CN101368169A - 产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用。本发明的重组恶臭假单孢菌将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入恶臭假单孢菌中获得的重组菌，所述脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶。所述重组恶臭假单孢菌可用来生产脱氧紫色杆菌素。生产脱氧紫色杆菌素的方法是以L－色氨酸为底物利用所述重组恶臭假单孢菌发酵生产脱氧紫色杆菌素。本发明的重组恶臭假单孢菌生产的脱氧紫色杆菌素，其产率较高，可用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用。
背景技术
紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物的代谢产物，属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，发现紫色杆菌素具有很强的生物活性：(1)具有广谱的抗菌活性，如抗staploylococcous aureus、Bacillus sp，streptococcus sp，mycobacterium，Neisserig，pseudomonas(Sanchez et al.，Reevaluation of the Violacein Biosynthetic Pathway and its Relationship toIndolocarbazole Biosynthesis.Chembiochem.20067(8)，1231-1240.)；(2)抗氧化(Konzen et al.，Antioxidant properties of violacein：possiblerelation on its biological function.Bioorg Med Chem.2006.14(24)，8307-8313)；(3)抗肿瘤细胞(de Carvalho et al.，Cytotoxicactivity of violacein in human colon cancer cells.Toxicol In Vitro.2006.20(8)，1514-21)；(4)抗病毒性；(5)抗原生动物；(6)作为染料加工各种材质布料(Akira SHIRATA et al.，Isolation of Bacteria Producing Bluish-PurplePigment and Use for Dyeing.Japan Agricultural Research Quarterly.2000.34(2)，131-140)。总之，紫色杆菌素具有很高的医学价值及工业应用前景。
在已发现的产紫色杆菌素的菌株中，对紫色色杆菌(C.violaceum)的研究最为广泛。2003年，C.violaceum全基因组测序完成，为紫色杆菌素合成途径解析及应用提供了保证。紫色杆菌素的生物合成涉及一个基因簇，长约7.3kb，包括5个基因，分别是VioA、VioB、VioE、VioC和VioD。
脱氧紫色杆菌素是比紫色杆菌素少一个氧原子的结构类似物，通常伴随紫色杆菌素产生，是紫色杆菌素合成途径的副产物。但是脱氧紫色杆菌素产量很低，分离困难，因此对其性质及生物活性研究较少。目前急需一种便利的方法来生产脱氧紫色杆菌素，加强对脱氧紫色杆菌素的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用。
本发明所提供的重组恶臭假单孢菌，是将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入恶臭假单孢菌中获得的重组菌，所述脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶。
紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶是由一株产紫色杆菌素的菌株-杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的紫色杆菌素合成相关基因簇编码的。杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056合成紫色杆菌素能力较强，其紫色杆菌素合成相关基因簇是一个新的基因簇。
其中，所述VioA为序列表中的序列2；所述VioB为序列表中的序列3；所述VioC为序列表中的序列4；所述VioE为序列表中的序列5。
所述脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子；
3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子。
所述步骤3)中的DNA分子，与1)的DNA分子最好有95％以上的同源性。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
所述恶臭假单孢菌可以为恶臭假单孢菌属的各种常见菌株如恶臭假单孢菌DSM 1693、恶臭假单孢菌ATCC 17485或恶臭假单孢菌NCIMB 10432。
所述重组恶臭假单孢菌可用来生产脱氧紫色杆菌素。
本发明的另一目的是提供一种生产脱氧紫色杆菌素的方法。
本发明所提供的生产脱氧紫色杆菌素的方法，是以L-色氨酸为底物利用所述的重组恶臭假单孢菌发酵生产脱氧紫色杆菌素。
其中，所述发酵生产中，发酵培养基为NaH2PO4·2H2O 1.3g/L、Na2HPO4·12H2O3.0g/L、NH4Cl 0.9g/L、K2HPO4·3H2O 7.5g/L、100mM MgSO4·7H2O 10mL/L、甘油3mL/L和酵母提取物1.0g/L。所述L-色氨酸在所述发酵培养基中的终浓度为0.3-0.5g/L，优选为0.4g/L。所述发酵培养基还含有诱导剂。所述诱导剂可根据构建脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇表达载体的出发载体的不同，选择不同的诱导剂。如选用pET系列载体用IPTG进行诱导，如选用pCOM系列载体，所述诱导剂具体可为正己烷。所述正己烷的终浓度为1.0mmol/L。
脱氧紫色杆菌素是紫色杆菌素合成途径的副产物，通常产量很低，分离困难，无法进行规模化生产及应用。本发明的重组恶臭假单孢菌生产脱氧紫色杆菌素，其产率较高，通常的摇瓶培养就可以达到1.5g/L发酵液，且提取方便，分离纯化简单；并且，本发明的重组菌P.putida-VioΔD是恶臭假单胞菌，方便控制，便于工业化生产。
附图说明
图1为重叠延伸PCR重组脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇。
图2为PCR扩增获得紫色杆菌素合成相关基因簇片段A、B、C和D的结果。
图3为高效液相色谱结果图。
具体实施方式
实施例1、产脱氧紫色杆菌素的重组菌P.putida-VioΔD
1)脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇
将杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.5g/L、色氨酸0.5g/L，pH为7.0)，25℃，200rpm培养36小时，按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书提取杜擀氏B2菌基因组DNA。
根据紫色杆菌素基因簇序列，采用Oligo 7.10软件设计3对引物，引物序列如表1，其中P1、P2扩增vioA及部分vioB基因部分序列，扩增产物命名为片段A；P3、P4扩增部分vioB及vioC基因，扩增产物命名为片段B；P5、P6扩增vioE基因，扩增产物命名为片段C；P4和P5两条引物之间有48bp的重复序列(图1)。
表1.PCR引物设计
分别使用P1和P2、P3和P4及P5和P6引物及高保真Pfu DNA聚合酶对杜擀氏B2菌基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，DNA模板为0.5μg，上下游引物各25pmol，2.5U Pfu DNA聚合酶。
扩增片段A和B采用表2中的PCR程序I，扩增片段C采用表2中的PCR程序II。
表2.PCR扩增程序
PCR产物片段B和C按1∶1的体积比混合，然后稀释10倍，作为进一步PCR扩增的模板。
PCR反应体系为50μL，上述含有片段B、C的混合物1.5μL，2.5U TaKaRa PfuDNA聚合酶。PCR反应程序为PCR程序III，当运行完第2步时停止程序，向反应体系中加入P3、P6引物各25pmol后接着运行PCR程序III中的3、4步骤，将片段B和C连接在一起形成片段D。用PCR产物试剂盒纯化片段D，将片段D克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-D载体，测序，测序结果表明片段D的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第3058-6198位所示。
PCR扩增获得紫色杆菌素基因簇片段A、B、C和D的结果如图2所示。
用Ase I和Not I双酶切片段A、Not I和Xhol I双酶切pMD18-T-D载体及Nde I和SalI双酶切表达载体pCOM10(Smits T.H.M.et al.，New alkane-responsiveexpression vectors for E.coli and Pseudomonas.Plasmid 2001.46，16-24.)(清华大学)回收3057bp的片段A、3140bp的片段D和pCOM10载体酶切后的大片段，将上述回收的三个片段在T4 DNA连接酶的作用下连接构建重组表达载体pCOM10VioΔD。将重组表达载体pCOM10VioΔD转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂于含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，挑取转化子培养后采用碱裂解法提取质粒，筛选含插入片断的阳性克隆，进行测序，测序结果表明VioΔD片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1自5′末端第1-1308位为VioA基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioA酶(序列表中序列2)；自5′末端第1305-4322位为VioB基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioB酶(序列表中序列3)；自5′末端第4323-5612位为VioC基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioC酶(序列表中序列4)；自5′末端第5622-6197为VioE基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioE酶(序列表中序列5)。VioΔD片段中不含有紫色杆菌素基因簇中的VioD基因。该VioΔD即为脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇。
2)表达VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的重组恶臭假单孢菌P.putida-VioΔD
将重组载体pCOM10VioΔD转入恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)mt-2NCIMB 10432，获得重组菌P.putida-VioΔD，以pCOM10载体转入Pseudomonasputida mt-2NCIMB 10432，获得的重组菌P.putida-pCOM10为对照。
在LB培养基中37℃培养菌体浓度OD600为0.7，加入体积百分含量为0.05％正己烷，20℃诱导30h。将50mL发酵液在7000×g下离心10min，弃上清液，在沉淀物中加入同体积的去离子水后用漩涡混合器将其混匀洗涤，在7000×g下离心10min，然后加入无水乙醇50mL，用漩涡混合器将其充分混匀，将洗涤液7000×g离心10min，上清转移到另外的干净的容器中，重复加入无水乙醇溶液，如上步骤直到菌体呈现灰白色为止，合并所有的乙醇提取溶液。
在P.putida-pCOM10的乙醇溶液中没有得到蓝色物质；在P.putida-VioΔD的乙醇溶液中得到蓝色物质，将P.putida-VioΔD的乙醇溶液减压蒸馏获得的物质溶于100％甲醇中进行高效液相色谱分析，使用Agilent-1100高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18，150mm×4mm，5μm；柱温30℃；洗脱剂为体积比为70％的甲醇水溶液；流速1.0mL/min；检测波长：570nm。
高效液相色谱检测结果如图3所示，表明P.putida-VioΔD的乙醇溶液中的蓝色物质与杜擀氏菌属Duganella B2紫色杆菌素副产物——脱氧紫色杆菌素保留时间一致(4.9min)，并且只有一个峰值。说明P.putida-VioΔD的乙醇溶液中的蓝色物质为脱氧紫色杆菌素。图3中，I：杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC№2056所产色素高效液相色谱图，第一峰为紫色杆菌素，第二峰为脱氧紫色杆菌素；II：P.putida-VioΔD所产色素高效液相谱图。
上述结果说明重组恶臭假单孢菌P.putida-VioΔD能表达紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE 4种酶，可以合成脱氧紫色杆菌素。
实例2、重组菌P.putida-VioΔD生产脱氧紫色杆菌素
将P.putida-VioΔD接入添加色氨酸的E2液体培养基(NaH2PO4·2H2O 1.3g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0g/L，NH4Cl 0.9g/L，K2HPO4·3H2O 7.5g/L，100mM MgSO4·7H2O 10mL/L，甘油3mL/L，酵母提取物1.0g/L，pH为7.0)，色氨酸的终浓度为0.4g/L，30℃，200rpm振荡培养过夜。次日按10ml/100ml的接种量，接种至新鲜的含卡那霉素(50μg/ml)的添加色氨酸(终浓度0.4g/L)的E2液体培养基中30℃继续发酵培养3-4h至OD600为1.0时加诱导剂正己烷(0.05ml/100ml)进行诱导，20℃诱导培养30h，离心收集菌体，菌体用乙醇进行提取，得到蓝紫色物质。
将杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.5g/L、色氨酸0.5g/L，pH为7.0)，25℃，200rpm培养36小时，离心收集菌体，菌体用乙醇进行提取，得到蓝紫色物质。
对上述两种蓝紫色物质分别进行高效液相色谱检测，方法同实施例1。
P.putida-VioΔD的蓝紫色物质的高效液相色谱检测结果表明该蓝紫色物质为脱氧紫色杆菌素。杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的蓝紫色物质的高效液相色谱检测结果表明该蓝紫色物质为紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的混合物。
对P.putida-VioΔD和杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056生产的脱氧紫色杆菌素进行定量分析。
定量分析是通过测定蓝紫色物质(色素)的乙醇溶液在最大吸收波长的吸光度值来衡量，Duganella sp B2所产脱氧紫色杆菌素测定波长为562nm，以无水乙醇作空白对照，通过吸光度值——色素浓度标准曲线得到相对应的色素浓度值，每个试验重复3次，取平均值，得到的吸光系数ε为14.8521·g-1·cm-1。
定量分析结果表明，P.putida-VioΔD生产的脱氧紫色杆菌素的量较高，最终产量达1.5g/L(平均值)，远高于杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056的脱氧紫色杆菌素的合成量(0.16g/L)。
序列表
<110>清华大学
<120>产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用
<130>CGGNARW81756
<160>1
<210>1
<211>6197
<212>DNA
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>1
<210>2
<211>435
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>2
<210>3
<211>1005
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>3
<210>4
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<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>4
<210>5
<211>191
<212>PRT
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC 2056
<400>5
Claims (10)
1.重组恶臭假单孢菌，是将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入恶臭假单孢菌中获得的重组菌，所述脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶。
2.根据权利要求1所述的重组恶臭假单孢菌，其特征在于：所述VioA为序列表中的序列2；所述VioB为序列表中的序列3；所述VioC为序列表中的序列4；所述VioE为序列表中的序列5。
3.根据权利要求1或2所述的重组恶臭假单孢菌，其特征在于：所述脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇是如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子；
3)与1)的DNA分子具有90％以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子。
4.根据权利要求1至3中任一所述的重组恶臭假单孢菌，其特征在于：所述恶臭假单孢菌为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)mt-2 NCIMB 10432。
5.一种生产脱氧紫色杆菌素的方法，是以L-色氨酸为底物利用权利要求1至4中任一所述的重组恶臭假单孢菌发酵生产脱氧紫色杆菌素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵生产中，发酵培养基包含NaH2PO4·2H2O 1.0-2.0g/L、Na2HPO4·12H2O 3.0-4.0g/L、NH4Cl 0.5-1.0g/L、K2HPO4·3H2O 7.0-8.0g/L、100mM MgSO4·7H2O 10-15mL/L、甘油3-4mL/L和酵母提取物0.5-1.5g/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基还含有L-色氨酸；所述L-色氨酸的浓度为0.3-0.5g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基还含有诱导剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述诱导剂为正己烷。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述正己烷的浓度为0.05ml/100ml。
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