JP2018138028A - サーモリシンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年11月5日出願の米国仮特許出願番号第61/722、660号に基づく優先権にかかる利益を主張するものであって、前記公報はそのすべてが参照として本明細書に組み込まれる。
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えDNAにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書の上述の及び以降に記載されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
IUPAC−IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)に従い定義されるアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を、本開示全体を通して使用する。一文字のXは、20種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重により1種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。変異は、親アミノ酸の1文字表記、続いて位置番号、次に変異アミノ酸を表す1文字表記により記載される。例えば、87位でのグリシン(G)のセリン(S)への変異は、「G087S」又は「G87S」と表される。変異は、また、アミノ酸の3文字表記に続いて、ポリペプチド鎖のN末端から数えた位置により記載されることがあり、例えば、10位のアラニンはAla10で記載される。複数の変異は、「−」を変異の間に挿入することで示される。87位及び90位での変異は、「G087S−A090Y」若しくは「G87S−A90Y」、又は「G87S+A90Y」若しくは「G087S+A090Y」のいずれかとして表される。欠失については、一文字コード「Z」を使用する。親配列に対する挿入については、一文字コード「Z」を位置番号の左側に記載する。欠失については、一文字コード「Z」を位置番号の右側に記載する。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の位置番号にアミノ酸毎に0.01を加えた番号である。例えば、3種のアミノ酸アラニン(A)、セリン(S)及びチロシン(Y)を位置87と88の間に挿入する場合は、「Z087.01A−Z087.02S−Z087.03Y」として示される。そのため、上記の全ての変異と100位での欠失とを組み合わせると、「G087S−Z087.01A−Z087.02S−Z087.03Y−A090Y−A100Z」となる。改変を記載する場合、位置番号の後に括弧で括られたアミノ酸記号が続くと、括弧で括られたアミノ酸のうちいずれかによるその位置での置換のリストを表す。例えば、6(L,I)とは、6位がロイシン又はイソロイシンで置換され得ることを意味する。
・隣接ワード閾値:11
・E値カットオフ:10
・スコア行列:NUC.3.1(マッチ=1、ミスマッチ=−3)
・ギャップ開始ペナルティ:5
・ギャップ伸長ペナルティ:2
・また、アミノ酸配列検索におけるデフォルトのBLASTパラメータ例は次の通りである。
・ワードサイズ:3
・E値カットオフ:10
・スコア行列:BLOSUM62
・ギャップ開始ペナルティ:11
・ギャップ伸長ペナルティ:1
Thompson et al.,Nucleic Acids Res.22:4673〜4680頁(1994)を参照されたい。CLUSTAL Wアルゴリズムのデフォルトパラメータは、次の通りである。
第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することは、2つのポリペプチドが実質的に同一であるの1つの指標になる。典型的に、保存的アミノ酸置換が異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、2つのペプチドが、保存的アミノ酸置換のみが異なる、又は1つ以上の保存的アミノ酸置換のみが異なる場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。
この用語は、選別に関する任意の好適な手段を包含することを意図するものである。実際のところ、本発明は、任意の特定のスクリーニング方法に制限されることを意図しない。
概して、対象とする基質のkcat/Km比がより大きい変異体酵素を生産することが所望されることから、これらの決定は、変異体酵素の効率を評価する際に特に有用である。
しかしながら、本発明は、いかなる特定の基質組成物又は基質特異性にも制限されないと意図される。
一部の実施形態では、粒状組成物は「コンパクト」形態であり;一部の実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
本明細書で使用するとき、サーモリシン酵素には、酵素、ポリポリペプチド又はタンパク質、或いはその活性断片が包含される。これにはペプチダーゼファミリーM4のファミリーメンバーも包含され、そのプロトタイプがサーモリシン(TLN;EC 3.4.24.27)である。
本発明は、洗剤組成物において有用となり得るサーモリシン酵素におけるアミノ酸位置であって、当該アミノ酸位置における好ましい改変によって、洗浄性能、洗剤組成物中での酵素安定性、および酵素の熱安定性に関する最小性能指数が得られ、更には親酵素サーモリシンよりもこれらの特性のうち少なくとも1つが改善された、アミノ酸位置を提供する。これらの改変は、本発明の好適な改変と考えられる。
a)親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.9以上であり、更に、これらの試験のうちのいずれか一つに関するPIが1.0以上である、位置、
b)親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.8以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.2以上である、位置、又は
c)親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.5以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.5以上である、位置。
本発明は、親酵素サーモリシンに1つ以上の改変を生じさせて得られたサーモリシン酵素変異体を包含する。酵素変異体は、洗浄性能、洗剤組成物中の酵素の安定性及び酵素の熱安定性に関する最小性能指数を有し、更に、これらの特性のうち少なくとも一つが親酵素サーモリシンよりも改善されていることにより、洗剤組成物中で有用であり得る。
高い温度因子(柔軟性の高い領域)を有する位置に改変を生じることによって熱安定性又は洗濯性能の改善のいずれかを付与する組み合わせ可能な変異体の位置としては、1位、2位、127位、128位、180位、181位、196位、197位、198位、211位、224位、298位、299位、及び316位が挙げられる。好適な改変としては、1位(I,V)、2位(T,C,I,M,P,Q,V)、127位(G,C)、128位(Q,C,E,F,I,L,V,Y)、180位(A,E,N)、181位(N,A,G,Q,S)、196位(G,L,Y)、197位(I,F)、198位(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y)、211位(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W)、224位(T,D,H,Y)、298位(S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y)、299位(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W)、316位(K,A,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y)が挙げられる(ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている)。
組み合わせ可能な変異の他に、サーモリシンに関する第二の群の変異は、組み合わせ可能な活性を有する変異がある。組み合わせ可能な活性を有する変異とは、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄を有し、Abz−AGLA−Nbaに対する活性が1.5以上であり、更に、洗剤安定性及び熱安定性に関するPI値を0.5より下に低下させないものである。組み合わせ可能な活性を有する変異の位置としては、17位、19位、24位、25位、31位、33位、40位、48位、73位、79位、80位、81位、85位、86位、89位、94位、109位、117位、140位、141位、150位、151位、152位、153位、156位、158位、159位、160位、161位、168位、171位、174位、175位、176位、178位、180位、181位、182位、183位、189位、205位、206位、207位、210位、212位、213位、214位、218位、223位、224位、227位、235位、236位、237位、238位、239位、241位、244位、246位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、258位、259位、260位、261位、262位、266位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、276位、278位、279位、280位、282位、283位、294位、295位、296位、297位、300位、302位、306位、310位、及び312位からなる群から選択される位置が挙げられる(ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている)。組み合わせ可能な活性を有する変異としては、17位(E,F,P)、19位(A,D,H,I,R,T,V)、24位(F,H)、25位(H)、31位(L)、33位(Q)、40位(C)、48位(A,R)、73位(Y)、79位(C)、80位(C,R)、81位(H)、85位(C,M,Y)、86位(V)、89位(K,R,T,V)、94位(E)、109位(D)、117位(A,K,R,T)、140位(S)、141位(T)、150位(E,M,W)、151位(A,C,E,I)、152位(D)、153位(V)、156位(H,R)、158位(F,G,I,V)、159位(F,I,K)、160位(S)、161位(Y)、168位(N)、171位(D)、174位(S,V)、175位(C,E,F,G,I)、176位(E,Q)、178位(C,M)、180位(L,W)、181位(Y)、182位(F,R)、183位(H,I,L,M,Q,R,T)、189位(C)、205位(C,F)、206位(F,H,I,T,V,Y)、207位(T)、210位(A,E,F,G,H,T)、212位(F,H,K,M,N,R,S,T)、213位(I,K,R,V,Y)、214位(Q)、218位(R)、223位(Y)、224位(I,R)、227位(C,E,G,K,Q,R,S,T,V)、235位(D,L,T)、236位(P)、237位(A,Q)、238位(A,C,D,E,R,S)、239位(C,G,H,L,Q,R,S,V,Y)、241位(E,F,G,I,T,V)、244位(Q)、246位(K,R)、248位(C,H)、249位(G,V)、250位(F,S)、251位(H)、252位(F,I,L)、253位(A,D,E,P)、254位(C,F,G,H,I,P)、255位(F,Q)、258位(F)、259位(I)、260位(C,D,I)、261位(K,R,T)、262位(C,F,H,L,P,R)、266位(W)、268位(F,R)、269位(P,T,W,Y)、270位(M,N,P,V)、271位(V)、272位(R)、273位(R)、274位(D,E)、276位(G,S)、278位(V)、279位(E)、280位(P,R,V)、282位(P)、283位(A,C,E,G,H,T,V)、294位(T)、295位(R)、296位(E,I)、297位(I,V)、300位(Q)、302位(W)、306位(Y)、310位(I,N)、及び312位(Q)が挙げられる(ここで、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている)。
本発明は新規ポリペプチドを提供し、これらは集合的に「本発明のポリペプチド」と呼ばれ得る。本発明のポリペプチドは、例えば、酵素活性(例えば、サーモリシン活性)を有するサーモリシン酵素変異体ポリペプチドのような、単離された、組換え型の、実質的に純粋な、又は非天然起源のサーモリシン酵素変異体ポリペプチドを包含する。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、クリーニング用途に有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面(例えば、物品の表面)をクリーニングする方法に有用なクリーニング組成物中に組み込まれ得る。
本発明は、単離された、非天然起源の、又は組み換え型の核酸(本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる)を提供し、これは集合的に本発明のポリペプチドをコードする「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。以下に記載のすべてのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生(例えば発現)に有用である。上述のように、ポリペプチドには、酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)を有するサーモリシン変異体ポリペプチドなどのプロテアーゼ変異体ポリペプチドであって、クリーニング用途、及びクリーニングする必要のある物品又は表面(例えば、物品の表面)をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である、プロテアーゼ変異体ポリペプチドが包含される。
本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明の改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、こうした方法としては、限定するものではないが、例えば、部位飽和変異導入法、スキャニング変異導入法、挿入変異法、欠失変異法、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、及び定向進化方法、並びに様々な他の組み換えアプローチが挙げられる。改変ポリヌクレオチド及びタンパク質(例えば、変異型プロテアーゼ)の製造方法としては、DNAシャフリング方法、遺伝子の非相同的組み換えに基づく方法、例えばITCHY(Ostermeier et al.,7:2139〜44頁[1999年]を参照されたい)、SCRACHY(Lutz et al.,98:11248〜53頁[2001年]を参照されたい)、SHIPREC(Sieber et al.,19:456〜60頁[2001年]を参照されたい)、及びNRR(Bittker et al.,20:1024〜9頁[2001年]、Bittker et al.,101:7011〜6頁[2004年]を参照されたい)、並びにランダム変異及び標的突然変異、欠失並びに/又は挿入を組み込むためにオリゴヌクレオチドを使用することに基づく方法(Ness et al.,20:1251〜5頁[2002年]、Coco et al.,20:1246〜50頁[2002年]、Zha et al.,4:34〜9頁[2003年]、Glaser et al.,149:3903〜13頁[1992年]を参照されたい)が挙げられる。
本発明は、本明細書に記載の少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載の本発明の変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド)を含む単離若しくは組み換え型のベクター、少なくとも1種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離若しくは組み換え型の発現ベクター又は発現カセット、少なくとも1種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えDNA構築物、少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチドを含む単離又は組み換え型細胞、少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物、少なくとも1種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、DNA構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を1種以上含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、枯草菌宿主細胞は、プロテアーゼ変異体の生産に使用される。米国特許第5,264,366号及び同第4,760,025号(再発行特許第34,606号)は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができる様々なバチルス属の宿主株を記述しているが、他の好適な株も使用することができる。
同様に、本発明の核酸、ベクター、又はDNA構築物を少なくとも1つ含む組成物も提供する。
一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体は、補助材料及びプロテアーゼ変異体を含む組成物で使用することができ、ここで、組成物は布地ケア製品及びホームケア製品である。
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルはすべて、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率(%)及び比率はすべて、別途記載のない限り、重量で計算している。
百分率(%)及び比率はすべて、別途記載のない限り、全組成物を基準として計算している。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
一部の実施形態では、20℃で測定した場合、本発明の洗濯洗剤組成物の密度は約400〜約1200g/リットルの範囲であり、一方で他の実施形態では約500〜約950g/リットルの範囲である。
i)モノ不飽和又はポリ不飽和カルボン酸からなる群から選択されるモノマー、
ii)一般式:R1(R2)C=C(R3)−X−R4で表されるモノマー(式中、R1〜R3は、互いに独立して、−H、−CH3又は−C2H5を表し、Xは、−CH2−、−C(O)O−及び−C(O)−NH−からなる群から選択される任意に含まれるスペーサー基を表し、そしてR4は、炭素原子数2〜22の直鎖又は分枝鎖飽和又は不飽和アルキル残基、好ましくは炭素原子数6〜22の芳香族残基を表す。)、
iii)場合により、追加モノマー。
2次の一般式で表される非イオン性界面活性剤:Rl−CH(OH)CH20−(AO)w−(A’0)x−(A’’0)y−(A’’’0)z−R2(式中、Rlは直鎖又は分枝鎖の飽和又はモノ不飽和若しくはポリ不飽和C6〜24アルキル又はアルケニル残基を表し、R2は炭素原子数2〜26の直鎖又は分枝鎖炭化水素残基を表し、A、A’、A’’及びA’’’は、互いに独立して、−−−CH2CH2、−CH2CH2−−−CH2、−−−CH2CH2−−CH(CH3)、CH2−CH2−CH2CH2、−CH2−CH−(CH3)−CH2−、−CH2−CH(CH2−CH3)からなる群から選択される残基を表し、そしてw、x、y及びzは0.5〜120の範囲の値を表し、更にx、y及び/又はzは0であってもよい。)
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に組成配合されて、配合者により選択された任意の好適なプロセスにより調製される(例えば、米国特許第同第5,879,584号、同第5,691,297号、同第5,574,005号、同第5,569,645号、同第5,565,422号、同第5,516,448号、同第5,489,392号、同第5,486,303号、同第4,515,705号、同第4,537,706号、同第4,515,707号、同第4,550,862号、同第4,561,998号、同第4,597,898号、同第4,968,451号、同第5,565,145号、同第5,929,022号、同第6,294,514号及び同第6,376,445号を参照されたい)。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、表面(例えば、食器)、洗濯物、硬質表面、コンタクトレンズなどのクリーニングにおいて有用である。一部の実施形態では、表面の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物の少なくとも一実施形態と接触させ、そしてその後、場合により、表面を洗浄及び/又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的洗浄が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、溶液中約500ppm〜約15,000ppmの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である一部の実施形態では、水温は、典型的には約5℃〜約90℃の範囲である。
「食卓用食器類」は食品を給仕する又は食べるための上記又は類似物品のいかなるものも包含することを意図する。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は、食器又は食卓用食器類である。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物(例えば、粉末洗濯洗剤組成物又は液体洗濯洗剤組成物)であり、クリーニングされる物品は布地物品である。その他の一部の実施形態では、クリーニング組成物は洗濯物前処理用組成物である。
アッセイ
以下のアッセイは、以下に記載の実施例に使用した標準アッセイ法である。場合により、特定のプロトコルは、これらの標準アッセイにあてはまらないこともある。この場合、以下のこれらの標準アッセイプロトコルから外れた部分については、実施例中で規定する。
性能指数(PI)は、同一タンパク質濃度下での変異体の性能(実測値)と標準酵素の性能(理論値)とを比較するものである。加えて、標準酵素のラングミュア等式のパラメータを用いることで、理論値が算出できる。
サーモリシンメタロプロテアーゼ及びサーモリシンメタロプロテアーゼ変異体のプロテアーゼ活性を決定するために、2−アミノベンゾイル−L−アラニルグリシル−L−ロイシル−L−アラニノ−4−ニトロベンジルアミド(Abz−AGLA−Nba)の加水分解を測定する。
i)MES緩衝液(NaOHでpH 6.5に調整した52.6mM MESであって、2.6mM CaCl2及び0.00526%(v/v)TWEEN(登録商標)−80を含有するもの)
ii)Abz−AGLA−Nba保存液(DMF中、48mM Abz−AGLA−Nba)(室温において遮光保存)
iii)プロピレングリコールを含む酵素希釈用緩衝液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2及び0.005%(v/v)TWEEN(登録商標)−80、10%プロピレングルコール)
配列番号3のアミノ酸配列を有する野生型サーモリシン酵素に対するサーモリシン変異体の熱安定性は、プロテアーゼ試料をHEPES緩衝液又は洗剤溶液のいずれかにおいて定義された条件下でインキュベートすることにより決定される。インキュベーション温度は、インキュベーション後の野生型サーモリシンの残留活性が初期活性の約30%となるにように選択する。初期活性及び残留サーモリシン活性は、上記B欄で説明したAbz−AGLA−Nbaアッセイを利用して決定する。
1.2.4mM Abz−AGLA−Nba実験溶液(上記B参照)
2.希釈用緩衝液:10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005%(v/v)TWEEN(登録商標)−80
3.HEPES緩衝液:10mM HEPES、0.1mM CaCl2、0.005%(v/v)TWEEN(登録商標)−80、pH 7.15
4.AT処方洗剤(pH 8)(21°GH(総硬度)の水中、2.5g/L)
5.Sun All−in−1 Turbo Gel洗剤(pH 6.3)(21°GH(総硬度)の水中、3g/L)
6.サーモリシン変異体の濾別した培養上清
サーモリシン変異体の培養上清をHEPES緩衝液に約1μg/mlまで希釈して、希釈酵素試料を50μl/穴で96穴PCRプレートへ移す。酵素試料5μLを、2.4mM Abz−AGLA−Nba基質溶液195μLを入れた黒色96穴アッセイマイクロプレート(例えば、Greiner 655076)に移すことにより、上記B欄で説明した通りにAbz−AGLA−Nbaアッセイを利用して酵素試料の初期活性を測定する。残りの45μl/穴の酵素試料を含むPCRプレートを接着剤箔シール(Bio−Rad B−シール)で密封し、Tetrad2サーマルサイクラーに入れて、83℃で15分間インキュベートする。インキュベーション後、試料を含むPCRプレートを室温まで冷却させ、酵素試料5μLを、2.4mM Abz−AGLA−Nba基質溶液195μLを入れた黒色96穴アッセイマイクロプレート(例えば、Greiner 655076)に移すことにより、上記B欄で説明した通りにAbz−AGLA−Nbaアッセイを利用して酵素試料の残留活性を測定する。
サーモリシン変異体の洗剤安定性は、変異体をストレス条件下、Sun All−in−1 Turbo Gel(Unilever、The Netherlands)として商業的に既知の自動食器洗浄用液体洗剤の0.3%(w/v)溶液中及AT処方洗剤(pH 8)(E欄に記載のもの)の0.25%(w/v)の溶液中、高温でインキュベートすることによりモニターする。市販のSun All−in−1 Turbo Gel洗剤中の酵素を、10%洗剤溶液を80℃で2時間インキュベートすることで熱失活させる。インキュベーション終了時、測定されたpH値は6.3である。
サーモリシン変異体の洗浄性能を、予め卵黄と色素でシミをつけたポリアクリル織物片上での微小布見本アッセイ(Center for Testmaterials、CFT、The Netherlands)を利用して96穴マイクロプレート形式で試験する。プロテアーゼ洗浄性能アッセイの原理は、微小布見本に付けられた卵黄の加水分解に基づく卵黄粒子とカーボンブラック染料との遊離に基づいている。洗浄液の405nmでの吸光度を測定することで、分析試料中のプロテアーゼ活性の測定が得られる(pH、温度及び洗剤などの所望の条件下)。
1.PAS−38微小布見本(卵黄が付いたポリアクリル布を、エージングしてカーボンブラック染料で着色したもの;CFT−Vlaardingen、The Netherlands)
2.PAPを含む及び含まないクエン酸系洗剤(pH8)(AT処方、E欄参照)
3.熱失活させた市販の液体洗剤Sun All−in−1 Turbo Gel
4.100mM CAPS緩衝液(pH 10.2)(すすぎ用緩衝液)
5.ポリプロピレングリコールを含む希釈用緩衝液:10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)80溶液、10%プロピレングリコール
プロテアーゼ試料(MTPプレート中で成長させた細菌培養物から濾別した上清)を、いくつかの条件下において好適な濃度で試験する。
−AT処方洗剤(pH 6)、50℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約0.3μg/ml
−AT処方洗剤(pH 8)、50℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約0.2μg/ml
−AT処方洗剤(pH 8)+PAP、50℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約0.15μg/ml
−Sun All−in−1 Turbo Gel洗剤(pH 6.3)、50℃、アッセイ中でのプロテアーゼ最終濃度約0.5μg/ml
PAS−38布見本を直径5mm片に切断して、96穴マイクロプレートの各穴に入れる。培養上清試料を希釈緩衝液で約10μg/mlに希釈する。Biomek FXピペッティングロボットを利用して洗剤溶液及び希釈酵素試料を、PAS−38微小布見本を入れた96穴マイクロプレートに最終容量180μl/穴となるように加える。MTPを接着剤シールで密封し、iEMSインキュベータ/シェーカー(Thermo Scientific)に入れて1150RPMで振とうさせながら50℃ 30分間インキュベートする。インキュベーション後、各穴から得た洗浄液100μLを新たなMTPへ移し替えて、SpectraMAXマイクロプレート分光光度計(Molecular Devices)を利用して405nmでの吸光度を測定する。この吸光度値は「初期液体性能値」と呼ぶ。微小布見本プレートに残った洗浄液を破棄した後、微小布見本を水200μLで一回すすぐ。最後に、0.1M CAPS緩衝液180μLを各穴に加えて、MTPをiEMSインキュベータ/シェーカーにおいて1150RPMで振とうさせながら50℃で更に10分間インキュベートする。インキュベーション工程後、液体100μLを再度新たなMTPに移し替えて、405nmでの吸光度をSpectraMAXマイクロプレート分光光度計(Molecular Devices)を利用して測定する。この吸光度値は「すすぎ液値」と呼ぶ。2つの測定値(「初期液体性能値」及び「すすぎ液値」)を足して、「全体性能値」とする。
吸光度測定値をブランク値(酵素の非存在下での微小標本のインキュベート後に得られたもの)に対して補正すると、得られた吸光度値は加水分解活性の測定である。各試料の性能指数(PI)を算出する。洗浄性能指数に関するPI計算では、野生型サーモリシンをベースとするラングミュアカーブフィットを利用する。変異体のタンパク質濃度を用い、カーブフィットに基づいて性能期待値を算出する。性能実測値を性能計算値で除して、次いで、この値を、配列番号3のアミノ酸配列を有する野生型サーモリシン酵素の性能値で除する。
次の2種類の洗剤を使用する。
1.Sun ALL−in−1 Turbo Gel(Unilever、The Netherlands)(2010年に市販されていたものを購入)
2.以下の表1.1に示す成分の、AT処方洗剤
**AT処方洗剤のpHは、クエン酸によって所望の値に調節する。安定性試験及び洗浄性能アッセイではいずれも、21°GH水中で0.25%の溶液を用いる。
培養上清からのサーモリシン変異体のタンパク質定量は、Agilent 1200 HPLCシステムを用いて行う。希釈用緩衝液(10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% TWEEN(登録商標)−80溶液、10%プロピレングリコール)中において、精製野生型サーモリシンタンパク質(濃度はA222における吸光度を用いて求めた)を用いて検量線(18ppm〜400ppm)を作成する。試料を全て96穴マイクロプレートに移し替えて、塩酸(0.3M最終濃度)で前処理して、4℃で5分間インキュベートする。オートサンプラーを用いて試料をサイズ排除クロマトグラフィーのカラムBioSuite 250(4μm UHR、4.6×300mm(Waters Corporation、Milford、Massachusetts))に充填する前に、試料を最終濃度2%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)によって処理する。25mMリン酸ナトリウム(pH 6、2%(w/v)のSDS含有)を用いて、試料をカラムから溶出させる。流速は、14分間の測定中、0.4mL/分とする。試料の吸光度を、UV検出器を用いて222nmで測定し、タンパク質濃度を検量線に基づいて決定する。
バチルス・サーモプロテオリティカスサーモリシン部位評価ライブラリ(「SEL」)の作製
サーモリシン様プロテアーゼ(TLP)は、ペプチダーゼファミリーM4のファミリーメンバーであって、そのプロトタイプがサーモリシン(TLN;EC 3.4.24.27)である。バチルス・サーモプロテオリティカスから分泌された中性メタロエンドペプチダーゼであるサーモリシン(EC 3.4.24.27)のアミノ酸配列は、Titani et alによって最初に報告された(Titani et al.,Amino−acid sequence of thermolysin.Nature New Biol.238:35〜37頁(1972年))。その後、この酵素に関する遺伝子はO’Donohue et alによってクローニングされて(O’Donohue,M.J著、Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin.Biochem.J.300:599〜603頁(1994年))、配列はUniProtKB/Swiss−Protの受託番号P00800(配列番号4)として示された。Titani et alとO’Donohue et alにより報告されたタンパク質配列は、37位のAsn(Aspの代わりとして)及び119位のGln(Gluの代わりとして)のみが相違することが確認されている。
316個の残基それぞれのポジショナルライブラリは、BaseClear BV(Leiden、The Netherlands)によって作製された。このライブラリは、成熟タンパク質の316個の位置でサーモリシン変異体配列コードする発現プラスミドを含む形質転換枯草菌細胞から構成された。各変異体を、DNAシークエンシング分析によって確認した後、タンパク質活性を評価した。個々のクローンを、以下の説明通りに培養して、機能的特徴付けのために異なるサーモリシン変異体を得た。
サーモリシン変異体を含む枯草菌形質転換体を96穴プレートにおいてネオマイシン10μg/mlを含むMTPトリプチックソイブロス(TSB)中で16時間培養し、この予備培養物10μlを、ネオマイシン10μg/mlを含む培養培地(以下に説明するもの)190μlを満たしたCorning 3599 MTPに添加した。このプレートを37℃、湿度80%で、300rpmの定速回転で混合させながら22〜26時間インキュベートした。2500rpmで10分間遠心分離することによって細胞を回収し、それを、Millipore減圧システムを利用してMillipore Multiscreenフィルタープレートで濾過した。回収後、培養上清にプロピレングリコールを最終濃度が10%となるように加えて、これらの試料をアッセイに用いた。培養培地は、リン酸緩衝液ベースで、主要炭素源としてグルコース及びマルトデキストリンを含む、半合成強化培地であり、ロバストな細胞成長のために0.2%ソイトン及び0.14%酵母エキスを追加した。
組み合わせ可能な変異の同定
生産的位置は、改善された特徴を示すコンビナトリアル変異体を製造するのに最も有用な分子内位置として記載され、この位置では、少なくとも1種の組み合わせ可能な変異が生じ得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアルな変異体を作製するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアル変異体を作製するのに使用することのできる分子内の置換として記載され得る。
親酵素サーモリシンと比較して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.9以上であり、更にこれらの試験のうちいずれか一つのPIが1.0以上である変異体(グループA)
・所定の位置での置換の15%未満がグループA、B又はCに当てはまる位置に、生産性スコア「1」を与える。
・所定の位置での置換の15%以上40%未満がA、B又はCに当てはまる位置に、生産性スコア「2」を与える。
・所定の位置での置換の40%以上75%未満がA、B又はCに当てはまる位置に、生産性スコア「3」を与える。
・所定の位置での置換の75%以上がA、B又はCに当てはまる位置に、生産性スコア「4」を与える。
組み合わせ可能な変異及び適性スコア
実施例3に示した通り、サーモリシンにおける組み合わせ可能な変異を、実施例1で説明したアッセイで得た性能指数(PI)を用いて決定した。
I001L,T002A,T002C,T002I,T002K,T002M,T004K,T004L,T004M,T004Y,Q017L,N037K,F040K,F040L,K045A,K045G,K045M,T049E,T049M,T049Y,L050P,S053C,S053L,A056M,A058E,A058L,Q061L,F063C,A064D,A064E,S065A,S065D,S065E,S065P,S065Y,V087C,V087K,V087L,V087M,V087N,V087Q,V087W,V087Y,N096K,N096L,N096Y,R101H,Q108L,Q108M,G109E,G109M,G109R,G109W,S118A,S118D,S118M,S118Q,S118R,S118T,S118V,Q128A,Q128L,Q128Y,I131L,I137L,T149N,G154A,G154H,G154K,G154M,G154Y,L155M,I164A,N181S,G196A,G196W,I197C,S198A,S198K,G199A,G199Y,A209C,A209M,H216A,Y217C,Y217L,T222K,N227A,I244L,Q246D,V256N,L263A,L263M,T272K,Q273N,Y274M,P277A,P277D,P277Y,L284A,L284M,L284Y,A286K,A286L,A286M,A286N,A286Y,A287C,A288L,A288M,V289A,S291A,S291T,T293A,T293I,T293K,T293L,T293M,T293Y,L295A,L295K,L295M,L295W,Y296M,G297N,S298A,S298G,S298K,S298M,S298R,T299A,T299K,S300D,S300N,Q301K,E302A,V303A,V303P,V303Y,A304E,A304K,A304Y,S305A,S305K,S305M,V306L,V306T,A309C,F310M,D311A,D311K,D311L,D311M,D311V,D311W,D311Y,およびA312C
T002Q,T004V,V007I,V009I,R011K,I020L,I020V,S025A,S025C,S025K,S025M,S025R,T026C,T026D,Y027C,Y027L,N037L,F040A,A044C,K045F,K045H,K045Q,K045Y,Y046C,R047D,R047E,R047G,R047L,R047M,R047Q,R047T,T049L,T049N,T049Q,T049V,S053A,S053N,S053V,A056E,Q061C,Q061I,A064T,S065L,S065T,S065W,A073F,A073L,A073M,A073W,H074C,H074F,H074M,H074N,H074Q,H074W,T080L,T080N,K085S,N086D,V087R,V087T,L091A,L091N,L091R,L091W,L091Y,S092L,Y093C,N096G,N096H,N096Q,N096R,N096S,N096W,N097E,N097M,A099R,A099S,R101C,R101L,R101S,S102N,S107G,Q108I,Q108K,Q108N,G109S,S118E,M120L,Q128I,Q128K,T129L,T129M,I131W,S134P,G136S,I137E,I137T,I137V,V140D,V148A,V148Q,T149D,T149S,T152G,G154C,G154N,L155I,N159S,N159Y,I164C,I168L,I171G,Y179F,A180S,G189A,Y193F,G196H,G196L,G196Y,I197F,S198M,S198N,S198R,S198W,S201A,A209G,A209I,A209K,A209P,A209R,A209Y,Y211E,Y211R,P214A,P214R,Y217A,Y217F,Y217M,Y217N,K219A,K219E,K219R,K219S,R220A,Y221A,Y221F,Y221G,Y221M,T222A,T222M,Q225C,Q225E,Q225K,Q225L,Q225S,I232L,I232R,I232S,I232T,I232V,I232Y,S234A,S234C,G235A,I236C,I244A,I244M,Q246C,V256S,G257K,G257R,I258A,I258C,I258K,I258Q,I258V,G259N,G259S,G259T,L263H,L263K,L263N,L263V,G264A,G264N,G264P,G264Q,G264S,G264T,K265N,I266C,I266M,I266T,I266V,F267A,F267C,F267H,F267I,F267K,F267L,F267M,F267T,F267Y,R269K,A270G,L271H,T272A,Q273E,Q273G,L275C,L275Q,L275S,L275T,T276A,T276L,T276V,T276Y,P277E,P277F,P277G,P277H,P277N,P277R,P277V,P277W,S279G,R285Y,A286C,A286Q,A286R,A286T,A288N,V289L,V289M,V289Y,Q290A,Q290H,Q290N,S291V,T293N,T293V,T293W,D294N,L295F,L295G,Y296W,G297D,S298E,S298N,S298P,T299N,S300A,S300G,S300T,Q301M,Q301S,Q301T,Q301V,E302D,E302Q,V303G,V303K,V303L,V303R,V303W,A304R,A304S,A304T,A304W,S305H,S305T,S305V,V306I,Q308A,Q308L,F310C,F310W,D311F,D311G,D311I,D311Q,D311S,D311T,V313C,G314Q,V315L,V315T,K316A,およびK316M
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I001A,I001H,I001W,I001Y,G003Y,T004A,T004N,S005H,S005L,V007L,V009L,V009T,R011Y,Q017C,Q017R,Q017V,N019L,N019Y,T026W,Y027A,Q031I,N033K,F040W,S053K,S053R,A056H,A056I,A056Y,D057K,A058N,A058Y,Q061R,Q061W,F063Y,Y075A,V079A,V079N,T080D,N086Y,V087P,N089L,N089M,D094T,A098Y,V104A,S107K,S107Y,Q108A,G109A,G109L,Y110L,S118C,T129E,I131Y,G135A,I137A,A141C,T149A,T149L,D150A,D150F,D150K,D150N,D150Q,D150T,D150V,T152L,T152M,I156M,I156T,Q158L,Q158R,Q158Y,E160L,E160Y,T174A,L175H,N181A,K182L,E187L,I188L,I197A,I197H,I197N,M205A,M205V,S206A,S206C,S206K,S206L,D207A,G212Y,D213L,H216R,S218F,T224F,T224L,T224P,T224Q,T224V,T224Y,N227D,N227L,N227Y,I236A,I237N,N238L,N238M,K239A,A241L,A241S,Q246L,T249L,T249Y,H250K,H250M,H250N,H250P,H250Q,H250R,H250V,H250Y,V253I,V253R,V253Y,S254K,S254L,V255A,V255Y,V256K,D261P,D261V,D261W,K262A,Y268A,Y268S,R269V,T272P,T272Y,Q273C,Q273S,Q273W,Y274A,T278K,T278R,T278Y,N280G,N280Q,S282R,Q283K,Q283L,Q283P,Q283R,Q283W,Q283Y,A287K,A287R,A287T,Q290Y,S291I,S291L,S291M,S291N,D294A,D294V,Y296L,Y296R,T299P,S300I,S300L,Q301L,E302K,E302L,F310A,A312L,A312N,A312R,V313A,V313G,およびV313L
サーモリシン同族体の同定
A.プロテアーゼのMEROPSデータベースにおける関連分子の同定
バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンは、MEROPSプロテアーゼデータベースではM4ファミリー(Mはメタロプロテアーゼを表す)に分類されている(http://merops.sanger.ac.uk)。サーモリシンは、M4ファミリー(サーモリシンファミリー)メタロプロテアーゼのプロトタイプであって、クランMAの典型例である。サーモリシンは更に、第三の亜鉛配位子がグルタミン酸塩であることから、Glu−Zincinとしても知られるサブクランMA(E)にも分類される。バチルス・サーモプロテオリティカスのサーモリシンには、Meropsの受託番号MER001026が割り当てられた。
PepSY〜ペプチダーゼ_M4〜ペプチダーゼ_M4_C
1スチグマテラ・オーランチアカ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER086404)
2(スチグマテラ・オーランチアカ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER086488)
3(ミクソコッカス・ザンサス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER068045)
4(シュードアルテロモナス・チュニカータ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER063156)
5 M04.017(ストレプトマイセス・エバミティリス)グリセリシン(MER028561)
6 M04.017(ストレプトマイセス・スビセウス)グリセリシン(MER144000)
7 M04.017(ストレプトマイセス・ビリドクロモ)ゲネスグリセリシン(MER229668)
8 M04.017(ストレプトマイセス・セリカラー)グリセリシン(MER012275)
9 M04.017(ストレプトマイセス・スカビエイー)グリセリシン(MER200776)
10 M04.017(クリベラ・フラビダ)グリセリシン(MER076577)
11 M04.017(ジャニバクター種HTCC2649)グリセリシン(MER119370)
12 M04.017(ノカルジオイデス種JS614)グリセリシン(MER075575)
13 M04.017(スチグマテラ・オーランチアカ)グリセリシン(MER086497)
14 M04.017(ザントモナス・カンペストリス)グリセリシン(MER070193)
15 M04.017(かいよう病菌)グリセリシン(XAC0465タンパク質)(MER019560)
16 M04.017(イネ白葉枯病菌)グリセリシン(MER113870)
17 M04.017(ミクロモノスポラ種L5)グリセリシン(MER230635)
18 M04.017(ストレプトマイセス・エバミティリス)グリセリシン(SAV1037タンパク質)(MER028563)
19 M04.017(ストレプトマイセス・スビセウス)グリセリシン(MER187827)
20 M04.017(ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス)グリセリシン(MER137080)
21 M04.017(ストレプトマイセス種SPB74)グリセリシン(MER163965)
22 M04.017(ストレプトマイセス・アルブス)グリセリシン(MER187823)
23 M04.017(ストレプトマイセス・エバミティリス)グリセリシン(SAV2795タンパク質)(MER028566)
24 M04.017(ストレプトマイセス・スビセウス)グリセリシン(MER137175)
25 M04.017(ストレプトマイセス・ガーナエンシス)グリセリシン(MER187817)
26 M04.017(ストレプトマイセス・セリカラー)グリセリシン(MER019351)
27 M04.017(ストレプトマイセス・スカビエイー)グリセリシン(MER200969)
28 M04.017(ストレプトマイセス種SPB74)グリセリシン(MER137964)
29 M04.017(ストレプトマイセス・スビセウス)グリセリシン(MER187826)
30 M04.017(ストレプトマイセス・エバミティリス)グリセリシン(MER028567)
31 M04.017(ストレプトマイセス・セプタタス)グリセリシン(MER108931)
32 M04.017(ストレプトマイセス・スカビエイー)グリセリシン(MER200878)
33 M04.017(ストレプトマイセス種Mg1)グリセリシン(MER180683)
34 M04.017(ストレプトマイセス・スビセウス)グリセリシン(MER187825)
35 M04.017(ストレプトマイセス・セリカラー)グリセリシン(MER011085)
36 M04.017(ストレプトマイセス・スカビエイー)グリセリシン(MER200968)
37 M04.017(ストレプトマイセス・ガーナエンシス)グリセリシン(MER187816)
38 M04.017(ストレプトマイセス・グリセウス)グリセリシン(MER004744)
39 M04.017(ストレプトマイセス・フィラメントサス)グリセリシン(MER187821)
40 M04.017(ストレプトマイセス・エバミティリス)グリセリシン(MER028565)
41 M04.017(ストレプトマイセス種Mg1)グリセリシン(MER163416)
42 M04.017(ストレプトマイセス・グリセウス)グリセリシン(MER121393)
43 M04.017(ストレプトマイセス・フィラメントサス)グリセリシン(MER187820)
44 M04.017(ストレプトマイセス種TH−3)グリセリシン(MER169964)
45 M04.017(ジャニバクター種HTCC2649)グリセリシン(MER109443)
46 M04.017(ジャニバクター種HTCC2649)グリセリシン(MER109417)
47 M04.017(クリベラ・フラビダ)グリセリシン(MER096497)
48 M04.017(ストレプトマイセス・エバミティリス)グリセリシン(MER028564)
49 M04.022(類鼻疽菌)ZmpAペプチダーゼ(MER029961)
50 M04.022(鼻疽菌)ZmpAペプチダーゼ(MER040142)
51 M04.022(バークホルデリア・タイランデンシス)ZmpAペプチダーゼ(MER058477)
52 M04.022(バークホルデリア・オクラホメンシス)ZmpAペプチダーゼ(MER187766)
53 M04.022(バークホルデリア・セノセパシア)ZmpAペプチダーゼ(MER050804)
54 M04.022(セパシア菌)ZmpAペプチダーゼ(MER028622)
55 M04.022(バークホルデリア・アンビファリア)ZmpAペプチダーゼ(MER055697)
56 M04.022(バークホルデリア種383)ZmpAペプチダーゼ(MER056816)
57 M04.022(バークホルデリア・ウボネンシス)ZmpAペプチダーゼ.(MER166266)
58(デハロコッコイデス種VS)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER109883)
59(未同定真正細菌SCB49)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER137229)
60(クロセイバクター・アトランチカス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER118340)
61(フラボバクテリウム・ジョンソニアエ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER062832)
62(フラボバクテリウムカラムナーレ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091620)
63(クロセイバクター・アトランチカス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER109847)
64(クリセオバクテリウム・グレウム)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187776)
65(コルディア・アルジシダ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER166403)
66(ミクロシラ・マリナ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091624)
67(クロセイバクター・アトランチカス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER117388)
68(クロセイバクター・アトランチカス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER138802)
69(パエニバチルス・ラルバエ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187765)
70 M04.001(パエニバチルス・ラルバエ)サーモリシン(MER168882)
71(パエニバチルス・ポリミキサ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER001033)
72 M04.001(ブレビバチルス・ブレビス)サーモリシン(MER001028)
73 M04.001(ブレビバチルス・ブレビス)サーモリシン(nprタンパク質)(MER169677)
74 M04.001(バチルス・シュードマイコイデス)サーモリシン(MER187790)
75 M04.001(バチルス・マイコイデス)サーモリシン(MER187794)
76 M04.001(セレウス菌)サーモリシン(MER061817)
77 M04.001(セレウス菌)サーモリシン(MER187808)
78 M04.001(バチルス・ウェイヘンステファネンシス)サーモリシン(MER109389)
79 M04.001(バチルス・マイコイデス)サーモリシン(MER187798)
80 M04.001(セレウス菌)サーモリシン(MER001030)
81 M04.001(バチルス・チューリンゲンシス)サーモリシン(MER003181)
82 M04.001(バチルス・シュードマイコイデス)サーモリシン(MER176709)
83 M04.001(乳酸桿菌種)サーモリシン(MER001354)
84 M04.001(バチルス・アントラシス)サーモリシン(MER021824)
85 M04.001(バチルス・メガテリウム)サーモリシン(MER001031)
86 M04.001(バチルス種SG−1)サーモリシン(MER109427)
87 M04.001(バチルス・カルドリティカス)サーモリシン(MER001034)
88 M04.018(ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス)ステアロリシン(MER001025)
89 M04.001(ゲオバチルス種Y412MC52)サーモリシン(MER234417)
90 M04.001(アリシクロバチルス・アシドカルダリウス)サーモリシン(MER001353)
91 M04.001(バチルス種)サーモリシン(MER001927)
92 M04.001(ゲオバチルス種Y412MC61)サーモリシン(MER168133)
93 M04.001(ゲオバチルス種C56−T3)サーモリシン(MER212338)
94 M04.001(ゲオバチルス・カウストフィルス)サーモリシン(MER040474)
95 M04.001(バチルス・サーモプロテオリティカス)サーモリシン(MER001026)
96 M04.001(ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス)サーモリシン(MER001027)
97 M04.018(バチルス種SG−1)ステアロリシン(MER109364) 98 M04.001(エクシグオバクテリウム・シビリクム)サーモリシン(MER091675)
99 M04.001(エクシグオバクテリウム種AT1b)サーモリシン(MER124526)
100 M04.001(バチルス・マイコイデス)サーモリシン(MER187797)
101 M04.001(バチルス・シュードマイコイデス)サーモリシン(MER187793)
102(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187787)
103 M04.012(バチルス・チューリンゲンシス)中性ペプチダーゼB(MER039810)
104 M04.012(セレウス菌)中性ペプチダーゼB(MER028887)
105 M04.012(バチルス・ウェイヘンステファネンシス)中性ペプチダーゼB(MER084215)
106 M04.012(バチルス・マイコイデス)中性ペプチダーゼB(MER187800)
107 M04.012(セレウス菌)中性ペプチダーゼB(MER151875)
108 M04.012(バチルス・アントラシス)中性ペプチダーゼB(MER021804)
109 M04.012(バチルス・シュードマイコイデス)中性ペプチダーゼB(MER187792)
110 M04.012(バチルス・マイコイデス)中性ペプチダーゼB(MER187796)
111(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER084165)
112 M04.012(セレウス菌)中性ペプチダーゼB(MER187810)
113 M04.012(セレウス菌)中性ペプチダーゼB(MER187806)
114 M04.012(バチルス・チューリンゲンシス)中性ペプチダーゼB(MER187779)
115 M04.012(オセアノバチルス・イヘイエンシス)中性ペプチダーゼB(MER022038)
116 M04.012(枯草菌)中性ペプチダーゼB(MER001029)
117(ヘルペトシフォン・アウランチアクス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091650)
118(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187809)
119 M04.009(表皮ブドウ球菌)オーレオリシン(MER001869)
120 M04.009(スタフィロコッカス・キャピティス)オーレオリシン(MER178903)
121 M04.009(黄色ブドウ球菌)オーレオリシン(MER004711)
122 M04.009(マクロコッカス・カセオリティカス)オーレオリシン(MER155135)
123 M04.009(スタフィロコッカス・シュードインターメディウス)オーレオリシン(MER179736)
124 M04.009(スタフィロコッカス・ワーネリ)オーレオリシン(MER187814)
125 M04.009(スタフィロコッカス・クロモゲネス)オーレオリシン(MER011075)
126 M04.009(スタフィロコッカス・サプロフィチカス)オーレオリシン(MER057051)
127(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER050323)
128(バチルス・チューリンゲンシスM4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187780)
129(セレウス菌)に割り当てられていないペプチダーゼ(MER062591)
130(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187770)
131(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER080987)
132(セレウス菌M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187805) 133(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187789)
134(バチルス・ベトナメンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER038281)
135(バチルス種NRRL B−14911)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER062589)
136(バチルス種SG−1)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER109478)
137(バチルス・コアウイレンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187771)
138 M04.021(サーモアクチノミセス属27a)中性ペプチダーゼ(MER029719)
139 M04.014(枯草菌)バシロリシン(MER080014)
140 M04.014(バチルス種RH219)バシロリシン(MER080743)
141 M04.014(バチルス種B16)バシロリシン(MER054676)
142 M04.014(ブレビバチルス・ラテロスポラス)バシロリシン(MER048471)
143 M04.014(バチルス・アミロリケファシエンス)バシロリシン(MER001035)
144 M04.014(バチルス種)バシロリシン(MER001038)
145 M04.014(バチルス・プミルス)バシロリシン(MER091634)
146 M04.014(枯草菌)バシロリシン(MER001032)
147(クロストリジウム・アセトブチリクム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER014937)
148 M04.011(クロストリジウム・パーフリンジェンス)λ毒素(MER002103)
149 M04.011(クロストリジウム・アセトブチリクム)λ毒素(MER014941)
150(クロストリジウム・ヒストリチクム)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER003790)
151(クロロフレクス・アウランティアカス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER001453)
152(クロロフレクサス属Y−400−fl)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER155497)
153 M04.008(リステリア・イノキュア)Mplペプチダーゼ(リステリア属)(MER229925)
154 M04.008(リステリア菌)Mplペプチダーゼ(MER001047) 155 M04.008(リステリア・イバノビイ)Mplペプチダーゼ(MER045739)
156 M04.008(リステリア・ゼーリゲリ)Mplペプチダーゼ(MER045740)
157(プレシオシスチス・パシフィカ(Plesiocystis pacifica))M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER160603)
158(スチグマテラ・オーランチアカ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091643)
159(スチグマテラ・オーランチアカ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091640)
160(ミクソコッカス・ザンサス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER068475)
161ミクソコッカス・ザンサス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER017624)
162(シェワネラ・ヘリファキセンシス(Shewanella halifaxensis))M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER117663)
163(シュワネラ・ビオラセア)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER203088)
164(ハリスコメノバクター・ヒドロシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER248570)
165(サイトファガ・ハッチンソニイ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER023927)
166(ビブリオ・ミミカス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER229315)
167(ビブリオ・バルニフィカス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER025442)
168(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187802)
169(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091678)
170(バチルス・アントラシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER019065)
171(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER054507)
172(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER039813)
173(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187804)
174(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER091674)
175(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER028889)
176(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER039811)
177(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER028890)
178(バチルス・アントラシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER020840)
179(バチルス・マイコイデス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187799)
180(バチルス・ウェイヘンステファネンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER109684)
181(バチルス・シュードマイコイデス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187791)
182(バチルス・マイコイデス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187795)
183(バチルス・マイコイデス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187801)
184(バチルス・チューリンゲンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER039814)
185(セレウス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER028888)
186(バチルス・アントラシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER020835)
187(ハヘラ・チェジュエンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER058667)
188(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(nprタンパク質)(MER088299)
189(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(npr−1タンパク質)(MER079342)
190(スポロゲネス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER137542)
191(ボツリヌス菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(nprタンパク質)(MER187767)
192(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(npr_1タンパク質)(MER187754)
193(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187753)
194(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER079338)
195(スポロゲネス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER144884)
196(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(nprタンパク質)(MER079341)
197(スポロゲネス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187769)
198(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(npr_2タンパク質)(MER187755)
199(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER079340)
200(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(npr−4タンパク質)(MER095317)
201(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(npr−4タンパク質)(MER094802)
202(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(nprタンパク質)(MER094801)
203(スポロゲネス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER136684)
204(ボツリヌス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(nprタンパク質)(MER079339)
205(スポロゲネス菌)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER178275)
206(メタノサルシナ・アセチボランス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER017697)
207(ストレプトマイセス・ガーナエンシス)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187818)
208(ストレプトマイセス・セリカラー)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER011082)
209(ストレプトマイセス・スカビエイー)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER200705)
210(ストレプトマイセス・エバミティリス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER028562)
211(ストレプトマイセス・スビセウス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER137373)
212(ストレプトマイセス種Mg1)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER137463)
213(ストレプトマイセス・グリセウス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER121447)
214(ストレプトマイセス・フィラメントサス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187819)
215(ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER140364)
216(ストレプトマイセス・アルブス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187822)
217(ストレプトマイセス種SPB74)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER163861)
218http://merops.sanger.ac.uk/cgi−bin/pepsum?id=M04.UPW(ストレプトマイセス・クラブリゲルス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187824)
219(アルスロバクター・クロロフェノリカス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER126758)
220(アルスロバクター・フェナントレニボランス(Arthrobacter phenanthrenivorans))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER240183)
221(アルスロバクター種FB24)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER050759)
222(アルスロバクター・アウレッセンス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER075195)
223(海洋性放線菌PHSC20C1)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ
224(ブラキバクテリウム・ファエシウム(Brachybacterium faecium))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER127552)
225(クラビバクター・ミシガンエンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER121216)
226(クラビバクター・ミシガンエンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER115299)
227(マイクロバクテリウム・テスタセウム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER247399)
228(イントラスポランギウム・カルバム(Intrasporangium calvum))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER231738)
229(ジャニバクター種HTCC2649)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER115301)
230(フランキア・アルニ(Frankia alni))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091651)
231(フランキア種CcI3)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER051510)
232(フランキア種EAN1pec)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER051747)
233(メイオテルムス・シルヴェナス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER038269)
234(蛍光菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187756)
235(ミクソコッカス・ザンサス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER068095)
236(バークホルデリア種CCGE1002)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER203878)
237(トウゴマ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER162821)
238(カテヌリスポラ・アシジフィラ(Catenulispora acidiphila))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER132795)
239(ブレビバクテリウム・リネンス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER115300)
240(アナベナ・バリアビリス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER054976)
241(ノストック種PCC 7120)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER016719)
242(ノストック・パンクチフォルメ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER024259)
243(かいよう病菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER019561)
244(ザントモナス・カンペストリス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER070175)
245(イネ白葉枯病菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER027496)
246(ザントモナス・カンペストリス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER019416)
247(サーモモノスポラ・クルバータ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER129229)
248(ハロモナス・エロンガータ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER223548)
249(クロモハロバクター・サレキシゲンス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER050897)
250(パラ百日咳菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER030706)
251(気管支敗血症菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER030781)
252(ボルデテラ・ペツリイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER114690)
253(バリオボラックス・パラドクス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187757)
254(バリオボラックス・パラドクス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER235281)
255(シュードモナス・ブラッシカセアルム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER244770)
256(シュードモナス・フルバ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER249215)
257(シュードモナス・スツッツェリ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER094699)
258(ディケヤー・ダダンティイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER223843)
259(ディケヤー・ダダンティイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER193415)
260(ディケヤー・ジアエ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187758)
261(軟腐病菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER001045)
262(ペクトバクテリウム・ワサビアエ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187830)
263(ディケヤー・ダダンティイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER182707)
264 M04.023(シトロバクター・ローデンチウム)zpxペプチダーゼ(MER196184)
265 M04.023(エンテロバクター・カンセロゲナス)zpxペプチダーゼ(MER187772)
266 M04.023(サルモネラ菌)zpxペプチダーゼ(MER108712) 267 M04.023(エンテロバクター・サカザキ)zpxペプチダーゼ(zpxタンパク質)(MER091601)
268 M04.023(火傷病菌)zpxペプチダーゼ(prt1タンパク質)(MER202074)
269 M04.025(エルウィニア・ビリンギアエ)プロテアリシン(mprタンパク質)(MER220902)
270 M04.025(パントエア種At−9b)プロテアリシン(MER232022)
271 M04.025(イネ内穎褐変病菌)プロテアリシン(MER202817) 272 M04.025(ラーネラ種Y9602)プロテアリシン(MER237139)
273 M04.025(セラチア・グリメシイ)プロテアリシン(MER115298)
274 M04.025(セラチア種A2)プロテアリシン(MER119664)
275 M04.025(セラチア・プロテアマキュランス)プロテアリシン(MER059439)
276 M04.025(セラチア種AS9)プロテアリシン(MER249825) 277 M04.025(セラチア種AS12)プロテアリシン(MER249807)
278(ゲオデルマトフィルス・オブスクルス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER132589)
279(ゲンマタ・オブスキュリグロブス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187768)
280(ノカルジオイデス種JS614)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER049523)
281 M04.024(ゼノラブダス・ボビエニイ)PrtSペプチダーゼ(フォトラブダス・ルミネッセンス)(MER200616)
282 M04.024(ゼノラブダス・ネマトフィラ)PrtSペプチダーゼ(MER219816)
283 M04.024(ゼノラブダス・ネマトフィラ)PrtSペプチダーゼ(MER219815)
284 M04.024(フォトラブダス・アシンビオティカ)PrtSペプチダーゼ(MER187759)
285 M04.024(フォトラブダス・ルミネッセンス)PrtSペプチダーゼ(MER033481)
286 M04.024(フォトラブダス種Az29)PrtSペプチダーゼ(MER115297)
287(アスペルギルス・テレウス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091644)
288(ネオサルトリア・フィシェリ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091615)
289(ピレノフォラ・トリチシ・リペンティス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER138903)
290(サッカロポリスポラ・エリスラエア)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER088688)
291(ネクトリア・ハエマトコカ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER243771)
292(ジベレラ・ゼアエ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER064838)
293(メタリジウム・アニソピラエ(メタリジウム菌))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER243770)
294(メタリジウム・アクリダム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER243769)
295(ワドリア・コンドロフィラ(Waddlia chondrophila))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER211844)
296(シュードモナス・サバスタノイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER232822)
297(シリンゲ菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER052672)
298(シュードモナス・コロナファシエンス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187813)
299(シアノセイス種ATCC 51142)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER103362)
300(バチルス・チューリンゲンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187783)
301(セレウス菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER178978)
302(セレウス菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187811)
303(バチルス・チューリンゲンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187778)
304(セレウス菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187807)
305(メタノサルシナ・アセチボランス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER017698)
306(バチルス・チューリンゲンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187784)
307(バチルス・チューリンゲンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187788)
308(セルロファーガ・アルジコラ(Cellulophaga algicola))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER235562)
309(クロコウジカビ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091631)
310(プロビデンシア・ラスティジアニイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187773)
311(プロビデンシア・アルカリファシエンス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187774)
312(プロビデンシア・レットゲリ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187775)
313(プロビデンシア・スチュアルティ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER122839)
314(マイコバクテリウム・アブセサス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER117364)
315(マイコバクテリウム・アブセサス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER117363)
316(ブラディリゾビウム・ジャポニクム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER026988)
317(アグロバクテリウム・ビチス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER162454)
318(ムシラジニバクター・パルジス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER229316)
319(霊菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER001046)
320(ストレプトマイセス・ガーナエンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187815)
321(粘液細菌)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER114292)
322(ストレプトマイセス・フィラメントサス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091679)
323(ストレプトマイセス・エバミティリス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER028519)
324(ストレプトスポランギウム・ロセウム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187812)
325 M04.007(フェシウム菌)ココリシン(MER187749)
326 M04.007(フェカリス菌)ココリシン(MER002810)
327(レニバクテリウム・サルモニナルム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER002083)
328(クリベラ・フラビダ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER079366)
329(ヘルペトシフォン・アウランチアクス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER085851)
330 M04.016(アエロモナス・ジャンダエイ)PAペプチダーゼ(アエロモナス型)(MER079815)
331 M04.016(アエロモナス・オイクレノフィラ)PAペプチダーゼ(アエロモナス型)(MER079803)
332 M04.016(アエロモナス・パンクタータ)PAペプチダーゼ(アエロモナス型)(MER029943)
333 M04.016(アエロモナス・エンシェレイア)PAペプチダーゼ(MER079817)
334 M04.016(アエロモナス・ベスチアルム)PAペプチダーゼ(MER079816)
335 M04.016(アエロモナス・メディア)PAペプチダーゼ(MER079802)
336 M04.016(アエロモナス・サルモニシダ)PAペプチダーゼ(MER079819)
337 M04.016(アエロモナス・パンクタータ)PAペプチダーゼ(MER030073)
338 M04.016(アエロモナス・エンシェレイア)PAペプチダーゼ(MER079804)
339 M04.016(アエロモナス・ポポフィイ)PAペプチダーゼ(MER079805)
340 M04.016(アエロモナス・ハイドロフィラ)PAペプチダーゼ(MER011853)
341 M04.016(アエロモナス種CDC 2478−85)PAペプチダーゼ(MER079818)
342 M04.016(アエロモナス・シュベルティイ(Aeromonas schubertii))PAペプチダーゼ(アエロモナス型)(MER079806)
343(アエロモナス・ベロニイ(Aeromonas veronii))M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER055154)
344(アエロモナス・ソブリア)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER079820)
346(シュワネラ・デニトリフィカンス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER050231)
347(シュワネラ・バルティカ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER048895)
348(シュワネラ・アマゾネンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER048811)
349(シュワネラ・ウーディイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER087265)
350(クロモバクテリウム・ビオラセウム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER027350)
351(シュードアルテロモナス種SB−B1)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER140592)
352(シュードアルテロモナス種SM9913)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091617)
353(シュードアルテロモナス種A28)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER019098)
354(南極細菌株(Antarctic bacterium str.)643)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER012255)
355(シュードアルテロモナス種SM495)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187748)
356(シュードアルテロモナス・ピスキキダ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER019099)
357(シュードアルテロモナス・ルテニカ(Pseudoalteromonas ruthenica))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187751)
358(シュードアルテロモナス・チュニカータ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER108855)
359(モリテラ・ビスコサ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER139442)
360(ハリアンギウム・オクラセウム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER114761)
361(ハリアンギウム・オクラセウム)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER124450)
362(カンギエラ・コレエンシス(Kangiella koreensis))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER065613)
363 M04.003(マリノモナス種MED121)ビブリオリシン(MER139826)
364(ビブリオ・スプレンディダス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER122486)
365(ビブリオナレス目の細菌SWAT−3)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER139254)
366(ビブリオ・トゥビアッシ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187750)
367(ビブリオ・ハーベイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091688)
368(ビブリオ・キャンプベリイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER139568)
369(シュワネラ種MR−7)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER072768)
370(シュワネラ種MR−4)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER073030)
371(シュワネラ種ANA−3)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER073381)
372(シュワネラ・アマゾネンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER049928)
373(シュワネラ・ウーディイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER087209)
374(腸炎ビブリオ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER027936)
375(ビブリオ種Ex25)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER139749)
376(ビブリオ・ハーベイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER109271)
377(ハヘラ・チェジュエンシス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER080002)
378 M04.003(モリテラ種PE36)ビブリオリシン(MER113768)
379(難培養性細菌pTW3)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER164961)
380(難培養性細菌pTW2)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER164951)
381 M04.005(緑膿菌)シュードリシン(MER001024)
382 M04.003(ビブリオ・トゥビアッシ)ビブリオリシン(MER139044)
383 M04.003(ビブリオ・プロテオリチカス)ビブリオリシン(MER001043)
384 M04.003(リストネラ・アンギラルム)ビブリオリシン(MER120583)
385 M04.003(ビブリオ・アンギラルム)ビブリオリシン(MER001044)
386 M04.003(リストネラ・アンギラルム)ビブリオリシン(MER120671)
387 M04.003(ビブリオ・エスチュアリアナス)ビブリオリシン(MER113809)
388 M04.003(ビブリオ・バルニフィカス)ビブリオリシン(MER003353)
389 M04.010(ビブリオ・スプレンディダス)ビメリシン(MER091636)
390 M04.010(ビブリオ種MED222)ビメリシン(MER113711)
391 M04.010(ビブリオ種T−1800)ビメリシン(MER029796)
392 M04.010(ビブリオナレス目の細菌SWAT−3)ビメリシン(MER109237)
393 M04.003(コレラ菌)ビブリオリシン(MER001041)
394 M04.003(ビブリオ・ミミカス)ビブリオリシン(MER122299)
395 M04.003(ビブリオ・フラビアリス)ビブリオリシン(MER019097)
396 M04.003(サリニビブリオ種AF−2004)ビブリオリシン(MER091639)
397 M04.010(フォトバクテリウム種SKA34)ビメリシン(MER110034)
398 M04.010(ビブリオ・アンガスタム)ビメリシン(MER109056)
399 M04.010(フォトバクテリウム・アンガスタム)ビメリシン(MER187763)
400 M04.010(ビブリオ・アンガスタム)ビメリシン(MER109302)
401(モリテラ種PE36)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER109180)
402(アルテロモナダーレス属の細菌TW−7)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER091610)
403(シュワネラ・ビオラセア)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER203253)
404(ビブリオ・キャンプベリイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER168125)
405(レジオネラ・ロングビーチエ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER198565)
406 M04.020(ビブリオ種AND4)pap6ペプチダーゼ(MER187764)
407 M04.020(ビブリオ・キャンプベリイ)pap6ペプチダーゼ(MER118605)
408 M04.020(ビブリオ・ハーベイ)pap6ペプチダーゼ(MER020240)
409(ビブリオ・スプレンディダス)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER139945)
410 M04.006(レジオネラ・ニューモフィラ)Mspペプチダーゼ(レジオネラ種)(MER001039)
411 M04.006(レジオネラ・ドランコーティイ)Mspペプチダーゼ(レジオネラ種)(MER187828)
412 M04.006(レジオネラ・ロングビーチエ)Mspペプチダーゼ(レジオネラ種)(MER002394)
413(レジオネラ・ニューモフィラ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER040780)
414(レジオネラ・ドランコーティイ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187829)
415(レジオネラ・ロングビーチエ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER198471)
416(レジオネラ・ニューモフィラ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER040782)
417(レジオネラ・ニューモフィラ)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER040781)
418 M04.019(シュードアルテロモナス・ピスキキダ)MprIII(MER024591)
419(テレディニバクター・ツルネラエ)M4に割り当てられていないペプチダーゼ(MER187760)
420(レイネケア種MED297)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER083722)
421(レイネケア・ブランデンシス(Reinekea blandensis))M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER187762)
422(レイネケア種MED297)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER117392)
423(アルテロモナス種SN2)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER247991)
424(ヒドロゲニビルガ種128−5−R1−1)M4ファミリーに割り当てられていないペプチダーゼ(MER142070)
タンパク質BLAST解析(Altschul SF,Madden TL,Schaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,Lipman DJ.(1997年)Nucleic Acids Res.25:3389〜402)を、Genome Quest(www.genomequest.com)において、特許及びパブリックドメインのデータベースに対して、問い合わせ配列としてサーモリシン(配列番号3)のアミノ酸配列を用いて実行することで、以下に示す結果を得た(表5.2)。BLASTは、GenomeQuestによるNCBI BLAST2アルゴリズムの実行であって、生物学的類似性の観点から最も関連するアミノ酸配列を見つけだす。この配列検索は、タンパク質を検索するために次のデフォルトBLASTパラメータを有している:ワードサイズ:3、E値カットオフ:10、スコア行列:BLOSUM62、ギャップ開始:11、ギャップ伸長:2
安定性が強化されたサーモリシン変異体を同定するための温度因子の利用
結晶学上の温度因子は、高分子を構成する各原子の相対運動の尺度である。これらの温度因子は、結晶X線回折の個々のピーク強度として与えられる回折パターン計算値が実測パターンと最もよくマッチするようにモデルを精密化した結果として生じる。温度因子は、式:−exp(−Bsin2θ/λ)(式中、Bは温度因子である)を用いて、運動性の高い原子が、散乱角(θ)の関数として高分子凝集体の回折全体の縮小効果を有することを反映するように減衰因子として精密化される(Blundell,T.L.及びJohnson L.N.、Protein Crystallography,Academic Press、1976年、121頁)。
これら領域は、コンセンサス柔軟性領域を表し、次の残基を含む。
Claims (14)
- 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変は生産的位置であり、前記生産的位置で試験された前記改変が、次の評価基準[すなわち、
前記親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、PAS−38微小布見本の洗浄活性、又はAbz−AGLA−Nbaに対する活性のパラメータのうち少なくとも3種に関する最小性能指数(PI)が1以上である、位置]を満たしており、
前記生産的位置が(i)278位、283位、180位、244位、48位及び63位、又は(ii)T278R、Q283E、A180E、I244T、T48E及びF63Cからなる群から選択され、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変は生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも1つの改変が、次の評価基準[すなわち、
前記親酵素サーモリシンに対して、発現、洗剤安定性、熱安定性、PAS−38微小布見本の洗浄活性、又はAbz−AGLA−Nbaに対する活性のパラメータの少なくとも全てに関する最小性能指数(PI)が0.5以上であるが、前記パラメータのうち一つ以下が0.8未満である、位置]を満たしており、
前記生産的位置が、(i)019位、025位、026位、065位、091位、096位、097位、101位、109位、118位、131位、140位、158位、159位、175位、180位、196位、219位、225位、232位、244位、246位、261位、277位、293位、300位、301位、301位、303位、305位、及び311位、又は(ii)N019D、S025A、T026R、S065A、L091M、N096Q、N096R、N096Y、N097K、R101M、G109A、S118A、I131L、V140D、Q158A、N159E、N159K、L175V、A180R、G196T、G196Y、K219S、Q225E、I232R、I244L、Q246D、D261N、P277G、T293Y、S300G、Q301F、Q301M、V303R、S305A、及びD311Aからなる群から選択され、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、
(i)2位、26位、47位、49位、53位、65位、87位、91位、96位、108位、118位、128位、154位、179位、196位、197位、198位、199位、209位、211位、217位、219位、225位、232位、256位、257位、259位、261位、265位、267位、272位、276位、277位、286位、289位、290位、293位、295位、298位、299位、300位、301位、303位、305位、308位、311位、及び316位、又は2位、26位、47位、53位、87位、91位、96位、108位、118位、154位、179位、197位、198位、199位、209位、211位、217位、219位、225位、232位、256位、257位、259位、261位、265位、267位、272位、276位、277位、286位、289位、290位、293位、295位、298位、299位、300位、301位、303位、305位、308位、311位、及び316位、又は2位、87位、96位、198位、277位、293位、295位、298位及び301位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも75%は、
(ii)1位、4位、17位、25位、40位、45位、56位、58位、61位、74位、86位、97位、101位、109位、149位、150位、158位、159位、172位、181位、214位、216位、218位、221位、222位、224位、250位、253位、254位、258位、263位、264位、266位、268位、271位、273位、275位、278位、279位、280位、282位、283位、287位、288位、291位、297位、302位、304位、307位、及び312位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも40%でかつ75%未満は、
(iii)5位、9位、11位、19位、27位、31位、33位、37位、46位、64位、73位、76位、79位、80位、85位、89位、95位、98位、99位、107位、127位、129位、131位、137位、141位、145位、148位、151位、152位、155位、156位、160位、161位、164位、168位、171位、176位、180位、182位、187位、188位、205位、206位、207位、210位、212位、213位、220位、227位、234位、235位、236位、237位、242位、244位、246位、248位、249位、252位、255位、270位、274位、284位、294位、296位、306位、309位、310位、313位、314位、及び315位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも15%でかつ40%未満は、又は
(iv)3位、6位、7位、20位、23位、24位、44位、48位、50位、57位、63位、72位、75位、81位、92位、93位、94位、100位、102位、103位、104位、110位、117位、120位、134位、135位、136位、140位、144位、153位、173位、174位、175位、178位、183位、185位、189位、193位、201位、223位、230位、238位、239位、241位、247位、251位、260位、262位、269位、及び285位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも1つの改変でかつ15%未満は、
次の評価基準[すなわち、
a)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.9以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.0以上である、位置、
b)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.8以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.2以上である、位置、及び
c)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.5以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.5以上である、位置]から選択される少なくとも1つを満たしており、
サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、サーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 前記親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を更に含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも40%でかつ75%未満は、次の評価基準[すなわち、
a)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.9以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.0以上である、位置、
b)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.8以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.2以上である、位置、及び
c)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.5以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.5以上である、位置]から選択される少なくとも1つを満たしており、
前記生産的位置が、1位、4位、17位、25位、40位、45位、61位、74位、86位、97位、101位、109位、149位、150位、158位、159位、172位、181位、214位、216位、218位、221位、222位、224位、250位、253位、254位、258位、263位、264位、266位、268位、271位、275位、279位、282位、287位、288位、291位、297位、302位、304位、307位、及び312位からなる群から選択され、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、請求項1に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 前記親酵素サーモリシンに対するアミノ酸の改変を更に含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変はサーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも15%でかつ40%未満は、次の評価基準[すなわち、
a)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.9以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.0以上である、位置、
b)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.8以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.2以上である、位置、及び
c)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.5以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.5以上である、位置]から選択される少なくとも1つを満たしており、
前記生産的位置が、5位、9位、11位、27位、31位、33位、37位、46位、64位、73位、76位、79位、80位、85位、89位、95位、98位、99位、107位、127位、129位、137位、141位、145位、148位、152位、155位、160位、161位、164位、168位、171位、176位、182位、187位、188位、205位、206位、207位、210位、212位、213位、220位、227位、234位、235位、236位、237位、242位、248位、249位、252位、255位、270位、274位、284位、294位、296位、306位、309位、310位、313位、314位、及び315位からなる群から選択され、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、請求項2に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 親酵素サーモリシンに対するアミノ酸改変を更に含むサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、前記改変が、サーモリシン酵素変異体の生産的位置で生じ、前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも1つの改変でかつ15%未満は、次の評価基準[すなわち、
a)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.9以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.0以上である、位置、
b)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.8以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.2以上である、位置、及び
c)前記親酵素サーモリシンに対して、pH6又はpH8でのPAS−38微小布見本の洗浄、Abz−AGLA−Nbaに対する活性、洗剤安定性及び熱安定性に関する最小性能指数(PI)が0.5以上であり、更に、これら試験のうちいずれか一つに関するPIが1.5以上である、位置]から選択される少なくとも1つを満たしており、
前記生産的位置が、3位、7位、20位、23位、24位、44位、48位、50位、57位、72位、81位、92位、93位、94位、100位、102位、103位、104位、110位、117位、120位、134位、135位、136位、140位、144位、153位、173位、174位、175位、178位、183位、185位、189位、193位、201位、223位、230位、238位、239位、241位、247位、251位、260位、262位、269位、及び285位からなる群から選択され、サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、請求項3に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 請求項3に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片であって、
(i)2位、26位、47位、49位、53位、65位、87位、91位、96位、108位、118位、128位、154位、179位、196位、197位、198位、199位、209位、211位、217位、219位、225位、232位、256位、257位、259位、261位、265位、267位、272位、276位、277位、286位、289位、290位、293位、295位、298位、299位、300位、301位、303位、305位、308位、311位、及び316位、又は2位、26位、47位、53位、87位、91位、96位、108位、118位、154位、179位、197位、198位、199位、209位、211位、217位、219位、225位、232位、256位、257位、259位、261位、265位、267位、272位、276位、277位、286位、289位、290位、293位、295位、298位、299位、300位、301位、303位、305位、308位、311位、及び316位、又は2位、87位、96位、198位、277位、293位、295位、298位及び301位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも75%が、a)、b)及びc)の評価基準から選択される少なくとも1つを満たしている場合は、
前記改変が、2位(T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M)、26位(T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D)、47位(R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T)、49位(T,A,F,H,V,E,Y)、53位(S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L)、65位(S,I,M,Q,L,A)、87位(V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y)、91位(L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y)、96位(N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y)、108位(Q,C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M)、118位(S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V)、128位(Q,D,E,R,S,K,A)、154位(G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y)、179位(Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F)、196位(G,E,T,K,V,L,Y,A,W)、197位(I,D,K,L,T,V,W,Y,A,H,N,E,Q,R,F,C)、198位(S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K)、199位(G,C,E,F,H,Q,S,T,W,L,A,Y)、209位(A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M)、211位(Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R)、217位(Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L)、219位(K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S)、225位(Q,D,G,H,I,P,V,W,A,M,R,C,E,K,L,S)、232位(I,C,E,F,K,M,N,Q,W,G,L,R,S,T,V,Y)、256位(V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S,N)、257位(G,C,D,E,L,N,P,Q,S,T,Y,K,R)、259位(G,A,C,E,F,H,L,M,W,K,R,N,S,T)、261位(D,A,N,P,V,W,G,H,I,S)、265位(K,A,C,D,M,P,Q,S,G,I,L,R,N)、267位(F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y)、272位(T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K)、276位(T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y)、277位(P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y)、286位(A,D,E,F,G,H,I,S,P,C,Q,R,T,K,L,M,N,Y)、289位(V,C,E,F,G,I,N,S,W,R,T,L,M,Y,A)、290位(Q,C,D,F,G,L,W,Y,R,T,V,A,H,N)、293位(T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,M,Y)、295位(L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W)、298位(S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R)、299位(T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K)、300位(S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,W,A,G,T,D,N)、301位(Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K)、303位(V,C,H,G,K,L,R,W,A,P,Y)、305(S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M)、308位(Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L)、311位(D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y)、及び316位(K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M)からなる群から選択され、
(ii)1位、4位、17位、25位、40位、45位、56位、58位、61位、74位、86位、97位、101位、109位、149位、150位、158位、159位、172位、181位、214位、216位、218位、221位、222位、224位、250位、253位、254位、258位、263位、264位、266位、268位、271位、273位、275位、278位、279位、280位、282位、283位、287位、288位、291位、297位、302位、304位、307位、及び312位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも40%でかつ75%未満が、a)、b)及びc)の評価基準から選択される少なくとも1つを満たしている場合は、前記改変が、1位(I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L)、4位(T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y)、17位(Q,I,W,Y,C,R,V,T,L)、25位(S,D,F,A,C,K,M,R)、40位(F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L)、45位(K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M)、56位(A,K,Q,V,W,H,I,M)、58位(A,N,Y,V,L)、61位(Q,M,R,W,F,V,C,I,L)、74位(H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W)、86(N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D)、97位(N,K,C,R,S,Y,E,M)、101位(R,T,C,L,S,H)、109位(G,A,L,S,E,M,R,W)、149位(T,M,V,A,L,D,S,N)、150位(D,A,F,K,N,Q,T,V,S)、158位(Q,A,K,M,N,L,R,Y,S)、159位(N,R,W,A,C,G,M,T,S,Y)、172位(F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H)、181位(N,L,A,G,K,M,T,S)、214位(P,C,G,K,S,N,A,R)、216位(H,C,E,S,T,R,A)、218位(S,K,L,Y,F,G,T,V)、221位(Y,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M)、222位(T,C,D,L,Y,I,V,A,M,K)、224位(T,K,M,F,L,P,Q,V,Y,E,H)、250位(H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y)、253位(V,N,T,I,R,Y,M,Q)、254位(S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W)、258位(I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V)、263位(L,C,I,Q,T,H,K,N,V,A,M)、264位(G,C,R,A,N,P,Q,S,T)、266位(I,A,F,L,S,C,M,T,V)、268位(Y,M,Q,V,A,S,K)、271位(L,A,D,F,I,N,Y,H)、273位(Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N)、275位(L,I,M,V,C,Q,S,T)、278位(T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S)、279位(S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G)、280位(N,A,C,D,E,G,Q,H,T)、282位(S,K,N,R,A,H,L,M,T)、283位(Q,K,L,P,R,W,Y,S)、287位(A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C)、288位(A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M)、291位(S,E,I,L,M,N,V,A,T)、297位(G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N)、302位(E,K,L,G,T,V,D,Q,A)、304位(A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y)、307位(K,A,C,G,I,M,N,Q,R,W,Y,H)、及び312位(A,G,M,V,L,N,R,T,C)からなる群から選択され、
(iii)5位、9位、11位、19位、27位、31位、33位、37位、46位、64位、73位、76位、79位、80位、85位、89位、95位、98位、99位、107位、127位、129位、131位、137位、141位、145位、148位、151位、152位、155位、156位、160位、161位、164位、168位、171位、176位、180位、182位、187位、188位、205位、206位、207位、210位、212位、213位、220位、227位、234位、235位、236位、237位、242位、244位、246位、248位、249位、252位、255位、270位、274位、284位、294位、296位、306位、309位、310位、313位、314位、及び315位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも15%でかつ40%未満が、a)、b)及びc)の評価基準から選択される少なくとも1つを満たしている場合は、前記改変が、5位(S,D,N,P,H,L)、9位(V,L,T,I)、11位(R,I,Y,K)、19位(N,L,Y,K,S)、27位(Y,W,A,M,V,C,L)、31位(Q,A,K,V,I,C,Y)、33位(N,S,T,K,A,C,L,M)、37位(N,D,Q,R,L,K)、46位(Y,L,H,N,C)、64位(A,H,Q,T,D,E)、73位(A,I,F,L,M,W)、76位(Y,H,L,M,Q,T)、79位(V,L,Q,T,A,N,S)、80位(T,I,D,A,L,N)、85位(K,E,A,L,N,R,S)、89位(N,L,M,H)、95(G,A,D,H,M,N,S)、98位(A,C,E,H,R,Y,K,V)、99位(A,E,K,P,R,S)、107位(S,D,K,Y,A,G)、127位(G,C,D,E)、129位(T,I,R,E,Y,L,M)、131位(I,Y,W,L)、137位(I,P,A,E,T,V,L)、141位(A,S,C,G)、145位(T,A,C,E,G,M,N,Q)、148位(V,L,N,Y,M,A,Q)、151位(Y,G)、152位(T,S,L,M,G)、155位(L,C,I,M)、156位(I,L,Q)、160位(E,L,Y,Q)、161位(S,A,N,P,T)、164位(I,L,N,S,T,V,C,A)、168位(I,A,M,T,L)、171位(I,C,E,F,L,S,G)、176位(V,L,N,C)、180位(A,E,G,K,T,S)、182位(K,L,A,W)、187位(E,L,D)、188位(I,L,V)、205位(M,L,A,V,Q)、206位(S,A,C,K,L,M,R)、207位(D,A,H,N)、210位(K,I,L,V)、212位(G,Y,A,D,Q)、213位(D,N,S,L,A,G,W)、220位(R,K,V,A)、227位(N,D,L,Y,A)、234位(S,D,N,A,C)、235位(G,M,C,Q,S,A)、236位(I,M,A,C)、237位(I,N,F,M)、242位(Y,C,F,N,V)、244位(I,T,V,F,A,M,L)、246位(Q,E,N,T,L,C,D)、248位(G,A,E,S)、249位(T,K,M,N,L,Y,P)、252位(G,K,Y,A,S,T,W)、255位(V,L,P,A,Y,M,N)、270位(A,C,F,I,L,S,G)、274位(Y,F,H,A,C,Q,T,M)、284位(L,V,W,A,M,Y)、294位(D,A,V,Q,N)、296位(Y,N,L,R,H,W,M)、306位(V,A,S,F,I,L,T)、309位(A,G,S,T,V,C)、310位(F,A,C,W,M)、313位(V,T,A,G,L,I,C)、314位(G,A,E,H,M,S,W,Q)、及び315位(V,A,C,I,M,L,T)からなる群から選択され、又は
(iv)3位、6位、7位、20位、23位、24位、44位、48位、50位、57位、63位、72位、75位、81位、92位、93位、94位、100位、102位、103位、104位、110位、117位、120位、134位、135位、136位、140位、144位、153位、173位、174位、175位、178位、183位、185位、189位、193位、201位、223位、230位、238位、239位、241位、247位、251位、260位、262位、269位、及び285位からなる群から選択される前記生産的位置で試験された前記改変のうち少なくとも1つの改変でかつ15%未満が、a)、b)及びc)の評価基準から選択される少なくとも1つを満たしている場合は、前記改変が、3位(G,Y)、6位(T,C,V)、7位(V,L,I)、20位(I,L,V)、23位(T,F,W)、24位(Y,W)、44位(A,C)、48位(T,E,D)、50位(L,P)、57位(D,K)、63位(F,Y,C)、72位(D,F,W)、75位(Y,A)、81位(Y,F)、92位(S,L)、93位(Y,T,C)、94位(D,T)、100位(I,L,V)、102位(S,G,N)、103位(S,T)、104位(V,A)、110位(Y,L)、117位(G,H)、120位(M,L)、134位(S,A,P)、135位(G,A)、136位(G,A,S)、140位(V,D)、144位(L,T)、153位(A,T)、173位(G,A,C)、174位(T,C,A)、175位(L,H,S)、178位(F,H,Y)、183位(N,S)、185位(D,E)、189位(G,A)、193位(Y,F)、201位(S,C,A)、223位(G,D,K)、230位(V,A)、238位(N,L,M)、239位(K,A)、241位(A,L,S)、247位(G,A,S)、251位(Y,M)、260位(R,A,N)、262位(K,A)、269位(R,V,K)、及び285位(R,K,Y)からなる群から選択され、
サーモリシン変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるサーモリシンのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている、請求項3に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。 - 前記変異体が、配列番号3に記載のサーモリシンと少なくとも50%の同一性を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体又はその活性断片。
- 前記サーモリシン酵素変異体が、バチルス属、ゲオバチルス種、アリシクロバチルス属、乳酸桿菌、エクシグオバクテリウム属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、ヘルペトシフォン属、オセアノバチルス属、シュワネラ属、クロストリジウム属、ブドウ球菌属、フラボバクテリウム属、スチグマテラ属、ミクソコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、クリセオバクテリウム属、ストレプトマイセス属、クリベラ属、ジャニバクター属、ノカルジオイデス属、ザントモナス属(Xanthamonas)、ミクロモノスポラ属、バークホルデリア属、デハロコッコイデス属、クロセイバクター、コルジア属、マイクロシーラ属、サーモアクチノミセス属、クロロフレクサス属、リステリア属、プレシオシスチス属、ハリスコメノバクター属、サイトファーガ属、ハヘラ属、アルスロバクター属、ブラキバクテリウム属、クラビバクター属、ミクロバクテリウム属、イントラスポランギウム属、フランキア属、メイオテルムス属、シュードモナス属、トウゴマ属、カテヌリスポラ属、アナベナ属、ノストック属、ハロモナス属、クロモハロバクター属、ボルデテラ属、バリオボラックス属、ディケヤー属、ペクトバクテリウム属、シトロバクター属、エンテロバクター属、サルモネラ属、エルウィニア属、パントエア属、ラーネラ属、セラチア属、ゲオデルマトフィルス属、ゲンマタ属、ゼノラブダス属、フォトラブダス属、アスペルギルス属、ネオサルトリア属、ピレノフォラ属、サッカロポリスポラ属、ネクトリア属、ジベレラ属、メタリジウム属、ワドリア属、シアノセイス属、セルロファーガ属、プロビデンシア属、ブラディリゾビウム属、アグロバクテリウム属、ムシラジニバクター(Mucilaginibacter)、セラチア属、ソランジウム属、ストレプトスポランジウム属、レニバクテリウム属、アエロモナス属、レイネケア属、クロモバクテリウム属、モリテラ属、ハリアンギウム属、カンギエラ属、マリノモナス属、ビブリオナレス属、リストネラ属、サリニビブリオ属、フォトバクテリウム属、アルテロモナダーレス属、レジオネラ属、テレディニバクター属、レイネケア属、ヒドロゲニビルガ属、及びシュードアルテロモナス属からなる群から選択される一つの属に由来するものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体を少なくとも1種含む、クリーニング組成物。
- 前記クリーニング組成物が洗剤組成物である、請求項10に記載のクリーニング組成物。
- 前記クリーニング組成物が、洗濯洗剤組成物、食器用洗剤組成物、又は硬質表面用クリーニング組成物である、請求項10又は11に記載のクリーニング組成物。
- 少なくとも1種の漂白剤、又はアシルトランスフェラーゼ、αアミラーゼ、βアミラーゼ、αガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、βガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1、4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エクソマンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、βグルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼ、追加のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種の追加の酵素を更に含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載のクリーニング組成物。
- 表面又は物品を、請求項1〜9のいずれか一項に記載のサーモリシン酵素変異体を少なくとも1種含むクリーニング組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。
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