CN112852789B - 腈水解酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种腈水解酶突变体及其在(R)‑3‑取代‑4‑氰基丁酸合成中的应用，具体地，本发明提供了一种提高催化合成(R)‑3‑取代‑4‑氰基丁酸活性的腈水解酶突变体，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有显著提高催化3‑取代‑戊二腈类化合物生成(R)‑3‑取代‑4‑氰基丁酸的活性，并且所述突变蛋白在野生型的腈水解酶的两个或两个以上的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的腈水解酶突变体可以显著提高腈水解酶催化合成产物的产量。

Description

腈水解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及一种活力提高的腈水解酶突变体及其在催化合成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物中的应用。
背景技术
腈水解酶(Nitrilase EC 3.5.5.1)是一类催化腈类化合物(R-CN)水解直接生成羧酸和氨的生物催化剂，具有反应条件温和、环境友好及高度化学、区域和立体选择性等特性，广泛应用于(手性)氨基酸、羧酸及其衍生物的合成。然而，野生型的腈水解酶作为生物催化剂通常活力较低，难以适应工业环境的要求，因此采用理性和非理性蛋白质改造方法为提高腈水解酶催化性能的重要手段，已成为研究及应用热点。
腈水解酶立体选择性水解3-取代戊二腈类化合物生成3-取代-4-氰基丁酸化合物，该类化合物作为手性中间体，可用于合成γ-氨基丁酸(GABA)类似物类药物，如(S)-普瑞巴林
Figure BDA0002293216540000011
(R)-巴氯酚
Figure BDA0002293216540000012
(R)-菲尼布特等。与GABA药物作用相同，均具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压等生理作用。此外，GABA类似物跨越血脑屏障能力较强，能够有效作用于中枢神经系统发挥生理作用。其中，普瑞巴林((S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸)与传统的药物相比，具有服用剂量低、次数少、毒副作用小、持续时间长、耐受性强等优点，被认为是最有希望的抗癫痫治疗药物之一。自2003年在美国提出注册申请后，在全球80多个国家和地区陆续上市，市场前景十分广阔。
目前，野生型腈水解酶尚未发现具有高立体选择性合成本文所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活性，本实验室通过基因工程手段已获得具有合成高立体选择性的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的腈水解酶突变体(专利申请号：201910613354.6)。已获得的R构型化合物经过腈基水合反应及霍夫曼降解可生成具有药理活性的GABA类似物，如(S)-普瑞巴林
Figure BDA0002293216540000013
(R)-巴氯酚
Figure BDA0002293216540000014
等，该路线具有反应原料廉价、反应条件温和等优点。然而，该路线中腈水解酶生物催化过程中一个挑战性的问题是腈水解酶活力较低，不能满足规模化应用的需求。因此，获得高活力腈水解酶生物催化剂，对实现(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的高效、绿色工业化生产具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种通过基因工程手段改造后的腈水解酶突变体，具体地，改造后的腈水解酶突变体水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的催化活力显著提高。
第一方面，本发明提供了一种腈水解酶突变体，该突变体与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，且所述突变体具有水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的能力，并且，水解活性显著提高。
第二方面，本发明提供的腈水解酶突变体获得首先是：在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1至346中的位点将第118位天门冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)、第141位组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)、第170位色氨酸(W)突变为甘氨酸(G)、第198位缬氨酸(V)突变为色氨酸(W)和第202位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)，获得的腈水解酶突变体SsNIT-E5，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
随后进一步获得的突变体是在对应于腈水解酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸1至346中的位点137、168、193、和288在内的一个或多个位点突变的腈水解酶突变体：
在另一优选例中，所述第137位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、半胱氨酸(C)，优选半胱氨酸(C)。
在另一优选例中，所述第168位丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、谷氨酸(E)，优选谷氨酸(E)。
在另一优选例中，所述第193位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、天冬氨酸(N)、色氨酸(W)，优选色氨酸(W)。
在另一优选例中，所述第288位甲硫氨酸(M)突变为丙氨酸(A)、丝氨酸(S)，异亮氨酸氨酸(I)，优选异亮氨酸氨酸(I)。
在另一优选例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2-9中的任一所示。
在另一优选例中，所述腈水解酶的催化底物包括二腈类化合物。
在另一优选例中，二腈类化合物选择下组：
Figure BDA0002293216540000021
其中R为异丁基，苯基，4-甲基苯基，4-异丙基苯基，4-氟苯基，4-溴苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-氯苯基，4-甲氧基苯基，4-硫甲基苯基，4-三氟甲基苯基。
在另一优选例中，所述腈水解酶的突变体具有显著提高催化3-取代-戊二腈类化合物反应生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活性。
在另一优选例中，所述的腈水解酶的突变体催化如下反应：具体地，所述催化反应以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以3-取代-戊二腈类化合物为底物，以甲醇等有机溶剂为助溶剂，以pH为6.0-10.0的缓冲液为反应介质，在25℃-50℃、200rpm条件下进行水解反应；
在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：
(i)反应体系含有菌体量为10-100g/L，更佳地，10-30g/L；
(ii)反应体系的pH为6.0-10.0，较佳地，6-8，更佳地，7；
(iii)反应体系温度为25℃-50℃，较佳地，25℃-35℃，更佳地，30℃。
反应体系助溶剂为无助溶剂，乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1,4-二氧己环，较佳地，无助溶剂、甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮，更佳地，甲醇。
(iv)反应时间为1-48小时，较佳地，8-30小时，更佳地，8-24小时。
在另一优选例中，所述腈水解酶的突变体具有选自下组的一个或多个特征：
(a)与野生型的腈水解酶相比，催化底物浓度为1-200g/L，更佳地，底物浓度为8.8-180g/L；
(b)与野生型的腈水解酶相比，催化获得的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的产率≥95％，较佳地，≥99％；
(b)与野生型的腈水解酶相比，催化获得的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的ee值≥20％，较佳地，≥90％，更佳地，≥98.5％；
(c)与野生型的腈水解酶相比，催化获得的(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的含量≥90％，≥92％，更佳地，≥95％。
本发明第三方面提供了一种腈水解酶突变体在制备(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的应用，包括步骤：
(i)将本发明第一方面所述的腈水解酶突变体与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物；和
(ii)任选地，分离并纯化所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物。
在另一优选例中，所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物为手性化合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了SsNIT与突变体蛋白经诱导表达后结果。
其中，M表示Marker，1为SsNIT可溶蛋白表达，2为SsNIT不可溶蛋白表达，3为代表性突变体可溶蛋白表达，4为代表性突变体不可溶蛋白表达。
具体实施方式
通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，已获得了可显著改变腈水解酶的突变体催化生产产物活性的关键氨基酸位点。本发明发现，对本发明的野生型的腈水解酶中的关键位点进行改造后，可以显著提高腈水解酶的活性。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“T137C”表示第137位的氨基酸T突变为C，以此类推。
本发明突变体及其编码核酸
如本文所用，术语“突变体”、“本发明突变体”、“本发明腈水解酶突变体”、“本方面腈水解酶突变体”可互换使用，均指非天然存在的腈水解酶突变体，且所述突变体为基于SEQ ID NO.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白，并且本发明突变体具有显著提高催化水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活性。
本发明的腈水解酶突变体具有宽广的底物谱，对一系列3-取代戊二腈类化合物底物均具有提高活力的能力。
在本发明的一优选实施方式中，本发明的腈水解酶突变体(SsNIT突变体)的制备方法如下：大肠杆菌作为表达宿主。
具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)SsNIT相应突变位点的基因构建到pET-15b表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌Rosetta2(DE3)pLysS)，获得相应的工程菌株。
(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养6小时，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃培养12小时。(4)离心收集菌体。
本发明还提供了利用突变体重组菌作为生物催化剂转化二腈类化合物的方法。具体地，将底物二腈类化合物与重组菌或者破菌液、纯酶构建反应体系，反应体系为pH 6.0-9.0的缓冲溶液，反应温度为20℃到50℃。待水解反应结束后，用2倍体积乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液进行萃取，重复萃取两次，收集水相溶液。水相溶液调节pH为1-2后，用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物，进一步通过常规方法，比如硅胶柱分离、减压蒸馏、重结晶等方法进行纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。
野生型腈水解酶
如本文所用，“野生型腈水解酶”是指天然存在的、未经过人工改造的腈水解酶，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其核苷酸序列可由氨基酸序列推导而得到。
上述涉及的SsNIT、SsNIT-E5、本发明突变体的序列信息如表2(见实施例)所示。
本发明的主要优点包括：
(i)本发明提供了多种腈水解酶突变体，能够显著提高腈水解酶催化水解3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活性。
(ii)本发明的腈水解酶具有宽广的底物谱，对一系列3-取代-戊二腈类化合物底物均具有提高活性的能力。
实施例1:SsNIT腈水解酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备
将SEQ ID No.1的氨基酸序列对应的碱基序列全合成后连接到pET-15b空质粒同时用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T4-DNA连接酶的作用下，于4℃连接2小时，得到重组质粒pET-15b-SsNIT，进一步转化至Rosetta2(DE3)pLysS，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli Rosetta2(DE3)pLysS/pET-15b-SsNIT。
实施例2:腈水解酶突变体SsNIT-E 5重组表达质粒和重组表达转化体的制备
构建腈水解酶突变体SsNIT-E5：以pET-15b-SsNIT为模板，设计引物，如表1所示，首先构建突变体SsNIT-N118A/W170G，再以突变体SsNIT-N118A/W170G为模板，设计引物，如表1所示，构建突变体SsNIT-N118A/H141A/W170G/V198W/F202A(SsNIT-E5)。聚合酶链式反应(PCR)采用两步法PCR，用高保真聚合酶PrimerSTAR MAX进行PCR。PCR反应条件如下：round 1：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入模板50～100ng，25μL 2×primerSTAR MAX(mix)，一对突变引物各1μL(10μM)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)58℃退火30sec，(3)72℃延伸8sec，步骤(1)～(3)共进行30个循环。Round 2：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入模板50～100ng，25μL 2×PrimerSTAR MAX(mix)，突变引物1μL(round 1产物)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)58℃退火30sec，(3)72℃延伸2min，步骤(1)～(3)共进行25个循环。4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入限内酶DpnI在37℃消化2h。将消化产物转入E.coli Rosetta2(DE3)pLysS感受态细胞并涂布于含有氨苄抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli Rosetta2(DE3)pLysS/pET-15b-SsNIT-E 5。
表1
Figure BDA0002293216540000051
实施例3:腈水解酶SsNIT-E 5突变体库的构建
构建腈水解酶SsNIT-E 5的突变体库：根据已知腈水解酶SsNIT的晶体结构(PDB:3WUY)构建SsNIT-E5的蛋白质结构模型，选取其底物结合口袋内非保守残基，分别进行饱和突变，采用简并密码子NNK设计突变引物，以pET-15b-SsNIT-E 5作为模板，构建方法如实施例2。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，筛选方法为苯酚次氯酸钠法，对活性较高的突变体的基因进行测序。对表达的蛋白进行活力检测，所述的底物为3-异丁基戊二腈，获得突变体活力提高的突变位点分别为137、168、193和289，分别为突变体1、2、3、4，蛋白序列如SEQ ID NO.:3-6所示。经对底物3-异丁基戊二腈进行测定，结果表明单点突变中突变体1活力最好，为SsNIT-E 5的4.3倍，蛋白序列如SEQ ID NO.:3所示。
实施例4:腈水解酶SsNIT-E 5组合突变体库构建：根据饱和突变结果，选取活力提高最优突变体为模板，分别构建组合突变体库。构建方法如实施例2，筛选方法如实施例3，对活性较高的突变体的基因进行测序。对表达的蛋白进行活力、ee值及副产物检测，所述的底物为3-异丁基戊二腈。经对底物3-异丁基戊二腈进行测定，结果表明两位点组合突变获得的突变体为突变体5、6，蛋白序列分别为SEQ ID NO.:7-8，其中最优双点突变体为突变体6，活力为E5的11倍、ee值为98％R且副产物的量为总产物量的2.6％；三个位点组合突变获得最优突变体为突变体7，蛋白序列为SEQ ID NO.:9，活力为E5的27.2倍，ee值为98.5％R，副产物的量为总产物量的1％；四个位点组合突变中最优突变体为突变体8活力为SsNIT-E5的34倍，ee值＝99％(R)，酰胺的生成量为1％，蛋白序列如SEQ ID NO.:10所示。
表2
Figure BDA0002293216540000061
实施例5：腈水解酶SsNIT突变体的诱导表达
配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于30℃，200rpm诱导10～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 7.0)清洗一遍。SDS-PAGE电泳图谱显示SsNTI与突变体的诱导表达情况，如图1所示。
结果表明，本实施例的方法获得的突变体蛋白与SsNTI均含可溶性蛋白表达，单亚基蛋白分子量为40KD。
实施例6：腈水解酶SsNIT突变体8重组菌催化3-取代-戊二腈类化合物的方法
按照实施例4的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体8，(其蛋白序列如SEQ IDNO.:10所示)，离心收集菌体(6000rpm)，并以氯化钠溶液(0.9％，g/v)洗涤菌体1次，以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-异丁基-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为65g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。GC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥99％(R)。
(2)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-苯基-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为20g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次除去副产物，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥64％(R)。
(3)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为21.7g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥40％(R)。
(4)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-异丙基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为8.7g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥91％(R)。
(5)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-氟苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为14g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥92％，ee值≥31％(R)。
(6)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-溴苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为11.3g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥25％(R)。
(7)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(2-氯苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为34.8g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥92％，ee值≥45％(R)。
(8)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(3-氯苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为37g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥50％(R)。
(9)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-氯苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为13g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥92％，ee值≥25.9％(R)。
(10)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-甲氧基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为22g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥95％，ee值≥75％(R)。
(11)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-硫甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为12.4g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥92％，ee值≥76％(R)。
(12)取菌体重悬于100mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-三氟甲基-苯基)-戊二腈(5％v/v甲醇)至终浓度为180g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯和石油醚1:1的混合溶液萃取反应液数次除去副产物，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率>99％，产物含量≥92％，ee值≥60％(R)。
结果表明，选取代表性腈水解酶SsNIT突变体8，能够提高3-取代戊二腈类化合物转化为(R)-3-取代-4-氰基丁酸的活力，转化产物的产率>99％；纯化产物含量≥92％，甚至，≥95％；转化产物的ee>20％(R)，ee>60％(R)，ee>90％(R)，甚至≥99％(R)。
结果表明，与腈水解酶突变体SsNIT-E 5相比，本发明的腈水解酶的突变体可显著提高立体选择性催化3-取代-戊二腈类化合物生成(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的活力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 腈水解酶突变体及其应用
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<170> PatentIn version 3.5
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Val Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ala Gly Leu Arg Thr Val Asp Thr Thr
145 150 155 160
Val Gly Arg Leu Gly Ala Leu Glu Cys Gly Glu His Tyr Asn Pro Leu
165 170 175
Ala Arg Tyr Ala Leu Met Ala Gln His Glu Gln Ile His Cys Gly Gln
180 185 190
Trp Pro Gly Ser Met Trp Gly Gln Ile Ala Ala Asp Gln Met Glu Val
195 200 205
Thr Met Arg His His Ala Leu Glu Ser Gly Cys Phe Val Ile Asn Ala
210 215 220
Thr Gly Trp Leu Thr Ala Glu Gln Lys Leu Gln Ile Thr Thr Asp Glu
225 230 235 240
Lys Met His Gln Ala Leu Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Ala Ile Ile Ser
245 250 255
Pro Glu Gly Lys His Leu Cys Glu Pro Ile Ala Glu Gly Glu Gly Leu
260 265 270
Ala Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ser Leu Ile Ala Lys Arg Lys Arg Met
275 280 285
Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ala Arg Pro Asp Leu Leu Gln Leu Thr
290 295 300
Leu Asn Asn Gln Pro Trp Ser Ala Leu Glu Ala Asn Pro Val Thr Pro
305 310 315 320
Asn Ala Ile Pro Ala Val Ser Asp Pro Glu Leu Thr Glu Thr Ile Glu
325 330 335
Ala Leu Pro Asn Asn Pro Ile Phe Ser His
340 345
<210> 10
<211> 346
<212> PRT
<213> Synechocystis sp. PCC6803
<400> 10
Met Leu Gly Lys Ile Met Leu Asn Tyr Thr Lys Asn Ile Arg Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Ile Ser Pro Val Leu Phe Ser Gln Gln Gly Thr Met Glu
20 25 30
Lys Val Leu Asp Ala Ile Ala Asn Ala Ala Lys Lys Gly Val Glu Leu
35 40 45
Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Val Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe
50 55 60
Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly Lys Ser His Leu Lys Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Glu Ala Val Thr Val Pro Gly Lys Val Thr Gln Ala Ile Ala Gln Ala
85 90 95
Ala Lys Thr His Gly Met Val Val Val Leu Gly Val Asn Glu Arg Glu
100 105 110
Glu Gly Ser Leu Tyr Ala Thr Gln Leu Ile Phe Asp Ala Asp Gly Ala
115 120 125
Leu Val Leu Lys Arg Arg Lys Ile Cys Pro Thr Tyr Ala Glu Arg Met
130 135 140
Val Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ala Gly Leu Arg Thr Val Asp Thr Thr
145 150 155 160
Val Gly Arg Leu Gly Ala Leu Glu Cys Gly Glu His Tyr Asn Pro Leu
165 170 175
Ala Arg Tyr Ala Leu Met Ala Gln His Glu Gln Ile His Cys Gly Gln
180 185 190
Trp Pro Gly Ser Met Trp Gly Gln Ile Ala Ala Asp Gln Met Glu Val
195 200 205
Thr Met Arg His His Ala Leu Glu Ser Gly Cys Phe Val Ile Asn Ala
210 215 220
Thr Gly Trp Leu Thr Ala Glu Gln Lys Leu Gln Ile Thr Thr Asp Glu
225 230 235 240
Lys Met His Gln Ala Leu Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Ala Ile Ile Ser
245 250 255
Pro Glu Gly Lys His Leu Cys Glu Pro Ile Ala Glu Gly Glu Gly Leu
260 265 270
Ala Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ser Leu Ile Ala Lys Arg Lys Arg Ile
275 280 285
Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ala Arg Pro Asp Leu Leu Gln Leu Thr
290 295 300
Leu Asn Asn Gln Pro Trp Ser Ala Leu Glu Ala Asn Pro Val Thr Pro
305 310 315 320
Asn Ala Ile Pro Ala Val Ser Asp Pro Glu Leu Thr Glu Thr Ile Glu
325 330 335
Ala Leu Pro Asn Asn Pro Ile Phe Ser His
340 345

Claims (2)

1.一种腈水解酶突变蛋白，其特征在于，具有以下任一种序列，
（1）将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第137位苏氨酸替换为半胱氨酸；
（2）将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第168位丙氨酸替换为谷氨酸；
（3）将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第137位苏氨酸替换为半胱氨酸，第193位苯丙氨酸替换为色氨酸；
（4）将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第137位苏氨酸替换为半胱氨酸，第168位丙氨酸替换为谷氨酸；
（5）将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第137位苏氨酸替换为半胱氨酸，第168位丙氨酸替换为谷氨酸；第193位苯丙氨酸替换为色氨酸；
（6）将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第137位苏氨酸替换为半胱氨酸，第168位丙氨酸替换为谷氨酸；第193位苯丙氨酸替换为色氨酸；288位甲硫氨酸替换为异亮氨酸。
2.一种制备(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物的方法，其特征在于，包括步骤：(i)将权利要求1所述的腈水解酶突变蛋白与反应底物3-取代-戊二腈类化合物接触，进行催化反应，从而获得所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物；和(ii)任选地，分离并纯化所述(R)-3-取代-4-氰基丁酸类化合物。
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