JPH06181761A - 新規プロテアーゼ - Google Patents
新規プロテアーゼInfo
- Publication number
- JPH06181761A JPH06181761A JP5045387A JP4538793A JPH06181761A JP H06181761 A JPH06181761 A JP H06181761A JP 5045387 A JP5045387 A JP 5045387A JP 4538793 A JP4538793 A JP 4538793A JP H06181761 A JPH06181761 A JP H06181761A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- residue
- replaced
- amino acid
- enzyme
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】配列表１のアミノ酸配列を有するサーモライシ
ン様中性金属プロテアーゼにおいて、次の群（アミノ末
端から、１４４番目のロイシン残基、１５０番目のアス
パラギン酸残基、１８７番目のグルタミン酸残基）から
選ばれた少なくとも１種以上のアミノ酸残基が他のアミ
ノ酸残基に置換された新規プロテアーゼ。特に、上記の
新規プロテアーゼにおいて、アミノ末端から２２７番目
のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基に置換された新
規プロテアーゼが好ましい 【効果】本発明における変異体酵素は、Ｚ−ＡＰＭの分
解及びその合成に対して、野生型酵素に比べて有意にそ
の比活性が向上しており、種々の用途における本酵素の
利用に際し、反応効率の上昇や反応時間の短縮などの点
で優れた効果を発揮する可能性がある。
ン様中性金属プロテアーゼにおいて、次の群（アミノ末
端から、１４４番目のロイシン残基、１５０番目のアス
パラギン酸残基、１８７番目のグルタミン酸残基）から
選ばれた少なくとも１種以上のアミノ酸残基が他のアミ
ノ酸残基に置換された新規プロテアーゼ。特に、上記の
新規プロテアーゼにおいて、アミノ末端から２２７番目
のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基に置換された新
規プロテアーゼが好ましい 【効果】本発明における変異体酵素は、Ｚ−ＡＰＭの分
解及びその合成に対して、野生型酵素に比べて有意にそ
の比活性が向上しており、種々の用途における本酵素の
利用に際し、反応効率の上昇や反応時間の短縮などの点
で優れた効果を発揮する可能性がある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は、新規なサーモライシ
ン様中性金属−プロテアーゼ及びその用途、特にベンジ
ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルの合成への使用に関わるも
のである。
ン様中性金属−プロテアーゼ及びその用途、特にベンジ
ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルの合成への使用に関わるも
のである。
【０００２】サーモリシンは工業的に製造されている有
用な酵素であり、その用途は多分野に及ぶ。例えば、洗
剤、食品製造、化粧品等の分野にわたっている。更に、
人工甘味料の一種であるアスパルテームの前駆体である
ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと
略する）の合成等に使用される。
用な酵素であり、その用途は多分野に及ぶ。例えば、洗
剤、食品製造、化粧品等の分野にわたっている。更に、
人工甘味料の一種であるアスパルテームの前駆体である
ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと
略する）の合成等に使用される。
【０００３】
【従来の技術】サーモリシンは好熱菌の一種であるバチ
ルス・サーモプロテオリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の培養上清中
に見つけられた金属プロテアーゼであり（Ｊ． Ｆｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ．，４０，ｐ．３４６（１９６２）
参照）、これまで数多くの研究が行われてきた。たとえ
ば、アミノ酸配列表（Ｔｉｔａｎｉ Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３８，ｐ．
３５−３７（１９７２））や、当該酵素の三次元構造(
Ｈｏｌｍｅｓ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ
ｓ， Ｂ．Ｗ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０．，
ｐ．６２３−６３９（１９８２））が明らかにされてい
る。ところが最近、バチルス・サーモプロテオリチカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓ）よりプロテアーゼ遺伝子がクローン化され
（特開平３−２３２４９４）、その塩基配列から推測さ
れる成熟酵素のアミノ酸配列は、これまで推定されてい
た配列とは２つの位置で異なることがわかった。即ち成
熟酵素のアミノ末端から３７番目のアスパラギン酸の代
わりにアスパラギン及び１１９番目のグルタミン酸の代
わりにグルタミンとなっていることが報告された。とこ
ろがこの配列は以前、バチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｃｉｌｕｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）からクローン化されたプロテアーゼ遺伝子
の一つ（ｎｐｒＭ，微工研菌寄託 ９６４５号）と全く
同一であることがわかった（Ｋｕｂｏ Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３４，ｐ．１８８３−１８９２
（１９８８））。
ルス・サーモプロテオリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の培養上清中
に見つけられた金属プロテアーゼであり（Ｊ． Ｆｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ．，４０，ｐ．３４６（１９６２）
参照）、これまで数多くの研究が行われてきた。たとえ
ば、アミノ酸配列表（Ｔｉｔａｎｉ Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３８，ｐ．
３５−３７（１９７２））や、当該酵素の三次元構造(
Ｈｏｌｍｅｓ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ
ｓ， Ｂ．Ｗ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０．，
ｐ．６２３−６３９（１９８２））が明らかにされてい
る。ところが最近、バチルス・サーモプロテオリチカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓ）よりプロテアーゼ遺伝子がクローン化され
（特開平３−２３２４９４）、その塩基配列から推測さ
れる成熟酵素のアミノ酸配列は、これまで推定されてい
た配列とは２つの位置で異なることがわかった。即ち成
熟酵素のアミノ末端から３７番目のアスパラギン酸の代
わりにアスパラギン及び１１９番目のグルタミン酸の代
わりにグルタミンとなっていることが報告された。とこ
ろがこの配列は以前、バチルス・ステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｃｉｌｕｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）からクローン化されたプロテアーゼ遺伝子
の一つ（ｎｐｒＭ，微工研菌寄託 ９６４５号）と全く
同一であることがわかった（Ｋｕｂｏ Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３４，ｐ．１８８３−１８９２
（１９８８））。
【０００４】従って、以下、本明細書においてはこのｎ
ｐｒＭ遺伝子又はバチルス・サーモプロテオリチカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓ）に由来するプロテアーゼを「野生型サーモリ
シン様金属プロテアーゼ」と呼ぶ。
ｐｒＭ遺伝子又はバチルス・サーモプロテオリチカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓ）に由来するプロテアーゼを「野生型サーモリ
シン様金属プロテアーゼ」と呼ぶ。
【０００５】サーモリシン様中性金属−プロテアーゼの
活性及び安定性の変化については、最近報告された（Ｋ
ｕｂｏ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ
ｎ−ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５８，
ｐ．３７７９−３７８３（１９９２））。この文献にお
いては、１又はそれ以上のアミノ酸残基、特に、アミノ
末端から９３番目、１１０番目、１１４番目、１１５番
目、１３６番目、１３７番目、１４３番目、１５１番
目、１５７番目、１９３番目、２１１番目、２１７番目
及び２２１番目のアミノ酸残基が最初の構造と異なる種
々のミュータントが記載されている。しかしながら、こ
の文献中では、カゼインの分解活性しか測定されておら
ず、どの酵素においても、Ｚ−ＡＰＭの合成又はＺ−Ａ
ＰＭの分解に関する活性が実際に良くなったことは示さ
れていない。又、カゼインの分解活性はＺ−ＡＰＭの合
成活性とは関連しないことが明かとなった（詳細は、実
施例中で述べる。）： 例え、カゼイン分解比活性が増
加してもＺ−ＡＰＭ合成比活性がいつも増加するもので
ない。
活性及び安定性の変化については、最近報告された（Ｋ
ｕｂｏ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ
ｎ−ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５８，
ｐ．３７７９−３７８３（１９９２））。この文献にお
いては、１又はそれ以上のアミノ酸残基、特に、アミノ
末端から９３番目、１１０番目、１１４番目、１１５番
目、１３６番目、１３７番目、１４３番目、１５１番
目、１５７番目、１９３番目、２１１番目、２１７番目
及び２２１番目のアミノ酸残基が最初の構造と異なる種
々のミュータントが記載されている。しかしながら、こ
の文献中では、カゼインの分解活性しか測定されておら
ず、どの酵素においても、Ｚ−ＡＰＭの合成又はＺ−Ａ
ＰＭの分解に関する活性が実際に良くなったことは示さ
れていない。又、カゼインの分解活性はＺ−ＡＰＭの合
成活性とは関連しないことが明かとなった（詳細は、実
施例中で述べる。）： 例え、カゼイン分解比活性が増
加してもＺ−ＡＰＭ合成比活性がいつも増加するもので
ない。
【０００６】これらの知見と、当該酵素の活性が比較的
低いこと、縮合反応の間での酵素の失活及び長時間の反
応時間及び／又は好ましくないｐＨ条件による生成物Ｚ
−ＡＰＭと出発物質であるＬ−フェニルアラニンメチル
エステル（ＰＭ）の加水分解の様な種々の問題点によ
り、Ｚ−ＡＰＭの合成活性が元の野生型サーモライシン
よりも高い改良酵素を開発する必要がある。
低いこと、縮合反応の間での酵素の失活及び長時間の反
応時間及び／又は好ましくないｐＨ条件による生成物Ｚ
−ＡＰＭと出発物質であるＬ−フェニルアラニンメチル
エステル（ＰＭ）の加水分解の様な種々の問題点によ
り、Ｚ−ＡＰＭの合成活性が元の野生型サーモライシン
よりも高い改良酵素を開発する必要がある。
【０００７】なお、本願明細書中では、ＰＭと言う語中
にはＰＭの塩も含まれる。
にはＰＭの塩も含まれる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本願発明の目的は上記
課題を解決することにある。
課題を解決することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】優れた特性を有する酵素
は、種々の位置からある特定の位置にある適当な置換基
を選択することにより得られることが明らかとなった。
すなわち、アミノ酸配列１を有する当該サーモライシン
様中性金属プロテアーゼから配列の特定の位置の１又は
それ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する
ことにより得られる。特に、本発明の新規なプロテアー
ゼは以下のアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ
酸残基に置換することにより得られる。：１４４番目の
ロイシン基、１５０番目のアスパラギン酸基、１８７番
目のグルタミン酸基及び２２７番目のアスパラギン基の
アミノ酸残基（但し、２２７番目のアスパラギン基の
み、他のアミノ酸残基に置換されている新規なプロテア
ーゼは除く。）。
は、種々の位置からある特定の位置にある適当な置換基
を選択することにより得られることが明らかとなった。
すなわち、アミノ酸配列１を有する当該サーモライシン
様中性金属プロテアーゼから配列の特定の位置の１又は
それ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する
ことにより得られる。特に、本発明の新規なプロテアー
ゼは以下のアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ
酸残基に置換することにより得られる。：１４４番目の
ロイシン基、１５０番目のアスパラギン酸基、１８７番
目のグルタミン酸基及び２２７番目のアスパラギン基の
アミノ酸残基（但し、２２７番目のアスパラギン基の
み、他のアミノ酸残基に置換されている新規なプロテア
ーゼは除く。）。
【００１０】特に、これらの酵素はＺ−ＡＰＭの合成ま
たはＺ−ＡＰＭの分解に対して、野生型酵素よりも高い
活性を示す。このことにより、バチルス・ステアロサー
モフィラス（Ｂａｃｉｌｕｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のサーモライシン様中性金属
プロテアーゼのＺ−ＡＰＭの合成の活性を高めるという
課題を解決する。更に、これらの酵素は低いｐＨで活性
が高く、このことによりＺ−ＡＰＭの合成の間のＺ−Ａ
ＰＭ及びＰＭの加水分解が起こりにくくなる。上記の特
定の位置を２つ以上置換することにより得られる酵素も
当然、本特許の範囲に入ることを断っておく。又、上記
の特定の位置の少なくとも１つアミノ酸残基を他のアミ
ノ酸残基に置換し、更に他の位置の少なくとも１つのア
ミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した酵素も本特許
の範囲に入る。
たはＺ−ＡＰＭの分解に対して、野生型酵素よりも高い
活性を示す。このことにより、バチルス・ステアロサー
モフィラス（Ｂａｃｉｌｕｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のサーモライシン様中性金属
プロテアーゼのＺ−ＡＰＭの合成の活性を高めるという
課題を解決する。更に、これらの酵素は低いｐＨで活性
が高く、このことによりＺ−ＡＰＭの合成の間のＺ−Ａ
ＰＭ及びＰＭの加水分解が起こりにくくなる。上記の特
定の位置を２つ以上置換することにより得られる酵素も
当然、本特許の範囲に入ることを断っておく。又、上記
の特定の位置の少なくとも１つアミノ酸残基を他のアミ
ノ酸残基に置換し、更に他の位置の少なくとも１つのア
ミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した酵素も本特許
の範囲に入る。
【００１１】
【作用】本発明に記載されている新規プロテアーゼは、
野生型サーモライシン様中性金属プロテアーゼのアミノ
酸配列とは異なる変更されたアミノ酸配列を有する由来
物である。特に、その新規プロテアーゼはＺ−ＡＰＭの
合成及び／又は分解に対して高い活性を有している。代
表的には、このことは、Ｚ−ＡＰＭの合成及び／又は分
解に対する活性を分析し、同じ方法で分析した野生型サ
ーモライシン様中性金属プロテアーゼの活性とを比較す
ることにより決定される。この方法は実施例において、
詳細に記載されている。
野生型サーモライシン様中性金属プロテアーゼのアミノ
酸配列とは異なる変更されたアミノ酸配列を有する由来
物である。特に、その新規プロテアーゼはＺ−ＡＰＭの
合成及び／又は分解に対して高い活性を有している。代
表的には、このことは、Ｚ−ＡＰＭの合成及び／又は分
解に対する活性を分析し、同じ方法で分析した野生型サ
ーモライシン様中性金属プロテアーゼの活性とを比較す
ることにより決定される。この方法は実施例において、
詳細に記載されている。
【００１２】変更された酵素は、それ自体当業者には公
知の方法により製造することが可能である。
知の方法により製造することが可能である。
【００１３】本発明の新規プロテアーゼを製造するのに
好ましい方法は、遺伝子組換方法により野生型サーモラ
イシン様中性金属プロテアーゼの１４４番目、１５０番
目、１８７番目及び２２７番目の内少なくとも１つの予
め決められた位置に他のアミノ酸残基を導入する方法で
ある（但し、２２７番目のアスパラギン基のみ、他のア
ミノ酸残基を導入する場合は除く。）。その得られたプ
ロテアーゼの性能は、本来の適用に於ける分析により決
定することが出来る。クローン化された遺伝子にアミノ
酸置換の導入する方法としては、種々の方法が知られて
いる。例えば、ｎｐｒＭ遺伝子の断片のミュータント
は、Ｍ１３ファ−ジ変異生成方法（Ｖａｎｄｅｙａｒ
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ． ６５，
ｐ．１２９（１９８８））を使用することにより製造さ
れる。
好ましい方法は、遺伝子組換方法により野生型サーモラ
イシン様中性金属プロテアーゼの１４４番目、１５０番
目、１８７番目及び２２７番目の内少なくとも１つの予
め決められた位置に他のアミノ酸残基を導入する方法で
ある（但し、２２７番目のアスパラギン基のみ、他のア
ミノ酸残基を導入する場合は除く。）。その得られたプ
ロテアーゼの性能は、本来の適用に於ける分析により決
定することが出来る。クローン化された遺伝子にアミノ
酸置換の導入する方法としては、種々の方法が知られて
いる。例えば、ｎｐｒＭ遺伝子の断片のミュータント
は、Ｍ１３ファ−ジ変異生成方法（Ｖａｎｄｅｙａｒ
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ． ６５，
ｐ．１２９（１９８８））を使用することにより製造さ
れる。
【００１４】本発明において、塩基配列の鋳型として使
用されるプラスミドＤＮＡ及びファージＤＮＡは公知の
プラスミドｐＭＫ１（Ｋｕｂｏ Ｍ． ａｎｄ Ｉｍａ
ｎａｋａ Ｔ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， Ｖｏ
ｌ． １７１， ｐ．４０８０〜４０８２， １９８
９）から作り出すことができる。幾つかの制限酵素がｎ
ｐｒＭ遺伝子の断片の消化と他のプラスミド又はファー
ジベクトルへのクローニングに使用される。
用されるプラスミドＤＮＡ及びファージＤＮＡは公知の
プラスミドｐＭＫ１（Ｋｕｂｏ Ｍ． ａｎｄ Ｉｍａ
ｎａｋａ Ｔ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， Ｖｏ
ｌ． １７１， ｐ．４０８０〜４０８２， １９８
９）から作り出すことができる。幾つかの制限酵素がｎ
ｐｒＭ遺伝子の断片の消化と他のプラスミド又はファー
ジベクトルへのクローニングに使用される。
【００１５】変異導入プライマーは、置換アミノ酸残基
のコドン以外は、ｎｐｒＭ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ鋳
型と相補正がなければならない。種々のヌクレオチドが
この目的に使用出来る。置換アミノ酸残基の為の種々の
コドンを有する変異導入プライマーを使用することによ
り、任意の所望するアミノ酸残基の置換が可能となる。
のコドン以外は、ｎｐｒＭ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ鋳
型と相補正がなければならない。種々のヌクレオチドが
この目的に使用出来る。置換アミノ酸残基の為の種々の
コドンを有する変異導入プライマーを使用することによ
り、任意の所望するアミノ酸残基の置換が可能となる。
【００１６】別に、ｎｐｒＭ遺伝子は化学的に合成され
たプライマー（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．， Ｋｒｕｍｍｅ
ｌ， Ｂ．， ａｎｄ Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ．，
（１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１６， ７３５１−７３６７）を使用するＰＣＲ技術
（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）により変異を導入することが出来る。酵素の制限位
置が変異導入位置の近傍に存在する時にこの方法は特に
適している。例えば、野生型サーモライシン様中性金属
プロテアーゼの１５０番目の位置でのアスパラギン酸に
対するコドンの近傍に制限酵素ＳｐｈＩの切断部位が存
在する為に、このＳｐｈＩ位置を含む変異プライマーは
１５０番目の位置での変異導入に使用することが出来
る。この様にして変異プライマーはセンスプライマーと
して使用される。逆方向プライマー（アンチセンスプラ
イマー）として、ｎｐｒＭ遺伝子のＡａｔＩ切断部位か
ら下方のｎｐｒＭ遺伝子と相補性のあるオリゴヌクレオ
チドが製造できる。
たプライマー（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．， Ｋｒｕｍｍｅ
ｌ， Ｂ．， ａｎｄ Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ．，
（１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１６， ７３５１−７３６７）を使用するＰＣＲ技術
（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）により変異を導入することが出来る。酵素の制限位
置が変異導入位置の近傍に存在する時にこの方法は特に
適している。例えば、野生型サーモライシン様中性金属
プロテアーゼの１５０番目の位置でのアスパラギン酸に
対するコドンの近傍に制限酵素ＳｐｈＩの切断部位が存
在する為に、このＳｐｈＩ位置を含む変異プライマーは
１５０番目の位置での変異導入に使用することが出来
る。この様にして変異プライマーはセンスプライマーと
して使用される。逆方向プライマー（アンチセンスプラ
イマー）として、ｎｐｒＭ遺伝子のＡａｔＩ切断部位か
ら下方のｎｐｒＭ遺伝子と相補性のあるオリゴヌクレオ
チドが製造できる。
【００１７】一つ以上位置に変異を導入する方法には二
つの方法が使用できる。一つの方法は同時に全ての位置
に変異を導入する方法であり、別の方法は最初に変異を
導入した後に次の位置に変異を導入する方法である。両
方の方法では、１つ以上の位置に変異が導入されたプラ
スミドが実際に得られる。
つの方法が使用できる。一つの方法は同時に全ての位置
に変異を導入する方法であり、別の方法は最初に変異を
導入した後に次の位置に変異を導入する方法である。両
方の方法では、１つ以上の位置に変異が導入されたプラ
スミドが実際に得られる。
【００１８】一般的な組換体サーモライシン様中性金属
プロテアーゼの製造法は公知文献（Ｋｕｂｏ， Ｍ．
ａｎｄ Ｉｍａｎａｋａ， Ｔ．， （１９８９）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ４０８０−４
０８２）に記載されており、以下の工程を含んでい
る。：修飾サーモライシン様中性金属プロテアーゼを記
録されたＤＮＡを展開ベクターに挿入し、宿主細胞に形
質転換する為にベクターを使用し、修飾金属プロテアー
ゼが培地で蓄積し、修飾酵素が培地から取り出される迄
その形質転換体を培養する。しかしながら、この文献中
で使用されているプラスミドｐＭＫ１は２０ｋｂ以上の
大きさであり、従ってそのプラスミドを大腸菌に形質転
換するのは実質的に困難である。さらに、枯草菌におい
てもプラスミドｐＭＫ１は培養の後半時にかなりの部分
が脱落することが明かとなった。
プロテアーゼの製造法は公知文献（Ｋｕｂｏ， Ｍ．
ａｎｄ Ｉｍａｎａｋａ， Ｔ．， （１９８９）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ４０８０−４
０８２）に記載されており、以下の工程を含んでい
る。：修飾サーモライシン様中性金属プロテアーゼを記
録されたＤＮＡを展開ベクターに挿入し、宿主細胞に形
質転換する為にベクターを使用し、修飾金属プロテアー
ゼが培地で蓄積し、修飾酵素が培地から取り出される迄
その形質転換体を培養する。しかしながら、この文献中
で使用されているプラスミドｐＭＫ１は２０ｋｂ以上の
大きさであり、従ってそのプラスミドを大腸菌に形質転
換するのは実質的に困難である。さらに、枯草菌におい
てもプラスミドｐＭＫ１は培養の後半時にかなりの部分
が脱落することが明かとなった。
【００１９】従って、この様な問題点を克服する為に、
両方の宿主、大腸菌と枯草菌を形質転換することが出
来、それらの宿主にｎｐｒＭ遺伝子を発現することが出
来るシャトルベクターを本発明者は組み立てられた。図
１〜図４に示された様に、ｎｐｒＭ遺伝子を含む二つの
シャトルベクターが組み立てられた（ｐＵＢＴＺ１及び
ｐＵＢＴＺ２）。これらのシャトルベクターは大腸菌Ｈ
Ｂ１０１及びＪＭ１０３株を形質転換するのに使用する
時、ｎｐｒＭ遺伝子がその株の中で発現する。付け加え
て、ＤＢ１０４，ＤＢ１１７及びＭＴ−２の枯草菌株の
形質転換は、効率の良いｎｐｒＭ遺伝子発現をもたら
す。又、培養の後半時の脱落は見られない。これらのシ
ャトルベクターの使用による同様の結果や利点は、野生
型遺伝子の代わりにサーモライシン様中性金属プロテア
ーゼのアミノ酸置換体を使用すると得られる。
両方の宿主、大腸菌と枯草菌を形質転換することが出
来、それらの宿主にｎｐｒＭ遺伝子を発現することが出
来るシャトルベクターを本発明者は組み立てられた。図
１〜図４に示された様に、ｎｐｒＭ遺伝子を含む二つの
シャトルベクターが組み立てられた（ｐＵＢＴＺ１及び
ｐＵＢＴＺ２）。これらのシャトルベクターは大腸菌Ｈ
Ｂ１０１及びＪＭ１０３株を形質転換するのに使用する
時、ｎｐｒＭ遺伝子がその株の中で発現する。付け加え
て、ＤＢ１０４，ＤＢ１１７及びＭＴ−２の枯草菌株の
形質転換は、効率の良いｎｐｒＭ遺伝子発現をもたら
す。又、培養の後半時の脱落は見られない。これらのシ
ャトルベクターの使用による同様の結果や利点は、野生
型遺伝子の代わりにサーモライシン様中性金属プロテア
ーゼのアミノ酸置換体を使用すると得られる。
【００２０】サーモライシン様中性金属プロテアーゼの
アミノ酸置換体は組換体バクテリア中で製造することが
出来、培養溶媒中に分泌される。これらのプロテアーゼ
は硫酸アンモニウム添加による沈殿化により回収され、
通常の方法、例えば疎水クロマトグラフィー及び／又は
ゲル濾過により精製される。
アミノ酸置換体は組換体バクテリア中で製造することが
出来、培養溶媒中に分泌される。これらのプロテアーゼ
は硫酸アンモニウム添加による沈殿化により回収され、
通常の方法、例えば疎水クロマトグラフィー及び／又は
ゲル濾過により精製される。
【００２１】新規プロテアーゼはアスパルテームの前駆
体であるＺ−ＡＰＭを野生型サーモリシン様中性金属プ
ロテアーゼよりも効率良く製造するのに使用される。こ
のことは、これらの新規プロテアーゼのカゼイン分解活
性、Ｚ−ＡＰＭ分解活性及びＺ−ＡＰＭ合成活性を野生
型プロテアーゼのそれらの活性とを比較することにより
示される。それらの新規プロテアーゼの活性は、野生型
プロテアーゼの活性よりも非常に高いことが明らかとな
った。これらの活性の測定値は後の実施例に記載され
る。
体であるＺ−ＡＰＭを野生型サーモリシン様中性金属プ
ロテアーゼよりも効率良く製造するのに使用される。こ
のことは、これらの新規プロテアーゼのカゼイン分解活
性、Ｚ−ＡＰＭ分解活性及びＺ−ＡＰＭ合成活性を野生
型プロテアーゼのそれらの活性とを比較することにより
示される。それらの新規プロテアーゼの活性は、野生型
プロテアーゼの活性よりも非常に高いことが明らかとな
った。これらの活性の測定値は後の実施例に記載され
る。
【００２２】本発明においては、サーモライシン様中性
金属プロテアーゼにおいて、アミノ末端アミノ酸から１
４４番目、１５０番目、１８７番目及び２２７番目の位
置がＺ−ＡＰＭ分解及びＺ−ＡＰＭ合成に対する活性を
高める大きな効果があり、特にこれらの位置の２つ又は
３つの位置が重なるとさらに大きな効果があることが明
らかとなった。
金属プロテアーゼにおいて、アミノ末端アミノ酸から１
４４番目、１５０番目、１８７番目及び２２７番目の位
置がＺ−ＡＰＭ分解及びＺ−ＡＰＭ合成に対する活性を
高める大きな効果があり、特にこれらの位置の２つ又は
３つの位置が重なるとさらに大きな効果があることが明
らかとなった。
【００２３】カゼインの分解活性は、Ｚ−ＡＰＭの合成
活性又はＺ−ＡＰＭの分解活性に対して関係がないこと
に注目すべきである。ミュータント酵素のカゼイン及び
Ｚ−ＡＰＭに対する活性を比較すると、例えカゼインの
分解活性が低下しても、Ｚ−ＡＰＭの合成活性及び又は
分解活性を著しく高められることは明らかである。以下
の実施例は、本発明を単に具体化するものであり、本発
明の範囲をけっして制限するものではない。
活性又はＺ−ＡＰＭの分解活性に対して関係がないこと
に注目すべきである。ミュータント酵素のカゼイン及び
Ｚ−ＡＰＭに対する活性を比較すると、例えカゼインの
分解活性が低下しても、Ｚ−ＡＰＭの合成活性及び又は
分解活性を著しく高められることは明らかである。以下
の実施例は、本発明を単に具体化するものであり、本発
明の範囲をけっして制限するものではない。
【００２４】
【実施例】実施例 １ （アミノ末端から１８７番目のアミノ酸残基でのアミノ
酸置換を有するサーモライシン様中性金属プロテア−ゼ
のアミノ酸置換体の合成）バチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）ＭＫ２３２株由来のサ−モリシン様金属
プロテア−ゼ遺伝子ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ１
の１μｇを２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に
於いて、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩの各５ユニットによ
り３７℃で２時間分解させた。このサンプルから１％ア
ガロースゲル電気泳動で約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分
離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キット
を用いて精製した。
酸置換を有するサーモライシン様中性金属プロテア−ゼ
のアミノ酸置換体の合成）バチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）ＭＫ２３２株由来のサ−モリシン様金属
プロテア−ゼ遺伝子ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ１
の１μｇを２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に
於いて、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩの各５ユニットによ
り３７℃で２時間分解させた。このサンプルから１％ア
ガロースゲル電気泳動で約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分
離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キット
を用いて精製した。
【００２５】一方、プラスミドベクターｐＵＣ９の１μ
ｇを含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に
於いて、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニットにより
３７℃で２時間分解させた。
ｇを含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に
於いて、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニットにより
３７℃で２時間分解させた。
【００２６】このようにして得られたｐＭＫ１のｎｐｒ
Ｍ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片を含む組換体ファ−ジ（ｐＵＣＴＺ５５）
を得た（図５）。
Ｍ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片を含む組換体ファ−ジ（ｐＵＣＴＺ５５）
を得た（図５）。
【００２７】図６に示すプラスミドｐＵＣＴＺ５５から
Ｍ１３ファ−ジＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する工程を
以下に説明する。
Ｍ１３ファ−ジＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する工程を
以下に説明する。
【００２８】組換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５の１μｇ
を、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス−
塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム １０
０ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及
びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時間分解
させた。このサンプルから１％アガロースゲル電気泳動
で約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社
ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
を、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス−
塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム １０
０ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及
びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時間分解
させた。このサンプルから１％アガロースゲル電気泳動
で約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社
ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
【００２９】一方、ファージベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８の
１μｇを、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム１００ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、Ｓｐ
ｈＩ及びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時
間分解させた。
１μｇを、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム１００ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、Ｓｐ
ｈＩ及びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時
間分解させた。
【００３０】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＳｐｈＩ
−ＢｃｌＩの分解物とを宝酒造社製ＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて連結反応を行なった。この反応混合物
を、通常の方法で、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎ
ｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を含む組換体フ
ァ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）を得た（図６）。
ＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＳｐｈＩ
−ＢｃｌＩの分解物とを宝酒造社製ＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて連結反応を行なった。この反応混合物
を、通常の方法で、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎ
ｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を含む組換体フ
ァ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）を得た（図６）。
【００３１】得られた組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ
−Ｂｃ）から、通常の方法で、１本鎖ＤＮＡを調製し、
アミノ酸置換の導入に用いた。アミノ酸置換の導入に用
いたオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ
社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて作製した。
−Ｂｃ）から、通常の方法で、１本鎖ＤＮＡを調製し、
アミノ酸置換の導入に用いた。アミノ酸置換の導入に用
いたオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ
社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて作製した。
【００３２】１８７番目残基の変換（グルタミン酸から
グルタミンへの変換）に使用されたアミノ酸置換導入用
オリゴヌクレオチドを以下に示した。
グルタミンへの変換）に使用されたアミノ酸置換導入用
オリゴヌクレオチドを以下に示した。
【００３３】 ５´−ＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＧ−３´ Ｇｌｎ １８７ アミノ酸置換の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビ
トロミュータゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配
列決定によってアミノ酸置換の導入を確認した。
トロミュータゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配
列決定によってアミノ酸置換の導入を確認した。
【００３４】アミノ酸置換を導入したＭ１３ＴＺＳｐ−
Ｂｃ及びｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを通常の方法に
より調製し、その二本鎖ＤＮＡの１μｇを、２０μリッ
トルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５ １
０ｍＭ 塩化マグネシウム１００ｍＭ 食塩１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及びＡａｔＩを各５ユニット
により３７℃で２時間反応させ、一部を切り取り、この
サンプルを１％アガロ−スゲルで電気泳動した。約５５
０ｂｐのＤＮＡ断片をＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ分解物から
分離し、そのＤＮＡ断片をバイオ−１０１遺伝子ＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。
Ｂｃ及びｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを通常の方法に
より調製し、その二本鎖ＤＮＡの１μｇを、２０μリッ
トルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５ １
０ｍＭ 塩化マグネシウム１００ｍＭ 食塩１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及びＡａｔＩを各５ユニット
により３７℃で２時間反応させ、一部を切り取り、この
サンプルを１％アガロ−スゲルで電気泳動した。約５５
０ｂｐのＤＮＡ断片をＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ分解物から
分離し、そのＤＮＡ断片をバイオ−１０１遺伝子ＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。
【００３５】同時に、枯草菌体中での発現の為のベクタ
ー断片を以下に記載した方法製造した。プラスミドｐＭ
Ｋ４（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｇ
ｅｎｅ， ９９， １０９−１１４）から、ｎｐｒＭ遺
伝子の一部を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＢｃｌＩ
で分解し、プラスミド ｐＵＣＴＺ３７を組み立てる為
に、プラスミドｐＵＣ９のＢａｍＨＩ位置にクローン化
した（図１）。
ー断片を以下に記載した方法製造した。プラスミドｐＭ
Ｋ４（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｇ
ｅｎｅ， ９９， １０９−１１４）から、ｎｐｒＭ遺
伝子の一部を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＢｃｌＩ
で分解し、プラスミド ｐＵＣＴＺ３７を組み立てる為
に、プラスミドｐＵＣ９のＢａｍＨＩ位置にクローン化
した（図１）。
【００３６】プラスミドｐＵＣＴＺ３７はｎｐｒＭ遺伝
子の５´末端領域を有さない不完全なプラスミドであ
る。プラスミドｐＵＣＴＺ３７は制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで分解し、その大きな断片と、プラスミドｐＭＫ４か
らＨｉｎｄＩＩＩ消化により得られた約１．２ｋｂ断片
とを連結し、プラスミドｐＵＣＴＺ４７を作製した（図
２）。この組換体プラスミドｐＵＣＴＺ４７はｎｐｒＭ
の全ての配列及び転写プロモーター配列を含む。
子の５´末端領域を有さない不完全なプラスミドであ
る。プラスミドｐＵＣＴＺ３７は制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで分解し、その大きな断片と、プラスミドｐＭＫ４か
らＨｉｎｄＩＩＩ消化により得られた約１．２ｋｂ断片
とを連結し、プラスミドｐＵＣＴＺ４７を作製した（図
２）。この組換体プラスミドｐＵＣＴＺ４７はｎｐｒＭ
の全ての配列及び転写プロモーター配列を含む。
【００３７】図３に示された様に、大腸菌と枯草菌との
間のシャトルベクターを組み立てる為に、ｐＵＣＴＺ４
７とｐＵＢ１１０（Ｌａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９
７４）をＥｃｏＲＩにより消化し、プラスミドｐＵＢＴ
Ｚ１を組み立てる為にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
ライゲーションを実施した。
間のシャトルベクターを組み立てる為に、ｐＵＣＴＺ４
７とｐＵＢ１１０（Ｌａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９
７４）をＥｃｏＲＩにより消化し、プラスミドｐＵＢＴ
Ｚ１を組み立てる為にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
ライゲーションを実施した。
【００３８】最終的に、図４に示された様に、プラスミ
ドｐＵＢＴＺ１から制限酵素ＳｍａＩとＰｖｕＩＩとの
間のＤＮＡ断片を除去することによりプラスミドｐＵＢ
ＴＺ２を作製した。プラスミドｐＵＢＴＺ２はｎｐｒＭ
遺伝子領域に制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ及びＡａｔ
Ｉの切断部位を一ケ所づつを有する。野生型遺伝子から
変異型遺伝子への変換は以下の様に実施した。
ドｐＵＢＴＺ１から制限酵素ＳｍａＩとＰｖｕＩＩとの
間のＤＮＡ断片を除去することによりプラスミドｐＵＢ
ＴＺ２を作製した。プラスミドｐＵＢＴＺ２はｎｐｒＭ
遺伝子領域に制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ及びＡａｔ
Ｉの切断部位を一ケ所づつを有する。野生型遺伝子から
変異型遺伝子への変換は以下の様に実施した。
【００３９】プラスミドｐＵＢＴＺ２はＳｐｈＩ及びＡ
ａｔＩで消化し、７．６ｋｂの断片を単離した。この様
にして得られたｐＵＢＴＺ２とｎｐｒＭ遺伝子のアミノ
酸置換を導入したＳｐｈＩ及びＡａｔＩ断片（約５５０
ｋｂ）とを宝酒造ＤＮＡライゲーションキットにより、
ライゲーションした。このライゲーション混合物はＪＭ
１０３大腸菌を通常の方法により組換体プラスミド（Ｅ
１８７Ｑ）を得ることに使用される（図７）。
ａｔＩで消化し、７．６ｋｂの断片を単離した。この様
にして得られたｐＵＢＴＺ２とｎｐｒＭ遺伝子のアミノ
酸置換を導入したＳｐｈＩ及びＡａｔＩ断片（約５５０
ｋｂ）とを宝酒造ＤＮＡライゲーションキットにより、
ライゲーションした。このライゲーション混合物はＪＭ
１０３大腸菌を通常の方法により組換体プラスミド（Ｅ
１８７Ｑ）を得ることに使用される（図７）。
【００４０】組換体プラスミドｐＵＢＴＺ２（アミノ酸
置換体）は通常の方法で、枯草菌ＭＴ−２株に形質転換
された。その細胞液を１％カゼイン、５μｇ／ミリリッ
トルのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７
℃にて一夜培養した。最終的に、ハロ−形成コロニ−を
単離することにより、組換体プラスミドｐＵＢＴＺ２
（アミノ酸置換体）を得た。
置換体）は通常の方法で、枯草菌ＭＴ−２株に形質転換
された。その細胞液を１％カゼイン、５μｇ／ミリリッ
トルのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７
℃にて一夜培養した。最終的に、ハロ−形成コロニ−を
単離することにより、組換体プラスミドｐＵＢＴＺ２
（アミノ酸置換体）を得た。
【００４１】組み換え枯草菌ＭＴ−２株／ｐＵＢＴＺ２
（アミノ酸置換体）の単一コロニーを、５μｇ／ミリリ
ットルの濃度でカナマイシンを含む５ミリリットルのＬ
Ｂ培地で３７℃にて一夜培養した。その培養液を、５μ
ｇ／ミリリットルの濃度でカナマイシンを含む５００ミ
リリットルの２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％イ
−ストエクストラクト、０．５％塩化ナトリウム）に移
し、３７℃、２０時間培養した。培養液を８０００ｒｐ
ｍにて３０分間遠心し菌体を除去し、上澄に６０％飽和
になるように硫安を加えて４℃一夜攪拌した。
（アミノ酸置換体）の単一コロニーを、５μｇ／ミリリ
ットルの濃度でカナマイシンを含む５ミリリットルのＬ
Ｂ培地で３７℃にて一夜培養した。その培養液を、５μ
ｇ／ミリリットルの濃度でカナマイシンを含む５００ミ
リリットルの２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％イ
−ストエクストラクト、０．５％塩化ナトリウム）に移
し、３７℃、２０時間培養した。培養液を８０００ｒｐ
ｍにて３０分間遠心し菌体を除去し、上澄に６０％飽和
になるように硫安を加えて４℃一夜攪拌した。
【００４２】遠心分離により沈殿を回収し、この沈殿を
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶解した。そ
の溶液を、２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプ
ライし、緩衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶
出させた。その活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩
析した。沈殿を１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離
して集め、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液Ｂ（２０
ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム）に溶解した。その酵素溶液はさらにゲル濾過カラム
（ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷ ２１．５ｘ６０
０ｍｍ）にアプライし、緩衝液Ｂで１ミリリットル／分
の流速で溶出した。活性画分を集め各種の精製酵素を得
た。
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶解した。そ
の溶液を、２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプ
ライし、緩衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶
出させた。その活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩
析した。沈殿を１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離
して集め、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液Ｂ（２０
ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム）に溶解した。その酵素溶液はさらにゲル濾過カラム
（ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷ ２１．５ｘ６０
０ｍｍ）にアプライし、緩衝液Ｂで１ミリリットル／分
の流速で溶出した。活性画分を集め各種の精製酵素を得
た。
【００４３】実施例２ （アミノ末端から１４４番目のアミノ酸残基におけるア
ミノ酸置換を有するサーモライシン様中性金属プロテア
ーゼの無作為なアミノ酸置換導入による製造）ｎｐｒＭ
遺伝子のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を含む組換体ファー
ジＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐは制限酵素をＰｓｔＩ−Ｂａｍ
ＨＩではなくＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩを使用し、ｍｐ１８
ではなくｍｐ１９のＭ１３ファージを使用する以外は実
施例１と同じ方法で得られた。組換体ファ−ジＭ１３Ｔ
ＺＢａ−Ｓｐの製造手順は図８に示されている。
ミノ酸置換を有するサーモライシン様中性金属プロテア
ーゼの無作為なアミノ酸置換導入による製造）ｎｐｒＭ
遺伝子のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を含む組換体ファー
ジＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐは制限酵素をＰｓｔＩ−Ｂａｍ
ＨＩではなくＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩを使用し、ｍｐ１８
ではなくｍｐ１９のＭ１３ファージを使用する以外は実
施例１と同じ方法で得られた。組換体ファ−ジＭ１３Ｔ
ＺＢａ−Ｓｐの製造手順は図８に示されている。
【００４４】Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ１本鎖ＤＮＡ５マイ
クログラムを、１Ｍ亜硝酸ナトリウム（ｐＨ＝４．３）
を含む２０マイクロリットルの０．２５Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液中で２１．５℃、４．５時間培養されたのち、
エタノ−ル沈殿により亜硝酸を除去、ＤＮＡを回収し
た。
クログラムを、１Ｍ亜硝酸ナトリウム（ｐＨ＝４．３）
を含む２０マイクロリットルの０．２５Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液中で２１．５℃、４．５時間培養されたのち、
エタノ−ル沈殿により亜硝酸を除去、ＤＮＡを回収し
た。
【００４５】回収したＤＮＡ０．５マイクログラムをＰ
ＣＲ反応溶液（６７ｍＭ トリス（ｐＨ８．８、１６ｍ
Ｍ 硫酸アンモニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ−ル、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ， ０．２ｍＭ ｄＣＴＰ，
１μＭ 順方向Ｍ１３ユニバ−サルプライマ−，１μＭ
逆方向Ｍ１３プライマ−）に溶かして、１ユニットの
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラ−ゼを加えた。その溶液の表面
をミネラルオイル１滴で覆った。９３℃で１分間変性さ
せ、４５℃で１分間アニ−ルし、７２℃で４５秒間の伸
長を３０サイクル繰り返した。反応終了後、水層を回収
し常法に従って、フェノ−ルで抽出、エタノ−ルで処理
し、増幅されたＤＮＡを沈殿化により回収した。
ＣＲ反応溶液（６７ｍＭ トリス（ｐＨ８．８、１６ｍ
Ｍ 硫酸アンモニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ−ル、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ， ０．２ｍＭ ｄＣＴＰ，
１μＭ 順方向Ｍ１３ユニバ−サルプライマ−，１μＭ
逆方向Ｍ１３プライマ−）に溶かして、１ユニットの
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラ−ゼを加えた。その溶液の表面
をミネラルオイル１滴で覆った。９３℃で１分間変性さ
せ、４５℃で１分間アニ−ルし、７２℃で４５秒間の伸
長を３０サイクル繰り返した。反応終了後、水層を回収
し常法に従って、フェノ−ルで抽出、エタノ−ルで処理
し、増幅されたＤＮＡを沈殿化により回収した。
【００４６】このようにして得られたＤＮＡの半量を、
２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩
酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００
ｍＭ塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）中で、Ｂａｍ
Ｉ、ＳｐｈＩ各５ユニットにより３７℃２時間で消化さ
せた。その後、反応混合物を７０℃で５分間反応させ
た。このようにして得られた変異の導入されたＢａｍＩ
ーＳｐｈＩ断片と、ｐＵＢＴＺ２のＢａｍＨＩーＳｐｈ
Ｉ断片（７．４ｋｂ）とを宝酒造社製ＤＮＡライゲ−シ
ョンキットを用いてライゲーションした。そのライゲー
ション混合物を、常法に従って大腸菌ＪＭ１０３に形質
転換し、アミノ酸置換を導入された形質転換体ＪＭ１０
３／ｐＵＢＴＺ２を得た。
２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩
酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００
ｍＭ塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）中で、Ｂａｍ
Ｉ、ＳｐｈＩ各５ユニットにより３７℃２時間で消化さ
せた。その後、反応混合物を７０℃で５分間反応させ
た。このようにして得られた変異の導入されたＢａｍＩ
ーＳｐｈＩ断片と、ｐＵＢＴＺ２のＢａｍＨＩーＳｐｈ
Ｉ断片（７．４ｋｂ）とを宝酒造社製ＤＮＡライゲ−シ
ョンキットを用いてライゲーションした。そのライゲー
ション混合物を、常法に従って大腸菌ＪＭ１０３に形質
転換し、アミノ酸置換を導入された形質転換体ＪＭ１０
３／ｐＵＢＴＺ２を得た。
【００４７】形質転換体を含む寒天培地上にアルカリ溶
液（０．２Ｎ 水酸化ナトリウム、０．２％ ＳＤＳ）
３ミリリットルを加えてコロニーを溶かし、１ミリリッ
トルの溶液を回収した。回収した液に５Ｍの酢酸カリウ
ムを１ミリリットル加え、氷中に１０分間放置したのち
８０００ｒｐｍ、２０分間遠心して沈殿を除去した。得
られた上澄を常法に従ってフェノ−ルで処理し、エタノ
ールで処理して沈殿させた。その沈殿を真空乾燥したの
ち、０．２ミリリットルのＴＥ（１０ｍＭ トリス（ｐ
Ｈ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解しミュ−タン
トライブラリーとした。
液（０．２Ｎ 水酸化ナトリウム、０．２％ ＳＤＳ）
３ミリリットルを加えてコロニーを溶かし、１ミリリッ
トルの溶液を回収した。回収した液に５Ｍの酢酸カリウ
ムを１ミリリットル加え、氷中に１０分間放置したのち
８０００ｒｐｍ、２０分間遠心して沈殿を除去した。得
られた上澄を常法に従ってフェノ−ルで処理し、エタノ
ールで処理して沈殿させた。その沈殿を真空乾燥したの
ち、０．２ミリリットルのＴＥ（１０ｍＭ トリス（ｐ
Ｈ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解しミュ−タン
トライブラリーとした。
【００４８】得られたミュ−タントライブラリーで常法
によって枯草菌ＭＴ−２を形質転換した。この細胞溶液
を、１％カゼイン及び５μｇ／ミリリットルのカイナマ
イシンを含むＬＢ寒天培地に展開し、３７℃にて一夜培
養し、最終的に１４０個のハロ−形成コロニ−を単離し
た。
によって枯草菌ＭＴ−２を形質転換した。この細胞溶液
を、１％カゼイン及び５μｇ／ミリリットルのカイナマ
イシンを含むＬＢ寒天培地に展開し、３７℃にて一夜培
養し、最終的に１４０個のハロ−形成コロニ−を単離し
た。
【００４９】選択したコロニ−を５μｇ／ミリリットル
のカイナマイシンを含むＬＢ培地３ミリリットルに移
し、３７℃にて一夜培養した。この培養液を１０，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄１．２ミリリットル
に硫酸アンモニウムの飽和水溶液０．３ミリリットル及
びブチルトヨパール６５０Ｓを０．０４ミリリットルを
加えて撹拌し、室温で５分間放置した。続いて１０，０
００ｒｐｍ、１分間遠心し上澄を除去し、洗浄液（８ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、８ｍＭ 塩化カルシウ
ム、２０％飽和硫酸アンモニウム）０．２ミリリットル
に懸濁し、容量１ミリリットルのピペットチップで作製
した遠心カラムに詰めた。０．６ミリリットルの洗浄液
で洗浄したのち、酵素溶液は０．２ミリリットルの溶離
液（１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、 １０ｍＭ
塩化カルシウム）で溶出した。こうして得られた酵素
液を先の溶離液で平衡化したファルマシア社製脱塩ゲル
濾過カラム（セファデックスＰＤ１０）によって脱塩を
行い、精製された酵素液０．５ミリリットルを得た。
のカイナマイシンを含むＬＢ培地３ミリリットルに移
し、３７℃にて一夜培養した。この培養液を１０，００
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄１．２ミリリットル
に硫酸アンモニウムの飽和水溶液０．３ミリリットル及
びブチルトヨパール６５０Ｓを０．０４ミリリットルを
加えて撹拌し、室温で５分間放置した。続いて１０，０
００ｒｐｍ、１分間遠心し上澄を除去し、洗浄液（８ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、８ｍＭ 塩化カルシウ
ム、２０％飽和硫酸アンモニウム）０．２ミリリットル
に懸濁し、容量１ミリリットルのピペットチップで作製
した遠心カラムに詰めた。０．６ミリリットルの洗浄液
で洗浄したのち、酵素溶液は０．２ミリリットルの溶離
液（１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、 １０ｍＭ
塩化カルシウム）で溶出した。こうして得られた酵素
液を先の溶離液で平衡化したファルマシア社製脱塩ゲル
濾過カラム（セファデックスＰＤ１０）によって脱塩を
行い、精製された酵素液０．５ミリリットルを得た。
【００５０】その酵素溶液の酵素濃度は色素結合法（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，７２，（１９７６） ２４８−２５４）によって
測定し、アミノ酸置換の導入された酵素をスクリーニン
グする為に、Ｚ−ＡＰＭの分解特性を以下の方法により
測定した。
ｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，７２，（１９７６） ２４８−２５４）によって
測定し、アミノ酸置換の導入された酵素をスクリーニン
グする為に、Ｚ−ＡＰＭの分解特性を以下の方法により
測定した。
【００５１】１ミリリットルの基質溶液（１０ｍＭ ト
リス−マレイン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化カル
シウム、 ５ｍＭ Ｚ−ＡＰＭ）に０．０５ミリリット
ルの酵素溶液を混合し３７℃、２０分反応させたのち、
０．５ミリリットルの反応停止液（０．１Ｍ 酢酸）を
加え、続いて１ミリリットルのニンヒドリン溶液を加え
た。１００℃で１５分間反応させた後、２ミリリットル
の５０％エタノ−ルを加えて、５７０ｎｍの吸光度を測
定した。酵素蛋白質１ｍｇ当たりの吸光度の変化を比活
性として野生型酵素との相対値で表した。その結果、Ｚ
−ＡＰＭ分解活性が高い２つのクローンが得られた。そ
の結果を以下に示す。
リス−マレイン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化カル
シウム、 ５ｍＭ Ｚ−ＡＰＭ）に０．０５ミリリット
ルの酵素溶液を混合し３７℃、２０分反応させたのち、
０．５ミリリットルの反応停止液（０．１Ｍ 酢酸）を
加え、続いて１ミリリットルのニンヒドリン溶液を加え
た。１００℃で１５分間反応させた後、２ミリリットル
の５０％エタノ−ルを加えて、５７０ｎｍの吸光度を測
定した。酵素蛋白質１ｍｇ当たりの吸光度の変化を比活
性として野生型酵素との相対値で表した。その結果、Ｚ
−ＡＰＭ分解活性が高い２つのクローンが得られた。そ
の結果を以下に示す。
【００５２】 野生型 クローン１ クロ−ン２ Ｚ−ＡＰＭ分解活性（％） １００ ２６０ ２８０ 得られた２つのクロ−ンより常法に従ってプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、２つの
クローンは同じものであり、アミノ末端から３８番目の
グリシンがグルタミンに、１４４番目のロイシンがセリ
ンに置換された変異体であった。以後これらのクローン
をＧ３８Ｑ−Ｌ１４４Ｓと示す。
ＮＡを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、２つの
クローンは同じものであり、アミノ末端から３８番目の
グリシンがグルタミンに、１４４番目のロイシンがセリ
ンに置換された変異体であった。以後これらのクローン
をＧ３８Ｑ−Ｌ１４４Ｓと示す。
【００５３】プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｇ３８Ｑ−Ｌ１
４４Ｓ）１μｇとｐＵＢＴＺ２（野生型）１μｇとを２
０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸
ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、 ５０ｍ
Ｍ 塩化ナトリウム、 １ｍＭ ＤＴＴ）中で、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ ５ユニットにより、３７℃で２時間消化させ
た。これらのサンプルを１％アガロ−スゲルで電気泳動
し約１．１ｋｂ及び約７ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、バ
イオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを用いた
精製した。
４４Ｓ）１μｇとｐＵＢＴＺ２（野生型）１μｇとを２
０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸
ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、 ５０ｍ
Ｍ 塩化ナトリウム、 １ｍＭ ＤＴＴ）中で、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ ５ユニットにより、３７℃で２時間消化させ
た。これらのサンプルを１％アガロ−スゲルで電気泳動
し約１．１ｋｂ及び約７ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、バ
イオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを用いた
精製した。
【００５４】この様にして得られたｐＵＢＴＺ２（Ｇ３
８Ｑ−Ｌ１４４Ｓ）由来の約７ｋｂ断片とｐＵＢＴＺ２
（野生型）由来の約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を宝酒造社
製ＤＮＡライゲ−ションキットを用いてライゲーション
した。そのライゲーション混合物を常法に従って大腸菌
ＪＭ１０３を形質転換した。その形質転換体を急速なＤ
ＮＡ分離とＤＮＡ配列調査により、ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１
４４Ｓ）を単離した。組換枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ
２（Ｇ３８Ｑ−Ｌ１４４Ｓ）及び組換枯草菌ＭＴ−２／
ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）のそれぞれの単一コロニー
を５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含むＬＢ培地
の５ミリリットルに移し３７℃にて一夜培養した。５μ
ｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む２リットルの培
地（２％ バクトトリプトン、１％イーストエクストラ
クト、０．５％ 塩化ナトリウム）の５００ミリリット
ルに移し、３７℃、２０時間培養した。その培養液を
８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、菌体を除去
し、６０％飽和にする為に、硫酸アンモニウムを上澄液
に添加し、その混合物を一夜間４℃に撹拌した。
８Ｑ−Ｌ１４４Ｓ）由来の約７ｋｂ断片とｐＵＢＴＺ２
（野生型）由来の約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を宝酒造社
製ＤＮＡライゲ−ションキットを用いてライゲーション
した。そのライゲーション混合物を常法に従って大腸菌
ＪＭ１０３を形質転換した。その形質転換体を急速なＤ
ＮＡ分離とＤＮＡ配列調査により、ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１
４４Ｓ）を単離した。組換枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ
２（Ｇ３８Ｑ−Ｌ１４４Ｓ）及び組換枯草菌ＭＴ−２／
ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）のそれぞれの単一コロニー
を５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含むＬＢ培地
の５ミリリットルに移し３７℃にて一夜培養した。５μ
ｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む２リットルの培
地（２％ バクトトリプトン、１％イーストエクストラ
クト、０．５％ 塩化ナトリウム）の５００ミリリット
ルに移し、３７℃、２０時間培養した。その培養液を
８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、菌体を除去
し、６０％飽和にする為に、硫酸アンモニウムを上澄液
に添加し、その混合物を一夜間４℃に撹拌した。
【００５５】遠心分離により沈殿を回収し、この沈殿を
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶解した。そ
の溶液を、２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプ
ライし、緩衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶
出させた。その活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩
析した。沈殿を１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離
して集め、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液Ｂ（２０
ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム）に溶解した。その酵素溶液はさらにゲル濾過カラム
（ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷ ２１．５ｘ６０
０ｍｍ）にアプライし、緩衝液Ｂで１ミリリットル／分
の流速で溶出した。活性画分を集め各種の精製酵素を得
た。
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶解した。そ
の溶液を、２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプ
ライし、緩衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶
出させた。その活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩
析した。沈殿を１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離
して集め、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液Ｂ（２０
ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム）に溶解した。その酵素溶液はさらにゲル濾過カラム
（ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷ ２１．５ｘ６０
０ｍｍ）にアプライし、緩衝液Ｂで１ミリリットル／分
の流速で溶出した。活性画分を集め各種の精製酵素を得
た。
【００５６】実施例３ （１５０番目のアミノ酸残基に変異を有するサーモリシ
ン様中性金属プロテアーゼの合成）変異導入に用いたオ
リゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ社製
３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて合成した。その変異
導入プライマーのヌクレオチドの塩基配列を以下に示
す。
ン様中性金属プロテアーゼの合成）変異導入に用いたオ
リゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ社製
３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて合成した。その変異
導入プライマーのヌクレオチドの塩基配列を以下に示
す。
【００５７】 ５´−ＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣ−３´ ＳｐｈＩ Ａｓｎ １５０ ５´−ＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣ−３´ ＳｐｈＩ Ｈｉｓ １５０ ５´−ＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＧＣ−３´ ＳｐｈＩ Ｌｙｓ １５０ 以下、このオリゴヌクレオチドを変異導入プライマ−と
呼ぶ。
呼ぶ。
【００５８】一方、以下のヌクレオチド配列を持つ逆方
向プライマ−も同じ装置により、合成した。
向プライマ−も同じ装置により、合成した。
【００５９】 ５´−ＧＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＣＡ−３´ プラスミドｐＵＢＴＺ２、１ｎｇをＰＣＲ反応溶液（６
７ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ 硫酸アン
モニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノ−ル、０．０５ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．
０５ｍＭ ｄＴＴＰ、１μＭ 変異導入プライマ−、１
μＭ 逆方向プライマ−）の１００マイクロリットルに
溶かして、１ユニットのＴｔｈ ＤＮＡポリメラ−ゼを
加えた。その溶液をミネラルオイル一滴により被覆し
た。９３℃１分間の変性、４５℃１分間のアニ−リング
及び７２℃４５秒間の伸長を３０サイクル繰り返した。
反応終了後、水層を回収し常法に従って、フェノ−ルで
抽出し、エタノ−ルで沈殿化を行い、増幅されたＤＮＡ
を回収した。
７ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ 硫酸アン
モニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノ−ル、０．０５ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．
０５ｍＭ ｄＴＴＰ、１μＭ 変異導入プライマ−、１
μＭ 逆方向プライマ−）の１００マイクロリットルに
溶かして、１ユニットのＴｔｈ ＤＮＡポリメラ−ゼを
加えた。その溶液をミネラルオイル一滴により被覆し
た。９３℃１分間の変性、４５℃１分間のアニ−リング
及び７２℃４５秒間の伸長を３０サイクル繰り返した。
反応終了後、水層を回収し常法に従って、フェノ−ルで
抽出し、エタノ−ルで沈殿化を行い、増幅されたＤＮＡ
を回収した。
【００６０】このようにして得られたＤＮＡの半量を含
む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ
及びＡａｔＩ各５ユニットにより３７℃で２時間消化さ
せ、７０℃で５分間反応させた。このようにして得られ
た変異の導入されたＳｐｈＩーＡａｔＩ断片約５３０ｂ
ｐを、ｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩーＡａｔＩ断片７．４ｋ
ｂにより宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用い
てライゲーションさせた。このライゲーション混合物
を、常法に従って大腸菌ＪＭ１０３に形質転換し、変異
の導入された形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２を得
た。置換されたアミノ酸残基は、これらのプラスミドの
ヌクレオチドの配列の同定により確認した。
む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ
及びＡａｔＩ各５ユニットにより３７℃で２時間消化さ
せ、７０℃で５分間反応させた。このようにして得られ
た変異の導入されたＳｐｈＩーＡａｔＩ断片約５３０ｂ
ｐを、ｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩーＡａｔＩ断片７．４ｋ
ｂにより宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用い
てライゲーションさせた。このライゲーション混合物
を、常法に従って大腸菌ＪＭ１０３に形質転換し、変異
の導入された形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢＴＺ２を得
た。置換されたアミノ酸残基は、これらのプラスミドの
ヌクレオチドの配列の同定により確認した。
【００６１】例えば、組み換え枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢ
ＴＺ２（Ｄ１５０Ｎ）の単一コロニ−を、５μｇ／ミリ
リットルの濃度でカナマイシンを含むＬＢ培地５ミリリ
ットルに移し、３７℃にて一夜培養した。その培養液
を、５００ミリリットルの５μｇ／ミリリットルの濃度
でカナマイシンを含む２Ｌ培地（２％バクトトリプト
ン、１％イ−ストエクストラクト、０．５％塩化ナトリ
ウム）に移し、３７℃、２０時間培養した。培養液を
８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、菌体を除去
し、上澄に６０％飽和になるように硫安を加えて４℃で
一夜撹拌した。
ＴＺ２（Ｄ１５０Ｎ）の単一コロニ−を、５μｇ／ミリ
リットルの濃度でカナマイシンを含むＬＢ培地５ミリリ
ットルに移し、３７℃にて一夜培養した。その培養液
を、５００ミリリットルの５μｇ／ミリリットルの濃度
でカナマイシンを含む２Ｌ培地（２％バクトトリプト
ン、１％イ−ストエクストラクト、０．５％塩化ナトリ
ウム）に移し、３７℃、２０時間培養した。培養液を
８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、菌体を除去
し、上澄に６０％飽和になるように硫安を加えて４℃で
一夜撹拌した。
【００６２】遠心分離により沈殿を回収し、この沈殿を
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、 １０ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解し、
２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプライし、緩
衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶出した。そ
の活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、１５００
０ｒｐｍにて３０分間遠心して、沈殿を集めた。続い
て、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶
解した。その酵素溶液を、ゲル濾過カラム（ＴＳＫ Ｇ
ｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（２１．５ｘ６００ｍｍ））に供
給し、緩衝液により１ミリリットル／分の流速で溶出、
活性画分を集め各々の精製酵素を得た。
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、 １０ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解し、
２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプライし、緩
衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶出した。そ
の活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、１５００
０ｒｐｍにて３０分間遠心して、沈殿を集めた。続い
て、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶
解した。その酵素溶液を、ゲル濾過カラム（ＴＳＫ Ｇ
ｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（２１．５ｘ６００ｍｍ））に供
給し、緩衝液により１ミリリットル／分の流速で溶出、
活性画分を集め各々の精製酵素を得た。
【００６３】実施例４ （１４４番目、１５０番目及び２２７番目のアミノ酸残
基に変異を導入したサーモリシン様金属プロテアーゼの
合成）三つの位置に変異が導入されたサーモリシン様金
属プロテアーゼを以下の様に組み立てた。２２７番目の
アミノ酸残基のコドンでのアスパラギン残基からヒスチ
ジン残基への変異を含むプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２
２７Ｈ）をＰＣＲ反応用一本鎖ＤＮＡとして使用した。
基に変異を導入したサーモリシン様金属プロテアーゼの
合成）三つの位置に変異が導入されたサーモリシン様金
属プロテアーゼを以下の様に組み立てた。２２７番目の
アミノ酸残基のコドンでのアスパラギン残基からヒスチ
ジン残基への変異を含むプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２
２７Ｈ）をＰＣＲ反応用一本鎖ＤＮＡとして使用した。
【００６４】尚、プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２２７
Ｈ）は以下の様に作成した。
Ｈ）は以下の様に作成した。
【００６５】バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）ＭＫ２３２株由来のサ−モリシン様金属プロテア−
ゼ遺伝子ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ１の１μｇを
２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩
酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００
ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、Ｐ
ｓｔＩおよびＢａｍＨＩの各５ユニットにより３７℃で
２時間分解させた。このサンプルから１％アガロースゲ
ル電気泳動で約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、バイ
オ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精
製した。一方、プラスミドベクターｐＵＣ９の１μｇを
含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス
−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１
００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に於い
て、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニットにより３７
℃で２時間分解させた。
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）ＭＫ２３２株由来のサ−モリシン様金属プロテア−
ゼ遺伝子ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ１の１μｇを
２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩
酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００
ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、Ｐ
ｓｔＩおよびＢａｍＨＩの各５ユニットにより３７℃で
２時間分解させた。このサンプルから１％アガロースゲ
ル電気泳動で約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、バイ
オ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精
製した。一方、プラスミドベクターｐＵＣ９の１μｇを
含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス
−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１
００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）に於い
て、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニットにより３７
℃で２時間分解させた。
【００６６】このようにして得られたｐＭＫ１のｎｐｒ
Ｍ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片を含む組換体ファ−ジ（ｐＵＣＴＺ５５）
を得た（図５）。
Ｍ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片を含む組換体ファ−ジ（ｐＵＣＴＺ５５）
を得た（図５）。
【００６７】図６に示すプラスミドｐＵＣＴＺ５５から
Ｍ１３ファ−ジＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する工程を
以下に説明する。
Ｍ１３ファ−ジＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する工程を
以下に説明する。
【００６８】組換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５の１μｇ
を、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス−
塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム １０
０ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及
びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時間分解
させた。このサンプルから１％アガロースゲル電気泳動
で約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社
ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
を、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス−
塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム １０
０ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及
びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時間分解
させた。このサンプルから１％アガロースゲル電気泳動
で約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社
ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
【００６９】一方、ファージベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８の
１μｇを、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム１００ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、Ｓｐ
ｈＩ及びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時
間分解させた。
１μｇを、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム１００ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）に於いて、Ｓｐ
ｈＩ及びＢｃｌＩの各５ユニットを加えて３７℃で２時
間分解させた。
【００７０】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＳｐｈＩ
−ＢｃｌＩの分解物とを宝酒造社製ＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて連結反応を行なった。この反応混合物
を、通常の方法で、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎ
ｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を含む組換体フ
ァ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）を得た（図６）。
ＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＳｐｈＩ
−ＢｃｌＩの分解物とを宝酒造社製ＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて連結反応を行なった。この反応混合物
を、通常の方法で、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎ
ｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を含む組換体フ
ァ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）を得た（図６）。
【００７１】得られた組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ
−Ｂｃ）から、通常の方法で、１本鎖ＤＮＡを調製し、
アミノ酸置換の導入に用いた。アミノ酸置換の導入に用
いたオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ
社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて作製した。
−Ｂｃ）から、通常の方法で、１本鎖ＤＮＡを調製し、
アミノ酸置換の導入に用いた。アミノ酸置換の導入に用
いたオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ
社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて作製した。
【００７２】２２７番目残基の変換（アスパラギンから
ヒスチジンへの変換）に使用されたアミノ酸置換導入用
オリゴヌクレオチドを以下に示した。
ヒスチジンへの変換）に使用されたアミノ酸置換導入用
オリゴヌクレオチドを以下に示した。
【００７３】 ５´−ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＧＧ−３´ Ｈｉｓ ２２７ アミノ酸置換の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビ
トロミュータゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配
列決定によってアミノ酸置換の導入を確認した。
トロミュータゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配
列決定によってアミノ酸置換の導入を確認した。
【００７４】アミノ酸置換を導入したＭ１３ＴＺＳｐ−
Ｂｃ及びｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを通常の方法に
より調製し、その二本鎖ＤＮＡの１μｇを、２０μリッ
トルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５ １
０ｍＭ 塩化マグネシウム１００ｍＭ 食塩１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及びＡａｔＩを各５ユニット
により３７℃で２時間反応させ、一部を切り取り、この
サンプルを１％アガロ−スゲルで電気泳動した。約５５
０ｂｐのＤＮＡ断片をＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ分解物から
分離し、そのＤＮＡ断片をバイオ−１０１遺伝子ＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。
Ｂｃ及びｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを通常の方法に
より調製し、その二本鎖ＤＮＡの１μｇを、２０μリッ
トルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５ １
０ｍＭ 塩化マグネシウム１００ｍＭ 食塩１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）に於いて、ＳｐｈＩ及びＡａｔＩを各５ユニット
により３７℃で２時間反応させ、一部を切り取り、この
サンプルを１％アガロ−スゲルで電気泳動した。約５５
０ｂｐのＤＮＡ断片をＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ分解物から
分離し、そのＤＮＡ断片をバイオ−１０１遺伝子ＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。
【００７５】同時に、枯草菌体中での発現の為のベクタ
ー断片を以下に記載した方法製造した。プラスミドｐＭ
Ｋ４（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｇ
ｅｎｅ， ９９， １０９−１１４）から、ｎｐｒＭ遺
伝子の一部を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＢｃｌＩ
で分解し、プラスミド ｐＵＣＴＺ３７を組み立てる為
に、プラスミドｐＵＣ９のＢａｍＨＩ位置にクローン化
した（図１）。
ー断片を以下に記載した方法製造した。プラスミドｐＭ
Ｋ４（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｇ
ｅｎｅ， ９９， １０９−１１４）から、ｎｐｒＭ遺
伝子の一部を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＢｃｌＩ
で分解し、プラスミド ｐＵＣＴＺ３７を組み立てる為
に、プラスミドｐＵＣ９のＢａｍＨＩ位置にクローン化
した（図１）。
【００７６】プラスミドｐＵＣＴＺ３７はｎｐｒＭ遺伝
子の５´末端領域を有さない不完全なプラスミドであ
る。プラスミドｐＵＣＴＺ３７は制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで分解し、その大きな断片と、プラスミドｐＭＫ４か
らＨｉｎｄＩＩＩ消化により得られた約１．２ｋｂ断片
とを連結し、プラスミドｐＵＣＴＺ４７を作製した（図
２）。この組換体プラスミドｐＵＣＴＺ４７はｎｐｒＭ
の全ての配列及び転写プロモーター配列を含む。
子の５´末端領域を有さない不完全なプラスミドであ
る。プラスミドｐＵＣＴＺ３７は制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで分解し、その大きな断片と、プラスミドｐＭＫ４か
らＨｉｎｄＩＩＩ消化により得られた約１．２ｋｂ断片
とを連結し、プラスミドｐＵＣＴＺ４７を作製した（図
２）。この組換体プラスミドｐＵＣＴＺ４７はｎｐｒＭ
の全ての配列及び転写プロモーター配列を含む。
【００７７】図３に示された様に、大腸菌と枯草菌との
間のシャトルベクターを組み立てる為に、ｐＵＣＴＺ４
７とｐＵＢ１１０（Ｌａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９
７４）をＥｃｏＲＩにより消化し、プラスミドｐＵＢＴ
Ｚ１を組み立てる為にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
ライゲーションを実施した。
間のシャトルベクターを組み立てる為に、ｐＵＣＴＺ４
７とｐＵＢ１１０（Ｌａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９
７４）をＥｃｏＲＩにより消化し、プラスミドｐＵＢＴ
Ｚ１を組み立てる為にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
ライゲーションを実施した。
【００７８】最終的に、図４に示された様に、プラスミ
ドｐＵＢＴＺ１から制限酵素ＳｍａＩとＰｖｕＩＩとの
間のＤＮＡ断片を除去することによりプラスミドｐＵＢ
ＴＺ２を作製した。プラスミドｐＵＢＴＺ２はｎｐｒＭ
遺伝子領域に制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ及びＡａｔ
Ｉの切断部位を一ケ所づつを有する。野生型遺伝子から
変異型遺伝子への変換は以下の様に実施した。
ドｐＵＢＴＺ１から制限酵素ＳｍａＩとＰｖｕＩＩとの
間のＤＮＡ断片を除去することによりプラスミドｐＵＢ
ＴＺ２を作製した。プラスミドｐＵＢＴＺ２はｎｐｒＭ
遺伝子領域に制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ及びＡａｔ
Ｉの切断部位を一ケ所づつを有する。野生型遺伝子から
変異型遺伝子への変換は以下の様に実施した。
【００７９】プラスミドｐＵＢＴＺ２はＳｐｈＩ及びＡ
ａｔＩで消化し、７．６ｋｂの断片を単離した。この様
にして得られたｐＵＢＴＺ２とｎｐｒＭ遺伝子のアミノ
酸置換を導入したＳｐｈＩ及びＡａｔＩ断片（約５５０
ｋｂ）とを宝酒造ＤＮＡライゲーションキットにより、
ライゲーションした。このライゲーション混合物はＪＭ
１０３大腸菌を通常の方法により組換体プラスミド（Ｎ
２２７Ｈ）を得ることに使用される（図７）。
ａｔＩで消化し、７．６ｋｂの断片を単離した。この様
にして得られたｐＵＢＴＺ２とｎｐｒＭ遺伝子のアミノ
酸置換を導入したＳｐｈＩ及びＡａｔＩ断片（約５５０
ｋｂ）とを宝酒造ＤＮＡライゲーションキットにより、
ライゲーションした。このライゲーション混合物はＪＭ
１０３大腸菌を通常の方法により組換体プラスミド（Ｎ
２２７Ｈ）を得ることに使用される（図７）。
【００８０】変異導入プライマーと逆方向プライマーは
実施例３と同じである。
実施例３と同じである。
【００８１】 変異導入プライマー （Ｄ１５０Ｎ） ５´−ＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣ−３´ ＳｐｈＩ Ａｓｎ １５０ （Ｄ１５０Ｈ） ５´−ＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣ−３´ ＳｐｈＩ Ｈｉｓ １５０ 逆方向プライマ− ５´−ＧＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＣＡ−３´ プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｎ２２７Ｈ）の１ｎｇをＰＣ
Ｒ反応溶液（６７ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１６．６
ｍＭ 硫酸アンモニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ−ル、０．０５ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ
ｄＣＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＴＴＰ、１μＭ 変異導
入プライマ−、１μＭ 逆方向プライマ−）の１００マ
イクロリットルに溶かして、１ユニットのＴｔｈ ＤＮ
Ａポリメラ−ゼを加えた。その溶液をミネラルオイル一
滴により被覆した。９３℃１分間の変性、４５℃１分間
のアニ−リング及び７２℃４５秒間の伸長を３０サイク
ル繰り返した。反応終了後、水層を回収し常法に従っ
て、フェノ−ルで抽出し、エタノ−ルで沈殿化を行い、
増幅されたＤＮＡ（Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ又はＤ１５
０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を回収した。
Ｒ反応溶液（６７ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１６．６
ｍＭ 硫酸アンモニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ−ル、０．０５ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ
ｄＣＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＴＴＰ、１μＭ 変異導
入プライマ−、１μＭ 逆方向プライマ−）の１００マ
イクロリットルに溶かして、１ユニットのＴｔｈ ＤＮ
Ａポリメラ−ゼを加えた。その溶液をミネラルオイル一
滴により被覆した。９３℃１分間の変性、４５℃１分間
のアニ−リング及び７２℃４５秒間の伸長を３０サイク
ル繰り返した。反応終了後、水層を回収し常法に従っ
て、フェノ−ルで抽出し、エタノ−ルで沈殿化を行い、
増幅されたＤＮＡ（Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ又はＤ１５
０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を回収した。
【００８２】このようにして得られたＤＮＡの半量を含
む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ
及びＡａｔＩ各５ユニットにより３７℃で２時間消化さ
せ、７０℃で５分間培養した。このようにして得られた
変異の導入されたＳｐｈＩーＡａｔＩ断片約５３０ｂｐ
を、ｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩーＡａｔＩ断片７．６ｋｂ
（Ｌ１４４Ｓ）により宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ション
キットを用いてライゲーションさせた。このライゲーシ
ョン混合物を、常法に従って大腸菌ＪＭ１０３に形質転
換し、変異の導入された形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢ
ＴＺ２を得た。置換されたアミノ酸残基は、これらのプ
ラスミドのヌクレオチドの配列の同定により確認した。
む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ
及びＡａｔＩ各５ユニットにより３７℃で２時間消化さ
せ、７０℃で５分間培養した。このようにして得られた
変異の導入されたＳｐｈＩーＡａｔＩ断片約５３０ｂｐ
を、ｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩーＡａｔＩ断片７．６ｋｂ
（Ｌ１４４Ｓ）により宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ション
キットを用いてライゲーションさせた。このライゲーシ
ョン混合物を、常法に従って大腸菌ＪＭ１０３に形質転
換し、変異の導入された形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵＢ
ＴＺ２を得た。置換されたアミノ酸残基は、これらのプ
ラスミドのヌクレオチドの配列の同定により確認した。
【００８３】例えば、組み換え枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢ
ＴＺ２の単一コロニ−を、５μｇ／ミリリットルの濃度
でカナマイシンを含むＬＢ培地５ミリリットルに移し、
３７℃にて一夜培養した。その培養液を、５００ミリリ
ットルの５μｇ／ミリリットルの濃度でカナマイシンを
含む２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％イ−ストエ
クストラクト、０．５％塩化ナトリウム）に移し、３７
℃、２０時間培養した。培養液を８，０００ｒｐｍにて
３０分間遠心分離し、菌体を除去し、上澄に６０％飽和
になるように硫安を加えて４℃で一夜撹拌した。
ＴＺ２の単一コロニ−を、５μｇ／ミリリットルの濃度
でカナマイシンを含むＬＢ培地５ミリリットルに移し、
３７℃にて一夜培養した。その培養液を、５００ミリリ
ットルの５μｇ／ミリリットルの濃度でカナマイシンを
含む２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％イ−ストエ
クストラクト、０．５％塩化ナトリウム）に移し、３７
℃、２０時間培養した。培養液を８，０００ｒｐｍにて
３０分間遠心分離し、菌体を除去し、上澄に６０％飽和
になるように硫安を加えて４℃で一夜撹拌した。
【００８４】遠心分離により沈殿を回収し、この沈殿を
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、 １０ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解し、
２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプライし、緩
衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶出した。そ
の活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、１５００
０ｒｐｍにて３０分間遠心して、沈殿を集めた。続い
て、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶
解した。その酵素溶液を、ゲル濾過カラム（ＴＳＫ Ｇ
ｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（２１．５ｘ６００ｍｍ））に供
給し、緩衝液により１ミリリットル／分の流速で溶出、
活性画分を集め各々の精製酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０
Ｎ−Ｎ２２７Ｈ又はＬ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７
Ｈ）を得た。
１０ミリリットルの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ９．０、 １０ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解し、
２０ミリリットルのブチルトヨパ−ルにアプライし、緩
衝液Ａで１．５ミリリットル／分の流速で溶出した。そ
の活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、１５００
０ｒｐｍにて３０分間遠心して、沈殿を集めた。続い
て、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）に溶
解した。その酵素溶液を、ゲル濾過カラム（ＴＳＫ Ｇ
ｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（２１．５ｘ６００ｍｍ））に供
給し、緩衝液により１ミリリットル／分の流速で溶出、
活性画分を集め各々の精製酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０
Ｎ−Ｎ２２７Ｈ又はＬ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７
Ｈ）を得た。
【００８５】本発明のサーモライシン様新規中性金属プ
ロテアーゼを分泌する二つの組換体枯草菌鎖、即ち、１
４４番目のロイシン残基をセリン残基に置換し、１５０
番目のアスパラギン酸残基をヒスチジンに置換し、２２
７番目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換した枯草
菌株ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（ＴＺ−１）及び１４４番
目のロイシン残基をセリン残基に置換し、１５０番目の
アスパラギン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７番
目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換した枯草菌株
ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（ＴＺ−２）を通商産業省、工
業技術院、生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東
１丁目１−３）に寄託をしており、その寄託番号は各々
ＦＥＲＭ ＢＰ−４１１２とＦＥＲＭ ＢＰ−４１１
３である。
ロテアーゼを分泌する二つの組換体枯草菌鎖、即ち、１
４４番目のロイシン残基をセリン残基に置換し、１５０
番目のアスパラギン酸残基をヒスチジンに置換し、２２
７番目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換した枯草
菌株ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（ＴＺ−１）及び１４４番
目のロイシン残基をセリン残基に置換し、１５０番目の
アスパラギン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７番
目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換した枯草菌株
ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（ＴＺ−２）を通商産業省、工
業技術院、生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東
１丁目１−３）に寄託をしており、その寄託番号は各々
ＦＥＲＭ ＢＰ−４１１２とＦＥＲＭ ＢＰ−４１１
３である。
【００８６】図９は、形質転換体プラスミドｐＵＢＴＺ
２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ又はＬ１４４
Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を組み立てる工程図を示
す。実施例 ５ （カゼインの分解活性及びＺ−ＡＰＭ分解活性の測定）
１４４番目のロイシン残基をセリンに置換した酵素（Ｌ
１４４Ｓ）、１８７番目のグルタミン酸残基をグルタミ
ンに置換した酵素（Ｅ１８７Ｑ）、１５０番目のアスパ
ラギン酸残基をアスパラギンに置換した酵素（Ｄ１５０
Ｎ），ヒスチジンで置換した酵素（Ｄ１５０Ｈ）、１４
４番目のロイシン残基をセリンに置換し、２２７番目の
アスパラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４
４Ｓ−Ｎ２２７Ｈ）、１４４番目のロイシン残基をセリ
ンに置換し、１５０番目のアスパラギン酸残基をアスパ
ラギンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ）、１
４４番目のロイシン残基をセリンに置換し、１５０番目
のアスパラギン酸残基をヒスチジンンに置換した酵素
（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ）、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７番目のアスパ
ラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｄ１５０Ｎ−
Ｎ２２７Ｈ）、１５０番目のアスパラギン酸残基をヒシ
チジンに置換し、２２７番目のアスパラギン残基をヒス
チジンに置換した酵素（Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）、１
４４番目のロイシン残基をセリンに置換し、１５０番目
のアスパラギン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７
番目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換した酵素
（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ）１４４番目の
ロイシン残基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラ
ギン酸残基をヒスチジンに置換し、２２７番目のアスパ
ラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−
Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を使用して、カゼインの分解
活性及びＺ−ＡＰＭの分解活性を測定した。
２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ又はＬ１４４
Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を組み立てる工程図を示
す。実施例 ５ （カゼインの分解活性及びＺ−ＡＰＭ分解活性の測定）
１４４番目のロイシン残基をセリンに置換した酵素（Ｌ
１４４Ｓ）、１８７番目のグルタミン酸残基をグルタミ
ンに置換した酵素（Ｅ１８７Ｑ）、１５０番目のアスパ
ラギン酸残基をアスパラギンに置換した酵素（Ｄ１５０
Ｎ），ヒスチジンで置換した酵素（Ｄ１５０Ｈ）、１４
４番目のロイシン残基をセリンに置換し、２２７番目の
アスパラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４
４Ｓ−Ｎ２２７Ｈ）、１４４番目のロイシン残基をセリ
ンに置換し、１５０番目のアスパラギン酸残基をアスパ
ラギンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ）、１
４４番目のロイシン残基をセリンに置換し、１５０番目
のアスパラギン酸残基をヒスチジンンに置換した酵素
（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ）、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７番目のアスパ
ラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｄ１５０Ｎ−
Ｎ２２７Ｈ）、１５０番目のアスパラギン酸残基をヒシ
チジンに置換し、２２７番目のアスパラギン残基をヒス
チジンに置換した酵素（Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）、１
４４番目のロイシン残基をセリンに置換し、１５０番目
のアスパラギン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７
番目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換した酵素
（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ）１４４番目の
ロイシン残基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラ
ギン酸残基をヒスチジンに置換し、２２７番目のアスパ
ラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−
Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を使用して、カゼインの分解
活性及びＺ−ＡＰＭの分解活性を測定した。
【００８７】カゼイン分解活性の測定では、１ミリリッ
トルの精製酵素溶液（酵素をｐＨ８．０のホウ酸緩衝溶
液−２ｍＭ硫酸カルシウム溶液に溶解させた溶液）を１
ミリリットルの基質溶液（１％カゼイン、１／１５Ｍリ
ン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２））に加えた。この混合溶液
を３５℃で１０分間培養し、２．０ミリリットルの反応
停止液（０．１Ｍ ＴＣＡ，０．２Ｍ酢酸ナトリウム、
０．３Ｍ酢酸）を加え、更に３５℃で３０分間培養し
た。濾過後、５ミリリットルのアルカリ溶液（０．４Ｍ
炭酸ナトリウム）とＦｏｌｉｎ溶液（フェノール試薬
を蒸留水で５倍稀釈した溶液）とを１ミリリットルの濾
液に加えて、３５℃で２０分間反応させた。その混合溶
液の６６０ｎｍの吸光度を測定した。酵素の一単位（Ｐ
Ｕ）は、ｐＨ７．２に於いて３５℃での分解反応の初期
での１分間当たりミルクカゼインから遊離したチロシン
の１マイクログラムで定義される。
トルの精製酵素溶液（酵素をｐＨ８．０のホウ酸緩衝溶
液−２ｍＭ硫酸カルシウム溶液に溶解させた溶液）を１
ミリリットルの基質溶液（１％カゼイン、１／１５Ｍリ
ン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２））に加えた。この混合溶液
を３５℃で１０分間培養し、２．０ミリリットルの反応
停止液（０．１Ｍ ＴＣＡ，０．２Ｍ酢酸ナトリウム、
０．３Ｍ酢酸）を加え、更に３５℃で３０分間培養し
た。濾過後、５ミリリットルのアルカリ溶液（０．４Ｍ
炭酸ナトリウム）とＦｏｌｉｎ溶液（フェノール試薬
を蒸留水で５倍稀釈した溶液）とを１ミリリットルの濾
液に加えて、３５℃で２０分間反応させた。その混合溶
液の６６０ｎｍの吸光度を測定した。酵素の一単位（Ｐ
Ｕ）は、ｐＨ７．２に於いて３５℃での分解反応の初期
での１分間当たりミルクカゼインから遊離したチロシン
の１マイクログラムで定義される。
【００８８】酵素蛋白質１ｍｇ当たりの吸光度の変化を
比活性として野生型酵素との相対値で表した。結果を表
１に示す。
比活性として野生型酵素との相対値で表した。結果を表
１に示す。
【００８９】Ｚ−ＡＰＭ分解活性は以下の様に求めた。
【００９０】０．５ミリリットルの基質溶液（１０ｍＭ
トリス−マレイン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化カル
シウム、１０ｍＭＺ−ＡＰＭ）に０．５ミリリットルの
精製酵素溶液（１０ｍＭトリス−マレイン酸（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭ塩化カルシウムに酵素を溶解したもの）
を加えた。その混合溶液を３７℃で２０分間反応させた
のち、０．５ミリリットルの反応停止液（０．１Ｍ酢
酸）を加え、続いて１ミリリットルのニンヒドリン溶液
を加えた。１００℃、１５分間処理した後、２ミリリッ
トルの５０％エタノールを加えて、５７０ｎｍの吸光度
を測定した。酵素蛋白質１ｍｇ当たりの吸光度の変化を
比活性として野生型酵素との相対値で表した。結果を表
１に示す。
トリス−マレイン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化カル
シウム、１０ｍＭＺ−ＡＰＭ）に０．５ミリリットルの
精製酵素溶液（１０ｍＭトリス−マレイン酸（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭ塩化カルシウムに酵素を溶解したもの）
を加えた。その混合溶液を３７℃で２０分間反応させた
のち、０．５ミリリットルの反応停止液（０．１Ｍ酢
酸）を加え、続いて１ミリリットルのニンヒドリン溶液
を加えた。１００℃、１５分間処理した後、２ミリリッ
トルの５０％エタノールを加えて、５７０ｎｍの吸光度
を測定した。酵素蛋白質１ｍｇ当たりの吸光度の変化を
比活性として野生型酵素との相対値で表した。結果を表
１に示す。
【００９１】
【表１】
【００９２】野生型プロテア−ゼと比較して、使用した
全ての酵素はＺ−ＡＰＭ分解活性が高いことが判明し
た。
全ての酵素はＺ−ＡＰＭ分解活性が高いことが判明し
た。
【００９３】実施例６（Ｚ−ＡＰＭ合成活性の測定） １４４番目のロイシン残基をセリンに置換した酵素（Ｌ
１４４Ｓ）、１５０番目のアスパラギン酸残基をアスパ
ラギン（Ｄ１５０Ｎ）、ヒスチジン（Ｄ１５０Ｈ），リ
ジンで置換した酵素（Ｄ１５０Ｋ）、１４４番目のロイ
シン残基をセリンに置換し、２２７番目のアスパラギン
残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｎ２２
７Ｈ）、１４４番目のロイシン残基をセリンに置換し、
１５０番目のアスパラギン酸残基をアスパラギンに置換
した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ）、１４４番目のロ
イシン残基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をヒスチジンンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−
Ｄ１５０Ｈ）、１５０番目のアスパラギン酸残基をアス
パラギンに置換し、２２７番目のアスパラギン残基をヒ
スチジンに置換した酵素（Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ）、
１５０番目のアスパラギン酸残基をヒスチジンに置換
し、２２７番目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換
した酵素（Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）、１４４番目のロ
イシン残基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７番目のアスパ
ラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−
Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ）及び１４４番目のロイシン残
基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラギン酸残基
をヒスチジンに置換し、２２７番目のアスパラギン残基
をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ
−Ｎ２２７Ｈ）を使用してＺ−ＡＰＭの合成活性を測定
した。
１４４Ｓ）、１５０番目のアスパラギン酸残基をアスパ
ラギン（Ｄ１５０Ｎ）、ヒスチジン（Ｄ１５０Ｈ），リ
ジンで置換した酵素（Ｄ１５０Ｋ）、１４４番目のロイ
シン残基をセリンに置換し、２２７番目のアスパラギン
残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｎ２２
７Ｈ）、１４４番目のロイシン残基をセリンに置換し、
１５０番目のアスパラギン酸残基をアスパラギンに置換
した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ）、１４４番目のロ
イシン残基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をヒスチジンンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−
Ｄ１５０Ｈ）、１５０番目のアスパラギン酸残基をアス
パラギンに置換し、２２７番目のアスパラギン残基をヒ
スチジンに置換した酵素（Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ）、
１５０番目のアスパラギン酸残基をヒスチジンに置換
し、２２７番目のアスパラギン残基をヒスチジンに置換
した酵素（Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）、１４４番目のロ
イシン残基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をアスパラギンに置換し、２２７番目のアスパ
ラギン残基をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−
Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ）及び１４４番目のロイシン残
基をセリンに置換し、１５０番目のアスパラギン酸残基
をヒスチジンに置換し、２２７番目のアスパラギン残基
をヒスチジンに置換した酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ
−Ｎ２２７Ｈ）を使用してＺ−ＡＰＭの合成活性を測定
した。
【００９４】１ミリリットルの基質溶液（０．１Ｍ ベ
ンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパラギン酸、
０．１Ｍ Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル・塩酸
塩をｐＨ７．０の緩衝液に溶解したもの）に０．１ミリ
リットルの精製酵素溶液（１ｍｇ／ミリリットル）を加
え、混合後、３７℃の水浴で酵素反応を行った。１０、
２０、３０分後にそれぞれ反応液１０マイクロリットル
を採取し、逆相カラムに注入し、高速液体クロマトグラ
フ装置による分析を行った。Ｚ−ＡＰＭの標準物質をも
ちいて、酵素反応によって生じるＺ−ＡＰＭの量を定量
し、酵素蛋白質１ｍｇ当たりの比活性を野生型酵素との
相対値で表した。結果を表２に示す。
ンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパラギン酸、
０．１Ｍ Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル・塩酸
塩をｐＨ７．０の緩衝液に溶解したもの）に０．１ミリ
リットルの精製酵素溶液（１ｍｇ／ミリリットル）を加
え、混合後、３７℃の水浴で酵素反応を行った。１０、
２０、３０分後にそれぞれ反応液１０マイクロリットル
を採取し、逆相カラムに注入し、高速液体クロマトグラ
フ装置による分析を行った。Ｚ−ＡＰＭの標準物質をも
ちいて、酵素反応によって生じるＺ−ＡＰＭの量を定量
し、酵素蛋白質１ｍｇ当たりの比活性を野生型酵素との
相対値で表した。結果を表２に示す。
【００９５】
【表２】
【００９６】野生型プロテア−ゼと比較して、使用した
全ての酵素はＺ−ＡＰＭ合成活性が高いことが判明し
た。
全ての酵素はＺ−ＡＰＭ合成活性が高いことが判明し
た。
【００９７】実施例７ （変異導入酵素のＺ−ＡＰＭ合成に対するｐＨ効果）変
異導入酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ（Ｔ
Ｚ−１）及びＬ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ（Ｔ
Ｚ−２））及び野生型サーモリシン様中性金属プロテア
ーゼのＺ−ＡＰＭ合成に対するｐＨの効果を求めた。ト
リス−マレイン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０−８．０）を使
用する以外は実施例６と同じ方法で測定を実施した。
異導入酵素（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ（Ｔ
Ｚ−１）及びＬ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ（Ｔ
Ｚ−２））及び野生型サーモリシン様中性金属プロテア
ーゼのＺ−ＡＰＭ合成に対するｐＨの効果を求めた。ト
リス−マレイン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０−８．０）を使
用する以外は実施例６と同じ方法で測定を実施した。
【００９８】測定結果を表３に示す。
【００９９】
【表３】
【０１００】活性値はｐＨ７．０での野生型酵素の活性
値に対する相対値で表された。Ｚ−ＡＰＭ合成活性はｐ
Ｈにより大きく影響される。
値に対する相対値で表された。Ｚ−ＡＰＭ合成活性はｐ
Ｈにより大きく影響される。
【０１０１】低いｐＨでは、基質のメチルエステルの加
水分解が起こりにくい為にＺ−ＡＰＭの合成は低いｐＨ
で実施することが望ましい。本発明は低いｐＨでの活性
値が最適ｐＨでの野生型酵素の値よりも大きいことから
上記課題が解決できた。ｐＨ６．０でのＬ１４４Ｓ−Ｄ
１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ（ＴＺ−１）及びＬ１４４Ｓ−Ｄ
１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ（ＴＺ−２）の活性値はｐＨ７．
０での野生型酵素の値よりも非常に高い。
水分解が起こりにくい為にＺ−ＡＰＭの合成は低いｐＨ
で実施することが望ましい。本発明は低いｐＨでの活性
値が最適ｐＨでの野生型酵素の値よりも大きいことから
上記課題が解決できた。ｐＨ６．０でのＬ１４４Ｓ−Ｄ
１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ（ＴＺ−１）及びＬ１４４Ｓ−Ｄ
１５０Ｎ−Ｎ２２７Ｈ（ＴＺ−２）の活性値はｐＨ７．
０での野生型酵素の値よりも非常に高い。
【０１０２】
【発明の効果】本発明における変異体酵素は、Ｚ−ＡＰ
Ｍの分解及びその合成に対して、野生型酵素に比べて有
意にその比活性が向上しており、種々の用途における本
酵素の利用に際し、反応効率の上昇や反応時間の短縮な
どの点で優れた効果を発揮する可能性がある。
Ｍの分解及びその合成に対して、野生型酵素に比べて有
意にその比活性が向上しており、種々の用途における本
酵素の利用に際し、反応効率の上昇や反応時間の短縮な
どの点で優れた効果を発揮する可能性がある。
【０１０３】尚、本発明における配列表１は以下のよう
に示される。
に示される。
【０１０４】［配列表］ 配列番号：１ 配列の長さ：３１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 配列 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys
【図１】プラスミドｐＭＫ４からプラスミドｐＵＣＴＺ
３７を構築する図である。
３７を構築する図である。
【図２】プラスミドｐＭＫ４及びプラスミドｐＵＣＴＺ
３７からプラスミドｐＵＣＴＺ４７を構築する図であ
る。
３７からプラスミドｐＵＣＴＺ４７を構築する図であ
る。
【図３】プラスミドｐＵＣＴＺ４７及びプラスミドｐＵ
Ｂ１１０からプラスミドｐＵＢＴＺ１を構築する図であ
る。
Ｂ１１０からプラスミドｐＵＢＴＺ１を構築する図であ
る。
【図４】プラスミドｐＵＢＴＺ１からｐＵＢＴＺ２を構
築する図である。
築する図である。
【図５】プラスミドｐＭＫ１からｐＵＣＴＺ５５を構築
する図である。
する図である。
【図６】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファージ
Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する図である。
Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する図である。
【図７】プラスミドｐＵＢＴＺ２及びＭ１３ファージＭ
１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ（ｍｕｔａｎｔ）からｐＵＢＴＺ２
（ｍｕｔａｎｔ）を構築する図である。
１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ（ｍｕｔａｎｔ）からｐＵＢＴＺ２
（ｍｕｔａｎｔ）を構築する図である。
【図８】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファージ
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する図である。
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する図である。
【図９】プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ）及びプ
ラスミドｐＵＢＴＺ２（２２７Ｈ）から形質転換体プラ
スミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２
７Ｈ）又は形質転換体プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４
４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を構築する図である。
ラスミドｐＵＢＴＺ２（２２７Ｈ）から形質転換体プラ
スミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｓ−Ｄ１５０Ｎ−Ｎ２２
７Ｈ）又は形質転換体プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４
４Ｓ−Ｄ１５０Ｈ−Ｎ２２７Ｈ）を構築する図である。
フロントページの続き (72)発明者 長尾 洋昌 神奈川県藤沢市湘南台４−26−５ (72)発明者 三沢 孝一 神奈川県横浜市神奈川区白幡向町12−18 (72)発明者 大江 正剛 神奈川県横浜市緑区たちばな台２−７−３ (72)発明者 半谷 友美 神奈川県茅ヶ崎市高田１−１−18 (72)発明者 家亀 晴宇 神奈川県海老名市河原口2389番地 (72)発明者 城所 俊一 神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者 三木 洋一郎 神奈川県相模原市西大沼４−４−１ (72)発明者 遠藤 きみ子 東京都町田市金森1733−10 (72)発明者 和田 昭允 東京都港区赤坂８−11−４
Claims (11)
- 【請求項１】配列表１のアミノ酸配列を有するサーモラ
イシン様中性金属プロテアーゼにおいて、次の群（アミ
ノ末端から、１４４番目のロイシン残基、１５０番目の
アスパラギン酸残基、１８７番目のグルタミン酸残基）
から選ばれた少なくとも１種以上のアミノ酸残基が他の
アミノ酸残基に置換された新規プロテアーゼ。 - 【請求項２】請求項１に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から２２７番目のアスパラギン残基
が他のアミノ酸残基に置換された新規プロテアーゼ。 - 【請求項３】請求項１に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から１４４番目のロイシン残基がセ
リンに置換された新規プロテア−ゼ。 - 【請求項４】請求項１に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から１５０番目のアスパラギン酸残
基がアスパラギン、ヒスチジン又はリジンに置換された
新規プロテア−ゼ。 - 【請求項５】請求項１に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から１８７番目のグルタミン酸残基
がグルタミンに置換された新規プロテア−ゼ。 - 【請求項６】請求項２に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から２２７番目のアスパラギン残基
がヒスチジン、リジン又はアルギニンに置換された新規
プロテア−ゼ。 - 【請求項７】請求項２に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から１４４番目のロイシン残基がセ
リン残基に置換され、１５０番目のアスパラギン酸残基
がヒスチジン残基に置換され、２２７番目のアスパラギ
ン残基がヒスチジン残基に置換された新規プロテア−
ゼ。 - 【請求項８】請求項２に記載された新規プロテア−ゼに
おいて、アミノ末端から１４４番目のロイシン残基がセ
リン残基に置換され、１５０番目のアスパラギン酸残基
がアスパラギン残基に置換され、２２７番目のアスパラ
ギン残基がヒスチジン残基に置換された新規プロテア−
ゼ。 - 【請求項９】ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの分解
又は合成に対しての請求項１〜８に記載された新規プロ
テア−ゼの使用。 - 【請求項１０】請求項１〜８に記載された新規プロテア
−ゼとベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパラギ
ン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを含有する
基質溶液とを接触させることからなるベンジルオキシカ
ルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニ
ンメチルエステルの合成方法。 - 【請求項１１】請求項１〜８に記載された新規プロテア
−ゼとベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを含有する基
質溶液とを接触させることからなるベンジルオキシカル
ボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルの分解方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5045387A JPH06181761A (ja) | 1992-06-08 | 1993-03-05 | 新規プロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-171479 | 1992-06-08 | ||
| JP17147992 | 1992-06-08 | ||
| JP5045387A JPH06181761A (ja) | 1992-06-08 | 1993-03-05 | 新規プロテアーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181761A true JPH06181761A (ja) | 1994-07-05 |
Family
ID=26385362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5045387A Pending JPH06181761A (ja) | 1992-06-08 | 1993-03-05 | 新規プロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06181761A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997021804A1 (fr) * | 1995-12-11 | 1997-06-19 | Sagami Chemical Research Center | Nouvelle protease analogue a la thermolysine et son utilisation |
| JP2006527584A (ja) * | 2003-06-19 | 2006-12-07 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ |
| JP2016527876A (ja) * | 2013-05-29 | 2016-09-15 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規メタロプロテアーゼ |
-
1993
- 1993-03-05 JP JP5045387A patent/JPH06181761A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997021804A1 (fr) * | 1995-12-11 | 1997-06-19 | Sagami Chemical Research Center | Nouvelle protease analogue a la thermolysine et son utilisation |
| JP2006527584A (ja) * | 2003-06-19 | 2006-12-07 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ |
| JP4880453B2 (ja) * | 2003-06-19 | 2012-02-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ |
| JP2016527876A (ja) * | 2013-05-29 | 2016-09-15 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規メタロプロテアーゼ |
| JP2018186821A (ja) * | 2013-05-29 | 2018-11-29 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規メタロプロテアーゼ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100258460B1 (ko) | 안정화 효소 및 세제 조성물 | |
| JPH04228079A (ja) | セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質 | |
| CN110862979B (zh) | 碱性蛋白酶的突变体及其应用 | |
| KR0174271B1 (ko) | 신규 프로테아제 | |
| US5496710A (en) | Protease | |
| KR100344204B1 (ko) | 신규의프로테아제ii | |
| EP0616033B1 (en) | Mutants of a thermostable neutral protease from Bacillus | |
| EP0416967B1 (en) | Novel alkaline protease | |
| JPH06181761A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| JP3396033B2 (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| KR0180749B1 (ko) | 프로테아제 및 그 이용방법 | |
| EP0896056A1 (en) | Novel thermolysin-like protease and use thereof | |
| JPH09255A (ja) | 変異型サーモリシンｙｔ７３及びその遺伝子 | |
| JP2001292772A (ja) | ロドコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子 | |
| JPH11501501A (ja) | バチルス由来の熱安定中性プロテアーゼの変異体 | |
| CA2451528C (en) | Novel aminopeptidase derived from bacillus licheniformis, gene encoding the aminopeptidase, expression vector containing the gene, transformant and method for preparation thereof | |
| JPH0670765A (ja) | プロテアーゼ、それをコードする遺伝子、そのプロテアーゼの製造方法および用途 | |
| JPH05199873A (ja) | 新規プロテア−ゼ | |
| JP4023855B2 (ja) | 耐熱性を増強したグルコースイソメラーゼを提供する方法 | |
| JPH07250679A (ja) | 変異型サーモリシンｔｙ１４０及びその遺伝子 | |
| JP2990280B1 (ja) | アミノペプチダ―ゼ及びその前駆体の遺伝子、該遺伝子を含むベクタ―並びに形質転換体 | |
| JPH09220090A (ja) | 新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途 | |
| JPH05199872A (ja) | 新規プロテア−ゼ | |
| JPH05260968A (ja) | 新規プロテア−ゼ | |
| JPH0591876A (ja) | プロテアーゼ、その製造法および用途 |