CN107903227A

CN107903227A - 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN107903227A
Application number: CN201711175710.8A
Authority: CN
Inventors: 牛雪梅; 杨晓钰; 陈月桂; 张克勤
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2037-11-22
Also published as: CN107903227B

Abstract

本申请涉及琥珀酸酐类化合物，还涉及与其相关的基因和蛋白以及其制备方法。该琥珀酸酐类化合物的分子式如结构式I所示：

Description

琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法

技术领域

本申请涉及琥珀酸酐类化合物，还涉及与其相关的基因和蛋白以及其制备方法。

背景技术

琥珀酸酐(也叫丁二酸酐)类化合物，是一种常用的化学物质，可作为食品添加剂；塑料工业用于制造玻璃纤维增强塑料。有机工业用作合成有机化合物的中间体，如聚乳酸等。琥珀酸酐类化合物的下游产品涵盖了N-羟基丁二酰亚胺、丁二酸单乙酯酰氯、红霉素琥珀酸乙酯、芬布芬、青蒿琥酯、恶丙嗪、曲匹布通等重要产品；同时，琥珀酸酐能与其他化合物组装，提升药物的活性等，表明琥珀酸酐类化合物为重要产品的合成前体和原料。

因此开发新型的琥珀酸酐类衍生物为发现新型材料和医药农药等重要产品提供新型的原材料。

发明内容

本申请之一提供了一种琥珀酸酐类化合物，其分子式如结构式I所示：

本申请之二提供了如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物在制备N-羟基丁二酰亚胺、丁二酸单乙酯酰氯、红霉素琥珀酸乙酯、芬布芬、青蒿琥酯、恶丙嗪和曲匹布通中的至少一种中作为前体，用于制造玻璃纤维增强塑料，作为食品添加剂，以及提高药物活性中的应用。

本申请之三提供了一种制备如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物的方法，所述方法包括发酵含有编I型PKS/NRPS酶的基因，以及含有编码ER酶的基因的异源生物，得到发酵液；通过在异源生物中表达I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物；其中，所述I型PKS/NRPS酶具有如下(I)或(II)的氨基酸序列：(I)来源于嗜热属(Thermomyces)的I型PKS/NRPS酶的氨基酸序列，优选地，如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；(II)与(I)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(I)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；所述ER酶具有如下(III)或(IV)的氨基酸序列：(III)来源于嗜热属(Thermomyces)的ER酶的氨基酸序列，优选地，如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；(IV)与(III)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(III)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中所述的异源生物的表述是相对于I型PKS/NRPS酶或ER酶的来源生物而言的。如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列和如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列来源于嗜热踝节菌Thermomyces dupontii(Talaromyces thermophilus NRRL 2155,该菌株保存时该菌株名为Talaromycesthermophilus,2014年后国际真菌分类学将此菌株改为Thermomyces dupontii，见文献Thermophilic fungi in the new age of fungal taxonomy,Extremophiles,DOI:10.1007/s00792-014-0707-0,https://www.researchgate.net/publication/268392182)，而表达这两个基因的生物可以是异源生物酵母。

在一个具体实施方式中，编码所述I型PKS/NRPS酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第一表达载体上；编码所述ER酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第二表达载体上；所述第一表达载体与所述第二表达载体不相同。

在一个具体实施方式中，所述第一表达载体在连接上所述I型PKS/NRPS酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7。

在一个具体实施方式中，所述第二表达载体在连接上所述ER酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7。

在一个具体实施方式中，编码所述I型PKS/NRPS酶的基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和/或编码所述ER酶的基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。I型PKS/NRPS基因由如下方法得到：通过柱式法提取T.dupontii NRRL 2155基因组，操作方法按照天根植物提取试剂盒使用说明。将PKS/NRPS基因分为三段(每段约4000bp)，设计引物进行PCR，通过酵母同源重组的方法连在捕获质粒pRS426上，得到含有目的基因的载体pRS426-Talth1_004980-t1，通过测序确证目的基因正确无突变；或者也可以分段人工合成得到。ER基因如下方法得到：通过柱式法提取T.dupontii NRRL 2155基因组，操作方法按照天根植物提取试剂盒使用说明。设计引物进行PCR并纯化片段进行测序，通过测序确证目的基因正确无突变；或者也可以人工合成得到。

在一个具体实施方式中，所述异源生物为酵母菌(Saccharomyces)；优选地，所述异源生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。例如，酿酒酵母FY834菌株。

在一个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：

1)将所述I型PKS/NRPS酶的基因连接到pGADT7载体上，得到第一表达载体；

2)将所述ER酶的基因连接到pGBKT7上，得到第二表达载体：

3)将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化至酿酒酵母中，获得工程菌株

4)将所述工程菌株接种至培养酿酒酵母的液体培养基(例如，酿酒酵母FY834菌株使用的氨基酸缺陷型液体培养基SD/-Leu/-Trp)中，在30±2℃ 200±50rpm培养10-14小时(例如12小时)；按照2％-10％的接种率扩大培养，在30±2℃ 200±50rpm的条件下发酵4-6天，得到发酵液。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括从发酵液中分离提纯得到本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物。

在一个具体实施方式中，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与丙酮水溶液混合并进行超声处理，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮混合并进行超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏用凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到凝胶柱色谱分离液；然后对所述凝胶柱色谱分离液进行柱层析，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到柱层析分离液；然后对所述柱层析分离液进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物；

在一个具体实施方式中，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液旋转蒸发浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与65-75％的丙酮水溶液混合并在80-120KHz下超声处理2-5次，每次10-30min，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮混合并在80-120KHz下超声处理2-5次，每次30-80min超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏在流动性为甲醇的条件下进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中TLC检测RF值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到凝胶柱分离液；然后在流动性为5％-15％甲醇水溶液的条件下对所述凝胶柱分离液进行中压RP18柱层析，过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中TLC检测RF值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到柱层析分离液，接着对所述柱层析分离液在以体积比为11-9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物。

在一个具体实施方式中，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液旋转蒸发浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与65-75％的丙酮水溶液混合并在80-120KHz下超声处理2-3次，每次15-25min，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮(100％的纯丙酮)混合并在80-120KHz下超声处理2-3次，每次55-70min超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏在流动性为甲醇的条件下进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，过程中的流出液每4ml至5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中TLC检测RF值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到凝胶柱分离液，然后在流动性为5％-15％甲醇水溶液的条件下对所述凝胶柱分离液进行中压RP18柱层析，过程中的流出液每4ml至5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中TLC检测RF值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到柱层析分离液，接着对所述柱层析分离液在以体积比为11-9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物。

在一个具体实施方式中，TLC展开体系为氯仿：丙酮9:1。

本申请之四提供了一种ER酶，所述ER酶具有如下(III)或(IV)的氨基酸序列：

(III)来源于嗜热属(Thermomyces)的ER酶的氨基酸序列，优选地，如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(IV)与(III)中的氨基酸序列的一致性在98％以上，且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(III)中的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

本申请之五提供了一种能够编码如本申请之四所述的ER酶的基因。

在一个具体实施方式中，优选所述基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本申请之六提供了根据本申请之四所述的ER酶，或本申请之五所述的基因在制备如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物中的应用。

本申请的有益效果：

现有技术认为ER酶参与PKS聚酮类化合物生物合成，而没有其参与琥珀酸酐类化合物的生物合成的报道。

本申请首次发现了通过将来源于嗜热属菌的I型PKS/NRPS酶和ER酶在酵母中进行共同异源表达，可以得到含有氨基的新型琥珀酸酐类化合物。首次发现I型PKS/NRPS和ER基因参与产生含有伯氨的琥珀酸酐类化合物的新功能，以及琥珀酸酐类化合物可以通过在酵母异源表达高温真菌中的I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成制备的新方法。该生物合成制备方法具有污染小、安全可靠以及发酵周期短等方面的优点。

附图说明

图1为PKS/NRPS(Talth1_004980-t1)3段基因PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL5000DNA Marker，泳道1、2和3分别为3段基因(每段约4000bp)。

图2为以pRS426-Talth1_004980-t1扩增Talth1_004980-t1的PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道为DL15000DNA Marker，泳道1为目的条带(11844bp)。

图3为ER(Talth1_004946_t1)的PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道为DL2000DNAMarker，泳道1为目的条带(1230bp)。

图4为pGADT7-Talth1_004980-t1表达载体图谱。

图5为pGBKT7-Talth1_004946_t1表达载体图谱。

具体实施方式

以下为结合具体实例对本申请进行进一步描述，但本申请的保护范围并不仅限于此。

在没有特别说明的情况下，本申请中使用的试剂和原料均可以市售获得，或者通过常规配制得到。

PDB培养基配方：将200g马铃薯用水煮沸30min后，取上清加入20g无水葡萄糖定容至1L，121℃灭菌20min。

氨基酸缺陷型固体及液体培养基SD/-Leu/-Trp来源：购自Takara公司。

pGADT7质粒载体来源：购自Takara公司。

pGBKT7质粒载体来源：购自Takara公司。

实施例1T.dupontii NRRL 2155PKS/NRPS基因的获得

采用柱式法提取T.dupontii NRRL 2155(菌种由云南省生物资源保护与利用国家重点实验室提供)基因组，将T.dupontii NRRL 2155于PDB培养基中45℃培养7天，过滤收集菌丝，加入液氮充分研磨至菌体呈粉末状；基因组的提取方法参照天根植物基因组提取试剂盒说明书。将编码总长为11844bp的PKS/NRPS基因Talth1_004980-t1(如SEQ ID No.3所示，其编码如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列)分为3段(每段约4000bp)设计引物进行PCR，其中第一对引物为PKS/NRPS-F1(如SEQ ID No.5所示)和PKS/NRPS-R1(如SEQ ID No.6所示)，第二对引物为PKS/NRPS-F2(如SEQ ID No.7所示)和PKS/NRPS-R2(如SEQ ID No.8所示)，第三对引物为PKS/NRPS-F3(如SEQ ID No.9所示)和PKS/NRPS-R3(如SEQ ID No.10所示)。PCR体系为50μL：5×PrimeSTAR GXL Buffer10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，PrimerF 1μL，PrimerR 1μL，模板1μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 32μL。PCR仪为eppendorf生产，PCR反应温度为：98℃ 2min，98℃ 10sec，55℃ 15sec，68℃ 4min共计35个循环，68℃ 5min。PCR产物分别％的琼脂糖凝胶电泳，可见3个约4000bp的PCR产物(见图1)。最后通过酵母的同源重组将3个片段依次连接到质粒pRS426上，得到含有完整目的片段的pRS426-Talth1_004980-t1质粒。

实施例2构建表达载体pGADT7-Talth1_004980-t1与pGBKT7-Talth1_004946_t1

根据实施例1的测序结果设计构建Talth1_004980-t1基因表达载体的引物分别为P1-F(如SEQ ID No.11所示)和引物P1-R(如SEQ ID No.12所示)。

以T.dupontii NRRL 2155基因组为模板，设计构建Talth1_004946_t1表达载体的引物分别为P2-F(如SEQ ID No.13所示)P2-R(如SEQ ID No.14所示)。

利用长片段高保真酶PrimeSTAR GXL进行扩增，PCR体系为(50μL)：1.Talth1_004980-t1：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，PrimerF 0.5μL，PrimerR 0.5μL，模板0.5μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL，ddH₂O32.5μL；2.Talth1_004946_t1：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，PrimerF 1μL，PrimerR 1μL，模板1μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 32μL。PCR反应温度为：1.Talth1_004980-t1：98℃ 2min，98℃ 10sec，55℃ 15sec，68℃ 3min共计35个循环，68℃ 10min；2.Talth1_004946_t1：98℃ 2min，98℃ 10sec，55℃ 15sec，68℃1min共计35个循环，68℃ 5min。

PCR产物分别％的琼脂糖凝胶电泳可见Talth1_004980-t1条带在11844bp位置(如图2)，Talth1_004946_t1条带在1230bp位置(如图3)。将两个目的片段纯化后，通过Takara的infusion酶分别与经过EcoRI和BamHI双酶切的酵母表达载体pGADT7、pGBKT7相连，构建表达载体pGADT7-Talth1_004980-t1与pGBKT7-Talth1_004946_t1。并测序检测基因序列的正确性。

实施例3构建工程菌株FY834/pGADT7-Talth1_004980-t1/pGBKT7-Talth1_004946_t1

将施实例2中构建的两个表达质粒pGADT7-Talth1_004980-t1与pGBKT7-Talth1_004946_t1共同转化到酿酒酵母FY834中，涂布于氨基酸缺陷型固体培养基SD/-Leu/-Trp上，30℃倒置培养2-4天。随机挑去转化子于5mL液体SD/-Leu/-Trp培养基中扩大培养并提取质粒进行PCR验证，并选取PCR验证为阳性的转化子进行测序验证。结果表明，表达载体pGADT7-Talth1_004980-t1与pGBKT7-Talth1_004946_t1成功转化至酿酒酵母FY834中。

实施例4工程菌株FY834/pGADT7-Talth1_004980-t1/pGBKT7-Talth1_004946_t1的表达

将实施例3构建的工程菌株FY834/pGADT7-Talth1_004980-t1/pGBKT7-Talth1_004946_t1接种至5mL液体SD/-Leu/-Trp培养基中，30℃ 200rpm过夜培养；按照5％的接种率扩大培养，30℃ 200rpm发酵5天。

实施例5琥珀酸酐含氨基衍生物化合物的提取分离应用

以实施例4发酵液为样品组，转化了空载质粒pGADT7和pGBKT7的FY834菌株为对照，对照组与样品组选用相同培养以及相同的处理方法。将发酵液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩产物用70％丙酮/水室温100KHz超声提取2次，每次20min，减压浓缩得70％丙酮/水粗提物；粗提物用纯丙酮100KHz超声提取两次，每次60min，减压浓缩得到褐色油状丙酮提取物浸膏；将样品组与对照组用TLC检测，10％的浓硫酸乙醇溶液进行显色，在样品组中得到一个与对照组存在差异的粉色点。丙酮提取物浸膏经凝胶柱色谱(Sephadex LH-20，甲醇为流动相冲洗)，每5ml流出液更换一次接样瓶，并用TLC检测流出液成分，将组分相同的样品进行合并；随后通过中压RP18柱层析(5％-15％甲醇/水为流动相梯度洗脱)，TLC检测流出液成分，合并相同组分；之后合并组份利用硅胶柱层析(氯仿-丙酮10:1)为流动相，得到粉末状化合物。经过对一位核磁共振谱、二维核磁共振谱以及质谱的分析，鉴定化合物为一个新型的琥珀酸酐含氨基衍生物，结构如下：

本申请的琥珀酸酐含氨基衍生物的理化性质：

物化特征为：

外观：无色油脂状物质。

溶解性：溶于氯仿、丙酮、二甲亚砜等，不溶于己烷和水等。

新化合物琥珀酸酐含氨基衍生物的分子式为：C₇H₁₁NO₃，分子量为157；高分辨正离子ESI-MS质谱：实测值为158.0817[M+H]⁺,计算值为158.0821(for C₇H₁₂NO₃)。氢谱和碳谱数据(其溶解溶剂为CD₃COCD₃，400MHz，δ：ppm)：碳谱为：175.4(s,C-1),76.9(s,C-2),40.6(t,C-3),172.0(s,C-4),35.2(d,C-5),16.5(q,C-6),15.7(q,C-7)；氢谱为2.90和2.73(3-H₂,d,19.2Hz),1.96(H-5,m),0.99(7-H₃,d,7.1Hz),0.91(6-H₃,d,7.1Hz)。

序列表

<110> 云南大学

<120> 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法

<130> LHA1760721

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3947

<212> PRT

<213> 嗜热踝节菌(Thermomyces dupontii)

<400> 1

Met Ala Ser Lys Val Arg Pro Glu Pro Ile Val Ile Ile Gly Thr Gly

1 5 10 15

Cys Arg Phe Pro Gly Asp Ile Arg Ser Thr Ser Gln Leu Trp Glu Val

20 25 30

Ile Cys Ser Gln Lys Asp Leu Leu Ala Arg Ile Pro Ser Ser Arg Phe

35 40 45

Ser Ser Lys Gly Phe Tyr His Ser Asn Gly Glu Arg His Gly Ser Thr

50 55 60

Asn Val Asp His Ala Tyr Leu Leu Ser Asn Asp Val Gly Ala Phe Asp

65 70 75 80

Ala Asp Phe Phe Gly Ile Asn His Arg Glu Ala Glu Ala Ile Asp Pro

85 90 95

Gln Gln Arg Ile Leu Leu Glu Thr Val Tyr Glu Ala Ile Glu Asp Ala

100 105 110

Gly Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Gly Ser Asn Thr Ala Val Tyr Val

115 120 125

Gly Leu Met Thr Gly Asp Tyr His Glu Met Gln Val Arg Asp Pro Glu

130 135 140

Asp Met Pro Thr Tyr Met Ala Thr Gly Thr Ala Arg Ser Ile Val Ser

145 150 155 160

Asn Arg Ile Ser Tyr Phe Phe Asp Trp Lys Gly Pro Ser Met Thr Ile

165 170 175

Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala Leu His Asn Ala Val Gln

180 185 190

Ala Leu Arg Ala Gly Glu Cys His Ile Ala Val Ala Ala Gly Ala Asn

195 200 205

Leu Ile Leu Gly Pro Glu Met Met Ile Ala Glu Ser Asn Leu Arg Met

210 215 220

Leu Ser Pro Thr Ala Arg Ser Arg Met Trp Asp Ala Ala Ala Asp Gly

225 230 235 240

Tyr Ala Arg Gly Glu Gly Phe Ala Ala Val Ile Leu Lys Thr Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Leu Ala Asp Gly Asp Pro Val Glu Tyr Ile Ile Arg Glu Thr

260 265 270

Gly Val Asn Gln Asp Gly Arg Thr Gln Gly Ile Thr Met Pro Asn Ala

275 280 285

Ala Ser Gln Thr Ala Leu Ile Arg Gln Val Tyr Gln Arg Ala Gly Leu

290 295 300

Asp Cys Thr Arg Pro Glu Asp Arg Cys Gln Phe Phe Glu Ala His Gly

305 310 315 320

Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Pro Ile Glu Ala Arg Ala Ile His Asp

325 330 335

Ala Phe Phe Val Asp His Ser Thr Ala Glu Glu Pro Met Tyr Val Gly

340 345 350

Ser Val Lys Thr Val Ile Gly His Leu Glu Gly Cys Ala Gly Leu Ala

355 360 365

Gly Leu Leu Lys Ala Ala Glu Ala Ile Arg Arg Ala Glu Ile Pro Pro

370 375 380

Asn Met His Phe Thr Glu Met Asn Pro Glu Ile Val Pro Phe Ala Gln

385 390 395 400

His Leu Arg Val Pro Thr Lys Thr Leu Pro Trp Pro Gly Gln Thr Lys

405 410 415

Ile Arg Arg Ala Ser Val Asn Ser Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala

420 425 430

His Val Ile Ile Glu Ser Tyr Asp Leu Ala Ser Ser Pro Ser Arg Ser

435 440 445

Leu Ser Ser Pro Thr Met Leu Pro Ile Pro Leu Thr Phe Ser Ala Ala

450 455 460

Lys Glu Thr Ser Leu Thr Arg Phe Ile Glu Glu Tyr Ile Thr Leu Ile

465 470 475 480

Lys Ser His Asp Ile Leu Pro Leu His Gln Ile Ala Ser Ile Leu Ser

485 490 495

Ser Arg Arg Ser Gln His Ser Thr Arg Ala Val Phe Ser Gly Thr Asp

500 505 510

Lys Asn Arg Leu Leu Gln Lys Leu Glu Thr Ala Leu Ala Ala Ser Pro

515 520 525

Leu Gly Glu Arg Lys Glu Lys Ala Pro Ile Ser Asp Arg Ile Leu Gly

530 535 540

Ile Phe Thr Gly Gln Gly Ala Gln Trp Ala Cys Met Gly Arg Glu Leu

545 550 555 560

Ile Arg Ser Ser Pro Met Ala Arg Glu Thr Leu Arg Ala Leu Gln Ala

565 570 575

Ser Leu Asp Glu Leu Pro Asp Gly Pro Asn Trp Thr Ile Glu Thr Gln

580 585 590

Leu Thr Glu Val Glu Glu Pro Ser Arg Ile Gln Glu Ala Ala Leu Ser

595 600 605

Gln Pro Leu Cys Thr Ala Val Gln Val Met Leu Val Asp Leu Leu Arg

610 615 620

Ala Ala His Val Ser Phe His Thr Val Val Gly His Ser Ser Gly Glu

625 630 635 640

Ile Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Gly Met Ile Ser Ala Arg Asp Ala Ile

645 650 655

Arg Ile Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Tyr Ala Lys Phe Ala Arg Gly Gln

660 665 670

Glu Cys Ala Lys Gly Ala Met Met Ala Val Gly Ile Ser Phe Asp Glu

675 680 685

Ala Gln Asp Leu Ile Ala Ala Lys Phe Arg Gly Arg Ile Ala Val Ala

690 695 700

Ala Ser Asn Ala Pro Arg Ser Val Thr Leu Ser Gly Asp Glu Asp Ala

705 710 715 720

Ile Ala Glu Ala Lys Ala Met Phe Glu Gln Asn Glu Thr Phe Cys Arg

725 730 735

Leu Leu Lys Val Asp Thr Ala Tyr His Ser His Gln Met Leu Pro Cys

740 745 750

Leu Asp Pro Tyr Leu Ala Ala Leu Arg Ala Ala Asn Ile Ser Pro Ser

755 760 765

Lys Pro Ser Asp Gly Leu Thr Trp Val Ser Ser Val His Glu Arg Glu

770 775 780

Met Val Thr Glu Glu Asp Ile Glu Ser Leu Arg Ala Asp Tyr Trp Gly

785 790 795 800

Asp Asn Met Ala Gln Thr Val Arg Phe Ser Gln Ala Val Gln Lys Ala

805 810 815

Ser Arg Leu His Gly Pro Phe Ala Val Gly Val Glu Val Gly Pro His

820 825 830

Pro Ala Leu Lys Gly Pro Ala Thr Gln Thr Ile Lys Asp Glu Cys Gly

835 840 845

Gln Thr Ile Pro Tyr Ser Gly Thr Leu Ala Arg Phe Glu His Asp Val

850 855 860

Glu Ala Phe Ser Asp Ala Leu Gly Phe Leu Trp Lys Glu Ile Gly Pro

865 870 875 880

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cgcgacccgg aggatatgcc cacgtacatg gctacgggga ctgctcgtag catcgtttcg 480

aacaggatct cctacttctt cgactggaaa ggcccgtcca tgaccattga taccgcctgt 540

tcctcgagtc tggttgcttt gcataatgct gtccaagctc tccgagcagg ggaatgtcac 600

attgctgtcg ctgccggggc aaatctcatt ctgggaccgg agatgatgat tgccgagtcg 660

aatcttcgta tgctttcgcc tactgcacga tctcgaatgt gggacgctgc agcggatggg 720

tatgcccgtg gtgaaggctt tgccgcggtc attctcaaaa cactctccca agctttggcc 780

gacggggatc ctgtggagta tatcattcga gaaacaggcg tcaatcagga cggcagaacg 840

cagggcatca ccatgccaaa cgcagcatca caaacggctc tgattcggca agtctatcaa 900

agagcgggtc ttgactgcac gcgtcctgaa gatcgttgcc aattcttcga ggcgcatgga 960

accggaaccc cccgtggcga tcccatcgag gcgcgcgcca tccatgatgc attcttcgtc 1020

gaccactcaa cggcagagga gccgatgtat gttggctcag tcaagactgt tatcggccac 1080

ttggaaggat gcgcagggtt ggccggtctt ctgaaagccg ctgaggcaat tcgtcgtgct 1140

gaaatccctc ccaacatgca ctttacggaa atgaaccccg aaattgttcc ttttgcgcag 1200

catttgcggg tcccaaccaa aaccctgccc tggcctggac agactaagat tcgtcgggcg 1260

agtgtcaatt cttttggatt cggaggaaca aatgcccacg ttatcatcga gagctatgat 1320

cttgcatcca gtccaagccg gagtctatcg tcaccaacca tgctaccaat cccactgaca 1380

ttctcggcgg caaaggagac atcactgact cgattcattg aggagtacat cactttgatt 1440

aaatctcatg acattctgcc tctccatcag atagcgtcga ttctgtcctc tcggcgatcc 1500

caacactcaa cccgggccgt tttctctggt acagacaaga acaggcttct gcaaaaactt 1560

gagaccgctc tcgccgcgtc tccacttgga gagcgaaagg agaaagcacc catttcggat 1620

cggattctgg gaatctttac cggccaaggc gctcaatggg cgtgtatggg acgggagtta 1680

attaggtcct ctccgatggc gcgggaaaca ttgagagcgc ttcaggcgtc tctggacgag 1740

cttccggatg gaccaaactg gactatagaa acgcagttga ccgaggttga ggaaccctct 1800

cggattcaag aagccgcact ctcgcagcca ctatgcaccg cagtgcaggt gatgctcgtt 1860

gatctcttgc gggctgcaca tgtctcattc cacactgtcg ttggtcactc atctggagag 1920

atcgctgctg cttatgccgc gggaatgatt tctgcacggg acgccattcg cattgcatac 1980

taccgcggcc tgtacgcaaa gttcgccaga ggccaagaat gcgcaaaggg agccatgatg 2040

gcagtaggta tctctttcga tgaggcacag gacttgattg ccgcgaaatt ccgaggccgc 2100

atcgccgttg ctgccagcaa tgcaccccgg tctgtcaccc tttctggaga cgaagatgcc 2160

atcgccgaag ccaaggccat gtttgagcag aatgaaacct tttgccgcct cctaaaagtg 2220

gacactgctt atcactccca tcaaatgctt ccgtgtcttg acccatatct tgcggctttg 2280

cgggccgcaa acatcagtcc ctcgaagccc tccgacgggc tcacctgggt gtcaagtgtg 2340

catgaacgag aaatggtcac tgaggaagat atcgagtcac tccgggccga ttattggggc 2400

gacaacatgg cgcagacggt gcgcttttct caggctgttc agaaagcgtc gcgtctacat 2460

ggtccttttg ctgtcggagt ggaagttgga ccgcatccag cattgaaagg accggccacc 2520

cagacgataa aagacgagtg tggccagaca atcccataca gtggcaccct cgcccggttt 2580

gaacacgatg ttgaggcatt ctccgacgca ttgggcttct tatggaaaga aattggtcct 2640

agctcggtcg accttcgcgc atacgccgcc gcagccttcg atctgtcgtt ccaagaacct 2700

ttctcgaacc acttatcgct gccgcgatac ccgtgggatc acagtcagcg attctggaag 2760

gagtcccgac tatctagaag gtatcgccaa cgtcggatca acaggcatga ccttctcggg 2820

acacgctgtt ctgacgacca tgaccacgaa atgcactgga ggaacatcct acgcgtctct 2880

gaatccccgt ggctctcggg ccataaggtt caagggcagg ttatcttccc cgcagcaggt 2940

tatctcgtaa tggcgatgca ggccgcgctc gaactcgcgg gcgatcgtcg tattttcatg 3000

atacatctct cggatgtcaa tattgatcgg gcgatcgcgc tcccggaata caagggagtc 3060

gaagtcatgt ttcatcttcg accaaagtcc gtcacttcat ccttgattaa ggctgagttc 3120

gcatgttact cggttacgtc tgatgaaaat ggttcacctt cacaacgaca tgcctctggt 3180

attgtgcaag ttcatctgga tccagcagat cagctccagc tcccgccctc gcaggaagaa 3240

ccggtctctt tggtgtcggt gaacatggaa acattctacg catcactcag cgaaatcggc 3300

ttggagtaca caggactctt ccgtcgtctc gatcgagtgg agcgccgagc tggtcgggcc 3360

actggttacg cacgggacat cccatccgat agcgaaatgc ccgtcgttat ccatccagca 3420

ttgttagatg ctgcgtttca aacaattttt gctgcatttt gctggccagg agacggcact 3480

ctgcacggcc cctacgtgcc cacgcatctt caatcactcc gtatcgtgcc ggtaactcag 3540

tttgaagctc agaagatgac aattgagtgc acaatcaccg agtctcgccc acagacagtc 3600

acagcggatg tcgatgtttt cgcgcagaac tgtccacgtg tgcaattgga gggcctcact 3660

tgcacgatgt tgaacgcacc aacccctgag gacgactgcg agctcttcgc ggaaactgta 3720

tggcgtgctg atgctggggc agatctcggg tcagccgact tggtctctga ctgcgctgat 3780

gacttgaaac tcgtggacct ctgcgaaagg ctctcctact cttatctacg ccagctcaat 3840

gctgcgatcg atcgcagcga gatagattcg tttgtctgga atcatcaacg catctttgaa 3900

ttcattgact atctcttccc tctgatcgaa agcggtcagc accccaccat ccggccggaa 3960

tggaaaggtg attcgcacga gtggttgctt gctcaggctc ggcaacatcc agatgtagtg 4020

gatctgcagc tgatctccgc cgttggcgaa caccttgcgg acgtggtccg gggaaagact 4080

actatactgg agcatatgat cgccaataat accctggaca gattctacaa gtacgggctg 4140

ggttttcagc gggccaacaa agctctcagt cttgtagctg cacagatcgc tcatcggtac 4200

ccgcgcatga agattctgga gattggcgct ggcacaggcg gagcaaccaa gggaatcttg 4260

gagcatctcg acgacaagtt cgagcaatat gtgtttacgg acatatccac cggcttcttc 4320

gagaacgccc aacaacagtt cgcaaggtgg gcatcgcgga tgtcatttag gcccctcaac 4380

atcgaagagg aggtatcttc tcaagggttt gaggacggca tttatgacat gatcatcgct 4440

tcgaatgtgc tgcacgcgac aaagaagctg gagtatacaa tgcaaaatgt acgcagattg 4500

ctaaagccag gcggattctt actcctcctc gaggtgacga gcgatattct cagagtcaag 4560

ttcatgatgt caggcctacc tggatggtgg ctgggtgctg atgatggccg acgatttgct 4620

ccaacaataa gtgcccctca atggcacgac cttcttatcc gtaccggttt ttctggagtg 4680

gatcagaggg tgactgattt tgaagacgtg tccaagcata tgacttcggt gatgctatcc 4740

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ctcacggtgg atcgtgtcat acttgtcggc ggccaaactg ctggcgtaca cacattggca 4860

gagcaggttt cgactcttct acgacgttgg agtattgact cacctgtcat tgtgcctcgg 4920

ttggaggata ttgttcactc cgatctaggc tctgccgtcg cagttgtgtg cctagctgat 4980

ctggaacagc cagtggtgtg ggacatgaac gatgaacgac tcaccgggtt gaagaaactc 5040

ctaaatataa gccgccagtt gctgtgggtg acgtctggcg cccgtgatac caatccctac 5100

gccaacatga gtattgggct cggacgatct ctgatgtacg aatacactca cattcgcatg 5160

cagcaccttg attttgtcag tgattgcgac aataaggcag tgtatattgc aactgcgctg 5220

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gaacctgaag tcgccttcca ggagggccgc tggttgatcc cccgaatttt gcccaacgac 5340

cctctgaacc gtcgcctcaa cgccagcagg agaagagtca cagaagatgt tctcatgaat 5400

gatcatccag tggaagtaat tggcgatggc gctgatgtat ggtgtgagaa gaccgatctt 5460

cctcgtcaag acgatactct gctcttggtc cggaagcagt acgctcttct ccatggcctg 5520

ttcctgaacg ggaatggtcc actatacctg tccattggga aggtggagga ttctgatcga 5580

agctactcat tgcccactgg cacgactgtt ctggcaatga gtcaccaaat tcgatcactt 5640

tcgtggattc ctccaagcca tgctgttcca attgacagtt ccactgcgac gccagactat 5700

ctcatgctca ctgctctcgc actcgtcgtc aattcagttg tcgaccaggt atcctctcag 5760

ggacatatcc ttctcgtgag tccagatcaa gctatccgtc gacttgttga agatcgcgcc 5820

cctgtgcgaa atctgaaggt gactatcgtg catttctctc cagggcatga aggtgccatt 5880

tatattccta gcctgcttcc caaacggcac atcagtggtc gtcttccaag caatgttgat 5940

ctcatactcg attgcagcgc cgaaacacat gtcctgggcg agctactgat ctgtgaccac 6000

accattcgtt tgcgcgacat cttcagaatc ccgtccggaa catattcatc taaggcaggc 6060

atctcgcaaa acgagcttgt ggaggccttg agagtcgcct caacatcatc ttacgagatt 6120

actgctcggc tcctacctct ctccgaggtc agtggcgcgg gacatttcgc tgatatcgcc 6180

tccgtgattg acttcacggc cgtgacaacc gttcagacgc tcgtgcgacc cgttgatgcc 6240

ggcagcctct tccgatctga tcgatcttat ctgctcgtcg gctgcactgg cgggttgggg 6300

caatcgctta ctcgttggat ggtgctgaat ggtgttcgcc acctcatact gaccagtcgc 6360

aactcaaaga atgtcaatcg agtgtggttg gaagaattga aacgcatggg agctcaagtt 6420

catctgttcg aactaaacat tgccgacaag caagctcttc acgccatgta tgatcaggtc 6480

cagcgacaac tacctcccat tgccggagta gccaatgcgg caatggtgct ctcggattgt 6540

cttttcaacg atatgacagt ggaggatctc cagaaagtgc ttgatccaaa ggttgccggc 6600

actgcttatc tagatgaact attctcgtcg ccaacgctgg atttcttcgt tttgttttct 6660

tcgctggcaa gcatcgtggg gaatcgtggt caatccaact atggcgcagc aaatctgttc 6720

atgacaagtc tggctgctcg acggaaacgg caaggccttg caggttctgt gcttgacatt 6780

ggcatggttc tgggaatagg atacgtctca caaacgggca tttacgaatc cacgttgcgc 6840

aagttcaact acatgcctat ctcggaacaa aagtttcacg tcatgttcac agaggccata 6900

attgcgggtc gtcctgacca acgagaagtc tccgctgaga tcatcacggg tctgcatcgc 6960

gtcgccgaat catcggatgg tagtggaaac caggccttct ggtctggtaa tccacgtttc 7020

tcccactatg ctgtccgcga gaaaggtggt tctgagcagg ccgcaactgc cgttgtcgca 7080

ctcaaaaagc agttagaaga ggccgaggat ctgaccgcga tcaatcaggt acttctgaac 7140

gcctttgcag acaagctcgg cagaattctt caggttcccc cggagcaaat caatactact 7200

cagccgctca tcaaccttgg aattgactcg ttgatggctg tcgaagtgcg gtcttggttc 7260

ctgaaggagg tcaatatgga cgtgccggtt ttgcgcatcc tcggcgacgc ctcaccggcc 7320

atgctctgcc aggaggccgc tgatcgctac atgcaactgc agaatccttc aatgcaggcg 7380

gcgattactt cagagacatc atcttcgagc gcgagtcaac tgcttgactc taccacggcg 7440

acgacctcgg aaatataccc cacgagttca gcttcatccc aagggattca aacccctcca 7500

gaaacgaccg acttcgtgga aacttcgtgt gatgaagagg aagcggagtt agaggtggtc 7560

gaggcatgcc aactgtcttt tgcccaggaa cgactgtggt tcctaagaga gttcctagaa 7620

gatcggtcaa catacaacgt gaccatggtg taccgggtgt gtggtcctac agtcagtgcg 7680

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gtggataaag agagtggtct gccgtatcag aacattctgc accaatctcc cttccggctt 7800

actcaaagag aaaaagagac agcgacagat gaagatattg atcgagagtt tcagagactc 7860

tgccatcaca catatgacct ggaacatgga gaatgtatgg ccgcagtgtt gttctcgcat 7920

gcgccagata ctcacactct gattctgggc tttcatcaca ttgtcttcga cggattcagt 7980

gcacaaatct ttgtcaagga tttggccaca gcactctctg gccggtatct ccctcctttg 8040

aattgtcagt acactgattt tgcgcgacgc caacgagcac aagtgcaaaa tgagatggca 8100

gaggatctcg cgtactggaa gcaggagttt tcgacgctgc catccccggt gcctctattt 8160

gagttctgcc aggttgccac gcgacggaca ttgactgaat atgctacaca cggaatacaa 8220

aagacgatcc ccgcgtcgac tgtttatgcc ttcagaagca tggcgcgacg gttccaagca 8280

acccctttcc acggccatct cgctattcta cggcttctcc ttgctcggtt gctggacctg 8340

acagaggttt gcatcggcat cacggacgcc aaccgcacag actcggactt cctcgagacg 8400

ataggctttt tcgtgaatct ccttccactc cgttttgagc tcggtcaaca tgactctttg 8460

gagcagctta tgcaaaacac gcgcgatgtc acctaccggg ctctccagca ttcctgtgtc 8520

ccgttcgacg ttcttttgga tgcgcttgtt gtcccgcggt cgactacgga aagccccctg 8580

tttcagattc tcatgaatta ccggatggga tcaaccagca aaattaagac aaatggattt 8640

gaggcagagc tgctacggtt ccaggatgcc cgcaatcctt acgatttgat ctttaatgtc 8700

gaggaacaag atgatggaac cactttggtt gatgtccagt cacagtccta cctctacact 8760

caagacgatt tggagatgtt gttggacgcc tacatctgcc ttctgacatc atgctcaacc 8820

aaccctggtt ggcctctcca caagtatacc atctacaatg aacaggatgt caacctcgcg 8880

ttggagttgg gaagggggcc ccaattgaat tttggtgaga gtgcgactct ttgccgtcga 8940

attgatgaaa tggtggccgc acaaccggat gagacagctg tcaaggatca caacggccaa 9000

ttcctcacat acaaacagct gctcagccat gttgagttca ttgcagctac gctggaggca 9060

catggagtgc gctcagggga ctatgtcgcc gtattctgtg agcctacaat ctattctgtt 9120

tgctatctgc ttgctatttg gcgcctgaat gcgatctatg tccccttgga tccgcagaac 9180

cccgcagctc gattgcagct tattcttgac gattgccaac ccaaggtcct catctaccat 9240

gaagcgacgg aagagacgat gcgcaagttc catttgtcga ccactgagcc agtcaccttc 9300

tctgactttt cttcctttgc ctccttgcct gttcctgaca ggtcagaatt cacgtcaccg 9360

gcctgcgctc tgtacactag tggctcaaca ggtgtaccaa aggggattct tctgacccat 9420

gacagctttg tcaaccaaat tctaggcatt cgacatcagt tctcagtcgg ccgtgagact 9480

gttctgcagc aaagttcgct tgggtttgat gtgtccttgg accaaatgtt acagcctctt 9540

gttggtggtg gaacgttggt ggtggcatcc cggcagctgc gttacgacgc cactgagctg 9600

gcgcgattga tggtacggga gcatatcacc tacacctacg cgactccatc agagtacgcg 9660

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ggtctccgcc taatcaaccg atatggccca acggagatta cgatatcaag taattgtcta 9840

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ttgccaaact atgtcaccta tatcatggat tccaacggac gtcctcttcc catcgggcat 9960

gttggagaga ttgtcatcgg aggcgctggg gtctctcagg gctatctccg gagagaagaa 10020

ctcacccgcg agcgattcct ggtagataaa tatggaaaat cagatgcagg gctcgtggag 10080

tgcggccgca tgtatcggac cggcgataag ggtcggctgc ttccgacggg agaactgttc 10140

tacttgggcc gaatggacgg agacacccag ataaagctac gaggcttccg catcgaactg 10200

gaggacattg cgcaaaccat cctgcgtgcc gctcatgggc gtctggcaga tgccgtggtg 10260

tcagttcgag gagtccacga tgaggaggga gatcgacgat tcttggtggc ttttgctgtt 10320

cctgcaagac agagtgatgg atcgggtgac attcaagcgt tcctggacca actcgtgcac 10380

accctccctc taccccaata catgattccc cggcgagttg tagtcgtgga ccatcttccg 10440

cggaatccca atggcaagct ggaccgacgt gcgctggatt cgctgccgct accttctctg 10500

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gagctgggag ggaactcgct gttgctggtt cgcgtgcatg ccttgttgtc cgaggccttt 10680

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agcgacatga agaagattga agtgtgtctg acaggatcaa ctggattctt gggctccgag 10920

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tcctcaaacg caaatcgtcc gcggacattg gccgttgatt ccgaaaagat cgtggtgtat 11040

accggtgatc tgacagaacc ccgcttgggg cttcctccag atacgtggga tgccttgggg 11100

gagcgagtgg acgccatcat tcacattggg gccgatgtgt cgttcctgaa gacttatcat 11160

tcactgcgta atgctaatgt ccattcaacg cgcgagttgg cgctccttgc cctccgtcgt 11220

cgtatcccac tgcattacat ttccacgggc ggagtggccc agctggttgg tgttgaaacc 11280

ctcacaccac aatcagtggc gcgcttccct cctccaaacg atggctcaat gggctacata 11340

gcttcgaagt gggctagtga ggtttatctg gagtcatgtg caacacaatt ccatctgccg 11400

tgtgtcatcc accgaccctc aaacatcatc ggcgaggggg ttccgtcgac cgatctgatt 11460

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cgcagtattg atgcctttgc gcgacctgat acgccggccg agtcgatgct gcgatttgtt 11640

caccattgtg gagcggaaaa gattcccgtg ggcgatattg gcgtctactt ggagaaaaag 11700

cacggagtta tgctccgctc gatagatatt ggctcatggc ttaatgctgc acgagccgct 11760

gggttacctg cggccatgga gaacctggtg acggcgacgt tgacggagaa gggccatcat 11820

gtactcccat cgctgtcaca atag 11844

<210> 4

<211> 1230

<212> DNA

<213> 嗜热踝节菌(Thermomyces dupontii)

<400> 4

atgtcccttg tggtacctag gtacttctca cagtgtccgc aacagcgatg cttccaagtt 60

ccattcaacg caagcaatgc gtgtcgtgat tataaatatg aagtacggcg gactgagtca 120

cgggtgttca ttgggaactc cagttctcga atcgccgtca tgtctgcgca gacgatcacc 180

ttccaacagc actcgacgga gccatcccgg gtgattcgcg tccatcacca tgagtctata 240

ggagaccgtc cacttccccc cgacagtgtg ctgctgcgct ttctggcagc tccgatcaac 300

ccacaagacc tgctggttat tgccggacga taccccgtgc agccacacta caagtacgca 360

gacgaaccca ttccgggcta cgacggcgtc gcgcgcgtgg agcgtgtcgg agctaatgtg 420

acgacccttc agccgggaga ccatgtcatt cctcgccatc acggcttggg cacctggcgg 480

tcggaagcag tcgtgccggc gacgtcggtg ctgaaggtgt caaaccgcct ggagcccacc 540

accgccgcac tgctgaagtt gggttgttcg accgcctacc ttttgctaga gagcagcaac 600

gccctccagc cgggggacct ggtcgcgatc aacgcggcga gcggctggat cgcccgaatg 660

gtggtccagt tcgctcggct tcgcggctgc ggcagcatct gtatcatccg cgaccgtgac 720

aacgtcgaga caacgaggca gtcactcctc gctcacggcg ctcacgtggt gctcaccgag 780

tcgcagctgg cacaagaggg cgtggccgct gcacgcacgg gcggccggcg ggtcatgcta 840

gccctggacg cggtgtttgg ggagtccggg cagcggctgg tatcgctgct ctccaccggt 900

gggacatata tcaactacgg atcgctgggg ggtgcagccg gacagatcat tctgacgcaa 960

gagctgctct tctggaagca aatcaccttt cgcaacttcc ggctgtctca ggccctggca 1020

cggtacacag aggaggcgca gatccagctc ctgacctggt tcggggagct ctttgagcag 1080

ggacagctgg ttgcgcctcc ggtgaagatc attaaatgga aaggagacgg ttcgctggag 1140

aaacgagtcc gggaggctct atctcagatc aaggagagtt ctgcaggggt ggtggggaat 1200

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

caggaattcg atatcaagct ggtacccgtc cgcaaggtgt tcgcc 45

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 8

cagagagtgc tgtggccaaa tccttgacaa agatttgtgc actg 44

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 10

ctaaagggaa caaaagctgg ggcgcgccct attgtgacag cgatgggag 49

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 11

attacgctca tatggccatg gaggccagtg atggcttcca aagttcgtcc gg 52

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 12

ctacgattca tctgcagctc gagctcgatg ctattgtgac agcgatggga gtacatg 57

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 13

atggccatgg aggccgaaat gtcccttgtg gtacctaggt acttctc 47

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 14

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Claims

1.一种琥珀酸酐类化合物，其分子式如结构式I所示：

2.如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物在制备N-羟基丁二酰亚胺、丁二酸单乙酯酰氯、红霉素琥珀酸乙酯、芬布芬、青蒿琥酯、恶丙嗪和曲匹布通中的至少一种中作为前体，用于制造玻璃纤维增强塑料，作为食品添加剂，以及提高药物活性中的应用。

3.一种制备如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物的方法，所述方法包括发酵含有编码I型PKS/NRPS酶的基因，以及含有编码ER酶的基因的异源生物，得到发酵液；通过在异源生物中表达I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物；其中，

所述I型PKS/NRPS酶具有如下(I)或(II)的氨基酸序列：

(I)来源于嗜热属(Thermomyces)的I型PKS/NRPS酶的氨基酸序列，优选地，如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列；

(II)与(I)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(I)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；

所述ER酶具有如下(III)或(IV)的氨基酸序列：

(IV)与(III)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(III)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，编码所述I型PKS/NRPS酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第一表达载体上；编码所述ER酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第二表达载体上；所述第一表达载体与所述第二表达载体不相同；

优选地，所述第一表达载体在连接上所述I型PKS/NRPS酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7；

优选地，所述第二表达载体在连接上所述ER酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7；

优选地，编码所述I型PKS/NRPS酶的基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和/或编码所述ER酶的基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述异源生物为酵母菌(Saccharomyces)；优选地，所述异源生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

6.根据权利要求3-5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2)将所述ER酶的基因连接到pGBKT7上，得到第二表达载：

3)将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化至酿酒酵母中，获得工程菌株；

4)将所述工程菌株接种至酿酒酵母的液体培养基，在30±2℃200±50rpm培养10-14小时；按照2％-10％的接种率扩大培养，在30±2℃200±50rpm的条件下发酵4-6天，得到发酵液。

7.根据权利要求3-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从发酵液中分离提纯得到如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物的步骤；

优选地，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液浓缩，得到浓缩物；

d)所述丙酮提取浸膏用凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到凝胶柱色谱分离液；然后对所述凝胶柱色谱分离液进行柱层析，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到柱层析分离液；然后对所述柱层析分离液进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物；

更优选地，

a)将所述发酵液旋转蒸发浓缩，得到浓缩物；

d)所述丙酮提取浸膏在流动性为甲醇的条件下进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中TLC检测RF值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到凝胶柱分离液；然后在流动性为5％-15％甲醇水溶液的条件下对所述凝胶柱分离液进行中压RP18柱层析，过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中TLC检测RF值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到柱层析分离液；接着对所述柱层析分离液在以体积比为11-9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱色谱分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物。

8.一种ER酶，所述ER酶具有如下(III)或(IV)的氨基酸序列：

9.一种能够编码如权利要求8所述的ER酶的基因；优选所述基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求8所述的ER酶，或权利要求9所述的基因在制备如权利要求1所述的琥珀酸酐类化合物中的应用。