CN110964708A

CN110964708A - 一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用

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Publication number: CN110964708A
Application number: CN201911425979.6A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 钱园园; 刘佳; 宋伟; 陈修来; 罗秋玲; 高聪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-07

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌L‑天冬氨酸α‑脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的改造方法通过组合突变设计出最佳突变体，对BsPanD的蛋白质进行改造，克服了之前野生型的酶因为严重的机制性失活而导致的催化稳定性低的局限，最终得到最佳突变体Q5(BsPanD^{I46V/I88M/K104S/I126*})，其催化半衰期和β‑丙氨酸产量分别为野生型的3.47和2.58倍，以L‑天冬氨酸为底物，转化后15L规模发酵罐产量为123.8g/L，转化率>99％，单位菌体生产β‑丙氨酸的能力为6.2g/g，将该突变体Q5进一步与L‑天冬氨酸酶(AspA)偶联，以富马酸为底物，β‑丙氨酸产量达到118.6g/L，因此大大降低了之前的高菌体量以及昂贵的底物成本，为β‑丙氨酸的工业化生产奠定了基础。

Description

一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

β-丙氨酸，又名3-氨基丙酸，是唯一一种天然存在的β型氨基酸。虽然β-丙氨酸是一种非蛋白氨基酸，但却是一种潜在的功能性氨基酸。它是合成肌肽、泛酸及辅酶A的重要前体物质，被广泛应用于医药、食品和化工等领域，是非常有潜力的一种三碳化合物。

目前，β-丙氨酸的主要生产方法为化学合成法，主要为丙烯腈和丙烯酸法，但是这种方法需要高温高压的环境，能耗较大但是产品的得率低，并且会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备β-丙氨酸具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，促进我国低碳和循环经济的发展，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备β-丙氨酸。

微生物法生产β-丙氨酸涉及到一个关键的酶L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD，Laspartate-α-decarboxylase，EC 4.1.1.11)，它具有高度的底物特异性，可以催化L-天冬氨酸，使其在α位脱羧，形成β-丙氨酸。其中，微生物法制备β-丙氨酸又分为发酵法和酶转化法。(1)利用发酵法生产精细化学品具有原料来源广泛(如葡萄糖、甘油等)且廉价的显著优点，其相对较低的底物成本为大规模工业化带来巨大的商业化效益。随着代谢过程和合成生物学的发展，利用发酵法生产β-丙氨酸将会迎来更多的机遇，但是实现大规模的工业化生产，仍面临着巨大的挑战。主要体现在以下几点：①通过发酵法生产精细化学品，细胞生长与酶的表达存在竞争，如何平衡两者关系成为关键问题；②发酵法发酵周期长，必然导致生产强度低；③一方面，β-丙氨酸需要大量积累，另一方面，高浓度的β-丙氨酸会抑制细胞的生长，酶的表达随之受到抑制；④细胞存在大量代谢竞争途径，即使敲除一些副产物基因，仍然存在副产物积累过多的问题，影响产品得率，并增加下一步分离纯化工艺的困难。(2)目前，由于酶转化法具备高产量、高转化率以及较短的转化周期等优点而更具备工业应用价值。但是，酶转化法大规模制备β-丙氨酸受到以下限制：(1)底物L-天冬氨酸成本高，对工业不经济；(2)高浓度的L-天冬氨酸会严重抑制PanD的催化效率；(3)伴随着催化反应的进行，PanD存在严重的机制性失活，导致催化稳定性差，这极大程度限制了β-丙氨酸产业化的发展，是目前研究的重点问题。因此，从工业角度来看，迫切需要解决PanD的机制性失活问题，使得通过酶转化法制备β-丙氨酸实现规模化应用。

近几十年来，蛋白质工程已经成为在分子水平改善酶的性质的有效策略，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性的最有效的方法。因此，通过蛋白质工程设计BsPanD，可能解决其催化稳定性差的问题。蛋白质工程改造主要可以分四类：传统的定向进化(即非理性设计)、半理性设计、理性设计(基于结构与计算机技术)和多种策略的组合应用。目前，关于利用蛋白质工程改造PanD已经取得了一定的研究进展，然而，催化稳定性的改善效果仍然有限，远不能满足实际的工业化需求。

此外，多酶级联反应也是酶生物转化中的重要手段，具有许多优点。例如，它可以避开反应中间体的积累，利用廉价易得的原料作为反应的起始底物，并且多酶反应间的协同性可以通过调控酶之间的表达比例得以调节，从而解决了底物L-天冬氨酸昂贵以及高浓度底物对PanD抑制的问题。常用的级联路径是将L-天冬氨酸酶(AspA)与PanD偶联，AspA可以利用富马酸为底物，催化富马酸加氨生成L-天冬氨酸，再进一步经过PanD的脱羧作用最终生成β-丙氨酸。富马酸是一种廉价的二元羧酸，以其为底物生产高值化学品具有极大的研究价值。

发明内容

本发明提供了一种可以高效制备β-丙氨酸的BsPanD突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化L-天冬氨酸制备β-丙氨酸，以及进一步将得到的突变体与L-天冬氨酸酶(EcAspA)偶联，以廉价底物富马酸制备β-丙氨酸。本发明所构建的菌株在β-丙氨酸制备中具有高生产强度，高催化稳定性，减少了转化中的投菌量，极大节约了工业化的生产成本。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD突变体，所述枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于BsPanD亲本，将其第46位氨基酸发生突变，获得突变体I46V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于BsPanD亲本，将其第104位氨基酸发生突变，获得突变体K104S。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于BsPanD亲本，将其第46位和第104位氨基酸同时突变，获得突变体I46V/K104S。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于BsPanD亲本，将其第46位、第104位和第126位氨基酸同时突变，获得突变体I46V/K104S/I126*。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于BsPanD亲本，将其第46位、第88位、第104位和第126位氨基酸同时突变，获得突变体I46V/I88M/K104S/I126*。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体I46V、K104S、I46V/K104S、I46V/K104S/I126*、I46V/I88M/K104S/I126*的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体I46V、K104S、I46V/K104S、I46V/K104S/I126*、I46V/I88M/K104S/I126*的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12所示。

本发明提供了一种获得所述BsPanD突变体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体BsPanD。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌和真菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明提供了一种含有编码BsPanD突变体以及大肠杆菌来源的AspA的重组载体，是将如SEQ ID NO.4所示BsPanD突变体基因以及如SEQ ID NO.33所示EcAspA基因整合至表达载体pET28a(+)从而得到共表达载体pET28a-3BsPA-1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体中插入3个拷贝的BsPanD突变体基因。

本发明提供了一种含有pET28a-3BsPA-1载体的菌株，所述菌株构建方法为：将构建成的pET28a-3BsPA-1载体导入BL21(DE3)感受态细胞，最终构建成BL21-3BsPA-1菌株。

本发明提供了一种利用BL21-BsPanD突变菌株制备β-丙氨酸的方法，所述方法中以L-天冬氨酸为反应底物，将BsPanD突变体细胞加入反应液，在pH5.5～8.0、30～40℃、通气量为1～6vvm条件下反应10～15h。

在本发明的一种实施方式中，所述BsPanD突变体细胞的添加量为终浓度10～60g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述BsPanD突变体细胞的添加量为终浓度10～30g/L。

在本发明的一种实施方式中，在pH6.0～7.0、35～40℃、通气量为1～3vvm条件下反应11～14h。

本发明提供了一种利用BL21-3BsPA-1菌株制备β-丙氨酸的方法，所述方法中以富马酸为反应底物，将pET28a-3BsPA-1细胞加入反应液，在pH5.5～8.0、30～40℃、通气量为1～62vvm条件下反应10～15h。

在本发明的一种实施方式中，所述BsPanD突变体细胞的添加量为终浓度10～30g/L，在pH6.0～7.0、35～40℃、通气量为1～3vvm条件下反应11～14h。

本发明提供了一种所述BsPanD突变体在制备β-丙氨酸中的应用。

本发明提供了一种所述BL21-BsPanD突变菌株在制备β-丙氨酸中的应用。

本发明提供了一种所述BL21-3BsPA-1菌株在制备β-丙氨酸中的应用。

本发明的有益效果：本发明构建了一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的突变体，用于催化生产β-丙氨酸。本发明突变体的催化半衰期(7.3h)和TTN(30200)较对照分别提高了2.47倍和1.58倍，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本，并且反应中仅以水为催化介质，具有反应条件温和、操作简便、收率高等优点。本发明得到的突变体在15L发酵罐中以L-天冬氨酸为底物时β-丙氨酸的产量可达123.8g/L，转化率>99％，在15L发酵罐中以富马酸为底物时β-丙氨酸的产量可达118.6g/L的，转化率>99％，加快了酶转化法生产β-丙氨酸的工业化进程。

附图说明

图1为基于分子动力学模拟计算出的野生型Q0和突变体Q5(BsPanD^I46V ^{/I88M/K104S/I126*})的RMSD值。

图2为Q0和Q5的分子动力学模拟，(A)：基于分子动力学模拟计算出的Q0和Q5的RMSF值；(B)：基于分子动力学模拟计算出的Q0和Q5的氢键个数。

图3为全细胞催化浓度和β-丙氨酸生产量的关系。

图4为L-天冬氨酸和终产物β-丙氨酸的HPLC图，(A)：L-天冬氨酸和β-丙氨酸的标样；(B)：反应体系的上清液。

图5为双酶重组载体的连接方式。

具体实施方式

基因来源：本专利所涉及到的生物酶BsPanD基因来源于Bacillus subtilis 168，pET28a(+)质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，限制性内切酶、T4 DNA连接酶、primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。O-diacetylbenzene和标样购自SIGMA。BsPanD突变体均为分子改造所得，其余试剂均为市场购买所得。

配制LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。

配置发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物(安琪酵母粉802)24g/L，甘油4mL/L，KH₂PO₄ 2.31g/L和K₂HPO₄ 12.31g/L。

HPLC法测定β-丙氨酸：具体步骤参见文献Molecular Catalysis B-Enzymatic121:1-8Molecular Catalysis B-Enzymatic 121:1-8(Enzymatic production ofagmatine by recombinant arginine decarboxylase)。

配制pH6.0的磷酸盐钠冲液：0.2mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠混合缓冲液，具体配方见《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，诸葛健主编)。

比酶活测定方法：采用HPLC法测PanD的酶活。1个单位的PanD的酶活被定义为生成1μmolβ-丙氨酸产物所需的酶量(U)。通过测定β-丙氨酸的含量即可计算酶活力。

比酶活定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(U/mg蛋白)。

β-丙氨酸含量的测定：反应产物采用高效液相色谱法(HPLC)测定。液相检测条件参见上述HPLC法测定β-丙氨酸。

实施例1：单突突变体的构建和筛选

(1)单突突变体构建：设计BsPanD^I46V和BsPanD^K104S突变位点的引物，如表1所示，通过全质粒PCR进行突变体构建。

表1单突变体突变引物序列

构建反应PCR扩增体系：PrimSTAR酶0.5μL、5×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL每个突变位点的两条引物各1μL、，模板(BsPanD^WT)4μL、水32.5μL；反应条件为：①94℃3min；②98℃10s；③55℃30s；④72℃3min；⑤将②～④三个步骤循环29次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。

将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，化学转化法具体步骤：

(1)将10μl同源重组产物导入100μl BL21感受态细胞；

(2)冰浴15-30min；

(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

(4)加入800μl无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

(5)5000rpm离心2min收菌；

(6)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。

(7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。

实施例2双突、三突及四突突变体的构建和筛选

(1)双突突变体构建：在突变体BsPanD^I46V的基础上，利用突变引物K104S-S和K104S-A(表2)，通过全质粒PCR进行双突突变体构建，具体实施方式参见实施例2中步骤(1)，所用引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，制备得到双突突变体BsPanD^I46V/K104S。

(2)三突突变体的构建：在突变体BsPanD^I46V/K104S的基础上，C末端删除策略的突变体利用表2突变引物，通过全质粒PCR进行三突变体的构建，具体实施方式参见实施例1，制备得到七种三突突变体BsPanD^{I46V/K104S/L127*}、BsPanD^{I46V/K104S/I126*}、BsPanD^{I46V/K104S/T125*}、BsPanD^{I46V/K104S/R124*}、BsPanD^{I46V/K104S/A123*}、BsPanD^{I46V/K104S/P122*}和BsPanD^{I46V/K104S/E121*}。

表2三突变体突变引物序列

(4)多突变体的筛选：将测序正确的的突变体菌株接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养10h左右，分别以5％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在200rpm、37℃培养至OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为5g/L的乳糖诱导，诱导条件为200rpm、25℃诱导14h。将诱导表达后的菌液。

转化条件为：转化温度37℃，反应pH为6.0，转化时间为12h，转速为550rpm。

将转化结束后的转化液用HPLC方法进行测定β-丙氨酸的产量，结果如表3所示，最终删除了两个氨基酸残基的I126*效果最好。

表3不同位置C末端删除突变体摇瓶筛选结果

(5)四突突变体(在突变体BsPanD^{I46V/K104S/I126*}基础上对I88M进行突变)：以BsPanD^{I46V/K104S/I126*}为模板，利用突变引物I88M-S和I88M-A进行全质粒PCR，PCR产物进行消化，PCR体系与消化体系和实施例1相同。

表4四突变体突变引物序列

实施例3：突变体酶的表达纯化方法

将实施例2和3制备得到的突变体重组菌株阳性转化子接种至LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～1.0时加入终浓度5g/L乳糖诱导酶的表达，诱导温度为25℃，诱导时间12h，得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、20mM咪唑、1％甘油，用HCl调pH至7.4)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入超纯水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。

实施例4：亲本酶和突变体的动力学参数测定

为了对突变体进行评价，本发明测定了突变亲本Q0及突变体Q1至Q5在37℃下的动力学参数。

k_cat/K_m通过在37℃条件下测定不同浓度的L-天冬氨酸所产生的β-丙氨酸的初始利率计算。通过转化过程中的残留酶活实验测定亲本酶和突变体的催化半衰期(在全细胞体系中进行)。分别将BsPanD亲本酶菌株和突变体菌株各以20g/L终浓度的湿细胞加入反应液中。以L-天冬氨酸为底物，在整个转化过程中每隔1h测定它们的残留酶活(反应0h时的初始酶活设为100％)，共测定12h。

如表5所示，所有的突变体与Q0相比，催化半衰期均变长，其中Q5为7.3h，比Q0的2.1h变长了247％。与之一致的是各突变体的总转化数(TTN)与Q0相比均得到提高。Q5的TTN是30200为Q0的12000的2.52倍。

表5 BsPanD亲本酶及其突变体的动力学参数

实施例5：BsPanD亲本酶和突变体分子动力学模拟

BsPanD亲本酶和突变体的分子动力学模拟是通过NAMD进行，运用Charmm27力场，模拟时间为20ns，模拟结果用VMD分析。

结果如图1所示，与野生型Q0相比，Q5的RMSD值呈中等程度的降低，表明BsPanD突变这四个关键残基后，蛋白的整体稳定性提高。此外，Q5的A、B和C区域的RMSF值显著降低，表明与Q0相比这些区域报的残基灵活性显著降低。同时还分别计算了Q0和Q5模拟过程中的平均氢键数，结果表明Q5的氢键数增加，从25.8提高到29.2(图2)。

实施例6：5L发酵罐水平优化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸

将平板上测序正确的突变体Q5菌株接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃培养10-12h，以体积比5％的接种量接种至TB培养基中，200rpm、37℃培养至OD₆₀₀为3时加入5g/L终浓度乳糖诱导，诱导温度为25℃，诱导时间14h后以6,000×g离心8min收集细胞，37℃放置16h后用于转化。

(1)不同全细胞催化剂浓度对β-丙氨酸浓度的影响

在发酵罐中配制转化反应体系：20g/L的L-天冬氨酸，用NaOH调至pH为6.5，装液量为4.8L，向反应体系中分别添加50g、100g、150g、200g、250g突变体湿菌体细胞(即为全细胞催化剂)，使得全细胞催化剂的浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L。

在37℃、550rpm、通气量为1vvm条件下进行转化反应，在反应过程添加L-天冬氨酸固体粉末使转化液中以维持pH在6.0左右，粉末补加时间从转化开始后持续11h后，再进行1h转化，此期间停止补加粉末，用稀硫酸调节pH为6.0，转化反应后总体积为1.5L。

转化反应结束后取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。结果如图3所示，当催化剂的浓度从10g/L提高至50g/L，β-丙氨酸的浓度从53.6g/L提高至209.5g/L。但是产物/催化剂的比值从5.4g/g降低至4.2g/g。考虑到工业对高产量以及低催化剂(菌体)用量，20g/L的全细胞催化剂浓度同时具备较高β-丙氨酸浓度及高产物/催化剂比例(即单位菌体生产β-丙氨酸能力)被用于转化实验。

(2)不同转化反应pH对β-丙氨酸浓度的影响

具体步骤同(1)，将全细胞化剂浓度控制为20g/L，且将转化反应过程中的pH分别控制为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。结果如表6所示，在微酸性的条件更适合β-丙氨酸的合成，因此选择转化pH控制在6.5左右，此时β-丙氨酸浓度为108.7g/L。

表6转化pH优化结果

(3)不同转化时长对β-丙氨酸浓度的影响

具体步骤同(1)，将转化pH控制为6.5，全细胞化剂浓度控制为20g/L，在不同转化时间取样测定β-丙氨酸产量(10-14h)(结果见表7)，随着转化时间的延长，产量不断增加，但13h之后，增加不明显，考虑到工业运转成本，控制转化时间为13h，最终β-丙氨酸产量到达124.3g/L，转化率>99％。

表7发酵时间优化结果

实施例7：15L发酵罐水平从L-天冬氨酸制备β-丙氨酸

具体实施方式参照实施例6中的最优条件，只是将反应按比例扩大至15L发酵罐中，转化后体积为5L，转化体系中累计投入931g L-天冬氨酸。HPLC色谱图结果如图4所示，最终β-丙氨酸产量到达123.8g/L，转化率>99％。

实施例8：构建BsPanD和EcAspA共表达菌株

将如SEQ ID NO.12所示BsPanD突变体基因以及如SEQ ID NO.33所示EcAspA基因按顺序串联于pET28a(+)载体(图5)从而得到共表达载体。(具体步骤参见赵慧.代谢工程改造大肠杆菌生产L-苏氨酸[D].江南大学,2018)。采用片段和载体双酶切连接的方式，将SEQID NO.12所示BsPanD突变体基因连接三次至pET28a(+)载体，最后将如SEQ ID NO.33所示EcAspA基因连接至pET28a(+)载体。具体引物如表8所示，下划线处为酶切位点，斜体为RBS序列。

表8引物序列

将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体转化步骤参见实施例1用化学转化法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，最终构建成BL21-3BsPA-1菌株。

实施例9：15L发酵罐水平从富马酸制备β-丙氨酸

将BL21-3BsPA-1湿菌体按照实施例6中的方法收集，将100g细胞重悬至3.8L转化液中(包含20g/L的富马酸，用氨水调至pH为6.5)。50％的氨水溶液以150mL/h恒速流加入转化液中(0～4h)，5～12h后氨水流加速率为70mL/h。与实施例7类似，富马酸固体粉末被加入到转化液中以维持pH在6.5左右之间。最后1h停止添加粉末，并用稀硫酸自动调节pH，其余转化条件与实施例7类似。转化结束后，最终的转化体积为5L，转化体系中累计投入782g富马酸。产物检测的步骤与实施例7类似。结果显示：β-丙氨酸产量为118.6g/L，转化率>99％。

对比例1

具体实施方式参见实施例6，不同之处在于，将突变体Q5菌株替换为野生型Q0菌株去进行发酵与转化实验。转化结束后，取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC色谱图结果显示：β-丙氨酸产量为48.6g/L，转化率为95％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用

<160> 41

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu

115 120 125

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtacaatttt g 381

<210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Val Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu

115 120 125

<210> 4

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaagtggt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtacaatttt g 381

<210> 5

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Ser Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu

115 120 125

<210> 6

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccgt ctgtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtacaatttt g 381

<210> 7

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Val Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Ser Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu

115 120 125

<210> 8

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaagtggt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccgt ctgtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtacaatttt g 381

<210> 9

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Val Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Ser Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr

115 120 125

<210> 10

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaagtggt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccgt ctgtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtaca 375

<210> 11

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Val Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Met Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Ser Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr

115 120 125

<210> 12

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaagtggt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatgtcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccgt ctgtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtaca 375

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

tgaaaaagta caannkgtga ataataata 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

tattattatt cacmnnttgt actttttca 29

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

aagccatgag ccgnnkgtgg ctgttctga 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 16

tcagaacagc cacmnncggc tcatggctt 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

accagcccgt acatagttgt agaagcttg 29

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caagcttcta caactatgta cgggctggt 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agcccgtaca atttagtaga agcttgcgg 29

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccgcaagctt ctactaaatt gtacgggct 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgaaccagcc cgttagattt tgtagaagc 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcttctacaa aatctaacgg gctggttcg 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaacgaacca gcctagacaa ttttgtaga 29

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tctacaaaat tgtctaggct ggttcgttc 29

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggggaacgaa ccatagcgta caattttgt 29

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acaaaattgt acgctatggt tcgttcccc 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gctggggaac gaataggccc gtacaattt 29

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaattgtacg ggcctattcg ttccccagc 29

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aatgctgggg aactagccag cccgtacaa 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttgtacgggc tggctagttc cccagcatt 29

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

taaggtcatt attatgtcct acaaaatga 29

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tcattttgta ggacataata atgacctta 29

<210> 33

<211> 1437

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 33

atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60

gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120

atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180

gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240

gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300

ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360

ctgatgggtc accagaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420

tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttctctg 480

attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540

ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600

ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa tatccaacgt 660

accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggcgcaacag caatcggtac tggtctgaac 720

acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagtcac tggcttccca 780

tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgtaatggtt 840

cacggcgcgc tgaaacgcct agctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900

ctctcttctg gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960

tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020

ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080

ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgtttg aatccgttca cattctgacc 1140

aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200

tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260

caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320

gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380

aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

catgccatgg caatgtatcg aacaatgatg agcggca 37

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgcggatccc tatgtacggg ctggttcgtt cc 32

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cgcggatcct taaggaggaa ttcttatgta tcgaacaatg atgagcggca 50

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

acgcgtcgac ctatgtacgg gctggttcgt tcc 33

<210> 38

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

acgcgtcgac ttaaggagga attcttatgt atcgaacaat gatgagcggc a 51

<210> 39

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cccaagcttc tatgtacggg ctggttcgtt cc 32

<210> 40

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cccaagcttg tcacacagga aagtaccatg tcacacagga aagtaccat 49

<210> 41

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ccgctcgagt tactgttcgc tttcatcagt atag 34

Claims

1.一种L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD突变体，所述突变体将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD的第46位、第104、第126位、第88位的氨基酸中的一个或多个进行突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(e)：

(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD的第46位突变为缬氨酸，突变体命名为I46V；

(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD的第104位突变为丝氨酸，突变体命名为K104S；

(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD的第46位和104位同时进行突变，分别突变为缬氨酸和丝氨酸，突变体命名为I46V/K104S；

(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD的第46位、第104位、第126位同时进行突变，突变体命名为I46V/K104S/I126*；

(e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶BsPanD的第46位、第88位、第104位、第126位同时进行突变，突变体命名为I46V/I88M/K104S/I126*。

3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的载体或重组微生物细胞。

5.一种重组载体，其特征在于，携带权利要求4所述突变体基因BsPanD及EcAspA基因；所述EcAspA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。

6.一种含有权利要求5所述重组载体的重组菌。

7.一种β-丙氨酸的制备方法，其特征在于，所述方法是以L-天冬氨酸为底物，以权利要求1～2任一所述突变体为催化剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，突变体的添加量为为终浓度10～60g/L，在pH5.5～8.0、30～40℃、通气量为1～6vvm条件下反应10～15h。

9.一种β-丙氨酸的制备方法，其特征在于，所述方法是以富马酸为底物，以权利要求6所述重组菌所产的酶为催化剂。

10.权利要求1～2任一所述突变体或权利要求6所述重组菌在制备β-丙氨酸中的应用。