CN112210549A - 腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(r)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种腈水解酶突变体及其在催化3‑取代‑戊二腈类化合物合成(R)‑3‑取代‑4‑氰基丁酸中的应用，具体地，本发明提供了一种区域、立体选择性合成(R)‑3‑取代‑4‑氰基丁酸的腈水解酶突变体，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化3‑取代‑戊二腈类化合物生成(R)‑3‑取代‑4‑氰基丁酸的活性，并且所述突变蛋白在野生型的腈水解酶的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的腈水解酶突变体可以显著将腈水解酶催化合成产物的构型翻转。

Description

腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(R)-3-取代-4-氰基丁酸 类化合物中的应用
技术领域
本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及腈水解酶突变体在催化3-取代-戊二腈合成(R)-3- 取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经递 质，具有极其重要的生理功能，如镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用。广泛的应用于食品、医药、 保健、饮料加工等领域。然而，由于GABA的亲脂性较低，且其通过血脑屏障的能力较差，口服或静脉注 射GABA并不是一种有效的治疗方法。亲脂性GABA类似物能够跨越血脑屏障，从而抑制降解GABA的 转氨酶，发挥其生理作用，目前已成为大量研究的目标。因此，合成亲脂性GABA类似物具有重要实用意 义。许多手性的β位取代的GABA类似物，如(S)-普瑞巴林
Figure RE-GDA0002205714950000011
巴氯酚
Figure RE-GDA0002205714950000012
(R)-菲尼布特 等是被用来治疗中枢神经紊乱的药物(见附图1)。
3-取代-4-氰基丁酸化合物为GABA类似物的前体物质，可由腈水解酶区域、立体选择性水解3-取代 戊二腈类化合物获得。如3-异丁基戊二腈，3-(4-氯苯基)-戊二腈，3-苯基-戊二腈，3-丙基-戊二腈等，分别 是合成(S)-普瑞巴林，(R)-巴氯酚，(R)-菲尼布特及布瓦西坦前体的二腈类化合物底物。目前，已知腈水解 酶中水解3-取代戊二腈类化合物的产物大部分为S构型，尚未发现针对3-取代戊二腈类化合物的水解产物 均为R构型的腈水解酶。
因此，开发能够合成(R)-3-取代-4-氰基丁酸化合物的腈水解酶，是合成手性γ-氨基酸前体化合物的关 键，对神经系统疾病药物的研究发展具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种具有水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合 物催化活性的腈水解酶突变蛋白。
第一方面，本发明提供了一种与野生型腈水解酶氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90％同一性，且所述 突变蛋白具有水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活性的突变蛋白。优选 地，所述野生型腈水解酶来源于Synechocystissp.PCC6803。
第二方面，本发明提供了一种在对应于野生型腈水解酶氨基酸序列SEQ ID NO：1的氨基酸1至346中的 位点64、118、140、141、170、173、197、198、202、205和288在内的一个或多个位点突变的腈水解酶 突变蛋白。
在另一优选例中，所述第64位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)，优选酪氨酸(Y)。
在另一优选例中，所述第118位天门冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)，优选丙 氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第140位酪氨酸(Y)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)，优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第141位组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天门冬氨酸(D)、精氨酸(R)， 优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第170位色氨酸(W)突变为苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)，优选甘氨酸 (G)。
在另一优选例中，所述第173位酪氨酸(Y)突变为甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)，优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第197位甲硫氨酸(M)突变为半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸 (F)，优选苯丙氨酸(F)。
在另一优选例中，所述第198位缬氨酸(V)突变为色氨酸(W)、天门冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸 (A)，优选色氨酸(W)。
在另一优选例中，所述第202位苯丙氨酸(F)突变为半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、 甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)，优选缬氨酸(V)和/或丝氨酸(S)和/或异亮氨酸(I)，更优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第205位谷氨酰胺(Q)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天门冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)， 优选酪氨酸(Y)。
在另一优选例中，所述第288位甲硫氨酸(M)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天门冬酰胺(N)，优选丙 氨酸(A)。
在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7-11中的任一所示。
在另一优选例中，所述腈水解酶来源于Synechocystis sp.strain PCC 6803.。在另一优选例中，所述腈水 解酶的催化底物包括二腈类化合物。
在另一优选例中，二腈类化合物选择下组：
Figure BDA0002123113010000031
其中R为异丁基，苯基，4-甲基苯基， 4-异丙基苯基，4-氟苯基，4-溴苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，4-甲氧基苯基，4-硫甲基苯基，4- 三氟甲基苯基。
在另一优选例中，所述腈水解酶的突变蛋白催化3-取代-戊二腈类化合物反应生成(R)-3-取代-4-氰基 丁酸类化合物。
在另一优选例中，所述的腈水解酶的突变蛋白催化如下反应：所述腈水解酶的突变蛋白催化3-取代- 戊二腈类化合物反应生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物；
在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：
(i)反应体系的pH为6.0-10.0，较佳地，6-8，更佳地，7；
(ii)反应体系助溶剂为无助溶剂，乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四 氢呋喃、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1,4-二氧己环，较佳地，无助溶剂、甲醇、乙醇、N，N- 二甲基甲酰胺、丙酮，更佳地，甲醇、乙醇。
(iii)反应时间为1-24小时，较佳地，8-16小时，更佳地，8-14小时。在另一优选例中，所述腈水解酶 的突变蛋白具有选自下组的一个或多个特征：
(a)与野生型的腈水解酶相比，催化获得的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的产率≥95％，较佳地， ≥99％；
(b)与野生型的腈水解酶相比，催化获得的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的ee值≥20％，较佳地， ≥60％，较佳地，≥80％，更佳地，≥95％；
(c)与野生型的腈水解酶相比，催化获得的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物含量>99％。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变蛋白。
本发明第三方面提供了一种制备(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的方法，包括步骤：
(i)将本发明第一方面所述的腈水解酶突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所(R)-3- 取代-4-氰基丁酸类化合物；和
(ii)任选地，分离并纯化所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物。
在另一优选例中，所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物为手性化合物。
在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，25-32℃。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特 征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了SsNIT突变体蛋白经过纯化后结果。
其中，M表示Marker，1为野生型蛋白，2为代表性突变体蛋白
具体实施方式
通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，筛到了可显著改变腈水解酶的突变蛋白催化生产产 物立体选择性的关键氨基酸位点。本发明发现，对本发明的野生型的腈水解酶中的关键位点进行改造后， 可以显著改变腈水解酶的ee值。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“Y59A”表示第59位的氨基酸 Y突变为A，以此类推。
本发明突变蛋白及其编码核酸
如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明腈水解酶突变蛋白”、“本方面腈水解酶突 变体”可互换使用，均指非天然存在的腈水解酶突变蛋白，且所述突变蛋白为基于SEQ ID NO.:1所示蛋白 进行人工改造的蛋白，并且本发明突变蛋白具有催化3-取代-戊二腈类化合物形成(R)-3-取代-4-氰基丁酸 类化合物的酶活性。
本发明的腈水解酶具有宽广的底物谱，对一系列3-取代戊二腈类底物均具有高的立体选择性。
在本发明的一优选实施方式中，本发明的腈水解酶突变体(SsNIT突变体)的制备方法如下：大肠杆 菌作为表达宿主。
具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)SsNIT相应突变位点的基因构建到pET-15b表达载体上， 获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌Rosetta2(DE3)pLysS)， 获得相应的工程菌株。
(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养6小时，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，30℃培养12小时。(4)离心收集菌体。
本发明还提供了利用SsNIT及突变体重组菌作为生物催化剂转化二腈类化合物的方法。具体地，将 底物二腈类化合物与重组菌或者破菌液、纯酶构建反应体系，反应体系为pH 6.0-9.0的缓冲溶液，反应温 度为20℃到50℃。待水解反应结束后，反应液用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、 乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取三次，合并萃取液， 加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物，进一步通过常规方法，比如硅胶柱 分离、减压蒸馏、重结晶等方法进行纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。
野生型腈水解酶
如本文所用，“野生型腈水解酶”是指天然存在的、未经过人工改造的腈水解酶，其核苷酸可以通过基 因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得 到。所述野生型腈水解酶的氨基酸序列如SEQID NO.:1所示。
上述涉及的野生蛋白、本发明突变蛋白的序列信息如表1(见实施例)所示。
本发明的主要优点包括：
(i)本发明提供了多种腈水解酶突变蛋白，能够显著改变腈水解酶催化水解3-取代-戊二腈类化合物 生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的ee值。
(ii)本发明的腈水解酶具有宽广的底物谱，对一系列3-取代-戊二腈类化合物底物均具有高的立体选 择性。
实施例1:SsNIT腈水解酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备
将SEQ ID No.1的序列全合成后连接到pET-15b空质粒同时用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶 切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T4-DNA连 接酶的作用下，于4℃连接2小时，得到重组质粒pET-15b-SsNIT，进一步转化至Rosetta2(DE3)pLysS， 挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliRosetta2(DE3)pLysS/pET-15b-SsNIT。
实施例2:腈水解酶SsNIT突变体构建
腈水解酶SsNIT丙氨酸扫描：根据SsNIT的晶体结构，选取其底物结合口袋内非保守残基，进行丙 氨酸突变扫描。以pET-15b-SsNIT作为模板，采用两步法PCR，用高保真聚合酶PrimerSTAR MAX进行 PCR。PCR反应条件如下：round 1：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入模板50～100ng，25μL 2×primerSTAR MAX(mix)，一对突变引物各1μL(10μM)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)98℃ 变性10sec，(2)58℃退火30sec，(3)72℃延伸8sec，步骤(1)～(3)共进行30个循环。Round 2：总体 积为50μL的PCR反应体系中，加入模板50～100ng，25μL 2×PrimerSTAR MAX(mix)，突变引物1μL (round 1产物)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)58℃退火30sec，(3)72℃ 延伸2min，步骤(1)～(3)共进行25个循环。4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入 限内酶DpnI在37℃消化2h。将消化产物转入E.coli Rosetta 2(DE3)pLysS感受态细胞并涂布于含有氨苄抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到含4ml LB培养 基的试管中进行培养，对相应的基因进行测序。对表达的蛋白进行活力检测，所述的底物为3-异丁基戊二 腈，获得产物ee值改变的突变位点分别为N118，H141，W170，V198，F202。
构建腈水解酶的SsNIT突变体库：根据丙氨酸扫描结果构建饱合突变体库。PCR体系及程序同上。将 所得到的突变体进行蛋白表达及产物测定，所述的底物为3-异丁基戊二腈。所获得ee值发生改变的突变 体分别为突变体1、2、3、4、5，蛋白序列如SEQ ID NO.:2-6所示。
腈水解酶构建腈水解酶SsNIT组合突变：根据饱和突变结果构建组合突变。将所得到的单克隆菌落 挑取到含4ml LB培养基的试管中进行培养，对表达的蛋白进行活力检测。
经对底物3-异丁基戊二腈进行测定，结果表明两位点组合突变中突变体9的ee值最好，ee值＝59.7％ (R)，蛋白序列如SEQ ID NO.:10所示；多位点组合突变中突变体12、14、15、19、20的立体选择性最 好，ee值≥95％(R)，蛋白序列如SEQ ID NO.:13、15、16、20、21所示。
表1
Figure BDA0002123113010000061
实施例3：腈水解酶SsNIT突变体的诱导表达及纯化
配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种 环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量 转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG， 并置于30℃，200rpm诱导10～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100mM， pH 7.0)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法 纯化回收目的蛋白，目的蛋白经透析除去咪唑后即得SsNIT突变体纯酶液。SDS-PAGE电泳图谱显示纯 化所得蛋白条带单一，如图1所示。
结果表明，本实施例的方法能够获得较纯的蛋白突变体，单亚基蛋白分子量为40KD，纯度>95％。
实施例4：腈水解酶SsNIT突变体9重组菌催化3-取代-戊二腈类化合物的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体9，(其蛋白序列如SEQ IDNO.:9所示，其核 苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示)，离心收集菌体(6000rpm)，并以氯化钠溶液(0.9％，g/v)洗涤菌体2次， 以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-异丁基 -戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为150mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，14h后停止反应。反应结 束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水 硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。GC检测，产率>99％，ee值>59.7％(R)。
(2)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-苯基- 戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为170mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。反应结 束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水 硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>52％(R)。
(3)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-甲 基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为184mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>38％(R)。
(4)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-异 丙基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为212mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，18h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物为副产物酰胺。
(5)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-氟 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为188mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，14h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>54％(R)。
(6)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-溴 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为248mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>46％(R)。
(7)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(2-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为204mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>34％(R)。
(8)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(3-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为204mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>32％(R)。
(9)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为200mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>47％(R)。
(10)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-甲 氧基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为200mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>70％(R)。
(11)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-硫 甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为216mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>49％(R)。
(12)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-三 氟甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为238mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止 反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并 有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>31％(R)。
实施例5：腈水解酶SsNIT突变体12重组菌催化3-取代-戊二腈类化合物的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体12，(其蛋白序列如SEQ IDNO.:10所示，其 核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示)，离心收集菌体(6000rpm)，并以氯化钠溶液(0.9％，g/v)洗涤菌体2 次，以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-异丁基 -戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为150mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，14h后停止反应。反应结 束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水 硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。GC检测，产率>99％，ee值>95.9％(R)。
(2)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-苯基- 戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为170mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，14h后停止反应。反应结 束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水 硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>64％(R)。
(3)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-甲 基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为184mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>4.5％(R)。
(4)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-异 丙基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为212mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>86.1％(R)。
(5)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-氟 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为188mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>77％(R)。
(6)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-溴 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为248mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>19％(R)。
(7)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(2-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为204mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>43％(R)。
(8)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(3-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为204mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>43％(R)。
(9)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为200mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>19％(R)。
(10)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-甲 氧基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为200mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>81％(R)。
(11)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-硫 甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为216mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>82％(R)。
(12)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-三 氟甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为238mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止 反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并 有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>35％(R)。
实施例6：腈水解酶SsNIT突变体14重组菌催化3-取代-戊二腈类化合物的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体14，(其蛋白序列如SEQ IDNO.:12所示，其 核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示)，离心收集菌体(6000rpm)，并以氯化钠溶液(0.9％，g/v)洗涤菌体2 次，以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-异丁基 -戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为150mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，14h后停止反应。反应结 束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水 硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。GC检测，产率>99％，ee值>95％(R)。
(2)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-苯基- 戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为170mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。反应结 束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水 硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>64％(R)。
(3)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-甲 基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为184mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>8.2％(R)。
(4)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-异 丙基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为212mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>91.2％(R)。
(5)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-氟 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为188mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>49％(R)。
(6)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-溴 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为248mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>11.8％(R)。
(7)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(2-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为204mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>48.5％(R)。
(8)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(3-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为204mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。反 应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>40.5％(R)。
(9)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-氯 苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为200mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，16h后停止反应。 反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相， 无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>16.2％(R)。
(10)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-甲 氧基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为200mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>88.1％(R)。
(11)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-硫 甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为216mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反 应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有 机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>93.8％(R)。
(12)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为50g/L，加入底物3-(4-三 氟甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为238mg/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止 反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并 有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，ee值>53％(R)。
结果表明，选取代表性腈水解酶SsNIT突变体9，腈水解酶SsNIT突变体12，腈水解酶SsNIT突变 体14能够转化3-取代戊二腈类化合物为(R)-3-取代-4-氰基丁酸，转化产物的ee>10％(R)，ee>20％(R)， 40％(R)，60％(R)，80％(R)，甚至>95％(R)。
结果表明，与野生型的腈水解酶相比，本发明的腈水解酶的突变蛋白可区域、立体选择性催化3-取代 -戊二腈类化合物，生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。 此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这 些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 腈水解酶突变蛋白及其在催化合成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用
<130> 20190708
<141> 2019-07-09
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Val Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe
50 55 60
Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly Lys Ser His Leu Lys Leu Tyr Gln
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Glu Gly Ser Leu Tyr Ala Thr Gln Leu Ile Phe Asp Ala Asp Gly Ala
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Lys Met His Gln Ala Leu Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Ala Ile Ile Ser
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Leu Asn Asn Gln Pro Trp Ser Ala Leu Glu Ala Asn Pro Val Thr Pro
305 310 315 320
Asn Ala Ile Pro Ala Val Ser Asp Pro Glu Leu Thr Glu Thr Ile Glu
325 330 335
Ala Leu Pro Asn Asn Pro Ile Phe Ser His
340 345

Claims (10)

1.分离的野生型腈水解酶的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白与野生型腈水解酶氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90％同一性，且所述突变蛋白具有水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活性。
2.权利要求1的突变蛋白，其特征在于，所述野生型腈水解酶来源于Synechocystissp.PCC6803。
3.权利要求1或2所述的突变蛋白，其特征在于，包括在一个或多个位点上的突变，所述的位点对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1至346中的位点64、118、140、141、170、173、197、198、202、205和288。
4.权利要求3的突变蛋白，其包括在对应于SEQ ID NO：1上的以下任一种位点的突变：
a)在118位上的突变；
b)在170位上的突变；
c)在118位和170位上的组合突变；
d)在118位和198位上的组合突变；
e)在170位和198位上的组合突变；
f)在118位和170位和198位上的组合突变；
g)在170位和198位和202位上的组合突变；
h)在141位和170位和198位上的组合突变；
i)在118位和170位和198位和202位上的组合突变；
j)在141位和170位和198位和202位上的组合突变；
k)在118位和141位和170位和198位和202位上的组合突变。
5.权利要求4的突变蛋白，其特征在于，对应于SEQ ID NO：1上的位点118的氨基酸由天门冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)，优选丙氨酸(A)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点141由组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天门冬氨酸(D)、精氨酸(R)，优选丙氨酸(A)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点170的氨基酸由色氨酸(W)突变为苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)，优选为甘氨酸(G)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点198的氨基酸由缬氨酸(V)突变为色氨酸(W)、天门冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)，优选色氨酸(W)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点202由苯丙氨酸(F)突变为半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选缬氨酸(V)和/或丝氨酸(S)和/或异亮氨酸(I)，更优选丙氨酸(A)。
6.权利要求3的突变蛋白，其包括对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1至346中的位点64、118、140、141、170、173、197、198、202、205和288中的六个及以上位点上的突变。
7.权利要求6所述的突变蛋白，其特征在于，优选下述在对应于SEQ ID NO：1上的以下任一种位点的突变：
a)在118位和140位和141位和170位和198位和202位上的组合突变；
b)在118位和141位和170位和197位和198位和202位上的组合突变；
c)在64位和118位和141位和170位和198位和202位上的组合突变；
d)在118位和141位和170位和198位和202位和205位上的组合突变；
e)在118位和141位和170位和173位和198位和202位上的组合突变；
f)在118位和141位和170位和198位和202位和288位上的组合突变。
8.权利要求7所述的突变蛋白，其特征在于，对应于SEQ ID NO：1上的位点64的氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选酪氨酸(Y)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点118的氨基酸由天门冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)，优选丙氨酸(A)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点140的氨基酸由酪氨酸(Y)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)，优选丙氨酸(A)。
对应于SEQ ID NO：1上的位点141由组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天门冬氨酸(D)、精氨酸(R)，优选丙氨酸(A)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点170的氨基酸由色氨酸(W)突变为苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)，优选为甘氨酸(G)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点173的氨基酸由酪氨酸(Y)突变为甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)，优选丙氨酸(A)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点197的氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)，优选苯丙氨酸(F)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点198的氨基酸由缬氨酸(V)突变为色氨酸(W)、天门冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)，优选色氨酸(W)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点202的氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选缬氨酸(V)和/或丝氨酸(S)和/或异亮氨酸(I)，更优选丙氨酸(A)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点205的氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天门冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)，优选酪氨酸(Y)；
对应于SEQ ID NO：1上的位点288的氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天门冬酰胺(N)，优选丙氨酸(A)。
9.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1-8任一所述的腈水解酶突变蛋白。
10.一种制备(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将权利要求1-8任一所述的腈水解酶突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸；和
(ii)任选地，分离并纯化所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸。
优选地，所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物为手性化合物。
进一步优选地，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，25-32℃。
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