CN102277338A - 双羰基还原酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的双羰基还原酶（diketoreductase,DKR）的突变体；本发明公开了一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQIDNO.1~SEQIDNO.20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。和野生型双羰基还原酶相比本发明所述双羰基还原酶突变体具有更高的转化效率，更高的立体选择性。

Description

双羰基还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的双羰基还原酶(diketoreductase，DKR)的突变体。

背景技术

生物催化是迄今为止人类所知的最高效和最具有选择性的催化体系。生物体中的酶能以超出人们想象的高速度催化各种生化反应。酶不仅在生物体内，也能在生物体外促进天然和人工合成的化学分子的诸多转换反应，并且显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。与传统的化学合成相比，生物催化反应所要求的的反应条件一般比较温和：常温、常压、中性或者接近中性pH。因此，生物催化是最有发展前景的“绿色”合成手段之一。

对134种工业的生物转化进行分析，发现水解酶(44％)和生物催化的氧化还原(30％)是最常见的工业应用，其中有89％是生物合成手性化合物(参见：Curr Org Chem，2010，14：1447-1460)。在大量的手性化合物中，具有光学活性的手性醇是一类重要的中间化合物，广泛应用于手性药物、农药以及其他手性化学品的合成。现在获得这些手性醇化合物的一个重要的方法，就是通过脱氢酶和还原酶生物催化还原相应的手性前体酮而得到。不过，现在人们所掌握并能应用的酶的数量还很有限，使得很多手性醇的合成反应还没有找到合适的生物催化剂。例如，2-氯-1-苯乙醇是一种重要的手性β-卤代仲醇，其取代基团上的卤素易于脱去，可作为手性药物前体参与构成手性环氧化物以及氨基醇类(参见：Chiral chemistry(2004)24)。在工业生产中，一般利用Baker’s Yeast由α-氯乙酰苯还原生成(R)-2-氯-1-苯乙醇(参见：Tetrahedron(1991)47：2073-2080)。(S)-2-氯-1-苯乙醇则可以由海洋真菌催化α-氯乙酰苯的还原反应而得到。然而，这类海洋真菌的催化条件比较苛刻，只有在类似海水的环境中才能产生活性，且产率和立体选择性都较差(参见：Biotechnol Lett(2009)31：1559-1563)。目前，可用于催化α-氯乙酰苯生成高光学纯度2-氯-1-苯乙醇的酶鲜有报道。

公开号为CN 101429514A的中国发明专利申请公开说明书公开了一种可用于制备3R，5S-双羟基化合物的双羰基还原酶。所述双羰基还原酶能够催化双羰基化合物的还原反应，例如使3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯生成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，同时该生物催化反应具有高度立体选择性(参见：Nature Precedings.http://hdl.handle.net/10101/npre.2008.1697.1或ActaBiochim Biophys Sin.(Shanghai)(2009)41：163-170)。随后，Wu et al.也对双羰基还原酶的底物谱进行了研究，发现该酶在催化单羰基底物还原的反应中也是良好的催化剂(参见：Tetrahedron：Asymmetry(2009)20：2504-2509)。不过，在催化α-氯乙酰苯生成2-氯-1-苯乙醇的反应中，表现出来的立体选择性较差，仅能获得ee为3.91％的R构型产物。

酶的催化功能可通过改变其特定的结构而改善。酶的催化活力只集中表现在酶的活性中心内的少数特异氨基酸残基，这些是酶发挥催化作用与底物直接作用的有效基团。双羰基还原酶是羰基还原酶中的一种。这类酶在结构上主要由两个结构域组成，分别是与NADH或NADPH结合的辅酶结合结构域，以及与底物结合的结构域。与底物结合的结构域由不同理化性质的氨基酸组成，决定了酶催化的底物的特异性。

因此，需要寻找和发现可提高酶立体选择性和催化效率的双羰基还原酶突变体。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种双羰基还原酶突变体，提高其立体选择性和活性。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示任一氨基酸序列具有80％以上的同源性。

一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的核苷酸序列与SEQID NO.21～SEQ ID NO.40所示任一核苷酸序列具有80％以上的同源性。

优选的技术方案中，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的氨基酸的突变情况选自以下任意一种：

(1)双羰基还原酶的氨基酸序列中第122位的丝氨酸突变为丙氨酸、半光氨酸；

(2)双羰基还原酶的氨基酸序列中第143位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；

(3)双羰基还原酶的氨基酸序列中第146位的天冬酰胺突变为丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及谷氨酰胺；

(4)双羰基还原酶的氨基酸序列中第147位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；

(5)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸；

(6)双羰基还原酶的氨基酸序列中第151位的天冬酰胺突变为丙氨酸；

(7)双羰基还原酶的氨基酸序列中第155位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；

(8)双羰基还原酶的氨基酸序列中第194位的天冬酰胺突变为丙氨酸；

(9)双羰基还原酶的氨基酸序列中第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸；

(10)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸和第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明同时要求保护一种重组质粒，所述重组质粒含有上述任一双羰基还原酶突变体的编码序列，进一步的技术方案中，将重组质粒转化入宿主细胞而制备得到一种基因工程菌；优选的技术方案中，所述重组质粒是pET22b(+)；所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

上双羰基还原酶突变体，在催化羰基化合物生成羟基产物的反应中，与野生型的双羰基还原酶相比，具有不同的催化性质，催化活性、催化效率以及立体选择性等发生了改变。

优选的技术方案中，所述的222位双羰基还原酶突变体可以作为催化剂，催化双羰基化合物生成双羟基产物的反应，突变体与野生型的双羰基还原酶相比，具有更高的催化效率。

因此，本发明要求保护一种双羰基还原酶突变体作为催化双羰基化合物制备双羟基产物反应的催化剂的应用，其中，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。

上述技术方案中，所述双羰基化合物的化学通式如下所示：

所述双羟基产物的下化学通式如下所示：

其中，R₁选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；

R₂选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。

优选的技术方案中，所述的222位双羰基还原酶突变体可在催化α-卤代苯乙酮还原成相应手性醇的反应中作为催化剂；该突变体酶与野生型的双羰基还原酶相比，偏好获得构型相反的手性产物；并且，突变体W222Y的立体选择性与野生型相比有大幅度的提高。

因此，本发明要求保护一种双羰基还原酶突变体作为催化α-卤代苯乙酮还原成手性醇的催化剂的应用，其中，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。

上述技术方案中，所述的α-卤代苯乙酮由以下化学通式表达：

所述的野生型双羰基还原酶催化得到的手性醇的R构型产物的结构如下化学通式所示：

所述的双羰基还原酶突变体催化得到的手性醇的S构型产物由以下化学通式表达：

其中，X选自氟、氯、溴、碘。

本发明的主要原理为：通过体外定点突变(site-directed mutagenesis)技术对双羰基还原酶进行修饰，作为模板的双羰基还原酶，其Genebank登录号为：EU273886，由283个氨基酸组成，其编码DNA序列包括852bp；过上述体外定点突变的方法获得的基因片段与pET22b(+)表达载体连接，并在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的双羰基还原酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30kD，其有效作用的pH范围为4.5～7.0，并且在20～50℃均具备良好的催化活性；所述体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是改造/优化基因常用的手段，其原理是设计两对引物，采用PCR的方法在基因中定点特异性的引入其他氨基酸。

由于上述技术方案的使用，本发明的有益效果是：

本发明所述双羰基还原酶的突变体，可以有效的说明该双羰基还原酶中参与催化作用的关键氨基酸；并且本发明所得222位突变体蛋白W222F、W222L、W222M、W2222Y，在辅酶NADH或再生体系存在的情况下，能有效地用于羰基类化合物的催化还原反应，例如：催化3，5-双羰基-6-苄氧基-己酸乙酯生成3R，5S-双羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，与野生型双羰基还原酶相比具有更高的转化效率；催化α-氯乙酰苯生成2-氯-1-苯乙醇，与野生型相比偏好型由R型转变为S型，且与野生型相比突变体W222Y的有更高的立体选择性。

附图说明

图1是实施例三中双羰基还原酶突变体表达并纯化结果的SDS-PAGE分析；

图2是实施例四中双羰基还原酶突变体与野生型活性比较；

图3是实施例六中双羰基还原酶突变体W222Y与野生型立体选择性比较。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：双羰基还原酶突变体基因的克隆

1.PCR扩增含有突变位点的基因

利用重叠PCR(overlap extension PCR，OE-PCR)的原理，通过两步PCR反应来获得含有突变位点的双羰基还原酶基因。

根据已知的双羰基还原酶的DNA序列设计一对上、下游引物，其中划线部分分别为NdeI和BamHI的酶切位点：

SEQ ID No.：41 引物 NO.1：5’-CAACAAGACATATGACCGGCATCACGAAT-3’

SEQ ID No.：42 引物 NO.2：5’-AATGGATCCTCAGTACCGGTAGAAGCCCT-3’

设计含有突变位点的突变引物，如下表所示：

表1双羰基还原酶的突变引物

第一步PCR反应，以pET22b-DKR(参见：Nature Precedings，http://hdl.handle.net/10101/npre.2008.1697.1)为模板，进行PCR扩增。

PCR反应体系(50μl)：上述模板0.5～20ng，5μl的10×PCR Buffer，4μldNTP(各2.5mM)，各30pmol一对引物(引物NO.1和突变引物R；引物NO.2和突变引物F)，1个单位的Taq酶(TaKaRa Biotechnology Co.，大连)，加灭菌蒸馏水至50μl。

PCR反应条件：95℃变性6min，95℃变性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行核苷酸电泳，用胶回收试剂盒(Axygen Scientific，Inc.，美国)从琼脂糖凝胶上回收两个目的PCR片段。

第二步PCR反应，以回收到的两个片段为共同模板，利用引物NO.1和引物NO.2，进行PCR扩增，具体如下：

PCR反应体系(50μl)：上述方法回收得到的两个片段各50～100ng，5μl的10×PCR Buffer，4μl dNTP(各2.5mM)，1个单位的Taq酶，加灭菌蒸馏水至50μl。

PCR反应条件：95℃变性6min，95℃变性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸1min，先进行7个循环，然后加入引物NO.1和引物NO.2，再进行30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行核苷酸电泳，用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶上回收分子量大约为852bp的PCR片段。

2.构建含重组质粒的表达工程菌株

为了便于双羰基还原酶突变体基因的表达，在引物NO.1和引物NO.2中设计了兼容的限制性酶切位点。用NdeI和BamHI分别将通过上述方法所得的目的基因和pET22b(+)质粒同时进行酶切，经纯化后的酶切产物由T4 DNA连接酶(Fermentas International，Inc.，加拿大)进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞中，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。

实施例二：突变体基因测序及序列比对

将通过实施例一方法得到的突变体单克隆送上海英骏生物科技有限公司测序，测序结果输入BioXM2.6软件，比较突变前后基因碱基序列和蛋白质氨基酸序列的差异。

结果显示，20个突变体蛋白的氨基酸序列与野生型相比均包含一个或多个突变位点。具体的突变体蛋白氨基酸序列和核苷酸序列改变情况如表2所示：

表2双羰基还原酶突变体序列变化

。

实施例三：双羰基还原酶突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

1.双羰基还原酶突变体蛋白的表达

将实施例一中所述方法得到的重组工程菌接种至50ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12～16h。再取500μl接种到50ml含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基内，37℃振荡培养至OD_600nm值约为0.8～1.0时，加入IPTG至终浓度为50μM，再继续于15℃培养12～16h进行诱导表达。13,500rpm/min离心收集菌体，用pH7.0的0.1M磷酸缓冲液洗涤一次。然后再用高压细胞破碎仪破碎细胞，以13,500rpm/min离心30min，离心后取上清，即可得到双羰基还原酶突变体蛋白的粗酶液。

2.双羰基还原酶突变体蛋白的纯化

使用DEAE-Sepharose阴离子交换柱纯化双羰基还原酶突变体蛋白，具体方法如下：

1)用50mM的pH8.0磷酸盐缓(Lysis buffer)冲液平衡阴离子交换柱；

2)将上述方法所得的双羰基还原酶突变体蛋白的粗酶液加入阴离子交换柱中，控制流速在1ml/min；

3)用50mM的pH8.0磷酸盐缓冲液(Washing buffer)洗脱不与交换柱结合的杂蛋白；

4)用含10mM NaCl的50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液(Elution Buffer)洗脱目的蛋白；

5)Elution Buffer洗脱完后，用Lysis Buffer平衡DEAE-Sepharose阴离子交换柱，备用。

6)用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测收集到的蛋白样品。取20μl蛋白样品，加入5μl 5×SDS上样缓冲液进行处理，上样量均为15μl，标准分子量的蛋白质购自于美国Sigma公司。SDS-PAGE的胶浓度为12％，先用85V电压进行浓缩电泳，再改为130V进行分离电泳。结果表明构建并表达纯化得到的双羰基还原酶突变体蛋白为可溶性表达，且单亚基的大小均在30kD左右。

参见图1，双羰基还原酶突变体蛋白纯化结果的SDS-PAGE分析。12％SDS-PAGE分析双羰基还原酶突变体蛋白经过量表达并纯化后的结果：a)泳道1～7分别是突变体蛋白S122A、S122C、H143A、H143K、E155Q、H147A以及H147K，泳道8为不同分子量的蛋白质标准品；b)泳道1为不同分子量的蛋白质标准品，泳道2～7分别是突变体蛋白N146A、N146S、N146T、N146Q、N151A、N194A；c)泳道7为不同分子量的蛋白质标准品，泳道1～6以及8分别是突变体蛋白W149A、W149F、W222F、W222L、W222M、W222Y以及W149F/W222F。

实施例四：双羰基还原酶突变体的活性测定

NAD(P)H在340nm处有最大吸收峰，通过测定反应过程中340nm处吸光度变化可以计算脱氢酶和氧化还原酶的活力。双羰基还原酶突变体的活性是通过该方法是利用恒温紫外分光光度计UV-1700(日本岛津)检测NADH在340nm吸光度的降低来测定酶的活性。

双羰基还原酶活性测定：总反应体积为1ml，其中含0.15mol的NADH，0.25mol的底物(3，5-二羰基-6-苄氧基己酸乙酯)，0.1mmol磷酸钾缓冲液(pH7.0)，于40℃预热2min后加入酶液开始检测2min内340nm处吸光度变化。一个酶活单位定义为在40℃条件下每分钟内消耗NADH的微摩尔数，而酶的比活力定义为每毫克总蛋白具有的活力单位数。

参见表3，对实施例三所获得的双羰基还原酶突变体纯蛋白进行活性测定。结果表明，突变122位Ser、143位His以及155位Glu会导致酶的催化活性完全丧失，说明这几个位点的氨基酸可能直接参与双羰基还原酶的催化反应。对146位Asn、147位His、149位Trp以及151位Asn进行突变后获得的突变体酶，其活性与野生型(比活力：8.2μmol/min/mg)相比均有大幅度的下降，说明这几个位点的氨基酸也会对双羰基还原酶的催化作用产生重要影响。

表3双羰基还原酶突变体的比活力

除了获得双羰基还原酶活性中心关键氨基酸的信息，本发明还获得了活性提高的突变体。将双羰基还原酶222位的色氨酸突变后，所获得的突变体酶的活力与野生型相比均有所提高。参见附图2，其中，W222F还原3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯的催化活性增加至野生型的206.8％，W222L的催化活性增加至野生型的174.4％，W222M的催化活性增加至野生型的135.2％，W222Y的催化活性增加至野生型的235.3％。

实施例五：双羰基还原酶突变体的催化常数测定

在酶浓度一定时，底物浓度远远大于酶浓度[Et]的情况下，酶对特定底物的最大反应速度(Vmax)也是一个常数。此时Vmax＝K₃[Et]。K₃表示酶被底物完全饱和时，每单位时间内每个酶分子所能转化底物的分子数，称为转换数(turnover number TN)，也称为催化常数Kcat。Kcat值愈大表示酶的催化效率愈高。

采用实施例四中所示测定酶活性的方法，针对实施例四中活力增强的突变体蛋白，测其在不同底物浓度条件下的比活力，根据双倒数的方法求出各突变体蛋白的Kcat值，结果显示与野生型相比，催化常数均有不同程度的提高，具体如表4所示。

表4双羰基还原酶催化常数比较

	Kcat(s-1)
			DKR(野生型)	16.7±1.03	1
W222F	29.1±1.97	1.74
			W222L	27.62±1.72	1.65
W222M	26.45±1.42	1.58
			W222Y	35.74±1.38	2.14

。

实施例六：催化α-卤代苯乙酮的还原反应及反应产物鉴定

该方法用的反应体系如下：

α-卤代苯乙酮	2mg/ml
		NAD+	0.5mM
甲酸脱氢酶	4U/ml
		甲酸钠	90mM
乙醇	5％(V/V)
		双羰基还原酶突变体	5U/ml

用0.1M pH6.0磷酸盐缓冲液补到最终体积为0.5ml。反应在25℃，220rpm条件下进行12h，用同等体积的乙醇终止反应。用OD-RH手性分析柱(Daicelchemical industries，美国)进行手性分析，洗脱溶剂为：A.含0.1％TFA的水；B.含0.1％TFA的乙腈，洗脱的梯度为B 20-30％，梯度时间为25分钟并在30％B保持5分钟。结果表明与野生型双羰基还原酶相比，222位色氨酸突变后的双羰基还原酶对产物的立体选择性改变，其中突变体W222Y的立体选择性提高了11倍，参见附图3。

Claims (9)

1.一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示任一氨基酸序列具有80％以上的同源性。

2.一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体的核苷酸序列与SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.40所示任一核苷酸序列具有80％以上的同源性。

3.一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的氨基酸的突变情况选自以下任意一种：

(1)双羰基还原酶的氨基酸序列中第122位的丝氨酸突变为丙氨酸、半光氨酸；

(2)双羰基还原酶的氨基酸序列中第143位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；

(3)双羰基还原酶的氨基酸序列中第146位的天冬酰胺突变为丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及谷氨酰胺；

(4)双羰基还原酶的氨基酸序列中第147位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；

(5)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸；

(6)双羰基还原酶的氨基酸序列中第151位的天冬酰胺突变为丙氨酸；

(7)双羰基还原酶的氨基酸序列中第155位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；

(8)双羰基还原酶的氨基酸序列中第194位的天冬酰胺突变为丙氨酸；

(9)双羰基还原酶的氨基酸序列中第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸；

(10)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸和第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求1～3中任一双羰基还原酶突变体的编码序列。

5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求4所述重组质粒。

6.一种双羰基还原酶突变体作为催化双羰基化合物制备双羟基产物反应的催化剂的应用，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。

7.根据权利要求6所述双羰基还原酶突变体作为催化双羰基化合物制备双羟基产物反应的催化剂的应用，其特征在于，所述双羰基化合物的化学通式如下所示：

所述双羟基产物的化学通式如下所示：

其中，R₁选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R₂选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。

8.一种双羰基还原酶突变体作为催化α-卤代苯乙酮还原成手性醇的催化剂的应用，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。

9.根据权利要求8所述双羰基还原酶突变体作为催化α-卤代苯乙酮还原成手性醇的催化剂的应用，其特征在于，所述α-卤代苯乙酮的化学通式如下所示：

所述手性醇的R构型产物的化学通式如下所示：

所述手性醇的S构型产物的化学通式如下所示：

其中，X选自氟、氯、溴、碘。

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