CN109355271A

CN109355271A - 一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用

Info

Publication number: CN109355271A
Application number: CN201811621721.9A
Authority: CN
Inventors: 徐雄峰; 王婷婷; 苏永君; 章程; 胡博淳; 胡蝶; 李剑芳; 邬敏辰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109355271B

Abstract

本发明公开了一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种来源于海洋红酵母R.paludigenum的环氧化物水解酶基因(rpeh1)及对应的氨基酸序列；构建了含有该基因的重组质粒pET28a(+)‑rpeh1和基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)‑rpeh1，并利用该菌株制备重组环氧化物水解酶；应用本发明构建的基因工程菌进行生物催化，制备得到对映纯的R型苯基乙二醇ee>73％。

Description

一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

手性环氧化物或邻二醇是一类高附加值的多功能合成子，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases，EHs)能催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。目前报道了约40种对映选择性高的EHs(对映选择率E值>30),主要用于环氧化物的水解动力学拆分，但理论产率仅为50％。

与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可达100％。对映归一性水解制备手性邻二醇有三种途径:(1)对映和区域选择性高且互补的两种EHs联合催化。Lin等将源自Streptomyces globisporus和Streptomyces carzinostaticus的两种EHs共催化外消旋环氧苯乙烷(SO)归一性水解，(R)-苯乙二醇(PED)的产率和纯度分别为87％和99％e.e._p。(2)生物酶法和化学酸法串联催化.Orru等利用Nocardia sp.胞内对映和区域选择性高的EH攻击一种对映体中取代基少的β-碳原子，构型保留；再用硫酸催化残留的另一种对映体水解，攻击发生在取代基多的α-碳原子上，构型反转。(3)区域选择性高且互补的单一EH催化。Kotik等利用表达最优AnEH突变酶H∶12-A1的E.coli全细胞催化(R,S)-SO对映归一性水解，(R)-PED的纯度为70.1％e.e._p。

一些具有环氧化物水解酶活性的菌种，如鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，红球菌(Rhodococcus sp.)，黑曲霉(Aspergillus niger)等先后被分离。Liu等将黑曲霉的环氧化物水解酶基因导入大肠杆菌中表达并获得成功，该酶以对硝基氧化苯乙烯为底物，酶活力达到104.5U/mg。Furstoss等发现A.niger(LCP 521)和Beauveria bassiana(ATCC7159)产生的酶有很高的立体选择性，并且酶的区域选择性相反。随着生物信息学的发展、基因序列信息的积累以及基因工程技术的进步，快速获得新的EH基因已成为可能，且来源于真菌A.niger和细菌Agrobacterium radiobacter ADI的EH分子的微观结构已通过x-射线分析，为EH的基因工程研究提供了条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)来源的环氧化物水解酶、环氧化物水解酶工程菌的构建以及重组环氧化物水解酶的异源表达方法。本发明发现了来源于Rhodosporidium paludigenum的一种新型环氧化物水解酶，命名为RpEH1，其相应的基因命名为Rpeh1。RpEH1具有较高的催化活性和手性选择性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。

本发明的第一个目的是提供一种(Rhodosporidium paludigenum)来源的环氧化物水解酶，环氧化物水解酶是(a)、(b)或(c)：

(a)含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的氨基酸序列具有>97％同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或表达所述环氧化物水解酶的细胞。

本发明的第四个目的是提供一种产环氧化物水解酶的基因工程菌，

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法：将SEQ ID NO.2所示的基因与载体pET-28a(+)连接，E.coli BL21(DE3)中表达。

本发明的第六个目的是提供一种制备R-苯乙二醇的方法，所述方法是以所述基因工程菌为细胞催化剂，以外消旋环氧苯乙烷为底物，在20～40℃下进行催化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以0.05～0.1U/mM环氧苯乙烷的比例加入细胞催化剂，于25～28度，200～220rpm反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是10mg/ml的菌浓催化400mM外消旋环氧苯乙烷，于25度，220rpm下反应6小时。

本发明还要求保护所述环氧化物水解酶在手性生物催化方面的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种R.paludigenum来源的新的环氧化物水解酶，命名为RpEH1，其相应的基因命名为Rpeh1。RPEH1具有较高的催化活性和手性选择性，以外消旋环氧苯乙烷为底物时，冷冻干燥的全细胞菌体催化活性达3.7U/mg,以10mg/ml的较低冷冻全细胞浓度可以在6个小时内完成高浓度外消旋环氧苯乙烷(400mM)的归一性水解，eep达到67％，转化率为100％有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。并且RpEH1的底物谱广泛对于4-氯氧化苯乙烯、3-氯氧化苯乙烯、苯基缩水甘油醚、对甲基缩水甘油醚、间甲基缩水甘油醚、邻甲基甲基缩水甘油醚和脂肪族环氧化物都具有较高的对映选择性和催化活性。

附图说明

图1：重组质粒pET-28a(+)-Rpeh1的构建示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

重组RpEH1的活性测定方法：在1.5mL的EP管中加入100μL冻干菌粉重悬液(菌体浓度10mg/ml以50mM pH7.2的磷酸盐缓冲液重悬)和800μL磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，25℃预热2min；加入100μL 200mM的环氧苯乙烷(styrene oxide，SO)并立即计时，准确反应30min后，取200μL反应液加入800μL乙酸乙酯中混匀，10000r/min离心5min后，取上层于新的EP管中，加入适量无水MgSO₄，进行手性气相色谱分析(检测方法参考公开号为CN106047834A的专利申请)。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟消耗1μmol外消旋环氧苯乙烷所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶活性单位(U)。

实施例1 RPEH1成熟肽cDNA序列的克隆

(1)根据同源性高的海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)CBS 6565环氧化物水解酶基因序列，设计一对特异性引物，引物序列如下：

RpEH1-F：5’-CATATGGCTGCCCATTCCTTTACTGC-3’，含Nde I酶切位点

RpEH1-R：5’-GAATTCTCAGGCCTGGTTCGACAGCAA-3’，含EcoR I酶切位点

提取筛选获得的R.paludigenum的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链。以RpEH1-F和M13Primer M4为引物进行第一轮PCR扩增，PCR条件为：94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。以RpEH1-F和RpEH1-R为引物进行第二轮PCR扩增，PCR条件为：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 30s，30个循环；72℃10min。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Rpeh1)，转化入E.coli JM109中，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序，得到RpEH1成熟肽cDNA序列。

实施例2 RPEH1成熟肽基因在E.coli BL21(DE3)中的表达

将测序结果正确的pUCm-T-Rpeh1与pET-28a(+)质粒均用Nde I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-Rpeh1，并对重组质粒进行序列测定。将pET-28a(+)-Rpeh1转化入E.coli BL21(DE3)中，经含有Kan的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2mL含Kan的抗性LB液体培养基中，37℃215r/min摇床振荡培养14～16h。按1％的接种量转接于30mL相同培养基中，37℃215r/min摇床振荡培养至对数生长中期(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，加入终浓度为150μM的IPTG，16℃215r/min诱导培养10h。将发酵液离心收集菌体，使用去离子水洗涤2次，冷冻干燥得到全细胞冻干酶粉。对照组分别用仅含空pET-28a(+)和无IPTG诱导的工程菌在相同条件下培养。经测定，全细胞冷冻干燥酶粉的酶活力为3.4U/mg，对照组无酶活。

实施例3 RPEH1的应用

以50mM pH7.2的磷酸盐缓冲液重悬使用实施例2中方法得到的全细胞冻干酶粉，使得重悬菌液的菌体浓度为100mg/mL。在2mL EP管中加入100μL前述重悬菌液，45.6μL环氧苯乙烷原液，854.4μL 50mM pH7.2的磷酸盐缓冲液。在25℃ 220rpm条件下反应，定时取样进行气相色谱分析计算其转化率和ee_p值。结果显示，在终浓度10mg/mL菌浓下反应6小时，底物环氧苯乙烷完全水解，转化率达到100％，ee_p达到67％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 411

<212> PRT

<213> Rhodosporidium paludigenum

<400> 1

Met Ala Ala His Ser Phe Thr Ala Pro Pro Ala Pro Tyr Asn Ile Asp

1 5 10 15

Phe Ala Pro Gln Val Asp Asp Leu His Arg Arg Leu Asp Ala Ala Arg

20 25 30

Trp Pro Gly Gln Asp Val Val Pro Asp Asp Val Asp Tyr Gly Glu His

35 40 45

Gly Ala Phe Gly Leu Gly Ala Gly Pro Ser Leu Ala Leu Met Lys Glu

50 55 60

Leu Ala Gln Glu Trp Arg Gly Gln Asp Gln Lys Gln Leu Gln Asp His

65 70 75 80

Leu Asn Ser Tyr Lys Asn Tyr Arg Val Glu Ile Glu Gly Leu Asp Ile

85 90 95

His Phe Leu His Tyr Pro Ser Ala Arg Ala Asp Ala Phe Pro Leu Ile

100 105 110

Leu Cys His Gly Trp Pro Gly Gly Tyr His Glu Phe Leu His Val Leu

115 120 125

Glu Arg Leu Thr Glu Pro Lys Asp Gln Gly Ser Arg Ala Phe His Val

130 135 140

Val Val Pro Ser Met Pro Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Pro Pro Lys Thr

145 150 155 160

Ala Lys Trp Gly Met Glu Asp Thr Ala Arg Val Phe Asp Lys Leu Met

165 170 175

Thr Gly Leu Gly Tyr Phe Arg Tyr Ala Ala Gln Gly Gly Asp Trp Gly

180 185 190

Ser Ile Thr Ala Arg Cys Leu Gly Ser Leu His Lys Glu Asn Cys Val

195 200 205

Ala Val His Leu Asn Phe Cys Pro Val Pro Pro Pro Phe Pro Leu Asn

210 215 220

Met Phe Asn Pro Arg Thr Leu Leu Asp Trp Met Pro Arg Phe Val Leu

225 230 235 240

Pro Asp Glu Arg Arg Ala Lys Leu Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile Glu

245 250 255

Arg Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Met Gln Asn Leu Thr Pro Arg Thr Pro

260 265 270

Ala Tyr Gly Leu Asn Asp Ser Pro Ile Gly Leu Leu Ala Trp Ile Gly

275 280 285

Glu Lys Met Ile Pro Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys His Pro Asn Ala

290 295 300

Thr Leu Asn Arg Glu Ala Leu Phe Thr Thr Leu Ser Ile Tyr Trp Phe

305 310 315 320

Thr Gly Ser Ile Gly Ser Ser Phe Leu Pro Tyr Ala Leu Asn Pro His

325 330 335

Phe Gly Thr Phe Leu Val Ser Pro Arg His His Leu Pro Asn Phe Ala

340 345 350

Leu Ser Asn Phe Pro Asp Glu Leu Phe Thr Pro Glu Glu Arg Asp Ala

355 360 365

Arg Arg Thr Gly Asn Leu Arg Trp Tyr Lys Asp Ala Glu Asp Gly Gly

370 375 380

His Phe Ala Ala Leu Glu Lys Pro Glu Val Phe Ala Glu His Val Arg

385 390 395 400

Glu Ala Met Gly Val Leu Leu Ser Asn Gln Ala

405 410

<210> 2

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctgccc attcctttac tgcacctcct gcaccctaca acatcgactt cgcgcctcag 60

gtggacgacc tgcaccgccg tctcgatgcc gcccgctggc ctggacagga cgtggtgccc 120

gacgatgtgg attacggaga gcacggcgca ttcggactcg gcgctggtcc cagcctcgcc 180

ctcatgaagg agctcgcgca ggagtggaga ggccaggacc agaagcagct gcaggaccac 240

ctcaactcct acaagaacta ccgcgtcgag atcgagggtc tcgacatcca cttcctgcac 300

tacccgtcgg ctcgtgccga cgcgttcccg ctcatcctgt gccacggctg gcctggcggc 360

taccacgagt tcctgcacgt cctggagcgc ctcacggagc caaaggatca ggggtcgcgg 420

gccttccatg tcgtcgtgcc ttccatgccg ggttacgcct tctcctcgcc gcccaagacg 480

gccaaatggg gcatggagga cacggctcgt gtgttcgaca agctcatgac ggggctaggt 540

tatttcaggt atgccgccca aggcggtgac tgggggtcta tcacggcgcg ctgcctaggc 600

tcgctgcaca aggagaactg cgtagctgtc cacctcaact tctgcccggt tcccccgccg 660

ttcccgctca acatgttcaa cccgcgcaca ctcttggact ggatgcctcg ctttgtcctg 720

cctgatgagc ggagggccaa gcttgagcgc ggcgtggcct atatcgagcg cggctcttcc 780

tactacgcca tgcagaactt gacgccgcgc acgcctgcgt acggcttgaa tgatagtccg 840

attggtttgc tggcgtggat tggcgagaag atgattccgg gcattgacaa ggctgtcaag 900

cacccgaacg caaccctcaa tcgcgaagct ttgttcacga cactctcgat ctattggttc 960

acgggctcga tcggctcctc cttcctgccg tatgctctca atcctcactt cggcaccttc 1020

ctcgtctcgc cacggcacca tttgccgaac ttcgctctgt ccaactttcc cgacgagctc 1080

tttacgccgg aagagcgcga tgctcgccgg acgggcaatt tgcggtggta caaggatgca 1140

gaggatgggg ggcactttgc tgcgctggag aagcccgagg tcttcgccga gcacgtaagg 1200

gaggcgatgg gggtcttgct gtcgaaccag gcctga 1236

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatggctg cccattcctt tactgc 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattctcag gcctggttcg acagcaa 27

Claims

1.一种海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)来源的环氧化物水解酶，其特征在于，环氧化物水解酶是(a)、(b)或(c)：

(a)含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

2.编码权利要求1所述环氧化物水解酶的基因。

3.表达权利要求1所述环氧化物水解酶的细胞或携带权利要求2所述基因的载体。

4.一种基因工程菌，其特征在于，在细菌或真菌细胞中表达权利要求1所述的环氧化物水解酶。

5.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的环氧化物水解酶或权利要求3所述的细胞。

6.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，权利要求3所述的细胞和细胞保护剂。

7.一种制备R-苯乙二醇的方法，其特征在于，以权利要求1所述的环氧化物水解酶、权利要求3所述的细胞或权利要求5所述的组合物为催化剂催化外消旋环氧苯乙烷。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化剂的用量为0.05～0.1U/mM环氧苯乙烷。

9.权利要求1所述的环氧化物水解酶在手性生物催化方面的应用。

10.权利要求4所述的基因工程菌在催化环氧化物方面的应用。