CN107254429A - 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法 - Google Patents

一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107254429A
CN107254429A CN201710593822.9A CN201710593822A CN107254429A CN 107254429 A CN107254429 A CN 107254429A CN 201710593822 A CN201710593822 A CN 201710593822A CN 107254429 A CN107254429 A CN 107254429A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
nit
nitrilase
pma5
cgmcc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710593822.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107254429B (zh
Inventor
龚劲松
许正宏
史劲松
张强
李恒
蒋敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201710593822.9A priority Critical patent/CN107254429B/zh
Publication of CN107254429A publication Critical patent/CN107254429A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107254429B publication Critical patent/CN107254429B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/05—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in nitriles (3.5.5)
    • C12Y305/05001—Nitrilase (3.5.5.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产腈水解酶的重组枯草芽孢杆菌及其在烟酸合成中的应用，属于生物工程技术领域。该方法通过PCR扩增恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC 3830腈水解酶基因编码序列并与pMA5质粒相连，构建得到重组质粒pMA5‑NIT，转化至Bacillus subtilis WB600中得到可高效表达腈水解酶的重组菌B.subtilis WB600(pMA5‑NIT)，命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT‑2，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14255。以重组枯草芽孢杆菌游离细胞为催化剂，可将3‑氰基吡啶完全转化生成烟酸。本发明提供了一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌菌株，具有突出的腈水解酶活性，重组菌发酵周期短，催化效率高，具有良好的应用前景。

Description

一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法
技术领域
本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2的构建及其在烟酸合成中的应用。
背景技术
烟酸，又称维生素PP或维生素B3，是人体必需的13种维生素之一，作为药物中间体可合成多种用于治疗皮肤性疾病、高血压症和冠心病等的药物，如异烟肼、尼可刹米及烟酸肌醇酯等，还可以用做饲料或食品添加剂，具有广泛的国内外市场。据统计，世界上年消耗烟酸8万吨以上，目前都采用化学法生产，欧美产能约4万吨。目前，我国生产烟酸的原料3-甲基吡啶和3-氰基吡啶基本依赖进口，其产品生产主要被几个国际合资或独资企业，如龙沙公司等垄断。由于生产原料供应受限，我国一些化学法生产烟酸的厂家无论在生产装置规模、产品质量和生产成本等方面也都难以与国外大公司抗衡，面临严峻的技术和市场挑战。
传统的化学法生产烟酸需要消耗昂贵的氧化剂及贵金属催化剂，并存在较为严重的环境污染。如，早期烟酸是通过氧化尼古丁制备获得，后来逐渐发展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等为原料进行制备；我国目前工业生产中主要以3-甲基吡啶为原料，通过氧化反应制备获得烟酸，而其中氧化方法主要分为液相氧化法和气相氧化法，以上方法具有氧化剂价格昂贵，过程复杂，产物难分离，污染较严重及对生产设备要求高等不足之处。腈水解酶介导的微生物催化合成烟酸是近年来快速发展的可替代性颠覆技术，具有污染排放少、高效生物催化、生产成本低等比较优势。
枯草芽孢杆菌作为一种传统的、安全可靠的表达宿主，在工业、农业以及医药等领域有着广泛应用，传统的重组表达产腈水解酶多数需进行体外诱导，增加了工艺步骤和生产成本。构建高产腈水解酶的枯草芽孢杆菌表达体系，无需添加诱导剂，可降低生产成本及缓解对菌体或酶蛋白造成的毒害作用，对于工业规模烟酸的生物合成具有重要的研究意义和实践价值。
发明内容
本发明的目的是构建一种无需进行体外诱导并且高产腈水解酶的枯草芽孢杆菌表达体系，并应用于烟酸的生物转化合成。
本发明采用的技术方案是：一种产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌NIT-2构建，方法如下：
1)腈水解酶基因NIT的制备：提取恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC 3830基因组，利用引物设计软件Oligo 7设计引物2PU和A5D，PCR扩增得到两端携带Nde I和MluI酶切位点的腈水解酶基因NIT，引物序列如下：
2PU：5'-GGAATTCCATATGATGGTTACGTACACGAATAAGTT-3'
A5D：5'-CGACGCGTTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3'
2)含Nde I和Mlu I酶切位点pMA5质粒的制备：利用Nde I和Mlu I限制酶对pMA5质粒进行双酶切；
3)腈水解酶基因与pMA5质粒的连接：连接经过Nde I和Mlu I限制酶酶切后的腈水解酶基因NIT与pMA5质粒，得到重组质粒pMA5-NIT；
4)重组质粒的转化：将重组质粒pMA5-NIT转入B.subtilis WB600中，构建获得可产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2。该菌株保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间2017年6月19日，分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.14255。
本发明还提供所述产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌NIT-2在转化合成烟酸中的应用，所述应用为：以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2在TB培养基中发酵获得的菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中构成转化反应体系，在30℃条件下进行转化反应，采用HPLC检测转化液中底物残留情况，反应完全后，获得的转化液中即含有烟酸。
所述反应体系中底物投料浓度为50-200mM。
所述枯草芽孢杆菌经发酵培养获得的含酶菌体的质量用量以菌体干重计为1.0～4.0g/L。
本发明所述检测底物3-氰基吡啶和产物烟酸的高效液相色谱条件为：Dionex3000型高效液相色谱仪，色谱柱为WATERS公司的XBridge dC 18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱温30℃，流速为0.5mL/min，紫外检测波长268nm，流动相为乙腈/0.02％三氟乙酸(3/2)。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明首次成功构建了产恶臭假单胞菌重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2，其无需进行体外诱导便可高效表达腈水解酶，降低了生产成本，提高了工艺效率，可为生物催化合成烟酸提供廉价的催化剂；(2)枯草芽孢杆菌作为一种传统的基因工程菌株，不仅生长周期较短，而且在工、农、医等领域均具有重要应用价值，其作为宿主菌表达的目的蛋白安全、可靠，本发明中所构建的含腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2，在生物催化生产烟酸中，提升了生产的烟酸的安全层级，能够满足该烟酸产品在食品、医药等安全较高领域的应用；(3)本发明将枯草芽孢杆菌NIT-2用于生物催化生产烟酸，结果表明，该菌可有效生物催化生产烟酸，3-氰基吡啶转化率可达到100％，在生物催化生产烟酸领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2用于生物催化生产烟酸过程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2的构建
1)腈水解酶基因NIT序列的扩增：从恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830中提取基因组DNA，作为模版，设计上下游引物2PU及A5D，在两端分别添加Nde I和MluI酶切位点，进行PCR扩增，引物：
2PU：5'-GGAATTCCATATGATGGTTACGTACACGAATAAGTT-3'
A5D：5'-CGACGCGTTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3'
PCR扩增体系：
PCR反应程序：在95℃预变性3min后开始循环，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；于72℃下终延伸5min；12℃保温获得两端携带Nde I和Mlu I酶切位点的腈水解酶基因NIT。
2)含Nde I和Mlu I酶切位点pMA5质粒的制备：利用Nde I和Mlu I限制酶对pMA5质粒进行双酶切，酶切体系设计如下：
经琼脂糖凝胶电泳分析回收获得两端携带Nde I和Mlu I酶切位点的pMA5质粒。
3)腈水解酶基因与pMA5质粒的连接：连接经过Nde I和Mlu I限制酶酶切后的腈水解酶基因与pMA5质粒，得到重组质粒pMA5-NIT，连接体系设计如下：
4)重组质粒的转化：将重组质粒pMA5-NIT转入B.subtilis WB600中，得到可产腈水解酶的枯草芽孢杆菌NIT-2。
实施例2：枯草芽孢杆菌NIT-2游离细胞的制备
将于TB培养基中培养8～10h的发酵液于12000×g离心1min后弃去上清液，再用pH7.2、100mM磷酸钠缓冲液(PBS)重悬菌体并洗涤2～3次，得到除去培养基残液的菌体，最后用相同的磷酸钠缓冲液重悬菌体得到游离细胞悬浮液，测定菌体浓度后保存于4℃冰箱中备用。
实施例3：生物转化合成烟酸
将制备的游离细胞菌悬液(100mL，菌体干重为2.87g/L)与1.04g 3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为100mM)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过HPLC检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，即获得含烟酸的转化液。
枯草芽孢杆菌NIT-2游离细胞能够在13min内完全转化100mM底物，3-氰基吡啶的转化率可达到100％，HPLC未检测出副产物烟酰胺生成，单位菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为16.72 g/h。
SEQ ID NO:1
Composition 262 A; 293 C; 276 G; 282 T; 0 OTHER
Percentage: 23.5% A; 26.3% C; 24.8% G; 25.3% T; 0.0%OTHER
Molecular Weight (kDa): ssDNA: 343.21 dsDNA: 686.18
ORIGIN
1 TCAGCTCTCT TCATGGACCT TAACCGGCTC AAATTGAGCG AGCGACTTTT GTAAGAAAGG
61 ACCGGGGACT TCCAAGCTAT ACGTTAAGCC GGGTACCGTA CCCTGCGATA TTGAGGAAAA
121 GACTTCCTCC GACTCAATAT GTTTGCCCAT ATCCTTCAGA CGTTTGACGG GAGATTGGGC
181 CTGGTTATTG AACTGCAATG AAAAAACATC GGGCCGGGAA TAATGGCCCA CAGGGTCTGC
241 AGCCTGTTTA GCCATCGTGA TTTGGGCCAG ATCGATCTCG GCGTAGAGGA TCCCCTCTCC
301 ATCCGCAGGC AGCCGCTCGG CTAATGGCCG ACCGTCCGGT CCGAATATTT GAGCGAATCC
361 CCCGCCATAG CCGATAAGCT TTTTGTGCAT TTCGTTTTCG CAGAAAAACT CAAGTGCAGC
421 TTTTCCCACA ACCTGAGTCG AGCACAACAC GAAGGTTTGA CCTTCCATTG CGTACATTTG
481 GGTGGCAACA AGCTGTGCTT CGGAACTGAA GGCGAACACT TCAGGCTGAT ATAAGGACAT
541 CCCAGGCCAT GCCGCGATGT GGACCTGTTC ATGTCATCGC GTACATCGCG TATTTGGTTG
601 GGGTCTGGAA ATGTTCCCAA CAGTTCAAAG CGCCGACCCT ACCAATAGGC ATGTCGTGAA
661 CTGCGATGTC CGAGCCATCA CCTTCGCCAT AGACGGTACG CTCTACATGA GTGGGTTTCA
721 GCTTTCGTCT GTGAGCAACG ATCTTCCCTT TTTCATCAAT AATCAGTTGG CTCATGTAGA
781 GGCTGCCGCC ATCGCGCTCA CTGAATCCGA TCACCACACA TATATTATTG CTCTCGGCAG
841 CTTCCTGAAT CCGTGTGATC AACGGGCTGT CAATCGACAG GGATTGTTCA TGATAGCGTG
901 TGGCGAACTT GCCCATCCCC GCGAAGGGGC TATCCAGCCA GATGTGATAC GGATATCCGG
961 GAATAAAAAC CTCAGGAAAT GCGATGATCT GAGCATTGTT GTCGGCTGCT TCTTTTATTA
1021 GGCCGATAGT TTCTCGACAG TAGCCGCGGC ATCAAACCAG ACGGGTTCAG CTTGAACCGT
1081 AGCCGCTTTG AACTTATTCG TGTACGTAAC CAT

Claims (6)

1.一株能高效表达重组腈水解酶、并转化3-氰基吡啶合成烟酸的枯草芽孢杆菌，其特征为，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NIT-2，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14255，保藏日期2017年6月19日。
2.权利要求1所述菌株，其特征在于含有重组质粒pMA5-NIT。
3.CGMCC No.14255的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)腈水解酶基因NIT序列的扩增：从恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC 3830中提取基因组DNA，作为模版，设计上下游引物2PU及A5D，在两端分别添加NdeI和MluI酶切位点，进行PCR扩增，获得两端携带NdeI和MluI酶切位点的腈水解酶基因NIT，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；引物序列如下：
2PU：5'-GGAATTCCATATGATGGTTACGTACACGAATAAGTT-3'
A5D：5'-CGACGCGTTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3'
2)利用NdeI和MluI限制酶对pMA5质粒进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析回收获得两端携带酶切位点的pMA5质粒；将经同样酶切的腈水解酶基因与pMA5质粒，得到重组质粒pMA5-NIT；
3)将重组质粒pMA5-NIT转入表达宿主中，构建获得可产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌CGMCC No.14255。
4.CGMCC No.14255在生物转化合成烟酸中的应用方法，其特征在于：以含CGMCCNo.14255的游离细胞菌悬液作为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在20-45℃条件下进行转化反应，采用HPLC检测转化液中底物3-氰基吡啶的残留情况，反应完全后，获得含烟酸的转化液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物投料浓度为50-200mM。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于CGMCC No.14255的游离细胞用量，以菌体干重计为1.0～4.0g/L。
CN201710593822.9A 2017-07-20 2017-07-20 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法 Active CN107254429B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710593822.9A CN107254429B (zh) 2017-07-20 2017-07-20 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710593822.9A CN107254429B (zh) 2017-07-20 2017-07-20 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107254429A true CN107254429A (zh) 2017-10-17
CN107254429B CN107254429B (zh) 2020-05-22

Family

ID=60025616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710593822.9A Active CN107254429B (zh) 2017-07-20 2017-07-20 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107254429B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136301A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种水解制备烟酸的方法
CN109234257A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 南京农业大学 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用
CN109295124A (zh) * 2018-10-24 2019-02-01 张刘兵 一种水解制备烟酸的方法
CN111778199A (zh) * 2020-09-07 2020-10-16 鲁东大学 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN114317506A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 兄弟科技股份有限公司 一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用
CN114410669A (zh) * 2022-03-28 2022-04-29 佛山市玉凰生态环境科技有限公司 重组腈水解酶的生产及固定化方法及其对乙腈的降解应用
CN114940649A (zh) * 2022-06-22 2022-08-26 大连万福制药有限公司 一种合成吲哚布芬中间体2-（4-硝基苯基）丁酸的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937821A (zh) * 2014-04-22 2014-07-23 江苏大学 一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术
CN104911174A (zh) * 2015-06-05 2015-09-16 浙江工业大学 一种含腈水解酶细胞的固定化方法
CN105176955A (zh) * 2015-08-27 2015-12-23 浙江工业大学 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937821A (zh) * 2014-04-22 2014-07-23 江苏大学 一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术
CN103937821B (zh) * 2014-04-22 2017-05-03 江苏大学 一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术
CN104911174A (zh) * 2015-06-05 2015-09-16 浙江工业大学 一种含腈水解酶细胞的固定化方法
CN105176955A (zh) * 2015-08-27 2015-12-23 浙江工业大学 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136301A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种水解制备烟酸的方法
CN109234257A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 南京农业大学 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用
CN109234257B (zh) * 2018-09-21 2022-05-10 南京农业大学 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用
CN109295124A (zh) * 2018-10-24 2019-02-01 张刘兵 一种水解制备烟酸的方法
CN111778199A (zh) * 2020-09-07 2020-10-16 鲁东大学 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN111778199B (zh) * 2020-09-07 2020-11-24 鲁东大学 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN114317506A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 兄弟科技股份有限公司 一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用
CN114410669A (zh) * 2022-03-28 2022-04-29 佛山市玉凰生态环境科技有限公司 重组腈水解酶的生产及固定化方法及其对乙腈的降解应用
CN114410669B (zh) * 2022-03-28 2022-06-17 佛山市玉凰生态环境科技有限公司 重组腈水解酶的生产及固定化方法及其对乙腈的降解应用
CN114940649A (zh) * 2022-06-22 2022-08-26 大连万福制药有限公司 一种合成吲哚布芬中间体2-（4-硝基苯基）丁酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107254429B (zh) 2020-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107254429A (zh) 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法
CN102605006B (zh) 一种白藜芦醇的生物生产方法
CN104560927B (zh) 一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
CN108753669A (zh) 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用
JP4998991B2 (ja) セルラーゼの製造方法
CN105039374B (zh) 一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用
CN107858340A (zh) 高催化活性的d‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用
CN101691560B (zh) 大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
CN101368169B (zh) 产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用
CN104726435B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株
CN105200076A (zh) 一株重组表达γ-内酰胺酶的枯草芽孢杆菌、固定化及应用
CN103184210B (zh) 一种定点突变改造的基因工程腈水解酶
CN102120999A (zh) 利用基因工程菌株耦合发酵合成人乳岩藻糖基化寡糖的方法
CN104862264B (zh) 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌
CN107012178A (zh) 一种酶法合成l‑2‑氨基丁酸的方法
CN107217025A (zh) 一种产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌jg‑1及其制备方法和应用
CN103937842B (zh) 一种提高全细胞转化生产α‑酮戊二酸产量的方法
CN110904014A (zh) 一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用
CN102936590B (zh) 一种腈水解酶及其基因序列与应用方法
CN111394396B (zh) 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
CN104560800A (zh) 一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(r)-苯乳酸中的应用
CN111154746B (zh) 酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN103146785B (zh) 解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺
CN107630057B (zh) 一种生产2-氧-α-D-吡喃葡糖基抗坏血酸的方法及其专用工程菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant