CN109234257B - 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腈水解酶基因nit2及其过表达方法和应用。一种哈茨木霉NJAU4742中IAA生物合成的关键基因腈水解酶基因nit2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。含有腈水解酶基因nit2的过表达方法。腈水解酶基因nit2及其过表达片段在构建IAA产量显著提高的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌中的应用。本发明最新发现的哈茨木霉NJAU4742中nit2基因在IAA合成过程中具有重要的作用，基因的过表达后均能显著增加植物主根系根毛区中柱鞘位置的IAA含量。本发明为新型木霉生物有机肥的研制、生态农业的发展提供了理论基础和技术保障。

Description

一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用。

背景技术

吲哚-3-乙酸又被称为生长素(IAA)，是一类含有吲哚环结构的植物内源激素，可调节植物细胞的生长、根茎叶的分化及果实发育，在植物生长发育的各阶段发挥着重要作用。研究表明，根际有益微生物也能够合成IAA，虽然合成的量比较少，其中木霉属(Trichoderma spp.) 的根际有益菌成为研究的热点。木霉是一类重要的植物促生菌，不仅具有很强的根际定殖能力，更可显著促进植物的生长发育。已有报道表明，木霉对辣椒、马铃薯、莴苣、黄瓜、白菜、豌豆、花生、长春花和菊花等多种作物有促生效应，尤其对植物根系的促生具有显著的效果。这些显著促生作用，可能是源于根际促生菌PGPR合成的IAA调节植物内源激素含量或提供外源激素促进宿主植物的生长和发育(抑制主根系伸长和增加侧根数量)，进而扩大了根系与土壤的接触面积增加了根系对养分水分的吸收能力提高农作物产量等。

微生物合成IAA途径比较多，与植物中IAA的合成途径具有较大的差异，相关的基因、蛋白及中间产物还不是很确定。色氨酸是细菌IAA生物合成的主要前体物质，以色氨酸为前体至少具有5种IAA生物合成途径。目前在细菌和植物体内编码限速步骤关键酶有吲哚-3-丙酮酸脱羧酶(IPDC)，吲哚-3-乙醛脱氢酶(IAAld)，在细菌和巴西固氮菌中缺失这两个基因均能导致IAA生物合成降低，然而目前没有获得过IAA完全缺失突变株，表明IAA生物合成具有冗余功能。但是关于木霉合成IAA代谢通路及其关键基因的研究还比较少，而且绝大多数研究只涉及一个生物合成途径的某个特异性基因或特异性酶。

本专利基于生物信息学技术分析预测了哈茨木霉NJAU4742中IAA生物合成中编码限速步骤关键基因,通过荧光定量分析、基因敲除、基因过表达等方法确定哈茨木霉NJAU4742中 IAA合成的关键基因，并利用基因工程的方法获得能显著提高IAA合成能力的菌株。因此，本专利对于提高木霉产生IAA的能力及与植物互作、促进植物的生长及提高自身免疫能力具有重要的意义。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种哈茨木霉NJAU4742中IAA生物合成的关键基因腈水解酶基因nit2。

本发明的另一目的是提供含有腈水解酶基因nit2的过表达片段。

本发明的又一目的是提供该基因和过表达片段的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种哈茨木霉NJAU4742(CGMCC No.12166)中IAA生物合成的关键基因腈水解酶基因 nit2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的腈水解酶基因nit2编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有权利要求1所述的腈水解酶基因nit2的过表达片段。

所述的过表达片段优选所述的腈水解酶基因nit2的过表达片段。

所述的腈水解酶基因nit2的过表达片段进一步优选主要通过以下方法构建：以哈茨木霉 NJAU4742的基因组为模板，克隆长度为1780bp的强启动子片段，nit2基因的完整片段，目的基因下游约1200bp的同源臂，以及潮霉素B抗性基因片段，并将4个片段按以上顺序，利用融合PCR技术进行融合，，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种基因工程哈茨木霉，用所述的腈水解酶基因nit2的过表达片段转化哈茨木霉NJAU4742 所得。

所述的转化方法优选原生质体转化。

本发明所述的腈水解酶基因nit2在构建IAA产量显著提高的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌中的应用。

本发明所述的过表达片段在构建IAA产量显著提高的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌中的应用。

本发明所述的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌在制备生物肥料中的应用。

有益效果：

本发明是为全面了解哈茨木霉NJAU4742中IAA生物合成通路，对已测序的基因组进行分析，筛选出哈茨木霉NJAU4742中18个可能与IAA合成相关的候选基因，并进一步明确这些基因在IAA生物合成过程中的作用。通过转录水平分析、基因敲除、基因过表达等方法，研究木霉IAA生物合成途径中编码限速步骤的关键基因(腈水解酶基因和吲哚乙醛脱氢酶基因)并获得能显著增加产IAA的突变株，提高木霉对植物的促生作用。

通过基因同源重组方法获得基因敲除和过表达突变子，发现了有两个基因对于木霉IAA 生物合成贡献率显著高于其他的基因，腈水解酶基因nit就是其中之一；腈水解酶基因nit2基因敲除突变株IAA的合成能力显著下降，较之腈水解酶基因nit敲除菌株，野生型木霉 NJAU4742定殖后IAA生物合成能力提高，其合成的IAA积累在植物根系表面促进植物侧根原基的发育，显著增加了侧根数量。腈水解酶基因nit2的过表达突变株IAA的合成能力显著提高。本发明利用提高木霉分泌IAA能力促进植物根系生长发育，为新型木霉生物有机肥的研制提供了一种可行的方法，有利于肥料中的木霉菌株施入土壤后快速提高根系生长发育，促进作物生长。

附图说明

图1接种木霉NJAU4742对黄瓜植株的促生。其中MT代表单独接种木霉在MS营养液的处理；MTC代表接种木霉到黄瓜根系进行互作的处理；MC单独培养黄瓜的对照处理；1B 单独培养黄瓜和接种木霉后黄瓜根系活力的测定结果；1C 表示不同处理对黄瓜促生效果的生物指标测定结果。

图2接种木霉和添加等量的IAA(1μmol)后在黄瓜生长过程中测定黄瓜根系内IAA含量的变化。

图3接种木霉NJAU4742于黄瓜根系互作后，将筛选出的关键基因进行转录分析。同一培养条件下不同基因间或不同培养条件下(是否与黄瓜共培养)同一基因间的差异在p<0.05水平上显著；定量PCR结果采用2^-ΔΔCt方法计算，以tef1为管家基因，以在木霉单独培养时的转录水平作为单位1进行转录差异比较。

图4外源添加色氨酸后比较生长素生物合成关键基因的转录分析。同一培养条件下不同基因间或不同培养条件下(是否添加色氨酸)同一基因间的差异在p<0.05水平上显著；定量 PCR结果采用2^-ΔΔCt方法计算，以tef1为管家基因，以在木霉单独发酵时的转录水平作为单位1进行转录差异比较。

图5IAA生物合成关键基因腈水解酶基因敲除突变株IAA含量定性和定量分析。

图6IAA生物合成关键基因腈水解酶基因过表达突变株IAA含量变化。

图7木霉对拟南芥的促生效果；Control代表单独培养拟南芥的对照处理：接种野生型菌株NJAU4742和基因敲除突变株△nit2在拟南芥根系进行互作的促生效果；DR5::GFPIAA响应基因在拟南芥根系的表达；SR(Secondary root)代表拟南芥根系侧根区域。PR(primary root) 代表拟南芥主根区域。

图8nit1和nit2基因敲除片段构建示意图。

图9nit2基因过表达片段构建示意图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1菌株活化与制备

1、菌株的观察：NJAU4742菌株为哈茨木霉(Trichoderma guizhouense)，具有以下特征：丝状真菌，菌丝有隔丛枝状，分生孢子梗光滑，绿色，顶端膨大呈球形，上面有生小梗产生孢子，分生孢子光滑球形，绿色。

2、菌株的培养

1)将NJAU4742接种到固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天，将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌水洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的玻璃瓶中制备成了孢子悬液备用。

2)将哈茨木霉NJAU4742孢子液按照1％接种到配置好的PDA培养基中摇瓶培养，装液量为三角玻璃瓶体积的20％-50％，培养条件为：温度为28℃、180rmp、4天后用4层纱布过滤后将菌体溶于100mL无菌水中，吸取1mL均匀混合菌液与黄瓜根系。

实施例2哈茨木霉NJAU4742在水培无菌条件下对黄瓜的促生作用

1.促生效果

本研究所用的黄瓜种子为江苏省农业科学院露丰黄瓜。种子在70％(v/v)乙醇中消毒约 5分钟，然后用20％次氯酸钠(NaClO)浸泡20分钟，然后用无菌水冲洗种子至少4次。消毒后的无菌种子在30℃黑暗中萌发24h，然后将萌发的种子置于含有营养液的烧杯栏上面无菌培养7天，将长势一致的无菌苗移入提前灭菌准备好的含有50mL霍格兰营养液的三角瓶进行培养，接入木霉菌体进行互作实验。在互作第10天各处理间生长差异显著结果如图1A 所示。

2.根系活力测定(TTC法)

称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液(pH 7.0)各5mL，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温2h，此后立即加入1M硫酸2mL，以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上)。把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯4mL，充分研磨，以提出 TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量即根系活力结果如图1B 所示结果表明木霉能显著提黄瓜根系活力与对照相比提高了3.2倍。

3.黄瓜植株生长指标测定

各处理差异显著时测定黄瓜生长指数(株高、茎粗、叶面积、SPAD、地上部、地下部鲜重和干重)，株高，叶宽叶长采用直尺测定；茎粗采用游标卡尺直接测定；SPAD用叶绿素测定仪(SPAD-502)直接测定；地上部和地下部鲜重和干重采用电子天平测量；结果如图1C 所示，接种NJAU4742的处理，其生长量远远好于对照组处理；通过液氮研磨法提取黄瓜根系IAA后离心萃取浓缩后测定不同生长时期黄瓜根系IAA含量变化，结果如图2所示，与等量外源添加的IAA处理相比木霉与黄瓜根系互作后能显著逐渐增加黄瓜根系IAA的含量。在第30天时，木霉处理IAA含量与对照(单独培养黄瓜)处理相比较增加了1.87倍而且具有逐渐增加的趋势。

实施例3黄瓜根系IAA含量测定

剪取黄瓜根系液氮冷冻研磨后溶于甲醇进行萃取后用ELISA法进行测定：

1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μl，余孔分别加标准品或待测样品50μl，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，每孔加Detection Reagent A 50μl(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育 1小时。

2)弃去液体，甩干，加入350μl的1x Wash Solution，浸泡1-2分钟，甩干。洗板3次，最后一次将酶标板倒扣于吸水纸上，吸干液体。

3)每孔加Detection Reagent B工作液(临用前配制)100μl，加上覆膜，37℃温育，30 min。

4)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤2。

5)每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色(反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。

6)每孔加50μl终止液终止反应，此时蓝色转变成黄色。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。用相应的标准曲线计算出该菌株产IAA的量。测定结果如图2 所示接种木霉能增加根系IAA含量，在接种木霉第5天开始黄瓜根系IAA与对照相比呈现逐渐增加的趋势，尤其在第30天时木霉处理与对照相比增加了1.87倍。

实施例4哈茨木霉NJAU4742中与IAA合成关键基因的筛选

已有研究报道了微生物中IAA合成途径及各反应所需的催化酶。根据哈茨木霉菌T. guizhouense NJAU 4742基因组注释文件进行生长素生物合成相关基因挖掘，将获得的生长素蛋白序列依据进行人工比对，分析筛选出含有这些催化酶功能域的蛋白(参数为E值：1e-5，覆盖率>60％,相似度>50％)，得到其对应的基因用于后续实验。

按照PDA配方配制PDA培养基(pH 6.5)，115℃，30min灭菌，后添加150umol过滤除菌后加入到融化后温度适中的PDA培养基中倒入9cm平板，并于其上覆盖一层灭菌的玻璃纸(Cellophane)。每个平板接种300ul木霉T.guizhouense NJAU 4742孢子悬液(10⁶spore ml^-1)，28℃,48h后收集菌丝，用RNeasy Plant Mini Kit提取RNA，RevertAid^TMFirst StrandcDNA Kit合成第一链cDNA作定量qPCR分析(qTOWER,Jena Analytics)。同时当木霉与黄瓜根系互作后，将定殖在黄瓜根系的菌丝体通过超声波法收集菌丝体，液氮研磨后用RNeasyPlant Mini Kit提取RNA，RevertAid^TMFirst Strand cDNA Kit合成第一链cDNA作定量qPCR分析 (qTOWER,Jena Analytics)通过荧光定量的方法定量可能与IAA合成相关的候选基因的转录水平。RT-PCR体系如下：

2×IQ^TMSYBR Green Supermix 10μl

引物F(10μM)1μl

引物R(10μM)1μl

模板cDNA(200ngμl^-1)1μl

加超纯水至20μl。qPCR反应条件设置如下：

95℃，6min；95℃，30s；60℃，1min，40×；72℃，7min

溶解曲线：55-95℃，每6s升高温度0.5℃

荧光定量PCR结果(图3)表明，哈茨木霉NJAU4742与植物根系互作后，与哈茨木霉NJAU4742中IAA合成相关基因的表达量有显著变化的分别是nit1、nit2、nit3、ipdc3、ao、ald1、ald2和ald3(基因引物序列如表1所示)，同时根据木霉菌体外源添加色氨酸后生长素相关基因的转录水平结果显示(图4)在与植物互组基础上分析相关基因转录水平，其中以腈水解酶基因(nit)和吲哚乙醛脱氢酶基因(ald)的转录水平最高。因此本发发明挑选nit2基因，进一步验证其功能与对IAA合成的贡献率。

表1 IAA生物合成中相关基因定量引物

实施例5哈茨木霉NJAU4742中IAA生物合成关键基因敲除、过表达突变子的构建和IAA含量比较

1、菌体培养：将NJAU4742接种到固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天，将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌8％NaCl洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的离心管中待用。

2、nit1和nit2基因敲除：基于同源重组原理构建目的基因敲除片段，分别扩增基因上游、下游约1200bp的同源臂片段以及潮霉素B抗性基因片段(约2300bp，序列见SEQ IDNO.4)，并将3个片段通过融合PCR技术进行片段融合，所有引物如表2所示，片段融合与敲除方法如图8所示，具体步骤如下。

上、下游同源臂克隆PCR体系设置如下：

反应条件：

hph cassette表达盒克隆PCR体系设置如下：

潮霉素隆PCR体系设置如下：

PCR反应条件设置如下：

98℃——10s

98℃——10s

60℃——15s 30×

72℃——2.30min

72℃——10min

将上述三个片段用融合PCR技术分两步融合，具体如下。

第一步：

2×CloneAmp HiFi PCR Premix——10μl

上游同源臂片段(250ng/ul)——1μl

潮霉素B抗性基因片段(250ng/μl)——1μl

下游同源臂片段(250ng/ul)——1μl

ddH2O——7μl

不加引物，PCR体系20ul。

第一步PCR反应条件设置如下：

98℃——10s

98℃——10s

60℃——15s 15×

72℃——30s

72℃——10min

第二步：

2×CloneAmp HiFi PCR Premix——25μl

引物(nit1-up-F或nit2-up-F，10uM)——2μl

引物(nit1-down-R或nit2-down-R，10uM)——2μl

第一步PCR产物——4μl

加超纯水17μl。

第二步PCR反应条件设置如下：

98℃——10s

98℃——10s

60℃——15s 30×

72℃——30s

72℃——10min

将PCR产物进行凝胶电泳验证，将正确的融合片段进行切胶回收用于后续实验验证。

3、原生质体制备：

木霉原生质体制作分别按要求配制200mL溶液A(含1.2M山梨醇和0.1M KH₂PO₄， pH5.6)、100mL溶液B(含1M山梨醇、50mM CaCl₂和10mM Tris-HCl，pH 7.5)和100 mL PEG溶液(含25％PEG6000、50mM CaCl₂和10mM Tris-HCl，pH 7.5)。木霉原生质体制作分如下7步完成：

1)在PDA平板上贴一层Cellphon，并用涂布棒铺平，在玻璃纸上加100微升孢子悬液，涂布均匀，做10个同样的处理，28℃培养18小时Cellphon玻璃纸上长有新鲜的木霉菌丝

2)在无菌离心管中称取加0.15g裂解酶(sigma L-1412)到20mL溶液A中，混匀，用0.22um的无菌滤膜进一步过滤除菌。取无菌平板吸取4mL裂解液将一张布满菌体的玻璃纸倒贴，继续加4mL裂解液再加一张玻璃纸，每个平板贴5张，依次贴完后封口，置于28℃，100rpm，100min。

3)将裂解完的菌体用5mL枪头轻轻吸打破碎，将原生质体悬液过滤到冰上的50mL离心管中。

4)2000rpm，4℃离心10min，弃上清，用4mL溶液B重悬后继续2000rpm，4℃离心10min，弃上清，用0.2mL溶液B重悬原生质体至终浓度达10⁸，放置冰上待转化。

5)转化用DNA提前纯化，转化体系中DNA体积不超过20ul，DNA浓度应不少于200ng/ul，转化体系操作在冰上进行:

200ul原生质体悬液

10ul纯化DNA片段

50ulPEG，冰上20min。

6)加入2mL PEG摇匀，20℃放置5min，加入3mL溶液2，混匀。

7)上述将转化液添加500ul到提前倒好PDA(含1M蔗糖)的蔗糖培养基上用涂布棒均匀涂满平板，28℃，24h后待原生质体复苏萌发。

8)在该PDA(含1M蔗糖)培养基上小心倒入一层厚度约2-3mm的含200ug ml^-1潮霉素B的PDA(不含1M蔗糖)培养基。

9)28℃培养3-4天将长势正常的菌落挑取。将菌落转接至新的含200ug/mL潮霉素B的 PDA平皿(60mm)中继续培养2-3天，对有抗性的转化子菌落筛选验证，最终获得木霉基因突变子。

4、基因敲除突变子(Δnit1和Δnit2)筛选与鉴定

木霉Δnit1和Δnit2敲除突变子筛选方法如下：

1)用无菌枪头挑取各个转化子菌丝若干，分别置于含20ul Dilution Buffer(Phire Plant Direct PCR Master Mix试剂盒，Thermo Scientific)的PCR管中，用枪头稍微压打菌丝，以帮助破壁释放gDNA；

2)真菌菌落PCR验证转化子阳性，PCR体系设置如下：

2×Phire Plant Direct PCR Master Mix——10μl

引物E-nit1-F或E-nit2-F——1ul

引物E-R2-hypB——1ul

上述含DNA的Dilution Buffer——0.5ul

加超纯水至20ul。

PCR反应设置如下：

98℃——5min

98℃——5s

60℃——5s 30×

72℃——34s

72℃——10min

所用引物见表2：筛选敲除转化子分别用引物对E-nit1-F/E-R2-hypB， E-nit2-F/E-R2-hypB的片段长度分别≈1.6kb和1.5kb；将菌落PCR验证为阳性的转化子置于28℃光照条件下继续培养，直至产孢；收集各阳性转化子孢子，稀释涂布于含200ug ml^-1潮霉素B的PDA平皿(90mm)中培养16-24h，孢子萌发后进行单胞分离，纯化菌株至新的PDA平皿(60mm)中培养，每个转化子分离5-6个单株；采用菌落PCR法进一步验证基因的缺失，菌落PCR如上所述，所用引物为E-nit1-F/E-R2-hypB和E-nit2-F/E-R2-hypB，以验证融合片段的正确插入同时用nit1-g-F、nit1-g-R引物和nit2-g-F、nit2-g-R验证基因在基因组上的缺失；将纯化的阳性突变子备份保存至-80℃。

IAA含量的测定：等量孢子液的野生型菌株和不同突变株接种在含有150umol/L色氨酸的PDB中进行液体发酵，28℃，170rpm，4天，然后离心5000rpm，4℃，5min，取上清液调节pH为2.8并用等体积乙酸乙酯进行3次萃取，萃取结束后将萃取液进行旋转蒸发后将浓缩物质溶解在1mL甲醇中待测。采用ELISA法测定。结果如图5所示，与木霉野生株NJAU 4742相比较△nit2基因突变株IAA含量显著降低了64％。

表2 nit基因敲除所用引物

5、nit2基因的过表达：以哈茨木霉NJAU4742的基因组为模板，分别克隆目的基因、目的基因下游约1000bp的同源臂、强启动子片段(约1780bp)和潮霉素B抗性表达片段(约2300bp，SEQ ID NO.4)，将4个片段(引物序列见表3)通过PCR技术进行片段融合，融合的示意图如图9所示，nit2基因过表达融合片段序列如SEQ ID NO.3所示。把正确的融合片段产物切胶回收，并进行下一步转化验证(转化步骤与基因敲除步骤)，挑取正确的转化子后进行单孢分离获得纯化菌株。在含有潮霉素的抗性平板上培养转化子后收集菌体，提取RNA进行反转录，进行荧光定量测定基因(引物序列见表1)的转录水平，选取转录水平最高的转化子进行IAA含量的测定，液体发酵提取RNA反转录后进行荧光定量检测各基因的转录水平后，选取几株基因过表达量相对较高的突变子，液体发酵测定IAA含量，测定结果如图6所示，过表达关键nit2基因后O1菌株内IAA产量增加与野生型菌株相比较显著增加了10％。

表3 nit2基因过表达引物

实施例6哈茨木霉NJAU4742野生株和突变株对拟南芥根系IAA含量及分布的影响

转基因材料种子处理：拟南芥种子在95％(v/v)乙醇中表面灭菌5分钟和20％(v/v)次氯酸钠消毒7分钟，用无菌水洗涤5次后保存在2mL无菌管中3天打破休眠进行春化作用。然后将种子用无菌牙签均匀点播在0.2MS固体培养基方形平板中进行萌发，放置在光照21℃， 16h，和黑暗18℃，8h培育10天后接种木霉(NJAU4742、△nit2)菌块在距根系5cm位置观察植物根系生长发育。

微生物促进植物根系生长发育与IAA的调节作用密切相关。在0.2的MS固体培养基上培养拟南芥9天后，将木霉菌块接种在距根系5cm的位置进行互作，在不同时期观察拟南芥根系生长发育。图6结果表明木霉与拟南芥互作后，能显著促进侧根发育增加侧根数量，在生长后期也能显著增加种子结实率。为了研究木霉是否影响植物中IAA的积累和转运，我们以响应IAA启动子DR5::GFP的拟南芥转基因材料进行探究。结果如图7所示。从图中可以得出，接种木霉很大程度的增加植物根系内IAA含量和扩大IAA的分布，木霉处理在植物主根IAA 含量提高与对照相比差异显著，在侧根的分生区和根尖部位IAA含量也增加尤其是在根尖部位存在，与对照差异明显。突变株△nit2对拟南芥根系的促生效果与野生型菌株相比根系IAA 含量有降低的趋势，而且主根长度的抑制效应和增加侧根数量的效应都有减弱的影响。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 948

<212> DNA

<213> 哈茨木霉NJAU 4742(T. guizhouense NJAU 4742)

<400> 1

atgagcgaaa ctatcaaagt tggcgctgtg caagctgagc ctgcttggct taacctgcca 60

gaatccgtga agaaggtcac ctcgcttgtt gagcaagctg gaaaagacgg tgtcaatgtc 120

ttgggtttcc ccgagttatt tgttcctgga tacccatgga gcatctggac tgaaccgtat 180

cttgacaaca ctggcatgtt tcacgagtac atggctaatt cgcttgtgaa agactctcct 240

gagatggctc aaatctgcga agctgttaag aaagctggca ttttcatcgt tttgggctac 300

tctgagcgag acggcgatag cttgtacatc gcccaatcct tcatcaatcc tgaggggaaa 360

attgtcctcc accgccgaaa gatcaagccg accggcgtag agcgcgcaat ttggggcgat 420

ggagatggcc tgataaatgt ggttgatagc ccctttggca agattggtgg tctcaattgc 480

tgggagcatt tccagccctt gctgcgatac cacgaataca gccagggcgt tgatatccac 540

atcgcaggat ggccaccatt ttttggcaga ccggaaaaca tccccatcct ttataccacc 600

acgggtgaag gagatcgcct cgcctgccag ttcatggcta tggagggagc ctgttttgtg 660

gtggttagca cgcaagtgat gggcgaaaag ggaagagaga agttgaagtt ggttggcagt 720

ccccatatca attcgggtgg aggtttcgcc atgatctttg gacctgatgg tacgccgctg 780

gttgacccat tggacactga tgaagagggt atcctcactg cagagattca gctgagcacc 840

attgactacg ctaagaatat gcttgatgtc gttggacatt attcccggcc agatcttttg 900

agtctgaacg tcaacttgaa aggagccaag cctgttcgat atgtataa 948

<210> 2

<211> 315

<212> PRT

<213> 哈茨木霉NJAU 4742(T. guizhouense NJAU 4742)

<400> 2

Met Ser Glu Thr Ile Lys Val Gly Ala Val Gln Ala Glu Pro Ala Trp

1 5 10 15

Leu Asn Leu Pro Glu Ser Val Lys Lys Val Thr Ser Leu Val Glu Gln

20 25 30

Ala Gly Lys Asp Gly Val Asn Val Leu Gly Phe Pro Glu Leu Phe Val

35 40 45

Pro Gly Tyr Pro Trp Ser Ile Trp Thr Glu Pro Tyr Leu Asp Asn Thr

50 55 60

Gly Met Phe His Glu Tyr Met Ala Asn Ser Leu Val Lys Asp Ser Pro

65 70 75 80

Glu Met Ala Gln Ile Cys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Phe Ile

85 90 95

Val Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Asp Gly Asp Ser Leu Tyr Ile Ala Gln

100 105 110

Ser Phe Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ile Val Leu His Arg Arg Lys Ile

115 120 125

Lys Pro Thr Gly Val Glu Arg Ala Ile Trp Gly Asp Gly Asp Gly Leu

130 135 140

Ile Asn Val Val Asp Ser Pro Phe Gly Lys Ile Gly Gly Leu Asn Cys

145 150 155 160

Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Leu Arg Tyr His Glu Tyr Ser Gln Gly

165 170 175

Val Asp Ile His Ile Ala Gly Trp Pro Pro Phe Phe Gly Arg Pro Glu

180 185 190

Asn Ile Pro Ile Leu Tyr Thr Thr Thr Gly Glu Gly Asp Arg Leu Ala

195 200 205

Cys Gln Phe Met Ala Met Glu Gly Ala Cys Phe Val Val Val Ser Thr

210 215 220

Gln Val Met Gly Glu Lys Gly Arg Glu Lys Leu Lys Leu Val Gly Ser

225 230 235 240

Pro His Ile Asn Ser Gly Gly Gly Phe Ala Met Ile Phe Gly Pro Asp

245 250 255

Gly Thr Pro Leu Val Asp Pro Leu Asp Thr Asp Glu Glu Gly Ile Leu

260 265 270

Thr Ala Glu Ile Gln Leu Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Lys Asn Met Leu

275 280 285

Asp Val Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Leu Leu Ser Leu Asn Val

290 295 300

Asn Leu Lys Gly Ala Lys Pro Val Arg Tyr Val

305 310 315

<210> 4

<211> 4295

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgaaa ctatcaaagt tggcgctgtg caagctgagc ctgcttggct taacctgcca 60

gaatccgtga agaaggtcac ctcgcttgtt gagcaagctg gaaaagacgg tgtcaatgtc 120

ttgggtttcc ccgagttatt tgttcctgga tacccatgga gcatctggac tgaaccgtat 180

cttgacaaca ctggcatgtt tcacgagtac atggctaatt cgcttgtgaa agactctcct 240

gagatggctc aaatctgcga agctgttaag aaagctggca ttttcatcgt tttgggctac 300

tctgagcgag acggcgatag cttgtacatc gcccaatcct tcatcaatcc tgaggggaaa 360

attgtcctcc accgccgaaa gatcaagccg accggcgtag agcgcgcaat ttggggcgat 420

ggagatggcc tgataaatgt ggttgatagc ccctttggca agattggtgg tctcaattgc 480

tgggagcatt tccagccctt gctgcgatac cacgaataca gccagggcgt tgatatccac 540

atcgcaggat ggccaccatt ttttggcaga ccggaaaaca tccccatcct ttataccacc 600

acgggtgaag gagatcgcct cgcctgccag ttcatggcta tggagggagc ctgttttgtg 660

gtggttagca cgcaagtgat gggcgaaaag ggaagagaga agttgaagtt ggttggcagt 720

ccccatatca attcgggtgg aggtttcgcc atgatctttg gacctgatgg tacgccgctg 780

gttgacccat tggacactga tgaagagggt atcctcactg cagagattca gctgagcacc 840

attgactacg ctaagaatat gcttgatgtc gttggacatt attcccggcc agatcttttg 900

agtctgaacg tcaacttgaa aggagccaag cctgttcgat atgtataaga ggctctcaaa 960

attgaacgct gacctgagct attctgaggt caatgctttt agatagcctc atataaactt 1020

ctgagatagt cgattagaga agaaattaag gccatataag ccaattctgc tagccaccac 1080

tgtgagactc ctaaattttg tttcttccta tttatatata gcctccaatt accacactca 1140

ccggaggaag aagaaaaagg tcccaggcca caacaggatg aatctgtata aaaaagcatt 1200

agtattaaat catgacacaa aggaaattga ctgacgagat gacaccaggg cctaaaacac 1260

gcgcatcatg cgcccaatcg tccaagctcc caaaaggcac aagggttgtt cagccggcgc 1320

cagggcgccc aaaccgggaa gagcaacaac gcctccagag gcggcaacga caccaggggg 1380

gcaccaacgg caacgacatc cgaggggaca gcgatggcag cggaggcagc agttggagca 1440

gggcagatac agggcgtcgt caggatgatg gtattgatgg tgatggtggt gacggcgatg 1500

gtcgccattc gctcccggtg gagcatgatt ctgttcatga tctcataggc caggccgagt 1560

aggatgccta ccacccacca ccaatcgatg agttggtctg tttcatgtca gcttttgtac 1620

ctgaaaattg aatagacagt gaagaaatgt tcggtaagag atgacgatga actaactctg 1680

gcggcggcga ggagcttcgg ggcgtgcagg agctgtgcag cgttagcaag acccggcaga 1740

ctggtagatt gcacatggca cttacgcatt tggacaattc tctcgaagaa aataaatgtt 1800

tttggttgtt ccacgtgata gagtttctcg aaattgtgtg agcttgacga aaaggaagat 1860

gaaaagcaag atcgcgactg cacatgcaag attttgctcg aggtacttgc tagttggtac 1920

tctttgattg cacccgatgg gcacctgaga gagctacctt acatcaatat ggccagcacc 1980

tcttcggcga tacatactcg ccaccccagc cggggcgatt gtgtgtacta ggtaggctcg 2040

tactatacca gcaggagagg tgctgcttgg caatcgtgct cagctgttag gttgtacttg 2100

tatggtactt gtaaggtggt catgcagttg ctaaggtacc tagggaggga ttcaacgagc 2160

cctgcttcca atgtccatct ggataggatg gcggctggcg gggccgaagc tgggaactcg 2220

ccaacagtca tatgtaatag ctcaagttga tgataccgtt ttgccaggat taggatgcga 2280

gaagcagcat gaatgtcgct catccgatgc cgcatcaccg ttgtgtcaga aacgaccaag 2340

ctaagcaact aaggtacctt accgtccact atctcaggta accaggtact accagctacc 2400

ctacctgccg tgcctacctg ctttagtatt aatctttcca cctccctcct caatcttctt 2460

ttccctcctc tcctcttttt tttttcttcc tcctcttctt ctccataacc attcctaaca 2520

acatcgacat tctctcctaa tcaccagcct cgcaaatcct caggttagta ttactactac 2580

tacaatcatc accacgatgc tccgcccgac gatgcggctt ctgttcgcct gcccctcctc 2640

tcactcgtgc ccttgacgag ctaccccgcc agactctcct gcgtcaccaa tttttttccc 2700

tatttacccc tcctccctct ctccctctcg tttcttccta acaaacaacc accaccaaaa 2760

tctctttgga agctcacgac tcacgcaagc tcaattcgca gatacaaatc tagaatgaaa 2820

aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 2880

tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 2940

gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 3000

gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 3060

ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 3120

ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc 3180

gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 3240

caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 3300

caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 3360

ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 3420

aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 3480

ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg 3540

gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc 3600

cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 3660

ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg 3720

actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta 3780

gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaataa 3840

tgcatgtgct gtgttcctca gaatgggccc cagaagggcg tcgagcattg tctatgaatg 3900

caaacaaaaa tagtaaataa atagtaattc tggccatgac gaatagagcc aatctgctcc 3960

acttgactat ccttgtgact gtatcgtatg tcgaaccctt gactgcccat tcaaacaatt 4020

gtaaaggaat atgagctaca agttatgtct cacgtttgcg tgcgagcccg tttgtacgtt 4080

attttgagaa agcgttgcca tcacatgctc acagtcactt ggcttacgat catgtttgcg 4140

atctttcggt aagaatacac agagtaacga ttatacatcc atcgctttct atgattaggt 4200

actcagacaa cacatgggaa acaagataac catcgcatgc aaggtcgatt ccaatcatga 4260

tctggactgg ggtattccat ctaagccata gtacc 4295

<210> 4

<211> 2347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagagctacc ttacatcaat atggccagca cctcttcggc gatacatact cgccacccca 60

gccggggcga ttgtgtgtac taggtaggct cgtactatac cagcaggaga ggtgctgctt 120

ggcaatcgtg ctcagctgtt aggttgtact tgtatggtac ttgtaaggtg gtcatgcagt 180

tgctaaggta cctagggagg gattcaacga gccctgcttc caatgtccat ctggatagga 240

tggcggctgg cggggccgaa gctgggaact cgccaacagt catatgtaat agctcaagtt 300

gatgataccg ttttgccagg attaggatgc gagaagcagc atgaatgtcg ctcatccgat 360

gccgcatcac cgttgtgtca gaaacgacca agctaagcaa ctaaggtacc ttaccgtcca 420

ctatctcagg taaccaggta ctaccagcta ccctacctgc cgtgcctacc tgctttagta 480

ttaatctttc cacctccctc ctcaatcttc ttttccctcc tctcctcttt tttttttctt 540

cctcctcttc ttctccataa ccattcctaa caacatcgac attctctcct aatcaccagc 600

ctcgcaaatc ctcaggttag tattactact actacaatca tcaccacgat gctccgcccg 660

acgatgcggc ttctgttcgc ctgcccctcc tctcactcgt gcccttgacg agctaccccg 720

ccagactctc ctgcgtcacc aatttttttc cctatttacc cctcctccct ctctccctct 780

cgtttcttcc taacaaacaa ccaccaccaa aatctctttg gaagctcacg actcacgcaa 840

gctcaattcg cagatacaaa tctagaatga aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg 900

agaagtttct gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg 960

aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata 1020

gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc 1080

tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct 1140

cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc 1200

tgcagccggt cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg 1260

ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat 1320

gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg 1380

cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc 1440

ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa 1500

cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca 1560

tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga 1620

ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg 1680

accaactcta tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc 1740

gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca 1800

gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac 1860

gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat aatgcatgtg ctgtgttcct cagaatgggc 1920

cccagaaggg cgtcgagcat tgtctatgaa tgcaaacaaa aatagtaaat aaatagtaat 1980

tctggccatg acgaatagag ccaatctgct ccacttgact atccttgtga ctgtatcgta 2040

tgtcgaaccc ttgactgccc attcaaacaa ttgtaaagga atatgagcta caagttatgt 2100

ctcacgtttg cgtgcgagcc cgtttgtacg ttattttgag aaagcgttgc catcacatgc 2160

tcacagtcac ttggcttacg atcatgtttg cgatctttcg gtaagaatac acagagtaac 2220

gattatacat ccatcgcttt ctatgattag gtactcagac aacacatggg aaacaagata 2280

accatcgcat gcaaggtcga ttccaatcat gatctggact ggggtattcc atctaagcca 2340

tagtacc 2347

Claims (5)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水解酶基因nit2在构建IAA产量显著提高的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌中的应用。

2.核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的过表达片段在构建IAA产量显著提高的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌中的应用。

3.过表达SEQ ID NO.1所示的腈水解酶基因nit2的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌在制备生物肥料中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的哈茨木霉NJAU4742基因工程菌是用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的腈水解酶基因nit2的过表达片段转化哈茨木霉NJAU4742所得。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的转化方法为原生质体转化。

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