CN111032875B - Iii型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途，特别是，涉及来自藻(优选真核褐藻)的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途。本发明还涉及显示出间苯三酚合酶活性的多肽以及编码上述III型聚酮合酶的分离的核酸分子，以及包含这种核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及生产间苯三酚的方法。

Description

III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途

技术领域

本发明属于微生物生物化学的领域，更具体而言，属于通过微生物酶合成间苯三酚的领域。本发明涉及III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途，特别是藻的(优选真核褐藻(ochrophytes))的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途。

背景技术

间苯三酚是一种芳香族有机化合物，特别用于医药产品和爆炸物的生产中。

间苯三酚合成被称为间苯三酚合酶的III型聚酮合酶催化。根据以下反应流程，间苯三酚合酶进行三个丙二酰基-CoA分子的缩合反应，从而形成间苯三酚分子(反应I)：

随后可以从间苯三酚合成许多低聚物，例如褐藻多酚。褐藻多酚具体包括多羟基联苯(fucols)、根皮素和岩藻糖根皮素，它们是由间苯三酚衍生的产物，其构成褐藻的壁。另外，褐藻的各种保护活性也归因于褐藻多酚。

目前，仅在革兰氏阴性荧光假单胞菌细菌(Achkar等人,2005；Zha等人,2006)和褐藻外子藻(Ectocarpus siliculosus)(Meslet-Cladière等人,2013)中描述了间苯三酚的合成。在这两个物种中已鉴定出参与间苯三酚合成的间苯三酚合酶。它们是迄今为止鉴定和表征的仅有的两种间苯三酚合酶。

在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中，间苯三酚合酶由PHLD基因编码(Achkar等人,2005；Zha等人,2006)。

在外子藻中，间苯三酚合酶由PKS1基因编码(Meslet-Cladière等人，2013)。

有可能在表达异源PHLD基因的大肠杆菌(Escherichia coli)中证明PHLD间苯三酚合酶的活性(Achkar等人,2005)。通过用从重组大肠杆菌培养物中表达和纯化的异源PHLD进行的小规模酶学测试，已在体外证实了这种活性(Zha等人，2006)。

已经在体外通过大肠杆菌中表达和纯化的重组PKS1以及外子藻(E.siliculosus)的细胞提取物证明了PKS1间苯三酚合酶的活性(Meslet-Cladière等人,2013,WO 2013/045510)。

但是，PHLD和PKS1酶表现出较低的酶活性。另外，尚未证明使用这些酶在体外大规模合成间苯三酚的可能性。最后，在这些研究中使用的间苯三酚合酶是由大肠杆菌或荧光假单胞菌细菌产生的。因此，当这些酶由真核生物例如酵母或昆虫或哺乳动物细胞产生时，其活性是未知的。然而，真核系统可能是有利的，特别是对于大规模生产。实际上，这使得可能获得更接近起源真核生物酶的酶，特别是因为所述酶能够在翻译后水平上的修饰。

因此，仍然需要鉴定在体外或体内具有高间苯三酚合成酶活性的新的间苯三酚合酶，其适于工业规模生产并且可以通过真核系统来生产。

然而，聚酮合酶的确切功能表征由于以下事实而变得复杂：该类酶将具有大的序列相似性的蛋白质汇集在一起，而他们可以催化基本不同的反应并识别完全不同的底物。

结果，在其他生物体中鉴定新型间苯三酚合酶的尝试并未成功。尤其是，已知马尾藻属(Sargassum sp.)的多种菌株能够产生间苯三酚。为了鉴定负责该产物合成的酶，在宾德马尾藻(S.binderi)中鉴定了推定的III型聚酮合酶。测试了这些候选酶的间苯三酚合酶活性。这些测试表明，在宾德马尾藻中鉴定出的这些III型聚酮合酶均未显示出这种活性(Baharum等人，2011)。

尽管存在这些困难，本发明人仍能够鉴定出具有间苯三酚合酶活性的多肽。因此，已经在褐藻中鉴定出新型间苯三酚合酶，特别是在宾德马尾藻和抑食金球藻(A.anophagefferens)中。它们构成了这种类型藻中间苯三酚合酶的第一个示例。发明人在此证明这些新的间苯三酚合酶表现出高的间苯三酚合成活性。因此，它们适合于工业规模的生产。此外，当在真核系统中生产时，它们是有功能的。

发明内容

在本发明的上下文中，发明人完全出乎意料地证明，除了荧光假单胞菌和外子藻(E.siliculosus)外，活生物体在其基因组中包含编码具有功能性间苯三酚合酶活性的III型聚酮合酶的基因。

因此，本发明涉及选自III型聚酮合酶的多肽，特别是选自真核褐藻的III型聚酮合酶的多肽，本发明还涉及其用作间苯三酚合酶的用途。

本发明还涉及分离的核酸分子，其编码间苯三酚合酶，特别是编码真核褐藻的间苯三酚合酶，并且还涉及由此编码的间苯三酚合酶。

本发明还涉及包含至少一个编码这种间苯三酚合酶的分离的核酸分子的载体。

本发明还涉及包含至少一个根据本发明的分离的核酸分子或至少一个载体的宿主细胞。

本发明还涉及生产功能性间苯三酚合酶的方法。

本发明还涉及生产间苯三酚的方法。

附图说明

图1显示了用Clustal W软件形成的藻PKS1.Es(PHLD.Es)、PHLD.Sbi和PHLD-1.Aa的酶或候选物的蛋白质序列比对，以及荧光假单胞菌细菌PHLD.Pf的蛋白质序列比对。

图2显示了在丙基五氟苯基(PFP)柱上间苯三酚/间苯二酚分离的示例。

图3显示了在抑食金球藻基因组重叠群中Blast搜索PHLD.Sbi N-末端部分的结果。

图4显示了编码与PHLD.Sbi的氨基末端部分同源的肽序列的抑食金球藻基因组序列的定位(序列以浅灰色突出显示，由两个黑色箭头加框)，其位于PHLD.Aa基因序列的5'端(深灰色箭头)，如在基因组数据库中所标注的。

图5显示了PHLD-1.Aa酶的重构肽序列的氨基末端部分。

图6显示了PKS1.Es酶的三维(3D)结构与重构PHLD-1.Aa酶的建模结构之间的比较。被鉴定为与PHLD.Sbi序列具有同源性的N-末端部分用浅灰色表示(箭头表示每个单体N-末端部分的起点)。

图7显示了为给定候选物(PHLD.ii)构建的基因单元结构的示例，这使得可以在酵母酿酒酵母中表达PHLD基因。

图8显示了在存在20g.L^-1的乙醇作为碳源、在30℃下在24孔板中培养48小时后，在ADH2启动子控制下表达各种PHLD.ii和PKS1.Es基因(几个拷贝)的酵母菌株中间苯三酚的生产水平。(A)各种测得数据的总结。(B)在600nm(DO₆₀₀)下测得的各种培养物的光密度(DO)，表明每种菌株的生长水平。(C)在培养基中测得的间苯三酚生产水平(以mg.L^-1计)。(D)相对于整合到基因组中的拷贝数归一化的间苯三酚的生产水平(以mg.L^-1计)。

图9显示了在JLP1基因座上整合到酵母基因组中的基因构建体的结构。编码每个PHLD/PKS1的基因在pADH2启动子或pCCW12启动子的控制下。

图10显示了在存在20g.L^-1的乙醇作为碳源、在30℃下在24孔板中培养48小时后，在ADH2启动子控制下表达各种PHLD.ii基因(仅1个拷贝)的酵母菌株中间苯三酚的生产水平。(A)各种测得数据的总结。(B)在600nm(DO₆₀₀)下测得的各种培养物的光密度(DO)，表明每种菌株的生长水平。(C)在培养基中测得的间苯三酚生产水平(以mg.L^-1计)。

图11显示了在存在20g.L^-1的葡萄糖作为碳源、在30℃下在24孔板中培养48小时后，在CCW12启动子控制下表达各种PHLD.ii基因(仅1个拷贝)的酵母菌株中间苯三酚的生产水平。(A)各种测得数据的总结。(B)在600nm(DO₆₀₀)下测得的各种培养物的光密度(DO)，表明每种菌株的生长水平。(C)在培养基中测得的间苯三酚生产水平(以mg.L^-1计)。

具体实施方式

定义

术语“III型聚酮合酶”旨在表示产生聚酮的多功能酶或酶复合物，并且不使用酰基载体蛋白(或ACP)结构域。

术语“聚酮”旨在表示细菌、霉菌、植物和某些动物品系中一个大的次级代谢产物家族，其源自聚酮合酶对乙酰基或丙二酰亚基的反复缩合。聚酮还用作生产各种天然和半合成产品的原料。

术语“间苯三酚”旨在表示具有以下化学式(式I)的芳香族有机化合物苯-1,3,5-三醇：

术语“间苯三酚合酶”旨在表示属于III型聚酮合酶家族并且催化间苯三酚合成的多功能酶或酶复合物。间苯三酚合酶催化三个丙二酰基-CoA分子的缩合，从而形成间苯三酚分子。

术语酶的“酶活性”或“催化活性”或“活性”旨在表示在给定环境中将底物转化为产物的酶的效率。酶的效率在本文中考虑了酶将底物转化为产物的速率和酶将底物转化为产物的程度。表述“酶将底物转化为产物的程度”在此旨在表示对于限定量的酶，获得的最终产物的量相对于底物的初始量之间的比率。例如，出于本发明的目的，酶活性可以表示为在给定体积(例如，以g.L^-1或mg.L^-1计)中生产的间苯三酚的量。

术语“藻”旨在表示能够进行氧合光合作用的生物体，其生命周期通常发生在水介质中。藻包括蓝藻和真核藻。术语“蓝藻(Cyanobactérie)”旨在表示属于蓝藻组的原核生物，也称为蓝藻。术语“真核藻”旨在表示属于真核藻组的真核生物，其包括青藻门(Glaucophyta)或青绿藻门(Glaucocystophyta)、红藻门(Rhodophyta)、衣原藻门(Chlorobionta)或绿色藻门(Viridiplantae)、隐藻门(Cryptophyta)、眼虫藻门(Euglenozoa)、丝足藻门(Cercozoa)、定鞭藻门(Haptophyta)或金藻门(Prymnesiophyta)、甲藻门(Dinophyta)和褐藻门(Ochrophyta)或褐藻植物门(Heterokontophyta)的分支。

术语“褐藻(algue Ochrophyte)”或“褐藻(Ochrophyte)”旨在表示属于褐藻门(Ochrophyta)(也称为褐藻植物门、褐藻或原生藻门(hétérocontophytes))分支的藻。褐藻是藻界(Chromista)的金棕色真核藻。

术语“海藻”或“海藻(Marista)”旨在表示属于海藻子分支的褐藻。海藻子分支特别包括褐藻纲(Phaeophyceae)和海金藻纲(Pelagophyceae)。

术语“褐藻(algue brune)”旨在表示属于褐藻纲的生物体，也称为褐藻纲(Phaeophyceae)，并且属于褐藻门的分支。褐藻使用叶绿素c以及褐色颜料岩藻黄素作为聚光颜料。它们的大小从微观尺度到大约十米长不等。褐藻尤其包括外子藻属(Ectocarpus)和马尾藻属(Sargassum)的藻。

术语“海金藻(algue pélagophyte)”或“海金藻(pélagophyte)”旨在表示属于海金藻纲的藻类生物体，也被称为海金藻，并且属于褐藻门的分支。海金藻构成了一小组真核微藻。

术语“外子藻属(Ectocarpus sp.)”旨在表示属于褐藻纲外子藻属(Ectocarpus)的藻，其属于外子藻科(Ectocarpaceae)。外子藻属特别包括外子藻(Ectocarpussiliculosus)菌种。

术语“马尾藻属(Sargassum sp.)”或“马尾藻属”旨在表示褐藻纲的马尾藻属的藻，其属于马尾藻科(Sargassaceae)。马尾藻属特别包括宾德马尾藻(Sargassum binderi)菌种(以下也称为Sbi)。

术语“金球藻属(Aureococcus sp.)”旨在表示金球藻纲(pélagophyte)金球藻属的藻。金球藻属特别包括抑食金球藻菌(Aureococcus anophagefferens)种(以下也称为Aa)。

术语“假单胞菌属”旨在表示革兰氏阴性(Gram-)细菌，其不形成孢子(或无孢子)，其为杆状形式、必须需氧的假单胞菌属。假单胞菌属特别地包括荧光假单胞菌种(以下也称为Pf)。

术语“PHLD.Pf”旨在无区别地表示编码荧光假单胞菌的PHLD间苯三酚合酶的基因，以及该基因的所有产物，包括由该基因编码的ARN和多肽。

术语“PKS1.Es”或“PHLD.Es”旨在无区别地表示编码外子藻的PKS1间苯三酚合酶的基因，以及该基因的所有产物，包括由该基因编码的ARN和多肽。

术语“PhlD”或“PHLD”在本文中表示编码候选间苯三酚合酶的候选基因，以及该基因的所有产物，包括由该基因编码的ARN和多肽。根据发明人选择的命名法，术语“PhlD.ii”或“PHLD.ii”在这里表示来自给定生物体的候选基因或候选多肽。字母“ii”代表所述生物体所属的属和菌种。

术语“核酸分子”旨在表示任何长度的脱氧核糖核酸(ADN)或多脱氧核糖核苷酸的聚合物，特别是包括互补ADN或ADNc、基因组ADN、质粒、载体、病毒基因组、分离的ADN、探针、引物及其任何混合物；或任何长度的核糖核酸(ARN)或多核糖核苷酸的聚合物，尤其包括信使ARN或ARNm、反义ARN；或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它们涵盖单链或双链、线性或环状以及天然或合成的多核苷酸。另外，多核苷酸可以包含非天然核苷酸，并且可以被非核苷酸组分中断。

在本发明的上下文中，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用。

术语“分离的分子”旨在表示从其天然环境中提取的分子，特别是蛋白质、多肽、肽、核酸分子、质粒载体、病毒载体或宿主细胞(也就是说，从与其天然相关的至少一个其他组分中分离)。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”旨在表示氨基酸残基的聚合物，其包含通过肽键结合的至少九个氨基酸。该聚合物可以是直链、支链或环状的。该聚合物可以包含天然氨基酸和/或氨基酸类似物，并且其可以被非氨基酸残基中断。作为一般说明并且不将其束缚于本申请中，如果氨基酸聚合物包含多于50个氨基酸残基，则其优选地称为多肽或蛋白质，而如果该聚合物由50个或更少氨基酸组成，则优选地其被称为“肽”。

术语“载体”旨在表示载体，优选核酸分子或病毒颗粒，其包含使一个或多个核酸分子能够被施用于宿主细胞或生物体、在宿主细胞或生物体中传播和/或在宿主细胞或生物体中表达所需的元件。

从功能的角度来看，该术语涵盖维持载体(克隆载体)、在各种宿主细胞或生物体中表达的载体(表达载体)、染色体外载体(例如多拷贝质粒)或整合载体(例如设计用于整合入宿主细胞的基因组，并且当宿主细胞复制时产生其包含的核酸分子的其他副本)。该术语还涵盖穿梭载体(例如，其在原核宿主和/或真核宿主中均起作用)和转移载体(例如，用于将核酸分子转移至宿主细胞的基因组中)。

从结构的角度来看，根据本发明的载体可以是天然的、合成的或人工的遗传来源，或天然和人工的遗传元件的组合。

因此，在本发明的上下文中，术语“载体”应被广义地理解，同时包括质粒载体(或质粒)和病毒载体。

如本文所用，“质粒”表示可复制的ADN构建体。通常，质粒载体包含选择性标记基因，其允许在存在对应于选择性标记物的化合物时鉴定和/或选择携带质粒的宿主细胞为阳性或阴性。多种阳性和阴性选择性标记基因是本领域已知的。通过举例说明，可以将抗生素抗性基因用作阳性选择性标记基因，用于在存在相应抗生素时选择宿主细胞。

如本文所用，术语“病毒载体”是指包含病毒基因组的至少一种元件并且可以包装在病毒颗粒或病毒颗粒中的核酸载体。病毒载体可以是具有复制能力的或选择性的(例如，设计成在特定宿主细胞中更好地或选择性地复制)，或者可以是基因失活的，从而是复制缺陷或复制不足。

术语“宿主细胞”旨在表示包含根据本发明的核酸分子的细胞。再次有利地，宿主细胞能够表达具有间苯三酚合酶活性的多肽和/或产生本发明载体。有利地，宿主细胞能够合成间苯三酚。

宿主细胞可以由单一类型的细胞或一组不同类型的细胞组成。宿主细胞也可以是杂合细胞，也就是说，由至少两种不同类型的细胞融合产生的细胞。

宿主细胞可以属于培养的细胞系、原代细胞、干细胞或增殖细胞。在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”包括原核细胞、低等真核细胞如酵母细胞、以及其他真核细胞如昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(例如人或非人细胞，优选非人细胞)。

术语“宿主细胞”更广泛地包括含有或已经含有根据本发明的核酸分子的细胞，以及此类细胞的后代。宿主细胞可以例如在组织或器官或者可以在完整的生物体中得以分离或被组织。在宿主细胞在完整生物体中的情况下，所述生物体不是人。

因此清楚的是，根据本发明的“宿主细胞”是重组宿主细胞，即，容纳外源遗传物质的细胞。因此，宿主细胞不是天然存在的野生型细胞，而是通过遗传操作技术获得的分子生物学工具。

术语“同一性”旨在表示两个多肽或两个氨基酸分子之间的确切序列对应性。两个序列之间的“同一性百分比”取决于两个序列共有的相同残基的数量，并考虑到为最佳比对必须引入的间隔数和每个间隔的长度。现有技术中有各种计算机程序和数学算法可用于确定氨基酸序列之间的同一性百分比，例如在NCBI或ALIGN基础上可用的Blast程序(Atlasof Protein Sequence and Structure,Dayhoff(编辑),1981,增刊3 482-489)。用于确定核苷酸序列之间同源性的程序也可在专门的数据库中获得(例如Genbank，威斯康星州序列分析软件包，BESTFIT，FASTA和GAP程序)。作为说明，如本文所用，表述“至少80％序列同一性”代表80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在下面的详细描述中，本领域技术人员可以将实施方案单独考虑或适当地组合。

分离的多肽及其作为间苯三酚合酶的用途

发明人完全出乎意料地鉴定了在活生物体基因组中编码新型III型聚酮合酶的基因，之前不知道这些生物体编码此类酶。特别地，本发明人首次证明，这些新型III型聚酮合酶具有间苯三酚合酶活性。

因此，本发明涉及分离的多肽，其选自III型聚酮合酶，特别是选自真核褐藻的III型聚酮合酶。

本发明尤其涉及具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽，其包含与序列SEQ ID No：3具有至少80％同一性的至少一个氨基酸序列。优选地，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽包含与序列SEQ ID No：3具有至少85％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、更优选至少93％同一性、更优选至少94％同一性、再更优选至少95％同一性、再更优选至少96％同一性、再更优选至少97％同一性、再更优选至少98％同一性、甚至更优选至少99％同一性的至少一个氨基酸序列。

根据一个实施方案，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽包含序列SEQ ID No：3的至少一个氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽具有序列SEQ IDNo：3的氨基酸序列，其序列在下表2中表示。

有利地，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽是抑食金球藻的分离的PHLD多肽，特别是SEQ ID No：3的PHLD-1.Aa。实际上，发明人完全出乎意料地鉴定了一种新的蛋白质PHLD-1.Aa，在本领域技术人员可以获得的各种数据库中并没有描述该蛋白质。发明人已经表明，这种新的PHLD-1.Aa蛋白质是III型聚酮合酶，并且其具有间苯三酚合酶活性。

根据一个实施方案，从培养的抑食金球藻菌株中分离具有间苯三酚合酶活性的多肽。

根据一个实施方案，具有间苯三酚合酶活性的多肽是从表达所述多肽的异源宿主细胞中分离的，所述宿主细胞如上文所定义和下文“宿主细胞”部分中所述。

根据一个实施方案，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽通过本领域技术人员完全熟知如何定义的蛋白质合成技术的方式在体外合成。

根据一个实施方案，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽是重组的。

本发明还涉及选自III型聚酮合酶的分离的多肽作为间苯三酚合酶的用途，优选地排除荧光假单胞菌的III型聚酮合酶PHLD和选自pKS1.Es、pKS2.Es和pKS3.Es的外子藻的III型聚酮合酶，更优选排除pKS1.Es。

根据一个实施方案，所述多肽选自藻(优选真核藻)的III型聚酮合酶。

本发明尤其涉及选自藻的III型聚酮合酶的至少一种多肽作为间苯三酚合酶的用途，其中排除选自PKS1.Es、PKS2.Es和PKS3.Es的外子藻的III型聚酮合酶。

在一个优选的实施方案中，所述多肽选自褐藻的III型聚酮合酶，优选马里斯塔藻的III型聚酮合酶，更优选属于褐藻纲或灵藻纲的藻的III型聚酮合酶。

有利地，所述多肽包含与选自SEQ ID No：1和SEQ ID No：3的序列具有至少80％同一性的至少一个氨基酸序列，SEQ ID No：1和SEQ ID No：3的序列在下表2中表示。

根据一个实施方案，所述分离的多肽选自褐藻的III型聚酮合酶，优选地排除选自PKS1.Es、PKS2.Es和PKS3.Es的外子藻的III型聚酮合酶，优选地排除PKS1.Es。有利地，所述分离的多肽选自马尾藻属藻的III型聚酮合酶，尤其是宾德马尾藻的III型聚酮合酶。

根据另一个有利的实施方案，所述多肽选自灵藻的III型聚酮合酶。有利地，所述分离的多肽选自金球藻属藻的III型聚酮合酶，特别地抑食金球藻的III型聚酮合酶。

根据一个实施方案，所述多肽包含至少一个氨基酸序列，其优选地与选自SEQ IDNo：1和SEQ ID No：3的序列具有至少80％的同一性、更优选至少85％的同一性、更优选至少90％的同一性、甚至更优选至少91％的同一性、再更优选至少92％同一性、甚至更优选至少93％同一性、甚至更优选至少94％同一性、更优选至少95％同一性、更优选至少96％同一性、甚至更优选至少97％同一性、再更优选至少98％的同一性、甚至更优选至少99％的同一性。

根据一个特别有利的实施方案，所述多肽包含选自SEQ ID No：1和SEQ ID No：3的至少一个氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽具有选自SEQ IDNo：1和SEQ ID No：3的氨基酸序列。

有利地，具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽选自宾德马尾藻的具有间苯三酚合酶活性的PHLD.Sbi的分离的多肽和抑食金球藻的具有间苯三酚合酶活性的PHLD-1.Aa的分离的多肽。

分离的核酸分子

本发明涉及编码至少一种选自III型聚酮合酶，特别是选自真核褐藻的III型聚酮合酶的多肽的分离的核酸分子。

有利地，所述多肽如上所述。

根据一个实施方案，分离的核酸分子包含控制至少一种编码如上所定义的多肽的核酸序列表达的启动子。因此，根据一个实施方案，本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含至少一种编码选自如上所定义的III型聚酮合酶的多肽的核酸序列，并且还包含控制所述至少一个核酸序列表达的启动子。

有利地，该启动子是外源性启动子，特别是酵母启动子，优选选自ADH2(pADH2)和CCW12(pCCW12)的启动子，更优选选自酿酒酵母的ADH2(pADH2)和酿酒酵母的CCW12的启动子，更优选选自SEQ ID No：7的ADH2(pADH2)和SEQ ID No：8的CCW12启动子。

根据一个实施方案，分离的核酸分子包含至少一个编码如上定义的多肽的核酸序列的转录终止子。因此，根据一个实施方案，本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含至少一种编码选自如上所定义的III型聚酮合酶的多肽的核酸序列，并且还包含控制所述至少一种核酸序列表达的终止子。

有利的是，所述终止子是外源性终止子，特别是酵母终止子，优选为RPL3终止子(tRPL3)，更优选为酿酒酵母的RPL3终止子，更优选为SEQ ID No：9的RPL3终止子。

根据一个优选的实施方案，分离的核酸分子包含如上定义的启动子和终止子。因此，根据一个实施方案，本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含至少一种编码选自如上所定义的III型聚酮合酶的多肽的核酸序列，并且还包含控制所述至少一种核酸序列表达的启动子和终止子。

根据一个实施方案，所述核酸分子还包含输出序列。有利地，该输出序列允许在细胞培养基中分泌或排出由所述核酸分子编码的多肽。

根据一个实施方案，核酸分子从培养物的同源菌株中分离，所述菌株优选选自宾德马尾藻和抑食金球藻。

根据一个实施方案，核酸分子从包含所述分子的异源载体或宿主细胞中分离，所述载体或所述宿主细胞如以下“载体”或“宿主细胞”部分中所定义。

根据一个实施方案，通过本领域技术人员完全熟知如何定义的核酸合成技术在体外合成分离的核酸分子。

根据一个实施方案，分离的核酸分子是重组的。

序列PHLD-1.Aa的分离的核酸分子

根据另一方面，本发明涉及包含序列PHLD-1.Aa的分离的核酸分子。

根据以上定义，术语“PHLD-1.Aa”旨在无区别地表示编码抑食金球藻的间苯三酚合酶PHLD-1.Aa的基因，以及该基因的所有产物，包括该基因编码的ARN和多肽。

根据一个实施方案，包含PHLD-1.Aa序列的分离的核酸分子包含至少一个与序列SEQ ID No：4具有至少80％同一性的核酸序列。优选地，所述分离的核酸分子包含至少一个与序列SEQ ID No：4具有至少85％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、更优选至少93％同一性、甚至更优选至少94％同一性、再更优选至少95％同一性、再更优选至少96％同一性、再更优选至少97％同一性、再更优选至少98％同一性、甚至更优选至少99％同一性的核酸序列。

根据一个实施方案，包含PHLD-1.Aa序列的分离的核酸分子包含序列SEQ ID No：4的至少一个氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述分离的核酸分子具有序列PHLD-1.Aa。优选地，所述PHLD-1.Aa序列是序列SEQ ID No：4，其序列在下表2中显示。

根据一个实施方案，所述分离的核酸分子是从培养的抑制食金球藻的菌株中分离的。

根据一个实施方案，所述分离的核酸分子是从包含所述分子的异源载体或宿主细胞中分离的，所述载体或所述宿主细胞如以下“载体”或“宿主细胞”部分中所定义。

根据一个实施方案，所述分离的核酸分子通过本领域技术人员完全熟知如何定义的核酸合成技术的方式在体外合成。

根据一个实施方案，所述分离的核酸分子是重组的。

根据各种实施方案，所述分离的核酸分子是根据上文“分离的核酸分子”部分中的描述。

特别地，所述分离的核酸分子可包含转录启动子和/或终止子和/或输出序列(更多细节参见上文)。

载体

本发明涉及包含至少一个如上所述的核酸分子的载体。

适用于本发明上下文的载体包括但不限于，例如用于在原核宿主细胞如细菌(例如大肠杆菌或假单胞菌属细菌)中表达的噬菌体、质粒或粘粒载体；用于在酵母中表达的载体(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))；用于在昆虫细胞系统中表达的杆状病毒载体(例如，Sf9细胞)；用于在植物细胞系统中表达的病毒和质粒载体(例如，Ti质粒、花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)；以及用于在高等真核细胞或生物体中表达的病毒和质粒载体。

这些载体通常是可商购的(例如，购自诸如Invitrogen、Stratagene、AmershamBiosciences、Promega等的供应商)，从诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md)的保藏机构获得，或已经有许多出版物主题描述了它们的序列、它们的结构和生产它们的方法，因此本领域技术人员可以毫无困难地应用它们。

合适的质粒载体的代表性示例包括但不限于，pREP4、pCEP4(Invitrogen)、pCI(Promega)、pVAX(Invitrogen)和pgWiz(Gene Therapy System Inc)。

因此，有利地，载体是质粒。

宿主细胞

在另一方面，本发明涉及包含至少一个如上所述的核酸分子或至少一个载体的宿主细胞。

根据各种实施方案，所述宿主细胞，特别是上述的所述异源宿主细胞可以是原核细胞、低等真核细胞如酵母细胞、以及其他真核细胞如昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(例如，人或非人细胞，优选非人细胞)。

有利地，宿主细胞是选自细菌、酵母、真菌、藻和蓝藻的微生物。

宿主细胞优选是酵母，所述酵母特别地选自酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、阿舒菌属(Ashbya)、德克拉菌属(Dekkera)、毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、克拉维孢菌属(Clavispora)、娄德酵母属(Lodderomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、合子酵母菌属(Zigosaccharomyces)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、孢圆酵母菌属(Torulaspora)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、酒香酵母菌属(Brettanomycces)、隐球菌属(Cryptococcus)和马拉色菌属(Malassezia)。

甚至更特别地，酵母选自菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酿酒酵母(Saccharomyces boulardii)、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、巴氏酵母(Saccharomyces bayanus)、拜耳接合酵母(Zigosaccharomyces bailii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、布氏德克拉菌(Dekkera brucelensis)、中间德克拉菌(Dekkera intermedia)、卡斯特酒香酵母菌(Brettanomycces custersii)、中间酒香酵母菌(Brettanomycces intermedius)、嗜热克鲁维酵母(Kluyveromyces themotolerens)、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)和光滑球拟酵母(Torulaspora glabrata)。

甚至更特别地，酵母是酿酒酵母属的酵母，优选地是酿酒酵母菌种的酵母。

根据一个实施方案，宿主细胞包含整合到其基因组中的至少一个拷贝的如上所定义的核酸分子。

根据一个实施方案，宿主细胞包含整合到其基因组中的如上定义的核酸分子的单个拷贝。

当宿主细胞是酵母细胞时，核酸分子的一个或多个拷贝可以整合在多个基因座，优选地整合在所述酵母细胞基因组的URA3基因座、JLP1基因座、LEU2基因座或TRP1基因座。当宿主细胞是酵母细胞并且整合了核酸分子的几个拷贝时，多个拷贝可以整合在相同的基因座上，或者整合在不同的基因座上，优选地整合在URA3、JLP1、LEU2和/或TRP1基因座的任何组合中。

有利地，核酸分子中使用的密码子已经被调整为在所选宿主细胞中最佳表达。

当所选择的密码子是宿主细胞起源生物体优先使用的那些密码子时，尤其可以获得最佳表达。对于本领域中通常使用的大多数生物体来说，优先使用的密码子是已知的。本领域技术人员将能够容易地确定将被用作所选择宿主细胞功能的最有利的密码子。

为此，本领域技术人员知道使用哪种技术来修饰核酸分子的密码子。例如，可以通过使用聚合酶链反应(PCR)扩增的方法，使用有待调整密码子的核酸分子的样品，通过体外定点诱变来修饰密码子。或者，可以用优化的密码子直接在体外合成核酸分子。

宿主细胞可以在小规模和大规模的需氧或厌氧生物反应器中、烧瓶或培养皿中培养。培养可以在适合给定宿主细胞的温度、pH、培养基和氧含量下进行。

方法

生产具有间苯三酚合酶活性的多肽的方法

本发明还涉及生产如上定义的具有间苯三酚合酶活性的多肽的方法。

根据一个实施方案，生产如上定义的具有间苯三酚合酶活性的多肽的方法至少包括以下步骤：

(i)将如上所述的核酸分子或载体引入根据之前描述的合适的宿主细胞中；和

(ii)在允许所述宿主细胞生长和/或表达所述核酸分子的条件下体外培养步骤(i)中获得的所述宿主细胞，以生产所述多肽。

根据另一个实施方案，生产如上定义的具有间苯三酚合酶活性的多肽的方法至少包括以下步骤：

(i)在允许所述宿主细胞生长和/或表达所述宿主细胞中包含的核酸分子的条件下，体外培养表达所述多肽的宿主细胞，例如如上所述的宿主细胞，从而生产所述多肽。

有利地，生产具有间苯三酚合酶活性的多肽的方法包括选自以下步骤的至少一个额外步骤：

(α)回收在培养步骤后获得的表达所述多肽的细胞；和

(β)从步骤(α)中回收的细胞中纯化多肽。

生产间苯三酚的方法

本发明还涉及生产间苯三酚的方法。

根据一个实施方案M1，生产间苯三酚的方法至少包括以下步骤：

(i)通过实施上述方法之一获得细胞；

(ii)使步骤(i)中获得的细胞与合适的底物接触；

(iii)在适于生产间苯三酚的条件下孵育步骤(ii)得到的混合物；

(iv)任选地，回收在步骤(iii)之后获得的包含间苯三酚的反应介质；和

(v)任选地，从步骤(iv)的反应介质中纯化间苯三酚。

根据另一个实施方案M2，生产间苯三酚的方法包括以下步骤：

(i)使如上所述表达具有间苯三酚合酶活性的多肽的宿主细胞(例如如上定义的宿主细胞)与合适的底物接触；

(ii)在允许所述宿主细胞生长和/或表达所述宿主细胞中包含的核酸分子的条件下体外培养步骤(i)的宿主细胞，以产生间苯三酚；

(iii)任选地，回收在步骤(ii)之后获得的包含间苯三酚的培养基；和

(iv)任选地，从步骤(iii)的培养基中纯化间苯三酚。

为了方法M1和M2的目的，所述底物是碳源。有利地，碳源是纯碳源或工业副产品(例如糖蜜或绿色糖浆，例如来自制糖业)。优选地，纯碳源或工业副产品中的底物是单糖，例如葡萄糖(或右旋糖)、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖；复合糖，例如单糖、二糖或三糖，或者多糖，例如淀粉；醇，例如乙醇；酸；脂肪酸及其酯衍生物；或糖、醇、酸和/或脂肪酸或其酯衍生物的混合物。

优选地，底物是葡萄糖或蔗糖。或者，底物是乙醇。

根据另一个实施方案M3，生产间苯三酚的方法至少包括以下步骤：

(i)使在上述方法的步骤(β)中获得的至少一种多肽与合适的底物接触；

(ii)在适合于生产间苯三酚的条件下孵育步骤(i)得到的混合物；

(iii)任选地，回收在步骤(ii)之后获得的包含间苯三酚的反应介质；和

(iv)任选地，从步骤(iii)的反应介质中纯化间苯三酚。

根据另一个实施方案M4，生产间苯三酚的方法至少包括以下步骤：

(i)使至少一种如上定义的多肽与合适的底物接触；

(ii)在适合生产间苯三酚的条件下孵育步骤(i)得到的混合物；

(iii)任选地，回收在步骤(ii)之后获得的包含间苯三酚的反应介质；和

(iv)任选地，从步骤(iii)的反应介质中纯化间苯三酚。

为了方法M3和M4的目的，底物是硫酯。有利地，底物是酰基辅酶A(或酰基-CoA)，例如丙二酰基-CoA、乙酰基-CoA、己酰基-CoA、癸酰基-CoA、月桂酰基-CoA和棕榈酰基-CoA、或其混合物。优选地，底物是丙二酰基-CoA。

根据一个优选的实施方案，间苯三酚的纯化通过液-液提取进行。

以下实施例旨在说明本发明而没有任何限制。

本文中使用分别由荧光假单胞菌的PHLD基因(Zha等人，2006)和外子藻的PKS1基因(Meslet-Cladière等人，2013)编码的酶作为对照。

实施例

实施例1：新型候选间苯三酚合酶的鉴定

直到本发明，仅鉴定和表征了两种间苯三酚合酶：

-荧光假单胞菌的PHLD基因编码的酶(Zha等人，2006)，和

-外子藻的PKS1基因编码的酶(Meslet-Cladière等人，2013)。

发明人现在已经使用遗传和功能分析发现并表征了新型间苯三酚合酶。

如以上介绍中所述，聚酮合酶的确切功能表征是复杂的，因为这类酶组合了具有高序列相似性的蛋白质，尽管这些蛋白质可以催化基本上不同的反应并识别完全不同的底物。

1.1.选择新的候选酶

为了鉴定新的间苯三酚合酶，发明人鉴定了编码推定的III型聚酮合酶的序列。使用具体由Meslet-Cladière等人，2013发表的III型聚酮合酶比对作为基础，对本发明人如此鉴定的这些推定的III型聚酮合酶的序列进行分析和相互比对。

对该序列比对的分析得到一组候选酶的选择，其蛋白质序列与藻外子藻的PKS1.Es基因产物的蛋白质序列接近(表1和表2)。

表1：鉴定的推定III型聚酮合酶。阴影行表示具有已知间苯三酚合酶活性的酶。

表2：鉴定的推定III型聚酮合酶的蛋白质或核酸序列

图1显示了藻PKS1.Es、PHLD.Sbi和PHLD-1.Aa以及荧光假单胞菌细菌PHLD.Pf中酶或候选蛋白质序列的比对。使用Clustal W软件进行所选的两种候选酶以及PKS1.Es与PHLD.Pf酶的比对。

表3显示了这些不同酶之间存在的序列同一性矩阵。

表3：各种候选酶之间存在的序列同一性的矩阵。

结果表明PKS1.ES藻的酶与细菌酶PHLD.Pf之间存在的系统发生的距离相当可观，因为在这两种酶之间观察到的同一性低于25％。因此，由于这种强的序列差异，不可能事先指定所研究的推定聚酮合酶具有间苯三酚合酶的功能。

1.2.在酵母中测量间苯三酚合酶的活性

为了在上述鉴定的候选物中鉴定间苯三酚合酶，开发了一种提取和分析间苯三酚的方法，如下所述。

1.2.1.间苯三酚提取方法

该方法使用间苯二酚作为内部标准开发。各种测试导致开发了在pH 4.0、在乙酸乙酯作为溶剂存在下、通过用NaCl使水相饱和来进行液-液提取的方法。提取在循环摇动下进行30分钟。除去有机相，并在30℃的氮N₂流下蒸发掉乙酸乙酯溶剂。然后将完全蒸发后获得的干提取物吸收到预定体积的50％-50％乙醇/H₂O混合物中。

在高压色谱法后通过质谱测量提取收率，使用0.03％的甲醇酸(HCOOH)/乙腈(ACN)梯度在C18柱(尺寸：100mm×2.1mm；粒径：1.7μm)上进行。

使用在用于酵母生长的培养基中制备的间苯三酚和间苯二酚的溶液确定和测量提取收率。间苯三酚浓度对应于测定范围的最低点(20μg.mL^-1)和最高点(200μg.mL^-1)。间苯二酚浓度对应于在测定过程中作为内部标准添加的浓度(200μg.mL^-1)。结果列于表4。

表4：根据所述方法，用乙酸乙酯提取的间苯三酚(20和200μg.mL^-1)和间苯二酚(200μg.mL^-1)的提取收率

1.2.2.开发UPLC/UV和UPLC/Mass分析方法

开发了一种通过UPLC色谱法和UV(紫外辐射)吸光度测量进行的分析方法。提取物在尺寸为100×2.1mm，1.8μm的五氟苯基丙基(PFP)柱上、根据0.1％HCOOH/ACN-0.1％HCOOH的梯度进行色谱分离。间苯三酚在230nm处通过UV检测。还开发了UPLC质谱(UPLC/Mass)方法。

使用酵母培养基(酵母抽提物1％，BactoPeptone 2％)中稀释的范围20-200μg.mL^-1的间苯三酚，在存在固定量的间苯二酚作为内部标准的情况下进行定量。通过计算间苯三酚/间苯二酚色谱峰的表面比率来测定间苯三酚的量。

图2表示在PFP柱上获得的间苯三酚/间苯二酚色谱峰的示例。

因此，该测定方法使得可以可靠地定性和定量地测量样品中存在的间苯三酚。

UPLC质谱法(UPLC/mass)使测定含有间苯三酚浓度为2至50μg/ml的样品成为可能。

实施例2：重构作为抑食金球藻PHLD.Aa酶的间苯三酚合酶的活性形式

使用数据库中标注的抑食金球藻序列(标注为PHLD.Aa)(实施例1中鉴定为推定的III型聚酮合酶)进行活性测试的第一次结果，未获得间苯三酚的产生(参见下面的实施例3)。

为了理解这种活性缺失，对相应的PHLD.Aa基因的序列进行了比较分析。在标注了抑食金球藻的基因组后描述了该序列(基因组序列的版本AURANDRAFT_25482)。

对该序列的比较分析能够令人惊讶地证明，在数据库中标注的PHLD.Aa酶的氨基末端部分的蛋白质序列显著短于其他3种酶或候选物的序列。因此，该结果将暗示基因组标注中的错误。

因此在抑食金球藻基因组的版本AURANDRAFT-25482中搜索了编码类似于宾德马尾藻的候选基因PHLD.Sbi氨基末端部分的蛋白质序列的核酸序列。为此，使用Blast软件比对了PHLD.Sbi蛋白质的氨基末端部分的蛋白质序列与抑食金球藻基因组的序列重叠群6个框架翻译所得的序列。该搜索的结果如图3所示。

图3表明抑食金球藻基因组确实含有一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码的肽序列与PKS1.Es和PHLD.Sbi基因的氨基末端部分非常相似。

图4显示了编码肽序列的抑食金球藻基因组序列的位置，所述肽序列与基因组数据库中注释的位于PHLD.Aa基因序列的5'(深灰色箭头)的PHLD.Sbi的氨基末端部分(由两个黑色箭头框出的浅灰色突出显示的序列)同源。因此，该序列位于如标注的抑食金球藻基因组中PHLD.Aa基因的5'部分的上游，并被约300个碱基对的非编码核苷酸序列与PHLD.Aa基因隔开。

在抑食金球藻基因组中无缘无故维持这种结构的可能性很小。因此，可能的是，该300个碱基对的序列对应于内含子序列，或对应于数据库中基因组序列的组装错误。这些结果表明，PHLD.Aa酶的序列实际上是由图5中所示的重构序列编码的这两个肽序列组合组成。

因此，发明人通过将这两个序列组合以形成称为PHLD-1.Aa的蛋白质，从而重构了抑食金球藻酶的完整序列。这两个序列的连接导致建立了PHLD-1.Aa肽序列，该肽序列具有与PHLD.Sbi相似的氨基末端部分(图5)。

编码重构的PHLD-1.Aa酶的核苷酸序列与其他PHLD候选基因的序列的比对证实了PHLD-1.Aa序列与实施例1中鉴定的其他候选更相似(数据未显示)。

对重构的PHLD-1.Aa酶的三维结构进行了建模，并与外子藻的PKS1酶进行了比较(由Meslet-Cladière等人，2013年建立)。显而易见的是，本文鉴定的氨基末端序列的添加可以使这两个酶的结构更好地并置，其二聚体形式如图6所示。

在ADH2启动子的控制下克隆了PHLD-1.Aa酶，并将得到的基因构建体整合在W303酵母菌株的URA3基因座上(多拷贝整合)。在20g.L^-1的乙醇作为碳源存在下，培养获得的转化体，并在30℃培养48小时后测量间苯三酚的产生。

获得的结果表明，与表达源自标注基因组的“截短的”PHLD.Aa形式的酵母菌株不同，表达重构的PHLD-1.Aa形式的酵母细胞产生了显著量的间苯三酚(约200mg.L^-1，参见下面的实施例3)。因此，这些结果证实了数据库中存在的PHLD.Aa序列是不完整的，并且发明人对基因组序列中氨基末端部分的鉴定使得有可能建立来自抑食金球藻的PHLD-1.Aa形式，其构成一种新的间苯三酚合酶。

实施例3：鉴定新功能的间苯三酚合酶

3.1.在酿酒酵母中多拷贝形式的候选基因的表达

通过调节用于酿酒酵母中最佳表达的密码子，合成了2个候选基因PHLD-1.Aa和PHLD.Sbi，以及编码迄今已鉴定的两种间苯三酚合酶的PHLD.Pf和PKS1.Es基因(用作对照)(见表1；阴影行)，以及候选基因PHLD.Aa。

进行这种密码子调整是为了优化这些不同基因在酵母细胞中的表达(这5个合成基因编码的蛋白质与原始生物体表达的蛋白质或推定蛋白质严格相同)。将这些基因中的每一个置于相同的酵母启动子ADH2(pADH2)的控制下，特别是在培养基中含有乙醇作为碳源的情况下，允许其表达。RPL3酵母基因(tRPL3)的转录终止子位于ADH2启动子控制下5个基因中每一个的下游。

图7显示了如此构建的候选或给定对照(PHLD.ii)基因单元的示例。

如此构建的各种基因单元被独立地整合到酿酒酵母野生型菌株的基因组的URA3基因座上。使用的野生型菌株是商业菌株W303(基因型：MAT-a、his3、leu2、trp1、ura3、ade-)。所使用的整合技术允许整合每个基因单元多个拷贝数目。对于每个构建体，根据常规Taqman方法通过定量PCR确定整合的基因单元的拷贝数。

将表达上述3个PHLD.ii候选基因或PHLD.Pf和PKS1.Es对照基因中每一种的多个拷贝数的酵母菌株在存在作为碳源的20g.L^-1乙醇的情况下在30℃下培养48小时。因此，分析了上述基因单元在URA3基因座上转化和整合后独立获得的5个酵母菌株产生间苯三酚的能力。在相同条件下培养W303野生型亲本菌株并用作对照。

在600nm(DO₆₀₀)下测量了各种培养物的光密度(DO)，由此表明每种菌株的生长水平(图8A和图8B)。

使用如上1.2节中所述开发的提取和测定方法，测试了在ADH2启动子控制下表达各种PHLD.ii基因的各种酵母菌株合成间苯三酚的能力。在培养基中测量间苯三酚的生产水平(以mg.L^-1计)(图8A和图8C)。

图8显示所有表达不同拷贝数的PHLD.Sbi、PHLD-1.Aa和PKS1.Es基因的菌株均产生显著量的间苯三酚，所述间苯三酚排入培养基中(图8A、图8C和图8D)。因此，这些结果表明这3个基因中的每一个都表达在酵母中有活性的间苯三酚合酶。

令人惊讶地，结果表明，在测试条件下PHLD.Aa候选酶不显示间苯三酚合酶活性。发明人能够证明以下事实：在数据库中标注的PHLD.Aa蛋白质的氨基末端部分显著短于其他PHLD(参见实施例2)。在测试的条件下，PHLD-1.Aa候选酶对于其部分，显示出显著的间苯三酚合酶活性。这些结果表明，根据实施例2重构和重新标注的基因(PHLD-1.Aa)产生了在酵母中有功能的PHLD间苯三酚合酶。

此外，如所预期的，在W303对照亲本菌株中未检测到间苯三酚的产生(数据未显示)。

因此，这项功能研究使得可能鉴定出两种新的间苯三酚合酶，分别由PHLD.Sbi和PHLD.-1Aa基因编码。这项研究首次揭示了藻宾德马尾藻和抑食金球藻编码功能性间苯三酚合酶(PHLD.Sbi和PHLD-1Aa)。这项研究还首次揭示了PKS1.ES酶在异源真核系统(即酵母)中表达时的功能。

这项研究还出乎意料地揭示了PHLD.Pf不编码在酵母中发挥功能的间苯三酚合酶。该结果令人惊讶，因为在大肠杆菌中表达时证实了由PHLD.Pf编码的酶表现出间苯三酚合酶活性(Achkar等人，2005)。

3.2.在酿酒酵母中以单拷贝形式表达候选基因

还评估了仅整合了选择和鉴定为在酵母中有功能的PHLD.ii候选基因的单拷贝的菌株产生的间苯三酚(参见前一节的结果和图8)。根据上文第3.1节中所述的结果，编码在酵母中有功能的间苯三酚合酶的PKS1.Es基因用作阳性对照。

将这些基因中的每一个置于允许其表达的酵母启动子ADH2(pADH2)的控制下(尤其是在培养基含有乙醇作为碳源时)，或者置于允许其表达的酵母启动子CCW12(pCCW12)的控制下(尤其是在培养基中含有葡萄糖作为碳源的糖酵解过程中)。RPL3酵母基因(tRPL3)的转录终止子置于每个构建体的下游。

所产生的各种基因构建体的细节在图9中报道。

在存在20g.L^-1乙醇作为碳源(由pADH2控制的构建体)或存在20g.L^-1葡萄糖(由pCCW12控制的构建体)时，在30℃下培养表达单拷贝PHLD或PKS1的酵母菌株48小时(图10和图11)。培养菌株并分析其产生间苯三酚的能力。

在600nm下测量各种培养物的光密度(指示每种菌株的生长水平；图10A和图10B以及图11A和图11B)，对于每个构建体的2个独立的转化体，在培养基中测量间苯三酚的产量(以mg.L^-1计)(图10A和图10C以及图11A和图11C)。

图10显示了在ADH2启动子控制下表达单拷贝PHLD.Sbi和PHLD-1.Aa基因的菌株合成了可测量的显著量的间苯三酚，所述间苯三酚被分泌到培养基中(图10A和图10C)。

对于在存在葡萄糖作为碳源的情况下进行的培养，在CCW12启动子控制下表达单拷贝PKS1.Es、PHLD.Sbi和PHLD-1.Aa基因的菌株全部合成间苯三酚，但是其量比存在乙醇作为碳源下进行的培养更高(图11A和图11C)。

以上获得的结果证实了在上文第3.1节中描述的含有几个拷贝的间苯三酚合酶的菌株中获得的结果。因此，PHLD.Sbi和PHLD-1.Aa候选酶的表达使得酵母细胞显著产生间苯三酚。这些结果表明这些基因编码间苯三酚合酶，而且这些间苯三酚合酶在酵母细胞中是有活性的。

另外，这些结果表明，即使表达单拷贝的编码间苯三酚合酶的基因，间苯三酚的产生水平也很高。此外，在包含单一拷贝的菌株中测得的活性，与包含多拷贝形式PHLD.ii基因的菌株中所测得并除以插入的每个基因的拷贝数所获得活性相当(因此，还是与每个基因的1个拷贝相关)。

这些结果首次证实了在宾德马尾藻和抑食金球藻中存在间苯三酚合酶活性。

3.3.其他观察

发明人进行的并在此报道的研究，使得能够鉴定出藻中具有间苯三酚合酶活性的2种新型酶(PHLD.Sbi和PHLD-1.Aa)。

这些结果还首次并明确地证明在酵母细胞中合成间苯三酚是可能的。

重要的是要注意，合成的间苯三酚超过95％被酵母细胞分泌到培养基中。这种特别有效的分泌对于间苯三酚生物生产过程的实施是非常有利的。

最后，发明人鉴定的酶在来源物种和蛋白质序列方面都是原创的。

事实上，首次表明属于马尾藻属和金球藻属的藻编码功能性间苯三酚合酶。由于之前马尾藻属中鉴定间苯三酚合酶的尝试失败(Baharum等人，2011)，这一发现更加令人惊奇。

另外，本文首次描述了抑食金球藻的PHLD-1.Aa酶的核酸和蛋白质序列。

参考文献

Achkar J等人(2005)“Biosynthesis of phloroglucinol”J Am Chem Soc.127:5332-5333.

Baharum H等人(2011)“Molecular Cloning,Modeling,and Site-DirectedMutagenesis of Type III Polyketide Synthase from Sargassum binderi”MarBiotechnol.13:845-856.

Meslet-Cladière L,Delage L,Leroux CJ,Goulitquer S,Leblanc C,Creis E,Gall EA,Stiger-Pouvreau V,Czjzek M,和Potin P.(2013)“Structure/functionanalysis of a type III polyketide synthase in the brown alga Ectocarpussiliculosus reveals a biochemical pathway in phlorotannin monomerbiosynthesis.”Plant Cell.25:3089-3103.

Zha W,Rubin-Pitel SB和Zhao H.(2006)“Characterization of the substratespecificity of PHLD,a type III polyketide synthase from Pseudomonasfluorescens.”J Biol Chem.281:32036-32047。

序列表

<110> 米其林集团总公司

<120> III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途

<130> B374764PCTD37151

<150> FR1756108

<151> 2017-06-30

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 413

<212> PRT

<213> 宾德马尾藻

<400> 1

Met Ser Ser Ala Ala Val Ala Met Leu Ala Asp Pro Thr Val Gln Ile

1 5 10 15

Ala Leu Ala Cys Ile Val Leu Ser Leu Ile Val Val Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Arg Lys Gly Lys Asp Glu Gln Thr Val Tyr Pro Val Ile Ala Gly Met

35 40 45

Ala Ile Gly Asn Pro Gln Tyr Arg Cys Thr Gln Asp Gln Ala Leu Thr

50 55 60

Val Ala Gln Lys Cys Pro Gly Val Glu Ser Val Lys Pro Val Leu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Tyr Gly Asn Ser Arg Ile Gly Ser Arg Tyr Phe Ala Val Pro

85 90 95

Asp Phe Thr Pro Asn Gln Ala Ala Lys Gly Asp Pro Met Phe Phe Pro

100 105 110

Ala Asp Gly Ser Phe Glu Val Pro Val Asp Thr Arg Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Lys Glu Lys Ala Val Pro Leu Val Ser Asp Val Ala Arg Arg Ala Ile

130 135 140

Lys Glu Ala Gly Ile Asp Val Ser Asp Val Ser Lys Leu Val Val Val

145 150 155 160

Ser Ser Thr Gly Phe Leu Gly Pro Gly Leu Asp Cys Glu Leu Ile Lys

165 170 175

Asn Leu Gly Leu Thr Arg Ser Val Asp Arg Thr Leu Ile Gly Phe Met

180 185 190

Gly Cys Ala Ala Ala Met Asn Gly Phe Arg Asn Ala Asn Asp Phe Val

195 200 205

Thr Ala Asn Pro Gly Lys Tyr Ala Leu Met Ile Cys Val Glu Leu Ser

210 215 220

Ser Val His Thr Thr Phe Asp Asp Asn Ile Asn Asp Ala Ile Leu His

225 230 235 240

Ala Ile Phe Ala Asp Gly Cys Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly Val Arg

245 250 255

Lys Glu Ala Pro Lys Gly Thr Leu Ala Ile Val Asp Asn His Ala Trp

260 265 270

Leu Met Glu Gly Thr Glu Asp Gly Ile Thr Leu Ala Ile Lys Pro Asn

275 280 285

Gly Ile Thr Cys Thr Leu Ser Lys Phe Leu Pro Gln Tyr Ile Ala Lys

290 295 300

Asn Ile Ala Phe Phe Ala Asp Gly Phe Leu Lys Lys His Asn Leu Gly

305 310 315 320

Arg Asp Asp Val Asp Phe Trp Cys Val His Pro Gly Gly Arg Arg Ile

325 330 335

Ile Glu Glu Ala Gln Asn Gly Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln Thr Ala

340 345 350

Asp Ser Trp Ala Val Leu Ala Glu Tyr Gly Asn Met Leu Ser Pro Ser

355 360 365

Val Met Phe Val Leu Ser Arg Val Phe Lys Arg His Asn Ala Ala Leu

370 375 380

Ala Gln Gly Lys Pro Gly Tyr Gln Thr Gly Met Ala Phe Ser Phe Ser

385 390 395 400

Pro Gly Val Gly Ala Glu Gly Ile Leu Leu Arg Gln Ile

405 410

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 抑食金球藻

<400> 2

Met Pro Val Glu Lys Arg Leu Asp Met Phe Arg Glu Lys Ser Val Pro

1 5 10 15

Leu Val Thr Lys Val Cys Lys Asp Ala Met Ala Asp Ala Gly Ile Asp

20 25 30

Val Glu Gln Ile Gly Lys Leu Val Val Val Ser Ser Thr Gly Phe Leu

35 40 45

Gly Pro Gly Leu Asp Ala Glu Leu Ile Lys Thr Leu Gly Leu Trp Arg

50 55 60

Gly Val Asp Arg Ser Leu Ile Gly Phe Met Gly Cys Ala Ala Ala Met

65 70 75 80

Asn Gly Phe Arg Val Ala Asn Asp Phe Ala Met Ser His Pro Gly Lys

85 90 95

Met Ala Leu Met Val Cys Val Glu Ile Ser Ser Val His Thr Thr Phe

100 105 110

Asp Asp Asn Val Asn Asp Ala Ile Leu His Ala Ile Phe Ala Asp Gly

115 120 125

Cys Ala Ala Ala Val Ile Ser Gly Glu Lys Pro Gly Ser Ala Ala Ala

130 135 140

Lys Gly Lys Phe Gly Ile Val Asp Thr His Gly Trp Leu Met Glu Gly

145 150 155 160

Thr Glu Asp Gly Ile Thr Leu Ser Ile Asn Glu Asn Gly Ile Ser Cys

165 170 175

Ile Leu Ser Lys Tyr Leu Pro Gln Tyr Ile Ala Lys Asn Met Ala Gly

180 185 190

Tyr Val Asp Ser Phe Leu Gly Met His Gly Leu Gln Lys Thr Asp Met

195 200 205

Asp Phe Trp Ala Ile His Pro Gly Gly Arg Arg Ile Ile Glu Glu Ala

210 215 220

Gln Asn Gly Leu Gly Leu Ser Glu Glu Gln Ala Lys Tyr Ser Trp Thr

225 230 235 240

Val Leu Ser Gln Tyr Gly Asn Met Leu Ser Pro Ser Val Met Phe Val

245 250 255

Leu Glu Leu Ile Leu Asn Asp His Lys Lys Ala Leu Ala Lys Gly Glu

260 265 270

Arg Gly Leu Lys Gln Gly Ile Ala Phe Ser Phe Ser Pro Gly Val Gly

275 280 285

Ala Glu Gly Ile Leu Ile Asn Val Met

290 295

<210> 3

<211> 382

<212> PRT

<213> 抑食金球藻

<400> 3

Met Ser Lys Lys Asp Glu Lys Ile Ile Pro Val Ile Met Gly Met Ala

1 5 10 15

Thr Gly Asn Pro Pro Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gln Ala Leu Ala Ile

20 25 30

Ala Glu Ser Cys Pro Glu Cys Asn Ser Ile Lys Pro Val Leu Ala Arg

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Arg Ile Asp Tyr Arg Phe Met Ala Val Pro Asp

50 55 60

Phe Thr Pro Glu Gln Lys Leu Glu Gly Asp Glu Asn Phe Phe Asp Lys

65 70 75 80

Asp Leu Met Phe Lys Met Pro Val Glu Lys Arg Leu Asp Met Phe Arg

85 90 95

Glu Lys Ser Val Pro Leu Val Thr Lys Val Cys Lys Asp Ala Met Ala

100 105 110

Asp Ala Gly Ile Asp Val Glu Gln Ile Gly Lys Leu Val Val Val Ser

115 120 125

Ser Thr Gly Phe Leu Gly Pro Gly Leu Asp Ala Glu Leu Ile Lys Thr

130 135 140

Leu Gly Leu Trp Arg Gly Val Asp Arg Ser Leu Ile Gly Phe Met Gly

145 150 155 160

Cys Ala Ala Ala Met Asn Gly Phe Arg Val Ala Asn Asp Phe Ala Met

165 170 175

Ser His Pro Gly Lys Met Ala Leu Met Val Cys Val Glu Ile Ser Ser

180 185 190

Val His Thr Thr Phe Asp Asp Asn Val Asn Asp Ala Ile Leu His Ala

195 200 205

Ile Phe Ala Asp Gly Cys Ala Ala Ala Val Ile Ser Gly Glu Lys Pro

210 215 220

Gly Ser Ala Ala Ala Lys Gly Lys Phe Gly Ile Val Asp Thr His Gly

225 230 235 240

Trp Leu Met Glu Gly Thr Glu Asp Gly Ile Thr Leu Ser Ile Asn Glu

245 250 255

Asn Gly Ile Ser Cys Ile Leu Ser Lys Tyr Leu Pro Gln Tyr Ile Ala

260 265 270

Lys Asn Met Ala Gly Tyr Val Asp Ser Phe Leu Gly Met His Gly Leu

275 280 285

Gln Lys Thr Asp Met Asp Phe Trp Ala Ile His Pro Gly Gly Arg Arg

290 295 300

Ile Ile Glu Glu Ala Gln Asn Gly Leu Gly Leu Ser Glu Glu Gln Ala

305 310 315 320

Lys Tyr Ser Trp Thr Val Leu Ser Gln Tyr Gly Asn Met Leu Ser Pro

325 330 335

Ser Val Met Phe Val Leu Glu Leu Ile Leu Asn Asp His Lys Lys Ala

340 345 350

Leu Ala Lys Gly Glu Arg Gly Leu Lys Gln Gly Ile Ala Phe Ser Phe

355 360 365

Ser Pro Gly Val Gly Ala Glu Gly Ile Leu Ile Asn Val Met

370 375 380

<210> 4

<211> 1149

<212> DNA

<213> 抑食金球藻

<400> 4

atgtcgaaga aggatgagaa gatcatccct gtcatcatgg gtatggccac aggtaatccg 60

ccatacaggg cgagtcaaca acaagctcta gcaattgcgg agtcctgccc agaatgtaat 120

agcattaaac cggtattggc aagaatttat ggtaatagcc gtatcgacta caggtttatg 180

gcagtaccgg atttcacacc cgaacagaag cttgaaggtg acgaaaactt ctttgataaa 240

gatttaatgt ttaagatgcc agtggagaag agattggaca tgtttaggga gaagagtgtg 300

ccattagtca cgaaggtctg taaggatgcc atggcagacg ctggtataga cgttgaacag 360

attggcaaac ttgtcgtggt atcatcaact ggcttcttag gccctggact agatgcggag 420

ttaattaaga cacttggact ttggcgtggt gttgaccggt ctctgattgg attcatgggt 480

tgtgcggcgg ccatgaacgg ttttcgggtt gctaatgatt tcgccatgtc ccacccggga 540

aagatggccc taatggtttg cgtcgaaata tcctctgtgc ataccacatt cgatgataac 600

gtaaatgatg caatacttca tgcgatcttc gccgatggat gtgcagccgc agtaatatcg 660

ggagagaagc caggttctgc ggcagcgaaa ggcaaattcg gaatcgtcga tacgcatggt 720

tggctcatgg aaggcacaga agatgggata accctgtcta tcaatgaaaa tggtatatca 780

tgcatcttga gtaagtatct accacagtat attgcaaaga acatggcagg ttacgtagat 840

agtttcctag ggatgcatgg attacagaag acagatatgg atttctgggc tattcacccc 900

ggcggccgca gaattataga ggaagcgcag aacggtttgg gtttatccga ggagcaggcg 960

aagtattctt ggactgttct tagtcagtat ggtaatatgt tgtcacctag cgtgatgttt 1020

gtgttagaac tgatccttaa tgaccacaag aaggcactgg caaagggaga gcgcggttta 1080

aagcaaggta tcgcatttag cttctcaccg ggtgttgggg ccgagggcat cctcattaat 1140

gttatgtaa 1149

<210> 5

<211> 349

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌Pf5

<400> 5

Met Ser Thr Leu Cys Leu Pro His Val Met Phe Pro Gln His Lys Ile

1 5 10 15

Thr Gln Gln Gln Met Val Asp His Leu Glu Asn Leu His Ala Asp His

20 25 30

Pro Arg Met Ala Leu Ala Lys Arg Met Ile Ala Asn Thr Glu Val Asn

35 40 45

Glu Arg His Leu Val Leu Pro Ile Asp Glu Leu Ala Val His Thr Gly

50 55 60

Phe Thr His Arg Ser Ile Val Tyr Glu Arg Glu Ala Arg Gln Met Ser

65 70 75 80

Ser Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ile Glu Asn Ala Gly Leu Gln Ile Ser

85 90 95

Asp Ile Arg Met Val Ile Val Thr Ser Cys Thr Gly Phe Met Met Pro

100 105 110

Ser Leu Thr Ala His Leu Ile Asn Asp Leu Ala Leu Pro Thr Ser Thr

115 120 125

Val Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Val Ala Gly Ala Ala Ala

130 135 140

Ile Asn Arg Ala Asn Asp Phe Ala Arg Leu Asp Ala Arg Asn His Val

145 150 155 160

Leu Ile Val Ser Leu Glu Phe Ser Ser Leu Cys Tyr Gln Pro Asp Asp

165 170 175

Thr Lys Leu His Ala Phe Ile Ser Ala Ala Leu Phe Gly Asp Ala Val

180 185 190

Ser Ala Cys Val Leu Arg Ala Asp Asp Gln Ala Gly Gly Phe Lys Ile

195 200 205

Lys Lys Thr Glu Ser Tyr Phe Leu Pro Lys Ser Glu His Tyr Ile Lys

210 215 220

Tyr Asp Val Lys Asp Thr Gly Phe His Phe Thr Leu Asp Lys Ala Val

225 230 235 240

Met Asn Ser Ile Lys Asp Val Ala Pro Val Met Glu Arg Leu Asn Tyr

245 250 255

Glu Ser Phe Glu Gln Asn Cys Ala His Asn Asp Phe Phe Ile Phe His

260 265 270

Thr Gly Gly Arg Lys Ile Leu Asp Glu Leu Val Met His Leu Asp Leu

275 280 285

Ala Ser Asn Arg Val Ser Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ala Gly

290 295 300

Asn Ile Ala Ser Val Val Val Phe Asp Val Leu Lys Arg Gln Phe Asp

305 310 315 320

Ser Asn Leu Asn Arg Gly Asp Ile Gly Leu Leu Ala Ala Phe Gly Pro

325 330 335

Gly Phe Thr Ala Glu Met Ala Val Gly Glu Trp Thr Ala

340 345

<210> 6

<211> 381

<212> PRT

<213> 外子藻

<400> 6

Met Ser Lys Asp Glu Gln Thr Val Tyr Pro Val Ile Ala Gly Met Ala

1 5 10 15

Ile Gly Asn Pro Gln Tyr Arg Cys Thr Gln Asn Glu Ala Leu Ala Val

20 25 30

Ala Ser Lys Cys Pro Gly Leu Glu Ser Ile Lys Pro Val Leu Glu Arg

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Arg Ile Gly Ser Arg Tyr Phe Ala Val Pro Asp

50 55 60

Phe Thr Pro Gly Arg Ala Ala Lys Gly Asp Pro Leu Phe Tyr Pro Ala

65 70 75 80

Asp Gly Ser Tyr Gln Val Pro Val Asp Val Arg Leu Asp Lys Phe Lys

85 90 95

Glu Lys Ala Val Pro Leu Val Ser Asp Val Ala Arg Arg Ala Ile Lys

100 105 110

Glu Ala Gly Leu Asn Val Glu Asp Ile Ser Lys Leu Val Val Val Ser

115 120 125

Ser Thr Gly Phe Leu Gly Pro Gly Leu Asp Cys Glu Leu Ile Lys Asn

130 135 140

Leu Gly Leu Thr Arg Ser Val Asp Arg Thr Leu Ile Gly Phe Met Gly

145 150 155 160

Cys Ala Ala Ala Met Asn Gly Phe Arg Asn Ala Asn Asp Tyr Val Thr

165 170 175

Ala Asn Pro Gly Lys Tyr Ala Leu Met Ile Cys Val Glu Leu Ser Ser

180 185 190

Val His Thr Thr Phe Asp Asp Asn Ile Asn Asp Ala Ile Leu His Ala

195 200 205

Ile Phe Ala Asp Gly Cys Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly Ala Arg Lys

210 215 220

Ser Glu Cys Pro Lys Gly Thr Leu Ala Ile Val Asp Asn His Ala Trp

225 230 235 240

Leu Met Glu Gly Thr Glu Asp Gly Ile Thr Leu Ala Ile Lys Pro Asn

245 250 255

Gly Ile Thr Cys Thr Leu Ser Lys Phe Leu Pro Gln Tyr Ile Ala Lys

260 265 270

Asn Ile Ala Phe Phe Ala Asp Gly Phe Leu Lys Lys His Lys Leu Gly

275 280 285

Arg Asp Asp Val Asp Phe Trp Cys Val His Pro Gly Gly Arg Arg Ile

290 295 300

Ile Glu Glu Ala Gln Asn Gly Leu Gly Leu Ser Glu Glu Gln Thr Ala

305 310 315 320

Asp Ser Trp Ala Val Leu Gly Glu Tyr Gly Asn Met Leu Ser Pro Ser

325 330 335

Val Met Phe Val Leu Ser Arg Val Phe Lys Arg His Asn Ala Ala Leu

340 345 350

Ala Gln Gly Lys Pro Gly Tyr Gln Thr Gly Met Ala Phe Ser Phe Ser

355 360 365

Pro Gly Val Gly Ala Glu Gly Ile Leu Leu Arg Gln Ile

370 375 380

<210> 7

<211> 598

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 7

tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60

gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120

atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180

taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240

acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300

accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420

atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480

ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540

atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598

<210> 8

<211> 998

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 8

aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca 60

aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca 120

tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc 180

aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc 240

gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc 300

ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt 360

agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat 420

agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca 480

gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg 540

cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa 600

aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca 660

agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta 720

cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg 780

cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa 840

ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt 900

ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa 960

attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata 998

<210> 9

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 9

gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta 60

aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa 120

gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac 180

tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc 240

ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat 300

Claims (14)

1.选自藻的III型聚酮合酶的至少一种多肽作为间苯三酚合酶的用途，其中所述多肽由SEQ ID No：3或SEQ ID No：1的氨基酸序列组成。

2.具有间苯三酚合酶活性的分离的多肽，其由SEQ ID No：3的序列组成。

3.根据权利要求2所述的分离的多肽，其特征在于其是重组的。

4.分离的核酸分子，其特征在于其编码权利要求2所述的分离的多肽。

5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子由SEQ ID No：4的序列组成。

6.载体，其包含至少一个权利要求4或5所述的核酸分子，所述载体是质粒。

7.宿主细胞，其包含至少一个权利要求4或5所述的核酸分子，或至少一个权利要求6所述的载体。

8.生产间苯三酚的方法，其包括以下步骤：

（i）使表达权利要求1至3中任一项所定义的具有间苯三酚合酶活性的多肽的宿主细胞与合适的底物接触；

（ii）在允许所述宿主细胞生长和/或表达所述宿主细胞中含有的核酸分子的条件下，体外培养步骤（i）的宿主细胞，以产生间苯三酚。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述宿主细胞为权利要求7所述。

10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括以下步骤：

（iii）回收在步骤（ii）之后获得的包含间苯三酚的培养基。

11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括以下步骤：

（iv）从步骤（iii）的培养基中纯化间苯三酚。

12.生产间苯三酚的方法，其至少包括以下步骤：

（i）使权利要求1至3中任一项所定义的至少一种多肽与合适的底物接触；和

（ii）在适合于生产间苯三酚的条件下孵育步骤（i）得到的混合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括以下步骤：

（iii）回收在步骤（ii）之后获得的包含间苯三酚的反应介质。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括以下步骤：

（iv）从步骤（iii）的反应介质中纯化间苯三酚。