JPH11501501A

JPH11501501A - バチルス由来の熱安定中性プロテアーゼの変異体

Info

Publication number: JPH11501501A
Application number: JP7516093A
Authority: JP
Inventors: 良和田中; 俊男三宅; 敏半澤; 正剛大江; 俊一城所; 洋一郎三木; きみ子遠藤; 昭充和田
Original assignee: 財団法人相模中央化学研究所; ホラントスゥイートナーカンパニーフェーオーエフ
Priority date: 1994-12-06
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 1999-02-09

Abstract

(57)【要約】配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有し、１５０位のアスパラギン酸残基がトリプトファンに置換されているサーモリシン様中性金属プロテアーゼの変異体である修飾プロテアーゼが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】バチルス由来の熱安定中性プロテアーゼの変異体発明の分野本発明は新規なサーモリシン様中性金属プロテアーゼおよびその利用、特にベンジルオキシカルボニル-α-Ｌ-アスパルチル-Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルの製造への利用に関する。サーモリシンは、市販され、多様な分野、例えば洗剤組成物、食品加工および化粧品処方において利用されている有用な酵素である。さらにこの酵素は人工甘味料であるアスパルテームの前駆体であるベンジルカルボニル-α-Ｌ-アスパルチル-Ｌ-フェニルアラニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと簡単に称する）の合成に利用されている。発明の背景サーモリシンはバチルス・サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteol yticus ）の培養液中で最初に発見され（Endo，S.（1962）J．Ferm．Tech.，40,3 46-353）、この酵素について数多くの研究が行なわれてきた。例えば、そのアミノ酸配列（Titani，K.，et al.，(1972)Nature New Biol.,238，35-37）およびこの酵素の三次元構造（Holmes，M.A．and Matthews，B.W.，(1982)J．Mol．Bio l．160，623-639）が明らかにされている。その間、プロテアーゼ遺伝子がバチルス・サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteolyticus）からクローン化され（EP-A-0418625）、そして上述の遺伝子の塩基配列から導かれる成熟酵素のアミノ酸配列は、Titaniにより示された最初の一次構造と二つの位置で異なることがわかった。即ち、成熟酵素の（アミノ末端から）第37番目のアミノ酸残基はアスパラギン酸ではなくアスパラギンであり、第119番目のアミノ酸残基はグルタミン酸ではなくグルタミンであると報告された。このアミノ酸配列は、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）からクローン化されたプロテアーゼ遺伝子の一つであるｎｐｒＭによってコードされたアミノ酸配列と同一であった（Kubo，M.，et al.，(1988)，Journal of General Micro biology 134，1883-1892）。従って、本明細書においては、このｎｐｒＭ遺伝子またはバチルス・サーモプロテオリチカスからの遺伝子によってコードされたプロテアーゼを「野性型サーモリシン様中性金属プロテアーゼ」と称する。サーモリシン様中性金属プロテアーゼの比活性および安定性の改変が報告されている（Kubo M.，et al.，(1992)Applied and Environmental Micro biology，58 ，3779-3783）。この文献においては、一次構造において１つ以上のアミノ酸残基、特に93位、110位、114位、115位、136位、137位、143位、151位、157位、 193位、211位、217位および221位で異なる多様な変異体が記載されている。だが、この文献では、その活性はカゼイン分解法のみによって測定されたものである。しかし、これら変異体はＺ−ＡＰＭの合成または分解に関しては実質的に向上した活性を示さなかった。カゼイン分解活性はＺ−ＡＰＭ合成活性とは関係ないことも現在（本出願人の以前の欧州特許出願No．93200773.5の実施例中にさらに記載されているように）立証されている：たとえカゼイン分解比活性が増加しても、Ｚ−ＡＰＭ合成活性が常に増加するわけではないと思われる。さらに、本出願人は、有用な新規プロテアーゼが、以下に示す配列番号１の（野性型）アミノ酸配列を持つサーモリシン様中性金属プロテアーゼの１つ以上特定の位置のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基から他のものへと置換することにより導くことのできることを先に見いだした。具体的には、本出願人は、第144番目（ロイシン）、第150番目（アスパラギン酸）、第187番目（グルタミン酸）および第227番目（アスパラギン）のアミノ酸残基の少なくとも１つをそれとは異なるアミノ酸で置換することによって野性型酵素から得られたそうした新規な変異体プロテアーゼの欧州特許（出願No．9320 0773.5）を既に出願している。この先に出願された特許（本出願の出願日ではまだ公開されていない）で述べられ、第１４４番目、第１５０番目、第１８７番目および第２２７番目のうちの１つの位置でアミノ酸置換を行った変異体酵素の比活性は、Ｚ−ＡＰＭの合成または分解において野性型酵素の比活性の２倍を超えるものではなかった。これらの観察に基づき、および当該酵素の比較的低い活性、縮合反応時の酵素の失活、そして長い反応時間および／または好適ではないｐＨ条件による生成物Ｚ−ＡＰＭと出発物質のＬ−またはＤ，Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ）の加水分解等、Ｚ−ＡＰＭの酵素的合成には種々の問題が存在するために、より高いＺ−ＡＰＭ合成活性を持つ改良酵素を開発する必要性がまだ存在する。勿論、ＰＭが本明細書中で言及される場合、その塩もＰＭの意味に含めることができる。発明の要約驚くべきことに、配列番号１の第１５０番目の位置にトリプトファン残基を持つ変異体酵素の活性の上昇は、これまでに述べた修飾プロテアーゼのものよりも非常に大きいことがわかった。これらの観察からこの発明は完成され、それにより、上記に示されたアミノ酸配列（配列番号１）を有するが、少なくともその第１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（野性型）からトリプトファンへと置換している変異体プロテアーゼを提供する。よって、それはバチルス・ステアロサーモフィラスに由来するサーモリシン様中性金属プロテアーゼのＺ−ＡＰＭ合成活性の更なる増強を提供する。したがって、本発明による変異体プロテアーゼは、Ｚ−ＡＰＭの大量生産に非常に有用である。図面の簡単な説明図１は、既知のプラスミドｐＭＫ４からｐＵＣＴＺ３７と名付けられた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図２は、プラスミドｐＭＫ４とプラスミドｐＵＣＴＺ３７からｐＵＣＴＺ４７と名付けられた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図３は、公知プラスミドｐＵＣＴＺ４７とプラスミドｐＵＢ１１０からｐＵＢＴＺ１と名付けた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図４は、プラスミドｐＵＢＴＺ１からｐＵＢＴＺ２と名付られた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図５は、プラスミドｐＵＢＴＺ２とポリメラーゼ連鎖反応によって得られた変異ＤＮＡ断片からｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ）と名付けられた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図６は、既知プラスミドｐＭＫ１からｐＵＣＴＺ５５と名付られた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図７は、プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃと名付られた組換えＭ１３ファージを構築するために用いられた方法を示す。図８は、プラスミドｐＵＢＴＺ２とＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ（Ｎ２２７Ｈ変異体）から組換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２２７Ｈ変異体）を構築するために用いられた方法を示す。図９は、プラスミドｐＵＢＴＺ２とポリメラーゼ連鎖反応によって得られた変異ＤＮＡ断片からｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）と名付けられた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図１０は、プラスミドｐＵＢＴＺ２とポリメラーゼ連鎖反応によって得られた変異ＤＮＡ断片からｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）と名付けられた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図１１は、プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）とプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）からｐＵＢＴＺ２（１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）と名付けられた組換えプラスミドを構築するために用いられた方法を示す。図１２は、変異体酵素のＺ−ＡＰＭ合成活性を示す。略号はアミノ酸の一文字コードを示している。１５０番目のアミノ酸残基における”Ｄ”は野性型サーモリシン様中性金属プロテアーゼを意味する。１秒間に１モルのＺ−ＡＰＭを合成する酵素活性を１ｋａｔａｌ（ｋａｔ）と定義する。図１３は、変異体酵素のＺ−ＡＰＭに対する加水分解活性を示す。発明の詳細な説明上述した以前の特許出願において、１５０番目の位置でアスパラギン酸からアスパラギン、ヒスチジン、リシンに置換した修飾プロテアーゼが開示された。これらの改良プロテアーゼのＺ−ＡＰＭ合成および加水分解に対する活性は、野性型サーモリシン様中性金属プロテアーゼのものよりもせいぜい２倍程度のものであった。本発明による新規な変異体プロテアーゼは、配列番号１のサーモリシン様中性金属プロテアーゼの第１５０番目の位置でアスパラギン酸残基の代わりにトリプトファン残基を有する誘導体である（以下、Ｄ１５０Ｗとも称する）。特に、これらの新規なプロテアーゼは、Ｚ−ＡＰＭ合成および／または分解において高く増強した活性を有している。得られたプロテアーゼの適用性は、最終的には用いるアッセイ試験によって決定することができる。典型的には、これはＺ−ＡＰＭの合成および／または分解のための活性を分析し、これらの活性を、同じ方法でアッセイ試験した野性型サーモリシン様中性金属プロテアーゼの活性と比較することによって決定した。この方法は実施例でさらに詳細に記載されている。この変異体プロテアーゼ（Ｄ１５０Ｗ）の他の位置のアミノ酸残基も他のアミノ酸残基に置換することができる。例えば、第１５０位でアスパラギン酸からトリプトファンに、そして第２２７位でアスパラギンからヒスチジンに置換した二重変異体（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）、そして第１４４残基でロイシンからセリンに、第１５０位でアスパラギン酸からトリプトファンに、そして第２２７位でアスパラギンからヒスチジンへ置換した三重変異体（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ− Ｎ２２７Ｈ）が合成され、これらはＺ−ＡＰＭ合成において非常に活性が高く安定であることが示された。変異体酵素は当業者にそれ自体公知の方法によって生産することができる。クローニングされたＤＮＡに変異を組み込むために用いることのできる多様な方法が知られている。例えば、変異ｎｐｒＭ遺伝子断片を、Ｍ１３ファージを利用した突然変異導入方法によって作成することができる（Vandeyar，M.，et al. ，(1988)Gene,65，129）。この方法で鋳型用に使用されるプラスミドとファージＤＮＡは、公知のプラスミドｐＭＫ１から得ることができる（Kubo，M．and Imanaka，T.，(1989)J．Bac teriol,171，4080-4082）。いくつかの制限酵素を用いて、ｎｐｒＭ遺伝子の断片を消化し、他のプラスミドまたはファージベクターにクローニングすることができる。変異導入用のプライマーは、置換されるアミノ酸残基を除けば、ｎｐｒＭ遺伝子を含む一本鎖鋳型ＤＮＡに対して相補的でなければならない。多様なヌクレオチド配列がこの目的のために考えられる。置換されるアミノ酸残基のために異なるコドンを持つこれらの変異導入用プライマーを用いることにより、どのような所望のアミノ酸置換も達成することができる。他の方法としては、化学合成したプライマーを使用して、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応）によってｎｐｒＭ遺伝子を変異させることができる（Higuchi，R .，Krummel，B.，and Saiki，R.K.,（1988）Nucleic Acids Res．16，7351-7367 ）。制限酵素認識部位が変異導入部位の近くに存在するときに、このＰＣＲ法は特に有用である。例えば、野性型サーモリシン様金属プロテアーゼの第１５０位のアスパラギン酸のコドン近くに制限酵素ＳｐｈＩの切断部位が存在するので、このＳｐｈＩ部位を含む変異導入用プライマーを、第１５０位に変異を作るために使用することができる。よって、変異導入用プライマーはセンスプライマーとして用いられる。逆方向プライマー（アンチセンス）として、例えば、ｎｐｒＭ遺伝子のＡａｔＩ切断部位の下流のｎｐｒＭ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを使用することができる。２つ以上の部位に変異導入を行なうために二つの方法を利用することができる。一つの方法は全ての標的部位で同時に変異導入を行なうことからなり、別の方法は最初の変異後に次の変異を導入することからなる。両方法では、複数の位置で変異を有するプラスミドが実際に与えられる。組換体サーモリシン様中性金属プロテアーゼの一般的な製造法は文献（Kubo， M．and Imanaka，T.，(1989)J．Bacteriol.，171，4080-4082）に記載されており、当該方法は、変異体サーモリシン様中性金属プロテアーゼをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養して変異体金属プロテアーゼを培地に蓄積させ、次に変異体酵素を培地から回収する工程からなる。しかしながら、この文献中で用いられるプラスミドｐＭＫ１は大きさが２０ｋｂを超えるため、該プラスミドで大腸菌を形質転換するには実質的に困難である。さらに、枯草菌においても、プラスミドｐＭＫ１は培養の後半期にかなりの程度まで脱落することがわかった。従って、そのような問題点を克服するために、本発明者らは、両方の宿主（大腸菌と枯草菌）を形質転換することができ、これらの宿主中でｎｐｒＭ遺伝子を発現することができるシャトルベクターを構築した。図１〜図４に示されているように、ｎｐｒＭ遺伝子を含む二つのシャトルベクター（ｐＵＢＴＺ１とｐＵＢＴＺ２）を構築した。これらはＨＢ１０１およびＪＭ１０３などの大腸菌株の形質転換に用いる場合、ｎｐｒＭ遺伝子がそれら株の中で発現する。さらに、これらのプラスミドによるＤＢ１０４、ＤＢ１１７およびＭＴ−２などの枯草菌株の形質転換は、ｎｐｒＭ遺伝子発現の成功をもたらした。また、培養の後半時の脱落は見られない。これらのシャトルベクターの使用の同様の結果や利点は、野性型遺伝子の代わりに変異体サーモリシン様中性金属プロテアーゼ遺伝子を使用しても得られる。変異体サーモリシン様中性金属プロテアーゼは、組換え体細菌中で産生させることができ、培養培地に分泌される。これらのプロテアーゼを硫酸アンモニウムによる沈殿で回収し、通常の方法、例えば疎水クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過により均一に精製する。この変異体プロテアーゼはアスパルテームの前駆体であるＺ−ＡＰＭを野性型サーモリシン様中性金属プロテアーゼよりも効率良く生産するために使用できる。このことは、これらの変異体プロテアーゼのＺ−ＡＰＭ分解活性およびＺ−ＡＰＭ合成活性を野性型プロテアーゼのものと比較することにより示される。これらの変異体プロテアーゼの活性は、野性型酵素や、上記欧州特許出願（出願番号 No．93200773.5）に記載の修飾プロテアーゼよりも非常に高いことがわかった。これらの活性の測定値は後の実施例に記載する。既に記載のように、本発明による新規な変異体プロテアーゼは、配列番号１のサーモリシン様中性金属プロテアーゼにおいて第１５０番目のアスパラギン酸残基がトリプトファンに置換されたプロテアーゼ（Ｄ１５０Ｗ）である。カゼインの分解活性は、Ｚ−ＡＰＭの合成活性または分解活性に対して関係がないことに注目すべきである。変異体酵素のカゼインおよびＺ−ＡＰＭに対する活性を比較すると、たとえカゼインの分解活性が低下しても、Ｚ−ＡＰＭの合成活性および／または分解活性を著しく高めることができることは明らかである。以下の実施例は、本発明を単に具体的に説明するためだけのものであり、本発明の範囲を決して限定するものではない。実施例１［第１５０番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からトリプトファンに置換した変異体プロテアーゼ（Ｄ１５０Ｗ）の合成］ａ）野性型ｎｐｒＭ遺伝子を含む発現プラスミドｐＵＢＴＺ２の構築プラスミドｐＭＫ４（Yamada et al.，(1991)Gene，99，109-114）から、ＢｃｌＩ消化で得られたｎｐｒＭ遺伝子の一部を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ９のＢａｍＨＩ部位にクローニンク化てプラスミドｐＵＣＴＺ３７を構築した（図１）。プラスミドｐＵＣＴＺ３７は、ｎｐｒＭ遺伝子の５’側末端領域を持っていない不完全なものである。プラスミドｐＵＣＴＺ３７は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＭＫ４の約１．２ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片を大きい方のｐＵＣＴＺ３７断片にクローン化してプラスミドｐＵＣＴＺ４７を構築した（図２）。この組換え体プラスミドｐＵＣＴＺ４７はｎｐｒＭの全ての配列およびその転写プロモーター配列を含む。図３に示されているように、大腸菌と枯草菌の間のシャトルベクターを構築するために、ｐＵＣＴＺ４７とｐＵＢ１１０の両方（Keggins,，K.M．et al.，Pro c．Natl．Ac．Sci．USA，(1978),75，1423-1427）をＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションしてプラスミドｐＵＢＴＺ１を構築した。最後に、図４に示されたように、プラスミドｐＵＢＴＺ１からＳｍａＩとＰｖｕＩＩの制限酵素部位間のＤＮＡ断片を除去することによりプラスミドｐＵＢＴＺ２を構築した。プラスミドｐＵＢＴＺ２は、ｎｐｒＭ遺伝子に制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩおよびＡａｔＩの認識部位を一ヶ所ずつ有する。ｂ）部位１５０のＴｒｐ変異導入この変異導入に利用したオリゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて合成した。その変異導入用プライマーのヌクレオチドの塩基配列を以下に示す。さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ逆方向プライマーを合成した。１ｎｇのプラスミドｐＵＢＴＺ２を、１００μｌのＰＣＲ反応混合物（６７ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、６．７ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭｄＡＴＰ、０．０５ｍＭｄＴＴＰ、０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．０５ｍＭｄＣＴＰ、１ μＭ変異導入用プライマー、１μＭ逆方向プライマー）に溶かして１ユニットのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを加えた。その溶液を一滴のミネラルオイルにより被覆した。９３℃１分間の変性、４５℃１分間のアニーリングおよび７２℃４５秒間の伸長を３０サイクル繰り返した。反応終了後、水層を回収し、フェノールで抽出し、エタノールで処理して、増幅されたＤＮＡを回収した。この増幅ＤＮＡの半量を含む２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）をＡａｔＩおよびＳｐｈＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、７０℃ で５分間インキュベートした。この変異ＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片をｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片（７．６ｋｂ）に宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた。このライゲーション混合物を用いて常法に従って大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ）を得た。置換されたアミノ酸は、このプラスミドのヌクレオチド配列の同定により確認した。ｃ）組換え枯草菌からの精製変異酵素の調製上述のプラスミドＤＮＡは迅速アルカリ−ＳＤＳ法によって抽出した（Maniat is，T.，Fritsch E.F.，Sambrook，Jr.,（1989）Molecular Cloning: a labora tory manual（2nd Ed.）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring H arbor，N.Y．USA．1.25-1.28）。枯草菌ＭＴ−２株の形質転換はコンピテントセル法によって行なった（Hardy，K.G.,（1985）in: Glover，D.M.，ed.，DNA Clo ning Volume II(1st ed.)，IRL Press Limited，Oxford，England，1-17）。このようにして得られた組換え枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ）の単一コロニーを、カナマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地５ｍｌに移し、３７℃にて一晩培養した。その培養液を、カナマイシン（５μｌ／ｍｌ）を含む５００ｍｌの２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）に移し、３７℃、２０時間培養した。培養液を８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、菌体を除去し、上澄に６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて４℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿を回収し、この沈殿を１０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ９．０、１０ｍＭＣａＣｌ₂）に溶解した。この溶液を２０ｍｌのブチルトヨパールにアプライした後、緩衝液Ａで１．５ｍｌ／分の流速で溶出した。活性画分を集め、６０％飽和硫安にして塩析した。析出物を１５，０００ｒｐｍにて３０分間遠心して集め、５ｍｌの緩衝液Ｂ（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．０、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂）に溶解した。さらに、その酵素溶液をゲル濾過カラム（ＴＳＫＧｅｌＧ２０００ＳＷ（２１．５×３００ｍｍ））にアプライし、緩衝液Ｂにより１ｍｌ／分の流速で溶出した。活性画分を集めて精製酵素を得た。図５に組換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ）を構築するために用いた方法を示す。実施例２［１５０番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からトリプトファンへ、２２７番目のアミノ酸残基をアスパラギンからヒスチジンに置換した２置換を有する変異体プロテアーゼ（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）の合成］サーモリシン様中性金属プロテアーゼのＤ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈの２部位変異体を以下の通り作製した。ａ）部位２２７のＨｉｓ変異導入バチルス・ステアロサーモフィラスＭＫ２３２（Kubo，M，and Imanaka，T.， (1989)J．Bacteriol.，171，4080-4082）に由来するサーモリシン様中性金属プロテアーゼ遺伝子ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ１の１μｇを、５ユニットの制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩによって２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス −塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）中で３７℃、２時間消化した。この試料を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、Bio-101 Gene Clean DNA精製キットを用いて精製した。これとは別に、１μｇのプラスミドｐＵＣ９を各５ユニットのＰｓｔＩとＢａｍＨＩによって、前述した２０μｌの同じ反応混合物中で３７℃、２時間の消化を行なった。ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を宝酒造のＤＮＡライゲーションキットを用いてｐＵＣ９のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結した。このライゲーション混合物を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組換えプラスミド（ｐＵＣＴＺ５５）を得た（図６）。１μｇの組換えプラスミドｐＵＣＴＺ５５を、各５ユニットの制限酵素ＳｐｈＩとＢｃｌＩによって２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）中で３７ ℃２時間消化した。その試料を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、Bio-101 Gene Clean DNA精製キットを用いて精製した。これとは別に、１μｇのファージベクターＭ１３ｍｐ１８を各５ユニットの制限酵素ＳｐｈＩとＢａｍＨＩによって、上述の同じ反応混合物２０μｌ中で３７ ℃２時間消化した。ｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を宝酒造のＤＮＡライゲーションキットを用いてＭ１３ｍｐ１８のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片と連結した。このライゲーション混合物を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を含む組換えファージ（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）を得た（図７）。一本鎖ＤＮＡをＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃから常法によって調製し、変異導入に供した。変異導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて合成した。２２７番目残基の置換（アスパラギンからヒスチジン）に用いられた変異導入用オリゴヌクレオチドを以下に示す。変異導入はＵＳＢ社製T7-GENinvitro mutagenesisキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定によって変異の確認を行なった。変異Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃの二本鎖ＤＮＡを常法によって調製し、この１μｇの二本鎖ＤＮＡを各５ユニットの制限酵素ＳｐｈＩとＡａｔＩによって２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）中で３７℃、２時間の消化を行い、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。約５５０ｂｐのＤＮＡ断片をＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ消化物から単離し、Bio-101 Gene Clean DNA精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＵＢＴＺ２は制限酵素ＳｐｈＩとＡａｔＩで消化し、７．６ｋｂ断片を単離した。ｎｐｒＭ遺伝子の変異を導入したＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片（約５５０ｂｐ）を、このようにして得られたｐＵＢＴＺ２ＳｐｈＩとＡａｔＩ断片に宝酒造ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。このライゲーション混合物を用いて組換え体プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２２７Ｈ）（図８）を得、大腸菌ＪＭ１０３を通常の方法で形質転換した。ｂ）部位１５０のＴｒｐ変異導入と変異体酵素（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）の調製プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２２７Ｈ）をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。配列番号２の変異導入用プライマーおよび配列番号３の逆方向プライマーを用いた。プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２２７Ｈ）の１ｎｇを１００μｌのＰＣＲ反応混合物（６７ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、６．７ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ２-メルカプトエタノール、０．０５ｍＭｄＡＴＰ、０．０５ｍＭｄＴＴＰ、０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．０５ｍＭｄＣＴＰ、１μＭ変異導入プライマー、１μＭ逆方向プライマー）に溶かして、１ユニットのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを加えた。その溶液をミネラルオイル一滴により被覆した。９３℃１分間の変性、４５℃１分間のアニーリングおよび７２℃４５秒間の伸長を３０サイクル繰り返した。反応後、水層を回収し、フェノールで抽出し、エタノールで処理して増幅されたＤＮＡを回収した（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）。この増幅ＤＮＡの半量を含む２０μｌの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）をＳｐｈＩとＡａｔＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、７０℃で５分間インキュベートした。この変異ＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片をｐＵＢＴＺ２の７．６ｋｂのＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片に宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた。このライゲーション混合物を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を得た。置換されたアミノ酸は、このプラスミドのヌクレオチド配列の決定により確認した。このプラスミドＤＮＡを用いて枯草菌ＭＴ−２を形質転換し、変異体酵素（１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を実施例１に記載の同じ方法によって調製した。図９に組換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を構築するために用いられた方法を示す。実施例３［１４４番目のアミノ酸残基をロイシンからセリン、１５０番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からトリプトファン、２２７番目のアミノ酸残基をアスパラギンからヒスチジンに置換した３置換を有する変異体酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）の合成］サーモリシン様中性金属プロテアーゼの三重変異体を以下のように構築した。ａ）部位１４４のＳｅｒ変異導入１４４位残基の置換（ロイシンからセリン）に用いられた変異導入用オリゴヌクレオチドを以下に示す。さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ逆方向プライマーを合成した。１ｎｇのプラスミドｐＵＢＴＺ２を１００μｌのＰＣＲ反応混合物（６７ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、６．７ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭｄＡＴＰ、０．０５ｍＭｄＴＴＰ、０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．０５ｍＭｄＣＴＰ、１ μＭ変異導入プライマー、１μＭセンスプライマー）に溶かして、１ユニットのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを加えた。その溶液をミネラルオイル一滴により被覆した。９３℃、１分間の変性、４５℃、１分間のアニーリングおよび７２℃、４５秒間の伸長を３０回繰り返した。反応後、水層を回収し、フェノールで抽出し、エタノールで処理して、増幅されたＤＮＡを回収した。この増幅ＤＮＡの半量を含む２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）をＢａｍＩおよびＳｐｈＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、７０℃で５分間インキュベートした。この変異導入ＢａｍＩ−ＳｐｈＩ断片をｐＵＢＴＺ２のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片（７．４ｋｂ）に宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた。このライゲーション混合物を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）を得た。置換アミノ酸は、このプラスミドのヌクレオチド配列の決定により確認した。図１０に組換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）を構築するために用いられた方法を示す。ｂ）プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）の構築実施例２で得られた１μｇのｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を含む２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）をＳｐｈＩとＡａｔＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、７０℃で５分間インキュベートした。この変異導入ＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片をｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）の７．６ｋｂＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片に宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた。このライゲーション混合物を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を得た。置換アミノ酸は、このプラスミドのヌクレオチド配列の決定により確認した。このプラスミドＤＮＡを用いて枯草菌ＭＴ−２の形質転換を行い、変異体酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を実施例１に記載の同じ方法によって調製した。図１１に組換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を構築するために用いられた方法を示す。実施例４［修飾プロテアーゼ活性の測定］（１）Ｚ−ＡＰＭの合成活性Ｚ−ＡＰＭの合成活性は、ベンジルオキシカルボニル-Ｌ-アスパラギン酸（Ｚ −Ａｓｐ）とＬ-フェニルアラニンメチルエステル塩化物（Ｌ−ＰＭ）の縮合反応後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。変異体酵素を０．１Ｍトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６または７）中で０．１ＭＺ−Ａｓｐと０．１ＭＬ−ＰＭとともに３５℃、３０分間インキュベートした。反応は等量の０．１２５ＭＥＤＴＡを添加することによって停止した。合成されたＺ −ＡＰＭの量はコスモシルＣ−１８カラム（ナカライテスク）を用いたＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣは溶出液として４０％アセトニトリルを含む６０ｍＭトリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用い、流速を１．０ｍｌ／分として行ない、溶出したＺ−ＡＰＭは２２４ｎｍの吸光度により定量した。１秒間に１モルのＺ−ＡＰＭを合成する活性値を１ｋａｔａｌ（ｋａｔ）と定義した。比較の目的のために、ランダム変異導入用プライマーを用いてほかのすべてのＤ１５０変異体も合成し、調べた。ランダム変異導入用プライマーの塩基配列は以下の通りである。（各ＸはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。）このプライマーは１５０位アミノ酸残基のコドンで変異を有し、この１５０位で２０種類のアミノ酸すべてを導入することができる。我々はこの変異導入用プライマーを用いて多様な変異を１５０番目の位置に導入し、トリプトファンを除く様々な変異体を調べた。１ｎｇのプラスミドｐＵＢＴＺ２を１００μｌのＰＣＲ反応混合物（６７ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、６．７ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭｄＡＴＰ、０．０５ｍＭｄＴＴＰ、０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．０５ｍＭｄＣＴＰ、１ μＭ変異導入プライマー、１μＭ逆方向プライマー）に溶かして、１ユニットのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを加えた。その溶液をミネラルオイル一滴により被覆した。９３℃、１分間の変性、４５℃、１分間のアニーリングおよび７２℃、４５秒間の伸長を３０回繰り返した。反応後、水層を回収し、フェノールで抽出し、エタノールで処理し、増幅されたＤＮＡを回収した。この増幅ＤＮＡの半量を含む２０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）をＳｐｈＩとＡａｔＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、７０℃で５分間インキュベートした。この変異導入ＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片をｐＵＢＴＺ２の７．６ｋｂのＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片に宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた。このライゲーション混合物を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２を得た。置換アミノ酸はこのプラスミドのヌクレオチド配列の決定により確認した。Ｄ１５０Ｗ変異体以外のプラスミドＤＮＡを迅速アルカリ−ＳＤＳ法により単離した。枯草菌ＭＴ−２株への形質転換はコンピテントセル法によって行なった。異なる各々の枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（変異）形質転換体の単一コロニーをカナマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含む５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃にて一晩インキュベートした。その培養液を、カナマイシン（５μｌ／ｍｌ）を含む２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）の５００ｍｌに移し、３７℃、２０時間インキュベートした。培養液を８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心して菌体を除去し、上澄に６０％飽和になるように硫安を加え、混合物を４℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿を回収し、これを１０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス− 塩酸ｐＨ９．０、１０ｍＭＣａＣｌ₂）に溶解した。この酵素溶液を２０ｍｌのブチルトヨパールにアプライし、緩衝液Ａで１．５ｍｌ／分の流速で溶出した。その活性画分を集め、６０％飽和硫安で塩析した。この析出物を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心して集め、５ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍＭＣａＣｌ₂）に溶解した。その酵素溶液をゲル濾過カラム（TSK Gel G2000SW（２１．５×３００ｍｍ））にアプライした後、緩衝液Ｂにより１ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性画分を集めて精製酵素を得た。１５０番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体酵素（Ｄ１５０変異体）の合成活性を図１２に示す。１５０位のアスパラギン酸残基がトリプトファンに置換された変異体（Ｄ１５０Ｗ）は顕著に高い比活性（すなわち野性型サーモリシン（Ｄ）よりも約４倍高い）を示している一方で、他のほとんどの変異体は野性型サーモリシン（Ｄ）よりも高い活性を示しているものの、これらの活性はＤ１５０Ｗよりはかなり低い。トリプトファン変異体は明らかに活性が最大である。表１に示されているように、さらに二つの多重変異体、つまり２重変異体Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ（１５０番目のアスパラギン酸をトリプトファンに置換し、２２７番目のアスパラギンをヒスチジンに置換したもの）や３重変異体Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ（１４４番目のロイシンをセリンに、１５０番目のアスパラギン酸をトリプトファンに、そして２２７番目のアスパラギンをヒスチジンに置換したもの）でも高い。（２）Ｚ−ＡＰＭの加水分解活性変異体酵素によるＺ−ＡＰＭのＺ−ＡｓｐとＰＭへの加水分解は井上の方法によって２２４ｎｍの吸光度の減少を追うことにより測定した（Inoue，K.，(1992 )，J．Biochem.112，335-340）。０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍＭのＺ−ＡＰＭを溶かした溶液３ｍｌを変異体酵素とともに３５℃でインキュベートし、２２４ｎｍの吸光度の減少をモニターした。加水分解されたＺ− ＡＰＭの量は、△ε２２４の吸光度の差が−４９３（Ｍ^-1・ｃｍ^-1）として求めた。Ｄ１５０変異体の活性を図１３に示す。Ｄ１５０Ｗ変異体は野性型サーモリシンに比べて約４倍の高活性を示した。他のほとんどの変異体酵素は野性型サーモリシン（Ｄ）と比較して約１〜３倍のＺ−ＡＰＭ分解活性しか示さなかった。トリプトファン変異体酵素は明らかに最も高い活性を示している。Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７ＨとＬ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈの活性も表１に示す。Ｚ−ＡＰＭの加水分解に対するそれらの活性は野性型酵素に比べて、それぞれ６〜７倍、９〜１０倍である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者半澤敏神奈川県海老名市今泉六丁目１番13−103 号 (72)発明者大江正剛神奈川県横浜市緑区たちばな台２−７−３ (72)発明者城所俊一神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者三木洋一郎新潟県長岡市下山三丁目2361−５ (72)発明者遠藤きみ子東京都町田市金森1733−10 (72)発明者和田昭充東京都港区赤坂八丁目11番４号

Claims

【特許請求の範囲】１．配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有し、１５０位のアスパラギン酸残基がトリプトファンに置換されているサーモリシン様中性金属プロテアーゼの修飾プロテアーゼ。２．２２７位のアスパラギン残基がヒスチジンに置換されている請求項１記載のサーモリシン様中性金属プロテアーゼの修飾プロテアーゼ。３．１４４位のロイシン残基をセリンに置換されている請求項１または２記載のサーモリシン様中性金属プロテアーゼの修飾プロテアーゼ。４．ベンジルオキシカルボニル-α-Ｌ-アスパルチル-Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルの分解または合成のための請求項１〜３いずれか一項記載の修飾プロテアーゼの利用。５．請求項１〜３いずれか一項の修飾プロテアーゼを、ベンジルオキシカルボニル-α-Ｌ-アスパラギン酸とＬ-またはＤ，Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルを含有する基質溶液と接触させることからなるベンジルオキシカルボニル-α- Ｌ-アスパルチル-L-フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。６．請求項１〜３いずれか一項の修飾プロテアーゼを、ベンジルオキシカルボニル-α-Ｌ-アスパルチル-Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルを含有する基質溶液と接触させることからなるベンジルオキシカルボニル-α-Ｌ-アスパルチル- Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルの分解方法。