CN104781400A

CN104781400A - 包含嗜热菌蛋白酶变体的组合物和方法

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Publication number: CN104781400A
Application number: CN201380057595.8A
Authority: CN
Inventors: V·Y·阿莱克塞耶夫; L·M·巴别; D·A·埃斯特尔; F·格德盖布; H·穆尔德; D·E·托雷斯帕兹米诺; J·姚; R·R·博特
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2015-07-15
Also published as: EP2914720B1; KR20150082502A; AU2013337255A1; US20160060611A1; JP2015534820A; CA2889864A1; JP6858487B2; MX2015005577A; CA2889864C; EP2914720A1; WO2014071410A1; BR112015010104A2; JP2021072794A; JP2018138028A

Abstract

本发明提供了丝氨酸蛋白酶和嗜热菌蛋白酶制备的丝氨酸蛋白酶变体和嗜热菌蛋白酶变体。具体地讲，本发明提供了与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含这些丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供了包含这些丝氨酸蛋白酶变体中的至少一种的清洁组合物。

Description

包含嗜热菌蛋白酶变体的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年11月5日提交的美国临时专利申请序列号61/722,660的优先权，该美国临时专利申请以引用方式全文并入本文。s

背景技术

杆菌(Bacilli)是分泌多种工业上有用的酶的革兰氏阳性菌，其可通过发酵大批量地廉价生产。分泌的芽孢杆菌(Bacillus)酶的例子是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶、含锌的中性蛋白酶、α-淀粉酶和纤维素酶。芽孢杆菌蛋白酶广泛用于纺织行业、洗衣行业和家居行业中(Galante,Current OrganicChemistry,7:1399-1422,2003(Galante，《当代有机化学》，第7卷，第1399-1422页，2003年)；以及Showell,Handbook of Detergents,Part D:Formulation,Hubbard(ed.),NY:Taylor and Francis Group,2006(Showell，《洗涤剂手册》部分D：配方，Hubbard编辑，纽约泰勒弗朗西斯集团2006年出版))。存在于微生物中的蛋白酶基于它们的催化机理被分为以下四组：丝氨酸蛋白酶，金属蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶具有碱性最适pH，金属蛋白酶在接近中性时活性最佳，而半胱氨酸酶和天冬氨酸酶具有酸性最适pH(Biotechnology Handbooks,Bacillus.vol.2,edited by Harwood,1989Plenum Press,New York(《生物技术手册：芽孢杆菌》，第2卷，Harwood编辑，纽约普莱南出版社1989年出版))。尽管丝氨酸蛋白酶在工业酶领域中已久为人所知，但对适于特定条件和用途的工程化蛋白酶仍存在需求。

发明内容

本发明尤其提供嗜热菌蛋白酶、编码所述嗜热菌蛋白酶的核酸，以及与它们的制备和使用有关的组合物和方法。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少75％满足以下标准中至少一项：a)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI；b)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI；c)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI；并且其中所述有效位置选自位置2、26、47、49、53、65、87、91、96、108、118、128、154、179、196、197、198、199、209、211、217、219、225、232、256、257、259、261、265、267、272、276、277、286、289、290、293、295、298、299、300、301、303、305、308、311和316，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ IDNO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，所述修饰选自2(T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M)、26(T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D)、47(R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T)、49(T,A,D,F,H,I,S,W,L,N,Q,V,E,M,Y)、53(S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L)、65(S,I,M,Q,V,L,T,W,A,D,E,P,Y)、87(V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y)、91(L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y)、96(N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y)、108(Q,C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M)、118(S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V)、128(Q,C,D,E,R,S,V,I,K,A,L,Y)、154(G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y)、179(Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F)、196(G,D,E,T,K,R,V,H,L,Y,A,W)、197(I,D,K,L,T,V,W,Y,A,H,N,E,Q,R,F,C)、198(S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K)、199(G,C,E,F,H,Q,S,T,W,L,A,Y)、209(A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M)、211(Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R)、217(Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L)、219(K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S)、225(Q,D,G,H,I,P,V,W,A,M,R,C,E,K,L,S)、232(I,C,E,F,K,M,N,Q,W,G,L,R,S,T,V,Y)、256(V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S,N)、257(G,C,D,E,L,N,P,Q,S,T,Y,K,R)、259(G,A,C,E,F,H,L,M,W,K,R,N,S,T)、261(D,A,N,P,V,W,G,H,I,S)、265(K,A,C,D,M,P,Q,S,G,I,L,R,N)、267(F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y)、272(T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K)、276(T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y)、277(P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y)、286(A,D,E,F,G,H,I,S,P,C,Q,R,T,K,L,M,N,Y)、289(V,C,E,F,G,I,N,S,W,R,T,L,M,Y,A)、290(Q,C,D,F,G,L,W,Y,R,T,V,A,H,N)、293(T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y)、295(L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W)、298(S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R)、299(T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K)、300(S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,W,A,G,T,D,N)、301(Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K)、303(V,C,H,G,K,L,R,W,A,P,Y)、305(S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M)、308(Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L)、311(D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y)、以及316(K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少40％但不到75％满足a、b和c(见上文)列出标准中的至少一项，并且其中所述有效位置选自位置1、4、17、25、40、45、56、58、61、74、86、97、101、109、149、150、158、159、172、181、214、216、218、221、222、224、250、253、254、258、263、264、266、268、271、273、275、278、279、280、282、283、287、288、291、297、302、304、307和312，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，所述修饰选自1(I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L)、4(T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y)、17(Q,I,W,Y,C,R,V,T,L)、25(S,D,F,A,C,K,M,R)、40(F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L)、45(K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M)、56(A,K,Q,V,W,H,I,Y,E,M)、58(A,N,Y,C,V,E,L)、61(Q,M,R,W,F,V,C,I,L)、74(H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W)、86(N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D)、97(N,K,C,R,S,Y,E,M)、101(R,T,C,L,S,H)、109(G,A,L,S,E,M,R,W)、149(T,M,V,A,L,D,S,N)、150(D,A,F,K,N,Q,T,V,S)、158(Q,A,K,M,N,L,R,Y,S)、159(N,R,W,A,C,G,M,T,S,Y)、172(F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H)、181(N,L,A,G,K,M,T,S)、214(P,C,G,K,S,N,A,R)、216(H,C,E,S,T,R,A)、218(S,K,L,Y,F,G,T,V)、221(Y,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M)、222(T,C,D,L,Y,I,V,A,M,K)、224(T,K,M,F,L,P,Q,V,Y,E,H)、250(H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y)、253(V,N,T,I,R,Y,M,Q)、254(S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W)、258(I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V)、263(L,C,I,Q,T,H,K,N,V,A,M)、264(G,C,R,A,N,P,Q,S,T)、266(I,A,F,L,S,C,M,T,V)、268(Y,M,Q,V,A,S,K)、271(L,A,D,F,I,N,Y,H)、273(Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N)、275(L,I,M,V,C,Q,S,T)、278(T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S)、279(S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G)、280(N,A,C,D,E,G,Q,H,T)、282(S,K,N,R,A,H,L,M,T)、283(Q,K,L,P,R,W,Y,S)、287(A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C)、288(A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M)、291(S,E,I,L,M,N,V,A,T)、297(G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N)、302(E,K,L,G,T,V,D,Q,A)、304(A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y)、307(K,A,C,G,I,M,N,Q,R,W,Y,H)、以及312(A,G,M,V,L,N,R,T,C)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少15％但不到40％满足a、b和c(见上文)列出标准中的至少一项，并且其中所述有效位置选自位置5、9、11、19、27、31、33、37、46、64、73、76、79、80、85、89、95、98、99、107、127、129、131、137、141、145、148、151、152、155、156、160、161、164、168、171、176、180、182、187、188、205、206、207、210、212、213、220、227、234、235、236、237、242、244、246、248、249、252、255、270、274、284、294、296、306、309、310、313、314和315，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，所述修饰选自5(S,D,N,P,H,L)、9(V,L,T,I)、11(R,I,Y,K)、19(N,L,Y,K,S)、27(Y,W,A,M,V,C,L)、31(Q,A,K,V,I,C,Y)、33(N,S,T,K,A,C,L,M)、37(N,D,Q,R,L,K)、46(Y,L,H,N,C)、64(A,H,Q,T,D,E)、73(A,I,F,L,M,W)、76(Y,H,L,M,Q,T)、79(V,L,Q,T,A,N,S)、80(T,I,D,A,L,N)、85(K,E,A,L,N,R,S)、89(N,L,M,H)、95(G,A,D,H,M,N,S)、98(A,C,E,H,R,Y,K,V)、99(A,E,K,P,R,S)、107(S,D,K,Y,A,G)、127(G,C,D,E)、129(T,I,R,E,Y,L,M)、131(I,Y,W,L)、137(I,P,A,E,T,V,L)、141(A,S,C,G)、145(T,A,C,E,G,M,N,Q)、148(V,L,N,Y,M,A,Q)、151(Y,K,G,H,S,W)、152(T,S,L,M,G)、155(L,C,I,M)、156(I,M,T,L,Q)、160(E,L,Y,Q)、161(S,A,N,P,T)、164(I,L,N,S,T,V,C,A)、168(I,A,M,T,L)、171(I,C,E,F,L,S,G)、176(V,L,N,C)、180(A,E,G,K,T,S)、182(K,L,A,W)、187(E,L,D)、188(I,L,V)、205(M,L,A,V,Q)、206(S,A,C,K,L,M,R)、207(D,A,H,N)、210(K,I,L,V)、212(G,Y,A,D,Q)、213(D,N,S,L,A,G,W)、220(R,K,V,A)、227(N,D,L,Y,A)、234(S,D,N,A,C)、235(G,M,C,Q,S,A)、236(I,M,A,C)、237(I,N,F,M)、242(Y,C,F,N,V)、244(I,T,V,F,A,M,L)、246(Q,E,N,T,L,C,D)、248(G,A,E,S)、249(T,K,M,N,L,Y,P)、252(G,K,Y,A,S,T,W)、255(V,L,P,A,Y,M,N)、270(A,C,F,I,L,S,G)、274(Y,F,H,A,C,Q,T,M)、284(L,V,W,A,M,Y)、294(D,A,V,Q,N)、296(Y,N,L,R,H,W,M)、306(V,A,S,F,I,L,T)、309(A,G,S,T,V,C)、310(F,A,C,W,M)、313(V,T,A,G,L,I,C)、314(G,A,E,H,M,S,W,Q)、以及315(V,A,C,I,M,L,T)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰但不到所述修饰的15％满足a、b和c(见上文)列出标准中的至少一项，并且其中所述有效位置选自位置3、6、7、20、23、24、44、48、50、57、63、72、75、81、92、93、94、100、102、103、104、110、117、120、134、135、136、140、144、153、173、174、175、178、183、185、189、193、201、223、230、238、239、241、247、251、260、262、269和285，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，所述修饰选自3(G,Y)、6(T,C,V)、7(V,L,I)、20(I,L,V)、23(T,F,W)、24(Y,W)、44(A,C)、48(T,E,D)、50(L,P)、57(D,K)、63(F,Y,C)、72(D,F,W)、75(Y,A)、81(Y,F)、92(S,L)、93(Y,T,C)、94(D,T)、100(I,L,V)、102(S,G,N)、103(S,T)、104(V,A)、110(Y,L)、117(G,H)、120(M,L)、134(S,A,P)、135(G,A)、136(G,A,S)、140(V,D)、144(L,T)、153(A,T)、173(G,A,C)、174(T,C,A)、175(L,H,S)、178(F,H,Y)、183(N,S)、185(D,E)、189(G,A)、193(Y,F)、201(S,C,A)、223(G,D,K)、230(V,A)、238(N,L,M)、239(K,A)、241(A,L,S)、247(G,A,S)、251(Y,M)、260(R,A,N)、262(K,A)、269(R,V,K)、以及285(R,K,Y)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰为活性可组合突变，其中在所述活性可组合位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：该位置的修饰导致关于表达和洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5；而关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于1.5；并且其中所述活性可组合位置选自位置17、19、24、25、31、33、40、48、73、79、80、81、85、86、89、94、109、117、140、141、150、151、152、153、156、158、159、160、161、168、171、174、175、176、178、180、181、182、183、189、205、206、207、210、212、213、214、218、223、224、227、235、236、237、238、239、241、244、246、248、249、250、251、252、253、254、255、258、259、260、261、262、266、268、269、270、271、272、273、274、276、278、279、280、282、283、294、295、296、297、300、302、306、310和312，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，所述修饰选自17(E,F,P)、19(A,D,H,I,R,T,V)、24(F,H)、25(H)、31(L)、33(Q)、40(C)、48(A,R)、73(Y)、79(C)、80(C,R)、81(H)、85(C,M,Y)、86(V)、89(K,R,T,V)、94(E)、109(D)、117(A,K,R,T)、140(S)、141(T)、150(E,M,W)、151(A,C,E,I)、152(D)、153(V)、156(H,R)、158(F,G,I,V)、159(F,I,K)、160(S)、161(Y)、168(N)、171(D)、174(S,V)、175(C,E,F,G,I)、176(E,Q)、178(C,M)、180(L,W)、181(Y)、182(F,R)、183(H,I,L,M,Q,R,T)、189(C)、205(C,F)、206(F,H,I,T,V,Y)、207(T)、210(A,E,F,G,H,T)、212(F,H,K,M,N,R,S,T)、213(I,K,R,V,Y)、214(Q)、218(R)、223(Y)、224(I,R)、227(C,E,G,K,Q,R,S,T,V)、235(D,L,T)、236(P)、237(A,Q)、238(A,C,D,E,R,S)、239(C,G,H,L,Q,R,S,V,Y)、241(E,F,G,I,T,V)、244(Q)、246(K,R)、248(C,H)、249(G,V)、250(F,S)、251(H)、252(F,I,L)、253(A,D,E,P)、254(C,F,G,H,I,P)、255(F,Q)、258(F)、259(I)、260(C,D,I)、261(K,R,T)、262(C,F,H,L,P,R)、266(W)、268(F,R)、269(P,T,W,Y)、270(M,N,P,V)、271(V)、272(R)、273(R)、274(D,E)、276(G,S)、278(V)、279(E)、280(P,R,V)、282(P)、283(A,C,E,G,H,T,V)、294(T)、295(R)、296(E,I)、297(I,V)、300(Q)、302(W)、306(Y)、310(I,N)、以及312(Q)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中与亲本嗜热菌蛋白酶相比，所述嗜热菌蛋白酶变体在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁性能改善、对Abz-AGLA-Nba的活性改善或者洗涤剂稳定性或热稳定性改善，并且其中所述修饰所处的位置具有的温度系数高于观察到的SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍；并且其中所述残基位置选自位置1、2、127、128、180、181、195、196、197、198、199、211、223、224、298、299、300和316，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中与亲本嗜热菌蛋白酶相比，所述嗜热菌蛋白酶变体的洗涤剂稳定性或热稳定性改善，并且其中所述修饰所处的位置具有的温度系数高于观察到的SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍；其中所述修饰选自1(I,V)、2(T,C,I,M,P,Q,V)、127(G,C)、128(Q,C,E,F,I,L,V,Y)、180(A,E,N)、181(N,A,G,Q,S)、196(G,L,Y)、197(I,F)、198(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y)、211(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W)、224(T,D,H,Y)、298(S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y)、299(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W)、以及316(K,A,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少75％满足以下标准中至少一项：a)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI；b)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI；c)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI；并且其中所述有效位置选自位置2、87、96、198、277、293、295、298和301，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

1.在另外的实施例中，所述有效位置选自位置2(T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M)、87(V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y)、96(N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y)、198(S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K)、277(P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y)、293(T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y)、295(L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W)、298(S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R)、301(Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于有效位置，其中在所述有效位置处测试的修饰满足以下标准：该位置的修饰导致关于表达、洗涤剂稳定性、热稳定性、PAS-38微样片清洁活性、或对Abz-AGLA-Nba的活性这些参数中的至少三个，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于1，并且其中所述有效位置选自位置278、283、180、244、48和63，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在另外的实施例中，所述有效位置选自位置T278R、Q283E、A180E、I244T、T48E和F63C，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，本发明为包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：该位置的修饰导致关于表达、洗涤剂稳定性、热稳定性、PAS-38微样片清洁活性、或对Abz-AGLA-Nba的活性这些参数中的至少全部，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，且关于这些参数中的仅一个，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)小于0.8；并且其中所述有效位置选自位置019、025、026、063、091、096、097、101、109、118、131、140、158、159、175、180、219、225、232、244、246、261、277、293、300、301、301、303、305和311，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在另外的实施例中，所述有效位置选自位置N019D、S025A、T026R、S065A、L091M、N096Q、N096R、N096Y、N097K、R101M、G109A、S118A、I131L、V140D、Q158A、N159E、N159K、L175V、A180R、G196T、G196Y、K219S、Q225E、I232R、I244L、Q246D、D261N、P277G、T293Y、S300G、Q301、Q301M、V303R、S305A、D311A，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体为M4肽酶。在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体为MA族群的成员。在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体为PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C家族的成员。在一些实施例中，所述变体与SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶具有至少50％的同一性。在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体来自选自以下的属：芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、标桩菌属(Stigmatella)、粘球菌属(Myxococcus)、弧菌属(Vibrio)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、克里贝拉菌属(Kribbella)、两面神菌属(Janibacter)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、黄单胞菌属(Xanthamonas)、小单孢菌属(Micromonospora)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、脱卤拟球菌属(Dehalococcoides)、Croceibacter、科迪亚菌属(Kordia)、微颤菌属(Microscilla)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、李斯特氏菌属(Listeria)、邻囊菌属(Plesiocystis)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、噬细胞菌属(Cytophaga)、河氏菌属(Hahella)、节杆菌属(Arthrobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、棒形杆菌属(Clavibacter)、微杆菌属(Microbacterium)、间孢囊菌属(Intrasporangium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、亚栖热菌属(Meiothermus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、蓖麻属(Ricinus)、细链孢菌属(Catenulispora)、鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)、盐单胞菌属(Halomonas)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、贪噬菌属(Variovorax)、狄克氏菌属(Dickeya)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、拉恩氏菌属(Rahnella)、沙雷氏菌属(Serratia)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、出芽菌属(Gemmata)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、光杆菌属(Photorhabdus)、曲霉属(Aspergillus)、新萨托菌属(Neosartorya)、核腔菌属(Pyrenophora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、丛赤壳属(Nectria)、赤霉菌属(Gibberella)、绿僵菌属(Metarhizium)、华诊体属(Waddlia)、蓝丝菌属(Cyanothece)、噬纤维菌属(Cellulphaga)、普罗威登斯菌属(Providencia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产冻胶菌属(Mucilaginibacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、堆囊菌属(Sorangium)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、肾杆菌属(Renibacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、海藻分解菌属(Reinekea)、色杆菌属(Chromobacterium)、莫里特拉菌属(Moritella)、嗜盐囊菌属(Haliangium)、康氏菌属(Kangiella)、海单胞菌属(Marinomonas)、弧菌目(Vibrionales)、利斯顿氏菌属(Listonella)、盐弧菌属(Salinivibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、军团菌属(Legionella)、船蛆杆菌(Teredinibacter)、海藻分解菌属(Reinekea)、Hydrogenivirga和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体来自选自以下的属：芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属、乳杆菌属、微小杆菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、滑柱菌属、海洋芽孢杆菌属、希瓦氏菌属、梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属、黄杆菌属、标桩菌属、粘球菌属、弧菌属、甲烷八叠球菌属、金黄杆菌属和假交替单胞菌属。在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶来自芽孢杆菌属。

在一些实施例中，本发明为包含上文列出的至少一种变体的清洁组合物。在一些实施例中，该清洁组合物为颗粒、粉末、固体、条棒、液体、片剂、凝胶或糊剂组合物。在一些实施例中，该清洁组合物为洗涤剂组合物。在一些实施例中，该清洁组合物为衣物洗涤剂组合物、盘碟洗涤剂组合物、或硬质表面清洁组合物。在一些实施例中，该盘碟洗涤剂为手动盘碟洗涤剂组合物或自动盘碟洗涤剂组合物。在一些实施例中，该清洁组合物是衣物洗涤剂组合物。在一些实施例中，该清洁组合物还包含至少一种漂白剂。在一些实施例中，该清洁组合物不含磷酸盐。在一些实施例中，该清洁组合物含有磷酸盐。在一些实施例中，该清洁组合物还包含至少一种另外的酶。在一些实施例中，所述至少一种另外的酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、另外的金属蛋白酶，以及它们的组合。

在一些实施例中，本发明为使用上文列出的清洁组合物进行清洁的方法。一种清洁方法，包括用含有至少一种根据权利要求1-33中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物来接触表面或物品。在一些实施例中，该方法包括用上文示出的清洁组合物来接触表面或物品。在一些实施例中，该方法包括在用所述清洁组合物分别接触所述表面或物品之后漂洗所述表面或物品。在一些实施例中，该物品是盘碟。在一些实施例中，该物品是织物。在一些实施例中，该方法包括在用所述清洁组合物接触所述表面或物品之后漂洗所述表面或物品的步骤。在一些实施例中，该方法包括在所述表面或物品的所述漂洗之后干燥所述表面或物品的步骤。在一些实施例中，该方法包括提供上文示出的清洁组合物以及需要清洁的表面或物品；以及在适于清洁所述表面或物品的所述表面的条件下，用需要清洁的所述表面或物品接触所述清洁组合物，以产生洁净的表面或物品。在一些实施例中，该方法包括漂洗所述洁净的表面或物品以产生漂洗过的表面或物品的步骤。在一些实施例中，该方法还包括干燥所述漂洗过的表面或物品的步骤。

附图说明

图1示出pHPLT-蛋白酶T的质粒图谱。

图2A-图2C提供了MEROPS家族M4的424个成员的进化树。图2A对X轴的位置进行了校正，而图2B和图2C的X轴在操作过程中发生了移动。

具体实施方式

本发明提供了改善的金属蛋白酶，特别是可用于洗涤剂组合物的酶。具体地讲，本发明提供了与亲本金属蛋白酶相比具有一个或多个修饰(例如置换)的金属蛋白酶变体。这种改善可通过改善酶的洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和/或酶的热稳定性从而提高酶在洗涤循环中的效力而实现。本发明提供了特别适合于并且可用于多种清洁应用的变体金属蛋白酶，包括但不限于变体嗜热菌蛋白酶金属蛋白酶。本发明包括含有本文示出的变体金属蛋白酶(例如，变体嗜热菌蛋白酶)中的至少一种的组合物。一些此类组合物包括洗涤剂组合物。本发明提供了各种物种包括芽孢杆菌属和地芽孢杆菌属物种的变体金属蛋白酶，以及包含一种或多种此类变体嗜热菌蛋白酶的组合物。可将本发明的金属蛋白酶变体与可用于洗涤剂组合物中的其他酶组合。本发明还提供了使用本发明的金属蛋白酶变体来进行清洁的方法。

本发明包括具有对亲本金属蛋白酶的一个或多个修饰的金属蛋白酶的酶变体。由于所述酶变体在洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性方面，同时这些特性中至少有一项，相对于亲本金属蛋白酶的最低性能指数有所改善，故可用于洗涤剂组合物中。

另外，本发明提供了在可用于洗涤剂组合物的金属蛋白酶中的一个或多个氨基酸位置处的修饰(例如置换)，其中有利的修饰导致在洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性方面，同时这些特性中至少有一项，相对于亲本金属蛋白酶的最低性能指数有所改善。这些修饰被认为是本发明的合适修饰。这些氨基酸位置可被认为是对亲本金属蛋白酶的组合修饰的有用位置。被认为是有用位置的金属蛋白酶氨基酸位置可进一步通过具有适用于洗涤剂组合物中的多个修饰来表征。对于每个位置而言，可能合适的修饰的个数越多，表示特定位置的有效性越高。

此外，本发明提供包含这些金属蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供清洁组合物，其包含这些金属蛋白酶变体中的至少一种。

可以理解的是，为清楚起见，上文和下文在单独实施例的上下文中所描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中以组合形式提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中所描述的本发明的各种特征也可单独地或以任意子组合形式提供。

定义

除非另外指明，否则本发明的实施涉及处于本领域技术范围内的常用于分子生物学、蛋白质工程、微生物学和重组DNA的常规技术。这类技术是本领域技术人员已知的并描述于本领域技术人员众所周知的许多文章和参考著作中。据此将本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，均明确地以引用的方式并入本文。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施，但本文中依然描述了一些合适的方法和材料。相应地，下面紧接着定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。另外，如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数含义。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。

除非另外指明，否则本发明的实施可采用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术以及蛋白质测序的常规技术，所有这些均在本领域技术人员的技能之内。

此外，本文提供的标题并不排除本发明的其他各个方面或实施例，这些方面或实施例都可以通过整体参考说明书而获取。因此，通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，将多个术语定义如下。

在本说明书通篇中给出的每一个最大值意在包括每一个下限值，就如同此类下限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个最小值将包括每一个上限值，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。

如本文所用，术语“蛋白酶”和“朊酶”是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，其通过水解在形成该蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而开始蛋白质分解代谢。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性称为“蛋白水解活性”。存在用于测定蛋白水解活性的多个熟知的工序(参见例如Kalisz的“MicrobialProteinases”(微生物蛋白酶)，载于：Fiechter(ed.),Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,(1988)(Fiechter编辑，《生物化学工程/生物技术进展》，1988年))。例如，蛋白水解活性可通过可分析该蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定法来确定。可用于蛋白酶或蛋白水解活性的分析的示例性底物包括但不限于：二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical 902111)。利用这些底物的比色测定法是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和美国专利No.6,376,450，这两个专利以引用方式并入本文)。pNA测定法(参见例如Del Mar et al.,Anal.Biochem.99:316-320[1979](Del Mar等人，《分析生物化学》，第99卷，第316-320页，1979年))也可以用于测定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量当该酶水解可溶性的合成底物即琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时对硝基苯胺释放的速率。用分光光度计在410nm处测量从该水解反应产生黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，可使用280纳米(nm)处的吸光度测量值来确定总蛋白质浓度。活性酶/总蛋白质比率给出了酶纯度。

如本文所用，术语“嗜热菌蛋白酶”是指如在MEROPS-肽酶数据库中所述的M4蛋白酶家族的任何成员(参见Rawlings et al.,MEROPS:thepeptidase database,Nucl Acids Res,34Database issue,D270-272[2006](Rawlings等人，“MEROPS：肽酶数据库”，《核酸研究》，第34卷，数据库专刊，第D270-272页，2006年))，在M4蛋白酶家族中嗜热菌蛋白酶(TLN；EC 3.4.24.27)为原型。嗜热菌蛋白酶(EC 3.4.24.27)是一种由嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)分泌的中性金属内切肽酶，其氨基酸序列首先由Titani等人报道(Titani et al,(1972),Amino-acidsequence of thermolysin.Nature New Biol.238:35-37(Titani等人，1972年，“嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列”，《自然新生物学》，第238卷，第35-37页))。后来，O'Donohue等人克隆了这种酶的基因(O'Donohue,M.J(1994)Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillusthermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloproteasethermolysin.Biochem.J.300:599-603(O'Donohue,M.J，1994年，“来自嗜热溶蛋白芽孢杆菌Rokko的编码热稳定金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶的npr基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达”，《生物化学杂志》，第300卷，第599-603页))，序列如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P00800(SEQ ID NO:4)所示出。由Titani等人和O'Donohue等人报道的蛋白质序列之间仅有的差别被确认为：位置37处为Asn(替代Asp)，位置119处为Gln(替代Glu)。鉴于此，术语“嗜热菌蛋白酶”、“stearolysin”、“芽孢杆菌溶素”、“蛋白酶-T”、“PrT”、“嗜热菌蛋白酶样蛋白酶”和“TLP”在本文中可互换使用，它们均指嗜热溶蛋白芽孢杆菌的中性金属蛋白酶。

如本文所用，术语“变体多肽”是指包含与亲本或参照多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列相差至少一个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。

如本文所用，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，意在使该属包括已经重新分类的种，包括但不限于例如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”(Geobacillus stearothermophilus)的嗜热脂肪芽孢杆菌的生物体。在氧存在下生成抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，但该特征也可适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指在链中共价键合的核苷酸单体的任何长度的聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)(包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸)和RNA(核糖核酸)(核糖核苷酸的聚合物)是具有独特生物学功能的多核苷酸或核酸的例子。多核苷酸或核酸包括(但不限于)：单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因、基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。

如本文所用，术语“突变”是指在参考氨基酸或核酸序列中作出的变化。意在使该术语涵盖置换、插入和缺失。

如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸引入或转移进靶细胞或组织中的核酸构建体。载体通常用于将外来DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如，病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体等等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体插入靶细胞中的过程通常称为转化。在一些实施例中，本发明包括载体，该载体包含编码金属蛋白酶多肽(例如，前体或成熟金属蛋白酶多肽)的DNA序列，该DNA序列有效连接至合适的前序列(例如，分泌性信号肽序列等)，该前序列能够影响所述DNA序列在合适宿主中的表达以及重组多肽链的折叠和易位。

如本文所用，术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指以重组方式或以合成方式产生的、用于目的核酸在靶细胞中的表达的核酸构建体或载体。表达载体或表达盒通常包含驱动外来核酸的表达的启动子核苷酸序列。表达载体或表达盒还通常包含允许特定核酸在靶细胞中的转录的任何其他规定的核酸元件。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。

在一些实施例中，序列的末端是闭合的，使得DNA构建体形成闭环。用本领域熟知的技术掺入DNA构建体中的目的核酸序列可以是野生型的、突变型的或经修饰的核酸。在一些实施例中，DNA构建体包含一条或多条与宿主细胞染色体同源的核酸序列。在其他实施例中，DNA构建体包含一条或多条非同源核苷酸序列。一旦在体外装配好DNA构建体，就可将其用于(例如)：1)将异源序列插入宿主细胞的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即用异源序列置换内源序列)；3)使靶基因缺失；和/或4)将复制型质粒引入宿主中。在本文中“DNA构建体”可与“表达盒”互换使用。

如本文所用，“质粒”是指染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。质粒是双链的(ds)并且可以是环状的，通常用作克隆载体。

如本文在将核酸序列引入细胞的语境中所用，术语“引入”指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。用于引入的此类方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导(参见例如Ferrari等人的“Genetics”(遗传学)，载于Hardwood et al.(eds.),Bacillus,PlenumPublishing Corp.,pp.57-72[1989](Hardwood等人编辑，《芽孢杆菌》，普莱南出版公司1989年出版，第57-72页))。

转化是指因遗传物质(例如，DNA)的吸收、任选的基因组掺入和表达所致的细胞的遗传变更。

如本文所用，某核酸当被设置成与另一个核酸序列处于功能关系中时，其与另一个核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子影响核苷酸编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列有效连接。如果核糖体结合位点被设置成使得有利于编码序列的翻译，则该核糖体位点可与该编码序列有效连接。通常，“有效连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制性位点处的连接来实现。如果这类位点不存在，则可根据常规操作使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文所用，术语“基因”是指这样的多核苷酸(例如，DNA片段)，其编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域以及位于各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文所用，“重组”在用于指细胞时，通常表示该细胞已通过引入外来核酸序列进行了修饰或表示该细胞衍生自经过如此修饰的细胞。例如，重组细胞可包含这样的基因，其不以相同的形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内，或者重组细胞可包含(存在于天然形式的细胞中的)天然基因，但该基因已经过修饰并被再次引入该细胞中。重组细胞可包含对该细胞而言是内源性的核酸，该核酸在未将其从该细胞移除的情况下进行了修饰；这种修饰包括通过基因置换、定点突变以及本领域一般技术人员已知的相关技术获得的那些修饰。重组DNA技术包括体外产生重组DNA以及将该重组DNA转移进细胞中的技术，在所述细胞中该重组DNA可表达或增殖，从而产生重组多肽。多核苷酸或核酸的“重组”和“重组的”一般是指两条或更多条核酸或多核苷酸链或片段的组装或组合，以产生新的多核苷酸或核酸。重组多核苷酸或核酸有时称为嵌合体。如果核酸或多肽是人工的或经工程改造的，则为“重组的”。

如本文所用，术语核酸或基因“扩增”是指这样一种过程，通过该过程特定DNA序列以不成比例的方式复制，使得被扩增的核酸或基因以高于基因组中最初存在的拷贝数的拷贝数存在。在一些实施例中，通过在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的存在下进行生长来选择细胞，导致编码在该药物存在下的生长所需的基因产物的内源基因扩增，或者导致编码该核酸或基因产物的外源(即输入)序列的扩增，或者导致这两种扩增。

“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特例。要将它与非特异性模板复制(即依赖于模板、但不依赖于特定模板的复制)区分开来。此处，模板特异性与复制保真性(即正确多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性有区别。模板特异性在很多情况下以“靶”特异性描述。靶序列是此种意义的“靶”，也就是可设法将它们从其他核酸挑选出来。已经设计出主要用于该挑选的扩增技术。

如本文所用，术语“引物”是指这样的寡核苷酸(核苷酸残基的聚合物)，无论是如在纯化的限制酶切消化物中天然存在的还是以合成方式产生的，其在被置于与某核酸链互补的引物延伸产物的合成得以诱导的条件下(即，在核苷酸、诱导剂如DNA聚合酶的存在下且在合适的温度和pH下)时能够充当合成起始点。为了使扩增效率最高，引物优选为单链的，但作为另一种选择其也可以是双链的。如果是双链，则首先对引物进行处理以分离其链，然后再用于制备延伸产物。在一些实施例中，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源以及使用的方法。

如本文所用，术语“探针”是指这样的寡核苷酸，无论是如在纯化的限制酶切消化物中天然存在的还是以合成方式、重组方式或通过PCR扩增产生的，其通常能够与另一种目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、识别和分离。可以设想，本发明中所用的任何探针将用任何“报告分子”进行标记，使得其可在任何检测系统中被检测到，所述检测系统包括但不限于酶系统(例如ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光系统、放射性系统和发光系统。无意于将本发明受限于任何具体的检测系统或标记。

如本文所用，当用于讨论聚合酶链反应时，术语“靶”是指用于聚合酶链反应的引物所结合的核酸区域。因此，“靶”被设法从其他核酸序列中挑选出来。核苷酸“片段”是在靶核酸序列内的核酸区域。

如本文所用，术语“聚合酶链反应”(PCR)是指美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,965,188的方法(藉此将这些专利以引用方式并入本文)，其包括在不进行克隆或纯化的情况下增加靶序列的某个片段在基因组DNA的混合物中的浓度的方法。扩增靶序列的这种方法是本领域众所周知的。

如本文所用，术语“扩增试剂”是指扩增所需的除引物、核酸模板和扩增酶以外的那些试剂(例如，脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲剂等)。通常，将扩增试剂连同其他反应组分放置于和装于反应容器(试管、微孔等)中。

如本文所用，术语“限制性内切核酸酶”或“限制酶”是指能够在称为限制位点的特定核苷酸序列处或附近切开双链或单链DNA的酶(例如，细菌酶)。包含限制位点的核苷酸序列为给定的限制性内切酶或限制酶所识别和切割并且常常是插入DNA片段的位点。可将限制位点工程引入到表达载体或DNA构建体中。

“同源重组”是指两个DNA分子或成对染色体之间的DNA片段在相同或几乎相同的核苷酸序列位点处的交换。在一些实施例中，染色体整合是同源重组。

如果核酸或多核苷酸在天然状态下或通过本领域技术人员已知的方法操纵时，可转录和/或翻译产生多肽或其片段，则称该核酸或多核苷酸“编码”多肽。也称这种核酸的反义链编码该序列。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是指用于包含目的DNA序列的表达载体的合适宿主。

“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的多聚序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。遵照国际纯化学及应用化学联合会-国际生物化学联合会的生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Joint Commission onBiochemical Nomenclature(JCBN))所定义的氨基酸的单字母和三字母代码在整个本公开中使用。单字母X指二十种氨基酸中的任一种。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。突变可按以下方式命名：亲本氨基酸的单字母代码，后跟位置编号，然后是变体氨基酸的单字母代码。例如，位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。突变还可按以下方式命名：使用氨基酸的三字母代码，后跟其在多肽链中从N端计数的位置；例如，位置10处的丙氨酸表示为Ala10。多点突变通过在各突变之间插入“-”表示。位置87和90处的突变可表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”，或者“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于缺失，使用单字母代码“Z”。对于相对于亲本序列的插入，单字母代码“Z”位于该位置号码的左侧。对于缺失，单字母代码“Z”位于该位置号码的右侧。对于插入，位置号码是在插入的氨基酸的前面的位置号码，每个氨基酸加0.01。例如，在位置87和88之间插入三个氨基酸即丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)显示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因此，将上面所有的突变加上位置100处的缺失组合在一起为：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。在描述修饰时，后跟列于括号中的氨基酸的位置表示该位置处由所列出的氨基酸中的任一个进行的一系列置换。例如，6(L,I)是指位置6可被亮氨酸或异亮氨酸置换。

“前序列”或“前肽序列”是指蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的处于信号肽序列和成熟蛋白酶序列之间的氨基酸序列；它们有时被称为分子内分子伴侣。前序列或前肽序列的切除会得到成熟的活性蛋白酶。细菌的金属蛋白酶通常表示为酶原。

术语“信号序列”或“信号肽”是指可参与成熟或前体形式的蛋白质的分泌或直接转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于该前体或成熟蛋白质序列的N端。信号序列可以是内源性的或外源性的。通常成熟蛋白质缺少信号序列。在转运蛋白质后通常由信号肽酶从该蛋白质切除信号序列。

术语蛋白质、多肽或肽的“成熟”形式是指无信号肽序列和前肽序列的该蛋白质、多肽或肽的功能形式。

术语蛋白质或肽的“前体”形式是指具有与该蛋白质的氨基末端或羰基末端有效连接的前序列的蛋白质成熟形式。前体还可具有与前序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如从前体上将其切除会留下蛋白质或肽的成熟形式的多肽)。

关于氨基酸序列或核酸序列的术语“野生型”是指所述氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指自然界中存在的任何东西(例如，蛋白质、氨基酸或核酸序列)。

如本文所用，术语“非天然存在的”是指自然界中不存在的任何东西(例如，实验室中制备的重组核酸和蛋白质序列)，其为野生型序列的修饰形式。

如本文所用，对于氨基酸残基位置，“与…相对应”或“对应于”或“对应”是指在蛋白质或肽的列举位置处的氨基酸残基，或与蛋白质或肽中列举的残基类似、同源或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”一般是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“得自”不仅指由或可由所考虑的生物菌株产生的蛋白质，还指由从这种菌株分离的DNA序列编码并在包含这种DNA序列的宿主生物中产生的蛋白质。另外，该术语指由合成来源的和/或cDNA来源的DNA序列编码的并具有所考虑的蛋白质的识别特性的蛋白质。举例来说，“源自芽孢杆菌属的蛋白酶”是指那些由芽孢杆菌属天然产生的具有蛋白水解活性的酶，以及与由芽孢杆菌属来源产生的那些蛋白酶类似的丝氨酸蛋白酶，但这些丝氨酸蛋白酶是使用基因工程技术通过编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的非芽孢杆菌属生物产生的。

在两条核酸或多肽序列的语境中，术语“相同”是指当比对以达到最大匹配程度时两条序列中相同的残基，如使用如下序列比较或分析算法中的一种所测定的。

如本文所用，“同源基因”是指来自不同但通常相关的物种的一对基因，这对基因彼此对应并且彼此相同或非常类似。该术语涵盖了因物种形成(即，新物种的形成)而分化的基因(例如，直系同源基因)，以及因基因复制而分化的基因(例如，平行同源基因)。

如本文所用，“同一性％或百分比同一性”是指序列相似性。百分比同一性可使用本领域已知的标准技术测定(参见例如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482[1981](Smith和Waterman，《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443[1970](Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988](Pearson和Lipman，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页，1988年)；软件程序，例如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package，得自美国威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux et al.,Nucl.Acid Res.12:387-395[1984](Devereux等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的简化渐进式比对方法(参见Feng andDoolittle,J.Mol.Evol.35:351-360[1987](Feng和Doolittle，《分子进化杂志》，第35卷，第351页-360页，1987年))。该方法与Higgins和Sharp描述的方法类似(参见Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153[1989](Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年))。可用的PILEUP参数包括默认间隙权重3.00、默认间隙长度权重0.10，以及加权末端间隙。其他可用的算法是Altschul等人描述的BLAST算法(参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410[1990](Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年)；以及Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787[1993](Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5787页，1993年))。BLAST程序使用几种搜索参数，大部分参数设定为默认值。

NCBI BLAST算法发现了生物学相似性方面最相关的序列，但对不到20个残基的查询序列不推荐使用该算法(Altschul,SF et al.(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402(Altschul,SF等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)以及Schaffer,AA et al.(2001)Nucleic Acids Res.29:2994-3005(Schaffer,AA等人，2001年，《核酸研究》，第29卷，第2994-3005页))。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数为：

·相邻字串阈值：11

·E-值截断值：10

·打分矩阵：NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)

·空位开放：5

·空位延伸：2

·氨基酸序列搜索的以下参数：

·字长：3

·E-值截断值：10

·打分矩阵：BLOSUM62

·空位开放：11

·空位延伸：1

百分比氨基酸序列同一性(％)值通过匹配的相同残基的数目除以“参考”序列的残基总数来确定，其中“参考”序列包括由用于最佳/最大比对的程序创建的任何空位。如果某序列与SEQ ID NO:A具有90％的同一性，则SEQ ID NO:A为“参考”序列。BLAST算法将“参考”序列当作“查询”序列。

CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个例子。参见Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680(Thompson等人，1994年，《核酸研究》，第22卷，第4673-4680页)。CLUSTAL W算法的默认参数为：

在CLUSTAL算法中，任一末端出现的缺失均包括在内。例如，在500个氨基酸的多肽的任一末端处(或在多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参考”多肽具有99％的百分比序列同一性(495/500个相同残基×100)。与多肽具有“至少99％序列同一性”的变体将涵盖这样一种变体。

如果目的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约60％、至少65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的氨基酸序列，则可称该目的多肽与参考多肽“基本上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两个多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，由保守氨基酸置换造成的有差别的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是实质上相同的。

如果目的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约60％、至少65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的核苷酸序列，则可称该目的核酸与参考核酸“基本上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示为这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。

当核酸或多核苷酸从其他组分(包括但不限于(例如)其他蛋白质、核酸、细胞等)至少部分地或完全地分开时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当多肽、蛋白质或肽从其他组分(包括但不限于(例如)其他蛋白质、核酸、细胞等)至少部分地或完全地分开时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔浓度计，在组合物中，分离的物质的丰度比其他物质更高。例如，分离的物质可以占所有存在的大分子物质的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔浓度计)。优选地，目的物质被纯化为基本上均一的(即通过常规检测方法在组合物中检测不到污染物)。纯度和均一性可以使用本领域熟知的多种技术测定，例如对核酸或蛋白质样品分别进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后染色显示。如果需要，可采用高分辨率技术，例如高效液相色谱法(HPLC)或类似的方法来纯化材料。

“杂交”是指核酸的一条链与互补链形成双链即与之碱基配对的过程。如果某核酸序列与参考核酸序列在中等至高度严格性杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为这两个序列“可选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”通常在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)下发生；“高严格性”通常在比Tm低约5至10℃下发生；“中等严格性”通常在比探针Tm低约10到20℃下发生；而“低严格性”通常在比Tm低约20到25℃下发生。在功能上，可以使用最高严格性条件来识别与杂交探针具有严格的同一性或接近严格的同一性的序列；而可以使用中等严格性或低严格性杂交条件来识别或检测多核苷酸序列同源物。

中等严格性和高严格性杂交条件是本领域所熟知的。严格杂交条件的例子为在如下条件下的杂交：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链核酸通过解链温度(T_m)表征，在解链温度下一半杂交的核酸不与互补链配对。双链内的错配核苷酸降低T_m。非常严格的杂交条件包括68℃和0.1X SSC。编码变体金属蛋白酶的核酸相比于SEQ ID NO:4与其相同互补链的核酸之间形成的双链可具有降低1℃-3℃或更多的T_m。

高严格性条件的另一个例子包括在约42℃下，在50％甲酰胺、5XSSC、5X邓哈特溶液(Denhardt’s solution)、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，然后在室温下在2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，接着在42℃下在0.1X SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。中等严格性条件的例子包括在37℃下在包含20％甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5X邓哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中温育过夜，然后将过滤器在约37-50℃下在1X SSC中洗涤。本领域的技术人员知道该如何调整温度、离子强度等以便适应例如探针长度等因素。

应用于核酸或多肽的术语“纯化的”一般表示核酸或多肽基本上不含其他组分，如本领域熟知的分析技术测得的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经密度梯度离心的介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽的纯度为至少约50％，通常纯度为至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％、或更大(例如，以摩尔浓度计的重量％)。在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽或多核苷酸的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。基本上纯的本发明的多肽或多核苷酸(例如，分别为基本上纯的本发明的金属蛋白酶多肽或编码本发明的金属蛋白酶多肽的多核苷酸)通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更高。

术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸、或其他指定的物质或组分以高于起始组合物中浓度的相对或绝对浓度存在于组合物中。

在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽(例如一种或多种本发明的金属蛋白酶多肽)或一种或多种本发明的核酸(例如一种或多种编码一种或多种本发明的金属蛋白酶多肽的核酸)的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。基本上纯的多肽或多核苷酸通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更高。

如本文所用，术语“组合诱变”或“组合”是指产生参考核酸序列的核酸变体的文库的方法。在这些文库中，变体含有选自一组预定突变的一个或数个突变。这类方法还提供了引入随机突变的手段，这些随机突变不是该预定突变组的成员。一些这类方法包括在美国专利No.6,582,914中列出的那些方法，藉此以引用的方式将该专利并入本文。一些此类组合诱变方法包括和/或涵盖在市售试剂盒(例如多定点诱变试剂盒(Stratagene公司)，PCR融合/延伸PCR)中体现的方法。

如本文所用，结合变体蛋白酶使用的“具有改善的特性”是指相对于对应的参考蛋白酶(例如野生型或天然存在的蛋白酶)而言，变体蛋白酶具有改善的或增强的洗涤或清洁性能，并且/或者具有改善的或增强的稳定性并任选地保持了洗涤或清洁性能。变体蛋白酶的改善的特性可以包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施例中，本发明提供表现出如下特性中的一种或多种的本发明的变体蛋白酶：相对于参考蛋白酶(例如野生型蛋白酶，如野生型嗜热菌蛋白酶)的改善的手动洗涤性能、改善的手动或人工盘碟洗涤性能、改善的自动盘碟洗涤性能、改善的洗衣性能和/或改善的稳定性。

如本文所用，术语“功能测定法”是指提供蛋白质活性的指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对蛋白质以其惯常的本领发挥作用的能力对该蛋白质进行分析的测定系统。例如，就酶而言，功能测定法涉及测定该酶催化反应的效力。

如本文所用，术语“靶性质”是指要改变的起始基因的性质。无意于将本发明限定于任何特定的靶性质。然而，在一些实施例中，靶性质是基因产物的稳定性(例如，对变性、蛋白水解或其他降解因素的抵抗)，而在其他实施例中，在生产宿主中的生产水平被改变。

如本文所用，在核酸的语境中，术语“性质”或其语法等同形式是指可选择或检测的核酸的任何特性或属性。这些性质包括但不限于影响与多肽的结合的性质、赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(例如启动子强度、启动子识别、启动子调控、增强子功能)、影响RNA加工的性质(例如RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的性质(例如mRNA的水平、调控、与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点以产生所需的特性或识别不期望的特性。

如本文所用，在多肽(包括蛋白质)的语境中，术语“性质”或其语法等同形式是指可选择或检测的多肽的任何特性或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性分布、对蛋白降解的耐受性、K_M、k_cat、k_cat/k_M比率、蛋白质折叠、诱导免疫应答、与配体结合的能力、与受体结合的能力、被分泌的能力、在细胞表面上展示的能力、低聚化的能力、信号传导的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导细胞凋亡的能力、被磷酸化或糖基化作用修饰的能力、以及/或者治疗疾病的能力等。

如本文所用，术语“筛选”在本领域中具有其通常含义。在一个示例性筛选方法中，提供了突变体核酸或由其编码的变体多肽，并且分别评估或测定突变体核酸或变体多肽的性质。突变体核酸或变体多肽的测定性质可以分别与对应的前体(亲本)核酸的性质或与对应的亲本多肽的性质比较。

对技术人员而言将显而易见的是，获得具有改变的性质的核酸或蛋白质的筛选方法取决于原料性质，突变体核酸的产生旨在促进原料性质的变更。因此，技术人员将认识到，本发明不限于要筛选的任何具体性质，并且如下性质描述仅列出了示例性的实例。筛选任何特定性质的方法通常在本领域中有所描述。例如，可在突变之前和之后测量结合性、pH、特异性等，其中变化表明发生了变更。优选地，筛选以高通量方式进行，包括同时筛选多个样品，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示和多底物和/或指示剂的测定法。

如本文所用，在一些实施例中，筛选方法包括一个或多个选择步骤，在这些步骤中将目的变体从一群变体中富集。这些实施例的实例包括对赋予宿主生物生长优势的变体的选择，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中可根据变体的结合或催化性质从一群变体捕集该变体。在一些实施例中，将变体库暴露于胁迫(例如热、变性等)，随后对仍然完整的变体在筛选中进行识别或通过选择进行富集。意在使该术语涵盖任何合适的选择方式。实际上，无意于将本发明限定于任何特定的筛选方法。

术语“经修饰的核酸序列”和“经修饰的基因”在本文中可互换使用，是指包含天然存在的(即野生型)核酸序列的缺失、插入或中断的核酸序列。在一些实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰为序列的缺失或中断的话)。在一些实施例中，截短的蛋白质保留生物活性。在另选的实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，修饰包括向核酸序列中的插入)。在一些实施例中，核苷酸插入核酸序列中会导致截短的蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可以导致截短的蛋白质或延长的蛋白质表达产物。

“突变型”核酸序列通常指这样的核酸序列，其在宿主细胞的野生型序列中存在的至少一个密码子中具有变更，使得该突变型核酸序列的表达产物是相对于野生型蛋白质而言具有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能本领(例如增强的酶活性)。

如本文所用，短语“底物特异性的改变”是指酶的底物特异性的变化。在一些实施例中，底物特异性的变化被定义为由于酶的突变或反应条件的改变而导致的特定底物的k_cat和/或K_m的变化。通过比较酶表现出的对不同底物的催化效率，来确定酶的底物特异性。这些测定尤其可用于评估突变酶的效率，因为通常期望产生对目的底物表现出更大k_cat/K_m比率的变体酶。然而，无意于将本发明限定于任何特定的底物组合物或底物特异性。

如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。

如本文所用，术语“净电荷”被定义为分子中存在的所有电荷的总和。可对亲本蛋白质分子作出“净电荷改变”，以提供具有与该亲本分子的净电荷不同的净电荷的变体(即，该变体具有的净电荷与亲本分子的净电荷不相同)。例如，用带负电的氨基酸置换中性氨基酸或用中性氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对于亲本分子而言净电荷为-1。用带负电的氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为-2。用带正电的氨基酸置换中性氨基酸或用中性氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+1。用带正电的氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+2。亲本蛋白质的净电荷还可通过缺失和/或插入带电的氨基酸来改变。

术语“热稳定的”和“热稳定”以及“热稳定性”是指蛋白酶在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他处理期间的主要条件下(同时暴露于改变的温度)，暴露于指定的温度达给定时间段后仍保持指定量的酶活性。“改变的温度”涵盖升高的或降低的温度。在一些实施例中，蛋白酶在暴露于改变的温度指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保持至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。

在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的语境中，术语“增强的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如嗜热菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移保持了更高的蛋白水解活性。

在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的语境中，术语“降低的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如嗜热菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移保持了更低的蛋白水解活性。

术语“清洁活性”是指在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他处理期间的主要条件下，变体蛋白酶或参考蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，变体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可以使用用于清洁物品或表面上的一种或多种不同的酶敏感性污渍(例如，来自食物、草、血、墨、奶、油和/或卵蛋白的污渍)的各种测定法来测定。变体或参考蛋白酶的清洁性能可通过使物品或表面上的污渍经受标准洗涤条件，并且使用各种色谱方法、分光光度方法或其他定量方法评估污渍被移除的程度来测定。示例性的清洁测定法和方法是本领域已知的，包括但不限于WO 99/34011和美国专利6,605,458(这两个专利均以引用方式并入本文)中描述的那些方法以及下文提供的实例中包括的那些清洁测定法和方法。

术语变体蛋白酶或参考蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中实现所需水平的酶活性的蛋白酶的量。此类有效量可由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，例如所用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及是需要液体组合物还是干燥(例如颗粒状、片状、条棒状)组合物等等。

术语“清洁辅助材料”是指清洁组合物中包含的除本发明的变体蛋白酶之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。每种清洁辅助材料通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、条棒、糊剂、喷雾、小片、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择。优选地，每种清洁辅助材料可与组合物中所用的蛋白酶相容。

在清洁活性的语境中，术语“增强的性能”是指酶对某些酶敏感性污渍例如蛋、奶、草、墨、油和/或血的增加的或较高的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环和/或多个洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。

在清洁活性的语境中，术语“降低的性能”是指酶对某些酶敏感性污渍例如蛋、奶、草或血的降低的或较小的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。

可如下测定清洁性能：在涉及酶敏感性污渍例如草、血、墨、油和/或奶的各种清洁测定法中，将本发明的变体蛋白酶与参考蛋白酶进行比较，如在标准洗涤循环条件后通过常用的分光光度测定或分析法来测定。

如本文所用，术语“消费品”意指织物和家庭护理产品。如本文所用，术语“织物和家庭护理产品”或“织物和家居护理产品”包括通常旨在以它们被售出时的形式使用或消费且用于处理织物、硬质表面和任何其他表面的产品；完全是用于护理和清洁无生命表面的清洁系统；织物调理剂产品和其他被特别地设计用于护理和保养织物的产品，以及空气护理产品，包括：包括空气清新剂和香味递送系统的空气护理产品、汽车护理产品、宠物护理产品、牲畜护理产品、个人护理产品、珠宝护理产品、盘碟洗涤产品、织物调理产品(包括软化和/或清新产品)、洗涤去污产品、洗涤和漂洗添加剂和/或护理产品、预处理清洁组合物，硬质表面清洁和/或处理产品包括地板和抽水马桶清洁剂、玻璃清洁剂和/或处理剂、瓷砖清洁剂和/或处理剂、陶瓷清洁剂和/或处理剂，以及其他供消费者或公共场所使用的清洁产品。在一些实施例中，织物和家庭护理产品适用于伤口和/或皮肤。“织物和家庭护理产品”包括消费品和机构产品。

如本文所用，术语“非织物和家庭护理产品”是指这样的组合物，其被添加至其他组合物中以产生可以为织物和家庭护理产品的最终产品。

如本文所用，术语“机构用清洁组合物”是指适用于机构的产品，所述机构包括但不限于学校、医院、工厂、商场、公司、建筑物、餐馆、办公楼和商厦、加工和/或制造车间、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等。

如本文所用，术语“清洁和/或处理组合物”是织物和家庭护理产品的子集，除非另外指明，该子集包括适用于清洁和/或处理物品的组合物。此类产品包括但不限于用于处理织物、硬质表面以及织物和家庭护理领域中的任何其他表面的产品，包括：空气护理产品(包括空气清新剂和香味递送系统)、汽车护理产品、盘碟洗涤产品、织物调理产品(包括软化和/或清新产品)、洗涤去污产品、洗涤和漂洗添加剂和/或护理产品、硬质表面清洁和/或处理产品包括地板和抽水马桶清洁剂、颗粒状或粉末状的通用洗涤剂或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体状、凝胶状或糊状的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类洗涤剂；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机洗盘碟洗涤剂，包括用于家居和公共场所用途的各种片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；以及清洁辅剂例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型，填充有基质的产品例如添加有干燥剂的薄片。

实际上，如本文所用，本发明的“清洁组合物”或“清洁制剂”是指任何可用于从待清洁的物体、物品或表面移除或除去化合物(例如，不需要的化合物)的本发明组合物，所述待清洁的物体、物品或表面包括但不限于(例如)织物、织物物品、盘碟物品、餐具物品、玻璃器具物品、隐形眼镜、其他固体基材、毛发(洗发剂)(包括人或动物的毛发)、皮肤(肥皂或/和霜膏)、牙齿(漱口水、牙膏)、物品或物体的表面(例如硬质表面，诸如桌子的硬质表面、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板、非盘碟物品、非餐具物品等)、过滤器、膜(例如过滤膜，包括但不限于超滤膜)等。该术语涵盖为所需清洁组合物的特定类型和产品的形式(例如液体、凝胶、颗粒、喷雾或其他组合物)选择的任何材料和/或添加的化合物，只要该组合物与用于组合物的蛋白酶和其他酶相容即可。易于通过考虑待清洁的表面、物体、物品或织物以及针对在使用期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁组合物材料。

清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于(例如)液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片状、凝胶、条状、颗粒和/或固体衣物清洁组合物或洗涤剂组合物，以及精细织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、洗衣添加剂清洁组合物和衣物预洗剂清洁组合物；盘碟洗涤组合物，包括手动或人工盘碟洗涤组合物(例如“手动”或“人工”盘碟洗涤剂)和自动盘碟洗涤组合物(例如“自动盘碟洗涤剂”)。

除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒状或粉末状的通用洗涤剂或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片状或糊状的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手动或人工盘碟洗涤剂，包括高起泡类型的那些；手动或人工盘碟洗涤剂、自动盘碟洗涤剂、或者盘碟或餐具洗涤剂，包括用于家居和公共场所用途的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车清洗剂、地毯清洗剂、浴室清洁剂；人和其他动物的洗发剂和/或毛发清洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属洗涤剂；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒状组合物为“紧凑”形式；在一些实施例中，液体组合物为“浓缩”形式。

如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于染污织物(例如衣物、亚麻布和其他纺织材料)的浸洗和/或预处理的组合物。

如本文所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织物(即，非织物)表面清洁组合物，包括但不限于(例如)手动或人工或自动的盘碟洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。

如本文所用，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组织物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指明，否则其包括颗粒状或粉末状的通用洗涤剂或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体状、凝胶状或糊状的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类洗涤剂；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机洗盘碟洗涤剂，包括用于家居和公共场所用途的各种片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；织物调理产品，包括可以为液体、固体和/或干燥剂薄片形式的软化和/或清新产品；以及清洁辅剂例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型，填充有基质的产品例如添加有干燥剂的薄片。所有此类适用的产品可以是标准、浓缩或甚至高浓缩形式，甚至浓缩到使此类产品在某些方面为非水性的程度。

如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中以便清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的这类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含至少一种本发明的变体蛋白酶，此外还包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂、和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些本发明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。

如本文所用，术语“漂白”是指以足够的时长和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增亮(即增白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的例子包括但不限于(例如)ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。

如本文所用，蛋白酶(例如本发明的变体蛋白酶)的“洗涤性能”是指变体蛋白酶对洗涤的贡献，与未向组合物中添加该变体蛋白酶的洗涤剂相比其为洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能在相关洗涤条件下进行比较。在一些测试系统中，其他相关因素(例如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)可以通过模拟某些细分市场中的家居应用(例如手动或人工盘碟洗涤、自动盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件从而进行控制。

术语“相关洗涤条件”在本文中用于指在手动盘碟洗涤、自动盘碟洗涤或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际上使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

术语“改善的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下在去污方面获得更好的最终结果，或以重量计，相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，需要较少的变体蛋白酶来获得相同的最终结果。

如本文所用，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于将本发明受限于任何特定表面、物品或待除去的污染物或微生物。

本文的清洁组合物的“紧凑”形式最好由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常占总组合物的约17重量％至约35重量％。相比之下，在紧凑型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量％，或更优选不超过约5重量％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，填料盐为硫酸钠。

在本文中，给定氨基酸序列中氨基酸残基的位置通常利用SEQ IDNO:3所示的G.caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号方式进行编号。SEQ ID NO:3示出的G.caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列因此充当参考序列。可利用如本文所述的比对算法将给定氨基酸序列(例如本文描述的变体蛋白酶氨基酸序列)与G.caldoproteolyticus序列(SEQ ID NO:3)比对，该给定氨基酸序列中与G.caldoproteolyticus序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可通过参照该嗜热菌蛋白酶G.caldoproteolyticus序列中的对应氨基酸残基便利地进行编号。

一般来讲，本文所用的命名以及下文描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学中的实验室方法中的许多方法是众所周知的，并常常为本领域一般技术人员所采用。重组核酸的产生和操纵方法、核酸合成方法、细胞培养方法以及转基因掺入(例如转染、电穿孔)方法是本领域技术人员已知的并在许多标准文献中有描述。寡核苷酸合成和纯化步骤通常根据说明书来进行。技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法以及本文通篇中提供的各种一般文献来进行。本文的程序据信是本领域普通技术人员所熟知的，并为了阅读者的便利而提供。

本发明的嗜热菌蛋白酶

如本文所用，嗜热菌蛋白酶包括表现出蛋白水解活性的酶、多肽或蛋白质，或它们的活性片段。这包括肽酶家族M4的成员，在肽酶家族M4中嗜热菌蛋白酶(TLN；EC 3.4.24.27)为原型。

嗜热菌蛋白酶的有效位置

本发明提供了可用于洗涤剂组合物的嗜热菌蛋白酶中的氨基酸位置，在所述氨基酸位置处的有利修饰导致在洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性方面，同时这些特性中至少有一项，相对于亲本嗜热菌蛋白酶的最低性能指数有所改善。这些修饰被认为是本发明的合适修饰。

可将本发明的嗜热菌蛋白酶的稳定性与标准物(例如)SEQ ID NO:3的G.caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶的稳定性比较。

术语“热稳定性”和“耐热性”是指本发明的嗜热菌蛋白酶在本文所公开的蛋白水解、水解、清洁或其他处理期间(例如当暴露于改变的温度时)常见的条件下暴露于确定的温度通常给定的时间段后保留规定量的酶活性。改变的温度包括升高的或降低的温度。在一些实施例中，变体嗜热菌蛋白酶变体在暴露于改变的温度给定的时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的嗜热菌蛋白酶活性。

如本文所用，具有改善的特性的变体嗜热菌蛋白酶包括具有相对于对应的亲本嗜热菌蛋白酶(例如野生型或天然存在的嗜热菌蛋白酶)改善的或增强的洗涤或清洁性能、和/或任选地在洗涤或清洁性能得以保留的情况下改善的或增强的稳定性的变体嗜热菌蛋白酶。变体嗜热菌蛋白酶的改善的特性可包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施例中，本发明提供表现出如下特性中的一种或多种的本发明的变体嗜热菌蛋白酶：相对于参考亲本嗜热菌蛋白酶(例如野生型嗜热菌蛋白酶，如具有SEQ ID NO:3序列的野生型嗜热菌蛋白酶)改善的手动洗涤性能、改善的手动或人工盘碟洗涤性能、改善的自动盘碟洗涤性能、改善的洗衣性能、和/或改善的稳定性。

有效位置被描述为分子内最适用于形成显示具有改善的特性的组合变体的那些位置，其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变可被描述为分子中可用于形成组合变体的那些置换。可组合突变是改善分子的至少一种所需特性，而未明显降低表达、活性或稳定性中任一者的那些突变。

可组合突变是改善分子的至少一种所需特性，而未明显降低表达、活性或稳定性中任一者的那些突变。例如，嗜热菌蛋白酶中的可组合突变可使用由实例1中所述的测定法得到的性能指数(PI)值来测定：Abz-AGLA-Nba蛋白酶测定法(活性)、PAS-38微样片测定法(活性)、洗涤剂稳定性和热稳定性测定法，以及蛋白质测定(表达)。

除可组合突变之外，嗜热菌蛋白酶的第二组突变是活性可组合突变。活性可组合突变是改善分子的至少一种活性特性(使其性能指数大于或等于1.5)、而未将表达PI值或稳定性PI值中的任一者降低到低于0.5的那些突变。这些活性可组合突变可用于修饰分子以便实现所需特性，而不显著降低分子的其他已知和所需特性(例如，表达或稳定性)。

发现为可用位置的嗜热菌蛋白酶氨基酸位置可具有适于在洗涤剂组合物中使用的不同修饰。修饰可包括在特定位置的插入、缺失或置换。在一个实施例中，修饰为置换。对于每个位置，可能的合适修饰的数量越多，导致该位置的有效性得分越高。例如，氨基酸位置的在有效位置处测试的修饰的至少75％、40％或15％可以是合适修饰，其中所述修饰满足以下适宜性标准中的至少一项：

a)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI；

b)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI；或者

c)该位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI。

所测试修饰的至少75％为合适修饰的本发明的嗜热菌蛋白酶位置包括位置2、26、47、49、53、65、87、91、96、108、118、128、154、179、196、197、198、199、209、211、217、219、225、232、256、257、259、261、265、267、272、276、277、286、289、290、293、295、298、299、300、301、303、305、308、311和316，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。合适的修饰包括2(T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M)、26(T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D)、47(R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T)、49(T,A,D,F,H,I,S,W,L,N,Q,V,E,M,Y)、53(S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L)、65(S,I,M,Q,V,L,T,W,A,D,E,P,Y)、87(V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y)、91(L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y)、96(N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y)、108(Q,C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M)、118(S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V)、128(Q,C,D,E,R,S,V,I,K,A,L,Y)、154(G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y)、179(Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F)、196(G,D,E,T,K,R,V,H,L,Y,A,W)、197(I,D,K,L,T,V,W,Y,A,H,N,E,Q,R,F,C)、198(S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K)、199(G,C,E,F,H,Q,S,T,W,L,A,Y)、209(A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M)、211(Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R)、217(Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L)、219(K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S)、225(Q,D,G,H,I,P,V,W,A,M,R,C,E,K,L,S)、232(I,C,E,F,K,M,N,Q,W,G,L,R,S,T,V,Y)、256(V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S,N)、257(G,C,D,E,L,N,P,Q,S,T,Y,K,R)、259(G,A,C,E,F,H,L,M,W,K,R,N,S,T)、261(D,A,N,P,V,W,G,H,I,S)、265(K,A,C,D,M,P,Q,S,G,I,L,R,N)、267(F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y)、272(T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K)、276(T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y)、277(P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y)、286(A,D,E,F,G,H,I,S,P,C,Q,R,T,K,L,M,N,Y)、289(V,C,E,F,G,I,N,S,W,R,T,L,M,Y,A)、290(Q,C,D,F,G,L,W,Y,R,T,V,A,H,N)、293(T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y)、295(L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W)、298(S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R)、299(T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K)、300(S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,W,A,G,T,D,N)、301(Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K)、303(V,C,H,G,K,L,R,W,A,P,Y)、305(S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M)、308(Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L)、311(D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y)、以及316(K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

所测试修饰的至少40％但不到75％为合适修饰的本发明的嗜热菌蛋白酶位置包括位置1、4、17、25、40、45、56、58、61、74、86、97、101、109、149、150、158、159、172、181、214、216、218、221、222、224、250、253、254、258、263、264、266、268、271、273、275、278、279、280、282、283、287、288、291、297、302、304、307和312，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。合适的修饰包括1(I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L)、4(T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y)、17(Q,I,W,Y,C,R,V,T,L)、25(S,D,F,A,C,K,M,R)、40(F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L)、45(K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M)、56(A,K,Q,V,W,H,I,Y,E,M)、58(A,N,Y,C,V,E,L)、61(Q,M,R,W,F,V,C,I,L)、74(H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W)、86(N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D)、97(N,K,C,R,S,Y,E,M)、101(R,T,C,L,S,H)、109(G,A,L,S,E,M,R,W)、149(T,M,V,A,L,D,S,N)、150(D,A,F,K,N,Q,T,V,S)、158(Q,A,K,M,N,L,R,Y,S)、159(N,R,W,A,C,G,M,T,S,Y)、172(F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H)、181(N,L,A,G,K,M,T,S)、214(P,C,G,K,S,N,A,R)、216(H,C,E,S,T,R,A)、218(S,K,L,Y,F,G,T,V)、221(Y,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M)、222(T,C,D,L,Y,I,V,A,M,K)、224(T,K,M,F,L,P,Q,V,Y,E,H)、250(H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y)、253(V,N,T,I,R,Y,M,Q)、254(S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W)、258(I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V)、263(L,C,I,Q,T,H,K,N,V,A,M)、264(G,C,R,A,N,P,Q,S,T)、266(I,A,F,L,S,C,M,T,V)、268(Y,M,Q,V,A,S,K)、271(L,A,D,F,I,N,Y,H)、273(Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N)、275(L,I,M,V,C,Q,S,T)、278(T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S)、279(S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G)、280(N,A,C,D,E,G,Q,H,T)、282(S,K,N,R,A,H,L,M,T)、283(Q,K,L,P,R,W,Y,S)、287(A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C)、288(A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M)、291(S,E,I,L,M,N,V,A,T)、297(G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N)、302(E,K,L,G,T,V,D,Q,A)、304(A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y)、307(K,A,C,G,I,M,N,Q,R,W,Y,H)，以及312(A,G,M,V,L,N,R,T,C)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

所测试修饰的至少15％但不到40％为合适修饰的本发明的嗜热菌蛋白酶位置包括位置5、9、11、19、27、31、33、37、46、64、73、76、79、80、85、89、95、98、99、107、127、129、131、137、141、145、148、151、152、155、156、160、161、164、168、171、176、180、182、187、188、205、206、207、210、212、213、220、227、234、235、236、237、242、244、246、248、249、252、255、270、274、284、294、296、306、309、310、313、314和315，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。合适的修饰包括5(S,D,N,P,H,L)、9(V,L,T,I)、11(R,I,Y,K)、19(N,L,Y,K,S)、27(Y,W,A,M,V,C,L)、31(Q,A,K,V,I,C,Y)、33(N,S,T,K,A,C,L,M)、37(N,D,Q,R,L,K)、46(Y,L,H,N,C)、64(A,H,Q,T,D,E)、73(A,I,F,L,M,W)、76(Y,H,L,M,Q,T)、79(V,L,Q,T,A,N,S)、80(T,I,D,A,L,N)、85(K,E,A,L,N,R,S)、89(N,L,M,H)、95(G,A,D,H,M,N,S)、98(A,C,E,H,R,Y,K,V)、99(A,E,K,P,R,S)、107(S,D,K,Y,A,G)、127(G,C,D,E)、129(T,I,R,E,Y,L,M)、131(I,Y,W,L)、137(I,P,A,E,T,V,L)、141(A,S,C,G)、145(T,A,C,E,G,M,N,Q)、148(V,L,N,Y,M,A,Q)、151(Y,K,G,H,S,W)、152(T,S,L,M,G)、155(L,C,I,M)、156(I,M,T,L,Q)、160(E,L,Y,Q)、161(S,A,N,P,T)、164(I,L,N,S,T,V,C,A)、168(I,A,M,T,L)、171(I,C,E,F,L,S,G)、176(V,L,N,C)、180(A,E,G,K,T,S)、182(K,L,A,W)、187(E,L,D)、188(I,L,V)、205(M,L,A,V,Q)、206(S,A,C,K,L,M,R)、207(D,A,H,N)、210(K,I,L,V)、212(G,Y,A,D,Q)、213(D,N,S,L,A,G,W)、220(R,K,V,A)、227(N,D,L,Y,A)、234(S,D,N,A,C)、235(G,M,C,Q,S,A)、236(I,M,A,C)、237(I,N,F,M)、242(Y,C,F,N,V)、244(I,T,V,F,A,M,L)、246(Q,E,N,T,L,C,D)、248(G,A,E,S)、249(T,K,M,N,L,Y,P)、252(G,K,Y,A,S,T,W)、255(V,L,P,A,Y,M,N)、270(A,C,F,I,L,S,G)、274(Y,F,H,A,C,Q,T,M)、284(L,V,W,A,M,Y)、294(D,A,V,Q,N)、296(Y,N,L,R,H,W,M)、306(V,A,S,F,I,L,T)、309(A,G,S,T,V,C)、310(F,A,C,W,M)、313(V,T,A,G,L,I,C)、314(G,A,E,H,M,S,W,Q)，以及315(V,A,C,I,M,L,T)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

所测试修饰的至少一个修饰但不到15％为合适修饰的本发明的嗜热菌蛋白酶位置包括位置3、6、7、20、23、24、44、48、50、57、63、72、75、81、92、93、94、100、102、103、104、110、117、120、134、135、136、140、144、153、173、174、175、178、183、185、189、193、201、223、230、238、239、241、247、251、260、262、269和285，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。合适的修饰包括3(G,Y)、6(T,C,V)、7(V,L,I)、20(I,L,V)、23(T,F,W)、24(Y,W)、44(A,C)、48(T,E,D)、50(L,P)、57(D,K)、63(F,Y,C)、72(D,F,W)、75(Y,A)、81(Y,F)、92(S,L)、93(Y,T,C)、94(D,T)、100(I,L,V)、102(S,G,N)、103(S,T)、104(V,A)、110(Y,L)、117(G,H)、120(M,L)、134(S,A,P)、135(G,A)、136(G,A,S)、140(V,D)、144(L,T)、153(A,T)、173(G,A,C)、174(T,C,A)、175(L,H,S)、178(F,H,Y)、183(N,S)、185(D,E)、189(G,A)、193(Y,F)、201(S,C,A)、223(G,D,K)、230(V,A)、238(N,L,M)、239(K,A)、241(A,L,S)、247(G,A,S)、251(Y,M)、260(R,A,N)、262(K,A)、269(R,V,K)，以及285(R,K,Y)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

这些氨基酸位置可被认为是对亲本嗜热菌蛋白酶的组合修饰的有用位置。因此，本发明包括在任何上述位置处具有一个或多个修饰的嗜热菌蛋白酶。合适的修饰包括1(I,V)、2(T,C,I,M,P,Q,V)、127(G,C)、128(Q,C,E,F,I,L,V,Y)、180(A,E,N)、181(N,A,G,Q,S)、196(G,L,Y)、197(I,F)、198(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y)、211(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W)、224(T,D,H,Y)、298(S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y)、299(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W)，以及316(K,A,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

嗜热菌蛋白酶的合适修饰

本发明包括具有对亲本嗜热菌蛋白酶的一个或多个修饰的嗜热菌蛋白酶的酶变体。由于所述酶变体在洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性方面，同时这些特性中至少有一项，相对于亲本嗜热菌蛋白酶的最低性能指数有所改善，故可用于洗涤剂组合物中。

使洗涤剂稳定性或热稳定性相比亲本嗜热菌蛋白酶改善的本发明的嗜热菌蛋白酶位置包括位置1、2、127、128、180、181、195、196、197、198、199、211、223、224、298、299、300和316，并且其中所述修饰所处的位置具有的温度系数高于观察到的SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

嗜热菌蛋白酶的稳定变体可包括在具有增大的温度系数的位置处的修饰，其中温度系数以结晶温度系数为基础，所述结晶温度系数是大分子的各个原子的相对运动的量度。温度系数作为结晶模型精化的产物出现，使得作为晶体X射线衍射最大值的各个强度给出的计算的衍射图案与观察到的图案最佳地匹配。温度系数可细化为衰减系数，用于反映运动较剧烈的原子将随散射角(θ)的变化对整体大分子聚集体衍射具有减弱的效果，采用的形式为–exp(-Bsin²θ/λ)，其中B是温度系数(Blundell,T.L.and Johnson L.N.,Protein Crystallography,Academic Press,1976,pp121(Blundell,T.L.和Johnson L.N.，《蛋白质晶体学》，学术出版社，1976年，第121页))。可能的是，整体移动性较高的区域也可能代表折叠的大分子在那里不够稳定的点，因此可能是当分子受到升高的温度或变性剂胁迫时解折叠在那里开始的点。进一步预期到，整体移动性较高的这些区域会是平均温度系数最高的区域。

被计算为嗜热菌蛋白酶的共有柔性区域的区域包括区域1-2、127-128、180-181、195-199、211、223-224、298-300和316。可使用这些区域中的每一个来修饰嗜热菌蛋白酶，以便要么实现热稳定性、要么实现改善的洗涤性能。通过修饰具有高温度系数的位置(高柔性区域)赋予热稳定性或改善的洗涤性能的可组合变体包括位置1、2、127、128、180、181、196、197、198、211、224、298、299和316。合适的修饰包括1(I,V)、2(T,C,I,M,P,Q,V)、127(G,C)、128(Q,C,E,F,I,L,V,Y)、180(A,E,N)、181(N,A,G,Q,S)、196(G,L,Y)、197(I,F)、198(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y)、211(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W)、224(T,D,H,Y)、298(S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y)、299(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W)和316(K,A,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

活性可组合突变

除可组合突变之外，嗜热菌蛋白酶的第二组突变是活性可组合突变。活性可组合突变是在pH6或pH8下的PAS-38微样片清洁能力、对Abz-AGLA-Nba的活性大于或等于1.5，而未将洗涤剂稳定性或热稳定性PI值降低到低于0.5的那些突变。活性可组合突变位置包括选自17、19、24、25、31、33、40、48、73、79、80、81、85、86、89、94、109、117、140、141、150、151、152、153、156、158、159、160、161、168、171、174、175、176、178、180、181、182、183、189、205、206、207、210、212、213、214、218、223、224、227、235、236、237、238、239、241、244、246、248、249、250、251、252、253、254、255、258、259、260、261、262、266、268、269、270、271、272、273、274、276、278、279、280、282、283、294、295、296、297、300、302、306、310和312的位置，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。活性可组合突变包括17(E,F,P)、19(A,D,H,I,R,T,V)、24(F,H)、25(H)、31(L)、33(Q)、40(C)、48(A,R)、73(Y)、79(C)、80(C,R)、81(H)、85(C,M,Y)、86(V)、89(K,R,T,V)、94(E)、109(D)、117(A,K,R,T)、140(S)、141(T)、150(E,M,W)、151(A,C,E,I)、152(D)、153(V)、156(H,R)、158(F,G,I,V)、159(F,I,K)、160(S)、161(Y)、168(N)、171(D)、174(S,V)、175(C,E,F,G,I)、176(E,Q)、178(C,M)、180(L,W)、181(Y)、182(F,R)、183(H,I,L,M,Q,R,T)、189(C)、205(C,F)、206(F,H,I,T,V,Y)、207(T)、210(A,E,F,G,H,T)、212(F,H,K,M,N,R,S,T)、213(I,K,R,V,Y)、214(Q)、218(R)、223(Y)、224(I,R)、227(C,E,G,K,Q,R,S,T,V)、235(D,L,T)、236(P)、237(A,Q)、238(A,C,D,E,R,S)、239(C,G,H,L,Q,R,S,V,Y)、241(E,F,G,I,T,V)、244(Q)、246(K,R)、248(C,H)、249(G,V)、250(F,S)、251(H)、252(F,I,L)、253(A,D,E,P)、254(C,F,G,H,I,P)、255(F,Q)、258(F)、259(I)、260(C,D,I)、261(K,R,T)、262(C,F,H,L,P,R)、266(W)、268(F,R)、269(P,T,W,Y)、270(M,N,P,V)、271(V)、272(R)、273(R)、274(D,E)、276(G,S)、278(V)、279(E)、280(P,R,V)、282(P)、283(A,C,E,G,H,T,V)、294(T)、295(R)、296(E,I)、297(I,V)、300(Q)、302(W)、306(Y)、310(I,N)，以及312(Q)，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

本发明的多肽

本发明提供新型多肽，它们可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体嗜热菌蛋白酶多肽，包括(例如)具有酶活性(如嗜热菌蛋白酶活性)的变体嗜热菌蛋白酶多肽。在一些实施例中，本发明的多肽可用于清洁应用，并且可掺入到可在清洁需要进行清洁的物品或表面(例如物品的表面)的方法中使用的清洁组合物中。

在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是来自芽孢杆菌属或地芽孢杆菌属的亲本嗜热菌蛋白酶的变体。已在芽孢杆菌属或地芽孢杆菌属中发现了各种嗜热菌蛋白酶，这些嗜热菌蛋白酶彼此具有很高的同一性，且与SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶具有很高的同一性。参见(例如)实例4的表4.1和图4.1。在其他实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是来自表4.2中列出的任何属的亲本嗜热菌蛋白酶的变体，所述属包括选自以下的属：芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属、乳杆菌属、微小杆菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、滑柱菌属、海洋芽孢杆菌属、希瓦氏菌属、梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属、黄杆菌属、标桩菌属、粘球菌属、弧菌属、甲烷八叠球菌属、金黄杆菌属、链霉菌属、克里贝拉菌属、两面神菌属、类诺卡氏菌属、黄单胞菌属、小单孢菌属、伯克霍尔德菌属、脱卤拟球菌属、Croceibacter、科迪亚菌属、微颤菌属、高温放线菌属、绿屈挠菌属、李斯特氏菌属、邻囊菌属、束缚杆菌属、噬细胞菌属、河氏菌属、节杆菌属、短状杆菌属、棒形杆菌属、微杆菌属、间孢囊菌属、弗兰克氏菌属、亚栖热菌属、假单胞菌属、蓖麻属、细链孢菌属、鱼腥藻属、念珠藻属、盐单胞菌属、色盐杆菌属、博德特氏杆菌属、贪噬菌属、狄克氏菌属、果胶杆菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、泛菌属、拉恩氏菌属、沙雷氏菌属、地嗜皮菌属、出芽菌属、致病杆菌属、光杆菌属、曲霉属、新萨托菌属、核腔菌属、糖多孢菌属、丛赤壳属、赤霉菌属、绿僵菌属、华诊体属、蓝丝菌属、噬纤维菌属、普罗威登斯菌属、慢生根瘤菌属、土壤杆菌属、产冻胶菌属、沙雷氏菌属、堆囊菌属、链孢囊菌属、肾杆菌属、气单胞菌属、海藻分解菌属、色杆菌属、莫里特拉菌属、嗜盐囊菌属、康氏菌属、海单胞菌属、弧菌目、利斯顿氏菌属、盐弧菌属、发光杆菌属、交替单胞菌目、军团菌属、船蛆杆菌、海藻分解菌属、Hydrogenivirga和假交替单胞菌属。在多个实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是来自表4.1或4.2中所述的任何物种的亲本嗜热菌蛋白酶的变体。在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是选自以下的属的亲本嗜热菌蛋白酶的变体：芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属、乳杆菌属、微小杆菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、滑柱菌属、海洋芽孢杆菌属、希瓦氏菌属、梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属、黄杆菌属、标桩菌属、粘球菌属、弧菌属、甲烷八叠球菌属、金黄杆菌属和假交替单胞菌属。

在一些实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是与来自芽孢杆菌属或地芽孢杆菌属的嗜热菌蛋白酶具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的变体。在多个实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是与来自表4.1中的任何属的嗜热菌蛋白酶具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的变体。在多个实施例中，嗜热菌蛋白酶变体可以是与来自表4.2中的任何属的嗜热菌蛋白酶具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的变体。

在具体实施例中，本发明为源自芽孢杆菌属或地芽孢杆菌属的酶。在具体实施例中，本发明为衍生自来自Geobacillus caldoproteolyticus菌种的嗜热菌蛋白酶的酶。

描述了与从Geobacillus caldoproteolyticus克隆的嗜热菌蛋白酶相关的组合物和方法。所述组合物和方法部分地基于以下观察结果：克隆并表达的嗜热菌蛋白酶在存在洗涤剂组合物的情况下具有蛋白水解活性。嗜热菌蛋白酶还在洗涤剂组合物中显示出极佳的稳定性。嗜热菌蛋白酶的这些特征使其特别适用于多种清洁应用，在这些应用中所述酶可在存在于洗涤剂组合物中的表面活性剂和其他组分的存在下将蛋白质水解。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供了变体嗜热菌蛋白酶多肽。亲本嗜热菌蛋白酶多肽从(SEQ ID NO:4)分离。成熟嗜热菌蛋白酶多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:3。类似地，实质上相同的嗜热菌蛋白酶多肽可存在于自然界中，例如存在于G.caldoproteolyticus的其他菌株或分离株中。本发明的组合物和方法涵盖这些和其他重组嗜热菌蛋白酶多肽。

在一些实施例中，本发明包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有嗜热菌蛋白酶活性的变体嗜热菌蛋白酶，其多肽包含与本文提供的亲本嗜热菌蛋白酶具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多肽序列。

在一些实施例中，变体多肽是与举例说明的嗜热菌蛋白酶多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如与SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的序列同源性的变体。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)通过氨基酸序列比对来测定。

还提供了分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的编码具有嗜热菌蛋白酶活性的变体嗜热菌蛋白酶的序列，所述变体嗜热菌蛋白酶(例如变体嗜热菌蛋白酶)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列，其中该变体嗜热菌蛋白酶的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号方式来进行编号，这是通过该变体嗜热菌蛋白酶氨基酸序列与Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列的比对来确定的。

如上所述，本发明的变体嗜热菌蛋白酶多肽具有酶活性(例如嗜热菌蛋白酶活性)并因此可用于清洁应用，包括但不限于用于清洁盘碟物品、餐具物品、织物和具有硬质表面的物品(例如桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。包含一种或多种本发明的变体嗜热菌蛋白酶多肽的示例性清洁组合物在下文中进行描述。本发明的变体嗜热菌蛋白酶多肽的酶活性(例如嗜热菌蛋白酶活性)可使用本领域普通技术人员熟知的程序容易地测定。下文提供的实例描述了用于评价酶活性、清洁性能、洗涤剂稳定性和/或热稳定性的方法。本发明的变体嗜热菌蛋白酶在移除污渍(例如脂质污渍)、清洁硬质表面或清洁衣物、盘碟或餐具物品方面的性能可使用本领域熟知的程序和/或通过使用实例部分中示出的程序容易地测定。

可对本发明的多肽进行多种改变，如一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或置换(保守的或非保守的置换)，包括其中这类改变不会实质上改变该多肽的酶活性的情况。类似地，也可对本发明的核酸作出各种变化，如在一个或多个密码子中对一个或多个核酸进行一种或多种置换使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(如核苷酸序列中的突变导致氨基酸序列中的沉默突变，例如当所编码的氨基酸未因该核酸突变而改变时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种添加或插入；和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的切除或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种截短。与原始核酸序列编码的变体嗜热菌蛋白酶相比，核酸序列中的许多此类变化可能不会实质上改变所得的编码的变体嗜热菌蛋白酶的酶活性。还可对本发明的核酸进行修饰以包括一个或多个使得能在表达系统(如细菌表达系统)中进行最佳表达的密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同氨基酸。

在一些实施例中，本发明提供这样一类多肽，其包括具有所需酶活性(例如，嗜热菌蛋白酶活性或清洁性能活性)的变体嗜热菌蛋白酶多肽，所述变体嗜热菌蛋白酶多肽包含具有本文所述的氨基酸置换的序列，并且还包含一个或多个另外的氨基酸置换，例如保守和非保守置换，其中多肽表现出、保持、或大致保持所需的酶活性(例如，嗜热菌蛋白酶活性或蛋白水解活性，如该变体嗜热菌蛋白酶的清洁活性或性能所反映的)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基中的成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分数时相同氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能相似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸是功能相似的，因而可充当彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可充当彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可充当彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换。

可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可通过相似的功能或化学结构或组成对氨基酸进行分组(例如酸性、碱性、脂族、芳族、含硫氨基酸)。例如，脂族组可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有可视为彼此保守置换的氨基酸的其他组包括：芳族组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫组：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电荷的残基的组：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P)；亲水性不带电荷的残基的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组方式是本领域技术人员所熟知的并在各种标准教科书中有描述。本文的多肽序列的列表，结合上文的置换组，提供了所有经保守置换的多肽序列的明确列表。

在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，其也可以是合适的或者其作为另一种选择可以是合适的。用于更保守的置换的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

本发明的多肽序列(例如，本发明的变体蛋白酶)的保守置换变异包括用相同保守置换组的保守选择氨基酸置换该多肽序列的少部分的，有时不到25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％的氨基酸，或该多肽序列的不到5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸，或对该多肽序列的氨基酸执行不到10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸置换。

如本文其他地方更详细描述的以及本文提供的实例部分中描述的，本发明的多肽可具有可与已知蛋白酶(包括已知金属蛋白酶)相当的清洁能力。

在一些实施例中，蛋白酶变体包含一个或多个突变，并且相对于Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)具有-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4或5的总净电荷。

在一些实施例中，上述高离子强度嗜热菌蛋白酶变体构成洗涤剂组合物的一部分，将该洗涤剂组合物稀释于水中，通常是洗衣机内的水中，以形成衣物洗涤剂洗涤液，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。

嗜热菌蛋白酶变体的电荷是相对于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶野生型来表示的。赋予单个负电荷的氨基酸为D和E，赋予单个正电荷的那些氨基酸为R、H和K。任何相对于SEQ ID NO:2可改变电荷的氨基酸变化均可用于计算嗜热菌蛋白酶变体的电荷。例如，从野生型中性位置引入负电荷突变将给嗜热菌蛋白酶变体添加净电荷-1，而从野生型正电荷氨基酸残基(R、H或K)引入负电荷突变(D或E)将添加净电荷-2。将嗜热菌蛋白酶变体的相对于具有SEQID NO:3的氨基酸序列的Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶野生型而言不同的所有氨基酸残基的电荷变化进行加和，得到了嗜热菌蛋白酶变体的电荷变化。通过正确选择电荷，可获得水平得到出乎意料的改善的嗜热菌蛋白酶清洁性能。“低电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm、或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm的电导率。“高电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm的电导率。意图是上述例子为非限制性的。一旦将突变进行组合以优化嗜热菌蛋白酶性能，还可以通过在另外的位置的突变来平衡酶电荷。

在一些实施例中，本发明提供了分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶(例如变体嗜热菌蛋白酶)，所述变体蛋白酶包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相差不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、或不超过8个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号方式来进行编号，这是通过该变体蛋白酶氨基酸序列与Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列的比对来确定的。

在一些实施例中，本发明提供了分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶(例如变体嗜热菌蛋白酶)，所述变体蛋白酶包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相差不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置根据SEQ IDNO:3示出的Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号方式来进行编号，这是通过该变体蛋白酶氨基酸序列与Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列的比对来确定的。

本发明的核酸

本发明提供分离的、非天然存在的、或重组的核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”，其编码本发明的多肽。本发明的核酸(包括下文所述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(如表达)，通常是通过表达包含编码目的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上面所论述，多肽包括变体蛋白酶多肽，包括具有酶活性(如蛋白水解活性)的变体嗜热菌蛋白酶多肽在内，其可用于清洁应用和清洁组合物，以供清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)。

在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码在以上题为“本发明的多肽”的章节中以及本文其他地方描述的任何本发明多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离、重组、实质上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码本发明上述和本文其他地方所述的任何多肽中两种或更多种的组合的核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明包括编码分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有嗜热菌蛋白酶活性的变体嗜热菌蛋白酶的多核苷酸，所述变体嗜热菌蛋白酶的多肽包含与本文提供的亲本嗜热菌蛋白酶具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％的序列同一性的多肽序列。

在一些实施例中，变体多肽是与举例说明的嗜热菌蛋白酶多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如与SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的序列同源性的变体。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文所述)，通过氨基酸序列比对来测定。

还提供了分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码具有蛋白水解活性的变体蛋白酶的多核苷酸序列，所述变体蛋白酶(例如变体嗜热菌蛋白酶)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列，其中变体嗜热菌蛋白酶的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号方式来进行编号，这是通过该变体蛋白酶氨基酸序列与Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列的比对来确定的。

本发明提供了编码地芽孢杆菌属或芽孢杆菌属嗜热菌蛋白酶的嗜热菌蛋白酶变体的核酸，其中所述嗜热菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并包含含有本说明书通篇列出的氨基酸置换的组合的氨基酸序列，其中嗜热菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的Geobacilluscaldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

本发明的核酸可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或这些技术的组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可用标准的核酸合成技术，如本领域技术人员所熟知的固相合成技术来制备。在这类技术中，通常合成多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(如通过酶连接方法或化学连接方法，或者聚合酶介导的重组方法连接)以形成基本上任何所需的连续核酸序列。还可通过本领域已知的任何合适的方法，包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage et al.Tetrahedron Letters22:1859-69[1981](Beaucage等人，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页，1981年))；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes et al.,EMBO J.3:801-805[1984](Matthes等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第801-805页，1984年))描述的方法(其为自动合成方法中通常采用的)进行化学合成，来促进(或者说完成)本发明核酸的合成。本发明的核酸也可以通过使用自动DNA合成仪来制备。定制的核酸可从多个商业来源订购(例如米德兰认证试剂公司(Midland Certified ReagentCompany)、大美洲基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术有限公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0公司(DNA2.0))。其他合成核酸的技术和相关原理是本领域已知的(参见例如Itakura et al.,Ann.Rev.Biochem.53:323[1984](Itakura等人，《生物化学年鉴》，第53卷，第323页，1984年)；和Itakura et al.,Science 198:1056[1984](Itakura等人，《科学》，第198卷，第1056页，1984年))。

如上文所指出的，可用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域所熟知的。例如，诸如限制性内切酶消化、连接、逆转录和cDNA产生以及聚合酶链反应(例如PCR)的技术是已知的并且易于被本领域的技术人员采用。本发明的核苷酸还可以通过使用一种或多种可与编码本发明的变体蛋白酶多肽的多核苷酸杂交或使之PCR扩增的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库(例如，使用本领域通常使用的诱变技术(包括本文所述的那些)产生的cDNA文库)而获得。筛选和分离cDNA克隆的程序和PCR扩增程序是本领域技术人员所熟知的，并在本领域技术人员已知的标准参考文献中描述。本发明的一些核酸可通过利用例如已知的诱变程序(例如定点诱变、点饱和诱变以及体外重组)来改变天然存在的多核苷酸骨架(例如编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸骨架)来获得。

本发明的经修饰的变体蛋白酶的制备方法

多种适用于产生编码本发明变体蛋白酶的本发明经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，包括但不限于例如点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。制备经修饰的多核苷酸和蛋白质(例如变体蛋白酶)的方法包括DNA改组方法，基于基因的非同源重组的方法，诸如ITCHY(参见Ostermeier et al.,7:2139-44[1999](Ostermeier等人，第7卷，第2139-2144页，1999年))、SCRACHY(参见Lutz et al.98:11248-53[2001](Lutz等人，第98卷，第11248页-11253页，2001年))、SHIPREC(参见Sieber et al.,19:456-60[2001](Sieber等人，第19卷，第456-460页，2001年))和NRR(参见Bittker et al.,20:1024-9[2001](Bittker等人，第20卷，第1024-1029页，2001年)；Bittker et al.,101:7011-6[2004](Bittker等人，第101卷，第7011-7016页，2004年))，以及依赖于使用寡核苷酸来插入随机和定向突变、缺失和/或插入的方法(参见Ness et al.,20:1251-5[2002](Ness等人，第20卷，第1251-1255页，2002年)；Coco et al.,20:1246-50[2002](Coco等人，第20卷，第1246-1250页，2002年)；Zha et al.,4:34-9[2003](Zha等人，第4卷，第34-39页，2003年)；Glaser et al.,149:3903-13(Glaser等人，第149卷，第3903-3913页))。

用于产生本发明的变体蛋白酶的载体、细胞和方法

本发明提供分离的或重组的包含至少一种本文所述的本发明多核苷酸(例如，编码本文所述的本发明变体蛋白酶的多核苷酸)的载体；分离的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒；分离的、实质上纯的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的DNA构建体；分离的或重组的包含至少一种本发明的多核苷酸的细胞；包含细胞的细胞培养物，该细胞包含至少一种本发明的多核苷酸；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的细胞培养物；和包含一种或多种此类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或它们的任何组合或混合物的组合物。

在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的载体(如表达载体或DNA构建体)的重组细胞，所述载体包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸。一些这类重组细胞转化有或转染有所述至少一种载体。这类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属物种细胞，诸如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含至少一种本发明的变体蛋白酶的重组细胞(例如重组宿主细胞)。

在一些实施例中，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体或表达盒，其中编码本发明变体蛋白酶的本发明多核苷酸序列有效连接至一个或多个为进行有效基因表达所需的核酸区段(例如与编码本发明变体蛋白酶的本发明多核苷酸有效连接的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗生素抗性基因，该抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中生长而对质粒感染的宿主细胞进行连续的培养维持。

表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或在另选的实施例中，含有这二者的元件。示例性的载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood and Cutting[eds.],Chapter 3,Molecular BiologicalMethods for Bacillus,John Wiley&Sons[1990](Harwood和Cutting编辑，《芽孢杆菌属的分子生物学方法》，第3章，约翰·威利父子出版公司，1990年)；适于枯草芽孢杆菌的复制型质粒包括第92页列出的那些；还可参见Perego,Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis,in Sonenshein et al.,[eds.]Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics,American Society forMicrobiology,Washington,D.C.[1993],pp.615-624(Perego，“用于在枯草芽孢杆菌中进行遗传操纵的整合载体”，载于Sonenshein等人编辑的《枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学》，美国微生物学学会，华盛顿哥伦比亚特区，1993年，第615-624页))。

为了在细胞中表达和产生目的蛋白质(例如变体蛋白酶)，将至少一个包含至少一个拷贝(优选包含多个拷贝)的编码经修饰的蛋白酶的多核苷酸的表达载体在适于表达该蛋白酶的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施例中，将编码变体蛋白酶的多核苷酸序列(以及载体中包含的其他序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其他实施例中，将包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明同时提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的输入核苷酸序列。本文所述的载体可用于产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，编码变体蛋白酶的多核苷酸构建体存在于整合型载体上，该整合型载体使得编码变体蛋白酶的多核苷酸能整合以及任选地扩增进细菌染色体中。整合位点的例子是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子对所选择的前体蛋白酶而言是野生型启动子。在一些其他实施例中，尽管启动子对于前体蛋白酶而言是异源的，但其在宿主细胞中是有功能的。具体而言，适用于细菌宿主细胞中的启动子的例子包括但不限于(例如)amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌(B.pumilis)木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子以及噬菌体λP_R或P_L启动子，和大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。

本发明的变体蛋白酶可在任何合适的革兰氏阳性微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。例如，在一些实施例中，变体蛋白酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种、埃希杆菌属(Escherichia)物种或曲霉属(Aspergillus)物种。在一些实施例中，变体蛋白酶通过芽孢杆菌属物种宿主细胞来产生。可用于产生本发明变体蛋白酶的芽孢杆菌属物种宿主细胞的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，使用枯草芽孢杆菌宿主细胞来产生变体蛋白酶。美国专利5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了各种可用于产生本发明变体蛋白酶的芽孢杆菌属宿主菌株，但可以使用其他合适的菌株。

可用于产生本发明变体蛋白酶的多种工业细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属物种菌株，以及天然存在的菌株的变体和/或重组菌株。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码目的多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，其包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT110和PEP 211菌株(参见例如Hoch et al.,Genetics 73:215–228[1973](Hoch等人，《遗传学》，第73卷，第215-228页，1973年)；还可参见美国专利No.4,450,235和4,302,544，以及EP 0134048，这些专利的每一者全文以引用方式并入)。枯草芽孢杆菌用作表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如Palva et al.,Gene 19:81-87[1982](Palva等人，《基因》，第19卷，第81-87页，1982年)；Fahnestock and Fischer,J.Bacteriol.,165:796–804[1986](Fahnestock和Fischer，《细菌学杂志》，第165卷，第796-804页，1986年)；和Wang et al.,Gene 69:39–47[1988](Wang等人，《基因》，第69卷，第39-47页，1988年))。

在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是在如下基因中的至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。优选地，突变在degU基因中，并且更优选地，突变为degU(Hy)32(参见例如Msadek et al.,J.Bacteriol.172:824-834[1990](Msadek等人，《细菌学杂志》，第172卷，第824-834页，1990年)；和Olmos et al.,Mol.Gen.Genet.253:562–567[1997](Olmos等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第253卷，第562-567页，1997年))。一种合适的宿主菌株为携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主包含在如下基因中的突变或缺失：scoC4(参见例如Caldwell et al.,J.Bacteriol.183:7329-7340[2001](Caldwell等人，《细菌学杂志》，第183卷，第7329-7340页，2001年))；spoIIE(参见例如Arigoni et al.,Mol.Microbiol.31:1407-1415[1999](Arigoni等人，《分子微生物学》，第31卷，第1407-1415页，1999年))；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如Perego et al.,Mol.Microbiol.5:173-185[1991](Perego等人，《分子微生物学》，第5卷，第173-185页，1991年))。实际上，设想到opp操纵子中的任何导致与oppA基因中的突变相同的表型的突变均将可用于本发明的改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独地出现，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可用于产生本发明的变体蛋白酶的改变的芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已在上述基因中的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌属物种宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如美国专利申请公开No.2005/0202535，该专利以引用方式并入本文)。

使用任何合适的本领域已知的方法用至少一条编码至少一种本发明变体蛋白酶的核酸转化宿主细胞。无论是将核酸整合进载体中还是在不存在质粒DNA的情况下使用核酸，通常将其引入微生物中，在一些实施例中，优选引入大肠杆菌细胞或感受态芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并且将此类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞中来将核酸(如DNA)引入此类细胞中的方法是所熟知的。在一些实施例中，随后从大肠杆菌细胞分离该质粒并且转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用例如大肠杆菌的中间微生物不是必需的，在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌宿主中。

本领域的技术人员充分了解适于将本发明的核酸或多核苷酸序列引入芽孢杆菌属细胞中的方法(参见例如Ferrari et al.，“Genetics，”inHarwood et al.[eds.],Bacillus,Plenum Publishing Corp.[1989],pp.57-72(Ferrari等人的“遗传学”，载于Harwood等人编辑的《芽孢杆菌》中，普莱南出版公司1989年出版，第57-72页)；Saunders et al.,J.Bacteriol.157:718-726[1984](Saunders等人，《细菌学杂志》，第157卷，第718-726页，1984年)；Hoch et al.,J.Bacteriol.93:1925-1937[1967](Hoch等人，《细菌学杂志》，第93卷，第1925-1937页，1967年)；Mann et al.,Current Microbiol.13:131-135[1986](Mann等人，《当代微生物学》，第13卷，第131-135页，1986年)；Holubova,Folia Microbiol.30:97[1985](Holubova，《叶面微生物》，第30卷，第97页，1985年)；Chang etal.,Mol.Gen.Genet.168:11-115[1979](Chang等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第168卷，第11-115页，1979年)；Vorobjeva et al.,FEMSMicrobiol.Lett.7:261-263[1980](Vorobjeva等人，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第7卷，第261-263页，1980年)；Smith et al.,Appl.Env.Microbiol.51:634[1986](Smith等人，《应用与环境微生物学》，第51卷，第634页，1986年)；Fisher et al.,Arch.Microbiol.139:213-217[1981](Fisher等人，《微生物学档案》，第139卷，第213-217页，1981年)；以及McDonald,J.Gen.Microbiol.130:203[1984](McDonald,J.，《普通微生物学杂志》，第130卷，第203页，1984年))。实际上，诸如转化(包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导和原生质体融合)之类的方法是众所周知的并且适用于本发明。使用转化方法将包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括诸如质粒标记补救转化的方法，质粒标记补救转化涉及携带部分同源的内生质粒的感受态细胞摄入供体质粒(参见Contente et al.,Plasmid 2:555-571[1979](Contente等人，《质粒》，第2卷，第555-571页，1979年)；Haima et al.,Mol.Gen.Genet.223:185-191[1990](Haima等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第223卷，第185-191页，1990年)；Weinrauch et al.,J.Bacteriol.154:1077-1087[1983](Weinrauch等人，《细菌学杂志》，第154卷，第1077-1087页，1983年)；和Weinrauch et al.,J.Bacteriol.169:1205-1211[1987](Weinrauch等人，《细菌学杂志》，第169卷，第1205-1211页，1987年))。在该方法中，输入的供体质粒与内生的“辅助”质粒的同源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。

除通常使用的方法外，在一些实施例中，将宿主细胞直接用包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体转化(即在引入宿主细胞之前，未使用中间细胞来扩增该DNA构建体或载体，或未对该DNA构建体或载体以别的方式处理)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的那些在不插入质粒或载体的情况下将核酸序列(如DNA序列)引入宿主细胞中的物理和化学方法。这类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的实施例中，将DNA构建体或载体与质粒共同转化，而不插入质粒中。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法从已改变的芽孢杆菌属菌株缺失掉选择标记(参见Stahl et al.,J.Bacteriol.158:411-418[1984](Stahl等人，《细菌学杂志》，第158卷，第411-418页，1984年)；和Palmeros et al.,Gene247:255-264[2000](Palmeros等人，《基因》，第247卷，第255-264页，2000年))。

在一些实施例中，将本发明的转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且在科学文献中很好地进行了描述。在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的变体蛋白酶或至少一种本发明的核酸的培养物(例如细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA构建体的组合物。

在一些实施例中，将用至少一条编码至少一种本发明变体蛋白酶的多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明蛋白酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，此后从该培养物回收所得的蛋白酶。用于培养细胞的培养基包含任何适于生长宿主细胞的常规培养基，如含有适当的补充成分的基本培养基和复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方(参见例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的目录中公布的配方)制备。在一些实施例中，通过常规的程序从培养基回收由细胞产生的蛋白酶，包括但不限于(例如)通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞，借助于盐(例如硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质组分，进行色谱纯化(例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等)。任何适于回收或纯化变体蛋白酶的方法均可用于本发明。

在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的变体蛋白酶分泌进培养基中。编码利于纯化的结构域的核酸序列可用来方便可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的载体或DNA构建体还可包含编码利于纯化的结构域的核酸序列，以利于纯化变体蛋白酶(参见例如Kroll et al.,DNA Cell Biol.12:441-53[1993](Kroll等人，《DNA细胞生物学》，第12卷，第441-453页，1993年))。此类利于纯化的结构域包括但不限于，例如金属螯合肽，如使得可以在固定化金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath,Protein Expr.Purif.3:263-281[1992](Porath，《蛋白质表达和纯化》，第3卷，第263-281页，1992年))，使得可以在固定化免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(如得自美国华盛顿州西雅图英姆纳克斯公司(Immunex Corp.,Seattle,WA)的蛋白A结构域)。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可裂解的接头序列例如XA因子或肠激酶(如得自美国加利福尼亚州圣地亚哥英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA)的序列)也可用于利于纯化。

用于检测和测量酶(例如本发明的变体蛋白酶)的酶活性的测定法是熟知的。各种用于检测和测量蛋白酶(例如本发明的变体蛋白酶)活性的测定法也是本领域的普通技术人员已知的。具体地讲，可用于测量蛋白酶活性的测定法有基于酸可溶性肽从酪蛋白或血红蛋白的释放，以280nm处的吸光度进行测量或使用本领域的技术人员熟知的福林法进行比色测量。其他示例性的测定法涉及显色底物的增溶作用(参见例如Ward,“Proteinases，”in Fogarty(ed.).,Microbial Enzymes and Biotechnology,Applied Science,London,[1983],pp.251-317(Ward的“蛋白酶”，载于Fogarty编辑的《微生物酶和生物技术》中，伦敦的应用科学出版社1983年出版，第251-317页))。其他示例性测定法包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定法(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS测定法)。本领域人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如Wells et al.,Nucleic Acids Res.11:7911-7925[1983](Wells等人，《核酸研究》，第11卷，第7911-7925页，1983年)；Christiansonet al.,Anal.Biochem.223:119-129[1994](Christianson等人，《分析生物化学》，第223卷，第119-129页，1994年)；以及Hsia et al.,Anal Biochem.242:221-227[1999](Hsia等人，《分析生物化学》，第242卷，第221-227页，1999年))。

有多种方法可用于测定成熟蛋白酶(例如本发明的成熟变体蛋白酶)在宿主细胞中的产生水平。这类方法包括但不限于例如利用对该蛋白酶有特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选法(FACS)。这些和其他测定法是本领域所熟知的(参见例如Maddox et al.,J.Exp.Med.158:1211[1983](Maddox等人，《实验医学杂志》，第158卷，第1211页，1983年))。

在一些其他实施例中，本发明提供用于制备或产生本发明的成熟变体蛋白酶的方法。成熟变体蛋白酶不包含信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种细胞(例如枯草芽孢杆菌细胞)中制备或产生本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，本发明提供产生本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括在有利于产生该变体蛋白酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸。一些这类方法还包括从培养物回收变体蛋白酶。

在一些实施例中，本发明提供了产生本发明的变体蛋白酶的方法，该方法包括：(a)将包含编码本发明变体蛋白酶的核酸的重组表达载体引入一群细胞(例如细菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有利于产生由该表达载体编码的变体蛋白酶的条件下在培养基中培养该细胞。一些这类方法还包括：(c)从细胞或从培养基分离变体蛋白酶。

织物和家庭护理产品

在一些实施例中，本发明的蛋白酶变体可用于包含辅助材料和蛋白酶变体的组合物，其中该组合物为织物和家庭护理产品。

在一些实施例中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的织物和家庭护理产品组合物包含一种或多种以下成分(基于总组合物重量计)：约0.0005重量％至约0.1重量％、约0.001重量％至约0.05重量％、或甚至约0.002重量％至约0.03重量％的所述嗜热菌蛋白酶变体；以及如下物质中的一种或多种：约0.00003重量％至约0.1重量％的织物调色剂；约0.001重量％至约5重量％的香料囊粒；约0.001重量％至约1重量％的冷水溶性增白剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的漂白催化剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的第一洗涤脂肪酶；约0.00003重量％至约0.1重量％的细菌清洁纤维素酶；和/或约0.05重量％至约20重量％的Guerbet非离子型表面活性剂。

在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物是液体衣物洗涤剂、盘碟洗涤剂。

意在使织物和家庭护理产品以任何合适的形式(包括流体或固体)提供。织物和家庭护理产品可以是单位剂量小袋的形式，尤其是液体的形式时，并且通常织物和家庭护理产品为至少部分地或甚至完全地被水溶性小袋封闭。此外，在包含至少一种蛋白酶变体的织物和家庭护理产品的一些实施例中，织物和家庭护理产品可以具有上面详述的参数和/或特性的任何组合。

清洁组合物

除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)不排除在外。酶组分重量是以总活性蛋白质计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是以总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。

如本文所指出，在一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含辅助材料，其包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定体系、螯合剂、荧光增白剂、去垢性聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有专利都以引用的方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的本发明变体蛋白酶不相容的实施例中，使用合适的方法保持清洁辅助材料与蛋白酶分离(即，相互不接触)，直到两种组分适宜进行组合为止。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等)。

有利地，本发明的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁、盘碟洗涤应用，以及美容应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。此外，由于在较低温度溶液中效用提高的独特优势，本发明的酶理想地适合于衣物洗涤应用。此外，本发明的酶可用于颗粒状和液体组合物。

本发明的变体蛋白酶还可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供清洁添加剂产品，其包含至少一种本发明的酶，当需要额外漂白效用时，该清洁添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。此类情形包括(但不限于)低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品为其最简单的形式，即一种或多种蛋白酶。在一些实施例中，添加剂被包装成剂型，用于添加到清洁过程中。在一些实施例中，添加剂被包装成剂型，用于添加到清洁过程中，该清洁过程采用了过氧源并且期望得到增强的漂白效果。任何合适的单一剂量单位形式都可用于本发明，包括但不限于：丸剂、片剂、明胶胶囊，或其他单一剂量单位例如预先计量的粉末或液体。在一些实施例中，包括填料或载体材料以增加所述组合物的体积。合适的填料或载体材料包括(但不限于)多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等。适于液体组合物的填料或载体材料包括(但不限于)水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。这些醇的实例包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有约5％至约90％的这类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施例中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将予以更完整地描述。

本发明清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文所提供蛋白酶变体中的至少一种，其单独使用或与其他蛋白酶和/或另外的酶组合使用。所需的酶水平通过添加一种或多种本发明的蛋白酶变体来实现。通常，本发明清洁组合物包含至少约0.0001重量％、约0.0001至约10重量％、约0.001至约1重量％或甚至约0.01至约0.1重量％的至少一种本发明变体蛋白酶。

通常配制本文的清洁组合物而使得，在水性清洁操作中使用期间，洗涤水的pH为约5.0至约11.5或甚至约7.5至约10.5。液体产品制剂通常配制成净pH为约3.0至约9.0或甚至约3至约5。颗粒状洗衣用产品通常配制成pH为约9至约11。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员众所周知的。

合适的“低pH清洁组合物”的净pH通常为约3至约5，并且通常不含在这种pH环境中水解的表面活性剂。这类表面活性剂包括包含至少一个环氧乙烷部分或甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷的烷基硫酸钠表面活性剂。这类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约3至约5。这些组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施例中，所述组合物为液体，而在其他实施例中，其为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10％固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另作说明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得的。

在一些实施例中，当颗粒组合物或液体中采用变体蛋白酶时，期望变体蛋白酶为封装颗粒的形式，以在存储过程中保护变体蛋白酶免受该颗粒组合物的其他组分的影响。此外，封装也是控制变体蛋白酶在清洁过程期间的利用度的方式。在一些实施例中，封装可增强变体蛋白酶和/或其他酶的性能。就这一点而言，本发明的变体蛋白酶使用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一些实施例中，封装材料通常包封本发明变体蛋白酶的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些实施例中，封装材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃化转变温度在WO 97/11151中进行了更详细的描述。封装材料通常选自如下：碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲壳质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型的实施例中，封装材料为淀粉(参见例如EP 0922499、US 4,977,252、US 5,354,559和US 5,935,826)。在一些实施例中，封装材料是由诸如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物之类的塑料制成的微球体；可使用的市售微球体包括(但不限于)由(瑞典斯托克韦斯文肯(Stockviksverken,Sweden))以及PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、和(美国宾夕法尼亚州翠谷的PQ公司(PQ Corp.,Valley Forge,PA))提供的微球体。

如本文所述，本发明的变体蛋白酶尤其可用于清洁行业，包括但不限于衣物和盘碟洗涤剂。这些应用使酶处于各种环境压力下。本发明的变体蛋白酶由于其在各种条件下的稳定性，提供了优于多种当前使用的酶的优点。

实际上，洗涤中所涉及的蛋白酶暴露于多种洗涤条件，包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区域中使用的洗涤剂制剂在洗涤水中存在不同浓度的其相关组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。

低洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本的洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度包括在洗涤水中存在介于约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。北美的洗涤剂一般被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。

高洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在超过约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲的洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。

拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可在中等洗涤剂浓度至高洗涤剂浓度之间，因为其在洗涤水中具有1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域(不限于其他拉丁美洲国家)也可具有在洗涤水中存在最高达约6000ppm的洗涤剂组分的高洗涤剂浓度系统。

按照前述内容，很明显在全世界范围内，典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在低于约800ppm洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度地理区域”，例如在日本约667ppm)至介于约800ppm至约2000ppm之间(“中等洗涤剂浓度地理区域”，例如在美国约975ppm，在巴西约1500ppm)再到高于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理区域”，例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及在高泡磷酸盐助洗剂地理区域中约6000ppm)间变动。

典型的洗涤溶液的浓度凭经验确定。例如，在美国，典型的洗衣机容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm的洗涤剂浓度，须将约62.79g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的典型量。

再举个例子，不同地理区域使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常在约10℃和约30℃之间(例如，约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常在约30℃和约60℃之间(例如，约40℃)。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于洗衣以及盘碟洗涤应用。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”利用适用于在约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合和在10℃至40℃内的所有范围的温度下进行洗涤的“冷水洗涤剂”。

再举个例子，不同地理区域通常具有不同的水硬度。水硬度通常按每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺的格令数来描述。硬度是水中钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。在美国，大多数水都较硬，但硬度有波动。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(ppm换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)的硬度矿物质。

水	每加仑格令数	ppm
			软	小于1.0	小于17
略硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬	3.5至7.0	60至120
硬	7.0至10.5	120至180
			极硬	大于10.5	大于180

欧洲的水硬度通常是每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如，每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺为约15格令)。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺为约3格令。

因此，在一些实施例中，本发明提供的变体蛋白酶在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出惊人的洗涤性能。在一些实施例中，本发明的变体蛋白酶与其他嗜热菌蛋白酶的洗涤性能相当。在本发明的一些实施例中，本文提供的变体蛋白酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在各种条件下的清洁能力、和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可用于不包含洗涤剂的清洁组合物，该变体蛋白酶同样是单独使用或与助洗剂和稳定剂组合。

在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，清洁组合物包含水平为约0.00001％至约10％的至少一种本发明变体蛋白酶，并且以组合物的重量计，余量(例如约99.999％至约90.0％)包含清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的至少一种变体蛋白酶，并且清洁组合物的余量(例如，约99.9999重量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包含清洁辅助材料。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤酶，该酶可提供清洁性能和/或织物护理和/或盘碟洗涤益处。合适的酶的例子包括但不限于：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的任何组合或混合物。在一些实施例中，使用包含常规可应用的酶的酶组合(即“混合物(cocktail)”)，如使用蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶联合淀粉酶。

除本文提供的蛋白酶变体之外，任何其他合适的蛋白酶均可用于本发明的组合物。合适的蛋白酶包括源自动物、植物或微生物的那些。在一些实施例中，使用微生物蛋白酶。在一些实施例中，其包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的例子包括美国专利No.RE 34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628中描述的那些突变型蛋白酶，所有这些专利以引用方式并入本文。另外的蛋白酶的例子包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施例中，可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、 PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM和PURAFAST^TM(杰能科公司(Genencor))； DURAZYM^TM、和(诺维信公司(Novozymes))；BLAP^TM和BLAP^TM变体(德国杜塞尔多夫汉高公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien,Duesseldorf,Germany))；以及KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶；日本东京花王公司(Kao Corp.,Tokyo,Japan))。各种蛋白酶在WO95/23221、WO 92/21760、美国专利公开No.2008/0090747和美国专利No.5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625、US RE 34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628以及各种其他专利中有所描述。在一些其他实施例中，金属蛋白酶可用于本发明，包括但不限于WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。

此外，任何合适的脂肪酶可用于本发明。合适的脂肪酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。本发明涵盖经过化学方式或遗传修饰的突变体。可用的脂肪酶的例子包括绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258 068和EP 305 216)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238 023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，诸如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如EP214761)、假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶诸如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois et al.,Biochem.Biophys.Acta 1131:253-260[1993](Dartois等人，《生物化学与生物物理学学报》，第1131卷，第253-260页，1993年))；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如JP 64/744992)；和短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO 91/16422)。

此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明一些实施例中，包括但不限于：卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi et al.,Gene 103:61-67[1991](Yamaguchi等人，《基因》，第103卷，第61-67页，1991年))、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada et al.,J.Biochem.,106:383-388[1989](Schimada等人，《生物化学杂志》，第106卷，第383-388页，1989年))，以及各种根霉属(Rhizopus)脂肪酶诸如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass et al.,Gene 109:117-113[1991](Hass等人，《基因》，第109卷，第117-113页，1991年))、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya et al.,Biosci.Biotech.Biochem.56:716-719[1992](Kugimiya等人，《生物科学、生物技术和生物化学》，第56卷，第716-719页，1992年))和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。

其他类型的嗜热菌蛋白酶(诸如角质酶)也可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和衍生自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。

其他合适的脂肪酶包括市售脂肪酶，例如M1LIPASE^TM、LUMAFAST^TM和LIPOMAX^TM(杰能科公司(Genencor))；和ULTRA(诺维信公司(Novozymes))；和LIPASE P^TM“Amano”(日本天野制药有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.,Japan))。

在本发明一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％的另外的脂肪酶，以组合物重量计余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶的脂肪酶。

在本发明的一些实施例中，任何合适的淀粉酶都可用于本发明。在一些实施例中，也可使用适用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如α和/或β淀粉酶)。合适的淀粉酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于得自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。可用于本发明的市售淀粉酶包括但不限于：和BAN^TM(诺维信公司(Novozymes))以及POWERASE^TM、和P(杰能科公司(Genencor))。

在本发明一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外淀粉酶的淀粉酶，以组合物重量计余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶的淀粉酶。

在一些其他实施例中，任何合适的纤维素酶都可用于本发明的清洁组合物。合适的纤维素酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参见例如美国专利No.4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶(参见例如EP 0495257)。可用于本发明中的市售纤维素酶包括(但不限于)：(诺维信公司)以及KAC-500(B)^TM(花王公司(Kao Corporation))。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失(参见例如美国专利No.5,874,276)。在一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外纤维素酶的纤维素酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶的纤维素酶。

任何适用于洗涤剂组合物中的甘露聚糖酶也可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。各种可用于本发明的甘露聚糖酶是已知的(参见例如美国专利No.6,566,114、美国专利No.6,602,842和美国专利No.6,440,991，所有这些专利均以引用方式并入本文)。在一些实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外甘露聚糖酶的甘露聚糖酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶的甘露聚糖酶。

在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明的组合物中。在一些可供选择的实施例中，氧化酶与氧气联合使用。这两种类型的酶，优选地连同增强剂一起用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织品染料从一种染色织物转移到另一种织物)(参见例如WO 94/12621和WO95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括(但不限于)植物、细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施例中，可使用另外的酶，其包括但不限于过水解酶(参见例如WO 05/056782)。此外，在一些实施例中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其是一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，设想到这些酶的各种混合物都可用于本发明。还设想到，变体蛋白酶与一种或多种另外的酶的不同水平都可独立地在最高达约10％的范围内，该清洁组合物的余量为清洁辅助材料。易于通过考虑待清洁表面、物品或织物以及针对在使用(例如通过使用洗涤剂)期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁辅助材料。

合适的清洁辅助材料的例子包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定体系、螯合剂、荧光增白剂、去垢性聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构增塑剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有这些专利均以引用方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的本发明变体蛋白酶不相容的实施例中，使用合适的方法保持清洁辅助材料与蛋白酶分离(即，相互不接触)，直到两种组分适宜进行组合为止。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等)。

在一些实施例中，在可用于清洁多种需要去除蛋白质污渍的表面的组合物中包含有效量的一种或多种本文提供的变体蛋白酶。这些清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物和餐具之类的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括洁牙剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。意在使本发明涵盖任何形式(即液体、颗粒状、条状、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊等)的洗涤剂组合物。

举例来说，在下文更详细地描述了几种在其中可使用本发明变体蛋白酶的清洁组合物。在本发明的清洁组合物被配制成适合在洗衣机洗涤方法中使用的组合物的一些实施例中，本发明组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、石灰皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施例中，洗衣组合物还含有软化剂(即作为额外的清洁辅助材料)。本发明组合物还可使用固体或液体形式的洗涤添加剂产品。所述添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可在洗涤过程的任何阶段添加。在一些实施例中，在20℃下测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200g/L的范围内，而在其他实施例中，其在约500至约950g/L组合物的范围内。

在配制为在人工餐具洗涤方法中使用的组合物的实施例中，本发明组合物优选地包含至少一种表面活性剂，以及优选地至少一种另外的选自以下的清洁辅助材料：有机聚合化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和另外的酶。

在一些实施例中，各种清洁组合物(例如美国专利No.6,605,458中提供的组合物)可与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是致密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，所述组合物是可用于清洗有色织物的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施例中，所述组合物是提供通过洗涤软化的能力(softening through the wash capacit)的颗粒状织物清洁组合物，在其他实施例中，所述组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些组合物。此外，本发明的变体蛋白酶可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别具有实用性的颗粒状衣物洗涤剂组合物中(参见例如美国专利No.6,610,642)。

在一些另选的实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642、No.6,376,450和No.6,376,450中所述的组合物。

在另外其他实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的盘碟洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些组合物。在一些其他实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的盘碟洗涤组合物。在一些其他实施例中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物包含口腔护理组合物，例如美国专利No.6,376,450和No.6,376,450中所述的那些组合物。上述美国专利No.6,376,450、No.6,605,458、No.6,605,458和No.6,610,642中所包含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述可用于本文提供的变体蛋白酶。

本发明清洁组合物被配制成任何合适的形式并且由配制者选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利均以引用方式并入本文。当需要低pH清洁组合物时，通过添加诸如单乙醇胺或酸性材料(例如盐酸)之类的材料来调整此类组合物的pH。

尽管不是实现本发明目的所必需的，但下文示例的辅助材料的非限制性名单适用于本发明清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助材料，例如从而帮助或增强清洁性能以便处理待清洁的基底，或改变清洁组合物的美观性，如利用芳香剂、着色剂、染料等情形就是如此。应当理解，这些助剂是本发明的变体蛋白酶的补充。这些另外的组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括(但不限于)：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、另外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构增塑剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开内容外，此类其他助剂及使用水平的适合例子见于美国专利No.5,576,282、No.6,306,812和No.6,326,348(以引用的方式并入本文)中。上述辅助成分可构成本发明清洁组合物的余量。

在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH清洁组合物实施例(例如净pH为约3至约5的组合物)中，组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信此类表面活性剂可能会被此类组合物的酸性内容物水解。在一些实施例中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1％至约60％的水平存在，而在可供选择的实施例中，所述量为约1％至约50％，而在其他实施例中，所述水平为约5％至约40％。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系。在一些掺入至少一种助洗剂的实施例中，以清洁组合物的重量计，清洁组合物包含至少约1％、约3％至约60％或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于：聚磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸盐化合物；醚羟基聚羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸；和羧甲基氧基琥珀酸；聚乙酸(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐；以及聚羧酸盐，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三甲酸、羧甲基氧基琥珀酸以及它们的可溶性盐。实际上，设想到任何合适的助洗剂都将可用于本发明各个实施例中。

在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和聚磷酸盐(例如三聚磷酸钠和六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等)。可以设想到，任何合适的助洗剂都将可用于本发明，包括本领域已知的那些助洗剂(参见例如EP 2 100 949)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于：铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，以本发明主题清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.1％至约15％或甚至约3.0％至约10％的螯合剂。

在一些其他实施例中，本文中提供的清洁组合物含有至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括(但不限于)：聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；去污聚合物，如聚对苯二甲酸；粘土，如高岭土、蒙脱土、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土以及它们的混合物。

如本文所指出，在一些实施例中，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施例。在一些实施例中，可使用非离子型表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施例中，非离子型表面活性剂可用于表面修饰目的，尤其用于被单料子，以避免成膜和起斑以及用于改善光泽度。这些非离子型表面活性剂也可用于防止污垢再沉积。在一些实施例中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子型表面活性剂(参见例如EP 2 100 949)。

在一些实施例中，本发明清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括(但不限于)：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，以清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％。

在一些实施例中，硅酸盐包含在本发明的组合物中。在一些此类实施例中，使用硅酸钠(例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些实施例中，以组合物的重量计，硅酸盐以约5％至约15％的水平存在。

在一些另外的实施例中，本发明清洁组合物还包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括(但不限于)均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多聚羧酸包含至少两个羧基，彼此间隔不超过两个碳原子。

在一些其他实施例中，通过任何合适的技术使清洁组合物中使用的酶稳定。在一些实施例中，本文所用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供钙和/或镁离子的水溶性钙和/或镁离子源来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐(包括碱土金属，如钙盐)。设想到，各种酶稳定化技术将可用于本发明。例如，在一些实施例中，本文所采用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性的这类离子源，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于本发明一些实施例。合适的寡糖和多糖(例如糊精)的例子是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施例中，也可使用可逆的蛋白酶抑制剂，诸如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)并且/或者必要时，可使用三肽醛进一步改进稳定性。

在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体形式，无额外保护，但在一些另外的实施例中，所述盐带涂层。本领域已知的任何适合的盐都可用于本发明(参见例如EP 2 100 949)。

在一些实施例中，将漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和低于60℃温度下进行的清洁过程中会增强漂白作用。适用于本发明的漂白活化剂包括这样的化合物，其在过氧化氢解条件下产生优选具有约1至约10个碳原子、尤其约2至约4个碳原子的脂族过氧羧酸，和/或任选取代的过苯甲酸。另外的漂白活化剂是本领域已知的并且可用于本发明(参见例如EP 2 100 949)。

此外，在一些实施例中以及如本文中进一步描述的，本发明的清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可使用三氮杂环壬烷锰和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。其他漂白催化剂可用于本发明中(参见例如US 4,246,612、5,227,084、4,810410、WO 99/06521和EP 2 100 949)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属漂白催化剂。在一些实施例中，金属漂白催化剂包含催化剂系统，所述催化剂系统包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极低漂白催化活性或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，和对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的螯合剂(sequestrate)，尤其可使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(参见例如美国专利No.4,430,243)。在一些实施例中，借助于锰化合物来催化本发明的清洁组合物。此类化合物及其使用水平是本领域熟知的(参见例如美国专利No.5,576,282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。多种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如美国专利No.5,597,936和No.5,595,967)且易于通过已知程序制备。

在一些另外的实施例中，本发明的清洁组合物包括巨多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践(但绝非限制)，在一些实施例中，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调整以在含水洗涤介质中提供约至少1ppm的活性MRL物质，而在一些实施例中在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm、更优选约0.05ppm至约10ppm且最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。

在一些实施例中，本发明过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括(但不限于)锰、铁和铬。MRL还包括但不限于交联的特异性超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL易于通过已知程序制备(参见例如WO 2000/32601和美国专利No.6,225,464)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO9426860和WO 94/26859中所述的金属护理剂。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些其他实施例中，本发明清洁组合物包含约0.1重量％至约5重量％的一种或多种金属护理剂。

在一些实施例中，清洁组合物是具有变体嗜热菌蛋白酶的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可包含去污表面活性剂(10％-40％)，；所述去污表面活性剂包括阴离子去污表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)以及任选地，非离子型表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C₈-C₁₈烷基乙氧基化醇和/或C₆-C₁₂烷基酚烷氧基化物)，任选地，其中阴离子去污表面活性剂(亲水指数(HIc)为6.0至9)与非离子型去污表面活性剂的重量比大于1:1。

组合物可任选地包含表面活性增强聚合物，该聚合物由两亲型烷氧基化脂清洁聚合物(选自具有支链亲水和疏水性质的烷氧基化聚合物，诸如在0.05重量％-10重量％范围内的烷氧基化聚亚烷亚胺)和/或无规接枝聚合物(通常由亲水主链和疏水侧链构成，所述亲水主链包含选自以下的单体：不饱和C₁-C₆羧酸类、醚类、醇类、醛类、酮类、酯类、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和多元醇诸如甘油，以及它们的混合物；所述疏水侧链选自：C₄-C₂₅烷基、聚丙烯、聚丁烯、饱和C₁-C₆单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C₁-C₆烷基酯，以及它们的混合物)组成。

所述组合物可包含另外的聚合物，诸如污垢释放聚合物(包括阴离子型封端的聚酯例如SRP1，包含至少一种选自糖类、二羧酸、多元醇和它们的组合的单体单元的聚合物，以无规或者嵌段构型，基于对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物以及它们的共聚物，以无规或者嵌段构型，例如Repel-o-texSF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，Marloquest SL)、抗再沉淀聚合物(0.1重量％至10重量％，包括羧酸盐聚合物，诸如包含至少一种选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸以及它们的任何混合物的单体的聚合物，乙烯吡咯烷酮均聚物和/或聚乙二醇，分子量在500至100,000道尔顿的范围内)；纤维素聚合物(包括那些选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的纤维素聚合物，它们的例子包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)和聚合羧酸(例如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

所述组合物还可包含饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的C₁₂-C₂₄脂肪酸(0重量％至10重量％)；沉淀助剂(其例子包括多糖，优选纤维素聚合物，聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC)以及DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮的共聚物、丙烯酰胺、咪唑啉鎓卤化物以及它们的混合物，以无规或者嵌段构型，阳离子型瓜尔豆胶、阳离子型纤维素如阳离子型羟乙基纤维素、阳离子型淀粉、阳离子型聚丙烯酰胺以及它们的混合物。

所述组合物还可包含染料转移抑制剂，其例子包括酞菁锰、过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或它们的混合物；螯合剂，其例子包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二乙烯三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDT A)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；氨三乙酸(NTA)；4,5-二羟基-间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)以及它们的衍生物。

所述组合物还可包含选自以下的酶(0.01重量％的活性酶至0.03重量％的活性酶)：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。所述组合物可包含酶稳定剂(其例子包括多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯、或者苯基硼酸衍生物诸如4-甲酰基苯基硼酸)。

所述组合物还可包含有机硅或脂肪酸基抑泡剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号成分、消泡剂(0.001重量％至约4.0重量％)，和/或结构剂/增稠剂(0.01重量％至5重量％，选自甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、纤维素基材料、微纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶以及它们的混合物)。

合适的清洁表面活性剂还包括阳离子型清洁表面活性剂(选自烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物；两性离子型和/或两亲型清洁表面活性剂(选自链烷醇胺硫甜菜碱)；淀粉分解表面活性剂；半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。

组合物可以是任何液体形式，例如液体或者凝胶形式，或者它们的任何组合。组合物可以是任何单位剂量形式，例如袋剂(pouch)。

在一些实施例中，清洁组合物是含有变体嗜热菌蛋白酶的高密度粉末(HDD)组合物。HDD粉末衣物洗涤剂可包含去污表面活性剂，所述去污表面活性剂包括阴离子型去污表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)、非离子型去污表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或未取代的C₈-C₁₈烷基乙氧基化物和/或C₆-C₁₂烷基酚烷氧基化物)、阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基叔锍化合物、以及它们的混合物)、两性离子型和/或两亲型去污表面活性剂(选自链烷醇胺硫甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物；助洗剂(无磷助洗剂(例如沸石助洗剂，其例子包括在0重量％至小于10重量％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)；磷酸盐助洗剂(其例子包括在0重量％至小于10重量％范围内的三聚磷酸钠)；柠檬酸、柠檬酸盐，次氮基三乙酸或其盐，其量在小于15重量％的范围内)；硅酸盐(在0重量％至小于10重量％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(在0重量％至小于10重量％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(光漂白剂，其例子包括磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、呫吨染料、以及它们的混合物；疏水或亲水漂白活化剂(其例子包括十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺TAED、和壬酰氧基苯磺酸盐NOBS、季腈、以及它们的混合物；过氧化氢；过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，其例子包括过硼酸、过碳酸、过硫酸、过磷酸或者过硅酸的单或四水合钠盐)；预先形成的亲水和/或疏水过酸(选自过羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚胺酸及盐、过氧基一硫酸及盐)以及它们的混合物，和/或漂白催化剂(诸如亚胺漂白促进剂，其例子包括亚胺鎓阳离子和聚离子；亚胺鎓两性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮以及它们的混合物；含金属漂白催化剂，例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子连同辅助金属阳离子诸如锌或铝，以及螯合剂(sequestrate)诸如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)和它们的水溶性盐)。

所述组合物还可包含选自以下的酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。

所述组合物还可包含另外的洗涤剂成分，包括香料微胶囊、淀粉包封的调和香料谐香剂(perfume accord)、调色剂(hueing agent)、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子型聚合物)、染料锁定成分、织物软化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉淀助剂、和/或环糊精。

在一些实施例中，清洁组合物是含有变体嗜热菌蛋白酶的自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物。ADW洗涤剂可包含两种或更多种非离子型表面活性剂，后者选自乙氧基化非离子型表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇、或氧化胺表面活性剂，以0重量％至10重量％的量存在；助洗剂，在5-60％的范围内，包括磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐或低聚-聚磷酸盐，优选三聚磷酸钠STPP)或无磷助洗剂(氨基酸基化合物，其例子包括MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物，次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)以及它们的盐)；聚羧酸的均聚物和共聚物及它们的部分或者完全中和盐、单聚的聚羧酸和羟基羧酸以及它们的盐，在0.5重量％至50重量％的范围内；磺酸化/羧酸化聚合物(向产品提供尺寸稳定性)，在约0.1重量％至约50重量％的范围内；干燥助剂，在约0.1重量％至约10重量％的范围内(选自聚酯，尤其是阴离子型聚酯，任选地与具有3至6个官能团的另外单体一起，所述官能团有助于缩聚反应，具体地讲为酸、醇或者酯官能团，反应性环状碳酸盐和脲类型的聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物)；硅酸盐，在约1重量％至约20重量％的范围内(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐；无机漂白剂(例如过氧化氢合物盐诸如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂，即有机过酸前体，在约0.1重量％至约10重量％的范围内；漂白催化剂(选自锰三氮杂环壬烷和相关络合物，Co、Cu、Mn和Fe二吡啶基胺和相关络合物，以及五胺乙酸钴(III)和相关络合物)；金属护理剂，在约0.1重量％至5重量％的范围内(选自苯并三唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；在每克自动盘碟洗涤剂组合物约0.01mg至5.0mg活性酶范围内的酶(选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。

在下列表中示出可用作含有本发明的变体嗜热菌蛋白酶的组合物的代表性洗涤剂组合物。

1共聚物包含

i)选自单不饱和羧酸或多不饱和羧酸的单体

ii)具有通式R^l(R²)C＝C(R³)-X-R⁴的单体，其中R^l至R³相互独立地指-H、-CH₃或-C₂H₅，X指任选存在的间隔基团，其选自-CH₂-、-C(O)O-和-C(O)-NH-，而R⁴指具有2至22个碳原子的直链或支链饱和烷基残基或指具有6至22个碳原子的不饱和的、优选芳族的残基

iii)任选另外的单体

2具有通式R^l-CH(OH)CH₂0-(AO)w-(A'0)_x-(A"0)_y-(A"'0)_z-R₂的非离子型表面活性剂，其中R^l指直链或支链的、饱和的或单不饱和或多不饱和的C6-C24烷基或烯基残基；R²指具有2至26个碳原子的直链或支链烃残基；A、A'、A"和A'"相互独立地指选自---CH₂CH₂、-CH₂CH₂---CH₂、---CH₂CH₂--CH(CH₃)、CH₂-CH₂-CH₂CH₂、-CH₂-CH-(CH₃)-CH₂-、-CH₂-CH(CH₂-CH₃)的残基，w、x、y和z指0.5与120之间的值，其中x、y和/或z也可以为0。

基于脂肪酸的基质1由如下组成：20重量％的椰油脂肪酸钠盐、50重量％的非聚合物型多元醇(山梨醇、甘油、丙二醇、蔗糖和葡萄糖)、15重量％的阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂和15重量％的水。

基于脂肪酸的基质2由如下组成：20重量％的硬脂酸钠盐、3重量％的月桂酸钠盐、3重量％的肉豆蔻酸钠盐、50重量％的非聚合物型多元醇(山梨醇、甘油和丙二醇)、2重量％的月桂酸、2重量％的硬脂酸、10重量％的阴离子表面活性剂和10重量％的水。

洗涤剂组合物A
	9％阴离子洗涤剂
1％非离子洗涤剂
	21.5％三聚磷酸钠
7％过硼酸钠
	0.6％Savinase(一种蛋白水解酶)
余量用硫酸钠+微量成分补足

洗涤剂组合物B
	9％阴离子洗涤剂
4％非离子洗涤剂
	28％沸石
4.5％次氨基三乙酸盐
	5.5％过硼酸钠
3.5％四乙酰基乙二胺
	0.5％Savinase
余量用硫酸钠+微量成分补足

洗涤剂组合物C
	5％阴离子洗涤剂
4％非离子洗涤剂
	1％皂
30％沸石
	3.％的丙烯酸与马来酸酐的共聚物
7.5％过硼酸钠
	3％四乙酰基乙二胺
余量用硫酸钠+微量成分补足

洗涤剂组合物D
	8％阴离子合成洗涤剂
4％非离子合成洗涤剂
	4％皂
35.％碳酸钠
	20％粉末方解石
6％过硼酸钠
	2％四乙酰基乙二胺
0.5％Savinase
	余量用硫酸钠+微量成分补足

如上文所指出的，本发明清洁组合物被配制成任何合适的形式并由配制者选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。在需要低pH清洁组合物的一些实施例中，通过添加诸如盐酸之类的酸性材料来调整此类组合物的pH。

本文所公开的清洁组合物可用于清洁位置(例如表面、物品、餐具或织物)。通常，使所述位置的至少一部分与纯的形式的本发明清洁组合物或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的实施例接触，随后任选洗涤和/或冲洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液中通常以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。

清洁组合物的制备和使用方法

本发明的清洁组合物被配制成任何合适的形式并通过配制者所选择的任何合适方法制备(参见例如美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392、No.5,486,303、No.4,515,705、No.4,537,706、No.4,515,707、No.4,550,862、No.4,561,998、No.4,597,898、No.4,968,451、No.5,565,145、No.5,929,022、No.6,294,514和No.6,376,445)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物以单位剂型提供，包括片剂、胶囊剂、扁囊剂、袋剂和多隔室袋剂。在一些实施例中，对单位剂量形式进行设计以提供多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内的成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(参见例如EP 2 100949、WO 02/102955、美国专利No.4,765,916和No.4,972,017，以及WO04/111178关于适用于单位剂量和控制释放形式的材料)。在一些实施例中，单位剂型以包有水溶性膜或水溶性小袋的片剂提供。各种用于单位剂量的形式在EP 2 100 947中提供，并且是本领域已知的。

使用方法

在一些实施例中，本发明的清洁组合物可用于清洁表面(例如餐具)、衣物、硬质表面、隐形眼镜等。在一些实施例中，该表面的至少一部分与纯形式的或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的至少一个实施例接触，然后任选地洗涤和/或漂洗所述表面。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械洗涤。在一些实施例中，本发明的清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在一些洗涤溶剂为水的实施例中，水温通常在约5℃至约90℃的范围内。

本发明提供用于清洁或洗涤需要清洁的物品或表面(例如硬质表面)的方法，其包括但不限于清洁或洗涤餐具物品、餐具物品、织物物品、衣物物品、个人护理物品等的方法，以及清洁或洗涤硬质或软质表面(例如物品的硬质表面)的方法。

在一些实施例中，本发明提供清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的变体嗜热菌蛋白酶或本发明的组合物接触足以清洁所述物品、物体或表面至所需程度的时间，和/或在适于和/或有效清洁所述物品、物体或表面至所需程度的条件下进行接触。一些这类方法还包括用水漂洗物品、物体或表面。对于一些这类方法，清洁组合物是盘碟洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是盘碟物品或餐具物品。如本文所用，“盘碟物品”是通常用于供给食物或食用食物的物品。盘碟物品可以是但不限于(例如)盘子、碟子、杯子、碗等等。如本文所用，“餐具”是更广泛的术语，其包括但不限于(例如)器皿、刀具、餐刀、餐叉、匙、筷子、玻璃器具、罐壶、调味汁碟、饮用容器、盛菜物品等。预期“餐具物品”包括这些或相似的用于供应食物或食用食物的物品中的任何一种。对于一些这类方法，清洁组合物是自动盘碟洗涤剂组合物或手动盘碟洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是盘碟或餐具物品。对于一些此类方法，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物(例如粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物)，而待清洁的物品是织物物品。在一些其他实施例中，清洁组合物是衣物预处理组合物。

在一些实施例中，本发明提供用于清洁或洗涤任选需要分别清洁或洗涤的织物物品的方法。在一些实施例中，所述方法包括提供包含变体蛋白酶的组合物(包括但不限于织物或衣物清洁组合物)和需要清洁的织物物品或衣物物品，并使该织物物品或衣物物品(希望进行清洁的物品的一部分)与该组合物在足以或有效清洁或洗涤该织物或衣物物品至所需程度的条件下接触。

在一些实施例中，本发明提供清洁或洗涤任选需要清洁的物品或表面(例如硬质表面)的方法，该方法包括提供待清洁或洗涤的物品或表面，使该物品或表面(希望进行清洁或洗涤的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的嗜热菌蛋白酶变体或包含至少一种这种嗜热菌蛋白酶变体的本发明组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间，和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下接触。这类组合物包括但不限于例如本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(例如手动盘碟洗涤剂组合物、手动盘碟洗涤清洁组合物、衣物洗涤剂组合物、或织物洗涤剂组合物、或者衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动盘碟洗涤剂组合物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂和衣物预洗剂组合物等)。在一些实施例中，将该方法重复一次或多次，尤其是如果需要额外的清洁或洗涤的话。例如，在某些情况下，该方法任选还包括让物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物保持接触足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施例中，这些方法还包括用水和/或另一种液体漂洗物品或表面。在一些实施例中，这些方法还包括再次用至少一种本发明的变体蛋白酶或本发明的组合物接触物品或表面，并且让该物品或表面与至少一种变体蛋白酶或组合物保持接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施例中，清洁组合物是盘碟洗涤剂组合物，而待清洁的物品是盘碟或餐具物品。在本发明方法的一些实施例中，清洁组合物是自动盘碟洗涤剂组合物或手动盘碟洗涤剂组合物，而待清洁的物品是盘碟或餐具物品。在所述方法的一些实施例中，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物，而待清洁的物品是织物物品。

本发明还提供在自动洗碗机中清洁餐具或盘碟物品的方法，该方法包括提供自动洗碗机，在机器中放入足以清洁餐具或盘碟物品的一定量的包含至少一种本发明嗜热菌蛋白酶变体或本发明组合物的自动盘碟洗涤组合物(例如通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)，将盘碟或餐具物品放入该机器中，运行该机器以清洁该餐具或盘碟物品(例如按照生产商的说明书)。在一些实施例中，所述方法包括本文所述的任何自动盘碟洗涤组合物，其包含但不限于至少一种本文提供的嗜热菌蛋白酶变体。待使用的自动盘碟洗涤组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，并可采用任何形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的自动盘碟洗涤组合物(例如液体、粉末、固体、凝胶、片剂等)，包括本文所述的任何组合物在内。

本发明还提供清洁任选需要清洁的表面、物品或物体的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与纯形式的或在洗涤液中稀释的至少一种本发明变体嗜热菌蛋白酶或本发明清洁组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下进行接触。然后如果需要，可对表面、物品或物体(任选)进行洗涤和/或漂洗。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于(例如)擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液(如水溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当表面、物品或物体包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。

本发明还提供在洗涤机中清洁衣物或织物物品的方法，该方法包括提供洗衣机，将足以清洁衣物或织物物品的一定量的包含至少一种本发明变体嗜热菌蛋白酶的衣物洗涤剂组合物置于该机器中(例如，通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室中或分配器中)，将衣物或织物物品置于该机器中，随后运行该机器以清洁衣物或织物物品(例如，按照生产商的说明书)。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含但不限于本文提供的任何变体嗜热菌蛋白酶中的至少一种。要使用的衣物洗涤剂组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，可采用任何形式的包含至少一种本发明变体蛋白酶的衣物洗涤剂组合物(例如固体、粉末、液体、片剂、凝胶等)，包括本文所述的任何组合物在内。

实验

实例1

测定法

以下测定法是用于下文所描述的实例中的标准测定法。有时具体方案要求与这些标准测定法有一定差异。在那些情况下，实例中标识了与下面这些标准测定法方案的差异。

A.性能指数

性能指数(PI)将相同蛋白质浓度下变体的性能(实测值)与标准酶的性能(理论值)相比较。另外，可使用标准酶的朗缪尔方程的参数来计算理论值。

大于1的性能指数(PI)(PI>1)表明变体的性能较标准(例如嗜热菌蛋白酶)的性能有所改善，而PI等于1(PI＝1)表明变体性能与标准的性能相同，PI小于1(PI<1)表明变体的性能比标准的性能差。

B.在96孔微量滴定板中执行Abz-AGLA-Nba蛋白酶测定

为了测定嗜热菌蛋白酶金属蛋白酶和嗜热菌蛋白酶金属蛋白酶变体的蛋白酶活性，测量了2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰基甘氨酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酸基-4-硝基苄基酰胺(Abz-AGLA-Nba)的水解情况。

使用的试剂溶液是：

i)MES缓冲液(52.6mM MES，用NaOH调节至pH 6.5，包含2.6mM CaCl₂和0.00526％(体积/体积))；

ii)Abz-AGLA-Nba储备液(DMF中的48mM Abz-AGLA-Nba)，在室温下避光保存；

iii)含有丙二醇的酶稀释缓冲液(10mM NaCl、0.1mM CaCl₂和0.005％(体积/体积)10％丙二醇)。

要制备2.4mM Abz-AGLA-Nba工作溶液，将1mL Abz-AGLA-Nba储备液添加到19mL MES缓冲液中并彻底混合至少10秒。将该溶液在室温下避光保存。

要制备蛋白酶溶液，将过滤后的嗜热菌蛋白酶变体培养上清液在酶稀释缓冲液中稀释50倍。

该测定法在适用于荧光读数的一次性黑色聚苯乙烯平底96孔微量板(例如Greiner 655076)中进行。首先，将195μL 2.4mM Abz-AGLA-Nba工作溶液添加到96孔微量测定板的每个孔中，然后添加5μL经稀释的蛋白酶样品。将溶液混合5秒，随后在25℃下使用微量板分光荧光计(SpectraMAX Gemini EM，分子仪器公司(Molecular Devices))采用动力学模式测量荧光变化(在180秒内读取9个读数，激发波长350nm，发射波长415nm，无截止滤波器)。以RFU/s(RFU＝相对荧光单位)为单位的荧光变化速率提供了蛋白酶活性的量度。

C.稳定性测定法

嗜热菌蛋白酶变体相对于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型嗜热菌蛋白酶的热稳定性通过在限定条件下将蛋白酶样品在HEPES缓冲液或洗涤剂溶液中温育来测定。选择的温育温度使野生型嗜热菌蛋白酶在温育后的剩余活性等于初始活性的大约30％。使用以上在章节B中描述的Abz-AGLA-Nba测定法来测定初始和残余的嗜热菌蛋白酶活性。

用于该组测定法的试剂溶液为：

1.2.4mM Abz-AGLA-Nba工作溶液(参见以上章节B)

2.稀释缓冲液：10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％(体积/体积)

3.HEPES缓冲液：10mM HEPES，0.1mM CaCl₂，0.005％(体积/体积)pH 7.15

4.AT配方pH 8洗涤剂(21°GH水中2.5g/L)

5.Sun All-in-1Turbo凝胶pH 6.3(21°GH水中3g/L)

6.过滤后的嗜热菌蛋白酶变体培养上清液

用于该组测定法的设备包括Biomek FX自动化工作站(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))、SpectraMAX Gemini EM微量板分光荧光计(分子仪器公司(Molecular Devices))和Tetrad2Peltier热循环仪(伯乐公司(Bio-Rad))。

在缓冲液中执行热稳定性测定：

将嗜热菌蛋白酶变体的培养上清液在HEPES缓冲液中稀释到约1μg/mL，随后将经稀释的酶样品以50微升/孔的量转移到96孔PCR板中。使用如以上章节B所述的Abz-AGLA-Nba测定法，通过将5μL酶样品转移到装有195μL 2.4mM Abz-AGLA-Nba底物溶液的黑色96孔测定微量板(例如Greiner 655076)来测量酶样品的初始活性。用胶粘箔密封件(Bio-RadB-密封件)将装有剩余的45微升/孔酶样品的PCR板密封，接着将该PCR板放置在Tetrad2热循环仪中，在83℃下温育15分钟。温育之后，将PCR板中的样品冷却至室温，使用如以上章节B所述的Abz-AGLA-Nba测定法，通过将5μL酶样品转移到装有195μL 2.4mM Abz-AGLA-Nba底物溶液的黑色96孔测定微量板(例如Greiner 655076)来测量酶样品的残余活性。

热稳定性活性比率的计算是基于热温育后的酶活性除以热温育前的酶活性，以百分比剩余活性表示。通过将变体酶的该活性比率与经类似处理的具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型嗜热菌蛋白酶的该活性比率比较，来确定热稳定性性能指数。

洗涤剂稳定性测定法：

通过在胁迫条件下温育嗜热菌蛋白酶变体，即在高温下的商业上称为Sun All-in-1Turbo凝胶(荷兰联合利华公司(Unilever,The Netherlands))的液体自动盘碟洗涤剂的0.3％(重量/体积)溶液中以及AT配方pH 8洗涤剂(章节E中有描述)的0.25％(重量/体积)溶液中温育，来监测所述变体的洗涤剂稳定性。通过将市售Sun All-in-1Turbo凝胶洗涤剂的10％溶液在80℃温育2小时，来执行对存在于该凝胶洗涤剂中的酶的热灭活。在温育结束时，测得pH值为6.3。

将嗜热菌蛋白酶变体的培养上清液在所述洗涤剂溶液中稀释到约1μg/mL，随后将经稀释的酶样品以50微升/孔的量转移到96孔PCR板中。用胶粘箔密封件(Bio-Rad B-密封件)将PCR板密封，接着将该PCR板放置在Tetrad2热循环仪中温育15分钟。选择的温育温度使野生型嗜热菌蛋白酶在温育后的剩余活性等于初始活性的大约30％。将加热灭活的Sun All-in-1Turbo凝胶中的样品在81℃温育15分钟，将AT配方pH 8洗涤剂中的样品在69℃温育15分钟。温育之后，将PCR板中的样品冷却至室温，使用如以上章节B所述的Abz-AGLA-Nba测定法，通过将5μL酶样品转移到装有195μL 2.4mM Abz-AGLA-Nba底物溶液的黑色96孔测定微量板(例如Greiner 655076)来测量酶样品的残余活性。

洗涤剂活性比率的计算是基于热温育后洗涤剂溶液中的酶活性除以热温育前HEPES缓冲液中的酶活性，以百分比剩余活性表示。

通过将变体酶的该活性比率与经类似处理的具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型嗜热菌蛋白酶的该活性比率比较，来确定洗涤剂稳定性性能指数。

D.PAS-38微样片测定法：

通过以96孔微量板形式对用蛋黄和颜料(荷兰测试材料中心(CFT))预染的聚丙烯(polyacryl)样片执行微样片测定法，而测试嗜热菌蛋白酶变体的清洁性能。该蛋白酶洗涤性能测定法的原理基于蛋黄颗粒和炭黑染料由于结合在微样片上的蛋黄水解而释放。测量洗涤液在405nm处的吸光度，由此提供被分析(在所需的pH、温度和洗涤剂条件下分析)样品中的蛋白酶活性的量度。

使用的试剂和溶液：

1.PAS-38微样片(其上有蛋黄的聚丙烯织物，用炭黑染料老化并上色；CFT公司，荷兰弗拉尔丁恩(CFT-Vlaardingen,TheNetherlands))

2.基于柠檬酸盐的洗涤剂，pH8，加有或不加PAP(AT配方，参见章节E)

3.加热灭活的市售液体洗涤剂Sun All-in-1Turbo凝胶

4.100mM CAPS缓冲液pH 10.2(漂洗缓冲液)

5.具有丙二醇的稀释缓冲液：10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％溶液，10％丙二醇

洗涤剂和条件：

在若干条件下对适当浓度的蛋白酶样品(在MTP板中生长的细菌培养物的经过滤上清液)进行测试。

-AT配方pH 6洗涤剂，50℃；测定法中的最终蛋白酶浓度为约0.3μg/mL

-AT配方pH 8洗涤剂，50℃；测定法中的最终蛋白酶浓度为约0.2μg/mL

-AT配方pH 8洗涤剂+PAP，50℃；测定法中的最终蛋白酶浓度为约0.15μg/mL

-Sun All-in-1Turbo凝胶，pH 6.3洗涤剂，50℃；测定法中的最终蛋白酶浓度为约0.5μg/mL

方法

将PAS-38样片切割成5mm直径的小片并放置在96孔微板的每个孔中。将培养上清液样品在稀释缓冲液中稀释至大约10μg/mL。使用BiomekFX移液自动化工作站，将洗涤剂溶液和稀释的酶样品添加到装有PAS-38微样片的96孔微板至180微升/孔的最终体积。用胶粘密封件将MTP密封，随后将其放置在iEMS振荡培养箱(赛默科技公司(Thermo Scientific))中，伴随1150RPM振荡在50℃下温育30分钟。温育后，将来自每个孔的100μL洗涤液转移到新的MTP，使用SpectraMAX微板分光光度计(分子仪器公司(Molecular Devices))测量405nm处的吸光度。该值被称为“初始性能液体”。弃去来自微样片板的剩余洗涤液，随后用200μL水将微样片漂洗一次。最后，将180μL 0.1M CAPS缓冲液添加到每个孔，接着将MTP置于iEMS振荡培养箱中，伴随1150RPM振荡在50℃下另外温育10分钟。在该温育步骤后，再次将100μL液体转移到新的MTP，使用SpectraMAX微板分光光度计(分子仪器公司(Molecular Devices))测量405nm处的吸光度。该值被称为“漂洗液体”。将这两个测量值(“初始性能液体”和“漂洗液体”)加在一起，所得的和代表“总性能”。

测试过程包括装有微样片和洗涤剂但无酶的对照孔，用于背景减除。

洗涤性能计算

将获得的吸光度值针对空白值(在缺少酶的情况下温育微样片后获得的值)进行校正，所得的吸光度是水解活性的量度。对每个样品计算性能指数(PI)。对于洗涤性能指数的PI计算，使用基于野生型嗜热菌蛋白酶的朗谬尔曲线拟合。使用变体的蛋白质浓度，计算基于曲线拟合的预期性能。将观察到的性能除以计算的性能，然后将该值除以具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型嗜热菌蛋白酶的性能。

E.洗涤剂

使用了两种洗涤剂：

1.于2010年通过商业途径购买的Sun ALL-in-1Turbo凝胶(荷兰联合利华公司(Unilever,The Netherlands))。

2.AT配方，其成分在下表1.1中列出

表1.1：洗涤剂AT配方的组合物

*仅将PAP添加到AT配方而制备出AT配方pH 8洗涤剂+PAP。

**用柠檬酸将AT配方洗涤剂的pH调节至所需值。在稳定性测定法和洗涤性能测定法两者中均使用21°GH水中的0.25％溶液。

F.蛋白质测定

使用Agilent 1200HPLC系统对来自培养上清液的嗜热菌蛋白酶变体执行蛋白质测定。在稀释缓冲液(10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％溶液，10％丙二醇)中使用经纯化的野生型嗜热菌蛋白酶(其浓度使用A222吸光度确定)制备校准曲线(18ppm-400ppm)。将所有样品转移到96孔微板，用盐酸(0.3M最终浓度)预处理，随后在4℃温育5分钟。在使用自动进样器将样品上样到尺寸排阻柱BioSuite 250(4μm UHR，4.6×300mm)(美国马萨诸塞州米尔福德沃特斯公司(Waters Corporation,Milford,Massachusetts))之前，用十二烷基硫酸钠(SDS)将样品处理成具有2％(重量/体积)的最终浓度。使用含有2％(重量/体积)SDS、pH为6的25mM磷酸钠将样品从柱中洗脱。流速为0.4mL/min，运行14分钟。使用紫外检测器在222nm处测量样品的吸收值，随后基于校准曲线确定蛋白质浓度。

通过将变体酶的表达与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的嗜热溶蛋白芽孢杆菌嗜热菌蛋白酶的表达比较，来确定性能指数。

实例2

生成嗜热溶蛋白芽孢杆菌嗜热菌蛋白酶位点评估文库(“SEL”)

嗜热菌蛋白酶样蛋白酶(TLP)是肽酶家族M4的成员，在肽酶家族M4中嗜热菌蛋白酶(TLN；EC 3.4.24.27)为原型。嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27)是一种由嗜热溶蛋白芽孢杆菌分泌的中性金属内切肽酶，其氨基酸序列首先由Titani等人报道(Titani et al,(1972),Amino-acid sequence ofthermolysin.Nature New Biol.238:35-37(Titani等人，1972年，“嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列”，《自然新生物学》，第238卷，第35-37页))。后来，O'Donohue等人克隆了这种酶的基因(O'Donohue,M.J(1994)Cloningand expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillusthermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloproteasethermolysin.Biochem.J.300:599-603(O'Donohue,M.J，1994年，“来自嗜热溶蛋白芽孢杆菌Rokko的编码热稳定金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶的npr基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达”，《生物化学杂志》，第300卷，第599-603页))，序列如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P00800(SEQ ID NO:4)所示出。由Titani等人和O'Donohue等人报道的蛋白质序列之间仅有的差别被确认为：位置37处为Asn(替代Asp)，位置119处为Gln(替代Glu)。

嗜热溶蛋白芽孢杆菌的全长嗜热菌蛋白酶蛋白质(O'Donohue,M.J(1994)Biochem.J.300:599-603(O'Donohue,M.J，1994年，《生物化学杂志》，第300卷，第599-603页))(此处以SEQ ID NO:4示出)与以下物质的同一性大于99％：Geobacillus caldoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶(Chen et al(2004).Extremophiles 8:489-498(Chen等人，2004年，《极端微生物》，第8卷，第489-498页)，且在WO2009058303中有所描述)、嗜热脂肪芽孢杆菌的nprS基因的产物(Nishiya,Y.and Imanaka,T.(1990)J.Bacteriol.172:4861-4869(Nishiya,Y.和Imanaka,T.，1990年，《细菌学杂志》，第172卷，第4861-4869页))，以及嗜热脂肪芽孢杆菌nprM(M.Kubo and T.Imanaka,J.Gen.Microbiol.134:1883-1892,1988(M.Kubo和T.Imanaka，《普通微生物学杂志》，第134卷，第1883-1892页，1988年))。鉴于此，术语“嗜热菌蛋白酶”、“stearolysin”、“芽孢杆菌溶素”、“蛋白酶-T”、“PrT”、“嗜热菌蛋白酶样蛋白酶”和“TLP”在本文中可互换使用，它们均指嗜热溶蛋白芽孢杆菌的中性金属蛋白酶。

嗜热溶蛋白芽孢杆菌的全长嗜热菌蛋白酶蛋白质(SEQ ID NO:4)与Geobacillus caldoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶(SEQ ID NO:5)之间的唯一序列差异在于在位置115处(前区域内)存在的是Ala而不是Ser，这是该位置的密码子中的一个核苷酸改变的结果。(从TCG改变为GCG)。

将pHPLT-蛋白酶T质粒提供给BaseClear(荷兰莱顿公司(Leiden,TheNetherlands))，用于生成位点评估文库(SEL)。该质粒编码Geobacilluscaldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶蛋白质编码序列。全长蛋白质序列(SEQ IDNO:2)在最初克隆的分子的前区域(SEQ ID NO:5)内存在一个氨基酸改变，但是两者均产生相同的具有316个氨基酸的成熟蛋白质。成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质的氨基酸序列以SEQ ID NO:3示出。BaseClear在嗜热菌蛋白酶成熟蛋白质的每个位点处生成位置文库。

该枯草芽孢杆菌表达质粒、pHPLT-蛋白酶T含有下面示出的嗜热菌蛋白酶表达盒、地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)和来自pUB110(McKenzie etal.,Plasmid,15:93-103,1986(McKenzie等人，《质粒》，第15卷：第93-103页，1986年))的包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)在内的额外元件(美国专利No.6,566,112中的图4)。pHPLT-蛋白酶T质粒的图谱在图1中提供。嗜热菌蛋白酶表达盒序列在下文以SEQ ID NO:1提供。

SEQ ID NO:1示出来自表达质粒pHPLT-蛋白酶T的嗜热菌蛋白酶基因的核苷酸序列(天然信号序列以小写字母示出，天然前肽以小写带下划线的文本示出，成熟序列以大写字母示出)：

atgaaaatgaaaatgaaattagcatcgtttggtcttgcagcaggactagcggcccaagtatttttaccttacaatgcgctggcttcaacggaacacgttacatggaaccaacaatttcaaacccctcaattcatctccggtgatctgctgaaagtgaat ggcacatccccagaagaactcgtctatcaatatgttgaaaaaaacgaaaacaagtttaaatttcatgaaaacgctaag gatactctacaattgaaagaaaagaaaaatgataaccttggttttacgtttatgcacttccaacaaacgtataaagggat tcctgtgtttggagcagtagtaactgcgcacgtgaaagatggcacgctgacggcgctatcagggacactgattccga atttggacacgaaaggatccttaaaaagcgggaagaaattgagtgagaaacaagcgcgtgacattgctgaaaaaga tttagtggcaaatgtaacaaaggaagtaccggaatatgaacagggaaaagacaccgagtttgttgtttatgtcaatgg ggacgaggcttctttagcgtacgttgtcaatttaaactttttaactcctgaaccaggaaactggctgtatatcattgatgc cgtagacggaaaaattttaaataaatttaaccaacttgacgccgcaaaaccaggtgacgtcaagtcgATAACAGGAACATCAACTGTCGGAGTGGGAAGAGGAGTACTTGGTGATCAAAAAAATATTAATACAACCTACTCTACGTACTACTATTTACAAGATAATACGCGTGGAAATGGGATTTTCACGTATGATGCGAAATACCGTACGACATTGCCGGGAAGCTTATGGGCAGATGCAGATAACCAATTTTTTGCGAGCTATGATGCTCCAGCGGTTGATGCTCATTATTACGCTGGTGTGACATATGACTACTATAAAAATGTTCATAACCGTCTCAGTTACGACGGAAATAATGCAGCTATTAGATCATCCGTTCATTATAGCCAAGGCTATAATAACGCATTTTGGAACGGTTCGCAAATGGTGTATGGCGATGGTGATGGTCAAACATTTATTCCACTTTCTGGTGGTATTGATGTGGTCGCACATGAGTTAACGCATGCGGTAACCGATTACACAGCCGGACTCATTTATCAAAACGAATCTGGTGCAATTAATGAGGCAATATCTGATATTTTTGGAACGTTAGTCGAATTTTACGCTAACAAAAATCCAGATTGGGAAATTGGAGAGGATGTGTATACACCTGGTATTTCAGGGGATTCGCTCCGTTCGATGTCCGATCCGGCAAAGTATGGTGATCCAGATCACTATTCAAAGCGCTATACAGGCACGCAAGATAATGGCGGGGTTCATATCAATAGCGGAATTATCAACAAAGCCGCTTATTTGATTAGCCAAGGCGGTACGCATTACGGTGTGAGTGTTGTCGGAATCGGACGCGATAAATTGGGGAAAATTTTCTATCGTGCATTAACGCAATATTTAACACCAACGTCCAACTTTAGCCAACTTCGTGCTGCCGCTGTTCAATCAGCCACTGACTTGTACGGTTCGACAAGCCAGGAAGTCGCTTCTGTGAAGCAGGCCTTTGATGCGGTAGGGGTGAAA

SEQ ID NO:2示出来自表达质粒pHPLT-蛋白酶T的嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列(天然信号序列以小写字母示出，天然前肽以小写带下划线的文本示出，成熟序列以大写字母示出)。

mkmkmklasfglaaglaaqvflpynalastehvtwnqqfqtpqfisgdllkvngtspeelvyqyveknenkfk fhenakdtlqlkekkndnlgftfmhfqqtykgipvfgavvtahvkdgtltalsgtlipnldtkgslksgkklsekq ardiaekdlvanvtkevpeyeqgkdtefvvyvngdeaslayvvnlnfltpepgnwlyiidavdgkilnkfnqld aakpgdvksITGTSTVGVGRGVLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLSGGIDVVAHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSVVGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK

SEQ ID NO:3示出由pHPLT-蛋白酶T质粒产生的嗜热菌蛋白酶成熟蛋白质的氨基酸序列(316个残基)：

ITGTSTVGVGRGVLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTL

PGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAI

RSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLSGGIDVVAHELTHAVTD

YTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSVVGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK

SEQ ID NO:4示出来自嗜热溶蛋白芽孢杆菌的嗜热菌蛋白酶的全长氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P00800)

mkmkmklasfglaaglaaqvflpynalastehvtwnqqfqtpqfisgdllkvngtspeelvyqyveknenkfk fhenakdtlqlkekkndnlgftfmrfqqtykgipvfgavvtshvkdgtltalsgtlipnldtkgslksgkklsekqa rdiaekdlvanvtkevpeyeqgkdtefvvyvngdeaslayvvnlnfltpepgnwlyiidavdgkilnkfnqlda akpgdvksITGTSTVGVGRGVLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLSGGIDVVAHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSVVGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK

SEQ ID NO:5示出来自Geobacillus caldoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶的全长氨基酸序列(Chen et al(2004).Extremophiles 8:489-498(Chen等人，2004年，《极端微生物》，第8卷，第489-498页，且在WO2009058303中有所描述)。

mkmkmklasfglaaglaaqvflpynalastehvtwnqqfqtpqfisgdllkvngtspeelvyqyveknenkfk fhenakdtlqlkekkndnlgftfmrfqqtykgipvfgavvtahvkdgtltalsgtlipnldtkgslksgkklsekqa rdiaekdlvanvtkevpeyeqgkdtefvvyvngdeaslayvvnlnfltpepgnwlyiidavdgkilnkfnqlda akpgdvksITGTSTVGVGRGVLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLSGGIDVVAHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSVVGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK

制备嗜热菌蛋白酶变体

通过BaseClear BV(荷兰莱顿公司(Leiden,The Netherlands))针对316个残基中的每一个构造位置文库。所述位置文库由转化的枯草芽孢杆菌细胞组成，该细胞含有编码成熟蛋白质的316个位置处的嗜热菌蛋白酶变体序列的表达质粒。在蛋白质活性评估之前通过DNA测序分析确认每个变体。按下文所述培养单个克隆以获得不同的嗜热菌蛋白酶变体用于功能表征。

蛋白质表达

将包含嗜热菌蛋白酶变体的枯草芽孢杆菌转化株于96孔板内在含10μg/mL新霉素的胰酶大豆肉汤(TSB)中培养16小时，随后将10μL这种预培养物添加到装有190μL补充了10μg/mL新霉素的培养基(下文有所描述)的Corning 3599MTP中。将板在37℃和80％湿度下伴随300rpm的不断旋转混合温育22至26小时。通过以2500rpm离心10分钟来收获细胞，随后使用Millipore真空系统通过Millipore Multiscreen过滤板过滤。收获之后，将丙二醇添加到培养物上清液至10％的最终浓度，将这些样品用于测定。培养基是基于磷酸盐缓冲液的富集半确定成分培养基，以葡萄糖和麦芽糖糊精为主要的碳源，并为使细胞旺盛生长而补充0.2％大豆胨和0.14％酵母提取物。

实例3

识别可组合突变

有效位置被描述为分子内最适用于形成显示具有改善的特性的组合变体的那些位置，其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变可被描述为分子中可用于形成组合变体的那些置换。可组合突变改善了分子的至少一种所需特性，同时未明显降低表达、活性或稳定性中的任一者。

可组合突变改善了分子的至少一种所需特性，同时未明显降低表达、活性或稳定性中的任一者。嗜热菌蛋白酶中的可组合突变使用由实例1中所述的测定法得到的性能指数(PI)值来测定：Abz-AGLA-Nba蛋白酶测定法(活性)、PAS-38微样片测定法(活性)、洗涤剂稳定性和热稳定性测定法，以及蛋白质测定(表达)。

除可组合突变之外，嗜热菌蛋白酶的第二组突变是活性可组合突变。活性可组合突变是改善分子的至少一种活性特性(使其性能指数大于或等于1.5)、而未将表达PI值或稳定性PI值中的任一者降低到低于0.5的那些突变。

已根据以下标准将可组合突变分组(汇总于表3.1)：

包含可组合突变的变体：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI(A组)

包含可组合突变的变体：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI(B组)

包含可组合突变的变体：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI(C组)

表3.1用于将嗜热菌蛋白酶变体的可组合突变分组的标准汇总

A、B和C组还包含对多个置换具有不同容许程度的氨基酸位置。为了识别有效位置，我们测量了每个位置处容许的置换程度，并将有效性得分赋予每个位置。使用下文示出的标准，根据属于A、B和C组的每个位置内的置换的百分比(基于所有测试的变体计算)分配有效性得分。

有效位置被定义为显示出对多个置换的一定程度的容许，同时符合下文示出的一组可组合标准的位置。

确定有效位置的有效性得分的标准如下：

·给定位置处置换的不到15％属于A、B或C组的位置被给予有效性得分“1”。

·给定位置处置换的不到40％但大于或等于15％属于A、B或C组的位置被给予有效性得分“2”。

·给定位置处置换的不到75％但大于或等于40％属于A、B或C组的位置被给予有效性得分“3”。

·给定位置处置换的75％或更多属于A、B或C组的位置被给予有效性得分“4”。

还根据置换出现在其中的组(A、B、C)，赋予这些氨基酸置换适宜性得分；适宜性得分越高，表示置换越适用于制备组合变体。适宜性得分在表3.2中定义。

表3.2依据适宜性得分与可组合突变和有效位置的组的相关性对每个适宜性得分进行定义。

在如下组中出现置换：	适宜性得分
		A、B和C	+++++
A和B	++++
		A或(B和C)	+++
B	++
		C	+

表3.3示出嗜热菌蛋白酶中属于此前描述的有效性得分“4”的有效位置以及这些位置内的可组合置换。位置编号方式基于以SEQ ID NO:3列出的成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质。

表3.3

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			2	T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M	4
26	T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D	4
			47	R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T	4
49	T,A,D,F,H,I,S,W,L,N,Q,V,E,M,Y	4
			53	S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L	4
65	S,I,M,Q,V,L,T,W,A,D,E,P,Y	4
			87	V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y	4
91	L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y	4
			96	N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y	4
108	Q,C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M	4
			118	S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V	4
128	Q,C,D,E,R,S,V,I,K,A,L,Y	4
			154	G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y	4
179	Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F	4
			196	G,D,E,T,K,R,V,H,L,Y,A,W	4
197	I,D,K,L,T,V,W,Y,A,H,N,E,Q,R,F,C	4
			198	S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K	4
199	G,C,E,F,H,Q,S,T,W,L,A,Y	4
			209	A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M	4
211	Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R	4
			217	Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L	4
219	K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S	4
			225	Q,D,G,H,I,P,V,W,A,M,R,C,E,K,L,S	4
232	I,C,E,F,K,M,N,Q,W,G,L,R,S,T,V,Y	4
			256	V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S,N	4
257	G,C,D,E,L,N,P,Q,S,T,Y,K,R	4
			259	G,A,C,E,F,H,L,M,W,K,R,N,S,T	4

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			261	D,A,N,P,V,W,G,H,I,S	4
265	K,A,C,D,M,P,Q,S,G,I,L,R,N	4
			267	F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y	4
272	T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K	4
			276	T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y	4
277	P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y	4
			286	A,D,E,F,G,H,I,S,P,C,Q,R,T,K,L,M,N,Y	4
289	V,C,E,F,G,I,N,S,W,R,T,L,M,Y,A	4
			290	Q,C,D,F,G,L,W,Y,R,T,V,A,H,N	4
293	T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y	4
			295	L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W	4
298	S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R	4
			299	T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K	4
300	S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,W,A,G,T,D,N	4
			301	Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K	4
303	V,C,H,G,K,L,R,W,A,P,Y	4
			305	S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M	4
308	Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L	4
			311	D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y	4
316	K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M	4

表3.4示出嗜热菌蛋白酶中属于此前描述的有效性得分“3”的有效位置以及这些位置内的可组合置换。位置编号方式基于以SEQ ID NO:3列出的成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质。

表3.4

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			1	I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L	3
4	T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y	3
			17	Q,I,W,Y,C,R,V,T,L	3
25	S,D,F,A,C,K,M,R	3
			40	F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L	3
45	K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M	3
			56	A,K,Q,V,W,H,I,Y,E,M	3
58	A,N,Y,C,V,E,L	3
			61	Q,M,R,W,F,V,C,I,L	3
74	H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W	3
			86	N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D	3
97	N,K,C,R,S,Y,E,M	3
			101	R,T,C,L,S,H	3

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			109	G,A,L,S,E,M,R,W	3
149	T,M,V,A,L,D,S,N	3
			150	D,A,F,K,N,Q,T,V,S	3
158	Q,A,K,M,N,L,R,Y,S	3
			159	N,R,W,A,C,G,M,T,S,Y	3
172	F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H	3
			181	N,L,A,G,K,M,T,S	3
214	P,C,G,K,S,N,A,R	3
			216	H,C,E,S,T,R,A	3
218	S,K,L,Y,F,G,T,V	3
			221	Y,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M	3
222	T,C,D,L,Y,I,V,A,M,K	3
			224	T,K,M,F,L,P,Q,V,Y,E,H	3
250	H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y	3
			253	V,N,T,I,R,Y,M,Q	3
254	S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W	3
			258	I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V	3
263	L,C,I,Q,T,H,K,N,V,A,M	3
			264	G,C,R,A,N,P,Q,S,T	3
266	I,A,F,L,S,C,M,T,V	3
			268	Y,M,Q,V,A,S,K	3
271	L,A,D,F,I,N,Y,H	3
			273	Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N	3
275	L,I,M,V,C,Q,S,T	3
			278	T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S	3
279	S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G	3
			280	N,A,C,D,E,G,Q,H,T	3
282	S,K,N,R,A,H,L,M,T	3
			283	Q,K,L,P,R,W,Y,S	3
287	A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C	3
			288	A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M	3
291	S,E,I,L,M,N,V,A,T	3
			297	G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N	3
302	E,K,L,G,T,V,D,Q,A	3
			304	A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y	3
307	K,A,C,G,I,M,N,Q,R,W,Y,H	3
			312	A,G,M,V,L,N,R,T,C	3

表3.5示出嗜热菌蛋白酶中属于此前描述的有效性得分“2”的有效位置以及这些位置内的可组合置换。位置编号方式基于以SEQ ID NO:3列出的成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质。

表3.5

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			5	S,D,N,P,H,L	2
9	V,L,T,I	2
			11	R,I,Y,K	2
19	N,L,Y,K,S	2
			27	Y,W,A,M,V,C,L	2
31	Q,A,K,V,I,C,Y	2
			33	N,S,T,K,A,C,L,M	2
37	N,D,Q,R,L,K	2
			46	Y,L,H,N,C	2
64	A,H,Q,T,D,E	2
			73	A,I,F,L,M,W	2
76	Y,H,L,M,Q,T	2
			79	V,L,Q,T,A,N,S	2
80	T,I,D,A,L,N	2
			85	K,E,A,L,N,R,S	2
89	N,L,M,H	2
			95	G,A,D,H,M,N,S	2
98	A,C,E,H,R,Y,K,V	2
			99	A,E,K,P,R,S	2
107	S,D,K,Y,A,G	2
			127	G,C,D,E	2
129	T,I,R,E,Y,L,M	2
			131	I,Y,W,L	2
137	I,P,A,E,T,V,L	2
			141	A,S,C,G	2
145	T,A,C,E,G,M,N,Q	2
			148	V,L,N,Y,M,A,Q	2
151	Y,K,G,H,S,W	2
			152	T,S,L,M,G	2
155	L,C,I,M	2
			156	I,M,T,L,Q	2
160	E,L,Y,Q	2
			161	S,A,N,P,T	2
164	I,L,N,S,T,V,C,A	2
			168	I,A,M,T,L	2
171	I,C,E,F,L,S,G	2
			176	V,L,N,C	2
180	A,E,G,K,T,S	2
			182	K,L,A,W	2
187	E,L,D	2

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			188	I,L,V	2
205	M,L,A,V,Q	2
			206	S,A,C,K,L,M,R	2
207	D,A,H,N	2
			210	K,I,L,V	2
212	G,Y,A,D,Q	2
			213	D,N,S,L,A,G,W	2
220	R,K,V,A	2
			227	N,D,L,Y,A	2
234	S,D,N,A,C	2
			235	G,M,C,Q,S,A	2
236	I,M,A,C	2
			237	I,N,F,M	2
242	Y,C,F,N,V	2
			244	I,T,V,F,A,M,L	2
246	Q,E,N,T,L,C,D	2
			248	G,A,E,S	2
249	T,K,M,N,L,Y,P	2
			252	G,K,Y,A,S,T,W	2
255	V,L,P,A,Y,M,N	2
			270	A,C,F,I,L,S,G	2
274	Y,F,H,A,C,Q,T,M	2
			284	L,V,W,A,M,Y	2
294	D,A,V,Q,N	2
			296	Y,N,L,R,H,W,M	2
306	V,A,S,F,I,L,T	2
			309	A,G,S,T,V,C	2
310	F,A,C,W,M	2
			313	V,T,A,G,L,I,C	2
314	G,A,E,H,M,S,W,Q	2
			315	V,A,C,I,M,L,T	2

表3.6示出嗜热菌蛋白酶中属于此前描述的有效性得分“1”的有效位置以及这些位置内的可组合置换。位置编号方式基于以SEQ ID NO:3列出的成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质。

表3.6

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			3	G,Y	1
6	T,C,V	1

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			7	V,L,I	1
20	I,L,V	1
			23	T,F,W	1
24	Y,W	1
			44	A,C	1
48	T,E,D	1
			50	L,P	1
57	D,K	1
			63	F,Y,C	1
72	D,F,W	1
			75	Y,A	1
81	Y,F	1
			92	S,L	1
93	Y,T,C	1
			94	D,T	1
100	I,L,V	1
			102	S,G,N	1
103	S,T	1
			104	V,A	1
110	Y,L	1
			117	G,H	1
120	M,L	1
			134	S,A,P	1
135	G,A	1
			136	G,A,S	1
140	V,D	1
			144	L,T	1
153	A,T	1
			173	G,A,C	1
174	T,C,A	1
			175	L,H,S	1
178	F,H,Y	1
			183	N,S	1
185	D,E	1
			189	G,A	1
193	Y,F	1
			201	S,C,A	1
223	G,D,K	1
			230	V,A	1
238	N,L,M	1
			239	K,A	1
241	A,L,S	1
			247	G,A,S	1

位置	置换，第一个是野生型	有效性得分
			251	Y,M	1
260	R,A,N	1
			262	K,A	1
269	R,V,K	1
			285	R,K,Y	1

实例4

可组合突变和适宜性得分

如实例3所示，使用由实例1中所述的测定法得到的性能指数(PI)值来测定嗜热菌蛋白酶中的可组合突变。

根据实例3中示出的标准将可组合突变分配到A、B或C组。还根据置换出现在其中的组(A、B、C)，赋予这些置换适宜性得分；适宜性得分越高，表示置换越适用于制备组合变体。适宜性得分在表4.1中定义。以下报道了符合上述标准的嗜热菌蛋白酶的各个置换的适宜性得分。

表4.1依据适宜性得分与可组合突变和有效位置的组的相关性对每个适宜性得分进行定义。

适宜性得分为+++++的变体：

I001L、T002A、T002C、T002I、T002K、T002M、T004K、T004L、T004M、T004Y、Q017L、N037K、F040K、F040L、K045A、K045G、K045M、T049E、T049M、T049Y、L050P、S053C、S053L、A056M、A058E、A058L、Q061L、F063C、A064D、A064E、S065A、S065D、S065E、S065P、S065Y、V087C、V087K、V087L、V087M、V087N、V087Q、V087W、V087Y、N096K、N096L、N096Y、R101H、Q108L、Q108M、G109E、G109M、G109R、G109W、S118A、S118D、S118M、S118Q、S118R、S118T、S118V、Q128A、Q128L、Q128Y、I131L、I137L、T149N、G154A、G154H、G154K、G154M、G154Y、L155M、I164A、N181S、G196A、G196W、I197C、S198A、S198K、G199A、G199Y、A209C、A209M、H216A、Y217C、Y217L、T222K、N227A、I244L、Q246D、V256N、L263A、L263M、T272K、Q273N、Y274M、P277A、P277D、P277Y、L284A、L284M、L284Y、A286K、A286L、A286M、A286N、A286Y、A287C、A288L、A288M、V289A、S291A、S291T、T293A、T293I、T293K、T293L、T293M、T293Y、L295A、L295K、L295M、L295W、Y296M、G297N、S298A、S298G、S298K、S298M、S298R、T299A、T299K、S300D、S300N、Q301K、E302A、V303A、V303P、V303Y、A304E、A304K、A304Y、S305A、S305K、S305M、V306L、V306T、A309C、F310M、D311A、D311K、D311L、D311M、D311V、D311W、D311Y和A312C

适宜性得分为++++的变体：

T002Q、T004V、V007I、V009I、R011K、I020L、I020V、S025A、S025C、S025K、S025M、S025R、T026C、T026D、Y027C、Y027L、N037L、F040A、A044C、K045F、K045H、K045Q、K045Y、Y046C、R047D、R047E、R047G、R047L、R047M、R047Q、R047T、T049L、T049N、T049Q、T049V、S053A、S053N、S053V、A056E、Q061C、Q061I、A064T、S065L、S065T、S065W、A073F、A073L、A073M、A073W、H074C、H074F、H074M、H074N、H074Q、H074W、T080L、T080N、K085S、N086D、V087R、V087T、L091A、L091N、L091R、L091W、L091Y、S092L、Y093C、N096G、N096H、N096Q、N096R、N096S、N096W、N097E、N097M、A099R、A099S、R101C、R101L、R101S、S102N、S107G、Q108I、Q108K、Q108N、G109S、S118E、M120L、Q128I、Q128K、T129L、T129M、I131W、S134P、G136S、I137E、I137T、I137V、V140D、V148A、V148Q、T149D、T149S、T152G、G154C、G154N、L155I、N159S、N159Y、I164C、I168L、I171G、Y179F、A180S、G189A、Y193F、G196H、G196L、G196Y、I197F、S198M、S198N、S198R、S198W、S201A、A209G、A209I、A209K、A209P、A209R、A209Y、Y211E、Y211R、P214A、P214R、Y217A、Y217F、Y217M、Y217N、K219A、K219E、K219R、K219S、R220A、Y221A、Y221F、Y221G、Y221M、T222A、T222M、Q225C、Q225E、Q225K、Q225L、Q225S、I232L、I232R、I232S、I232T、I232V、I232Y、S234A、S234C、G235A、I236C、I244A、I244M、Q246C、V256S、G257K、G257R、I258A、I258C、I258K、I258Q、I258V、G259N、G259S、G259T、L263H、L263K、L263N、L263V、G264A、G264N、G264P、G264Q、G264S、G264T、K265N、I266C、I266M、I266T、I266V、F267A、F267C、F267H、F267I、F267K、F267L、F267M、F267T、F267Y、R269K、A270G、L271H、T272A、Q273E、Q273G、L275C、L275Q、L275S、L275T、T276A、T276L、T276V、T276Y、P277E、P277F、P277G、P277H、P277N、P277R、P277V、P277W、S279G、R285Y、A286C、A286Q、A286R、A286T、A288N、V289L、V289M、V289Y、Q290A、Q290H、Q290N、S291V、T293N、T293V、T293W、D294N、L295F、L295G、Y296W、G297D、S298E、S298N、S298P、T299N、S300A、S300G、S300T、Q301M、Q301S、Q301T、Q301V、E302D、E302Q、V303G、V303K、V303L、V303R、V303W、A304R、A304S、A304T、A304W、S305H、S305T、S305V、V306I、Q308A、Q308L、F310C、F310W、D311F、D311G、D311I、D311Q、D311S、D311T、V313C、G314Q、V315L、V315T、K316A和K316M

适宜性得分为+++的变体：

I001K、I001M、I001V、T002F、T002L、T002P、T002S、T002V、T002W、T002Y、T004E、S005D、S005N、S005P、T006C、R011I、Q017I、Q017W、Q017Y、S025D、S025F、T026K、T026L、T026R、T026V、T026Y、Y027W、Q031A、Q031K、Q031V、N033S、N033T、N037D、N037Q、N037R、F040E、F040G、F040M、F040Q、F040S、F040Y、K045E、K045L、K045S、Y046L、R047A、R047C、R047H、R047K、R047N、T048E、T049A、T049D、T049F、T049H、T049I、T049S、S053F、S053H、S053I、S053M、S053Q、S053T、S053W、A056K、A056Q、A056V、A056W、Q061M、S065I、S065M、S065Q、S065V、D072F、H074E、H074L、Y076H、Y076L、Y076M、Y076Q、V079L、V079Q、V079T、T080I、Y081F、K085E、N086L、N086S、V087D、V087E、V087G、V087I、V087S、L091D、L091E、L091F、L091K、L091M、L091P、L091Q、L091S、Y093T、G095A、G095D、G095H、G095M、G095N、G095S、N096C、N096D、N096I、N096V、N097K、A098C、A098E、A098H、A098R、A099E、A099K、A099P、S107D、Q108C、Q108E、Q108F、Q108H、G127C、G127D、G127E、Q128C、Q128D、Q128E、Q128R、Q128S、T129I、T129R、S134A、I137P、A141S、T145A、T145C、T145E、T145G、T145M、T145N、T145Q、V148L、V148N、V148Y、T149M、T149V、Y151K、T152S、A153T、G154L、G154Q、G154S、G154T、L155C、Q158A、Q158K、Q158M、Q158N、N159R、N159W、S161A、S161N、S161P、S161T、I164L、I164N、I164S、I164T、I164V、I171C、I171E、I171F、I171L、I171S、F172G、F172L、F172M、F172Q、F172S、F172V、F172W、F172Y、G173A、G173C、T174C、V176L、V176N、N181L、G196D、G196E、G196T、I197D、I197K、I197L、I197T、I197V、I197W、I197Y、S198C、S198E、S198F、S198G、S198H、S198I、S198P、S198Q、S198T、S198V、G199C、G199E、G199F、G199H、G199Q、G199S、G199T、G199W、M205L、A209D、A209E、A209L、A209S、A209T、A209V、Y211A、Y211C、Y211D、Y211F、Y211G、Y211H、Y211I、Y211L、Y211N、Y211Q、Y211S、Y211T、D213N、D213S、P214C、P214G、P214K、P214S、H216C、H216E、H216S、H216T、Y217Q、Y217S、Y217T、Y217V、Y217W、S218K、S218L、S218Y、K219D、K219F、K219G、K219H、K219I、K219M、K219N、K219Q、K219T、R220K、R220V、Y221K、Y221N、Y221Q、Y221R、Y221S、Y221T、Y221V、T222C、T222D、T222L、T222Y、T224K、T224M、Q225D、Q225G、Q225H、Q225I、Q225P、Q225V、Q225W、I232C、I232E、I232F、I232K、I232M、I232N、I232Q、I232W、S234D、G235M、I236M、Y242C、Y242F、Y242N、Y242V、I244T、I244V、Q246E、Q246N、Q246T、G247A、G247S、T249K、T249M、T249N、H250A、H250C、G252K、G252Y、V253N、V253T、S254A、S254M、S254R、S254Y、V255L、V255P、V256L、V256T、G257C、G257D、G257E、G257L、G257N、G257P、G257Q、G257S、G257T、G257Y、I258E、I258L、I258M、I258N、G259A、G259C、G259E、G259F、G259H、G259L、G259M、G259W、D261A、D261N、L263C、L263I、L263Q、L263T、K265A、K265C、K265D、K265M、K265P、K265Q、K265S、I266A、I266F、I266L、I266S、F267E、F267G、F267N、F267S、F267V、F267W、Y268M、Y268Q、Y268V、A270C、A270F、A270I、A270L、A270S、L271A、L271D、L271F、L271I、T272E、T272L、T272V、T272W、Q273A、Q273H、Q273Y、Y274F、Y274H、L275I、L275M、L275V、T276C、T276F、T276I、T276P、T276Q、T276W、P277Q、P277S、P277T、T278G、S279A、S279D、S279I、S279L、S279M、S279N、S279Q、S279T、N280A、N280C、N280D、N280E、S282K、S282N、L284V、L284W、R285K、A286D、A286E、A286F、A286G、A286H、A286I、A286S、A287I、A287L、A287N、A287V、A287Y、A288C、A288I、A288S、A288T、A288V、V289C、V289E、V289F、V289G、V289I、V289N、V289S、V289W、Q290C、Q290D、Q290F、Q290G、Q290L、Q290W、S291E、T293C、T293E、T293F、T293G、T293H、T293Q、T293S、L295C、L295I、L295N、Y296N、G297A、G297M、G297R、G297Y、S298C、S298T、S298W、S298Y、T299C、T299F、T299L、T299M、T299R、T299W、S300C、S300K、S300M、S300R、S300Y、Q301E、Q301H、Q301P、Q301R、V303C、V303H、A304C、A304D、A304L、A304N、S305G、S305I、S305L、S305N、S305W、S305Y、V306A、V306S、K307A、K307C、K307G、K307I、K307M、K307N、K307Q、K307R、K307W、K307Y、Q308C、Q308D、Q308F、Q308G、Q308I、Q308M、A309G、A309S、D311C、D311E、A312G、A312M、A312V、V313T、G314A、G314E、G314H、G314M、G314S、G314W、V315A、V315C、V315I、V315M、K316D、K316E、K316F、K316G、K316H、K316L、K316N、K316P、K316Q、K316R、K316S、K316V、K316W和K316Y

适宜性得分为++的变体：

I001C、T004R、T006V、Q017T、N019K、N019S、T023F、T023W、Y024W、T026F、T026G、T026H、T026I、T026M、Y027M、Y027V、Q031C、Q031Y、N033A、N033C、N033L、N033M、Y046H、Y046N、T048D、T049W、A058C、A058V、Q061F、Q061V、A064H、A064Q、D072W、A073I、H074V、Y076T、V079S、T080A、K085A、K085L、K085N、K085R、N086A、N086C、N086E、N086F、N086G、N086K、N089H、N096F、N096T、N097C、N097R、N097S、N097Y、A098K、A098V、I100L、I100V、R101T、S102G、S103T、S107A、Q108D、G117H、S118G、Q128V、T129Y、G136A、A141G、L144T、V148M、D150S、Y151G、Y151H、Y151S、Y151W、G154D、G154I、G154W、I156L、I156Q、Q158S、N159A、N159C、N159G、N159M、N159T、E160Q、I168A、I168M、I168T、F172D、F172H、L175S、V176C、F178H、F178Y、Y179A、Y179D、Y179H、Y179M、Y179N、Y179Q、Y179S、Y179T、Y179W、A180E、A180G、A180K、A180T、N181G、N181K、N181M、N181T、K182A、K182W、N183S、D185E、E187D、I188V、G196K、G196R、G196V、I197E、I197Q、I197R、G199L、S201C、M205Q、S206M、S206R、D207H、D207N、K210I、K210L、K210V、G212A、G212D、G212Q、D213A、D213G、D213W、P214N、Y217G、S218G、S218T、S218V、T222I、T222V、G223D、G223K、T224E、T224H、Q225A、Q225M、Q225R、V230A、I232G、S234N、G235C、G235Q、G235S、I237F、I237M、I244F、G248A、G248E、G248S、T249P、Y251M、G252A、G252S、G252T、G252W、V253M、V253Q、S254N、S254V、S254W、V255M、V255N、V256A、V256D、V256F、V256G、V256H、V256R、I258R、I258S、G259K、G259R、R260A、R260N、D261G、D261H、D261I、D261S、G264C、G264R、K265G、K265I、K265L、K265R、Y268K、L271N、L271Y、T272C、T272F、T272N、T272Q、Y274C、Y274Q、Y274T、T276H、T278C、T278H、T278M、T278N、T278Q、T278S、N280H、N280T、S282A、S282H、S282L、S282M、S282T、Q283S、A286P、A287D、A288Y、V289R、V289T、Q290R、Q290T、Q290V、D294Q、L295T、L295V、Y296H、G297C、G297F、G297K、G297T、T299D、T299Q、S300H、S300P、S300V、S300W、Q301C、Q301F、Q301G、Q301W、E302G、E302T、E302V、S305Q、V306F、K307H、Q308R、Q308V、Q308W、Q308Y、A309T、A309V、A312T和V313I

适宜性得分为+的变体：

I001A、I001H、I001W、I001Y、G003Y、T004A、T004N、S005H、S005L、V007L、V009L、V009T、R011Y、Q017C、Q017R、Q017V、N019L、N019Y、T026W、Y027A、Q031I、N033K、F040W、S053K、S053R、A056H、A056I、A056Y、D057K、A058N、A058Y、Q061R、Q061W、F063Y、Y075A、V079A、V079N、T080D、N086Y、V087P、N089L、N089M、D094T、A098Y、V104A、S107K、S107Y、Q108A、G109A、G109L、Y110L、S118C、T129E、I131Y、G135A、I137A、A141C、T149A、T149L、D150A、D150F、D150K、D150N、D150Q、D150T、D150V、T152L、T152M、I156M、I156T、Q158L、Q158R、Q158Y、E160L、E160Y、T174A、L175H、N181A、K182L、E187L、I188L、I197A、I197H、I197N、M205A、M205V、S206A、S206C、S206K、S206L、D207A、G212Y、D213L、H216R、S218F、T224F、T224L、T224P、T224Q、T224V、T224Y、N227D、N227L、N227Y、I236A、I237N、N238L、N238M、K239A、A241L、A241S、Q246L、T249L、T249Y、H250K、H250M、H250N、H250P、H250Q、H250R、H250V、H250Y、V253I、V253R、V253Y、S254K、S254L、V255A、V255Y、V256K、D261P、D261V、D261W、K262A、Y268A、Y268S、R269V、T272P、T272Y、Q273C、Q273S、Q273W、Y274A、T278K、T278R、T278Y、N280G、N280Q、S282R、Q283K、Q283L、Q283P、Q283R、Q283W、Q283Y、A287K、A287R、A287T、Q290Y、S291I、S291L、S291M、S291N、D294A、D294V、Y296L、Y296R、T299P、S300I、S300L、Q301L、E302K、E302L、F310A、A312L、A312N、A312R、V313A、V313G和V313L

表4.2示出嗜热菌蛋白酶的活性可组合变体。位置编号方式基于以SEQ ID NO:3列出的成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质。

位置	变体
		17	E,F,P
19	A,D,H,I,R,T,V
		24	F,H
25	H

31	L
		33	Q
40	C
		48	A,R
73	Y
		79	C
80	C,R
		81	H
85	C,M,Y
		86	V
89	K,R,T,V
		94	E
109	D
		117	A,K,R,T
140	S
		141	T
150	E,M,W
		151	A,C,E,I
152	D
		153	V
156	H,R
		158	F,G,I,V
159	F,I,K
		160	S
161	Y
		168	N
171	D
		174	S,V
175	C,E,F,G,I
		176	E,Q
178	C,M
		180	L,W
181	Y
		182	F,R
183	H,I,L,M,Q,R,T
		189	C
205	C,F
		206	F,H,I,T,V,Y
207	T
		210	A,E,F,G,H,T
212	F,H,K,M,N,R,S,T
		213	I,K,R,V,Y

214	Q
		218	R
223	Y
		224	I,R
227	C,E,G,K,Q,R,S,T,V
		235	D,L,T
236	P
		237	A,Q
238	A,C,D,E,R,S
		239	C,G,H,L,Q,R,S,V,Y
241	E,F,G,I,T,V
		244	Q
246	K,R
		248	C,H
249	G,V
		250	F,S
251	H
		252	F,I,L
253	A,D,E,P
		254	C,F,G,H,I,P
255	F,Q
		258	F
259	I
		260	C,D,I
261	K,R,T
		262	C,F,H,L,P,R
266	W
		268	F,R
269	P,T,W,Y
		270	M,N,P,V
271	V
		272	R
273	R
		274	D,E
276	G,S
		278	V
279	E
		280	P,R,V
282	P
		283	A,C,E,G,H,T,V
294	T
		295	R

296	E,I
		297	I,V
300	Q
		302	W
306	Y
		310	I,N
312	Q

另外列出了选取的嗜热菌蛋白酶的有效位置变体。位置编号方式基于以SEQ ID NO:3列出的成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质。T002I、T002M、T048E、A058L、F063C、V087L、N096H、Q128Y、Y151R、A180E、S198A、I244T、Q273N、P277R、T278R、Q283E、T293L、T293N、L295F、S298A、Q301I、N019D、S025A、T026R、T049K、T049Q、F063L、S065A、S065T、L091M、N096Q、N096R、N096Y、N097K、R101M、G109A、S118A、I131L、V140D、Q158A、N159E、N159K、L175V、A180R、G196H、G196T、G196Y、K219S、Q225E、I232R、I244L、Q246D、D261N、P277G、T293Y、S300G、Q301F、Q301M、V303R、S305A、D311A。

实例5

嗜热菌蛋白酶同源物的识别

A.在蛋白酶的MEROPS数据库中识别相关分子

嗜热溶蛋白芽孢杆菌的嗜热菌蛋白酶归类于MEROPS蛋白酶数据库(http://merops.sanger.ac.uk)中的家族M4(M指金属蛋白酶)下。嗜热菌蛋白酶是M4家族(嗜热菌蛋白酶家族)金属蛋白酶的原型和MA族群的类型例。因为第三锌配体是谷氨酸盐，故嗜热菌蛋白酶被进一步归类为子族群MA(E)，也称为谷氨酸锌蛋白。嗜热溶蛋白芽孢杆菌的嗜热菌蛋白酶分配到的Merops登录号为MER001026。

MEROPS数据库对肽酶(蛋白酶)采用基于结构的层次分类方法。在此，基于氨基酸序列在统计学上显著的相似性将每种肽酶分配到相应家族，并将被认为具有同源性的家族归类到一起成为族群。根据分子结构和同源性对肽酶进行分类始于二十世纪九十年代，原因在于这种分类取决于氨基酸序列数据的可用性和当时对大批量的三维结构的认识。在1993年，Rawlings和Barrett描述了一种其中各肽酶被分配到家族、随后家族被归类到一起成为族群的系统(Rawlings,N.D.&Barrett,A.J.(1993)Evolutionaryfamilies of peptidases.Biochem J 290,205-218(Rawlings,N.D.和Barrett,A.J.，1993年，“肽酶的进化家族”，《生物化学杂志》，第290卷，第205-218页))。

M4家族中的所有肽酶结合单个催化锌离子。像在许多其他家族的金属肽酶中那样，存在HEXXH基序，其中组氨酸为锌配体，谷氨酸为活性位点残基。该家族的大多数成员在中性pH下具有内肽酶活性且几乎全部来自细菌，而热稳定性则归因于其与钙离子的结合。蛋白质和肽利用Xaa+Yaa的优先裂解来降解，其中Xaa为疏水残基，Yaa为亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。嗜热菌蛋白酶具有双结构域结构，该结构在其结构域之间具有活性位点。N-端结构域包括具有两个螺旋的独特六链β-折叠，其中一个螺旋携带HEXXH锌结合基序。C-端结构域是该家族独有的，主要为螺旋形且携带第三锌配体。

在MEROPS(第9.5版)内对成熟嗜热菌蛋白酶蛋白质(SEQ ID NO:3)的同源物进行BLAST搜索得到下面示出的结果(表5.1)。每种酶由MEROPS数据库的唯一登录号、基因来源列出，并示出由程序计算的百分比同一性。

表5.1：针对M4家族金属蛋白酶的成员(包括嗜热菌蛋白酶)的 MEROPS数据库输出。

可对MEROPS数据库中的各家族的成员执行进一步分析，诸如系统发育树的生成。M4家族系统发育树的424个成员的结构(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famwrap/famcards/trees/m4_tree.htm)在下文中提供(图2A-图2C)。

M4家族系统发育树的序列和结构的关键之处在图2上示出。

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

1 (橙色标桩菌)M4家族未分配的肽酶(MER086404)

P_前蛋白～肽酶_M4～肽酶_M4_C

2 (橙色标桩菌)M4家族未分配的肽酶(MER086488)

3 (黄色粘球菌)M4家族未分配的肽酶(MER068045)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PPC

4 (被囊假交替单胞菌)M4家族未分配的肽酶(MER063156)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

5 M04.017(阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis))griselysin(MER028561)

6 M04.017(斯维链霉菌(Streptomyces sviceus))griselysin(MER144000)

7 M04.017(产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes))griselysin(MER229668)

8 M04.017(天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))griselysin(MER012275)

9 M04.017(疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei))griselysin(MER200776)

10 M04.017(黄色韩国生工菌(Kribbella flavida))griselysin(MER076577)

11 M04.017(两面神菌属物种HTCC2649)griselysin(MER119370)

12 M04.017(类诺卡氏菌属物种JS614)griselysin(MER075575)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

13 M04.017(橙色标桩菌)griselysin(MER086497)

14 M04.017(野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris))griselysin(MER070193)

15 M04.017(地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis))griselysin(XAC0465蛋白质)(MER019560)

16 M04.017(水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae))griselysin(MER113870)

17 M04.017(小单孢菌属物种L5)griselysin(MER230635)

18 M04.017(阿维链霉菌)griselysin(SAV1037蛋白质)(MER028563)

19 M04.017(斯维链霉菌)griselysin(MER187827)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

20 M04.017(始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis))griselysin(MER137080)

21 M04.017(链霉菌属物种SPB74)griselysin(MER163965)

22 M04.017(白色链霉菌(Streptomyces albus))griselysin(MER187823)

23 M04.017(阿维链霉菌)griselysin(SAV2795蛋白质)(MER028566)

24 M04.017(斯维链霉菌)griselysin(MER137175)

25 M04.017(加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis))griselysin(MER187817)

26 M04.017(天蓝色链霉菌)griselysin(MER019351)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

27 M04.017(疮痂病链霉菌)griselysin(MER200969)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～P_前蛋白

28 M04.017(链霉菌属物种SPB74)griselysin(MER137964)

29 M04.017(斯维链霉菌)griselysin(MER187826)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～He_PIG

30 4.017(阿维链霉菌)griselysin(MER028567)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

31 04.017(横膈链霉菌(Streptomyces septatus))griselysin(MER108931)

32 04.017(疮痂病链霉菌)griselysin(MER200878)

33 04.017(链霉菌属物种Mg1)griselysin(MER180683)

34 04.017(斯维链霉菌)griselysin(MER187825)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～P_前蛋白

35 04.017(天蓝色链霉菌)griselysin(MER011085)

36 04.017(疮痂病链霉菌)griselysin(MER200968)

37 04.017(加纳链霉菌)griselysin(MER187816)

38 04.017(灰色链霉菌(Streptomyces griseus))griselysin(MER004744)

39 04.017(丝状链霉菌(Streptomyces filamentosus))griselysin(MER187821)

40 04.017(阿维链霉菌)griselysin(MER028565)

41 04.017(链霉菌属物种Mg1)griselysin(MER163416)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

42 04.017(灰色链霉菌)griselysin(MER121393)

43 04.017(丝状链霉菌)griselysin(MER187820)

44 04.017(链霉菌属物种TH-3)griselysin(MER169964)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

45 04.017(两面神菌属物种HTCC2649)griselysin(MER109443)

46 04.017(两面神菌属物种HTCC2649)griselysin(MER109417)

47 04.017(黄色韩国生工菌)griselysin(MER096497)

48 04.017(阿维链霉菌)griselysin(MER028564)

49 04.022(类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei))ZmpA肽酶(MER029961)

50 04.022(鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei))ZmpA肽酶(MER040142)

51 04.022(泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis))ZmpA肽酶(MER058477)

52 04.022(Burkholderia oklahomensis)ZmpA肽酶(MER187766)

53 04.022(新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia))ZmpA肽酶(MER050804)

54 04.022(洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))ZmpA肽酶(MER028622)

55 04.022(双向伯克霍尔德菌(Burkholderia ambifaria))ZmpA肽酶(MER055697)

56 04.022(伯克霍尔德菌属物种383)ZmpA肽酶(MER056816)

57 04.022(尤伯纳伯克霍尔德菌(Burkholderia ubonensis))ZmpA肽酶(MER166266)

58 脱卤拟球菌属物种VS)M4家族未分配的肽酶(MER109883)

59 未鉴定的真细菌SCB49)M4家族未分配的肽酶(MER137229)

60 Croceibacter atlanticus)M4家族未分配的肽酶(MER118340)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～fn3

61 约氏黄杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER062832)

62 柱状黄杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER091620)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

63 Croceibacter atlanticus)M4家族未分配的肽酶(MER109847)

64 粘金黄杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187776)

65 Kordia algicida)M4家族未分配的肽酶(MER166403)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～MAM

66 海洋微颤菌(Microscilla marina))M4家族未分配的肽酶(MER091624)

67 Croceibacter atlanticus)M4家族未分配的肽酶(MER117388)

68 Croceibacter atlanticus)M4家族未分配的肽酶(MER138802)

69 幼虫芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187765)

70 04.001(幼虫芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER168882)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

71 多粘类芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER001033)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

72 04.001(短短芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001028)

73 4.001(短短芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(npr蛋白质)(MER169677)

74 M04.001(假蕈状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER187790)

75 M04.001(蕈状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER187794)

76 M04.001(蜡状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER061817)

77 M04.001(蜡状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER187808)

78 M04.001(韦氏芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER109389)

79 M04.001(蕈状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER187798)

80 M04.001(蜡状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001030)

81 M04.001(苏云金芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER003181)

82 M04.001(假蕈状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER176709)

83 M04.001(乳杆菌属物种)嗜热菌蛋白酶(MER001354)

84 M04.001(炭疽芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER021824)

85 M04.001(巨大芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001031)

86 M04.001(芽孢杆菌属物种SG-1)嗜热菌蛋白酶(MER109427)

87 M04.001(热容芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001034)

88 M04.018(嗜热脂肪地芽孢杆菌)stearolysin(MER001025)

89 M04.001(地芽孢杆菌属物种Y412MC52)嗜热菌蛋白酶(MER234417)

90 M04.001(酸热脂环酸芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001353)

91 M04.001(芽孢杆菌属物种)嗜热菌蛋白酶(MER001927)

92 M04.001(地芽孢杆菌属物种Y412MC61)嗜热菌蛋白酶(MER168133)

93 M04.001(地芽孢杆菌属物种C56-T3)嗜热菌蛋白酶(MER212338)

94 M04.001(嗜热地芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER040474)

95 M04.001(嗜热溶蛋白芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001026)

96 M04.001(嗜热脂肪地芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER001027)

97 M04.018(芽孢杆菌属物种SG-1)stearolysin(MER109364)

98 M04.001(西伯利亚微小杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER091675)

99 M04.001(微小杆菌属物种AT1b)嗜热菌蛋白酶(MER124526)

100 M04.001(蕈状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER187797)

101 M04.001(假蕈状芽孢杆菌)嗜热菌蛋白酶(MER187793)

102 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187787)

103 M04.012(苏云金芽孢杆菌)中性肽酶B(MER039810)

104 M04.012(蜡状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER028887)

105 M04.012(韦氏芽孢杆菌)中性肽酶B(MER084215)

106 M04.012(蕈状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER187800)

107 M04.012(蜡状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER151875)

108 M04.012(炭疽芽孢杆菌)中性肽酶B(MER021804)

109 M04.012(假蕈状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER187792)

110 M04.012(蕈状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER187796)

111 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER084165)

112 M04.012(蜡状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER187810)

113 M04.012(蜡状芽孢杆菌)中性肽酶B(MER187806)

114 M04.012(苏云金芽孢杆菌)中性肽酶B(MER187779)

115 M04.012(伊平屋海岭海洋芽孢杆菌)中性肽酶B(MER022038)

116 M04.012(枯草芽孢杆菌)中性肽酶B(MER001029)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

117 (橙色滑柱菌)M4家族未分配的肽酶(MER091650)

118 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187809)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

119 M04.009(表皮葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER001869)

120 M04.009(头状葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER178903)

121 M04.009(金黄色酿脓葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER004711)

122 M04.009(溶酪大球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER155135)

123 M04.009(伪中间型葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER179736)

124 M04.009(沃氏葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER187814)

125 M04.009(产色葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER011075)

126 M04.009(腐生葡萄球菌)金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(MER057051)

127 蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER050323)

128 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187780)

129 (蜡状芽孢杆菌)未分配的肽酶(MER062591)

130 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187770)

131 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER080987)

132 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187805)

133 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187789)

134 (越南芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER038281)

135 (芽孢杆菌属物种NRRL B-14911)M4家族未分配的肽酶(MER062589)

136 (芽孢杆菌属物种SG-1)M4家族未分配的肽酶(MER109478)

137 (Bacillus coahuilensis)M4家族未分配的肽酶(MER187771)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

138 M04.021(高温放线菌属物种27a)中性肽酶(MER029719)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

139 M04.014(枯草芽孢杆菌)芽孢杆菌溶素(MER080014)

140 M04.014(芽孢杆菌属物种RH219)芽孢杆菌溶素(MER080743)

141 M04.014(芽孢杆菌属物种B16)芽孢杆菌溶素(MER054676)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

142 M04.014(侧孢短芽孢杆菌)芽孢杆菌溶素(MER048471)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

143 M04.014(解淀粉芽孢杆菌)芽孢杆菌溶素(MER001035)

144 M04.014(芽孢杆菌属物种)芽孢杆菌溶素(MER001038)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

145 M04.014(短小芽孢杆菌)芽孢杆菌溶素(MER091634)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

146 M04.014(枯草芽孢杆菌)芽孢杆菌溶素(MER001032)

147 丙酮丁醇梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER014937)

148 M04.011(产气荚膜梭状芽孢杆菌)λ毒素(MER002103)

149 M04.011(丙酮丁醇梭状芽孢杆菌)λ毒素(MER014941)

150 (溶组织梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER003790)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

151 (橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus))M4家族未分配的肽酶(MER001453)

152 (绿屈挠菌属物种Y-400-fl)M4家族未分配的肽酶(MER155497)

153 M04.008(无害李斯特氏菌(Listeria innocua))Mpl肽酶(李斯特氏菌属物种)(MER229925)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

154 M04.008(单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))Mpl肽酶(MER001047)

155 M04.008(伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii))Mpl肽酶(MER045739)

156 M04.008(斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri))Mpl肽酶(MER045740)

157 (太平洋邻囊菌(Plesiocystis pacifica))M4家族未分配的肽酶(MER160603)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PPC

158 (橙色标桩菌)M4家族未分配的肽酶(MER091643)

159 (橙色标桩菌)M4家族未分配的肽酶(MER091640)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

160 (黄色粘球菌)M4家族未分配的肽酶(MER068475)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PPC

161 (黄色粘球菌)M4家族未分配的肽酶(MER017624)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

162 (真实希瓦氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER117663)

163 (紫色希瓦氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER203088)

164 (水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis))M4家族未分配的肽酶(MER248570)

165 (哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii))M4家族未分配的肽酶(MER023927)

166 (拟态弧菌)M4家族未分配的肽酶(MER229315)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

167 (创伤弧菌)M4家族未分配的肽酶(MER025442)

168 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187802)

169 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER091678)

170 (炭疽芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER019065)

171 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER054507)

172 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER039813)

173 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187804)

174 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER091674)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～Big_3～Gram_pos_锚定

175 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER028889)

176 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER039811)

177 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER028890)

178 (炭疽芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER020840)

179 (蕈状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187799)

180 (韦氏芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER109684)

181 (假蕈状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187791)

182 (蕈状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187795)

183 (蕈状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187801)

184 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER039814)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

185 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER028888)

186 (炭疽芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER020835)

187 (哈赫拉菌(Hahella chejuensis))M4家族未分配的肽酶(MER058667)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

188 (肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum))M4家族未分配的肽酶(npr蛋白质)(MER088299)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

189 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr-1蛋白质)(MER079342)

190 (生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))M4家族未分配的肽酶(MER137542)

191 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr蛋白质)(MER187767)

192 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr_1蛋白质)(MER187754)

193 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187753)

194 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER079338)

195 (生芽孢梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER144884)

196 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr蛋白质)(MER079341)

197 (生芽孢梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187769)

198 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr_2蛋白质)(MER187755)

199 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER079340)

200 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr-4蛋白质)(MER095317)

201 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr-4蛋白质)(MER094802)

202 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr蛋白质)(MER094801)

203 (生芽孢梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER136684)

204 (肉毒梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(npr蛋白质)(MER079339)

205 (生芽孢梭状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER178275)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～P_前蛋白～P_前蛋白

206 (乙酸甲烷八叠球菌)M4家族未分配的肽酶(MER017697)

207 (加纳链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER187818)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

208 (天蓝色链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER011082)

209 (疮痂病链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER200705)

210 (阿维链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER028562)

211 (斯维链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER137373)

212 (链霉菌属物种Mg1)M4家族未分配的肽酶(MER137463)

213 (灰色链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER121447)

214 (丝状链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER187819)

215 (始旋链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER140364)

216 (白色链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER187822)

217 (链霉菌属物种SPB74)M4家族未分配的肽酶(MER163861)

218 http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/pepsum？id＝M04.UPW(棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus))M4家族未分配的肽酶(MER187824)

219 (氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus))M4家族未分配的肽酶(MER126758)

220 (Arthrobacter phenanthrenivorans)M4家族未分配的肽酶(MER240183)

221 (节杆菌属物种FB24)M4家族未分配的肽酶(MER050759)

222 (金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens))M4家族未分配的肽酶(MER075195)

223 (海洋放线菌(marine actinobacterium)PHSC20C1)M4家族未分配的肽酶

224 (粪短状杆菌(Brachybacterium faecium))M4家族未分配的肽酶(MER127552)

225 (密执安棒形杆菌(Clavibacter michiganensis))M4家族未分配的肽酶(MER121216)

226 (密执安棒形杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER115299)

227 (砖红色微杆菌(Microbacterium testaceum))M4家族未分配的肽酶(MER247399)

228 (秃裸间胞囊菌(Intrasporangium calvum))M4家族未分配的肽酶(MER231738)

229 (两面神菌属物种HTCC2649)M4家族未分配的肽酶(MER115301)

230 (桤木弗兰克氏菌(Frankia alni))M4家族未分配的肽酶(MER091651)

231 (弗兰克氏菌属物种CcI3)M4家族未分配的肽酶(MER051510)

232 (弗兰克氏菌属物种EAN1pec)M4家族未分配的肽酶(MER051747)

233 (Meiothermus silvanus)M4家族未分配的肽酶(MER038269)

234 (荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens))M4家族未分配的肽酶(MER187756)

235 (黄色粘球菌)M4家族未分配的肽酶(MER068095)

236 (伯克霍尔德菌属物种CCGE1002)M4家族未分配的肽酶(MER203878)

237 (蓖麻(Ricinus communis))M4家族未分配的肽酶(MER162821)

238 (嗜酸细链孢菌(Catenulispora acidiphila))M4家族未分配的肽酶(MER132795)

239 (扩展短杆菌(Brevibacterium linens))M4家族未分配的肽酶(MER115300)

240 (鱼腥藻(Anabaena variabilis))M4家族未分配的肽酶(MER054976)

241 (念珠藻属物种PCC 7120)M4家族未分配的肽酶(MER016719)

242 (念珠藻(Nostoc punctiforme))M4家族未分配的肽酶(MER024259)

243 (地毯草黄单胞菌)M4家族未分配的肽酶(MER019561)

244 (野油菜黄单胞菌)M4家族未分配的肽酶(MER070175)

245 (水稻黄单胞菌)M4家族未分配的肽酶(MER027496)

246 (野油菜黄单胞菌)M4家族未分配的肽酶(MER019416)

247 (弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata))M4家族未分配的肽酶(MER129229)

248 (伸长盐单胞菌(Halomonas elongata))M4家族未分配的肽酶(MER223548)

249 (需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens))M4家族未分配的肽酶(MER050897)

250 (副百日咳博德特氏杆菌(Bordetella parapertussis))M4家族未分配的肽酶(MER030706)

251 (支气管炎博德特氏杆菌(Bordetella bronchiseptica))M4家族未分配的肽酶(MER030781)

252 (百日咳博德特氏杆菌(Bordetella petrii))M4家族未分配的肽酶(MER114690)

253 (争论贪噬菌(Variovorax paradoxus))M4家族未分配的肽酶(MER187757)

254 (争论贪噬菌)M4家族未分配的肽酶(MER235281)

255 (油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum))M4家族未分配的肽酶(MER244770)

256 (黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva))M4家族未分配的肽酶(MER249215)

257 (施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri))M4家族未分配的肽酶(MER094699)

258 (达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii))M4家族未分配的肽酶(MER223843)

259 (达旦提狄克氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER193415)

260 (玉米狄克氏菌(Dickeya zeae))M4家族未分配的肽酶(MER187758)

261 (胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))M4家族未分配的肽酶(MER001045)

262 (山葵果胶杆菌(Pectobacterium wasabiae))M4家族未分配的肽酶(MER187830)

263 (达旦提狄克氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER182707)

264 M04.023(鼠类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium))zpx肽酶(MER196184)

265 M04.023(生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus))zpx肽酶(MER187772)

266 M04.023(肠道沙门氏菌(Salmonella enterica))zpx肽酶(MER108712)

267 M04.023(坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii))zpx肽酶(zpx蛋白质)(MER091601)

268 M04.023(解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora))zpx肽酶(prt1蛋白质)(MER202074)

269 M04.025(Erwinia billingiae)protealysin(mpr蛋白质)(MER220902)

270 M04.025(泛菌属物种At-9b)protealysin(MER232022)

271 M04.025(菠萝泛菌(Pantoea ananatis))protealysin(MER202817)

272 M04.025(拉恩氏菌属物种Y9602)protealysin(MER237139)

273 M04.025(格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii))protealysin(MER115298)

274 M04.025(沙雷氏菌属物种A2)protealysin(MER119664)

275 M04.025(变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans))protealysin(MER059439)

276 M04.025(沙雷氏菌属物种AS9)protealysin(MER249825)

277 M04.025(沙雷氏菌属物种AS12)protealysin(MER249807)

278 (昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilus obscurus))M4家族未分配的肽酶(MER132589)

279 (隐球出芽菌(Gemmata obscuriglobus))M4家族未分配的肽酶(MER187768)

280 (类诺卡氏菌属物种JS614)M4家族未分配的肽酶(MER049523)

281 M04.024(伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii))PrtS肽酶(发光光杆菌(Photorhabdus luminescens))(MER200616)

282 M04.024(嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila))PrtS肽酶(MER219816)

283 M04.024(嗜线虫致病杆菌)PrtS肽酶(MER219815)

284 M04.024(非共生光杆菌(Photorhabdus asymbiotica))PrtS肽酶(MER187759)

285 M04.024(发光光杆菌)PrtS肽酶(MER033481)

286 M04.024(光杆菌属物种Az29)PrtS肽酶(MER115297)

287 (土曲霉(Aspergillus terreus))M4家族未分配的肽酶(MER091644)

288 (费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri))M4家族未分配的肽酶(MER091615)

289 (偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis))M4家族未分配的肽酶(MER138903)

290 (红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea))M4家族未分配的肽酶(MER088688)

291 (鞭毛藻丛赤壳菌(Nectria haematococca))M4家族未分配的肽酶(MER243771)

292 (玉米赤霉菌(Gibberella zeae))M4家族未分配的肽酶(MER064838)

293 (金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae))M4家族未分配的肽酶(MER243770)

294 (蝗绿僵菌(Metarhizium acridum))M4家族未分配的肽酶(MER243769)

295 (嗜软骨华诊体(Waddlia chondrophila))M4家族未分配的肽酶(MER211844)

296 (油橄榄癌肿假单胞菌(Pseudomonas savastanoi))M4家族未分配的肽酶(MER232822)

297 (丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae))M4家族未分配的肽酶(MER052672)

298 (晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens))M4家族未分配的肽酶(MER187813)

299 (蓝丝菌属物种ATCC 51142)M4家族未分配的肽酶(MER103362)

300 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187783)

301 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER178978)

302 (蜡状芽孢杆菌M4家族未分配的肽酶(MER187811)

303 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187778)

304 (蜡状芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187807)

305 (乙酸甲烷八叠球菌)M4家族未分配的肽酶(MER017698)

306 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187784)

307 (苏云金芽孢杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER187788)

308 (Cellulophaga algicola)M4家族未分配的肽酶(MER235562)

309 (黑曲霉(Aspergillus niger))M4家族未分配的肽酶(MER091631)

310 (拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii))M4家族未分配的肽酶(MER187773)

311 (产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens))M4家族未分配的肽酶(MER187774)

312 (雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri))M4家族未分配的肽酶(MER187775)

313 (斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii))M4家族未分配的肽酶(MER122839)

314 (脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus))M4家族未分配的肽酶(MER117364)

315 (脓肿分枝杆菌)M4家族未分配的肽酶(MER117363)

316 (大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum))M4家族未分配的肽酶(MER026988)

317 (葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis))M4家族未分配的肽酶(MER162454)

318 (Mucilaginibacter paludis)M4家族未分配的肽酶(MER229316)

肽酶_M4_C

319 (粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))M4家族未分配的肽酶(MER001046)

320 (加纳链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER187815)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

321 (纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum))M4家族未分配的肽酶(MER114292)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

322 (丝状链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER091679)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

323 (阿维链霉菌)M4家族未分配的肽酶(MER028519)

324 (粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum))M4家族未分配的肽酶(MER187812)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

325 M04.007(屎肠球菌(Enterococcus faecium))球菌蛋白酶(MER187749)

326 M04.007(粪肠球菌)球菌蛋白酶(MER002810)

327 (鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum))M4家族未分配的肽酶(MER002083)

328 (黄色韩国生工菌)M4家族未分配的肽酶(MER079366)

329 (橙色滑柱菌)M4家族未分配的肽酶(MER085851)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

330 M04.016(简达气单胞菌(Aeromonas jandaei))PA肽酶(气单胞菌型)(MER079815)

331 M04.016(嗜矿泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila))PA肽酶(气单胞菌型)(MER079803)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

332 M04.016(斑点气单胞菌(Aeromonas punctata))PA肽酶(气单胞菌型)(MER029943)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

333 M04.016(鳗鱼气单胞菌(Aeromonas encheleia))PA肽酶(MER079817)

334 M04.016(兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum))PA肽酶(MER079816)

335 M04.016(中间气单胞菌(Aeromonas media))PA肽酶(MER079802)

336 M04.016(杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida))PA肽酶(MER079819)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

337 M04.016(斑点气单胞菌)PA肽酶(MER030073)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

338 M04.016(鳗鱼气单胞菌(Aeromonas encheleia))PA肽酶(MER079804)

339 M04.016(波波夫气单胞菌(Aeromonas popoffii))PA肽酶(MER079805)

340 M04.016(嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila))PA肽酶(MER011853)

341 M04.016(气单胞菌属物种CDC 2478-85)PA肽酶(MER079818)

342 M04.016(舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii))PA肽酶(气单胞菌型)(MER079806)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

343 (维氏气单胞菌(Aeromonas veronii))M4家族未分配的肽酶(MER055154)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

344 (温和气单胞菌(Aeromonas sobria))M4家族未分配的肽酶(MER079820)

FTP～PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PPC

345 (海藻分解菌属物种MED297)M4家族未分配的肽酶(MER083727)

346 (反硝化希瓦氏菌(Shewanella denitrificans))M4家族未分配的肽酶(MER050231)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PKD

347 (波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica))M4家族未分配的肽酶(MER048895)

348 (亚马逊希瓦氏菌(Shewanella amazonensis))M4家族未分配的肽酶(MER048811)

349 (武氏希瓦氏菌(Shewanella woodyi))M4家族未分配的肽酶(MER087265)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

350 (紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum))M4家族未分配的肽酶(MER027350)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PPC

351 (假交替单胞菌属物种SB-B1)M4家族未分配的肽酶(MER140592)

352 (假交替单胞菌属物种SM9913)M4家族未分配的肽酶(MER091617)

353 (假交替单胞菌属物种A28)M4家族未分配的肽酶(MER019098)

354 (南极细菌(Antarctic bacterium)菌株643)M4家族未分配的肽酶(MER012255)

355 (假交替单胞菌属物种SM495)M4家族未分配的肽酶(MER187748)

356 (杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida))M4家族未分配的肽酶(MER019099)

357 (鲁塞尼亚假交替单胞菌(Pseudoalteromonas ruthenica))M4家族未分配的肽酶(MER187751)

358 (被囊假交替单胞菌)M4家族未分配的肽酶(MER108855)

359 (Moritella viscosa)M4家族未分配的肽酶(MER139442)

360 (赭黄嗜盐囊菌(Haliangium ochraceum))M4家族未分配的肽酶(MER114761)

361 (赭黄嗜盐囊菌)M4家族未分配的肽酶(MER124450)

362 (韩国康氏菌(Kangiella koreensis))M4家族未分配的肽酶(MER065613)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

363 M04.003(海单胞菌属物种MED121)弧菌溶血素(MER139826)

364 (灿烂弧菌(Vibrio splendidus))M4家族未分配的肽酶(MER122486)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PKD

365 (弧菌目细菌SWAT-3)M4家族未分配的肽酶(MER139254)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PKD

366 (塔氏弧菌(Vibrio tubiashii))M4家族未分配的肽酶(MER187750)

367 (哈氏弧菌(Vibrio harveyi))M4家族未分配的肽酶(MER091688)

368 (坎氏弧菌(Vibrio campbellii))M4家族未分配的肽酶(MER139568)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

369 (希瓦氏菌属物种MR-7)M4家族未分配的肽酶(MER072768)

370 (希瓦氏菌属物种MR-4)M4家族未分配的肽酶(MER073030)

371 (希瓦氏菌属物种ANA-3)M4家族未分配的肽酶(MER073381)

372 (亚马逊希瓦氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER049928)

373 (武氏希瓦氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER087209)

374 (副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus))M4家族未分配的肽酶(MER027936)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

375 (弧菌属物种Ex25)M4家族未分配的肽酶(MER139749)

376 (哈氏弧菌)M4家族未分配的肽酶(MER109271)

377 (哈赫拉菌)M4家族未分配的肽酶(MER080002)

378 M04.003(莫里特拉菌属物种PE36)弧菌溶血素(MER113768)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC～PPC～P_前蛋白

379 (未经培养的细菌pTW3)M4家族未分配的肽酶(MER164961)

380 (未经培养的细菌pTW2)M4家族未分配的肽酶(MER164951)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

381 M04.005(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))假单胞菌素(MER001024)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C～PPC

382 M04.003(塔氏弧菌)弧菌溶血素(MER139044)

383 M04.003(解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus))弧菌溶血素(MER001043)

384 M04.003(鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum))弧菌溶血素(MER120583)

385 M04.003(鳗弧菌(Vibrio anguillarum))弧菌溶血素(MER001044)

386 M04.003(鳗利斯顿氏菌)弧菌溶血素(MER120671)

387 M04.003(河口弧菌(Vibrio aestuarianus))弧菌溶血素(MER113809)

388 M04.003(创伤弧菌)弧菌溶血素(MER003353)

389 M04.010(灿烂弧菌)vimelysin(MER091636)

390 M04.010(弧菌属物种MED222)vimelysin(MER113711)

391 M04.010(弧菌属物种T-1800)vimelysin(MER029796)

392 M04.010(弧菌目细菌SWAT-3)vimelysin(MER109237)

393 M04.003(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))弧菌溶血素(MER001041)

394 M04.003(拟态弧菌)弧菌溶血素(MER122299)

395 M04.003(河流弧菌(Vibrio fluvialis))弧菌溶血素(MER019097)

396 M04.003(盐弧菌属物种AF-2004)弧菌溶血素(MER091639)

397 M04.010(发光杆菌属物种SKA34)vimelysin(MER110034)

398 M04.010(纤细弧菌(Vibrio angustum))vimelysin(MER109056)

399 M04.010(狭小发光杆菌(Photobacterium angustum))vimelysin(MER187763)

400 M04.010(纤细弧菌)vimelysin(MER109302)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

401 (莫里特拉菌属物种PE36)M4家族未分配的肽酶(MER109180)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

402 (交替单胞菌目细菌TW-7)M4家族未分配的肽酶(MER091610)

403 (紫色希瓦氏菌)M4家族未分配的肽酶(MER203253)

404 (坎氏弧菌)M4家族未分配的肽酶(MER168125)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

405 (长滩军团菌(Legionella longbeachae))M4家族未分配的肽酶(MER198565)

406 M04.020(弧菌属物种AND4)pap6肽酶(MER187764)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

407 M04.020(坎氏弧菌)pap6肽酶(MER118605)

408 M04.020(哈氏弧菌)pap6肽酶(MER020240)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

409 (灿烂弧菌)M4家族未分配的肽酶(MER139945)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

410 M04.006(嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))Msp肽酶(军团菌型)(MER001039)

411 M04.006(姜氏军团菌(Legionella drancourtii))Msp肽酶(军团菌型)(MER187828)

PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C

412 M04.006(长滩军团菌)Msp肽酶(军团菌型)(MER002394)

413 (嗜肺军团菌)M4家族未分配的肽酶(MER040780)

414 (姜氏军团菌)M4家族未分配的肽酶(MER187829)

415 (长滩军团菌)M4家族未分配的肽酶(MER198471)

416 (嗜肺军团菌)M4家族未分配的肽酶(MER040782)

417 (嗜肺军团菌)M4家族未分配的肽酶(MER040781)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～PKD～PKD～PKD

418 M04.019(杀鱼假交替单胞菌)MprIII(MER024591)

419 (船蛆杆菌(Teredinibacter turnerae))M4家族未分配的肽酶(MER187760)

肽酶_M4～肽酶_M4_C～PKD～PKD～PKD～PKD

420 (海藻分解菌属物种MED297)M4家族未分配的肽酶(MER083722)

421 (Reinekea blandensis)M4家族未分配的肽酶(MER187762)

肽酶_M4～肽酶_M4_C

422 (海藻分解菌属物种MED297)M4家族未分配的肽酶(MER117392)

423 (交替单胞菌属(Alteromonas)物种SN2)M4家族未分配的肽酶(MER247991)

PepSY～肽酶_M4_C

424 (Hydrogenivirga物种128-5-R1-1)M4家族未分配的肽酶(MER142070)

B.用GenomeQuest搜索算法对相关分子进行识别

蛋白质BLAST分析(Altschul SF,Madden TL,AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,Lipman DJ.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402(Altschul SF、Madden TL、AA、Zhang J、Zhang Z、Miller W、Lipman DJ，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))在Genome Quest搜索算法(www.genomequest.com)过程中针对专利数据库和公共领域数据库运行，使用嗜热菌蛋白酶的序列(SEQ ID NO:3)作为查询序列，得到了下文(表5.2)示出的结果。BLAST是以GenomeQuest方式实现的NCBI BLAST2算法，其发现了在生物学相似性方面最相关的序列。序列搜索采用以下默认BLAST参数进行蛋白质搜索：字长：3，E-值截断值：10，打分矩阵：BLOSUM62，空位开放：11，空位延伸：2

表5.2：通过BLAST分析鉴定的嗜热菌蛋白酶蛋白质(SEQ ID NO:3)的同源物。使用的术语：％ID＝百分比序列同一性，标识符＝专利号-SEQ IDNO或公共领域登录号。

实例6

使用温度系数来识别具有增强的稳定性的嗜热菌蛋白酶变体

结晶温度系数是大分子的各个原子的相对运动的量度。这些温度系数作为结晶模型精化的产物出现，使得作为晶体X射线衍射最大值的各个强度给出的计算的衍射图案与观察到的图案最佳地匹配。温度系数被细化为衰减系数，用于反映运动较剧烈的原子将随散射角(θ)的变化对整体大分子聚集体衍射具有减弱的效果，采用的形式为–exp(-Bsin²θ/λ)，其中B是温度系数(Blundell,T.L.and Johnson L.N.,Protein Crystallography,AcademicPress,1976,pp121(Blundell,T.L.和Johnson L.N.，《蛋白质晶体学》，学术出版社，1976年，第121页))。

可能的是，整体移动性较高的区域也可能代表折叠的大分子在那里不够稳定的点，因此可能是当分子受到升高的温度或变性剂胁迫时解折叠在那里开始的点。进一步预期到，整体移动性较高的这些区域会是平均温度系数最高的区域。

嗜热溶蛋白芽孢杆菌嗜热菌蛋白酶蛋白质的晶体结构已由多个独立的实验室确定。所述蛋白质的三个独立模型选自蛋白质数据库中的条目标识号8TLN、2TLX和3DO1。我们通过筛选晶体结构中主链的温度系数最高，具体地讲平均主链温度系数至少超过观察到的平均值方差1.5倍的区域来寻找区域的整体移动性。表6a-表6c列出了与就整体分子在给定结晶模型中的平均主链温度系数观察到的方差相比，平均主链温度系数的z分数大于1.5的残基。在这三种结构中，已发现相同区域表现出的温度系数高于观察到的嗜热菌蛋白酶中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍。这些区域代表共有柔性区域并包含以下残基：

1-2(N-端残基)、127-128、180-181、195-199、211、223-224、298-300和316(C-端残基)。

通过对分子中的氨基酸进行尽可能多的单置换来筛选嗜热菌蛋白酶中的所有位点。已发现赋予不同的衣物洗涤剂制剂在高温下的热稳定性或改善的洗涤性能的若干变体是在与这些共有柔性区域之一相对应的位点处发生了改变。在共有柔性区域中进行的赋予Sun All-in-1Turbo凝胶或AT配方pH 8洗涤剂改善的洗涤性能或改善的热稳定性的代表性置换在表6.2中列出。用到的假设是这些柔性区域为蛋白质解折叠的起始位点。基于该假设，可预知源于不同共有柔性区域的变体的组合能够提供更大程度的稳定。选自表2所示那些的若干柔性区域同时稳定将得到明显更稳定的分子。

Claims

1.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少75％满足以下标准中至少一项：

a)所述位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI；

b)所述位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI；

c)所述位置的修饰导致：关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性、洗涤剂稳定性和热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI；

并且其中所述有效位置选自2、87、96、198、277、293、295、298和301，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

2.根据权利要求1所述的变体，其中所述有效位置选自：

2(T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M)、

87(V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y)、

96(N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y)、

198(S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K)、

277(P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y)、

293(T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y)、

295(L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W)、

298(S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R)、

301(Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K)，

其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

3.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于有效位置，其中在所述有效位置处测试的所述修饰满足以下标准：

所述位置的修饰导致关于表达、洗涤剂稳定性、热稳定性、PAS-38微样片清洁活性、或对Abz-AGLA-Nba的活性这些参数中的至少三个，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于1，并且

其中所述有效位置选自：278、283、180、244、48和63，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

4.根据权利要求3所述的变体，其中所述有效位置选自：T278R、Q283E、A180E、I244T、T48E和F63C，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

5.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：

所述位置的修饰导致关于表达、洗涤剂稳定性、热稳定性、PAS-38微样片清洁活性、或对Abz-AGLA-Nba的活性这些参数中的至少全部，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，且关于这些参数中的仅一个，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)小于0.8，并且

其中所述有效位置选自：019、025、026、063、091、096、097、101、109、118、131、140、158、159、175、180、219、225、232、244、246、261、277、293、300、301、301、303、305和311，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ IDNO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

6.根据权利要求5所述的变体，其中所述有效位置选自：N019D、S025A、T026R、S065A、L091M、N096Q、N096R、N096Y、N097K、R101M、G109A、S118A、I131L、V140D、Q158A、N159E、N159K、L175V、A180R、G196T、G196Y、K219S、Q225E、I232R、I244L、Q246D、D261N、P277G、T293Y、S300G、Q301、Q301M、V303R、S305A、D311A，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

7.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少75％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：2、26、47、49、53、65、87、91、96、108、118、128、154、179、196、197、198、199、209、211、217、219、225、232、256、257、259、261、265、267、272、276、277、286、289、290、293、295、298、299、300、301、303、305、308、311和316，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

8.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少75％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：2、26、47、53、87、91、96、108、118、154、179、197、198、199、209、211、217、219、225、232、256、257、259、261、265、267、272、276、277、286、289、290、293、295、298、299、300、301、303、305、308、311和316，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

9.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少40％但不到75％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：1、4、17、25、40、45、56、58、61、74、86、97、101、109、149、150、158、159、172、181、214、216、218、221、222、224、250、253、254、258、263、264、266、268、271、273、275、278、279、280、282、283、287、288、291、297、302、304、307和312，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

10.根据权利要求3所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，还包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少40％但不到75％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：1、4、17、25、40、45、61、74、86、97、101、109、149、150、158、159、172、181、214、216、218、221、222、224、250、253、254、258、263、264、266、268、271、275、279、282、283、287、288、291、297、302、304、307和312，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

11.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少15％但不到40％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：5、9、11、19、27、31、33、37、46、64、73、76、79、80、85、89、95、98、99、107、127、129、131、137、141、145、148、151、152、155、156、160、161、164、168、171、176、180、182、187、188、205、206、207、210、212、213、220、227、234、235、236、237、242、244、246、248、249、252、255、270、274、284、294、296、306、309、310、313、314和315，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

12.根据权利要求5所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，还包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少15％但不到40％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：5、9、11、19、27、31、33、37、46、64、73、76、79、80、85、89、95、98、99、107、127、129、131、137、141、145、148、152、155、160、161、164、168、171、176、180、182、187、188、205、206、207、210、212、213、220、227、234、235、236、237、242、244、246、248、249、252、255、270、274、284、294、296、306、309、310、313、314和315，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

13.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰但不到所述修饰的15％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：3、6、7、20、23、24、44、48、50、57、63、72、75、81、92、93、94、100、102、103、104、110、117、120、134、135、136、140、144、153、173、174、175、178、183、185、189、193、201、223、230、238、239、241、247、251、260、262、269和285，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

14.根据权利要求7所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，还包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰但不到所述修饰的15％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述有效位置选自：3、7、20、23、24、44、48、50、57、72、81、92、93、94、100、102、103、104、110、117、120、134、135、136、140、144、153、173、174、175、178、183、185、189、193、201、223、230、238、239、241、247、251、260、262、269和285，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

15.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少75％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述修饰选自：

2(T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M)、

26(T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D)、

47(R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T)、49(T,A,F,H,V,E,Y)、

53(S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L)、65(S,I,M,Q,L,A)、

87(V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y)、

91(L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y)、

96(N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y)、

108(Q,C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M)、118(S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V)、

128(Q,D,E,R,S,K,A)、154(G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y)、

179(Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F)、196(G,E,T,K,V,L,Y,A,W)、

197(I,D,K,L,T,V,W,Y,A,H,N,E,Q,R,F,C)、

198(S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K)、

199(G,C,E,F,H,Q,S,T,W,L,A,Y)、

209(A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M)、

211(Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R)、

217(Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L)、

219(K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S)、

225(Q,D,G,H,I,P,V,W,A,M,R,C,E,K,L,S)、

232(I,C,E,F,K,M,N,Q,W,G,L,R,S,T,V,Y)、

256(V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S,N)、

257(G,C,D,E,L,N,P,Q,S,T,Y,K,R)、

259(G,A,C,E,F,H,L,M,W,K,R,N,S,T)、

261(D,A,N,P,V,W,G,H,I,S)、265(K,A,C,D,M,P,Q,S,G,I,L,R,N)、

267(F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y)、

272(T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K)、

276(T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y)、

277(P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y)、

286(A,D,E,F,G,H,I,S,P,C,Q,R,T,K,L,M,N,Y)、

289(V,C,E,F,G,I,N,S,W,R,T,L,M,Y,A)、

290(Q,C,D,F,G,L,W,Y,R,T,V,A,H,N)、

293(T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y)、

295(L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W)、

298(S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R)、

299(T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K)、

300(S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,W,A,G,T,D,N)、

301(Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K)、

303(V,C,H,G,K,L,R,W,A,P,Y)、

305(S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M)、

308(Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L)、

311(D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y)、以及

316(K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M)，

16.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少40％但不到75％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述修饰选自：

1(I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L)、4(T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y)、

17(Q,I,W,Y,C,R,V,T,L)、25(S,D,F,A,C,K,M,R)、

40(F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L)、45(K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M)、

56(A,K,Q,V,W,H,I,M)、58(A,N,Y,V,L)、

61(Q,M,R,W,F,V,C,I,L)、74(H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W)、

86(N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D)、97(N,K,C,R,S,Y,E,M)、

101(R,T,C,L,S,H)、109(G,A,L,S,E,M,R,W)、

149(T,M,V,A,L,D,S,N)、150(D,A,F,K,N,Q,T,V,S)、

158(Q,A,K,M,N,L,R,Y,S)、159(N,R,W,A,C,G,M,T,S,Y)、

172(F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H)、181(N,L,A,G,K,M,T,S)、

214(P,C,G,K,S,N,A,R)、216(H,C,E,S,T,R,A)、

218(S,K,L,Y,F,G,T,V)、221(Y,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M)、

222(T,C,D,L,Y,I,V,A,M,K)、224(T,K,M,F,L,P,Q,V,Y,E,H)、

250(H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y)、253(V,N,T,I,R,Y,M,Q)、

254(S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W)、258(I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V)、

263(L,C,I,Q,T,H,K,N,V,A,M)、264(G,C,R,A,N,P,Q,S,T)、

266(I,A,F,L,S,C,M,T,V)、268(Y,M,Q,V,A,S,K)、

271(L,A,D,F,I,N,Y,H)、273(Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N)、

275(L,I,M,V,C,Q,S,T)、278(T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S)、

279(S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G)、280(N,A,C,D,E,G,Q,H,T)、

282(S,K,N,R,A,H,L,M,T)、283(Q,K,L,P,R,W,Y,S)、

287(A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C)、288(A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M)、

291(S,E,I,L,M,N,V,A,T)、297(G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N)、

302(E,K,L,G,T,V,D,Q,A)、304(A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y)、

307(K,A,C,G,I,M,N,Q,R,W,Y,H)以及

312(A,G,M,V,L,N,R,T,C)，

17.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰的至少15％但不到40％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述修饰选自：

5(S,D,N,P,H,L)、9(V,L,T,I)、11(R,I,Y,K)、19(N,L,Y,K,S)、

27(Y,W,A,M,V,C,L)、31(Q,A,K,V,I,C,Y)、

33(N,S,T,K,A,C,L,M)、37(N,D,Q,R,L,K)、46(Y,L,H,N,C)、

64(A,H,Q,T,D,E)、73(A,I,F,L,M,W)、76(Y,H,L,M,Q,T)、

79(V,L,Q,T,A,N,S)、80(T,I,D,A,L,N)、85(K,E,A,L,N,R,S)、

89(N,L,M,H)、95(G,A,D,H,M,N,S)、98(A,C,E,H,R,Y,K,V)、

99(A,E,K,P,R,S)、107(S,D,K,Y,A,G)、127(G,C,D,E)、

129(T,I,R,E,Y,L,M)、131(I,Y,W,L)、137(I,P,A,E,T,V,L)、

141(A,S,C,G)、145(T,A,C,E,G,M,N,Q)、148(V,L,N,Y,M,A,Q)、

151(Y,G)、152(T,S,L,M,G)、155(L,C,I,M)、156(I,L,Q)、

160(E,L,Y,Q)、161(S,A,N,P,T)、164(I,L,N,S,T,V,C,A)、

168(I,A,M,T,L)、171(I,C,E,F,L,S,G)、176(V,L,N,C)、

180(A,E,G,K,T,S)、182(K,L,A,W)、187(E,L,D)、188(I,L,V)、

205(M,L,A,V,Q)、206(S,A,C,K,L,M,R)、207(D,A,H,N)、

210(K,I,L,V)、212(G,Y,A,D,Q)、213(D,N,S,L,A,G,W)、

220(R,K,V,A)、227(N,D,L,Y,A)、234(S,D,N,A,C)、

235(G,M,C,Q,S,A)、236(I,M,A,C)、237(I,N,F,M)、

242(Y,C,F,N,V)、244(I,T,V,F,A,M,L)、246(Q,E,N,T,L,C,D)、

248(G,A,E,S)、249(T,K,M,N,L,Y,P)、252(G,K,Y,A,S,T,W)、

255(V,L,P,A,Y,M,N)、270(A,C,F,I,L,S,G)、

274(Y,F,H,A,C,Q,T,M)、284(L,V,W,A,M,Y)、

294(D,A,V,Q,N)、296(Y,N,L,R,H,W,M)、306(V,A,S,F,I,L,T)、

309(A,G,S,T,V,C)、310(F,A,C,W,M)、313(V,T,A,G,L,I,C)、

314(G,A,E,H,M,S,W,Q)、以及315(V,A,C,I,M,L,T)，

18.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰位于所述嗜热菌蛋白酶变体的有效位置处，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰但不到所述修饰的15％满足以下标准中至少一项：

并且其中所述修饰选自：

3(G,Y)、6(T,C,V)、7(V,L,I)、20(I,L,V)、23(T,F,W)、

24(Y,W)、44(A,C)、48(T,E,D)、50(L,P)、57(D,K)、

63(F,Y,C)、72(D,F,W)、75(Y,A)、81(Y,F)、92(S,L)、

93(Y,T,C)、94(D,T)、100(I,L,V)、102(S,G,N)、103(S,T)、

104(V,A)、110(Y,L)、117(G,H)、120(M,L)、134(S,A,P)、

135(G,A)、136(G,A,S)、140(V,D)、144(L,T)、153(A,T)、

173(G,A,C)、174(T,C,A)、175(L,H,S)、178(F,H,Y)、

183(N,S)、185(D,E)、189(G,A)、193(Y,F)、201(S,C,A)、

223(G,D,K)、230(V,A)、238(N,L,M)、239(K,A)、241(A,L,S)、247(G,A,S)、251(Y,M)、260(R,A,N)、262(K,A)、

269(R,V,K)、以及285(R,K,Y)，

19.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰为活性可组合突变，其中在所述活性可组合位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：

所述位置的修饰导致关于表达和洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于0.5；而关于在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁、对Abz-AGLA-Nba的活性，相对于嗜热菌蛋白酶亲本的最低性能指数(PI)大于或等于1.5；

并且其中所述活性可组合位置选自：17、19、24、25、31、33、40、48、73、79、80、81、85、86、89、94、109、117、140、141、150、151、152、153、156、158、159、160、161、168、171、174、175、176、178、180、181、182、183、189、205、206、207、210、212、213、214、218、223、224、227、235、236、237、238、239、241、244、246、248、249、250、251、252、253、254、255、258、259、260、261、262、266、268、269、270、271、272、273、274、276、278、279、280、282、283、294、295、296、297、300、302、306、310和312，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

20.根据权利要求13所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰，其中所述修饰为活性可组合突变，其中在所述活性可组合位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：

并且其中所述活性可组合位置选自：17、19、24、25、31、33、40、48、73、79、80、81、85、86、89、94、109、117、140、141、150、152、153、158、159、160、161、168、171、174、175、176、178、180、181、182、183、189、205、206、207、210、212、213、214、218、223、224、227、235、236、237、238、239、241、244、246、248、249、250、251、252、253、254、255、258、259、260、261、262、266、268、269、270、271、272、273、274、276、278、279、280、282、283、294、295、296、297、300、302、306、310和312，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

21.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰为活性可组合突变，其中在所述活性可组合位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：

并且其中所述修饰选自：17(E,F,P)、19(A,D,H,I,R,T,V)、24(F,H)、25(H)、31(L)、33(Q)、40(C)、48(A,R)、73(Y)、79(C)、80(C,R)、81(H)、85(C,M,Y)、86(V)、89(K,R,T,V)、94(E)、109(D)、117(A,K,R,T)、140(S)、141(T)、150(E,M,W)、151(A,C,E,I)、152(D)、153(V)、156(H,R)、158(F,G,I,V)、159(F,I,K)、160(S)、161(Y)、168(N)、171(D)、174(S,V)、175(C,E,F,G,I)、176(E,Q)、178(C,M)、180(L,W)、181(Y)、182(F,R)、183(H,I,L,M,Q,R,T)、189(C)、205(C,F)、206(F,H,I,T,V,Y)、207(T)、210(A,E,F,G,H,T)、212(F,H,K,M,N,R,S,T)、213(I,K,R,V,Y)、214(Q)、218(R)、223(Y)、224(I,R)、227(C,E,G,K,Q,R,S,T,V)、235(D,L,T)、236(P)、237(A,Q)、238(A,C,D,E,R,S)、239(C,G,H,L,Q,R,S,V,Y)、241(E,F,G,I,T,V)、244(Q)、246(K,R)、248(C,H)、249(G,V)、250(F,S)、251(H)、252(F,I,L)、253(A,D,E,P)、254(C,F,G,H,I,P)、255(F,Q)、258(F)、259(I)、260(C,D,I)、261(K,R,T)、262(C,F,H,L,P,R)、266(W)、268(F,R)、269(P,T,W,Y)、270(M,N,P,V)、271(V)、272(R)、273(R)、274(D,E)、276(G,S)、278(V)、279(E)、280(P,R,V)、282(P)、283(A,C,E,G,H,T,V)、294(T)、295(R)、296(E,I)、297(I,V)、300(Q)、302(W)、306(Y)、310(I,N)、以及312(Q)，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

22.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中与所述亲本嗜热菌蛋白酶相比，所述嗜热菌蛋白酶变体在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁性能改善、对Abz-AGLA-Nba的活性改善或者洗涤剂稳定性或热稳定性改善，并且其中所述修饰所处的位置具有的温度系数高于观察到的SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍；

并且其中所述残基位置选自：1、2、127、128、180、181、195、196、197、198、199、211、223、224、298、299、300和316，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

23.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中与所述亲本嗜热菌蛋白酶相比，所述嗜热菌蛋白酶变体在pH6或pH8下对PAS-38微样片的清洁性能改善、对Abz-AGLA-Nba的活性改善或者洗涤剂稳定性或热稳定性改善，并且其中所述修饰所处的位置具有的温度系数高于观察到的SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍；

并且其中所述残基位置选自：1、2、127、180、181、195、196、197、198、199、211、223、224、298、299、300和316，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

24.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中与所述亲本嗜热菌蛋白酶相比，所述嗜热菌蛋白酶变体的洗涤剂稳定性或热稳定性改善，并且其中所述修饰所处的位置具有的温度系数高于观察到的SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列中的所有残基的平均主链温度系数的方差的1.5倍；

其中所述修饰选自：1(I,V)、2(T,C,I,M,P,Q,V)、127(G,C)、128(Q,E,F)、180(A,E,N)、181(N,A,G,Q,S)、196(G,L,Y)、197(I,F)、198(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y)、211(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W)、224(T,D,H,Y)、298(S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y)、299(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W)、以及316(K,A,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y)，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

25.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰是有效突变，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：

其中所述活性可组合位置选自：002、048、063、087、096、180、198、244、277、283、293、295、298和301，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

26.一种包含对亲本嗜热菌蛋白酶的氨基酸修饰的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述修饰是有效突变，其中在所述有效位置处测试的所述修饰中的至少一个修饰满足以下标准：

其中所述活性可组合位置选自：T002I、T002M、T048E、A058L、F063C、V087L、N096H、A180E、S198A、I244T、P277R、T278R、Q283E、T293L、T293N、L295F、S298A和Q301I，其中所述嗜热菌蛋白酶变体的所述氨基酸位置根据SEQ IDNO:3示出的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列来编号。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述变体为M4肽酶。

28.根据权利要求27所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述变体为MA族群的成员。

29.根据权利要求27所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述变体为PepSY～肽酶_M4～肽酶_M4_C家族的成员。

30.根据权利要求1-26中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体或其活性片段，其中所述变体与SEQ ID NO:3示出的嗜热菌蛋白酶具有至少50％的同一性。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体，其中所述嗜热菌蛋白酶变体来自选自以下的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、标桩菌属(Stigmatella)、粘球菌属(Myxococcus)、弧菌属(Vibrio)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、克里贝拉菌属(Kribbella)、两面神菌属(Janibacter)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、黄单胞菌属(Xanthamonas)、小单孢菌属(Micromonospora)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、脱卤拟球菌属(Dehalococcoides)、Croceibacter、科迪亚菌属(Kordia)、微颤菌属(Microscilla)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、李斯特氏菌属(Listeria)、邻囊菌属(Plesiocystis)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、噬细胞菌属(Cytophaga)、河氏菌属(Hahella)、节杆菌属(Arthrobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、棒形杆菌属(Clavibacter)、微杆菌属(Microbacterium)、间孢囊菌属(Intrasporangium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、亚栖热菌属(Meiothermus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、蓖麻属(Ricinus)、细链孢菌属(Catenulispora)、鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)、盐单胞菌属(Halomonas)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、贪噬菌属(Variovorax)、狄克氏菌属(Dickeya)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、拉恩氏菌属(Rahnella)、沙雷氏菌属(Serratia)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、出芽菌属(Gemmata)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、光杆菌属(Photorhabdus)、曲霉属(Aspergillus)、新萨托菌属(Neosartorya)、核腔菌属(Pyrenophora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、丛赤壳属(Nectria)、赤霉菌属(Gibberella)、绿僵菌属(Metarhizium)、华诊体属(Waddlia)、蓝丝菌属(Cyanothece)、噬纤维菌属(Cellulphaga)、普罗威登斯菌属(Providencia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产冻胶菌属(Mucilaginibacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、堆囊菌属(Sorangium)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、肾杆菌属(Renibacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、海藻分解菌属(Reinekea)、色杆菌属(Chromobacterium)、莫里特拉菌属(Moritella)、嗜盐囊菌属(Haliangium)、康氏菌属(Kangiella)、海单胞菌属(Marinomonas)、弧菌目(Vibrionales)、利斯顿氏菌属(Listonella)、盐弧菌属(Salinivibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、军团菌属(Legionella)、船蛆杆菌(Teredinibacter)、海藻分解菌属(Reinekea)、Hydrogenivirga和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体，其中所述嗜热菌蛋白酶变体来自选自以下的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、标桩菌属(Stigmatella)、粘球菌属(Myxococcus)、弧菌属(Vibrio)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体，其中所述嗜热菌蛋白酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)。

34.一种清洁组合物，其包含权利要求1-33中任一项所述的至少一种嗜热菌蛋白酶变体。

35.根据权利要求34所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为颗粒、粉末、固体、条棒、液体、片剂、凝胶或糊剂组合物。

36.根据权利要求34或35所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为洗涤剂组合物。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为衣物洗涤剂组合物、盘碟洗涤剂组合物、或硬质表面清洁组合物。

38.根据权利要求36所述的清洁组合物，其中所述盘碟洗涤剂为手动盘碟洗涤剂组合物或自动盘碟洗涤剂组合物。

39.根据权利要求36所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为衣物洗涤剂组合物。

40.根据权利要求34-39中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种漂白剂。

41.根据权利要求34-40中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物不含磷酸盐。

42.根据权利要求34-40中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物含有磷酸盐。

43.根据权利要求34-42中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种另外的酶。

44.根据权利要求43所述的清洁组合物，其中所述至少一种另外的酶选自：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、另外的金属蛋白酶，以及它们的组合。

45.一种清洁方法，包括用含有至少一种根据权利要求1-33中任一项所述的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物来接触表面或物品。

46.一种清洁方法，包括用权利要求34-44中任一项示出的清洁组合物来接触表面或物品。

47.根据权利要求45或46所述的方法，还包括在用所述清洁组合物分别接触所述表面或物品之后漂洗所述表面或物品。

48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述物品为盘碟。

49.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述物品为织物。

50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，还包括在用所述清洁组合物接触所述表面或物品之后漂洗所述表面或物品的步骤。

51.根据权利要求50所述的方法，还包括在所述表面或物品的所述漂洗之后干燥所述表面或物品的步骤。

52.一种清洁表面或物品的方法，包括：提供权利要求34-44中任一项示出的所述清洁组合物和需要清洁的表面或物品；以及在适于所述表面或物品的所述表面的所述清洗的条件下，用需要清洁的所述表面或物品接触所述清洁组合物，以产生洁净的表面或物品。

53.根据权利要求52所述的方法，还包括漂洗所述洁净的表面或物品以产生漂洗过的表面或物品的步骤。

54.根据权利要求52或53中任一项所述的方法，还包括干燥所述漂洗过的表面或物品的步骤。