KR100196785B1 - 신규의 고알칼리성 프로타아제 - Google Patents

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Description

신규의 고알칼리성 프로테아제

제1도는 Bacillus alcalophilus HAl에서 나온 고알칼리성 출발 프로테아제의 구조유전자를 갖는 Aval/Hind III-단편의 DNA-서열 및 출발 프로테아제의 아미노산 서열.

제2도는 플라스미드 pCLEAN0의 제한도.

제3도는 플라스미드 pCLEAN4의 제한도.

제4도는 합성올리고 뉴클레오타이드 I-XV의 DNA-서열과 각각의 제한효소에 대한 제한된 혹은 생성된 인식장소에 대한 언급; 출발 프로테아제의 원래의 DNA-서열에 비교해서 나타난 뉴클레오타이드 변형은 소문자로 변형된 뉴클레오타이드를 표시하였다.

제5도는 벡터 pCLMUTN1의 제한도.

제6도는 벡터 pCLMUTC1의 제한도.

제7도는 벡터 pUB131의 제한도.

제8도는 벡터 pUBC131의 제한도.

제9도는 벡터 pBSREPU(제9a도)이 제한도 및 벡터 pUBC131에서 나온 NcoI-및 Sty I-인식장소(repu-단백질로 표시된 DNA-서열을 함유한다)의 제한을 위한 합성 DNA-서열(제9b도).

제10도는 벡터 pUBC132의 제한도.

제11도는 플라스미드 pALIP의 제한도.

제12도는 플라스미드 pAL1N의 제한도.

제13도는 플라스미드 pAL1C의 제한도.

제14도는 돌연변이된 그리고 돌연변이되지 않은 고알칼리성 프로테아제의 발현을 위한 발현벡터 pAL1NC 형의 제한도.

본 발명은 고알칼리성 프로테아제로 표시한 DNA-서열의의도된 돌연변이에의해서 최적의 고알칼리성 프로테아제, 프로테아제로 표시한 DNA-서열들(유전자), 이들 DNA-서열을 함유하는 벡터, 이들 벡터에의해 형질전환된 미생물, 최적의 고알칼리성 프로테아제 제조방법 및 최적의 프로테아제를 함유하는 세제등에 관한 것이다.

고알칼리성 프로테아제는 여러모로 이용될 수 있는가치있는 공업제품이다. 특히 세제산업에서는 단백질을 함유한 불순물을 제거해 줄 수 있기 때문에 더욱 유용하다. 이들 프로테아제가 유용하기 위해서는 세척조건(수소이온농도, 온도)하에서 단백분해 능력은 물론, 다른 세제의 구성성분 즉 다른 효소나, 계면활성제, 지지체, 표백제, 표백촉진제 및 다른 보조제들과 잘 화합해야 한다. 즉, 이들의 존재하에서도 충분한 안정성과 유용성이 있어야 한다.

고알칼리성 프로테아제는 미생물의 배양에의해 얻어질 수 있는 특이한 효소이며, 미생물은 간균류, 예로서 원하는 고알칼리성 프로테아제를 생산하고 배양배지에 이를 방출시키는 Bacillus alcalophilus를 들 수 있다. 고알칼리성 프로테아제는 B. Subtilis, B. amyloliquefaciens 나 B. licheniformis 등과 같은 간균류에의해 얻어질 수 있는 보통의 알칼리성 프로테아제와는 구별이 된다.

기술적인 면에서도 원하는 특성을 갖는 새로운 고알칼리성 프로테아제를 얻어내기 위하여 많은 노력이 있어 왔으며, 결과로서 일련의 천연산 및 인공적인(유전공학적인)알칼리성 및 고알칼리성 프로테아제가 발견되었다. 그러나 여전히 세척의 특성을 고려해 볼때 새로운 그리고 최적의 고알칼리성 프로테아제에 대한 요구가 있어왔다.

그런 이유에서 최적의 새로운 고알칼리성 프로테아제를 생산하는과제, 즉 여기에 필요한 DNA-서열(유전자)은 돌연변이를 이용해서 생산하고, 또 필요한 벡터와 형질전환된 미생물들을 구하는과제가 주어졌었다.

이들과제는 고알칼리성 프로테아제를 발명하므로써, 또 이에 해당하는 DNA-서열(유전자), 벡터 및 형질전환된 미생물들을 찾아냄으로써 해결되었다.

본 발명은 고알칼리성 프로테아제에 관한 것이며, 이들은 다음의 아미노산 서열을가지는 것이 특징이다. 즉 제1도에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80%의 상동성을가지며 제1도의 18, 27, 42, 49, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 238, 255, 259, 266번 위치의 적어도 하나에서, 바람직하게는 18, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 255, 259, 266번 위치의 하나에서 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 것에의해서 구별되는 것이 특징이다. 고알칼리성 프로테아제는 분자량을 알고 있는 표준물질을 사용한 SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동법에의해서 분자량이 26000-28000g/몰임을 알았다. 고알칼리성 프로테아제는 최적 pH가 10-12.5 이며 이 영역에서 최대의 단백분해능력을 나타낸다. 본 발명에 따른 프로테아제는 실질적으로 원래의 프로테아제와 같은 pH -안정성을 갖는다. 본 발명에 따른 프로테아제의가장 좋은 것은 제1도와 90% 이상, 특히 95% 이상이 상동한 아미노산 서열을가지며 지정된 위치의 하나에서 적어도 한 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 것이다.

제1도의 아미노산 서열과 상동하다고 하는 것은 제1도의 아미노산 서열과 구조적으로 아주가까운 서열을 갖는 것을의미한다. 상동체를 결정하기 위해서는 제1도의 아미노산 서열의 각 해당부분을 비교하는 아미노산 서열과 맞붙여 보고 이에 따라 삭제된 것, 새로이 삽입된 것등을 비교하게 된다. 아미노산 서열에서 일치되는 아미노산의 수는(상동위치) 제1도의 서열에서 함유된 아미노산 전체수에 비교해서 상동체 %로 나타낸다. 아미노산 서열에서의 차이가 나는 것은 아미노산의 변이, 삽입, 삭제등으로 규정될 수 있다.

이에 따라 적어도 제1도와 80%가 상동한 프로테아제에서 얻어진 발명에 따른 고알칼리성 프로테아제에서 제1도와 관련해서 표시된 아미노산 위치는 발명에 따른 프로테아제들의 상동한 위치에 관련된 것은 당연하다.

제1도에 상동한 프로테아제에서 아미노산 배열에 삽입되나 삭제가 있으면 아미노산 위치의 상대적인 위치변동이 있게 되고, 따라서 서로 아미노산 서열의 상동부위에서 서로 대응하는 아미노산 위치의 변호표시는 같을 필요가 없다.

프로테아제에서 돌연변이수는 제한이 있는 것은 아니다. 본 발명에 따른 최적의 프로테아제에서 하나 혹은 그 이상에서, 예로써 1번에서 3번, 바람직하게는 1번 혹은 2번위치의 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환될 수 있다. 지정된 위치의 아미노산에서 하나이상이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 본 발명에 따른 고알칼리성 프로테아제의 예는 적어도 제1도의 아미노산 서열과 80%가 상동한 프로테아제들이며, 지정한 위치의 둘에서 예를들면 27과 115, 27과 135, 96과 266 혹은 107과 238에서 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환되었다. 치환되는 보다 강한 염기성 아미노산으로 아르기닌과 리신이 적합하며 특히 아르기닌이 목적에 부합된다.

본 발명에 따른 최적의 고알칼리성 프로테아제중에서가장 목적에 부합되는 예들은 한편으로는 18번이나 259번의 아미노산이 리신으로 치환된 것들이고, 다른 한편으로는 27, 42, 57, 96, 107, 114, 135, 138, 166, 238, 255 혹은 266번중의 하나가 아르기닌으로 치환된 것들이다.

본 발명에 따른 프로테아제를 얻기 위해서는 관련된 프로테아제로 표식된 구조를 함유하는 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양한다. 여기에서 발현벡터들은 다음에 기술된 방법에의해서 얻는다. 이 방법의 준비로서는 제1도의 프로테아제에 대한 아미노산의 서열 작업이다.

따라서 본 발명은 제1도의 프로테아제에 대한 아미노산의 서열작업방법, 고알칼리성 프로테아제의 획득이나 구성에 아주 중요한 형질전환된 미생물, 발현벡터들 및 프로테아제 구조유전자(즉, 프로테아제로 표시된 DNA-서열)들을 망라한다.

발명에 따른 DNA-서열은 제1도에 나타난 아미노산 서열과 적어도 80%가 상동한 것이 특징적이며, 또 제1도의 18, 27, 42, 49, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 238, 255, 259, 266번 위치의 적어도 하나에서, 바람직하게는 18, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 255, 266번 위치의 하나에서, 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 것에의해서 구별되는 것이 특징적이다.

제1도의 아미노산 서열과 90% 이상, 특히 95% 이상 상동한 서열을 갖는 고알칼리성 프로테아제로 표식한 DNA-서열이 우선적이며, 여기에서 적어도 지시된 위치의 하나에서 한 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된다. 발명에 따른 DNA-서열은 지정된 위치의 아미노산 즉 1-3번, 바람직하게는 1 혹은 2번 위치가 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환될 수 있다. 하나이상, 예로써 2개의 아미노산이 치환된 예들도 고알칼리성 프로테아제에서 이미 언급한 바있다.

발명에 따른 DNA-서열에서 관련 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산인 리신이나 아르기닌, 특히 아르기닌으로 치환된 것이 특징적이다. 발명에 따른 DNA서열중에서가장 목적에 부합되는 예들은 한편으로는 18번이나 259번의 아미노산이 리신으로 치환된 것들이고, 다른 한편으로는 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 255 혹은 266번중의 하나가 아르기닌으로 치환된 것들이다.

상기 DNA-서열들은 미생물의 형질전환에 적합한 발명에의한 벡터에 함유되어 있다. 이들 벡터는 고알칼리성 프로테아제의 제조에 응용되는 미생물들의 형질전환에 적합한 발현벡터일 수 있다. 발명에 따른 프로테아제의 대량생산을 위해서는 상기 DNA-서열을 목적에 따라 생산에 이용하는 미생물의 게놈에 삽입시킬 수 있다.

벡터로서는 플라스미드가 바람직하다. 여기에서 이용되는 플라스미드의 한 그룹은 대장균에서 베타-락타마제(마아커: 예 앰피실린-저항성)와 대장균 복제의 기원(대장균에서 플라스미드의 증식을 위해 필요한 유전정보를 함유한다)으로 표식한 DNA-서열, Bacillus subtilis에서 항생제 저항성(마아카: 예 카나마이신-혹은 네오마이신 저항성)과 간균 복제의 기원(간균류에서 플라스미드의 증식을 위해 필요한 유전정보를 함유한다)으로 표식한 DNA-서열, 프로모터서열 그리고 발명에의한 프로테아제를 위한 프리프로-서열 및 발명에 따른 DNA-서열의 하나를 함유한다. 후에 기술하는 방법에 따라 얻을 수 있는 플라스미드는 발현 벡터로서 아주 우수하다. pALINC로 표시되는 발현벡터에 대한 한 예는 제14도의 제한도에 표시되어 있다.

본 발명의의한 또다른 벡터는 상기 발현벡터의 전구체이다. 한 돌연변이체에서 본 발명에의한 프로테아제를 암호하는 본 발명의 돌연변이된 서열을 제외하고는 상기 발현벡터에 함유되어 있는 모든 DAN 서열을 함유한다. 프로테아제-DNA-서열의 장소는 여기서 합성된 링커로 연결되고 이는 적합한 제한효소로 전체적으로 혹은 부분적으로 절단하여 제거할 수 있다. 잔류되어 있는 벡터 부위의 계속적인 재조합에서는 프로테아제-DNA-서열로 대치된다. pALIP로 표시되는 그러한 발현벡터의 전구체에 대한 예가 제11도의 제한도에 표시되어 있다. 합성링커는 제한장소 NcoI(1207)의 예에서 제한장소 XbaI(1213)과 Asp 718(1219)를 넣어서 제한장소 Hind III(1225)까지 다다른다.

또다른 돌연변이체에서 발현벡터 전구체는 추가적으로 돌연변이가 일어날 수 없는 프로테아제-DNA-서열의 부위를 이미 갖고 있다. 이러한 벡터는 예를들어 프로테아제-DNA의 돌연변이가 프로테아제 구조유전자의 C-말단 혹은 N-말단의 반에서 아미노산의 치환에의해서 수반되는지의 여하에 따라서 프로테아제-DNA의 N 혹은 C-말단반을 갖고 있다. 그러한 발현벡터-전구체는 합성링커의 일부를 돌연변이하지 않은 프로테아제 구조유전자의 N-혹은 C-말단의 반을 교환함으로써 pALIP 형의 발현벡터 전구체에서 얻을 수 있다. pALIN 으로 표시한(벡터 PALIP에서 합성링커의 NcoI/XbaI 부분이 대치된 프로테아제 구조유전자의 돌연변이 하지 않은 N-말단반을 함유한다) 혹은 pALIC 으로 표시한(벡터 pALIP에서 합성링커의 XbaI/Asp 718 부분이 대치된 돌연변이하지 않은 C-말단반을 함유한다) 완전한 발현벡터의 전구체에 대한 예는 제12도 및 제13도의 제한도에 표시되어 있다.

본 발명에 따른 벡터로서 또 파게미드를 들 수 있는데, 이것은 프로테아제 구조유전자의 돌연변이된 N-혹은 C-말단반을 얻기 위해 이용이 된다. 파게미드는 적절한 제한효소로 절단을 하고 고알칼리성 출발 프로테아제의 프로테아제 구조유전자의 반으로 재조합을 통해서 프로테아제에 해당하는 프로모터나 프레프로-DNA-서열을 포함하는 N-말단의 반이나 혹은 프로테아제 구조유전자의 C-말단반을 도입하는데 중요하다.

pCLMUTN 1로 표시한(해당의 프레프로-및 프로모터 배열을 포함해서 고알칼리성 출발 프로테아제 구조유전자의 돌연변이하지 않은 N-말단반을 함유한다; 혹은 pCLMUTC 1로 표시한(고알칼리성 출발 프로테아제 구조유전자의 비돌연변이 C-말단반을 함유한다)이들 벡터에 대한 예는 제5도와 제6도에 표시되어 있다.

본 발명에 따른 벡터로서 또 클론-및 발현벡터를 포함하는 플라스미드를 들 수 있으며, 이들은 한편으로는 고알칼리성 출발 프로테아제 구조유전자의 분리, 복제, 배열에 중요하며, 또 한편으로는 전체 프로테아제 구조유전자의 원천으로나 상기 벡터의 구성에 필요한 부분의 원천으로서 역할을 하고 있다. 이들 벡터들은 간균에서 항생물질 저항성과 복제의 기원 으로 표식된 DNA-서열을 함유하고, 또 고알칼리성 초기 프로테아제의 프로모터-, 프레프로-및 DNA-서열을 함유한다. pCLEAN0 및 pCLEAN4로 표시한 이런 플라스미드의 예들은 제한도 제2도 및 제3도에 표시되어 있다.

본 발명에 따른 미생물들은 상기벡터들 중 하나에의해 형질전환된 것이 특징적이다. 벡터의 정보를 표출해 낼 수 있는 모든 미생물은 적합하다고 할 수 있다. 한편으로는 본 발명에 따른 프로테아제의 생산에 적합하게 형질전환된 미생물들, 다른 한편으로는 후에 기술하는 서열화 방법과 DNA-서열-돌연변이 방법에의해 처음 생성된 그런 형질전환이 된 미생물들은 본 발명에 따른 미생물에 속한다. 프로테아제 생산을 위해 형질전환된 미생물을 얻기 위해서 발현벡터로 형질전환에 적합한 미생물 및 고알칼리성 프로테아제의 생산에 적합한 미생물을 이용한다. 여기에는 프로테아제를 생성하는 세균, 우선적으로 간균류가 해당되며, 프로테아제를 생산하지는 못하지만 형질전환에의해 이런 능력에 달하며 본 발명에 따른 발현벡터로 형질전환에 적합한 미생물들은 여기에 해당된다. 특히 알칼리성 혹은 고알칼리성 프로테아제를 생성하는 세균 및 본 발명에 따른 발현벡터로 형질전환이 되는 프로테아제 결핍 돌연변이주가 우선적이다; 즉 Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis 및 Bacillus amyloliquefaciens 같은 간균류가 해당된다. 다른 본 발명에 따른 미생물은 본 발명에 따른 벡터로 대장균류의 형질전환된 세균들이다. 이들 미생물은 특히 본 발명에 따른 벡터의 구성을 위해 이용되며, 여기서 이들은 이들 벡터의 선별 및 복제를 위해 일한다. 또 이들은 돌연변이 및 서열화 작업에 이용되며 여기서 한가닥의 DNA-서열을 얻는데 기여한다.

적어도 고알칼리성 프로테아제를 하나 함유하는 세제도 본 발명에 속한다. 이미 알려진 프로테아제에 비해 새로운 특성을 갖는 새로운 고알칼리성 프로테아제는 이용되는 고알칼리성 프로테아제의 특별히 필요한 특성에 따라서(세척력, 온도 안정성, 다른 성분과의 친화성) 이용되어 질 수 있으며, 그때마다 특별한 세제조성을 위해 적합한 프로테아제가 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 프로테아제는 세제 구성성분으로, 특히 분말세제 조성에 단독으로나 혹은 필요에 따라 서로 혼합해서 이용될 수 있으며, 경우에 따라서 일반적인 세제효소, 즉 아밀라제, 라파제, 펙틴아제, 뉴클레아제, 산화환원효소등과 혼합해서 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 프로테아제는 세제 조성에서 세제 효소에 일반적인 양을 특히 중량대비 3% 까지(전체 조성의 건조물질에 대한 양) 바람직하게는 0.2-1.5% 까지 이용될 수 있다.

이미 언급한 세제 효소들 이외에도 본 발명에의한 세제는 계면활성제, 표백제, 지지제(구성물질) 및 세제의 성분에 일반적인 보조제를 일반적인 양으로 함유할 수 있다. 보조 성분으로서 강화제, 효소안정제, 불순물 운반제, 혼합개선제, 착화물 형성제, 비누거품 조정제 및 광학적 반사체, 불투명제, 부식억제제, 정전기제거제, 염료, 세균제, 연화촉진제,과산연화제 전구체 같은 첨가제를 들 수 있다.

본 발명에 따른 세제조성은 건조물질에 대한 조성, 즉

a) 적어도 장력제 혹은 장력제 혼합물의 5 중량%, 예를들어 10-50 중량%.

b) 지지제 혹은 지지제 혼합물의 40 중량%.

c) 연화제 혹은 연화제 혼합물, 바람직하게는 나트륨과 붕산염사수화물이나 나트륨가 붕산염-일수화물과 같은과붕산염의 40% 까지.

d) 본 발명에 따른 프로테아제의 적어도 3% 까지.

e) 보조제 같은 기타 성분은 100 중량%를 함유한다.

이런 세제조성은 보통의 방법으로 작성될 수 있다. 본 발명에 따른 프로테아제는과립, 환제등의 형태로, 경우에 따라서는 피막을 해서 일반적인 방법으로 세제조성의 다른 성분들과 혼합될 수 있다.

본 발명은 또 다음의 DNA-서열을 갖는 벡터를 함유하고 있는 형질전환된 미생물로 최적의 고알칼리성 프로테아제를 제조하는 방법도 포함하고 있다; DNA-서열은 제1도에 나타낸 초기 프로테아제의 아미노산 배열과 적어도 80%가 상동하며 제1도의 18, 27, 42, 49, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 238, 255, 259, 266번 위치의 적어도 하나에서, 바람직하게는 18, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 259, 266번 위치의 하나에서 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환되어 있는 것이다. 본 발명에 따른 형질전환된 미생물을 배양하고 그리고 이 배양배지에서 제1도의 출발 프로테아제의 아미노산 서열과 비교해서 적어도 전술한 위치의 하나에서 보다 강한 염기성 아미노산으로 한 아미노산이 치환된 서열을 갖는 최적의 고알칼리성 프로테아제를 분리해 낸다. 이 방법에서 바람직하게는 다음의 미생물을 이용한다. 즉 이 미생물은 제1도의 아미노산 서열과 90% 이상, 특히 95% 이상이 상동하며, 지정된 위치의 적어도 하나에서 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 DNA-서열을 갖는 벡터를 함유한다.

전술한 방법에 이용되는 미생물을 생산키 위해서 다음의 일들이 수행되어야 한다.

a) 먼저 제1도의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 이상, 특히 95% 이상 상동한 배열을 갖는 고알칼리성 프로테아제를 생성하는 적당한 세균에서 프로테아제로 표시된 DNA-서열(즉 프로테아제 구조유전자)을 분리해 내고,

b) DNA-서열에 대한 뉴클레오타이드 순번을 결정하고,

c) 알게된 DNA-서열에 돌연변이된 DNA-서열이 출발 프로테아제 아미노산의 전술한 위치에서 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 고알칼리성 프로테아제로 표식되도록 돌연변이(포인트돌연변이)를 야기시킨다.

d) 다음에 돌연변이된 DNA-서열의 도움을 받아 발현벡터를 생산하고,

e) 돌연변이된 고알칼리성 프로테아제의 제조에 이용되는 적당한 미생물에 얻어진 발현벡터를 형질전환시킨다.

본 발명에 따른 고알칼리성 프로테아제의 형성 및 획득을 위한 각 단계 및 여기에 얻어진, 부분적으로는 발명에 해당하는 부산물, 즉 DNA-서열, 벡터, 특히 발현벡터, 그리고 형질전환된 미생물들은 다음에 또 상세히 기술된다.

제1도의 아미노산 서열과 적어도 80%가 상동한 고알칼리성 프로테아제 아미노산 서열로 표식된 구조유전자는 알려진 일반적인 방법으로 얻을 수 있다. 이를 위해서 고알칼리성 프로테아제를 생산하는 세균(기증 -박테리아(donor bacterium)), 특히 간균류에서 염색체 DNA를 알려진 방법에 따라 분리해 내고, 적절한 제한효소로 부분가수분해시킨다. 제한효소는 DNA의 각 뉴클레오타이드 결합물질사이에 있는 인산디에스테르 결합을 절단하여 기질특이성 이중나선 DNA를 분해시키는 효소이다. 모든 제한효소는 DNA의 특정 염기서열을 인식하는 능력이 있고, 염기서열에는 해당 제한효소의 활성을 위한 작용점(절단부위)이 표시되어 있다. 이중나선 DNA의 절단때에(제한) 어떤 제한효소는 특이하게 소위 돌출말단 이 생기게 되며, 이는 특정조건하에서 서로 혹은 해당의(보충의) 돌출말단과 다른 방법으로 얻어진 DNA-단편과 결합되게 된다(재조합). 다른 제한효소로 절단때에 평활말단을 갖는 DNA-이중나선이 생성된다. 평활말단을 갖는 DNA-이중나선은 마찬가지로 평활말단을 갖는 원하는 이중나선과 재결합될 수 있다.

기증-DNA의 얻어진 제한단편은 겔-전기영동법에의해 크기에 따라 분리될 수 있고 적절한 이중나선 벡터-DNA를 갖는 원하는 크기의 단편은 재조합될 수 있다.

벡터는 운반분자로서 숙주 세포에서 외부 DNA의 유입을 위해 적합한 DNA-분자이며, 자가복제능력이 있으며, 경우에 따라서는 소위 마아커를 갖고 있다. 마아커는 DNA-단편으로서 일정한 관찰할 수 있는 특성(예, 항생물질-저항성)이 표식되어 있으며, 형질전환 미생물의 선택에 기여한다. 자주 이용되는 벡터는 소위 플라스미드이다. 즉 염색체 외부의 둥근모양의 이중나선의 세균-DNA로써, 적당한 방법으로 다른 미생물에 도입시킬 수 있으며 거기서 증식할 수도 있다.

생체외에서 재조합된 DNA로(벡터+기증 DNA의 제한단편)세균, 바람직하게는 간균류를 형질전환시킬 수 있으며, 알려진 마아커 특성(예, 네오마이신-저항성)에 따라 형질전환체를 선택할 수 있다. 이렇게 해서 클론, 즉 유전적으로 상동한 형질전환체를 얻을 수 있다. 이들 형질전환체에서 증식된 프로테아제를 분비하는 것을 단백질을 함유하는 판에서 찾아내고 분리해 낼 수 있다. 프로테아제 활성을 갖는 클론에서 마침내 형질전환체에 도입한 플라스미드-DNA를 분리해 낸다. 그리고 세균의 새로운 형질전환에의해서 프로테아제 활성이 플라스미드와 관련된 것인지, 즉 프로테아제 활성이 마아커 특성과 연결된 것인지 조사한다.

그렇게 분리된 플라스미드는 알려진 제한장소를 갖는 벡터-DNA이외에 원하는 적절한 고알칼리성 출발 프로테아제의 구조유전자와 기타의 것, 즉 여기서는 필요치 않은 기증자-세균에서 온 DNA-서열등을 함유한다. pCLEAN0로 표시한 그런 벡터의 예가 제한도 제2도에 표시되어 있다.

적당한 고알칼리성 프로테아제의 구조유전자의 서열화 작업에 효율적인 방법으로 다음 방법이 추천된다; 즉 서열화 작업이전에 기증자-DNA-서열에서 온 추가의 불필요한 DNA-서열을 제거하고 실질적으로 프로테아제 구조유전자로 감축한다. 이를 위해서 예를 들어 구조유전자와 추가의 DNA-서열을 갖는 플라스미드는 여러 제한엔도 뉴클레아제로 잘라지고, 얻어진 DNA-단편은 겔-전기영동법으로 크기에 따라 분리되며, 밝혀진 표준 밴드에 따라 제한도가 작성된다. 기증자-DNA-서열범주에 있는 제한장소가 조사된다. 플라스미드 제한도에 대한 지식으로 선택한 제한효소로 절단하여 기증자-DNA-서열에서 나온 DNA-단편을 끄집어낼 수 있게 되며, 이 단편에는 프레-및 프로-단위, 유전자 발현에 필요한 프로모터-단위 그리고 고알칼리성 프로테아제등에 대한 구조유전자를 포함한다.

크기에 있어 감소된 기증자-DNA-서열을 적절한 벡터에 재구성하므로써 새로운, 발현될 수 있는 벡터가 얻어지며, 세균을 특히 간균류를 이 벡터로 형질전환시키고, 얻어진 형질전환체를 배양하고 프로테아제 활성을 조사하므로써 고알칼리성 출발 프로테아제의 발현능력을 검사할 수 있다. PCLEAN4로 표시한 그런 감소된 벡터에 대한 예가 제한도 제3도에 표시되어 있다.

프로테아제 구조유전자의 뉴클레오타이드 서열 결정을 위해서(서열화) 먼저 전술한 벡터를 적당한 미생물에 발현케 하고 프로테아제 유전자를 분리해 낸다. 이것을 파게미드에 재클론화시키고, 얻어진 파게미드는 적당한 미생물, 예로서 대장균에 형질전환시키고, 형질전환체의 배양을 통해서 단일나선의 프로테아제를 함유하는 DNA를 생산한다. 형성된 단일나선의 DNA를 분리하고 서열화 작업을 수행한다. 서열작업은 다음의 알려진 방법에 따라 수행한다; 즉 예를들어 유전자가 있는 프로테아제 단일나선-DNA를 맥샴 및 길버트법에 따라 염기 특이적으로 부분적인 화학적 분해를 통해서(1980, Methods in Enzymology, Grossmann L., Moldave K., eds., Academic press Inc. New York and London, vol. 65 499), 혹은 프로테아제 유전자가 있는 단일나선 DNA를 생거 및 브라운리의 디데옥시-사슬말단방법에 따라 보족의 DNA-나선부분의 부분합성을 위한 기질로서 이용하므로써(1977, Proc. Natal. Acad. Sci. USA74; 5473) 연구된 뉴클레오타이드 서열은 이제 유전코드에의해(3개의 단어=코돈은 특정아미노산을 나타낸다)프로테아제의 아미노산 서열로 번역된다. 성숙한 프로테아제 효소(예, 프레-나 프로-단위가 없는 효소)에 대한 아미노산 서열의 시작점을 결정키 위해 성숙한 프로테아제의 N-말단에 펩타이드에 아미노산 서열을 결정키 위한 알려진 방법으로 아미노산 순서의 짧은 단편을 확정한다. 알려진 N-말단 아미노산 서열을 유전코드로 위에 언급한 뉴클레오타이드 순서의 해당부위에 배열하고 이렇게 해서 성숙 프로테아제로 표식한 DNA-서열의 시작점이 확정된다. 프로테아제의 다음의 아미노산 순서는 유전부호로 부터 계속적인 아미노산 서열을 통해서 DNA-서열에서 알게 된다.

발명에 따라서 프로테아제로 표식된 DNA-서열은 해당코돈의 치환에의해 돌연변이가 일어나며, 최적의 고알칼리성 프로테아제로 표시된 돌연변이를 한 DNA-서열은 제1도 아미노산 서열의 18, 27, 42, 49, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 238, 255, 259, 266 번 위치의 적어도 하나에서, 바람직하게는 18, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 255, 259, 266 번 위치의 적어도 하나에서 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된다.

본 발명에 따른 치환될 수 있는 아미노산은 프로테아제 분자의 표면 부위에서 프로테아제의 촉매작용에의한 중심의 치환에의해서 프로테아제 분자의 2차-및 3차 구조의 유지에 중요한 중심점은 영향을 받지 않는 위치에 존재한다.

본 발명에 따른 최적의 고알칼리성 프로테아제는 최적의 pH가 10-12.5이며 출발 프로테아제에 비교해서 pH에 따른 안정성에 변화가 없으며 더구나 특정조건하에서(세제형태, 온도등) 증강된 세척특성을 나타낸다.

고알칼리성 프로테아제로 표시된 DNA에서 포인트 돌연변이는 지정된 돌연변이를 위한 일반적인 알려진 방법에의한다. 적절한 벡터에서(파게미드), 예로써 제5도의 pCLMUTN1이나 제6도의 pCLMUTC1에서 경우에 따라서는 헬퍼-파겐의 도움으로 환상의 단일나선-DNA가 생성되며, 여기에는 전체의 구조유전자나 혹은 우선적으로 돌연변이를 위도한 원래 프로테아제 구조유전자의 일부(예로써 N-말단이나 C-말단)가 함유되어 있다. 이 환상의 단일나선 DNA로 합성한 하이브리드화 능력이 있는 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화시킨다. 이 올리고뉴클레오타이드는 원하는 포인트 돌연변이 장소에 뉴클레오타이드 구성물질이 함유되어 있으며 이 뉴클레오타이드 구성물질은 해당코돈이 이 위치에 있는 원래의 아미노산에 대해서 보다 강한 염기성 아미노산, 즉 아르기닌이나 리신으로 표시되어 있다. 또 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화 되는 원래의 뉴클레오타이드 서열에 대해서 하나나 혹은 몇개의 뉴클레오타이드 구성물질에의해서 변화되어서, 원래 아미노산 서열의 코드는 유전코드의 변질되는 정도에서 유지되지만, 원래의 프로테아제-뉴클레오타이드 서열에서는 합성올리고 뉴클레오타이드에서 경우에 따라 존재하는 제한장소가 없어지거나 합성 올리고뉴클레오타이드에서 다른 제한 장소가 도입된다. 떨어져 나간 혹은 도입된 제한장소는 후에 적절한 제한 엔도 뉴클레아제로 출발형태 -DNA-서열에 비교해서 돌연변이체-DNA-서열의 확인에 도움이 된다. 이 변이체에서의도된 돌연변이 방법으로 우라실화된 단일나선 DNA가 주형으로 생성되며 합성 올리고 뉴클레오타이드로 하이브리드화 하는데 이용된다.의도된 돌연변이 반응이 끝난후에 돌연변이한 DNA-나선(벡터)을 생산키위한 주형으로 기여하는 우라실 함유 DNA-단일나선은 우라실-N-글루코실라제 처리로 돌연변이체의 발현성의 선택에 대한 필요도 없이 제거될 수 있다. 글루코실라제 처리는 분리한 효소나 돌연변이된 벡터-DNA로 형질전환된 우라실-N-글루코실라제 활성이 있는 적당한 미생물로 수행될 수 있다.

하이브리드화에의해 얻어진 부분적 이중나선 DNA-서열을 완전한 이중나선으로 하는 것은 필요한 뉴클레오타이드를 첨가하거나 또는 DNA-폴리머라제나 DNA-연결효소 처리로가능하다. 생성된 환상의 이중나선의 DNA-서열은 계속해서 적절한 미생물에서 벡터로서 형질전환이 일어나고 충분히 복제된 후에 돌연변이된 DNA-서열은 단일의 제한효소-인식장소를 통해 확인되고 분리된다. 우라실화된 단일나선 DNA가 이용되면, 돌연변이 방법으로 생성된 이중나선-벡터의 특히 돌연변이된, 우라실화되지 않는 DNA-나선이 증식하는 대장균종에서 복제가 일어난다. 이것에의해서 돌연변이된 DNA-벡터의 선택이 용이하게 된다.

의도된 돌연변이에 필요한 합성 올리고 뉴클레오타이드는 알려진 방법에 따라 만들어진다. 예로써, 올리고 뉴클레오타이드는 보카쥬, S.L. 그리고 카루더스 M.H.(1918. Tetrahedron Letters 22, 1859-1862)방법에 따라 사이클론 합성기에서

-시안노-에틸-인산아미데이드로 만들어진다. 얻어진 올리고 뉴클레오타이드는 예를들어 폴리아클릴 아마이드-겔에서 용출하거나 경우에 따라서 계속해서 쎄파덱스칼럼으로 탈염한 후에 다음 목적으로 사용한다. 합성 올리고 뉴클레오타이드는 전술한 돌연변이 방법에서 DNA-폴리머라제에 대한 프라이머로 기여한다. 합성 올리고 뉴클레오타이드 서열은 7-10 아미노산으로 표식된 20-30개의 뉴클레오타이드 구성물질을 함유한다. 물론 상기의 하이브리드화에서 더 긴 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 것도가능하지만 짧은 길이의 합성 올리고 뉴클레오타이드도 충분한 하이브리드화 능력을 발휘하는 한 더 큰 장점은 없다. 그러나 인접위치에서 2 혹은 그 이상의 돌연변이가 도입되어져야 할 때는 보다 긴 뉴클레오타이드 서열이 고려된다. 올리고 뉴클레오타이드는 자체로서 단일 뉴클레오타이드에서 합성되거나, 적절한 보다 짧은 올리고 뉴클레오타이드 서열로 부터 합성될 수도 있다. 그러나 이것은 꼭 필요한 것은 아니다. 왜냐하면 2 혹은 그 이상의 돌연변이 역시 예를 든다면 프로테아제-DNA의 N-말단 혹은 C-말단에서 2 혹은 그 이상의 적당한 올리고 뉴클레오타이드 서열로 수행될 수 있기 때문이다. 게다가 이중돌연변이는 역시 본 발명에 따른 고알칼리성 프로테아제의 C-말단 및 N-말단으로 표식된 DNA-단편의 돌연변이된 C-말단과 N-말단을 조합하므로서 생성될 수 있다.

상기한 방법에 따라 수행된의도된 돌연변이에서 얻어진 둥근모양의 이중나선의 DNA-서열은 돌연변이된 벡터에 해당하며, 여기에서 적절한 제한효소 처리로 경우에 따라서 전체 돌연변이된 프로테아제-구조유전자나 프로테아제 구조유전자의 돌연변이된 부분단편을 끄집어 낼 수 있고 적절한 발현벡터에 도입시킬 수 있다(재클론화). 이 발현벡터론 적절한 미생물, 예로써 간균류를 형질전환시키고, 적당한 조건하에서 돌연변이한 고알칼리성 프로테아제의 발현 및 획득을 위해 배양시킨다.

본 발명에서는 우선적으로의도된 돌연변이를 위해서 전체의 구조유전자를 이용하는 것이 아니고 돌연변이가 일어나야만 되는 구조유전자의 일부분을 이용한다. 이를 위해서 구조유전자의 복제에 기여하는 벡터에서 예를들어 적당한 제한효소를 갖는 구조유전자의 N-말단 혹은 C-말단반을 끄집어 내고 적당한 파게미드에 클론화 시킨다. 이렇게 해서 프로테아제 구조유전자의 N-말단이나 혹은 C-말단반을 함유하는 벡터를 얻게 되고 적당한 미생물, 예 대장균에 먼저 충분히 복제해서 전술한의도된 돌연변이를 시킨다. 구조유전자 일부분에 대한 돌연변이는 보다 짧은 단일나선-DNA-서열을 이용할 수 있는 장점이 있으며 이렇게 하면 부분적인 DNA-이중나선에 합성 올리고 뉴클레오타이드로 하이브리드화 단계후에 실질적으로 전체의 DNA-서열을 이용할 때보다 더 적은 뉴클레오타이드를 보충해도 된다. 이렇게 해서 합성에 대한 낭비와 이외에도 돌연변이가 우연히 생기는 위험성이 감소된다. 이외에도 프로테아제-DNA-서열의 돌연변이된 N-말단과 C-말단반을 조합해서 쉽게 프로테아제-DNA-서열에서 이중돌연변이를 생성케 할 수 있다.

돌연변이된 DNA-서열은 돌연변이 생성에 기여하는 콜론화 벡터로 부터 적당한 제한효소로 끄집어 낼 수 있고 고알칼리성 프로테아제의 발현에 필요한 발현벡터의 전구체인 해당의 제한장소를 갖고 있는 벡터에 도입될 수 있다. 이 벡터는 적당한 제한장소 이외에도(예, 합성링커로 부터) 숙주미생물에서 프로테아제 발현에 필요한 조절서열, 신호서열, 프로모터서열 및 프로테아제의 프리-및 프로단위로 표식된 DNA-서열을 갖고 있다.

이러한 벡터에 돌연변이된 DNA-서열의 재클론화로써 최적의 고알칼리성 프로테아제에 대한 발현벡터를 얻을 수 있다. 발현벡터의 전구체에 돌연변이된 DNA-서열이 도입되는 것은 적절한 판독 격자를 갖는 발현벡터가 생성되어 수행된다. 이때 프로테아제로 표식된 DNA-서열의 돌연변이된 부분단편은 예를들어 C-말단이나 N-말단단편은 벡터를 함유하고 있으며 돌연변이되지 않은 혹은 돌연변이된(다중돌연변이)부분단편에 도입된다; 혹은 프로테아제-DNA-서열의 어떤 부분단편도 함유하지 않는 벡터에 프로테아제로 표식된 전체 돌연변이된 DNA-서열이 도입된다. 그러한 것에 대한 예는, 발현벡터의 전구벡터를 함유하는 돌연변이되지 않은 혹은 또 돌연변이된 DNA-서열의 부분단편은 pALIN 및 pALIC로 표시된 벡터들이며, 제12도 및 제13도의 제한도에 표시되어 있다. 프로테아제-DNA-서열의 어느 부분도 함유치 않는 벡터는 제한도 제11도에 있는 벡터 pALIP 이다.

발명에 우선적인 돌연변이체(C-말단반에서난 혹은 N-말단반에서의 돌연변이)에 대한 발현벡터 전구체는 예를들어 다음과 같이 얻어진다. 먼저 간균-플라스미드에 폴리클론화 장소를 도입하고, 이렇게 얻어진 플라스미드는 제한이 되며 그리고 마아커 및 복제를 위해 중요한 서열을 함유한 대장균-플라스미드 단편과 결합된다. 후에 방해가 될지도 모르는 제한장소는 경우에 따라서의도된 돌연변이에의해 제거한다. 이렇게 해서 얻은 플라스미드에서 새로운 벡터가 얻어지며, 이 벡터는 간균-플라스미드와 대장균-플라스미드에서 복제에 기여하는 DNA-서열, 프로모터의 DNA-서열, 프로테아제의 프리-프로서열로 표식된 DNA-서열(제3도의 플라스미드 pCLEAN4에 얻는다) 및 합성링커를 함유한다. 이러한 플라스미드에 대한 예는 pALIP로 표시되어 제한도 제11도에 표시되어 있다. 이때 합성링커는 적당한 제한효소로 절단후에 전체의 초기구조유전자와 혹은 전체 돌연변이된 구조유전자와 혹은 돌연변이된 혹은 돌연변이되지 않은 구조유전자의 부분구조와 재조합되도록 선택된다. 돌연변이된 구조유전자의 N-말단반과 재조합되는 발현벡터-전구체를 제조하기 위해서 프로테아제의 소위 간균-, 대장균-, 프로모터-, 프리-및 프로서열과 합성링커를 함유하는 전기에 따라 구조된 벡터에 합성링커의 절단에의해서, 예를들어 먼저 돌연변이하지 않은 혹은 경우에 따라 역시 돌연변이된(예, 프로테아제-DNA-서열의 C-및 N-말단에서 돌연변이로 프로테아제를 생성키 위해서)프로테아제 구조유전자의 C-말단반을 도입시킨다. 이렇게 해서 이미 언급한 제3도의 벡터 pALIC를 얻는다. 계속해서 합성링커의 보통의 절단방법으로 아직 부족한 프로테아제-구조유전자의 돌연변이된 N-말단반을 도입한다. 이런 방법으로 제14도의 벡터 pALINC를 얻는다. 반대의 경우에는 유사체도가능하다. 먼저 돌연변이하지 않은 혹은 경우에 따라 이미 돌연변이된 N-말단반을 제13도의 벡터 pALIP 타입에 도입하고 다음에 이렇게 얻어진 제12도의 벡터 pALIN 타입에 돌연변이 C-말단반을 도입한다. 이때에는 제14도의 벡터 pALINC 타입을 얻는다.

상기한 발현벡터로 적당한 미생물, 바람직하게는 간균류, 특히 Bacillus subtilis, licheniformis 및 alcalophilus를 형질전환시킨다. 형질전환체는 계속해서 알려진 방법으로 배양하고, 형성된 고알칼리성 프로테아제를 배양배지에서 분리해 낸다. 발현벡터는 자신의 프로테아제를 생성할 수 있는 세균에서도, 또는 프로테아제 결핍세균에서도(자신의 프로테아제를 생성할 수 없다) 형질전환될 수 있다. 자신의 프로테아제를 형성하는 미생물에서는 본 발명에 따른 고알칼리성 프로테아제를 원하는 경우 정제조작을 통해서, 예를 들어 고압액체 크로마토그래피(HPLC)법에의해서 형성된 자신의 프로테아제에서 분리해 낼 수 있다. 이런 정제조작은 프로테아제 결핍 숙주균에서는 발명에 한 프로테아제만 형성되기 때문에 필요가 없게 된다. 다음의 서술사항은 본 발명에 따른 예들을 설명키 위한 것이며, 이것에의해 발명이 제한받지는 않는다.

예들을 좀더 간소화하기 위해서, 자주 되풀이되는 방법이나 개념은 다음에 상세히 서술하겠으며 각각의 예에서는 간단한 표시만으로 언급하겠다. 특별히 언급되지 않는 한 일반적으로는 메니아티스등,(Maniatis et al. = T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)에 기술된 방법에 따라 연구하였다.

여기서 사용된 출발벡터는 구입된 것이며, 무제한 공급이가능하다; 혹은 알려진 방법에 따라 구입가능한 벡터로 부터 만들수도 있다.

이용된 여러 제한효소들은 기술수준에 속하며 구입이가능하다. 알려진 제한효소를 사용할 때 필요한 반응-, 공통인자 및 기타 조건들은 알려져 있다. 예를들어 벡터나 DNA-단편 1㎍ 에 대해서 제한효소 1단위(=1μ)를 약 20㎕ 완충용액에 넣어 사용한다. 37℃에서 약 1시간의 충분한 배양시간을 일반적으로 준수하며 배양조건도 주어진 요구사항에 적합해야 한다. 제한효소와 같이 배양한 후에 단백질은 추출법으로(예, 페놀과 클로로포름으로)제거되고 절단된 DNA는(예, 에탄올로 침전하여 수층에서)분리되어 다음 목적에 사용된다.

제한효소로 벡터를 자를 때에 경우에 따라서 알칼리성 포스파타제(탈인산화)로 말단의 5'-인산잔기를가수분해시킬 수 있다. 이로 인해서 절단때에 생기는 제한된 DNA-말단이나 제한된 벡터의 말단이 스스로 결합되어 제한장소에 외부-DNA-단편의 원하는 삽입이 방해받는 것을 차단할 수 있다. 예에서 5'-말단에 탈인산화가 있으면, 이것은 알려진 방법에 따른다. 탈인산화에 있어서 기타의 언급이나 이에 필요한 시약들은 메니아티스 등(S.133-134)에의한다.

부분가수분해란 제한효소로 DNA를 불완전하게 소화하는 것을의미한다. 반응조건은 DNA-기질에서 이용된 제한효소의 전체가 아닌 몇개의 인식장소에서 잘라지도록 선택되어 진다.

제한효소로 DNA를 처리한 후에 특정 DNA-단편을 분리하여 얻을 때에는 알려진 방법에 따라 겔전기영동법으로 생성된 DNA-단편을 분리한 다음, 분자량을(기지의 분자량을 갖는 대조-DNA-단편과 비교해서 결정)확인하고 해당 겔부위에서 원하는 DNA-단편을 떼어내어 분리한다.

대장균의 DNA-폴리머라제 I의 크레나우절편을 처리한다는 것은 이중나선 DNA의 내부 3'-말단을 DNA-이중 나선의 위에 있는 5'-말단의 뉴클레오타이드에 보족인 뉴클레오타이드로 충진하는 방법을 말한다. 이 방법은 제한효소로 이중 나선 DNA를 자를 때 결과로 나오는 내부 DNA-나선-말단을 계속적인 연결을 위해서 필요한 평평한 DNA-이중나선-말단을 생성키 위해 뉴클레오타이드로 채울때 이용된다. 크레나우절편처리는 적당한 보족의 뉴클레오타이드를 대장균-DNA-폴리머라제 I의 크레나우절편의 충분한 촉매활동하에서 충전된 DNA와 반응케함으로써(예 15°에서 약 15분간) 수행된다. 크레나우절편 및 크레나우처리에 필요한 시약은 기술의 수준에서 알려져 있으며 구입가능하다. 크레나우처리의 기타 상세한 것은 메니아티스등(S. 107-108)에 나와 있다.

리게이션(연결)은 DNA-단편 사이에서 인산다이에스텔 결합을 형성하는 방법을 뜻한다(예, 메니아 티스등 S.146). 리게이션은 알려진 조건에서, 예로써 접합되는 DNA-단편의 상동 몰량의 0.5㎍ 당 약 10단위 T4-DNA-연결효소와 함께 완충액에서 수행된다.

형질전환이란 미생물에 DNA를 도입하여, DNA가 미생물에서 발현되는 것을 말한다. 대장균의 형질전환을 위해서 예를 들어 멘델등(1970. J. Mol. Biol. 53:154) 나 메니아티스등(P.250-251)에 따른 염화칼슘 방법이 적당하다. 간균류를 위해서는 예를 들어 아나그너스토폴리스 등의(1961. J. Bact. 81:701-746)방법이 적당하다.

링커는 짧은 사슬형의 이중나선 DNA-단편이며, 제한효소를 위한 몇개의 인식장소를 갖고 있으며 DNA-단편의 결합에 적합하다. 링커는 예를들어 DNA-단편을 벡터에 재조합때에 이용되며 이 벡터에 제한효소를 위한 특저인식장소를 도입하는데 기여한다.

폴리클론화장소(폴리링커)는 짧은 또는 중간정도의 이중나선 DNA-단편이며, 제한효소를 위한 다수의 인식장소가 밀집되어 있다. 벡터 M 13tg 131에서 나온 예에서 이용한 폴리클론화 장소는 예를 들어 크기가 약 0.07KB(킬로 염기쌍)이며 14개의 제한효소를 위해 인식장소를 갖는다.

실시예 1에서 이용되고 Bacillus alcalophillus HAl 이라 명명한 Bacillus alcalophillus-종은 독일미생물 보관소(DSM)에 DSM-No. 5466, 1989. 7. 28. 보관되어 있다.

[실시예 1]

B.alcalopnilus로 부터 게놈 DNA-라이브러리의 제조 및 고알칼리성 출발 프로테아제 유전자의 분리

천연에서 분리한 Bacillus alcalophillus HAl로 부터(독일 미생물 보관소에 No. DSM 544표시로 보관됨) 사이토 등의 방법에 따라(1963. Biochem. Biophys. Acta. 72:619-629) 염색체 DNA를 분리하고 제한효소 Sau3A로 부분가수분해한다. 제한된 부분을 전기영동법으로 크기가 3-8 KB(킬로 염기)인 부분을 분리해 낸다.

B. alcalophilus HAl에서 분리되어 크기에 따라 선별된 DNA-단편은 플라스미드 pUB 110 벡터 DNA로(실시예 9에 기술됨) 시험관내에서 재조합한다.

플라스미드 pUB 110을 먼저 제한효소 Bam HI 으로 제한하고 송아지장의 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨다. 계속해서 제한되고 탈인산화된 벡터-DNA2㎍을 8㎍ B. alcalophilus DNA-단편과 함께 T4-DNA-연결효소로 전체양이 100㎕ 되게 16℃에서 24시간 배양한다.

B. subtilis BD 224원형질체(Bacillus Genetic 보관소 1A46)를 장과 코앤의(1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115) 방법에 따라 시험관내에서 재조합된 DNA로 형질전환한다. 형질전환체를 네오마이신이 있는 플레이트 위에서 선별하고 탈지우유한천으로 옮긴다. 13800 개의 조사된 형질전환체 중에서 탈지우유한천의 단백분해에의해서 확연하게 보다 큰 환을 형성하는 하나를 발견하였다. 이 클론으로 부터 플라스미드-DNA를 메니아티스 등의 방법에 따라 분리하였다. B. alcalophillus HAl의 고알칼리성 프로테아제를 위한 완전히 정확한 DNA-서열을 함유한다. 이 플라스미드는 pCLEANO로 표시한다. 플라스미드 pCLEANO는 여러 제한효소로 자른 다음 제한된 DNA를 전기영동법으로 분리하여 밴드 표준폼에 따라 제한도를 작성한다. 후에 서열화 작업을 한 다음 결과를 실시예 4에 따라서 검토한다. 이 플라스미드의 제한도는 제2도에 표시되었다.

[실시예 2]

구조유전자의 발현 및 발현된 출발 프로테아제에 대한 단백 분해능력의 결정

플라스미드 pCLEANO를 새로이 B. sutilis BD 224에 도입한 다음, 얻어진 형질전환체를 배양한다. 대조균주로서 플라스미드 pUB 110 으로 형질전환된 B. sutilis BD 224를, 그리고 프로테아제 유전자의 분리를 위해서 B. alcalophilus HAl을 같이 배양한다. B. sutilis BD 224(pCLEANO)와 대조균주인 B. sutilis BD 224(pUB 110)과 B. alcalophilus HAl은 8g 브로쓰(육즙), 40mg MgSO, 0.2g CaCl, 1mg MnCl, 1mg FeSO를 당 함유하는 배지에서 37℃, 250 Upm에서 배양한다. 플라스미드를 함유하는 B. sutilis 균주용 배지는 추가로 10㎍ 네오마이신/ml를 함유한다. B. alcalophilen 출발 균주용 배지에는 추가로 당 10ml 탄산나트륨 완충액(1몰, 수소이온농도 9.75)을 함유한다.

28시간후에 배양액에서 샘플을 취해서 원심분리한 다음 상등액에 대해서 단백분해능력을 결정한다. 계속해서 세린 프로테아제-억제제 PMSF(페닐메칠설포닐플로라이드) 및 금속프로테아제-억제제 EDTA(에틸렌디아민테트라초산) 존재하에서 단백분해능력도 결정한다.

표 1은 억제제가 없을 때와 있을 때에 대한 결과들이다.

원심분리하여 얻은 배양상등액에 대한 단백분해능력결정에 대한 보완으로 상등액에 함유된 단백질을 등전 초점화법으로 분리해 냈다. B. sutilis BD224(pCLEANO) 균주는 대조균주(플라스미드 pUB 110 벡터-DNA만을 갖는 B. sutilis BD224)와는 반대로 한 단백질을 분비하며, 이것은 B. alcalophilus HAl 이 생성하는 고알칼리성 프로테아제와 같은 등전점을 갖고 있었다.

pCLEANO로 형질전환시킨 B. sutilis BD224에서 프로테아제가 형성된다는 것은 실시예 1에서 이용한 네오마이신 저항성과 프로테아제 활성(예, 탈지분유한천에서 강한 동공을 형성)과 같은 프로테아제 구조유전자의 선택을 위한 현상적인 특성이 상동한 플라스미드 pCLEANO에서 발견된 것을 입증한다.

더우기 이 결과로써 B. alcalophilus HAl에서 나온 플라스미드 pCLEANO 에 함유된 DNA-단편은 고알칼리성 B. alcalophilus-프로테아제의 합성을 위한 완전한 정보를 다 갖고 있음을 알 수 있다. 왜냐하면 B. sutilis BD224(pCLEANO)에의해 형성된 프로테아제는 원래의 B. alcalophilus-HAl-프로테아제와 상동한 등전점을가지며, 또 PMSF나 EDTA와 같은 억제제에 대해서 B. alcalophilus 프로테아제와 비슷하게 작용하기 때문이다.

[실시예 3]

플라스미드 pCLEAN4의 구성

플라스미드 pCLEANO는 제한효소 AvaI 및 Hind III로 제한된다. 2.3KB 크기의 DNA-단편을 분리해 내며 AvaI 및 Hind III로 자른 벡터 pBU 131(실시예 10에서와 같이 제조)와 조합한다. 얻은 플라스미드는 pCLEAN4로 표시하며, B. sutilis BD 224균주에 도입한다. 형질전환체는 고알칼리성 프로테아제를 분비할 수 있으며, 이것은 AvaI/Hind III-단편이 B. alcalophilus HAl의 고알칼리성 프로테아제를 위한 완전한 구조유전자를 갖고 있음을 보여준다. 플라스미드 pCLEAN4의 제한도는 제3도에 표시되어 있다.

[실시예 4]

고알칼리성 프로테아제 구조유전자에 대한 서열결정

프로테아제 구조유전자의 단일나선-DNA를 제조하기 위해서 플라스미드 pCLEAN1을 제한효소 AVaI 및 Hind III로 자르고, 약 2.3KB 크기의 AvaI/Hind III-DNA-단편(프로테아제-구조유전자)을 파게미드 pBS(+)나 pBS(-) 에 도입한다; 파게미드 pBS(+/-)는 스트라타 유전자(LAJolla, Califronia)에서 구입하였다.

분리한 단일나선 파게미드에 함유된 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 생거등(1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:5473)의 디데옥시-사슬말단방법과 맥샴등(1980. Methods in Enzymology, Grossmann L., Moldave K., eds., Academic Press Inc., New York and London, vol. 65. 199)의 DNA-단일나선의 염기 특이적 화학분해법에 따라 결정한다. 프로테아제에 대한 조사된 뉴클레오타이드 서열과 배열한 아미노산 서열은 제1도에 표시되어 있다. 뉴클레오타이드 서열 1190 위치에서 성숙한 고알칼리성 프로테아제에 대한 아미노산 서열의 출발은 고알칼리성 프로테아제의 N-터미날말단의 아미노산 서열화에의해서 결정되었다.

[실시예 5]

의도된 돌연변이에의해서 돌연변이된 DNA-서열의 제조

의도된 돌연변이는 컨켈 T.A.(1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)의 프라이머 확장 방법에 따라 프로테아제 구조유전자의 DNA-부분서열에서 실시한다. 여기에서 먼저 다음에 기술한 방법에 따라 우라실화한 단일나선의 유사체로 변환된 플라스미드 pCLMUTN1(실시예 6의 방법에 따라 제조)와 플라스미드 pCLMUTC1(실시예 7의 방법에 따라 제조)를 이용한다.

출발벡터인 pCLMUTN1와 pCLMTC1는 B. alcalophilus HAl의 프로테아제 구조유전자에 대한 전체의 DNA-서열을 함유치 않고, 단지 이것의 N-말단반(pCLMUTN1)이나 C-말단반(pCLMUTC1)을 함유한다.

이들 벡터는 어떤 범주에서는 파게미드의 후손으로서 단일나선-벡터 DNA를 형성할 능력이 있으며, 여기 주어진 조건하에서 복제에 기여하는 숙주미생물에서 빠져 나와 분리될 수가 있다. 이들 벡터는 메니아티스등(P.250-251)의 염화칼슘방법에 따라 숙주미생물로서 대장균 CJ236 에 도입한다. 대장균 CJ236(우라실-N-글리코실라제 결핍돌연변이체)는 벡터의 복제때에 티민대신에 뉴클레오타이드 우라실을 벡터의 DNA-서열에 도입하기 때문에 상기 형질전환체의 배양때에 벡터 pCLMUTN1 이나 pCLMUTC1의 우라실함유 유사체가 얻어진다. 이 우라실 함유 벡터는 보통의 티민함유벡터와 시험관내 반응에서 구별이 안된다. 벡터-DNA에서 우라실 함량은 시험관내 DNA-합성에서 장애요소가 안된다. 왜나하면 우라실은 시험관내에서도 생체내에서도 돌연변이원이 아니고 또 우라실은 티민과 상동하게 표식하기 때문이다. 우라실화된 벡터는 다음의의도된 돌연변이의 시험관내 반응에서 용이하게 이용될 수 있다. 반응이 끝난 후에 돌연변이된 DNA-나선(벡터)의 생성을 위한 주형으로 기여하는 우라실-함유 DNA-단일나선은 돌연변이체에 대한 발현형의 선택이 필요없이 우라실 N-글루코실라제 처리로 제거될 수 있다. 글루코실라제 처리는 분리해 낸 효소나 우라실-N-글루코실라제 활성을 갖는 벡터 DNA로 형질전환시켜 대장균으로 할 수 있다.

의도된 돌연변이에서 주형으로 필요한 벡터 pCLMUTN1와 pCLMUTC1의 우라실화된 단일나선 DNA는 다음과 같이 제조한다: 즉 양 벡터로 형질전환시킨 대장균 CJ236 균주를 배양하고, 또 헬퍼-파겐 M13K07(Bio-Rad 실험실에서 구입, Richmond, California)로 감염시킨다. 헬퍼-파지자체는 거의 증식능력이 없으며, 벡터 pCLMUTN1 이나 pCLMUTC1의 벡터 DNA와 어떤 방해적인 상호작용이 없다. 이것의 임무는 우라실화된 단일나선 벡터-DNA의 단백질 피막의 합성이다. 피막된 단일나선 벡터 DNA는 숙주미생물인 대장균 CJ236에서 나와서 배양배지에서 분리될 수 있다. 헬퍼-파지의 도움으로 단일나선 벡터-DNA에 대한 정량정성적 수득률은 실질적으로 증가된다. 분리된, 우라실화된 DNA-단일나선-벡터 pCLMUTN1 이나 pCLMUTC1은 실시예 8에 따라 제조된 합성올리고 뉴클레오타이드로 하이브리드화 되며, 여기에는 돌연변이 장소가 있으며 동시에 돌연변이로 완전한 DNA-이중 나선을 위한 추가 보충에서 프라이머로써 기여한다.

제2의 DNA-나선은 T4-DNA-폴리머라제를 갖는 뉴클레오타이드를 첨가하고 다음에 T4-DNA-연결효소를 갖는 신생된 나선을 연결하므로써 합성된다(Kunkel et al. 1987, Methods in Enzymol. 154, 367-382). 형성된 이중나선 벡터-DNA는 대장균 MC1061에서 형질전환되며, 돌연변이된 벡터는 합성올리고 뉴클레오타이드로 도입되고 또 제거되는 해당 유일의 제한효소 인식장소를 감토하여 확인된다.

프로테아제 구조유전자의 C-말단이나 N-말단에서 2개의 돌연변이를 수행하기 위해서는 첫번째 돌연변이 도입방법을(실시예 8의 첫번째 합성올리고 뉴클레오타이드를 이용) 프로테아제 구조유전자의 한부분에서 비슷한 방법으로 2번째 돌연변이를 도입키 위한 실시예 8의 합성올리고 뉴클레오타이드를 이용하여 반복한다. 이렇게 하여 프로테아제 구조유전자의 C-말단이나 N-말단의 부위에서 두개의 돌연변이를 한 pCLMUTN1 이나 pCLMUTC1 형태의 돌연변이한 벡터를 얻게 된다.

[실시예 6]

벡터 pCLMUTN1의 구성

실시예 3에서 제조된 플라스미드 pCLEAN4는 AvaI으로 자른다. 상등의 말단은 대장균 DNA-폴리머라제 I의 크레나우절편으로 필요한 뉴클레오타이드 첨가하에서 DNA-이중 나선으로 채워진다. XbaI 으로 이 DNA를 제한한 후에 N-말단의 1618 염기쌍(BP)을 함유하는 프로테아제 유전자의 부분을 분리해 내고 pBS의 SmaI/XbaI-장소에 클론화한다. 이 벡터는 pCLMUTN1 으로 표시되어 제5도의 제한도에 표시되어 있다.

[실시예 7]

벡터 pCLMUTC1의 구성

실시예 3에서 제조된 플라스미드 pCLEAN4는 제한효소 XbaI 및 Asp 718 으로 자른다. 658 BP를 함유하는 XbaI/Asp 718-이중나선 DNA부분은 프로테아제 구조유전자의 C-말단반을 함유하며, pBS의 XbaI/Asp 718-장소에 클론화 한다. 이 벡터는 pCLMUTC1로 표시하며 제6도의 제한도에 표시되어 있다.

[실시예 8]

의도된 돌연변이를 위한 인공올리고 뉴클레오타이드의 합성

합성올리고 뉴클레오타이드는 보카쥬 S.L과 카루더스 M.H.(1981, Tetrahedron Letters 22: 1859-1862)에 따라

-시아노에틸-인산아미데이트로 싸이클론-합성기에서 제조된다. 얻은 올리고 뉴클레오타이드는 폴리아크릴아마이드겔로 유출하고 세파덱스-G25-컬럼으로 탈염해서 정제한다. 합성올리고뉴클레오타이드 서열에 대한 예 및 특성은 제4도에 나와 있다. 합성올리고 뉴클레오타이드 I-XV의 서열은 실시예 5의 방법에 따라 프로테아제 유전자에 돌연변이의 도입에 기여하며, 다음의 조건을 충족하도록 선별된다.

-합성올리고뉴클레오타이드의 DNA-서열은 충분한 하이브리드화 능력이 확실한 이상 프로테아제 유전자의 해당 서열에 보족성이다.

-이제는 이 돌연변이된 코돈이 리신이나 아르기닌군중에서 보다 강한 염기성 아미노산으로 표식된 정도로(돌연변이)치환될 아미노산으로 표식되는 코도내에서 다른 뉴클레오타이드로 하나 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드가 치환된다. 새로운, 보다 강한 염기성 아미노산을 위해서 프로테아제 유전자에서가장 자주 나타나는 코돈이 이용된다.

-아미노산의 원래 표식이 유지되는 한도에서 다른 코도내에서 더 이상의 뉴클레오타이드가 치환된다. 그러나 이로 인해서 프로테아제 유전자에 존재하는 제한효소에 대한 인식장소는 없어지고, 새로이 생성된다. 이것은 실시예 5의 방법에서 새로운 고알칼리성 프로테아제에 대한 돌연변이된 DNA-서열을 갖는 벡터의 스크리닝에 도움이 된다.

[실시예 9]

플라스미드 pBU110의 분리.정제

Bacillus sutilis BD 336(Bacillus 종 저장센터 1E6)속으로 부터 T.J. 크릭잔 등(1978, J.Bacteriol. 34: 318-329)방법에 따라 플라스미드 pUB110을 분리하고 메니아티스등(p.93)의 염화칼슘-밀도차에 따른 원심분리법에의해서 정제한다. 벡터 pUB110은 단지 한번 나타나는 제한효소 BamHI을 위한 인식장소를 갖으며, 또 마아커로써 네오마이신 항생물질 저항성으로 표식된 DNA-서열과 간균류에서 복제에 필요한 DNA-서열을 함유한다(복제의 기원).

[실시예 10]

벡터 pUB131의 구성

실시예 9에 따라 얻은 플라스미드 pUB110은 EcoRI과 BamHI으로 제한된다. 보다 더 적은 DNA-단편(790BP)은 먼저 EcoRI/Bg1II-단편으로서 벡터 M13tg131(Amersham에서 구입. Buckinghamshire, 영국)에서 분리된 67 BP로 구성된 폴리링커로 대치된다. 새로운 벡터는 pUB131로 표시된다. 벡터 pUB131은 pUB110의 후손이며 약 0.8 KB 크기의 EcoRI/BamHI 단편이 빠져 있으며, 여기에 폴리클론화 장소가 도입되어 있다. 제한도 제7도에 표시되어 있다.

[실시예 11]

벡터 pUBC 131의 구성

플라스미드 pUC 18(PharmaciALKB에서 구입. Uppsala, 스웨덴)은 Ast II와 PvuII로 절단된다. 베타-락타마제-유전자와 대장균의 복제의 기원을 갖는 1990 BP 크기의 단편이 분리된다. 상등의 말단은 대장균 DNA-폴리머라제I(Maniatis et al. P114)의 크레나우절판으로 필요한 뉴클레오타이드 첨가하에서 DNA-이중나선으로 채워진다. 이 단편은 실시예 10에 따라 얻은 벡터 pUB 131의 SnaBI-장소에 도입된다. 새로운 벡터는 pUBC 131로 표시되며 제한도 제8도에 표시되어 있다.

[실시예 12]

벡터 pUBC 132의 구성

실시예 11에서 얻은 벡터 pUBC 131의 2187 BP EcoRI/BgIII-단편은 pBS(+)의 EcoRI/BamHI-장소에 클론화 된다. 얻어진 벡터는 pBSREPU로 표시되며 제한도 제9a도에 표시되어 있다. 벡터 pBSRERPU의 repu-폴리펩타이드 DNA-서열에 존재하는(I.Maciag et al. 1988, Mo1. Gen. Genet. 212: 232-240) NcoI-및 StyI-인식장소는 제거된다. 여기에서 뉴클레오타이드 서열 CCATGG는 CCG TGG로(양 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 순서 트립토판-프롤린으로 표식)대치된다. 이것은 실시예 5와 비슷한 방법으로 수행된다. 여기에서 NcoI-및 Sty I-인식장소를 제거키 위한의도된 돌연변이의 주형으로서 벡터 pBSREPU의 우라실화된 단일나선 DNA를 제조한다. 이 주형을 실시예 5에 기술된 프라이머-확장 기술에 유사하게 제9b도의 합성 올리고 뉴클레오타이드를 이용하여(실시예 8의 합성올리고 뉴클레오타이드의 제조방법 및 정제법과 유사) DNA-이중나선에 보충하고, 대장균 MC 1061을 형질전환시키고 배양해서 NcoI-및 StyI-인식장소가 없는 벡터를 분리해 낸다. 분리한 벡터의 1726 BP EcoRI/ApaI-단편은 pUBC131의 EcoRI/ApaI 장소에 도입된다. 새로운 벡터는 pUBC 132로 표시되어 제한도 제10도에 표시되어 있다.

[실시예 13]

플라스미드 pALIP의 구성

플라스미드 pALIP은 다음 3가지 요소의 연결로 제조된다.

-pCLEAN4의 2218 BP 크기의 AvaI/NcoI-단편; 이 단편은 프로모터와 고알칼리성 출발 프로테아제의 프레프로-영역을 갖고 있다.

-실시예 17에 따라 제조한 합성링커; 이것은 제한효소 NcoI, XbaI 및 Asp 718 개개의 인식장소를 갖으며, 이것은 돌연변이된 벡터 pCLMUT1 및 pCLMUTC1에서 나온 프로테아제 유전자의 돌연변이된 N-말단 및 C-말단반을 도입하거나, 혹은 플라스미드 pCLEAN4에서 나온 출발 프로테아제의 전체 유전자 도입을가능케 해준다.

-실시예 12에서 제조된 벡터 pUBC 132에서 나온 5776 BP 크기의 AvaI/HindIII-단편; 이것은 대장균의 복제를 위한 DNA-서열과 선택성 마아커, 그리고 B.sutilis, B. lichenformis 및 alcalophilus의 복제를 위한 DNA-서열 및 선택성 마아커를 함유한다.

벡터 PALIP의 구성은 대장균 MC1061에서 수행하며 암피실린-저항성 대장균-형질전환체에서 분리한다. 얻어진 벡터는 제한도 제11도에 표시되어 있다.

[실시예 14]

플라스미드 pALIN의 구성

플라스미드 pALIN은 먼저 실시예 1에서 얻은 벡터 pCLEAN4을 제한효소 NcoI과 XbaI로 자르고, 얻어진 414BP 크기의 NcoI/XbaI-단편을 벡터 pALIP 에다(실시예 13에 따라서 제조) 클로닝함으로써 얻는다. 벡터 pALIN은 대장균 MC 1061에서 구성하며 암피실린 저항성 대장균 형질전환체에서 나온 벡터를 분리한다. 제조한 벡터는 DNA-서열의 N-말단부분을 함유하고, 이것은 성숙한 효소로 표시하며 고알칼리성 프로테아제의 전사와 번역을 위한 조절인자 및 신호-서열과 진행서열을 함유한다. 이 벡터는 제한도 제12도에 표시되어 있다.

[실시예 15]

플라스미드 pALIC의 구성

플라스미드 pALIC는 먼저 실시예 3에서 얻은 벡터 pCLEAN4을 제한효소 XbaI과 Asp 718로 자르고, 얻은 606 BP 크기의 XbaI/Asp 718-단편을 벡터 pALIP의(실시예 13에 따라 제조) XbaI/Asp 718-장소에 클로닝한다. 벡터 pALIC의 구성은 대장균 MC 1061에서 수행되며 암피실린-저항성 대장균-형질전환체에서 나온 벡터를 분리한다. 제조된 벡터는 DNA-서열의 C-말단부분을 함유하며, 이것은 성숙된 프로테아제로 표시하며 고알칼리성 프로테아제의 전사와 번역을 위한 조절인자 및 신호서열 및 진행-서열을 함유한다. 이 벡터는 제한도 제13도에 표시되어 있다.

[실시예 16]

발현 벡터 pALINC의 구성

프로테아제-DNA-서열의 N-말단에서 돌연변이를 한 발현벡터, 프로테아제-DNA-서열의 C-말단에서 돌연변이를 한 발현벡터, DNA-서열의 C-말단과 N-말단에서 돌연변이를 한 발현벡터, 프로테아제 DNA-서열에서 대조균으로 돌연변이를 하지 않는 발현벡터등을 제조한다.

A. 프로테아제 DNA-서열의 N-말단에서 돌연변이가 있는 발현벡터

실시예 5에 따라의도된 돌연변이에의해 얻은 돌연변이한 벡터 pCLMUTN1는 제한효소 NcoI와 XbaI로 자른다. 분리한 414염기쌍(BP) 크기의 NcoI/XbaI-단편은(돌연변이 N18K, K27R, N42R, Q57R, A96R, Q107R, N114R, N115R, Q135R, N138R를 갖는 프로테아제 구조유전자의 돌연변이한 N-말단) 실시예 15에 따라 얻은 플라스미드 pALIC의 NcoI/XbaI-장소에 클로닝한다. 얻은 벡터는 돌연변이한 프로테아제의 발현을 위한 적절한 해독판이 있는 완전한 발현벡터이다. 이들 벡터는 다음과 같이 표시된다.

pALN18K = 돌연변이 N18K를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALK27K = 돌연변이 K27R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALN42R = 돌연변이 N52R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALQ57R = 돌연변이 Q57R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALA96R = 돌연변이 A96R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALQ107R = 돌연변이 Q107R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALN114R = 돌연변이 N114R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALN115R = 돌연변이 N115R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALQ135R = 돌연변이 Q135R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALN138R = 돌연변이 N138R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pAL27/115= 돌연변이 K27R/N115R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pAL27/135= 돌연변이 K27R/Q135R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

B. 프로테아제 DNA-서열의 C-말단에서 돌연변이를 한 발현벡터

실시예 5에 따라의도된 돌연변이에의해 얻은 돌연변이된 벡터 pCLMUTC1은 제한효소 XbaI와 Asp 718로 자른다. 분리한 606 염기쌍(BP) 크기의 XbaI/Asp 718 단편은(돌연변이 A166R, V238R, N255R, S259K, A266R를 갖는 프로테아제 구조유전자의 돌연변이한 C-말단) 실시예 14에 따라 얻은 플라스미드 pALIN의 XbaI/Asp 718 -장소에 클로닝한다. 얻은 벡터는 돌연변이한 프로테아제의 발현을 위한 적절한 해독판이 있는 완전한 발현벡터이다. 이들 벡터는 다음과 같이 표시된다.

pALA166R = 돌연변이 A166R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALV238R = 돌연변이 V238R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALN255R = 돌연변이 N255R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALS259K = 돌연변이 S259K를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

pALA266R = 돌연변이 A266R를 갖는 프로테아제를 위한 발현벡터

C. 프로테아제-DNA-서열의 N-말단과 C-말단에서 돌연변이를 한 발현벡터

실시예 A에서 제조한 발현벡터 pALA96R과 B에서 제조한 발현벡터 pALA266R은 각각 제한효소 XbaI과 AbaI로 자른다. 플라스미드 pALA96R의 1612 염기쌍 크기의 단편을 플라스미드 pALA266R의 6388 BP 크기의 단편과 연결한다. 결과로 얻은 플라스미드는 pAL96/266로 표시된다. 이 실시예 A에서 제조한 발현벡터 pALQ107과 B에서 제조한 발현벡터 pALV238R과 유사하게 플라스미드 pAL107/238을 제조한다.

D. 출발 프로테아제의 돌연변이하지 않은 DNA-서열을 갖는 발현 벡터

프로테아제의 돌연변이하지 않은 출발 구조유전자를 갖는 발현벡터는 414BP 크기의, 실시예 3에 따라 얻은 플라스미드 pCLEAN4에서 나온 돌연변이하지 않은 NcoI/XbaI-단편을 실시예 15에 따라 얻은 플라스미드 pALIC의 NcoI/XbaI -장소에 클로닝시켜서 얻거나, 실시예 3에 따라 얻은 플라스미드 pCLEAN4에서 나온 606 BP 크기의 XbaI/Asp 718-단편을 실시예14에 따라 얻은 플라스미드 pALIN의 XbaI/Asp 718-장소에 클로닝시켜서 얻는다. 이렇게 하여 얻는 벡터는 돌연변이하지 않은 고알칼리성 출발 프로테아제의 발현을 위한 적절한 해독판을 갖는 완전한 발현벡터이다.

상기한 4개의 발현벡터의 구성은 경우에 따라서 대장균 MC1061에서 수행된다. 암피실린-저항성 대장균-형질전환체에서 발현벡터들이 분리된다. 돌연변이한 그리고 돌연변이하지 않은 프로테아제의 유전자의 발현을 위해서 이번 실시예에서 제조되어 분리된 발현벡터를 B. sutilis BD 224에 도입시킨다. 네오마이신이나 플레오마이신-저항성에 대해서 선택한다. 형질전환체는 돌연변이한(A,B,C에서 나온 벡터로 형질전환) 또는 돌연변이하지 않은(D에서 나온 벡터로 형질전환) 고알칼리성 프로테아제를 생산할 능력이 있다. 벡터 pALINC는 제한도 제14도에 표시되어 있다.

[실시예 17]

DNA-이중나선-링커의 합성

상등의 5'-말단을 갖는 이중나선 링커를 합성하기 위해서는 두개의 단일나선-DNA-서열을 실시예 8에서의 합성올리고 뉴클레오타이드의 경우와 유사하게 제조하고 정제한다. 상등의 5'-말단을 갖는 이중나선 링커는 주어진 순서로 밀집되어 있거나 혹은 서열의 처음에는 제한효소 NcoI, 다음에 XbaI, Asp 718, 끝에는 Hind III 등의 순서로 표식된 DNA-서열인 것이 특징이다. 얻어진 DNA-단일 나선들은 서로 이중 나선으로 하이브리드화 된다. 다음의 서열과 다음의 제한효소를 위한 개개의 인식장소를 갖는 합성된 DNA-이중나선 링커는 실시예 13에 따라 만든 벡터의 구성에 이용된다.

[실시예 18]

돌연변이된 고알칼리성 프로테아제의 제조 및 대조목적으로 출발 프로테아제의 제조

50ml의 배양전배지에(20g 트립톤, 10g 헤페-추출물, 5g 식염, 75g가용성 전분, 10ml 맥아수/1) 시험균주를(실시예 16에 따라 제조된 벡터 pALINC로 형질전환한 B. sutilis BD 224)접종시킨다. 37℃에서 16시간, 250Upm 배양한다. 50ml 주 배양배지에(30g 콩가루, 90g 감자전분, 10g-카제인 나트륨염, 10ml 맥아수/1) 배양한 것 2.5ml를 접종시킨다. 주 배양도 전배양과 같은 조건에서 배양한다. 72시간후에 배양액을 원심분리한다.

상등액에서 고알칼리성 프로테아제를 HPLC를 통해서(ultropac 컬럼 타입 TSK-CM-25W von LKB; 유출완충액 0.05M 아세테이트 나트륨염(pH 6), 0.8M 아세테이트 나트륨염(pH 6)) 정제한다.

다음에 최적의 돌연변이된 프로테아제의 세척성을 돌연변이하지 않은 출발 프로테아제와 비교하여 결정한다.

[실시예 19]

세척시험은 시험물질로서(스위스 연방물질 시험소에서 구입, 상크트갈렌, 스위스)EMPA117(11cm x 11cm, 폴리에스텔/면-혼합조직, 우유, 피, 먹으로 더럽혀짐)을 사용하여 수행하였다. 6g/1과붕산염 포함 IEC-시험세척제, 타입1(Lever Sunlicht 유한회사, 만하임: 조성; 6.4% 알킬설폰산염, 2.3% 에톡시지방알콜(14% 에톡시 그룹)2.8% 나트륨비누, 35% 나트륨 트리폴리인산염, 6% 나트륨실리케이트, 1.5% 마그네슘실리케이트, 1% 카르복시메칠셀룰로오즈, 0.2% EDTA, 0.2% 광학활성반사체(스틸벤타입), 16.8% 나트륨황산, 연활성화제가 없는 분사건조분말로서 7.8% H O, 20% 나트륨과붕산-4수화물)을 물에서 15°dH. 이 액의 수소이온농도는 10.5이었다. 세척시간은 45℃에서 30분간이며, 100ml당 20U 프로테아제(실시예 18에 따라 제조)를 이용하였다. 세척이 끝난 다음 천을 세번 수도물로 헹군 다음 건조하여 다리미질 하였다. 시험된 헝겊단편의 반사율은 앞뒤로 각 4번 결정하였다. 표 2는 16번 시도에 대한 평균치이다.

[실시예 20]

세척시험은 실시예 19에 유사하게 수행하였다. 세척가루로써 음성-및 니오장력제, 착화합물형성제로서 나트륨 트리폴리포스페이트, 나트륨실리케이트, 연화제로서 나트륨퍼보레이트, 조정제로써 나트륨설페이트등을 함유하는 세척제를 유럽에서 적절한 조성의 하나에 이용하였다. 결과는 표 3에 나와 있다.

Claims (27)

1. 아미노산 서열이 제1도에 표시된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을가지고, 세척조건하에서 단백질 분해능력을가지며, 제1도의 18, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 238, 255, 259, 266번의 위치중 하나이상에서 다르며, 상기 위치의 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 것에의해서 구별됨을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
2. 제1항에 있어서, 제1항에서 표시된 위치중 1개 내지 3개 위치의 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 서열을가짐을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
3. 제1항에 있어서, 최적 pH가 10∼12.5이며 분자량은 26000∼28000g/mol 임을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
4. 제1항에 있어서, 제1도에 표시된 아미노산서열과 90% 이상이 상동한 서열을가짐을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
5. 제1항에 있어서, 보다 강한 염기성 아미노산이 리신 혹은 아르기닌인 것을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
6. 제1항에 있어서, 아미노산 서열의 18번 혹은 259번 위치중 하나이상이 리신으로 치환됨을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
7. 제1항에 있어서, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 255 혹은 266번 위치중 하나이상에서 아미노산이 아르기닌으로 치환됨을 특징으로 하는 고알칼리성 프로테아제.
8. 제1도에 표시한 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을가지고, 세척조건하에서 단백질 분해능력을가지며, 제1도의 18, 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 238, 255, 259, 266번의 위치중 하나이상에서 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환됨을 특징으로 하는 아미노산 서열을 갖는 고알칼리성 프로테아제를 암호하는 DNA서열.
9. 제8항에 있어서, 제8항에서 표시된 위치의 아미노산중 1개 내지 3개의 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환됨을 특징으로 DNA서열.
10. 제8항에 있어서, 제1도에 나타난 아미노산 서열과 90% 이상 상동한 서열을가짐을 특징으로 하는 DNA서열.
11. 제8항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 제8항중 표시된 위치의 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산인 리신 혹은 아르기닌으로 치환됨을 특징으로 하는 DNA서열.
12. 제8항에 있어서, 아미노산 서열의 18번 혹은 259번 위치중 하나이상에서 리신으로 치환됨을 특징으로 하는 DNA서열.
13. 제8항에 있어서, 아미노산이 27, 42, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 238, 255 혹은 266번 위치중 하나이상에서 아르기닌으로 치환됨을 특징으로 하는 DNA서열.
14. 제8항에 따른 DNA서열을가짐을 특징으로 하는 미생물의 형질전환에 적합한 벡터.
15. 제14항에 있어서, 벡터가 플라스미드임을 특징으로 하는 벡터.
16. 제15항에 있어서, 제8항에 따른 DNA서열, 대장균 선택성의 마아커 및 복제를 위한 DNA서열, 그리고 고알칼리성 프로테아제의 발현을 위해 적합한 배열에서 간균 선택성의 마아커 및 복제를 위한 DNA서열을 함유함을 특징으로 하는 벡터.
17. 제16항에 있어서, 제14도에 따른 제한지도를가짐을 특징으로 하는 벡터.
18. 배열에 있어서, 하기 a) 내지 e)를 포함하고 부족된 DNA서열 부위의 도입으로 고알칼리성 프로테아제를 위한 발현벡터를 생성함을 특징으로 하는 플라스미드 : a) 제1도의 아미노산 서열과 80% 이상 상동한 서열을가지는 고알칼리성 프로테아제를 암호하는 DNA서열의 일부, b) 고알칼리성 프로테아제의 프로모터나 프리프로 영역으로 암호된 DNA서열, c) 프로테아제를 암호하는 DNA서열의 일부분의 도입을 위한 제한효소 인식부위를가지는 DNA이중나선링커의 일부분, d) 대장균에서 선택성의 마아커 및 복제를 위한 DNA서열, e) 간균에서 선택성의 마아커 및 복제를 위한 DNA서열.
19. 제18항에 있어서, a)에의해 표시되고, 플라스미드에 포함되며, 고알칼리성 프로테아제를 암호하는 DNA서열 부분이 이 DNA서열의 N-터미날 Nco/XbAI 단편임을 특징으로 하는 플라스미드.
20. 제18항에 있어서, a)에의해 표시되고, 플라스미드에 포함되며, 고알칼리성 프로테아제를 암호하는 DNA서열 부분이 이 DNA서열의 C-터미날 XbAI/Asp 718 단편임을 특징으로 하는 플라스미드.
21. 배열에 있어서, 하기 a) 내지 d)를 포함하고 DNA이중나선링커를 대신하여 완전한 고알칼리성 프로테아제를 암호하는 DNA서열을 도입하여 프로테아제 발현을 위한 발현벡터가 생성됨을 특징으로 하는 플라스미드 : a) 제1도의 아미노산 서열과 80% 이상 상동한 DNA서열의 도입을 위한 제한효소 인식부위를 갖는 DNA이중나선링커, b) 고알칼리성 프로테아제의 프로모터나 프리프로영역의 DNA서열, c) 대장균 선택성인 마아커 및 복제를 위한 DNA서열, d) 간균 선택성인 마아커 및 복제를 위한 DNA서열.
22. 제21항에 있어서, a)항에의해 표시된 DNA이중나선링커는

    

    를 제한효소 Nco I, XbAI, Asp718 및 HindIII에 대한 인식부위로서 포함하는 DNA이중나선링커임을 특징으로 하는 플라스미드.
23. 제14항 내지 제17항중 어느 한항에 따른 벡터로 형질전환된 바실러스 서브틸리스(Baxillus subtilis), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 리세니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물.
24. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 고알칼리성 프로테아제를 포함함을 특징으로 하는 세제.
25. 제24항에 있어서, 보통세제의 조성성분으로서 장력제, 지지제 및 계면활성제, 경우에 따라서 기타 일반적인 첨가물 및 보조제를 함유함을 특징으로 하는 세제.
26. 제4도에 표시된 DNA서열 I -XV 중 하나를 포함함을 특징으로 하는 합성올리고 뉴클레오타이드.
27. 제1도에 표시된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을가지며 제1도의 18, 27, 42, 49, 57, 96, 107, 114, 115, 135, 138, 166, 176, 179, 188, 189, 198, 235, 255, 259, 266번 위치중 하나이상에서 아미노산이 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 DNA서열을가지는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 알칼로필러스종 미생물을 배양하고, 이 배양배지로부터 제1도에 나타난 아미노산 서열과 80% 이상 상동한, 아울러 상기된 위치의 하나이상에서 보다 강한 염기성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을가지는 최적의 고알칼리성 프로테아제를 분리하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 표시된 아미노산 서열을가지는 최적의 고알칼리성 프로테아제의 제조방법.

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