CN114934038B

CN114934038B - 天冬氨酸酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114934038B
Application number: CN202210482696.0A
Authority: CN
Inventors: 徐斌; 汪本助; 方国康; 卓雪瑞; 周伯楠; 周娜娜; 赵亚飞; 常凯丽
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114934038A

Abstract

本发明公开了一种天冬氨酸酶突变体及其应用，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明提供的天冬氨酸酶突变体能够催化制备β‑丙氨酸，本发明构建的天冬氨酸酶突变体的反应温度为15℃～30℃，避免了丙烯酸聚合反应。本发明提供的天冬氨酸酶突变体酶活力为3.28U/mg，与野生型酶活力0.023U/mg相比，酶活提高了143倍。

Description

天冬氨酸酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及天冬氨酸酶突变体及其在生产β-丙氨酸中的应用。

背景技术

β-丙氨酸(β-alanine)，又名3-氨基丙酸，纯品为白色棱形结晶，主要用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料、食品等领域应用广泛。

目前，国内外生产β-丙氨酸的工业化方法主要采用化学合成法，包括丙烯酸氨化法、丙烯腈氨化水解法及β-氨基丙腈水解法，国内的工业化生产主要采用丙烯腈氨化水解法。这些方法大多需要强酸强碱、高温、高压的条件，而且产物纯化步骤繁琐，同时存在腈类物质易造成环境污染。

随着β-丙氨酸需求量的不断增加，寻求绿色的生产方法具有十分明显的经济和社会效益。酶转化法制备β-丙氨酸具有工艺简单、纯化方便、绿色无污染的特点，该方法现已逐步成为人们研究的热点。微生物L-天冬氨酸α-脱羧酶使L-天冬氨酸脱去一个CO₂分子，转变成β-丙氨酸。在此酶转化过程中，产物分子量/底物分子量＝0.67，即1kg原料天冬氨酸生产0.67kg的β-丙氨酸。

天冬氨酸酶(L-Aspartate ammonia-lyase，E.C.4.3.1.1)是一种重要的工业用酶，主要用于酶法合成L-天冬氨酸。生物合成的原理在富马酸α-位进行氨基加成生成L-天冬氨酸。

专利(CN109385415B，CN110923272B)所涉及的酶转化法制备β-丙氨酸，使用的酶为来源于芽孢杆菌天冬氨酸酶突变体。原料为丙烯酸，此类酶定向加成氨基制备β-丙氨酸，产物分子量/底物分子量＝1.24，即1kg原料丙烯酸生产1.24kg的β-丙氨酸。上述专利方法中酶所介导的氨基加成反应的最适温度在35℃～55℃之间。

因此，需要开发新的方法和菌株，以期提高生产β-丙氨酸的量。

发明内容

本发明的目的是提供天冬氨酸酶突变体，并利用此突变体在20-25℃下催化丙烯酸制备β-丙氨酸。

第一方面，本发明提供天冬氨酸酶突变体，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或多个：Q130E(第130位谷氨酰胺变为谷氨酸)、N217Q(第217位天冬酰胺变为谷氨酰胺)、R220K(第220位精氨酸变为赖氨酸)、I268L(第268位异亮氨酸变为亮氨酸)；其中，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为一个具体的实施方案，本发明所述天冬氨酸酶突变体具有：(1)：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供编码所述天冬氨酸酶突变体的核酸分子，所述核酸分子：(1)由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

作为一个具体的实施方案，本发明所述核酸分子与SEQ ID NO.5的核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％以上同源性的序列。

第三方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供一种能够生产β-丙氨酸的重组菌，所述重组菌含有所述的重组表达载体。

作为一个具体的实施方案，所述重组菌为重组大肠杆菌(Escherichia Coli)；优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)菌株。

第五方面，本发明提供所述的天冬氨酸酶突变体、所述的核酸分子、所述的重组表达载体、所述的重组菌在生产β-丙氨酸中的应用。

第六方面，本发明提供所述的天冬氨酸酶突变体、所述的核酸分子、所述的重组表达载体、所述的重组菌用于催化生产β-丙氨酸的方法。

第七方面，本发明提供一种合成β-丙氨酸的方法，包括如下步骤：将底物与所述天冬氨酸酶突变体接触，或者与表达所述天冬氨酸酶突变体的宿主细胞接触，进行催化反应，生成β-丙氨酸。

其中，所述底物为丙烯酸。

其中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)。

其中，所述反应条件为：底物丙烯酸浓度0.5M～5.0M，所述天冬氨酸酶突变体的浓度为3g/L～20g/L，反应pH值为pH7.0～pH8.0，反应温度为15℃～30℃，反应时间为0.1h～5h。

在一些实施方案中，所述底物丙烯酸的浓度可以为，例如，0.5M、0.8M、1.0M、1.3M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M或5.0M。优选的浓度范围可以为0.5M～3.0M，更优选的浓度范围可以为0.8M～2.0M。

在一些实施方案中，所述天冬氨酸酶突变体的浓度可以为，例如，3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L或20g/L。

在一些实施方案中，反应pH值可以为，例如，7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。

在一些实施方案中，反应温度可以为，例如，15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。优选的温度范围为15℃～25℃，更优选的温度范围为17℃～25℃，甚至更优选的温度范围为20℃～25℃。

丙烯酸由于含有双键，容易发生二聚反应，该反应是自发反应，并随着温度的升高而加快。在温度低于13℃的条件下，丙烯酸发生凝结反应；丙烯酸在15℃～25℃较为稳定，不易发生聚合反应。因此，在由酶介导的丙烯酸氨基加成反应生产β-丙氨酸过程中，酶促反应在15℃～25℃之间为最适温度，丙烯酸的转化率可达83％以上。令人惊奇的是，当温度在20℃～25℃范围内时，获得了显著更高的97％以上的转化率。

在一些实施方案中，反应时间可以为，例如，0.1h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h或5.0h。

本发明还提供所述天冬氨酸酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

(1)采用PCR方法对大肠杆菌K12中的天冬氨酸酶编码基因asp进行扩增，获得asp基因(氨基酸序列见SEQ ID NO.2)；

(2)分别将扩增获得的asp基因及pET-42a质粒双酶切，连接酶切后asp基因及pET-42a质粒，将pET42a-asp转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得asp表达载体；

(3)采用易错PCR方法对大肠杆菌K12中的天冬氨酸酶编码基因asp进行扩增，获得asp基因突变库，即aspM；

(4)分别将aspM及pET-42a质粒双酶切，连接酶切后aspM及pET-42a质粒，将pET42a-asp转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得aspM表达载体库；

(5)随机挑取突变菌株进行表达，表达后超声破碎菌体并纯化ASPM酶蛋白。进行酶活检测，最终获得酶活最高菌株ASPM1，提取ASPM1菌株质粒测序以确定其序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了制备天冬氨酸酶突变体的方法以及利用此突变体在20-25℃下催化丙烯酸制备β-丙氨酸的方法。

本发明涉及将大肠杆菌K12的天冬氨酸酶进行分子改构，使其一种突变体能对丙烯酸进行氨基加成反应，其特性是氨基加成位于β-位，即利用丙烯酸为原料，酶法合成β-丙氨酸，本发明构建的天冬氨酸酶突变体的最适反应温度范围为15℃～25℃，在该较低温度范围内可以避免丙烯酸聚合反应。另外，本发明还意外地发现在20℃～25℃的范围内，显著提高了丙烯酸的转化率。

本发明控制在低温下反应，不仅降低了底物丙烯酸聚合反应，而且提高了底物浓度及产物浓度，进而提高了转化率。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就如同它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆试验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

实施例1.大肠杆菌基因asp的获得

以1μg大肠杆菌K12基因组DNA为PCR反应模板，按如下所示的引物序列进行PCR扩增；

正向引物序列asp-F：

反向引物序列asp-R：

其中，斜体字母部分分别为酶切位点Nde I和Xho I；PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为：95℃变性3min，95℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸3min，共35个循环；72℃延伸10min，取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证；取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒(购自上海生工)的说明回收目的片段(约1500bp)。

实施例2.基因asp表达载体的构建

将实施例1中的PCR产物经限制性内切酶Nde I和Xho I(购自takara公司)双酶切消化后，与用Nde I和Xho I内切酶消化的pET-42a质粒(购自Novagen公司)进行连接反应，构建的载体被命名为pET42a-asp，然后用连接产物pET42a-asp转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购自promega公司)。

实施例3.易错PCR扩增大肠杆菌基因asp

利用Taq DNA聚合酶(购自上海生工)不具有3′-5′校对功能的性质，在高镁离子浓度(8mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L，dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库，模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM，实验中最优突变率约为0.6％。

易错PCR反应体系(100μL)：

PCR程序为：95℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸3min，45个循环；最后75℃延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物，取5μL产物1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。

实施例4.天冬氨酸酶基因突变体库的构建

将易错PCR产物经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切消化后，与用Nde I和Xho I内切酶消化的pET-42a质粒进行连接反应，构建载体库pET42a-aspM，然后将pET42a-aspM转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，构建表达突变体库。

实施例5.构建表达突变体库及突变体的筛选

随机挑取若干突变菌株单克隆至含60μg/mL卡那霉素的LB培养基的6孔板中，37℃、150rpm培养，待OD600值达0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mmol/L)，30℃继续培养12h；离心收集菌体，以50mmol/L、pH 8.0Tris-HCl(含1mmol/L咪唑)缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体：5mL缓冲液)，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清，并进行蛋白纯化及酶活测定。

蛋白纯化具体方法包括如下步骤：取Ni²⁺-NTA Agarose 5mL装入层析柱，用25mL水洗涤，重复洗涤两次，接着用25mL的NAT-0缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)平衡层析柱，收集上述破碎菌体，离心后得到的上清加入到Ni²⁺-NTA层析柱中，反复加入2-3次后，用25mL的NAT-1缓冲液(即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE分析得到了符合预期大小的特异蛋白带(约50kDa)，蛋白的浓度采用Brandford方法测定。

酶活测定方法：向含1.0M丙烯酸的pH7.5混合反应液中加入5.0g/L的上述纯化蛋白混匀，25℃反应1h，测定丙烯酸及β-丙氨酸含量，以确定其酶活。

催化丙烯酸加氨酶活定义：1分钟内生成1mM的β-丙氨酸定义为1U。单位蛋白催化丙烯酸加氨酶活力的定义：1.0mg天冬氨酸酶蛋白在1分钟内催化反应生成1mMβ-丙氨酸定义为1U/mg。

经计算，纯化后野生型菌株的酶活为0.023U/mg，但本申请的天冬氨酸酶突变菌株M1(ASPM1)底物转化率非常高，且酶活也非常高，酶活为3.28U/mg，比野生型的酶活提高了143倍。

向含5.0M丙烯酸的pH7.5混合反应液中加入20g/L纯化天冬氨酸酶突变体蛋白混匀，15-45℃反应5h，测定丙烯酸及β-丙氨酸含量，计算转化率(见表1)。从结果中可以看出，20-25℃为ASPM1的最适反应温度，丙烯酸转化率达到97.2％以上。

表1丙烯酸转化率测定

挑取突变菌株ASPM1克隆，并提取质粒pET42a-aspM1，进行PCR验证及测序鉴定，经测序鉴定，测定的天冬氨酸酶突变体M1对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.1ASPM1氨基酸序列：

MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYEYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKQIQKTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLLEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ。

SEQ ID NO.2野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列：

MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ。

SEQ ID NO.5编码ASPM1氨基酸序列的核苷酸序列：

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司

<120> 天冬氨酸酶突变体及其应用

<130> CP11942FY

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu

1 5 10 15

Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu

20 25 30

Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val

35 40 45

Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu

50 55 60

Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys

65 70 75 80

Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp

85 90 95

Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu

100 105 110

Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu

115 120 125

Tyr Glu Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr

130 135 140

Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu

145 150 155 160

Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg

165 170 175

Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu

180 185 190

Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser

195 200 205

Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Gln Ile Gln Lys Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn

225 230 235 240

Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val

245 250 255

Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Leu Glu Ala Thr Ser

260 265 270

Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala

275 280 285

Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly

305 310 315 320

Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val

325 330 335

Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met

340 345 350

Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile

355 360 365

Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr

370 375 380

Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val

385 390 395 400

Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn

405 410 415

Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala

420 425 430

Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu

435 440 445

Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His

450 455 460

Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln

465 470 475

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> 野生型天冬氨酸酶(Wild-type aspartase)

<400> 2

Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu

1 5 10 15

Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu

20 25 30

Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val

35 40 45

Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu

50 55 60

Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys

65 70 75 80

Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp

85 90 95

Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu

100 105 110

Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu

115 120 125

Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr

130 135 140

Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu

145 150 155 160

Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg

165 170 175

Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu

180 185 190

Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser

195 200 205

Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn

225 230 235 240

Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val

245 250 255

Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser

260 265 270

Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala

275 280 285

Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly

305 310 315 320

Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val

325 330 335

Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met

340 345 350

Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile

355 360 365

Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr

370 375 380

Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val

385 390 395 400

Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn

405 410 415

Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala

420 425 430

Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu

435 440 445

Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His

450 455 460

Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln

465 470 475

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatatgatg tcaaacaaca ttcgtat 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctcgagtta ctgttcgctt tcatcag 27

<210> 5

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60

gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120

atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180

gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240

gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300

ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360

ctgatgggtc accaaaaagg tgaatatgag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420

tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttccctg 480

attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540

ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600

ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaca gatccaaaag 660

accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggtgcaacag caatcggtac tggtctgaac 720

acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagttac tggcttccca 780

tgcgtaccgg ctgaagacct gctcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgttatggtt 840

cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900

ctctcttcag gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960

tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020

ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080

ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgttcg aatccgttca cattctgacc 1140

aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200

tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260

caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320

gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380

aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437

Claims

1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 编码权利要求1所述天冬氨酸酶突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成或由与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列互补的序列组成。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种能够生产β-丙氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求3所述的重组表达载体。

5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组大肠杆菌（Escherichia Coli）。

6. 根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组大肠杆菌（Escherichia Coli）BL21（DE3）菌株。

7.权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组表达载体、权利要求4-6任一项所述的重组菌在生产β-丙氨酸中的应用。

8.权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组表达载体、权利要求4-6任一项所述的重组菌用于催化生产β-丙氨酸的方法。

9.一种生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将底物与权利要求1所述天冬氨酸酶突变体接触，或者与表达所述天冬氨酸酶突变体的宿主细胞接触，进行催化反应，生成β-丙氨酸，其中，所述底物为丙烯酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应条件为：所述底物丙烯酸浓度为0.5M~5.0M，所述天冬氨酸酶突变体的浓度为3g/L~20g/L，反应pH值为pH7.0~pH8.0，反应温度为15℃~30℃，反应时间为0.1h~5h。

11. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌（Escherichia Coli）BL21（DE3）。