgatatcttc accggtaagg gtcaagatat ggtttttact 360

gtttacggtg aacattggag aaagatgaga agaattatga ccgttccatt cttcaccaac 420

aaggttgtcc aacaaaacag agaaggttgg gaatttgaag ctgcttctgt tgttgaagat 480

gtcaagaaga atccagattc tgctactaag ggtatcgttt tgagaaaaag attgcaattg 540

atgatgtaca acaacatgtt cagaatcatg ttcgacagaa gatttgaatc cgaagatgac 600

cctttgtttt tgagattgaa ggctttgaac ggtgaaagat ctagattggc tcaatccttc 660

gaatacaact acggtgattt catcccaatc ttaagaccat tcttgagagg ttacttgaag 720

atctgccaag atgttaagga tagaagaatc gccttgttca aaaagtactt cgttgacgaa 780

agaaagcaaa tcgcttcttc taaacctact ggttctgaag gtttgaagtg cgccattgat 840

catattttgg aagctgaaca aaagggtgaa atcaacgaag ataacgtctt gtacatcgtc 900

gaaaacatta acgttgctgc tattgaaact accttgtggt ctattgaatg gggtattgct 960

gaattggtta atcacccaga aatccaatcc aagttgagaa acgaattgga tactgttttg 1020

ggtccaggtg ttcaagttac tgaacctgac ttgcataagt tgccatactt gcaagctgtt 1080

gtaaaagaaa ccttgagatt aagaatggcc atccctttgt tggttccaca tatgaacttg 1140

catgatgcta aattggccgg ttatgatatt ccagccgaat ccaagatttt ggttaatgct 1200

tggtggttgg ctaacaatcc aaattcttgg aaaaagccag aagaattcag accagaaaga 1260

tttttcgaag aagaaagtca cgttgaagcc aacggtaatg attttagata cgttccattt 1320

ggtgttggta gaagatcttg tccaggtatt atcttggctt tgccaatttt gggtattacc 1380

atcggtagaa tggtccaaaa cttcgaatta ttgccaccac ctggtcaatc taaggttgat 1440

acttctgaaa agggtggtca attctccttg catattttga accactccat catcgttatg 1500

aagccaagaa actgttga 1518

<210> 12

<211> 1671

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 12

atgactaccc aagatgttat cgtcaacgat caaaacgacc aaaagcaatg ttccaacgat 60

gtcatcttca gatctagatt gccagatatc tacatcccaa accatttgcc attgcacgat 120

tacatcttcg aaaacatttc tgaattcgct gctaagccat gcttgattaa cggtccaact 180

ggtgaagttt acacttacgc tgatgttcat gttacctcta gaaaattggc tgctggttta 240

cacaatttgg gtgttaagca acacgatgtc gttatgattt tgttgccaaa ctctccagaa 300

gttgtcttga cttttttggc tgcttctttc attggtgcta ttactacttc tgctaaccca 360

ttttttaccc cagccgaaat ttctaaacaa gctaaagctt ctgctgccaa gttgatcgtt 420

actcaatcaa gatacgttga caagatcaag aacttgcaaa acgatggtgt tttgattgtc 480

accactgatt ctgatgctat tccagaaaac tgcttgagat tctctgaatt gacccaatct 540

gaagaaccta gagttgattc catcccagaa aagatttcac cagaagatgt tgttgctttg 600

ccattctctt caggtactac tggtttgcca aaaggtgtta tgttgactca taagggtttg 660

gttacatccg ttgctcaaca agttgatggt gaaaatccaa acttgtactt caacagagat 720

gacgttatct tgtgcgtttt gccaatgttt catatctacg ccttgaactc catcatgttg 780

tgttctttga gagttggtgc caccattttg attatgccaa agttcgaaat caccttgttg 840

ttggaacaaa tccaaagatg caaggttacc gttgctatgg ttgttccacc aatagttttg 900

gctattgcta agtctccaga aaccgaaaag tacgatttgt cctctgttag aatggttaag 960

tctggtgctg ctccattggg taaagaattg gaagatgcta tttctgctaa gttcccaaat 1020

gctaagttgg gtcaaggtta tggtatgact gaagctggtc cagttttagc tatgtctttg 1080

ggttttgcta aagaaccatt cccagtaaaa tctggtgctt gtggtactgt tgttagaaac 1140

gctgaaatga agattttgga cccagatact ggtgattctt tgccaagaaa caaaccaggt 1200

gaaatatgca tcagaggtaa tcaaatcatg aagggttact tgaacgatcc attggctact 1260

gcttctacca ttgataagga tggttggttg catacaggtg atgttggttt catagatgat 1320

gacgacgaat tattcatcgt tgatagattg aaagaattga tcaagtacaa gggtttccaa 1380

gttgctccag ctgaattgga atctttgttg attggtcatc cagaaatcaa cgacgttgct 1440

gttgttgcaa tgaaggaaga agatgccggt gaagttccag ttgctttcgt tgttagatcc 1500

aaggattcta acatctccga agacgaaatc aagcaattcg tttctaagca agtcgttttc 1560

tacaagagaa tcaacaaggt tttcttcacc gactctattc caaaagctcc atctggtaag 1620

atcttgagaa aggatttgag agctagattg gctaacggtt tgatgaactg a 1671

<210> 13

<211> 1179

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

atggcttccg ttgaagaatt cagaaacgct caaagagcta aaggtccagc tactattttg 60

gctattggta ctgctactcc agatcattgt gtttaccaat ctgattacgc cgactactac 120

ttcagagtta ctaagtctga acacatgacc gaattgaaga aaaagttcaa cagaatctgc 180

gacaagtcca tgatcaagaa gagatatatc cacttgaccg aagaaatgtt ggaagaacat 240

ccaaacattg gtgcttatat ggctccatcc ttgaacatca gacaagaaat tatcactgcc 300

gaagttccaa gattgggtag agatgctgct ttgaaggctt tgaaagaatg gggtcaacct 360

aagtctaaga tcacccattt ggttttctgt actacctctg gtgttgaaat gccaggtgct 420

gattacaaat tggctaactt gttgggtttg gaaacctccg ttagaagagt tatgttgtac 480

catcaaggtt gttatgctgg tggtactgtt ttgagaactg ctaaagattt ggctgaaaac 540

aatgctggtg ctagagtttt ggttgtttgc tctgaaatta ccgttgttac tttcagaggt 600

ccatctgaag atgctttgga ttctttggtt ggtcaagctt tgtttggtga tggttcttct 660

gctgttatag ttggttctga tccagatgtc tctatcgaaa gacctttgtt ccaattggtt 720

tctgctgctc aaactttcat tccaaattct gctggtgcaa ttgctggtaa cttgagagaa 780

gttggtttga cttttcattt gtggccaaac gttccaactt tgatctccga aaacattgaa 840

aagtgtttga cccaagcttt cgatccattg ggtatttctg attggaattc cttgttctgg 900

attgctcatc caggtggtcc agcaattttg gatgctgttg aagctaaatt gaacttggaa 960

aagaagaagt tggaagccac cagacatgtt ttgtctgaat acggtaatat gtcctctgct 1020

tgcgttttgt tcattttgga cgaaatgaga aaaaagtcct tgaagggtga aaaggctact 1080

actggtgaag gtttggattg gggtgttttg ttcggttttg gtccaggttt gactattgaa 1140

actgttgtct tgcattctgt tccaaccgtt accaattga 1179

Claims (7)

1. 一种具有将白藜芦醇3-羟基进行糖基化修饰的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

2.权利要求1所述蛋白质作为白藜芦醇-3-糖基转移酶的应用。

3. 一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

4.一种含有权利要求3所述基因的重组表达载体或表达盒；所述重组表达载体为在酵母中表达的载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包括编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸的重组载体或表达盒；所述宿主细胞是酵母。

6.权利要求1所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或表达盒、权利要求5所述的宿主细胞在催化虎杖苷的合成中的应用。

7.一种合成虎杖苷的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1所述的蛋白质进行催化的步骤。