JPH05199873A - 新規プロテア−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中性プ
ロテアーゼにおいて、アミノ末端から２２７番目のアス
パラギン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規なプ
ロテアーゼ及びそのアミノ酸残基が、ヒスチジン、リジ
ン又アルギニンである新規プロテアーゼ 【効果】本発明における変異体酵素は、特定の合成ペプ
チド、例えばα−ＡＰＭの前駆体であるＺ−ＡＰＭの分
解活性が著しく高く、種々の用途における本酵素の利用
に際し、反応効率の上昇や反応時間の短縮などの点で優
れた効果を発揮する可能性がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】サ−モリシンは工業的に製造され
ている有用な酵素であり、その用途は洗剤、食品製造、
化粧品等、広範な分野にわたっている。例えば、人工甘
味料の一種であるアスパルテ−ムの前駆体であるベンジ
ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチルフェニルア
ラニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと略する。）の
合成等に使用される。本発明は、サーモリシン様金属プ
ロテアーゼの改良に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】サーモリシンは好熱菌の一種であるバチ
ルス サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoprote
olyticus）の培養上清中に見つけられた金属プロテアー
ゼであり（J. Fermentation Tech.,40,346 (1962) 参
照）、これまで数多くの研究が行われてきた。たとえ
ば、酵素蛋白質の一次構造（Titani K.,et al.,Nature
NewBiol.(1972) 238,35-37)や、三次構造( Holmes, M.
A., Matthews, B.W. J. Mol. Biol.(1982) 160,623-63
9)が明らかにされている。しかし、その遺伝子構造はま
だ報告されていない。ところが最近、バチルス ステア
ロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ) よ
り耐熱性中性プロテアーゼの遺伝子（ｎｐｒＭ）がクロ
ーン化され（Kubo M. and Imanaka T., J.Gen.Microbio
l. (1988) 134,1883-1892)、その塩基配列から推測され
る成熟酵素のアミノ酸配列（配列表１に記載）が、サー
モリシンと極めて類似していることが明らかになった。
以下、本明細書においてはこのｎｐｒＭ遺伝子に由来す
るプロテアーゼを「サーモリシン様金属プロテアーゼ」
と呼ぶ。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本酵素の基質特異性、
至適ｐＨ、物理的安定性等はアミノ酸配列により規定さ
れている。工業用酵素として本酵素の利用範囲を拡大す
るためには、これらの諸性質を利用分野に適するよう改
変しなければならない。一般に蛋白質の高次構造はアミ
ノ酸配列に由来しており、蛋白質の性質を改変するため
にはアミノ酸配列を改変することが必須である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この様な課題を解決する
ために、本発明者らはタンパク質工学の手法を用いて、
上記 Bacillus stearothermophilus 由来のサーモリシ
ン様金属プロテアーゼの改変を行い、本発明を完成する
に至った。すなわち、配列表１のアミノ酸配列を有する
上記サーモリシン様金属プロテアーゼにおいて、アミノ
末端から２２７番目のアスパラギン残基を他のアミノ酸
に置換することにより、新規なプロテアーゼを作成し
た。置換するアミノ酸としては種々のものが考えられる
が、たとえばアルギニン、リジン、ヒスチジン等に置換
した場合に、優れた性質の酵素が得られることがわかっ
た。以下、これらの変異体酵素の作成方法について具体
的に説明する。組換えＤＮＡ技術によるサーモリシン様金属プロテアー
ゼの生産 ｎｐｒ Ｍ遺伝子を枯草菌において発現させる方法が報告
されている(Kubo M.and Imanaka T., J. Bacteriol.(19
89) 171, 4080-4082) 。本報告における、プラスミドｐ
ＭＫ１はｎｐｒＭ遺伝子を含み枯草菌で複製される領域
およびカナマイシン耐性遺伝子を有する。本プラスミド
によって形質転換された枯草菌は培地中に多量のサーモ
リシン様金属プロテアーゼを分泌することが見出だされ
た。この結果からｎｐｒＭ遺伝子は枯草菌においても効
率よく発現されることがわかるが、さらに効率の良いプ
ロモーター等を導入することにより発現量を高めること
は可能であると考えられる。また枯草菌内で複製可能な
他のベクターを用いても同様に本遺伝子を発現させるこ
とができるであろう。ｎｐｒＭ遺伝子への変異導入 クローン化ＤＮＡへの部位特異的な変異導入方法は種々
の方法が報告されている。我々はVandeyarらの方法（Va
ndeyar M.,et al. Gene (1988) 65, 129.) を用いて、
Ｍ１３ファージにｎｐｒＭ遺伝子の全体または一部をク
ローン化して得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、化学合
成したオリゴヌクレオチドを変異プライマーとして、変
異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を作成した。

【０００５】鋳型一本鎖ＤＮＡの作成はたとえば次のよ
うにして行うことができる。図１に示したように、プラ
スミドｐＭＫ１より制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ
で消化して得られる約３．５ｋｂの断片をプラスミドｐ
ＵＣ９にサブクローン化しｐＵＣＴＺ５５なるプラスミ
ドを作成した。さらに図２に示したようにｐＵＣＴＺ５
５よりＳｐｈＩ、ＢｃｌＩで消化して得られる約５５０
ｂｐの断片を、Ｍ１３ファージｍｐ１８にクローン化し
（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）一本鎖ＤＮＡを調製した。

【０００６】変異プライマーは２２７番目のアスパラギ
ン酸残基のコドンを含む鋳型一本鎖ＤＮＡと部分的に相
補性があれば良く、例えば次のようなものが考えられ
る。

【０００７】 置換アミノ酸の種類 ヒスチジン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＧＧ ３´ リジン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ アルギニン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧ ３´ バリン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ アラニン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ フェニルアラニン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ チロシン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ トリプトファン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＴＧＧＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ ロイシン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ イソロイシン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ メチオニン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ トレオニン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ セリン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ グルタミン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ グルタミン酸 ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ アスパラギン酸 ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ グリシン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ システイン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴ ３´ プロリン ５´ ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＧＧｃＧＧＧＧＴ ３´ これらの変異プライマーを用いることにより所望のアミ
ノ酸に置換することができる。部位特異的変異導入を行
った後、変異体Ｍ１３ファージをクローン化し、ＤＮＡ
塩基配列を決定することによって目的のアミノ酸置換が
起こっていることを確認した。変異体Ｍ１３ファージの
二本鎖ＤＮＡから変異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を切り出
し、プラスミドｐＵＣＴＺ５５の相当領域と置換するこ
とにより変異体ｎｐｒＭ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ
ＴＺ５５（ｍｕｔａｎｔ）が得られた。変異体ｎｐｒＭ遺伝子の枯草菌における発現 図３に示したように、まず野性型サーモリシン様金属プ
ロテアーゼの遺伝子の一部を欠失したプラスミドｐＭＫ
８を作成した。これは以下の操作において野性型酵素の
組換体の出現を防ぐために重要な意味を持つ。ｐＭＫ８
およびｐＵＣＴＺ５５（ｍｕｔａｎｔ）をそれぞれＢａ
ｍＨＩで切断し、ＤＮＡリガーゼで連結し、枯草菌を形
質転換することによってｐＭＫ９（ｍｕｔａｎｔ）を作
成した（図４）。プラスミドにより形質転換された枯草
菌は変異体酵素を培地中に分泌発現することができる。

【０００８】分泌された酵素は通常の方法、たとえば疎
水クロマトグラフィーやゲル濾過によって均一に精製す
ることが出来る。変異体酵素の性質 精製された変異体酵素はカゼイン分解活性において、野
性型酵素とほぼ同様の比活性を示したが、α−ＡＰＭの
前駆体であるＺ−ＡＰＭの分解活性を測定したところ、
著しい比活性の上昇が認められた。なお変異体酵素の表
わし方として、例えば２２７番目のアスパラギン残基を
アルギニンに置換したものをＮ２２７Ｒと示した。

【０００９】以下の表１に示す様に、２２７番目のアス
パラギン残基を塩基性アミノ酸であるヒスチジン、リジ
ン、又はアルギニンに置換すると、Ｚ−ＡＰＭ分解の活
性の上昇が認められた。

【００１０】

【表１】 本発明の新規プロテアーゼは、上に詳細に記載したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドのほかに、これと実質上
同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。特
定の酵素活性を有するポリペプチド中の酵素活性に関与
しない領域においてアミノ酸配列に変更を加えても、当
該酵素活性が影響を受けない場合があることは、当業者
により良く知られている。したがって、そのような変更
を含むポリペプチドも、本発明の特徴を保持している限
り、すなわち配列表１において２２７番目のアスパラギ
ン残基を置換したものである限り本発明の範囲に属する
ものである。

【００１１】

【実施例】次に、本発明の実施例を説明するが、これら
の実施例は本発明を何等限定するものでない。

【００１２】実施例１ Bacillus stearothermophilus MK232 株由来のサ−モリ
シン様金属プロテア−ゼ遺伝子、ｎｐｒＭを含むプラス
ミドｐＭＫ１、１μｇを２０μリットルの反応液（５０
ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩化マグ
ネシウム，１００ｍＭ食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）にＰｓｔ
Ｉ５ユニットおよびＢａｍＨＩ５ユニットを加えて３７
℃で２時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−ス
ゲル電気泳動で約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、バ
イオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを用いて
精製した。

【００１３】一方、プラスミドベクタ−ｐＵＣ９、１μ
ｇを含む２０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩化マグネシウム，１０
０ｍＭ 食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ、ＢａｍＨ
Ｉ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。こ
のようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ消化物
を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用いて反応
させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎ
ｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組換体
プラスミド（ｐＵＣＴＺ５５）を得た。

【００１４】組換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５、１μｇ
を含む２０μリットルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩化マグネシウム，１００ｍ
Ｍ食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ、ＢｃｌＩ各５ユ
ニットを加えて３７℃で２時間反応させた。このサンプ
ルを１％アガロ−スゲル電気泳動で約５５０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。

【００１５】一方、ファ−ジベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８、
１μｇを２０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩化マグネシウム，１０
０ｍＭ 食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ、ＢａｍＨ
Ｉ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。こ
のようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−Ｂｃ
ｌＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１８のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ消
化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用いて
反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
し、ｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片を含む組
換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）を得た。

【００１６】得られたＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃから、常法
に従って１本鎖ＤＮＡを調製し、変異の導入に用いた。
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて
作成し、その塩基配列の一例を以下に記す。

【００１７】 ５´−ＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＧＧ−３´ 変異の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビトロミュ
−タゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定に
よって確認した。

【００１８】変異を導入したＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ及
び、ｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを、常法に従って調
整し、それぞれ１μｇを含む２０μリットルの反応液
（５０ｍＭ トリス−塩酸，ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩
化マグネシウム，１００ｍＭ 食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）
にＳｐｈＩ、ＡａｔＩ各５ユニットを加えて３７℃で２
時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−スゲルで
電気泳動しＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ消化物からは、５５０
ベ−スペアのＤＮＡ断片を分離し、ｐＵＣＴＺ５５消化
物からは、５．３キロベ−スペアのＤＮＡ断片を分離
し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを
用いて精製した。このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝
子の変異の導入されたＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片と、ｐＵ
ＣＴＺ５５のＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片を宝酒造社製ＤＮ
Ａライゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子の変
異の導入されたＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組換体
プラスミドｐＵＣＴＺ５５（Ｎ２２７Ｈ）を得た。

【００１９】プラスミドｐＭＫ１、１μｇを含む２０μ
リットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．
５，１０ｍＭ 塩化マグネシウム，１００ｍＭ 食塩，
１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加えて３
７℃で２時間反応させた。ｐＭＫ１消化物を１％アガロ
−スゲルで電気泳動し、１５．８キロベ−スペアのＤＮ
Ａ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。このようにして得られた
ｐＭＫ１のＢａｍＨＩ断片を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−
ションキットを用いて反応させ、常法に従って枯草菌Ｍ
Ｔ−２株（ｔｒｐＣ２ ｌｅｕＣ７ ｈｓｄＲ ｈｓｄ
Ｍ Ｎｐｒ−）に形質転換し、５μｇ／ミリリットルの
カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて
一夜培養し、コロニ−を単離することにより、組換体プ
ラスミドｐＭＫ８を持った形質転換体を得た。これより
定法に従ってプラスミドＤＮＡを調整した。プラスミド
ｐＭＫ８およびｐＵＣＴＺ５５（Ｎ２２７Ｈ）それぞれ
１μｇを２０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩化マグネシウム，１０
０ｍＭ 食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニ
ットを加えて３７℃で２時間反応させた。これらを宝酒
造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用いて反応させ、
常法に従って枯草菌ＭＴ−２株に形質転換し、１％カゼ
イン、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含むＬＢ
寒天培地に塗布し、３７℃にて一夜培養し、ハロー形成
コロニーを単離することにより、組換体プラスミドｐＭ
Ｋ９（Ｎ２２７Ｈ）を持った形質転換体を得た。実施例２ 組換枯草菌ＭＴ−２／ｐＭＫ９（Ｎ２２７Ｈ）の単一コ
ロニーを、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む
ＬＢ培地５ミリリットルで３７℃にて一夜培養したの
ち、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む２ｘＬ
Ｂ培地（２％バクトトリプトン、１％イ−ストエクスト
ラクト、１％食塩）５００ミリリットルに植菌し４０
℃、１８時間培養した。培養液を８０００ｒｐｍにて１
０分間遠心分離し、菌体を除去し、上清に６０％飽和に
なるように硫安を加えて４℃一夜攪拌した。

【００２０】この沈殿を１０ミリリットルの緩衝液（２
０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ９．０、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム）に溶解し、２０ミリリットルのブチルトヨパ−ル
にアプライし、同じ緩衝液で３ミリリットル／分の流速
で溶出、活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、１
５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、沈殿を集め
た。

【００２１】続いて、この沈殿を５ミリリットルの緩衝
液（２０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化
カルシウム）に溶解し、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００
ＳＷ（２１．５ｘ６００ｍｍ）にアプライし、同じ緩衝
液で３ミリリットル／分の流速で溶出、活性画分を集め
精製酵素を得た。実施例３ 基質溶液｛１０ｍＭトリス−マレイン酸（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ Ｚ−ＡＰ
Ｍ｝０．５ミリリットルに精製酵素溶液（１０ｍＭトリ
ス−マレイン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ムに酵素を溶解したもの）０．５ミリリットルを混合し
３７℃、２０分間保温したのち、０．５ミリリットルの
反応停止液（０．１Ｍ酢酸）を加え、続いて１ミリリッ
トルのニンヒドリン溶液を加えた。１００℃、１５分間
処理した後、２ミリリットルの５０％エタノ−ルを加え
て、５７０ｎｍの吸光度を測定した。酵素蛋白質１ｍｇ
当たりの吸光度の変化を比活性として野性型酵素との相
対値で表した。結果はすでに表１に示した。

【００２２】

【発明の効果】本発明における変異体酵素は、特定の合
成ペプチド、例えばα−ＡＰＭの前駆体であるＺ−ＡＰ
Ｍの分解活性が著しく高いものであり、種々の用途にお
ける本酵素の利用に際し、反応効率の上昇や反応時間の
短縮などの点で優れた効果を発揮する可能性がある。

【００２３】尚、本発明における配列表１は以下の様に
表現される。

【００２４】［配列表１］ 配列の長さ：３１６ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＵＣＴＺ
５５を構築する工程図である。

【図２】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファージ
Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する工程図である。

【図３】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＭＫ８を
構築する工程図である。

【図４】プラスミドｐＭＫ８およびプラスミドｐＵＣＴ
Ｚ５５（ｍｕｔａｎｔ）からｐＭＫ９（ｍｕｔａｎｔ）
を構築する工程図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 長尾 洋昌 神奈川県藤沢市湘南台４−26−５ (72)発明者 城所 俊一 神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者 三木 洋一郎 神奈川県相模原市西大沼４−４−１ (72)発明者 遠藤 きみ子 東京都町田市金森1733−10 (72)発明者 和田 昭允 東京都港区赤坂８−11−４

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中
   性プロテアーゼにおいて、アミノ末端から２２７番目の
   アスパラギン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規
   なプロテアーゼ
2. 【請求項２】請求項１に記載された他のアミノ酸残基が
   ヒスチジンである新規なプロテアーゼ
3. 【請求項３】請求項１に記載された他のアミノ酸残基が
   リジンである新規なプロテアーゼ
4. 【請求項４】請求項１に記載された他のアミノ酸残基が
   アルギニンである新規なプロテアーゼ