CN108424900A - 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108424900A
CN108424900A CN201810136409.4A CN201810136409A CN108424900A CN 108424900 A CN108424900 A CN 108424900A CN 201810136409 A CN201810136409 A CN 201810136409A CN 108424900 A CN108424900 A CN 108424900A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nitrilase
gly
ala
val
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810136409.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108424900B (zh
Inventor
郑仁朝
郑裕国
张琴
吴哲明
汤晓玲
卢夏峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN201810136409.4A priority Critical patent/CN108424900B/zh
Publication of CN108424900A publication Critical patent/CN108424900A/zh
Priority to US16/968,808 priority patent/US11492606B2/en
Priority to PCT/CN2019/074110 priority patent/WO2019154249A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108424900B publication Critical patent/CN108424900B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/05—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in nitriles (3.5.5)
    • C12Y305/05001—Nitrilase (3.5.5.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其构建方法和在普瑞巴林手性中间体合成中的应用，属于生物工程技术领域。本发明分别以芜菁腈水解酶BrNIT和拟南芥腈水解酶AtNIT为亲本，运用肽段替换，将高山南芥腈水解酶AaNIT的225‑285位肽段替换BrNIT氨基酸序列的226‑286位和AtNIT氨基酸序列的225‑285位，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3所示的腈水解酶突变体BrNIT225‑285及AtNIT225‑285。相比于野生型腈水解酶，本发明提供的腈水解酶突变体催化水解外消旋异丁基丁二腈的活力及产物的立体选择性显著提高，可以满足工业化应用要求，同时在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。

Description

一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种催化活力及立体选择性提高的腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用。
背景技术
腈水解酶(Nitrilase EC 3.5.5.1)是一类催化腈类化合物(R-CN)水解生成羧酸和氨的生物催化剂，广泛应用于(手性)氨基酸、羧酸及其衍生物的合成。腈的酶法水解因其反应条件温和、过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等优势引起学术界和工业界的重视。
由于野生型腈水解酶通常难以适应工业环境需求，因此通过理性和非理性蛋白质改造方法提高腈水解酶催化性能成为研究热点。DeSantis等通过点饱和突变技术改造野生型腈水解酶，获得的突变体A190H能够催化3M 3-羟基戊二腈完全水解合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸，产物ee值高达99％(J.Am.Chem.Soc.,2003,125:11476-11477)。Schreiner等利用易错PCR技术改造Arabidopsis thaliana腈水解酶AtNIT2，筛选获得催化苯乙腈水解活力提高4倍的突变体(ChemCatChem,2010,2:263-267)。
普瑞巴林，化学名为(3S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是治疗神经病理性疼痛、癫痫、焦虑和由脊髓损伤、外伤或多发性硬化症等引起的中枢神经疼痛的一线药物。与传统同类药物相比，普瑞巴林具有服用剂量低、次数少、持续时间长、副作用小、耐受性强等优点，已成为全球畅销药之一。
手性中心的构筑是普瑞巴林合成的关键，生物催化法合成普瑞巴林手性中间体的研究受到越来越多的关注。腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸路线具有原料廉价、原子经济性高等优势，但现有的腈水解酶催化活力低(J.Mol.Catal.B:Enzym.2006,41:75-80)，难以满足规模化应用要求。因此，开发腈水解酶突变体构建技术，获得高活力腈水解酶生物催化剂，对实现普瑞巴林的高效、绿色工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程手段对野生型腈水解酶进行改造，使改造后腈水解酶突变体的催化活力和立体选择性等催化性能显著提高，达到工业化应用的要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种腈水解酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
本发明分别对十字花科植物芜菁(Brassica rapa)腈水解酶(BrNIT)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶(AtNIT)的氨基酸序列，尤其是225-285位区域中的多位氨基酸进行替换，获得如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的腈水解酶突变体，研究证明，相较于野生型腈水解酶，该突变体对底物外消旋异丁基丁二腈的催化活性、立体选择性显著提升。
对所述腈水解酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
本发明还提供了一种编码所述腈水解酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。作为优选，原始载体为pET28b。
本发明还提供了一种包含所述重组载体的重组基因工程菌。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述腈水解酶突变体的方法，所述方法，包括以下步骤：
(1)针对芜菁腈水解酶基因或拟南芥腈水解酶基因序列，设计PCR引物，以高山南芥cDNA为模板，利用所述PCR引物扩增获得含有高山南芥腈水解酶核苷酸序列673-855位的DNA片段Ⅰ或DNA片段Ⅱ；
(2)以携带有芜菁腈水解酶基因或拟南芥腈水解酶基因的重组质粒为模板，利用反向PCR扩增获得芜菁腈水解酶核苷酸序列676-858位缺失的BrNIT质粒片段或拟南芥腈水解酶核苷酸序列673-855位缺失的AtNIT质粒片段；
(3)将DNA片段Ⅰ和BrNIT质粒片段，或DNA片段Ⅱ和AtNIT质粒片段重组，再将重组产物转化至宿主菌，筛选获得腈水解酶突变体表达菌株；
(4)对腈水解酶突变体表达菌株进行诱导表达，获得所述的腈水解酶突变体。
十字花科植物芜菁(Brassica rapa)腈水解酶(BrNIT)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)腈水解酶(AtNIT)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶(AaNIT)均具有催化外消旋异丁基丁二腈生成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的活力，但是在催化活性及立体选择性方面各有优缺点。本发明分别以芜菁腈水解酶BrNIT和拟南芥腈水解酶AtNIT为亲本，运用肽段替换，将高山南芥腈水解酶AaNIT的225-285位肽段替换BrNIT氨基酸序列的226-286位和AtNIT氨基酸序列的225-285位，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的腈水解酶突变体BrNIT225-285及AtNIT225-285，以提高腈水解酶的催化活性和立体选择性。
作为优选，步骤(2)中，所述重组质粒的原始载体为pET28b。
作为优选，制备腈水解酶突变体BrNIT225-285所需的PCR引物：
步骤(1)中，扩增DNA片段Ⅰ所需引物：
上游引物：5’-GAATGGCAGTCTTCTATGATGCACATCGC-3’；
下游引物：5’-GAAGTTCGGACCAGCCAGAACCTGACCC-3’。
步骤(2)中，扩增BrNIT质粒片段所需引物：
上游引物：5’-GCGATGTGCATCATAGAAGACTGCCATTC-3’；
下游引物：5’-GGGTCAGGTTCTGGCTGGTCCGAACTTC-3’。
制备腈水解酶突变体AtNIT225-285所需的PCR引物：
步骤(1)中，扩增DNA片段Ⅱ所需引物：
上游引物：5’-CTAAAGAATGGCAGTCTTCTATGCTGCACATCGC-3’；
下游引物：5’-GATTCGAAGTTCGGACCAGCCAGAACCTGACCCAGC-3’。
步骤(2)中，扩增AtNIT质粒片段所需引物：
上游引物：5’-GCGATGTGCAGCATAGAAGACTGCCATTCTTTAG-3’；
下游引物：5’-GCTGGGTCAGGTTCTGGCTGGTCCGAACTTCGAATC-3’。
作为优选，所述宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21。
本发明的另一个目的是提供所述的腈水解酶突变体在催化外消旋异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
具体地，所述应用为以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH 5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～45℃、100～300rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
作为优选，反应体系中，底物的终浓度为0.5～1.5M，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～30g/L。更为优选，每1mol的底物所需湿菌体的添加量为20g。
作为优选，所述反应介质为pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
作为优选，在30～35℃、200rpm条件下进行水解反应。
作为优选，所述湿菌体为含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-BrNIT225-285或E.coli BL21(DE3)/pET28b-AtNIT225-285，发酵培养的方法为：含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，培养至OD600＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导培养10-12h，离心，收集菌体得到所述湿菌体。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供了一种酶定向改造方法，将高山南芥腈水解酶的关键性肽段替换至芜菁腈水解酶或拟南芥腈水解酶对应区域中，理性改造野生型腈水解酶，构建了高活力、高立体选择性的腈水解酶突变体，在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸中具有良好的应用前景。
(2)本发明提供的腈水解酶突变体BrNIT225-285，其催化外消旋异丁基丁二腈水解的活力是野生型的2.5倍，对映体选择率(E值)由200提高到500以上；腈水解酶突变体AtNIT225-285催化外消旋异丁基丁二腈水解的活力是野生型的1.9倍。在不减弱催化活力的同时，提高立体选择性，满足工业化应用要求。
附图说明
图1为腈水解酶及其突变体蛋白纯化后的电泳图。泳道1为BrNIT，泳道2为BrNIT225-285，泳道3为AtNIT，泳道4为AtNIT225-285。
图2为BrNIT突变体和野生酶催化100g/L外消旋异丁基丁二腈立体选择性水解反应进程比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例所用主要实验材料来源为：
大肠杆菌宿主菌株E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DH5α)购自Transgen公司，表达载体pET-28b(+)购自Novagen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase购自Vazyme公司，2×TsingKe Master Mix(blue)购自TsingKe公司；卡那霉素购自大连宝生物有限公司；IPTG为Promega公司产品。
实施例1
1、腈水解酶突变体的构建
本发明采用一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术—技术，将扩增的肽段定向克隆至缺失对应基因片段的BrNIT质粒片段中。
通过对十字花科植物腈水解酶核苷酸和氨基酸序列进行比对分析，确定各个肽段。野生型芜菁腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5，该蛋白是由SEQ ID No.6的核苷酸序列所编码的；野生型高山南芥腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.7，该蛋白是由SEQ IDNo.8的核苷酸序列所编码的。
以AaNIT核苷酸序列为模板，分别克隆0-85位、85-175位、175-225位、225-285位和285-342位肽段。
同时，以包含BrNIT核苷酸序列的重组质粒为模板，设计引物扩增缺失0-86位、86-176位、176-226位、226-286位和286-342位肽段的BrNIT质粒片段。
将缺失对应肽段基因片段的BrNIT载体序列进行线性化，在插入片段正/反向PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列。其引物序列如表1所示。
对各个肽段进行PCR扩增，PCR反应体系(50μL):Template DNA<1μg，Master Mix，上下游引物各0.2μM，其余ddH2O补充至总体积。PCR反应参数：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸10s，步骤(2)-(4)循环30次；(5)72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收，65℃灭活10min，放置4℃备用。
载体线性化采用反向PCR扩增的方式获得。PCR反应体系(50μL):模板DNA 0.1ng-1ng，2×Phanta Max Buffer，dNTPs(10mM each)0.2mM，上下游引物各0.2μM，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1U，其余ddH2O补充至总体积。PCR反应参数：(1)95℃预变性30s；(2)95℃变性15s；(3)63℃退火15s；(4)72℃延伸6.0min，步骤(2)-(4)循环30次；(5)72℃彻底延伸5min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后，加入内切酶Dpn I于37℃消化3h，65℃灭活10min。
表1：BrNIT嵌合酶引物设计表
将上述所获得的插入片段和线性化载体利用NanoDropTM One/OneC超微量紫外分光光度计进行基因浓度测定，计算出各个插入肽段及对应缺失肽段的线性化载体的添加量。连接反应体系组成如表2，将PCR样品混匀后，放置37℃保温30min，降至4℃。
表2：重组反应体系
将10μL重组产物加入到100μL E.coli BL21(DH 5α)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性(终浓度为50mg/L)的LB平板上，37℃培养10-12h。挑取单菌落培养于含卡那霉素抗性(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中，提取质粒测序。测序结果正确者转化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含卡那霉素的LB平板上培养过夜，得到腈水解酶突变体表达菌株。
2、腈水解酶突变体基因的表达
挑取单菌落接入5mL液体LB培养基中，卡那霉素的终浓度为50mg/L。培养条件为37℃，200rpm，培养6-8h。将上述种子液以2％的体积比转接至新鲜的含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养至菌体OD600约为0.6-0.8时，向上述LB液体培养基中加入IPTG(终浓度为0.1mM)，28℃，150rpm诱导培养10-12h，收集发酵液于4℃，8000rpm的条件下离心10min，然后加入生理盐水洗涤菌体一次，将离心所得菌体置于-20℃冰箱保存。菌体破碎后，分离纯化获得腈水解酶突变体BrNIT225-285，电泳检测如图1所示。
3、含腈水解酶突变体重组大肠杆菌活力测定
将培养得到的含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT0-85、E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT85-175、E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT175-225、E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT225-285以及E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT285-342进行活力测定。含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，外消旋异丁基丁二腈30g/L，湿菌体10g/L。反应液于30℃，200rpm反应15min。取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应。
底物外消旋异丁基丁二腈和产物3-氰基-5-甲基己酸的对映体过量值由气相色谱测定。气相色谱型号为7890N(安捷伦)，毛细管柱型号为BGB-174(BGB AnalytikSwitzerland)。色谱条件为：进样量1.0μL，进样口、检测器温度均为250℃，柱温为120℃保持15min，10℃/min升温至170℃，保持9min。载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，分流比为50:1。
对映体过量值(ee)、转化率(c)的计算参考Rakels等的计算方法(EnzymeMicrob.Technol.,1993,15:1051)。
经测定，各腈水解酶突变体活力如表3所示：
表3：含腈水解酶突变体重组大肠杆菌活力测定结果
注：ND为No Detection(未检测)。
4、腈水解酶突变体BrNIT225-285和野生型催化外消旋异丁基丁二腈水解比较
以培养得到的含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT225-285以及含有野生型腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT为生物催化剂，比较其立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈的效果。
反应体系组成为(100mL):Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，1.5g湿菌体和10g外消旋异丁基丁二腈构成反应体系。35℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应。腈水解酶突变体和野生型催化外消旋异丁基丁二腈水解进程如图2所示。
5、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT225-285催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
以重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT225-285为生物催化剂，在100mLTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中加入2.0g湿菌体(终浓度20g/L)和终浓度1.0M(136g/L)外消旋异丁基丁二腈构成反应体系。于30℃、200rpm条件下反应，每隔一定时间取样500μL，加入2M的HCl终止反应。样品检测方式参照步骤3。反应8h，转化率达到39.8％，产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的ee值大于99.3％。相对于已报道的催化工艺过程，菌体添加量减少了2.5倍。
实施例2
拟南芥腈水解酶突变体AtNIT225-285的构建及其催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
野生型拟南芥腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.9，该蛋白是由SEQ ID No.10的核苷酸序列所编码的。
参照实施例1的方法构建拟南芥腈水解酶突变体AtNIT225-285。突变体构建所用引物如表4所示。
表4AtNIT嵌合酶引物设计表
参照实施例1的方法获得含有拟南芥腈水解酶突变体的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-AtNIT225-285和含有野生型拟南芥腈水解酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AtNIT。重组大肠杆菌经诱导表达后收集全细胞，作为生物催化剂。菌体破碎后，分离纯化获得腈水解酶突变体AtNIT225-285，电泳检测如图1所示。
分别取含有拟南芥腈水解酶突变体和野生型的静息细胞各0.1g(湿重)，悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液中(50mM，pH 8.0)，反应体系中添加0.3g外消旋异丁基丁二腈，于30℃，200rpm条件下进行反应。经测定，腈水解酶突变体AtNIT225-285催化外消旋异丁基丁二腈水解的活力是野生型的1.9倍。反应24h，野生型AtNIT和突变体AtNIT225-285的转化率分别为25.64％和48.76％，ee均大于98.5％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Gly Ser Glu Glu Met Ser Lys Ala Leu Asn Ala Thr Thr Pro
1 5 10 15
Gly Phe Pro Asp Ile Pro Ser Thr Ile Val Arg Ala Thr Ile Val Gln
20 25 30
Ala Ser Thr Val Tyr Asn Asp Thr Pro Lys Thr Ile Glu Lys Ala Glu
35 40 45
Lys Phe Ile Ala Glu Ala Ala Ser Asp Gly Ala Gln Leu Val Val Phe
50 55 60
Pro Glu Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Tyr Arg Phe Gly Ile
65 70 75 80
Gly Val Gly Val His Asn Glu Ala Gly Arg Asp Cys Phe Arg Arg Tyr
85 90 95
His Ala Ser Ala Ile Val Val Pro Gly Pro Glu Val Asp Lys Leu Ala
100 105 110
Glu Ile Ala Arg Lys Tyr Lys Val Tyr Leu Val Met Gly Ala Met Glu
115 120 125
Lys Asp Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys Thr Ala Leu Phe Phe Ser Ser Glu
130 135 140
Gly Arg Phe Leu Gly Lys His Arg Lys Val Met Pro Thr Ser Leu Glu
145 150 155 160
Arg Cys Ile Trp Gly Phe Gly Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp
165 170 175
Thr Pro Leu Gly Lys Leu Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met
180 185 190
Pro Leu Tyr Arg Thr Ser Leu Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Leu Tyr Cys
195 200 205
Ala Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Leu His
210 215 220
Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys
225 230 235 240
Arg Arg Lys Asp Phe Pro Asp His Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp
245 250 255
Asp Asp Asn Gln Glu Asp His Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val
260 265 270
Ile Ile Ser Pro Leu Gly Gln Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser
275 280 285
Glu Gly Leu Ile Thr Ala Asp Leu Asp Leu Gly Asp Val Ala Arg Ala
290 295 300
Lys Leu Tyr Phe Asp Val Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Glu Ile Phe
305 310 315 320
Asn Leu Thr Val Asn Glu Thr Pro Lys Lys Pro Val Thr Phe Val Ser
325 330 335
Lys Ser Val Lys Ala Glu Asp Asp Ser Glu Pro Gln Asp Lys
340 345 350
<210> 2
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctggct ctgaagaaat gtccaaagct ctgaatgcta ccactccagg tttcccggac 60
atccctagca ccatcgttcg cgccacgatc gttcaggctt ccactgtata caacgacact 120
cctaaaacca tcgaaaaagc tgaaaaattc atcgcggaag ctgctagcga cggtgcgcag 180
ctggtggtct ttccggaagc tttcatcgct ggttacccgc gtggctatcg tttcggcatc 240
ggtgtaggtg tgcacaacga ggcgggccgt gattgtttcc gccgctatca tgctagcgcg 300
atcgttgtcc cgggtccgga ggttgataaa ctggcagaaa ttgctcgtaa atacaaagtc 360
tacctggtaa tgggtgccat ggagaaagat ggttataccc tgtactgtac tgcgctgttt 420
ttcagctctg aaggtcgttt cctgggcaag caccgcaaag tcatgccgac gtctctggaa 480
cgttgcatct ggggcttcgg tgatggttct actatcccgg tctacgacac cccgctgggc 540
aagctgggcg ccgcaatctg ttgggaaaac cgcatgccgc tgtaccgtac tagcctgtac 600
ggcaaaggta tcgagctgta ttgcgctccg actgccgatg gctctaaaga atggcagtct 660
tctatgctgc acatcgctct ggaaggtggt tgcttcgttc tgtctgcttg ccagttctgc 720
cgtcgtaaag acttcccgga ccacccggac tacctgttca ccgactggga cgacaaccag 780
gaagaccacg ctatcgtttc tcagggtggt tctgttatca tctctccgct gggtcaggtt 840
ctggctggtc cgaacttcga gtctgagggc ctgatcactg cagatctgga tctgggcgat 900
gtagcgcgtg caaaactgta tttcgatgtt gttggtcact actcccgccc tgagattttt 960
aatctgacgg ttaacgagac tccgaagaaa ccggttactt tcgtttccaa gtccgtaaaa 1020
gctgaggacg actctgagcc gcaggacaaa 1050
<210> 3
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Ser Thr Lys Asp Met Ser Thr Val Gln Asn Ala Thr Pro Phe
1 5 10 15
Asn Gly Val Ala Pro Ser Thr Thr Val Arg Val Thr Ile Val Gln Ser
20 25 30
Ser Thr Val Tyr Asn Asp Thr Pro Ala Thr Ile Asp Lys Ala Glu Lys
35 40 45
Tyr Ile Val Glu Ala Ala Ser Lys Gly Ala Glu Leu Val Leu Phe Pro
50 55 60
Glu Gly Phe Ile Gly Gly Tyr Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Leu Ala
65 70 75 80
Val Gly Val His Asn Glu Glu Gly Arg Asp Glu Phe Arg Lys Tyr His
85 90 95
Ala Ser Ala Ile His Val Pro Gly Pro Glu Val Ala Arg Leu Ala Asp
100 105 110
Val Ala Arg Lys Asn His Val Tyr Leu Val Met Gly Ala Ile Glu Lys
115 120 125
Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys Thr Val Leu Phe Phe Ser Pro Gln Gly
130 135 140
Gln Phe Leu Gly Lys His Arg Lys Leu Met Pro Thr Ser Leu Glu Arg
145 150 155 160
Cys Ile Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr
165 170 175
Pro Ile Gly Lys Leu Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro
180 185 190
Leu Tyr Arg Thr Ala Leu Tyr Ala Lys Gly Ile Glu Leu Tyr Cys Ala
195 200 205
Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Leu His Ile
210 215 220
Ala Leu Glu Gly Gly Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Arg
225 230 235 240
Arg Lys Asp Phe Pro Asp His Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp Asp
245 250 255
Asp Asn Gln Glu Asp His Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile
260 265 270
Ile Ser Pro Leu Gly Gln Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu
275 280 285
Gly Leu Val Thr Ala Asp Ile Asp Leu Gly Asp Ile Ala Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Tyr Phe Asp Ser Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu His
305 310 315 320
Leu Thr Val Asn Glu His Pro Arg Lys Ser Val Thr Phe Val Thr Lys
325 330 335
Val Glu Lys Ala Glu Asp Asp Ser Asn Lys Tyr Lys Leu Ala Ala
340 345 350
<210> 4
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagctcta ctaaagatat gtccacggtt caaaacgcaa ctcctttcaa cggcgtcgca 60
ccgtccacta ctgttcgcgt tactattgta cagagcagca ccgtgtataa tgacacgcca 120
gcaaccatcg ataaagcaga aaaatacatc gtggaagcgg catccaaagg tgcggaactg 180
gtcctgttcc cagaaggctt tattggtggt tatccgcgtg gtttccgttt cggcctggct 240
gttggtgtgc ataacgaaga aggtcgtgac gagttccgta aataccacgc ctccgcaatc 300
cacgtgccgg gtccggaagt agctcgcctg gcagacgttg cacgtaagaa ccatgtatac 360
ctggttatgg gcgcgattga aaaggaaggt tatactctgt attgcaccgt actgttcttc 420
tctccgcaag gccagttcct gggcaagcac cgtaagctga tgccaacgtc cctggaacgt 480
tgtatctggg gccagggtga tggttctacc atcccggttt atgatacccc gatcggtaaa 540
ctgggtgcgg ccatctgttg ggaaaaccgt atgcctctgt accgtaccgc cctgtatgcg 600
aaaggtattg agctgtattg cgcccctacc gccgacggct ctaaagaatg gcagtcttct 660
atgctgcaca tcgctctgga aggtggttgc ttcgttctgt ctgcttgcca gttctgccgt 720
cgtaaagact tcccggacca cccggactac ctgttcaccg actgggacga caaccaggaa 780
gaccacgcta tcgtttctca gggtggttct gttatcatct ctccgctggg tcaggttctg 840
gctggtccga acttcgaatc tgagggtctg gtcactgcag acatcgacct gggcgatatc 900
gctcgtgcta aactgtactt cgactctgtt ggccactact cccgtccaga tgtgctgcac 960
ctgaccgtaa acgaacaccc gcgtaaatcc gtcacttttg tgaccaaagt ggaaaaagct 1020
gaagatgact ctaacaaata caagcttgcg gcc 1053
<210> 5
<211> 350
<212> PRT
<213> 芜菁(Brassica rapa)
<400> 5
Met Ser Gly Ser Glu Glu Met Ser Lys Ala Leu Asn Ala Thr Thr Pro
1 5 10 15
Gly Phe Pro Asp Ile Pro Ser Thr Ile Val Arg Ala Thr Ile Val Gln
20 25 30
Ala Ser Thr Val Tyr Asn Asp Thr Pro Lys Thr Ile Glu Lys Ala Glu
35 40 45
Lys Phe Ile Ala Glu Ala Ala Ser Asp Gly Ala Gln Leu Val Val Phe
50 55 60
Pro Glu Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Tyr Arg Phe Gly Ile
65 70 75 80
Gly Val Gly Val His Asn Glu Ala Gly Arg Asp Cys Phe Arg Arg Tyr
85 90 95
His Ala Ser Ala Ile Val Val Pro Gly Pro Glu Val Asp Lys Leu Ala
100 105 110
Glu Ile Ala Arg Lys Tyr Lys Val Tyr Leu Val Met Gly Ala Met Glu
115 120 125
Lys Asp Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys Thr Ala Leu Phe Phe Ser Ser Glu
130 135 140
Gly Arg Phe Leu Gly Lys His Arg Lys Val Met Pro Thr Ser Leu Glu
145 150 155 160
Arg Cys Ile Trp Gly Phe Gly Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp
165 170 175
Thr Pro Leu Gly Lys Leu Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met
180 185 190
Pro Leu Tyr Arg Thr Ser Leu Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Leu Tyr Cys
195 200 205
Ala Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Met His
210 215 220
Ile Ala Ile Glu Gly Gly Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys
225 230 235 240
Leu Arg Lys Asp Phe Pro Asp His Ala Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp
245 250 255
Tyr Pro Asp Gln His Gln Glu Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val
260 265 270
Ile Ile Ser Pro Leu Gly Lys Ile Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser
275 280 285
Glu Gly Leu Ile Thr Ala Asp Leu Asp Leu Gly Asp Val Ala Arg Ala
290 295 300
Lys Leu Tyr Phe Asp Val Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Glu Ile Phe
305 310 315 320
Asn Leu Thr Val Asn Glu Thr Pro Lys Lys Pro Val Thr Phe Val Ser
325 330 335
Lys Ser Val Lys Ala Glu Asp Asp Ser Glu Pro Gln Asp Lys
340 345 350
<210> 6
<211> 1050
<212> DNA
<213> 芜菁(Brassica rapa)
<400> 6
atgtctggct ctgaagaaat gtccaaagct ctgaatgcta ccactccagg tttcccggac 60
atccctagca ccatcgttcg cgccacgatc gttcaggctt ccactgtata caacgacact 120
cctaaaacca tcgaaaaagc tgaaaaattc atcgcggaag ctgctagcga cggtgcgcag 180
ctggtggtct ttccggaagc tttcatcgct ggttacccgc gtggctatcg tttcggcatc 240
ggtgtaggtg tgcacaacga ggcgggccgt gattgtttcc gccgctatca tgctagcgcg 300
atcgttgtcc cgggtccgga ggttgataaa ctggcagaaa ttgctcgtaa atacaaagtc 360
tacctggtaa tgggtgccat ggagaaagat ggttataccc tgtactgtac tgcgctgttt 420
ttcagctctg aaggtcgttt cctgggcaag caccgcaaag tcatgccgac gtctctggaa 480
cgttgcatct ggggcttcgg tgatggttct actatcccgg tctacgacac cccgctgggc 540
aagctgggcg ccgcaatctg ttgggaaaac cgcatgccgc tgtaccgtac tagcctgtac 600
ggcaaaggta tcgagctgta ttgcgctccg actgccgatg gctctaaaga atggcagtcc 660
tccatgatgc acatcgctat cgaaggcggt tgtttcgttc tgtctgcttg ccaattctgc 720
ctgcgcaaag acttcccgga ccacgctgac tatctgttta ccgattggta cccggatcag 780
caccaggaag cgattgtaag ccagggtggt tctgttatca ttagcccact gggtaaaatc 840
ctggcgggtc cgaacttcga gtctgagggc ctgatcactg cagatctgga tctgggcgat 900
gtagcgcgtg caaaactgta tttcgatgtt gttggtcact actcccgccc tgagattttt 960
aatctgacgg ttaacgagac tccgaagaaa ccggttactt tcgtttccaa gtccgtaaaa 1020
gctgaggacg actctgagcc gcaggacaaa 1050
<210> 7
<211> 346
<212> PRT
<213> 高山南芥(Arabis alpine)
<400> 7
Met Ser Gly Lys Glu Glu Met Ser Ser Val Lys Asn Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Asn Gly Val Ala Pro Ser Ser Ile Val Arg Ala Ser Ile Val Gln Ala
20 25 30
Ser Thr Val Tyr Asn Asn Thr Pro Ala Thr Leu Glu Lys Ala Glu Lys
35 40 45
Leu Ile Ala Glu Ala Ala Ser Asn Gly Ser Lys Leu Val Val Phe Pro
50 55 60
Glu Ala Phe Ile Gly Gly Tyr Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Ile Gly
65 70 75 80
Val Gly Val His Asn Glu Asp Gly Arg Asp Glu Phe Arg Asn Tyr His
85 90 95
Ala Ser Ala Ile Arg Val Pro Gly Pro Glu Val Glu Lys Leu Ala Glu
100 105 110
Val Ala Gly Lys Asn Asn Val Tyr Leu Val Met Gly Ala Ile Glu Lys
115 120 125
Asp Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys Thr Ala Leu Phe Phe Ser Ser Gln Gly
130 135 140
Leu Phe Leu Gly Lys His Arg Lys Leu Met Pro Thr Ser Leu Glu Arg
145 150 155 160
Cys Ile Trp Gly Tyr Gly Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr
165 170 175
Pro His Gly Lys Leu Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro
180 185 190
Leu Tyr Arg Thr Ala Leu Tyr Ala Lys Gly Val Glu Ile Tyr Cys Ala
195 200 205
Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Leu His Ile
210 215 220
Ala Leu Glu Gly Gly Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Arg
225 230 235 240
Arg Lys Asp Phe Pro Asp His Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp Asp
245 250 255
Asp Asn Gln Glu Asp His Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile
260 265 270
Ile Ser Pro Leu Gly Gln Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu
275 280 285
Gly Leu Val Thr Ala Asp Leu Asp Leu Gly Asp Val Ala Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Tyr Phe Asp Val Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Val Phe Asn
305 310 315 320
Leu Thr Val Asn Glu Asp Arg Lys Lys Pro Val Thr Phe Val Ser Lys
325 330 335
Val Glu Lys Ala Glu Asp Glu Pro Lys Lys
340 345
<210> 8
<211> 1038
<212> DNA
<213> 高山南芥(Arabis alpine)
<400> 8
atgtctggta aagaagaaat gtcttctgtt aaaaacacca ccccggctaa cggtgttgct 60
ccgtcttcta tcgttcgtgc ttctatcgtt caggcttcta ccgtttacaa caacaccccg 120
gctaccctgg aaaaagctga aaaactgatc gctgaagctg cttctaacgg ttcgaagctg 180
gttgtattcc cggaagcgtt catcggcggt tacccacgtg gctttaggtt cggtataggt 240
gttggtgttc acaacgaaga cggtcgtgac gaattccgta actaccacgc ttctgctatc 300
cgtgttccgg gtccggaagt tgaaaaactg gctgaagttg ctggtaaaaa caacgtttac 360
ctggttatgg gtgctatcga aaaagacggt tacaccctgt actgcaccgc tctgttcttc 420
tcttctcagg gtctgttcct gggtaaacac cgtaaactga tgccgacctc tctggaacgt 480
tgcatctggg gttacggtga cggttcgact atcccggtgt acgacacacc gcacggtaaa 540
ctgggtgctg ctatctgctg ggaaaaccgt atgccgctgt accgtaccgc tctgtacgct 600
aaaggtgttg aaatctactg cgctccgacc gctgacggtt ctaaagaatg gcagtcttct 660
atgctgcaca tcgctctgga aggtggttgc ttcgttctgt ctgcttgcca gttctgccgt 720
cgtaaagact tcccggacca cccggactac ctgttcaccg actgggacga caaccaggaa 780
gaccacgcta tcgtttctca gggtggttct gttatcatct ctccgctggg tcaggttctg 840
gctggtccga acttcgaatc tgaaggtctg gttaccgctg acctggacct gggtgacgtt 900
gctcgtgcta aactgtactt cgacgttgtt ggtcactact ctaaaccgga agttttcaac 960
ctgaccgtta acgaagaccg taaaaaaccg gttaccttcg tttctaaagt tgaaaaagct 1020
gaagacgaac cgaaaaaa 1038
<210> 9
<211> 351
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 9
Met Ser Ser Thr Lys Asp Met Ser Thr Val Gln Asn Ala Thr Pro Phe
1 5 10 15
Asn Gly Val Ala Pro Ser Thr Thr Val Arg Val Thr Ile Val Gln Ser
20 25 30
Ser Thr Val Tyr Asn Asp Thr Pro Ala Thr Ile Asp Lys Ala Glu Lys
35 40 45
Tyr Ile Val Glu Ala Ala Ser Lys Gly Ala Glu Leu Val Leu Phe Pro
50 55 60
Glu Gly Phe Ile Gly Gly Tyr Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Leu Ala
65 70 75 80
Val Gly Val His Asn Glu Glu Gly Arg Asp Glu Phe Arg Lys Tyr His
85 90 95
Ala Ser Ala Ile His Val Pro Gly Pro Glu Val Ala Arg Leu Ala Asp
100 105 110
Val Ala Arg Lys Asn His Val Tyr Leu Val Met Gly Ala Ile Glu Lys
115 120 125
Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys Thr Val Leu Phe Phe Ser Pro Gln Gly
130 135 140
Gln Phe Leu Gly Lys His Arg Lys Leu Met Pro Thr Ser Leu Glu Arg
145 150 155 160
Cys Ile Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr
165 170 175
Pro Ile Gly Lys Leu Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro
180 185 190
Leu Tyr Arg Thr Ala Leu Tyr Ala Lys Gly Ile Glu Leu Tyr Cys Ala
195 200 205
Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Leu His Ile
210 215 220
Ala Ile Glu Gly Gly Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Gln
225 230 235 240
Arg Lys His Phe Pro Asp His Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp Tyr
245 250 255
Asp Asp Lys Glu His Asp Ser Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile
260 265 270
Ile Ser Pro Leu Gly Gln Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu
275 280 285
Gly Leu Val Thr Ala Asp Ile Asp Leu Gly Asp Ile Ala Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Tyr Phe Asp Ser Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu His
305 310 315 320
Leu Thr Val Asn Glu His Pro Arg Lys Ser Val Thr Phe Val Thr Lys
325 330 335
Val Glu Lys Ala Glu Asp Asp Ser Asn Lys Tyr Lys Leu Ala Ala
340 345 350
<210> 10
<211> 1053
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 10
atgagctcta ctaaagatat gtccacggtt caaaacgcaa ctcctttcaa cggcgtcgca 60
ccgtccacta ctgttcgcgt tactattgta cagagcagca ccgtgtataa tgacacgcca 120
gcaaccatcg ataaagcaga aaaatacatc gtggaagcgg catccaaagg tgcggaactg 180
gtcctgttcc cagaaggctt tattggtggt tatccgcgtg gtttccgttt cggcctggct 240
gttggtgtgc ataacgaaga aggtcgtgac gagttccgta aataccacgc ctccgcaatc 300
cacgtgccgg gtccggaagt agctcgcctg gcagacgttg cacgtaagaa ccatgtatac 360
ctggttatgg gcgcgattga aaaggaaggt tatactctgt attgcaccgt actgttcttc 420
tctccgcaag gccagttcct gggcaagcac cgtaagctga tgccaacgtc cctggaacgt 480
tgtatctggg gccagggtga tggttctacc atcccggttt atgatacccc gatcggtaaa 540
ctgggtgcgg ccatctgttg ggaaaaccgt atgcctctgt accgtaccgc cctgtatgcg 600
aaaggtattg agctgtattg cgcccctacc gccgacggct ctaaagagtg gcagtcctcc 660
atgctgcaca tcgcgattga gggtggctgc ttcgtgctgt ctgcctgcca gttttgccag 720
cgtaaacact ttccggacca tccggactat ctgttcacgg attggtacga tgacaaagaa 780
cacgacagca tcgtttccca gggtggttct gttatcatta gcccgctggg ccaggtactg 840
gctggtccga acttcgaatc tgagggtctg gtcactgcag acatcgacct gggcgatatc 900
gctcgtgcta aactgtactt cgactctgtt ggccactact cccgtccaga tgtgctgcac 960
ctgaccgtaa acgaacaccc gcgtaaatcc gtcacttttg tgaccaaagt ggaaaaagct 1020
gaagatgact ctaacaaata caagcttgcg gcc 1053
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccatgtctgg taaagaagaa atgtc 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgttgtgaac accaacacct ataccg 26
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacatttctt ctttaccaga catggtatat ctcc 34
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cggtataggt gttggtgttc acaacg 26
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtgtaggtgt gcacaacgaa gacggtcgtg acgaattc 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcgaaccgt caccgtaacc ccagatgcaa cgttccag 38
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaattcgtca cgaccgtctt cgttgtgcac acctacac 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctggaacgtt gcatctgggg ttacggtgac ggttcgac 38
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtgacggtt cgactatccc ggtgtacgac 30
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcgatgtgca gcatagaaga ctgccattc 29
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtcgtacacc gggatagtcg aaccgtcacc 30
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaatggcagt cttctatgct gcacatcgc 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaatggcagt cttctatgct gcacatcgc 29
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaagttcgga ccagccagaa cctgaccc 28
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcgatgtgca gcatagaaga ctgccattc 29
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gggtcaggtt ctggctggtc cgaacttc 28
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggtaaaatcc tggcgggtcc gaacttcgaa tc 32
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtggtggtgg tggtgctcga gtcttttttt cgg 33
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gattcgaagt tcggacccgc caggatttta cc 32
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccgaaaaaaa gactcgagca ccaccaccac cac 33
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctaaagaatg gcagtcttct atgctgcaca tcgc 34
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gattcgaagt tcggaccagc cagaacctga cccagc 36
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcgatgtgca gcatagaaga ctgccattct ttag 34
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gctgggtcag gttctggctg gtccgaactt cgaatc 36

Claims (10)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
2.一种编码如权利要求1所述的腈水解酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.一种包含如权利要求3所述的重组载体的重组基因工程菌。
5.如权利要求1所述的腈水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对芜菁腈水解酶基因或拟南芥腈水解酶基因序列，设计PCR引物，以高山南芥cDNA为模板，利用所述PCR引物扩增获得含有高山南芥腈水解酶核苷酸序列673-855位的DNA片段Ⅰ或DNA片段Ⅱ；
(2)以携带有芜菁腈水解酶基因或拟南芥腈水解酶基因的重组质粒为模板，利用反向PCR扩增获得芜菁腈水解酶核苷酸序列676-858位缺失的BrNIT质粒片段或拟南芥腈水解酶核苷酸序列673-855位缺失的AtNIT质粒片段；
(3)将DNA片段Ⅰ和BrNIT质粒片段，或DNA片段Ⅱ和AtNIT质粒片段重组，再将重组产物转化至宿主菌，筛选获得腈水解酶突变体表达菌株；
(4)对腈水解酶突变体表达菌株进行诱导表达，获得所述的腈水解酶突变体。
6.如权利要求1所述的腈水解酶突变体在催化外消旋异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH 5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～45℃、100～300rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，反应体系中，底物的终浓度为0.5～1.5M，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～30g/L。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述湿菌体为含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNIT225-285或E.coli BL21(DE3)/pET28b-AtNIT225-285，发酵培养的方法为：含腈水解酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，培养至OD600＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导培养10-12h，离心，收集菌体得到所述湿菌体。
CN201810136409.4A 2018-02-09 2018-02-09 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用 Active CN108424900B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810136409.4A CN108424900B (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
US16/968,808 US11492606B2 (en) 2018-02-09 2019-01-31 Nitrilase mutant, construction method therefor, and application thereof
PCT/CN2019/074110 WO2019154249A1 (zh) 2018-02-09 2019-01-31 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810136409.4A CN108424900B (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108424900A true CN108424900A (zh) 2018-08-21
CN108424900B CN108424900B (zh) 2020-11-03

Family

ID=63156761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810136409.4A Active CN108424900B (zh) 2018-02-09 2018-02-09 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11492606B2 (zh)
CN (1) CN108424900B (zh)
WO (1) WO2019154249A1 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234257A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 南京农业大学 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用
WO2019154249A1 (zh) * 2018-02-09 2019-08-15 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
CN111100856A (zh) * 2020-01-13 2020-05-05 浙江工业大学 腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用
CN111172140A (zh) * 2020-01-21 2020-05-19 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在制备抗癫痫药物中间体中的应用
CN111254134A (zh) * 2018-12-03 2020-06-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈基水解酶突变体及其在(s)-单腈单酸合成中的应用
CN111471668A (zh) * 2020-02-28 2020-07-31 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用
CN111944792A (zh) * 2020-08-19 2020-11-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法
CN112048492A (zh) * 2019-06-06 2020-12-08 尚科生物医药（上海）有限公司 一种酯水解酶突变体
CN112063607A (zh) * 2020-10-09 2020-12-11 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN112210549A (zh) * 2019-07-09 2021-01-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(r)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用
CN112359036A (zh) * 2020-11-30 2021-02-12 浙江工业大学 一种催化活力和反应专一性提高的腈水解酶突变体及应用
CN112852789A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈水解酶突变体及其应用
CN114908075A (zh) * 2022-04-02 2022-08-16 浙江工业大学 一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110714002B (zh) * 2018-07-12 2021-03-26 浙江工业大学 一种植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用
CN114214308B (zh) * 2021-12-06 2024-02-27 江南大学 一种经半理性改造提升活性的腈水解酶突变体

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8304252B2 (en) * 2004-04-14 2012-11-06 Pfizer Inc. Stereoselective bioconversion of aliphatic dinitriles into cyano carboxylic acids
CN104152500A (zh) * 2014-08-27 2014-11-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生物合成(r)-3-羟基戊二酸单酯的新方法
CN104561142A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 中国科学院天津工业生物技术研究所 (r)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成方法
CN104962540A (zh) * 2015-06-30 2015-10-07 浙江工业大学 一种腈水解酶、编码基因、载体及应用
CN105176955A (zh) * 2015-08-27 2015-12-23 浙江工业大学 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用
CN108715881A (zh) * 2018-05-04 2018-10-30 浙江工业大学 一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2800749B1 (fr) * 1999-11-08 2004-07-16 Rhone Poulenc Animal Nutrition Procede de modulation de la selective des nitrilases, nouvelles nitrilases obtenues par ce procede et leur utilisation
CA2888877C (en) * 2012-11-07 2021-07-27 Hikal Limited A process for the preparation of pregabalin
CN107177576B (zh) * 2017-05-10 2020-07-28 浙江工业大学 腈水解酶突变体及其应用
CN107641622B (zh) * 2017-11-01 2021-10-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 可水解对苯二甲腈制备对氰基苯甲酸的腈水解酶
CN108424900B (zh) * 2018-02-09 2020-11-03 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8304252B2 (en) * 2004-04-14 2012-11-06 Pfizer Inc. Stereoselective bioconversion of aliphatic dinitriles into cyano carboxylic acids
CN104561142A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 中国科学院天津工业生物技术研究所 (r)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成方法
CN104152500A (zh) * 2014-08-27 2014-11-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生物合成(r)-3-羟基戊二酸单酯的新方法
CN104962540A (zh) * 2015-06-30 2015-10-07 浙江工业大学 一种腈水解酶、编码基因、载体及应用
CN105176955A (zh) * 2015-08-27 2015-12-23 浙江工业大学 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用
CN108715881A (zh) * 2018-05-04 2018-10-30 浙江工业大学 一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B T SEWELL等: "Oligomeric Structure of Nitrilases Effect of Mutating Interfacial Residues on Activity", 《ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES》 *
CHIA-JUNG CHANG等: "Exploring the Mechanism Responsible for Cellulase Thermostability by Structure-Guided Recombination", 《PLOS ONE》 *
SALANOUBAT,M.等: "nitrilase 1 [Arabidopsis thaliana]", 《GENBANK DATABASE》 *
嵇东情等: "环氧树脂固定化拟南芥腈水解酶NIT的研究", 《精细与专用化学品》 *

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019154249A1 (zh) * 2018-02-09 2019-08-15 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
CN109234257B (zh) * 2018-09-21 2022-05-10 南京农业大学 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用
CN109234257A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 南京农业大学 一种腈水解酶基因nit2及其过表达和应用
CN111254134A (zh) * 2018-12-03 2020-06-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈基水解酶突变体及其在(s)-单腈单酸合成中的应用
CN112048492B (zh) * 2019-06-06 2023-12-22 尚科生物医药（上海）有限公司 一种酯水解酶突变体
CN112048492A (zh) * 2019-06-06 2020-12-08 尚科生物医药（上海）有限公司 一种酯水解酶突变体
CN112210549B (zh) * 2019-07-09 2022-06-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(r)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用
CN112210549A (zh) * 2019-07-09 2021-01-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(r)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用
CN112852789A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈水解酶突变体及其应用
CN112852789B (zh) * 2019-11-28 2022-04-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 腈水解酶突变体及其应用
CN111100856B (zh) * 2020-01-13 2021-12-07 浙江工业大学 腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用
CN114164197A (zh) * 2020-01-13 2022-03-11 浙江工业大学 一种热稳定性和活力提高的腈水解酶突变体及其应用
CN111100856A (zh) * 2020-01-13 2020-05-05 浙江工业大学 腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用
CN114164197B (zh) * 2020-01-13 2023-08-18 浙江工业大学 一种热稳定性和活力提高的腈水解酶突变体及其应用
CN111172140A (zh) * 2020-01-21 2020-05-19 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在制备抗癫痫药物中间体中的应用
CN111172140B (zh) * 2020-01-21 2022-04-19 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在制备抗癫痫药物中间体中的应用
CN111471668A (zh) * 2020-02-28 2020-07-31 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用
CN111471668B (zh) * 2020-02-28 2022-05-24 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在制备1-氰基环己基乙酸中的应用
CN111944792A (zh) * 2020-08-19 2020-11-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法
CN112063607B (zh) * 2020-10-09 2021-12-07 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN112063607A (zh) * 2020-10-09 2020-12-11 浙江工业大学 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN112359036B (zh) * 2020-11-30 2022-03-08 浙江工业大学 一种催化活力和反应专一性提高的腈水解酶突变体及应用
CN112359036A (zh) * 2020-11-30 2021-02-12 浙江工业大学 一种催化活力和反应专一性提高的腈水解酶突变体及应用
CN114908075A (zh) * 2022-04-02 2022-08-16 浙江工业大学 一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法
CN114908075B (zh) * 2022-04-02 2024-03-26 浙江工业大学 一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20210009981A1 (en) 2021-01-14
US11492606B2 (en) 2022-11-08
WO2019154249A1 (zh) 2019-08-15
CN108424900B (zh) 2020-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108424900A (zh) 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
CN106754846B (zh) 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
KR100206453B1 (ko) 신규한플라즈미드를이용하여형질전환시킨균주 이.채씨오엘아이.피와이로부터생산된피타제
CN103045559B (zh) 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用
CN108467860B (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的方法
CN112626056B (zh) 一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
CN112626057B (zh) 一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用
CN111518783B (zh) 重组(R)-ω-转氨酶、突变体及其在制备西他列汀中的应用
CN107603994B (zh) 一种κ-卡拉胶酶及其基因和应用
CN103981160B (zh) 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN110499301A (zh) 一种催化效率提高的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体
CN112746067B (zh) 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
CN110872593B (zh) 一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用
CN106434611A (zh) 一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法
CN113621592B (zh) 一种转氨酶突变体及其编码基因与应用
CN108277216A (zh) 高活性s-氰醇裂解酶及其应用
CN105907735B (zh) 一种催化效率与热稳定性提高的n-乙酰谷氨酸激酶突变体
CN112553185B (zh) 一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
CN110195088A (zh) 一种新的精氨酸水解酶及其编码基因和应用
CN109762801B (zh) 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性药物中间体中的应用
CN106434710A (zh) 一种耐热精氨酸酶的基因表达序列和应用
CN105349507B (zh) 一种脂肪酶LIPDa6及其编码基因和应用
CN115612691B (zh) 一种在非茶植物中合成l-茶氨酸的方法
CN110904066B (zh) 重组r型转氨酶、突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant