FI106315B - Menetelmä entsyymien stabiilisuuden parantamiseksi sekä stabiloidut entsyymit - Google Patents

Description

106315

Menetelmä entsyymien stabiilisuuden parantamiseksi ja stabiloidut entsyymit Förfarande for förbättring av stabiliteten hos enzymer samt stabiliserade enzymer &

Oheisen keksinnön kohteena on menetelmä entsyymien stabiilisuuden parantamiseksi ionisten tensidien vaikutusta vastaan toteuttamalla näitä entsyymejä koodavissa DNA-sekvensseissä kohdennettu mutageneesi, minkä jälkeen nämä entsyymit, joiden stabiilisuus ionisten tensidien suhteen on parantunut, ilmennetään .

Sellaiset entsyymit kuten proteaasit, lipaasit, amylaasit, sellulaasit ja muut vastaavat ovat arvokkaita teollisia tuotteita, joita voidaan käyttää edullisesti pesuaineteollisuudes-sa, koska ne hajottavat esimerkiksi entsymaattisesti pilkkoutuvia likoja helpottaen tällä tavalla näiden likojen poistamista. Jotta nämä entsyymit kykenisivät vaikuttamaan, ei riitä, että ne ovat entsymaattisesti aktiivisia pesuolosuhteissa (pH-arvo, lämpötila), vaan sen lisäksi niiden on siedettävä pesuaineen muita komponentteja, erityisesti tensideihin yhdistettynä, toisin sanoen niiden on oltava riittävän stabiileja ja riittävän vaikutuskykyisiä näiden komponenttien läsnäollessa. Erityisesti pesu- ja puhdistusainekoostumuksissa usein käytetyt, tyypiltään ioniset tensidit saattavat vaikuttaa haitallisesti käytettyjen pesuaineentsyymien stabiilisuuteen siten, että entsyymien aktiivisuus heikkenee nopeasti ionisen tensidin läsnäollessa niin, ettei aktiivisuutta voida juurikaan hyödyntää riittävällä tavalla edes lyhyissä, noin 30 * minuutin pituisissa pesujaksoissa. Entsymaattisen aktiivisuu- .. den riittämätön hyödyntäminen pesu- tai puhdistustapahtuman ; aikana, minkä syynä on entsyymien puutteellinen stabiilisuus ionisten tensidien läsnäollessa, johtaa näin ollen selvästi heikentyneeseen pesu- ja puhdistustehoon. Pesu- ja puhdistusaineissa käytettyjen entsyymien hyvä stabiilisuus ionisten tensidien läsnäollessa on välttämätöntä erityisesti nestemäisten pesu- ja puhdistusaineiden koostumusten tapauksessa, koska 2 106315 näissä koostumuksissa entsyymejä ei voida suojata pinnoittamalla koostumuksessa läsnäolevien muiden komponenttien, erityisesti ionisten tensidien, destabiloivalta vaikutukselta, niinkuin jauhemaisissa koostumuksissa.

Tehtävänä oli näin ollen saada aikaan entsyymejä, joilla on hyvä stabiilisuus ionisten, erityisesti anionisten tensidien destabiloivaa vaikutusta vastaan, sekä tähän tarkoitukseen sopiva menetelmä.

Todettiin, että entsyymin aminohappoja korvaamalla -saadaan aikaan entsyymejä, joiden stabiilisuus on hyvä ionisten tensidien läsnäollessa.

Keksinnön kohteena ovat ionisten tensidien destabiloivia vaikutuksia vastaan stabiloitu erittäin alkalinen proteaasientsyy-mi, jossa on vähintään 90-prosenttisesti homologinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa oleva aminohapposekvenssi, jossa vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 on hydrofiilinen aminohappoproteaasi.

Keksinnön eräässä tarkoituksenmukaisessa suoritusmuodossa saadaan aikaan ionisten tensidien destabiloivia vaikutuksia vastaan stabiloitu erittäin alkalinen proteaasientsyymi, jossa aminohapposekvenssissä vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, * 80, 111, 235 tai 256 on aminohappo, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat asparagiinihappo, glutamiinihappo, lysiini, arginiini, asparagiini ja glutamiini.

Vaikka ohessa ei halutakaan rajoittua mihinkään tiettyyn teo-„ riaan, niin kuitenkin voidaan olettaa, että entsyymin pinnalla sijaitsevat, sähköstaattisesti vastakkaisesti varautuneet alueet vetävät puoleensa ionisten tensidien varautuneita ryhmiä, jotka muodostavat sähköstaattisten voimien seurauksena ensimmäisen sidoksen entsyymin kanssa. Todennäköisesti voidaan olettaa, että ionisen tensidin tämän ensimmäisen sitoutumisen jälkeen tensidimolekyylin pitkäketjuinen ei-polaarinen jäännös voi joutua läheiseen vuorovaikutukseen entsyymin niiden, saavu- 3 106315 tettavissa olevien, hydrofobisten pinta-alueiden kanssa, jotka alueet sijaitsevat ionisen tensidin sähköstaattisen sitoutumiskohdan välittömässä läheisyydessä. Apolaarisen tensidijäännöksen ja entsyymin hydrofobisen pinta-alueen väliset vuorovaiku-. tukset voivat johtaa entsyymin denaturoitumiseen ja näin ollen sen deaktivoitumiseen, erityisesti siinä tapauksessa, että tämä hydrofobinen alue on painuma, kuoppa tai reikä. Tällä tavalla apolaarinen tensidijäännös pääsee entsyymin hydrofobiseen ytimeen, mikäli entsyymin pysyvät rakenne-elementit kuten esimerkiksi kierre tai jäykkä poimu tai vastaava ei estä apolaarisen tensidi jäännöksen pääsyä entsyymin sisään. Mikä'li apolaarinen tensidijäännös pääsee tunkeutumaan helposti, erityisesti hydrofobisten painumien, kuoppien tai reikien tapauksessa entsyymin hydrofobisen pinta-alueen kautta entsyymin sisään, niin tällöin entsyymin poimujen avautuminen ja deaktivoi-tuminen on todennäköistä.

Keksinnön mukaisesti stabiloituina entsyymeinä voivat tulla kysymykseen kaikki pesu- ja puhdistusaineteollisuudessa käyttökelpoiset ionisten tensidien destabiloivia vaikutuksia vastaan stabiloidut erittäin alkaliset proteaasientsyymit. Keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisemmin käyttäen esimerkkeinä erityiseni edullisia proteaaseja edustavia niinkutsuttuja subtilisiineja. Subtilisiinit ovat aikalisiä seriiniproteaase-ja, eli proteaaseja, joiden pH-optimi on alkalisella pH-alueel-• la, ja joissa on olennainen seriinijäännös aktiivisessa keskuk sessa. Oheisen keksinnön mukaisia subtilisiineja voidaan saada viljelemällä Gram-positiivisia bakteereita tai sieniä. Erittäin tunnettuja, tekniikan nykytason mukaisia subtilisiineja saadaan Bacillus-kannoista, ja esimerkkeinä subtilisiineista ’ .. voidaan mainita subtilisiini BPN1 tai subtilisiini Carlsberg, y, Tähän ryhmään kuuluvat myös alkaliset proteaasit, joita saa daan viljelemällä bakteereita Bacillus subtilis, Bacillus amvloliauefaciens, Bacillus licheniformis tai Bacillus lentus. Aivan erityisen edullisia subtilisiineja ovat ne erittäin alkaliset seriiniproteaasit, joita saadaan viljelemällä etenkin sellaisia Bacillus-lajeja kuten Bacillus alcaloohilus.

4 106315

Keksinnön eräässä erityisessä suoritusmuodossa näiden erittäin alkalisten proteaasien aminohapposekvenssi on vähintään 90-prosenttisesti, edullisesti kuitenkin vähintään 95-prosenttisesti homologinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, ja tämän erittäin alkalisen proteaasin aminohapposekvenssissä vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 on hydrofiilinen aminohappo.

Homologialla kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa tarkoitetaan ohessa kyseessä olevien aminohapposekvenssien rakenteellista samankaltaisuutta kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa. Homologian määrittämiseksi kuvion 1 mukaisen aminohapposekvenssin ja siihen verrattavan aminohapposekvenssin kulloinkin toisiaan rakenteellisesti vastaavat osat saatetaan keskenään päällekkäin siten, että aminohapposekvenssien rakenteet saadaan vastaamaan mahdollisimman tarkoin toisiaan, ottaen kuitenkin huomioon yksittäisten aminohappojen häviämistä tai lisäyksistä johtuvat erot, jotka on korjattava siirtämällä sekvenssiosia vastaavasti toistensa suhteen. Tämän jälkeen sekvensseissä keskenään samanlaisten aminohappojen ("homologisten asemien") lukumäärä suhteessa kuvion 1 mukaisessa sekvenssissä läsnäolevien aminohappojen kokonaislukumäärään on prosentuaalinen homologia. Sekvenssien erot voivat johtua sekä aminohappojen vaihtumisista, lisäyksistä että häviämistä.

Näin ollen itsestään selvää on se, että kuvion 1 kanssa vähintään 90-prosenttisesti homologisten, erittäin alkalisten proteaasien tapauksessa kuviossa 1 käytetyt aminohappoasemat viit-taavat kulloinkin käytetyssä proteaasissa näiden asemien kans-.. sa homologisiin asemiin. Kuvion 1 kanssa homologisten proteaa- ·· sien aminohapposekvenssissä tapahtuneet häviämät tai lisäykset voivat johtaa aminohappoasemien suhteelliseen siirtymiseen siten, että keskenään homologisten aminohapposekvenssien homologisissa osapätkissä toisiaan vastaaville aminohappoasemille annetut numeromerkinnät eivät ole välttämättä samoja.

• 1 5 106315

Keksinnön kohteena olevat, tarkoituksenmukaiset, stabiloidut, erittäin alkaliset proteaasit ovat erityisesti sellaisia, jotka on stabiloitu korvaamalla vähintään yksi jossakin kuvion 1 mukaisessa asemassa 43, 47, 77, 80, lii, 235 tai 256 sijaitseva aminohappo toisella hydrofiilisellä aminohapolla. Esimerkkeinä erityisen edullisista, stabiloiduista, erittäin aikalisistä proteaaseista voidaan mainita ne, joissa aminohapposekvenssissä vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 on aminohappo, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat asparagiinihappo, glutamiinihappo, lysiini, arginiini, asparagiini ja glutamiini. Keksinnön erityisen edullisessa muodossa aminohappo aminohapposekvenssin asemassa 43 on aminohappo arginiini, lysiini, glutamiini tai glutamiinihappo.

Alkuperäisellä, aminohapon paikalle sijoittuneella uudella, hydrofiilisellä aminohapolla voi olla sekä varautunut että varautumaton polaarinen aminohappojäännös. Varautuneen aminohappo jäännöksen käsittävistä hydrofiilisista aminohapoista voidaan mainita esimerkiksi asparagiinihappo (= Asp, D) , glutamiinihappo (= Glu, E) , lysiini (= Lys, K) , arginiini (= Arg, R); varautumattoman polaarisen aminohappojäännöksen käsittävistä hydrofiilisista aminohapoista voidaan erityisesti mainita mm. asparagiini (= Asn, N) ja glutamiini (= Gin, Q). Edullisia ovat erityisesti pitkäketjuiset aminohapot glutamiini, glutamiinihappo, arginiini ja lysiini. Esimerkkinä hydrofobisesta alueesta, jossa tapahtuva keksinnön mukainen aminohappokorvaus johtaa stabiloituneeseen, erittäin alkaliseen Bacillus alcalo-philus-bakteerin proteaasiin, voidaan mainita kuviossa 9 esitetty, aminohappoasemaa Ile 43 vastaava hydrofobinen alue. Tätä hydrofobista aluetta ympäröivät polaariset aminohapot Gin 57, Asn 42 ja ioninen aminohappo Arg 44. Tässä hydrofobisessa alueessa tapahtuva aminohapon Ile 43 korvautuminen esimerkiksi arginiinilla, lysiinillä, glutamiinilla tai glutamiinihapolla johtaa keksinnön mukaisesti stabiloituneisiin, erittäin aikalisiin proteaaseihin, joissa on tapahtunut jokin mutaatioista I43R, I43K, I43Q tai I43E. Mutaatioita on merkitty alalla tavanomaisesti käytetyillä merkinnöillä. Aminohappoja on mer- « kitty yksikirjaimisilla symboleilla siten, että alkuperäinen 6 106315 aminohappo on merkitty ennen aseman järjestysnumero ja stabii-lisuuden parantamiseksi istutettu aminohappo on merkitty aseman järjestysnumeron jälkeen.

Edellä kuvatut, keksinnön mukaisesti stabiloidut, erittäin alkaliset proteaasit ovat esimerkiksi sellaisia, joita saadaan viljelemällä mikro-organismeja kuten esimerkiksi Bacillus alcalophilus-bakteeria. Näitä erittäin aikalisiä Bacillus-proteaaseja saadaan erityisesti viljelemällä sellaisia Bacillu-s-lajeja, joilla on Bacillus alcalophilus DSM 5466-kannan tunnusomaiset piirteet. Täten keksinnön mukaisesti stabiloiduilla proteaaseilla on edellä esitetyn homologian määrittämää sukulaisuutta Bacillus alcalophilus DSM 5466-kannasta saatavien proteaasien kanssa, joiden kuviossa 1 esitettyä aminohapposekvenssiä voidaan verrata keksinnön mukaisesti stabiloitujen proteaasien aminohapposekvenssiin. Näiden erittäin alkalisten proteaasien molekyylipaino on 26000-28000 g/mooli, määritettynä SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeettisesti vertaamalla viiteproteiineihin, joiden molekyylipaino on tunnettu. Niiden tunnusomaisena piirteenä on lisäksi alueella 10-12,5 oleva pH-optimi, jolla pH-optimilla tarkoitetaan sitä pH-aluetta, jolla proteaasien proteolyyttinen aktiivisuus on suurimmillaan ja jolla proteaasien pH-stabiilisuus on hyvä.

Keksinnön mukaisia proteaaseja valmistettaessa kulloinkin stabiloitavan entsyymin aminohapposekvenssin aminohappoja korvataan toisilla aminohapoilla siten, että tämän entsyymin aminohapposekvenssiä koodaavassa DNA-sekvenssissä toteutetaan kohdennettu mutageneesi. Tätä seuraava mutatoidun DNA-sekvens-sin ilmentäminen sopivan mikro-organismin avulla johtaa sitten .. keksinnön mukaiseen, aminohappokorvauksen avulla stabiloituun entsyymiin. Entsyymin saamiseksi voidaan menetellä erityisesti siten, että a) ensin sopivasta, stabiloitavaa entsyymiä tuottavasta mikro-organismista eristetään kyseistä entsyymiä koodaava DNA-sek-venssi (eli entsyymin rakennegeeni); • * b) tämän DNA-sekvenssin nukleotidijärjestys määritetään; 7 106315 c) tähän, nyt tunnettuun DNA-sekvenssiin aiheutetaan sellaisia mutaatioita, että mutatoitunut DNA-sekvenssi koodaa nyt sellaista entsyymiä, jossa alkuperäisen entsyymin jokin aminohappo on korvautunut keksinnön mukaisesti jollain toisella aminohapolla; d) sitten tämä mutatoitu DNA-sekvenssi istutetaan sopivaan ilmentämisvektoriin; e) tällä saadulla ilmentämisvektorilla transformoidaan sopiva-mikro-organismi, jota voidaan lopulta käyttää mutatoituneen entsyymin tuottamiseen.

Menetelmän yksittäiset vaiheet keksinnön mukaisesti stabiloitujen entsyymien saamiseksi, tällä tavalla saadut tuotteet sekä välituotteet, joita ovat DNA-sekvenssit, vektorit, erityisesti ilmentämisvektorit sekä transformoidut mikro-organismit, on kuvattu jäljempänä yksityiskohtaisemmin käyttäen esimerkkinä erittäin aikalisiä proteaaseja.

Ensimmäiseksi, keksinnön mukaisesti stabiloitujen, erittäin alkalisten proteaasien valmistusta varten sopivasta, tällaista erittäin alkalista proteaasia, jonka aminohapposekvenssi on vähintään 90-prosenttisesti, edullisesti kuitenkin vähintään 95-prosenttisesti homologinen kuviossa 1 esitetyn aminohappo-sekvenssin kanssa, tuottavasta bakteerista eristetään tätä proteaasia koodaava DNA-sekvenssi (eli proteaasin rakenne-geeni) . Näiden erittäin alkalisten proteaasien aminohapposekvenssiä koodaavia rakennegeenejä voidaan saada sinänsä tunnetuilla, yleisesti käytetyillä menetelmillä. Tätä tarkoitusta varten esimerkiksi bakteerista ("luovuttajabakteerista"), erityisesti jostakin, tällaista erittäin alkalista proteaasia tuottavasta Bacillus-lai ista eristetään sinänsä tunnetulla tavalla kromosomaalinen DNA, joka hydrolysoidaan osittain sinänsä tunnetulla tavalla sopivien restriktioendonukleaasien avulla. Tällä tavalla luovuttaja-DNA:sta saadut restriktiokap-paleet voidaan erottaa esimerkiksi geelielektroforeettisesti 8 106315 koon mukaan, minkä jälkeen toivotun kokoiset kappaleet sidotaan in vitro (ligatoidaan) sopivaan kaksijuosteiseen vekto-ri-DNA:han ("rekombinaatio"). Usein käytettyjä vektoreita ovat niinkutsutut plasmidit, jotka ovat kromosomien ulkopuolista, rengasmaista, kaksijuosteista bakteeri-DNA:ta, jota voidaan siirtää sopivilla menetelmillä (transformoida) mikro-organis-meihin, joissa se kykenee lisääntymään (replikoitumaan autonomisesti) . Näissä plasmideissa on mahdollisesti niinkutsuttuja merkitsimiä, eli sellaisia DNA-kappaleita, joihin on koodautu-nut tiettyjä, todettavia ominaisuuksia (esim. antibiootin vastustuskyky), ja jotka tekevät transformoituneiden mikro-organismien (transformanttien) valikoinnin helpommaksi.

Edellä mainituilla plasmideilla (jotka on saatu vektori-DNA:s-ta ja luovuttaja-DNA:n restriktiokappaleista) voidaan transformoida bakteereita, edullisesti jokin ffacillus-laii ja tran-sformantit voidaan valikoida merkitsimen tunnetun ominaisuuden (esim. neomysiinin vastustuskyky) perusteella. Tällä tavalla saadaan klooneja, eli geneettisesti identtisiä transformantte-ja. Näiden transformanttien joukosta voidaan etsiä proteiini-pitoisilla maljoilla sellaisia, jotka erittävät enemmän prote-aasia, ja jotka voidaan tämän jälkeen eristää. Lopuksi kloonista, jolla on proteaasiaktiivisuutta, eristetään tähän transfor-manttiin istutettu plasmidi-DNA, jolla transformoidaan uudestaan bakteeri, jotta saataisiin selville, saako plasmidi ai-* kaan proteaasiaktiivisuuden, eli onko proteaasiaktiivisuus kytkeytynyt merkitsimen ominaisuuteen.

Täten eristetty plasmidi sisältää tunnettuja restriktiokohtia käsittävän vektori-DNA:n ohella stabiloitavan, erittäin al-.. kalisen lähtöproteaasin rakennegeenin sekä luovuttajabakteerin ·*. muita DNA-sekvenssejä, joita ei kuitenkaan tarvita tässä yhteydessä. Jotta stabiloitavan, erittäin alkalisen proteaasin rakenne-geenin myöhempi sekvenssimääritys ei olisi liian hankalaa, on suositeltavaa, että ennen varsinaista sekvenssimääri-tystä nämä ylimääräiset, tarpeettomat DNA-sekvenssit eliminoidaan luovuttaja-DNA-sekvenssistä siten, että luovuttaja-DNA- •« ' sekvenssi saadaan supistetuksi olennaisesti proteaasin raken- 9 106315 negeeniksi. Tätä tarkoitusta varten esim. plasmidi, joka käsittää rakennegeenin ja ylimääräisen DNA-sekvenssin, pilkotaan monella erilaisella restriktioendonukleaasilla (restriktio), saadut DNA-kappaleet erotetaan geelielektroforeesilla koon mukaan ja todettujen vyöhykekuvioiden perusteella laaditaan restriktiokartta. Tällä tavalla saadaan selville restriktio-kohdat, jotka sijaitsevat luovuttaja-DNA-sekvenssin alueessa. Plasmidin restriktiokartan tunteminen tekee mahdolliseksi sen, että tiettyjen restriktio-endonukleaasien avulla luovuttaja-DNA-sekvenssistä voidaan leikata irti DNA-kappale, joka käsittää olennaisesti vain erittäin alkalisen proteaasin rakenne-geenin, siihen kuuluvat pre- ja pro-yksiköt sekä geenin ilmentymiselle välttämättömän promoottoriyksikön.

Kun tämä kooltaan supistettu luovuttaja-DNA-sekvenssi istutetaan uudestaan sopivaan vektoriin, voidaan saada uusi, rep-likoituva vektori, jonka kyky ilmentää erittäin alkalista lähtöproteaasia voidaan selvittää siten, että jokin bakteeri, erityisesti jokin Bacillus-laii transformoidaan tällä vektorilla, saatuja transformantteja viljellään ja niiden proteaasi-aktiivisuus määritetään. Esimerkki tällaisesta supistetusta vektorista, josta käytetään merkintää pCLEAN4, on esitetty kuvion 2 restriktiokartassa.

Proteaasin rakennegeenin nukleotidisekvenssin määrittämiseksi (sekvenssimääritys) edellä kuvattu vektori replikoidaan ensin sopivassa mikro-organismissa ja proteaasigeeni eristetään. Sitten se alikloonataan faagimidiin ja saaduilla faagimideilla transformoidaan tämän jälkeen sopiva mikro-organismi, esim. E. coli, minkä jälkeen näitä transformantteja viljelemällä saadaan yksijuosteista, proteaasigeenin sisältävää DNA:ta. Muo- • dostunut yksijuosteinen DNA eristetään ja sekvenssi määrite tään. Sekvenssi määritetään sinänsä tunnetuilla menetelmillä esimerkiksi siten, että proteaasigeenin sisältävällä yksijuos-teisella DNA:11a toteutetaan Maxam:in ja Gilbert:in mukainen emässpesifinen osittainen kemiallinen pilkkominen (1980, teoksessa Methods in Enzymology, Grossmann L., Moldave K:, toimit- t tajat, Academic Press Inc., New York ja Lontoo, voi. 65, 499), 106315 10 tai siten, että esimerkiksi proteaasigeenin käsittävää yksi-juosteista DNA:ta käytetään matriisina täydentävän vastin-DNA-juosteen osakappaleiden osittaista synteesiä varten dideok-si-ketjunpäättäjä-menetelmän mukaisesti (Sanger et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463).

Saadusta nukleotidisekvenssistä, geneettisen koodin perusteella (yksi triplettisana = kodoni edustaa yhtä määrättyä ami-nohap-poa) voidaan nyt päätellä proteaasin aminohapposekvenssi. Kypsän proteaasientsyymin (eli entsyymin, josta puuttuvat pre- ja proyksiköt) aminohapposekvenssin alkupisteen määrittämiseksi kypsän proteaasin N-päätteen päässä sijaitsevasta lyhyestä pätkästä määritetään aminohappojärjestys sinänsä tunnetuilla menetelmillä, joita käytetään aminohapposekvenssien määrittämiseksi peptideistä. Tämä tunnettu N-päätteen aminohappo-sekvenssi voidaan nyt saattaa vastaamaan geneettisen koodin perusteella edellä esitetyn nukleotidisekvenssin vastaavaa osa-kappaletta, jolloin saadaan selville kypsää proteaasia koodaa-van DNA-sekvenssin alkupiste. Proteaasin muiden aminohappojen järjestys saadaan tämän jälkeen automaattisesti selville DNA-sekvenssistä määrittämällä seuraavat aminohapot geneettisen koodin perusteella.

Keksinnön mukaisesti erittäin alkalista proteaasia koodaavaa DNA-sekvenssiä mutatoidaan vastaavia kodoneita muuttamalla siten, että mutatoitu DNA-sekvenssi saadaan koodaamaan ionis-ten tensidien vaikutusta vastaan stabiloitua, erittäin alkalista proteaasia, jonka aminohapposekvenssissä jokin kuviossa 1 esitetyissä asemissa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 on korvattu hydrofiilisella aminohapolla, edullisesti asparagiini-hapolla, glutamiinihapolla, lysiinillä, arginiinillä, aspara-giinilla tai glutamiinilla.

Erittäin alkalista proteaasia koodaavaan DNA:hän tuotetaan mutaatioita sinänsä tunnetuilla menetelmillä kohdennetun muta-geneesin tuottamiseksi. Tätä tarkoitusta varten sopivista vektoreista (faagimidi), esimerkiksi kuvion 4 mukaisesta vektorista pCLMUTNl tai kuvion 5 mukaisesta vektorista pCLMUTCl tuote- 11 106315 taan, mahdollisesti apufaagia apuna käyttäen, rengasmaista yksijuosteista DNA:ta, joka sisältää koko rakennegeenin tai edullisesti vain sen osan (esimerkiksi vain N-päätteen osan tai C-päätteen osan) alkuperäisen proteaasin rakennegeenistä, johon osaan mutaatioita on tarkoitus aiheuttaa. Tähän rengasmaiseen yksijuosteiseen DNA:han hybridisoidaaan synteettinen, hybridisoituva oligonukleotidi, joka sisältää toivotussa mutaa-tiokohdassa emästripletin (kodonin), joka koodaa alkuperäisen, korvattavan aminohapon sijasta keksinnön mukaisesti asemissa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 hydrof iilista aminohappoa, edullisesti asparagiinihappoa, glutamiinihappoa, lysiiniä, arginiiniä, asparagiinia tai glutamiinia. Lisäksi tämä oligonukleotidi eroaa siihen hybridisoitavasta, alkuperäisestä nukleotidisekvenssistä vielä yhden tai muutaman muun nukleoti-dikomponentin suhteen siten, että alkuperäisen aminohapposekvenssin koodautuminen pysyy vielä geneettisen koodin degeneraation puitteissa, kuitenkin niin, että alkuperäisessä proteaasin nukleotidisekvenssissä mahdollisesti läsnäoleva restrikti-okohta puuttuu synteettisestä oligonukleotidistä tai että synteettisessä oligonukleotidissä on ylimääräinen restriktiokoh-ta. Tätä poistunutta tai lisättyä restriktiokohtaa käytetään myöhemmin sopivien restriktioendonukleaasien kanssa mutatoitu-neen DNA-sekvenssin tunnistamiseen lähtö-DNA-sekvenssistä. Hybridisoimalla saatu, osittain kaksijuosteinen DNA-sekvenssi täydennetään tarvittavia nukleotidejä lisäämällä ja DNA-polyme-raasin ja DNA-ligaasin vaikutuksen avulla täydelliseksi kaksois juosteeksi. Saatu rengasmainen, kaksoisjuosteinen DNA-sekvenssi transformoidaan vektorina sopivaan mikro-organismiin, jossa sen annetaan replikoitua riittävästi, minkä jälkeen mutatoituneet DNA-sekvenssit tunnistetaan oligo-nukleoti-disekvenssiosasta puuttuvien tai tähän osaan lisättyjen res-triktiokohtien perusteella ja eristetään tämän jälkeen.

Eräässä valmistustavassa kohdennetun mutageneesin matriisiksi tehdään urasyloitua yksijuosteista DNA:ta, joka hybridisoidaan synteettisten oligonukleotidien kanssa. Sen jälkeen, kun kohdennetussa mutageneesissä tapahtuvat reaktiot ovat päättyneet, tämä urasiilipitoinen yksijuosteinen DNA, jota käytettiin 12 106315 matriisina mutatoitujen DNA-juosteiden (vektoreiden) tuottamiseksi, voidaan poistaa urasiili-N-glykosylaasilla käsittelemällä, jolloin ei tarvita mutanttien fenotyyppistä valikointia. Tämä glykosylaasikäsittely voidaan toteuttaa esimerkiksi sopivalla mikro-organismilla, joka on transformoitu mutatoidul-la vektori-DNA:11a, ja jolla on urasiili-N-glykosylaasiaktiivi-suutta. Replikointi voidaan toteuttaa esimerkiksi E. coli-kannassa, jossa vain mutaatiomenetelmässä syntyneen kaksijuos-teisen vektorin mutatoitunut, ei-urasyloitu DNA-juoste lisääntyy. Tämä helpottaa edelleen mutatoituneiden DNA-vektoreiden valikointia.

Kohdennetussa mutageneesissä tarvittavat synteettiset oligonuk-leotidit valmistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Näiden oligonukleotidien valmistus voidaan toteuttaa esimerkiksi julkaisun Beaucage, S.L. ja Caruthers, M.H., 1981, Tetrahedron Letters. 22: 1859-1862, mukaisesti, syklonisyntetisaattorissa b-syanoetyylifosforamidiittia käyttäen. Saadut oligonukleoti-dit voidaan puhdistaa esimerkiksi eluoimalla polyakryyliamidi-geeleistä, minkä jälkeen toteutetaan mahdollisesti suolanpois-to Sephadex-pylväiden avulla, minkä jälkeen niitä voidaan käyttää muissa vaiheissa. Näitä synteettisiä oligonukleotidejä voidaan käyttää suoraan DNA-polymeraasin alukkeena edellä kuvatussa mutageneesimenetelmässä. Synteettiset oligonukleoti-disekvenssit käsittävät esimerkiksi 20-30 nukleotidikomponent-tia, joihin on koodautunut noin 7-10 aminohappoa. Edellä mainitussa hybridisoinnissa voidaan luonnollisestikin käyttää myös pitempiä nukleotidisekvenssejä, mutta tällä ei saavuteta kuitenkaan mitään lisäetuja, kunhan vain lyhytketjuisten synteettisten oligo-nukleotidien riittävä hybridisoitumiskyky on saatu taatuksi.

• >

Edellä kuvatulla kohdennetun mutageneesin menetelmällä saadut rengasmaiset kaksijuosteiset DNA-sekvenssit, joihin on aiheutettu mutaatioita, ovat mutatoituneita vektoreita, joista voidaan leikata irti sopivien restriktioendonukleaasien avulla, aina tapauksesta riippuen, proteaasin koko mutatoitunut ra-kennegeeni tai proteaasin rakennegeenin mutatoitunut osakappa- 13 106315 le, joka voidaan sitten istuttaa (alikloonata) sopivaan ilmen-tamisvektoriin. Tällä ilmentämisvektorilla transformoidaan sitten sopivia mikro-organismeja, esimerkiksi Bacillus-laiei a. joita viljellään tämän jälkeen sopivissa olosuhteissa muta-toituneiden, erittäin alkalisten proteaasien ilmentämiseksi ja saamiseksi.

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan kohdennettuun mutageneesiin ei alisteta koko rakennegeeniä, vaan vain se osa siitä, johon osaan mutaatio on tarkoitus saada aikaan. Tätä tarkoitusta varten vektorista, jota on käytetty rakennegeenin replikoimiseksi, leikataan irti sopivien restriktioendonuk-leaasien avulla esim. rakennegeenin N-päätteen tai C-päätteen puolikas ja alikloonataan sopivaan faagimidiin. Tällä tavalla saadaan vektoreita, jotka sisältävät joko N-päätteen tai C-päätteen puolikkaan proteaasin rakennegeenistä, ja joita replikoidaan ensin riittävästi sopivassa mikro-organismissa, esim. E. coli:ssa. minkä jälkeen ne alistetaan edellä kuvattuun kohdennettuun mutageneesiin. Rakennegeenin osakappaleiden mutageneesiin liittyy se etu, että lyhyempien yksijuosteisten DNA-sekvenssien käyttö on mahdollista, jolloin synteettisiin oligonukleotideihin hybridisoinnin jälkeen saatua, osittain kaksijuosteista DNA:ta on täydennettävä huomattavasti harvemmalla nukleotidillä kuin koko DNA-sekvenssiä käytettäessä. Tämä vähentää synteesivaiheissa tarvittavaa työmäärää sekä myös epätoivottujen satunnaisten mutaatioiden vaaraa.

Mutatoituneet DNA-sekvenssit voidaan leikata irti sopivien restriktioendonukleaasien avulla mutaation aikaansaamiseen käytetyistä kloonausvektoreista ja istuttaa sitten sopivia restriktiokohtia käsittäviin vektoreihin. Saadut vektorit ovat esimerkiksi varsinaisten, erittäin alkalisen proteaasin ilmentämiseen tarvittavien ilmentämisvektoreiden esimuotoja. Näiden vektoreiden rakenne on sellainen, että ne sisältävät sopivien restriktiokohtien (esim. synteettisestä kytkijästä) lisäksi myös jo isäntäorganismissa toteutettavalle proteaasin ilmentämiselle välttämättömiä säätäviä sekvenssejä, signaali-sekvenssejä, promoottorisekvenssejä sekä proteaasin pre- ja 14 106315 proyksiköitä koodaavia DNA-sekvensejä.

Optimoidun, erittäin alkalisen proteaasin varsinainen ilmentä-misvektori saadaan alikloonaamalla mutatoitu DNA-sekvenssi tällaiseen vektoriin. Mutatoidun DNA-sekvenssin istuttaminen ilmentämisvektorin tähän esimuotoon tapahtuu siten, että saadaan sopivan luentakehyksen käsittävä ilmentämisvektori. Tällöin proteaasia koodaavan DNA-sekvenssin mutatoituneita osakap-paleita, esimerkiksi C-päätteen tai N-päätteen osakappale, voidaan istuttaa vektoreihin, jotka sisältävät jo kulloinkin kappaleeseen kuuluvan, jäljellä olevan mutatoitumattoman osa-kappaleen ; tai proteaasia koodaava koko mutatoitu DNA-sekvenssi istutetaan vektoreihin, jotka eivät vielä sisällä lainkaan osakappaleita tästä proteaasin DNA-sekvenssistä. Esimerkkeinä sellaisista ilmentämisvektorin esiastevektoreista, jotka sisältävät jo osakappaleen ei-mutatoituneesta DNA-sekvenssistä, ovat jäljempänä sekä esimerkeissä yksityiskohtaisemmin kuvatut vektorit, joista käytetään merkintää pALIN ja pALIC. Vektori, joka ei sisällä proteaasin DNA-sekvenssin osakappaleita, on vektori pALIP, jolla on kuviossa 7 esitetty restriktiokartta.

Keksinnön edullisen muunnoksen (mutaatio N-päätteen puolikkaassa tai C-päätteen puolikkaassa) mukaisia ilmentämisvektoreiden esimuotoja saadaan seuraavalla tavalla. Ensin Bacillusplasmi-diin muodostetaan polykloonauskohta. Täten saatu plasmidi f pilkotaan restriktioentsyymeillä ja siihen yhdistetään E. coli-plasmidikappale, joka sisältää merkitsimen ja replikaa-tion kannalta tärkeitä sekvenssiosia. Tämän jälkeen poistetaan mahdollisesti kohdennetun mutageneesin avulla sellaisia res-triktio-kohtia, jotka saattavat häiritä myöhempiä toimenpiteitä. Tällä tavalla saadusta plasmidista muodostetaan uusi vek-. tori, joka sisältää Bacillus-plasmidista ja E. coli-plasmidis-ta saadut, replikaatioon tarvittavat DNA-sekvenssit, promoottorin DNA-sekvenssit, proteaasin pre-pro-sekvenssiä koodaavat DNA-sekvenssit (jotka on saatu esim. kuvion 2 mukaisesta plasmidista pCLEAN4) sekä synteettisen kytkijän. Kuvion 7 restriktiokartta esittää esimerkkiä tällaisesta plasmidista, josta käytetään merkintää pALIP. Synteettinen kytkijä on valittu 15 106315 tässä tapauksessa siten, että yhdistäminen voidaan toteuttaa sopivilla restriktioendo-nukleaaseilla pilkkomisen jälkeen joko koko alkuperäisen rakennegeenin tai koko mutatoidun rakennegeenin tai rakennegeenin mutatoitujen tai mutatoimattomien osakappaleiden kanssa. Ilmentämisvektorin esimuodon, joka on tarkoitus yhdistää esimerkiksi rakennegeenin mutatoituun N--päätteen puolikkaaseen, valmistamiseksi edellä muodostettuun vektoriin, joka sisältää mainitut Bacillus-, E. coli-, promoottori- sekä proteaasin pre- ja pro-sekvenssit sekä synteettisen kytkijän, istutetaan ensin synteettisen kytkijän leikkaamisen jälkeen esim. proteaasin rakennegeenin mutatoimaton C-päätteen puolikas. Tällä tavalla saadaan jo mainitut, tyyppiä pALlC olevat vektorit. Tämän jälkeen synteettinen kytkijä leikataan vielä kertaalleen puuttuvan, proteaasin rakennegeenin mutatoidun N-päätteen puolikkaan istuttamiseksi. Tällä tavalla saadaan kuviossa 8 esitettyä tyyppiä pALINC oleva vektori. Päinvastainen tapaus toteutetaan analogisella tavalla. Tällöin tyyppiä pALIP olevaan vektoriin istutetaan ensin mutatoimaton N-päätteen puolikas, ja näin saatuun, tyyppiä pALIN olevaan vektoriin istutetaan myöhemmin mutatoitu C-päät-teen puolikas, jolloin saadaan myös kuviossa 8 esitettyä tyyppiä pALINC oleva vektori.

Edellä kuvatuilla ilmentämisvektoreilla transformoidaan sopivia bakteereita, edullisesti Bacillus-lajeja, erityisesti «

Bacillus subtilis. B. licheniformis ja B. alcaloohilus. Tämän jälkeen näitä transformantteja viljellään sinänsä tunnetulla tavalla ja muodostuneet, keksinnön mukaisesti stabiloituneet, erittäin alkaliset proteaasit eristetään viljelyalustasta. Tätä tarkoitusta varten ilmentämisvektorit voidaan transformoida sekä sellaisiin bakteereihin, jotka kykenevät vielä muodostamaan omaa proteaasia, sekä proteaasin suhteen puutteellisiin bakteereihin (jotka eivät enää muodosta omaa proteaasia) . Omaa proteaasia muodostavien isäntäorganismien tapauksessa keksinnön mukaisesti stabiloitu, erittäin alkalinen proteaasi voidaan toivottaessa erottaa muodostuneesta omasta proteaasista tämän jälkeen toteutettavilla puhdistustoimenpiteillä, esimerkiksi erittäin erotuskykyisellä nestekromatogra- 16 106315 fisella (HPLC) menetelmällä. Sitä vastoin proteaasituotannon suhteen puutteellisten isäntäorganismien tapauksessa tällainen puhdistusvaihe voidaan jättää pois, koska nämä isäntäorganis-mit kykenevät tuottamaan vain (tai olennaisesti vain) stabiloitunutta proteaasia.

Keksinnön mukaisten entsyymien stabiloinnissa ionisten tensi-dien destabiloivia vaikutuksia vastaan syntyy myös uusia DNA-sekvenssejä, jotka ovat samoin keksinnön eräs kohde. Näiden keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien tunnusomaisena piirteenä on se, että ne koodaavat sellaista erittäin alkalista proteaasia, jonka aminohapposekvenssi on vähintään 90-prosenttisesti, edullisesti kuitenkin 95-prosenttisesti homologinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, eroten kuitenkin tästä aminohapposekvenssistä siten, että proteaasin aminohapposekvenssissä vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, 80, lii, 235 tai 256 on hydrofiilinen aminohappo, edullisesti asparagiini-happo, glutamiinihappo, lysiini, arginiini, asparagiini ja glutamiini. Erityisen edullisesti asemassa 43 on aminohappo arginiini, lysiini, glutamiini tai glutamiinihappo.

Keksinnön mukaisesti stabiloidut entsyymit soveltuvat yksinään tai toisiinsa tai muihin alalla tunnettuihin, tekniikan nykytason mukaisiin entsyymeihin yhdistettyinä erinomaisesti kiinteisiin ja nestemäisiin pesu- ja puhdistusainekoostumuksiin, erityisesti nestemäisiin koostumuksiin. Näitä pesu- ja puh-distusainekoostumuksia voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla. Keksinnön mukaisesti stabiloituja entsyymejä voidaan sekoittaa näiden pesu- ja puhdistusainekoostumusten muihin komponentteihin sinänsä tunnetulla tavalla rakeina, jauheena tai pelletteinä, mahdollisesti pinnoitetussa muodossa, tai nestemäisten koostumusten tapauksessa myös liuonneessa muodossa. Keksinnön mukaisesti stabiloituja entsyymejä voidaan käyttää näissä valmisteissa pesu- ja puhdistusaine-entsyymeille tavanomaisina määrinä, esimerkiksi määränä, joka on korkeintaan 3 paino-% (kokonaiskoostumuksen kuivapainosta laskien), edullisesti alueella 0,2-1,5 paino-% olevana määränä. Näin ollen keksinnön kohteena ovat myös pesu- ja puhdistusainekoos- 17 106315 tumukset, jotka sisältävät vähintään yhtä keksinnön mukaisesti stabiloitua entsyymiä; erityisesti sellaiset koostumukset, jotka sisältävät keksinnön mukaisia entsyymejä sekä ionisia, edullisesti anionisia tensidejä. Näiden keksinnön mukaisten entsyymien ohella nämä pesu- ja puhdistusainekoostumukset voivat myös sisältää sinänsä tunnettuja entsyymejä ja kaikkia muita tekniikan nykytason mukaisia, pesuaineissa tavanomaisesti käytettyjä komponentteja kuten tensidejä, valkaisuainetta tai runkoainetta (builder) sekä muita tavallisia, pesuaineiden muodostamista helpottavia apuaineita sinänsä tavanomaisina määrinä. Näitä apuaineita ovat esimerkiksi paksuntavat aineet, entsyymejä stabiloivat aineet, likaa sitovat aineet ja/tai yhteensopivuutta parantavat aineet, kompleksien ja kelaattien muodostajat, saippuavaahtoa säätävät aineet sekä lisäaineet kuten optiset kirkasteet, läpinäkymättömyyttä parantavat aineet, korroosion estoaineet, staattista sähköä estävät aineet, väriaineet, bakterisidit, valkaisuaineen aktivaattorit, per-happovalkaisuaineen esiasteet. Niinpä keksinnön mukaiset pesuja puhdistusainevalmisteet sisältävät tyypillisessä esimerkinomaisessa koostumuksessa a) vähintään 5 paino-%, esimerkiksi 10-50 paino-% ionista, edullisesti anionista tensidiä tai tällaisten tensidien seosta; b) korkeintaan 40 paino-% runkoainetta tai runkoaineseosta; c) korkeintaan 40 paino-% valkaisuainetta tai valkaisuaine-seosta, edullisesti perboraattia kuten natriumperboraatti-tetra-hydraattia tai natriumperboraatti-monohydraattia; d) korkeintaan 3 paino-% vähintään yhtä keksinnön mukaista entsyymiä, erityisesti keksinnön mukaista proteaasia; e) muita komponentteja kuten apuaineita siten, että päästään 100 painoprosenttiin, kuivapainosta laskien.

Kuvio 1 esittää Bacillus alcaloohilus HAl-bakteerin erittäin alkalisen lähtöproteaasin rakennegeenin käsittävän Aval/Hind- III-kappaleen DNA-sekvenssiä sekä tämän lähtöproteaasin amino- « 18 106315 happosekvenssiä.

Kuvio 2 esittää plasmidin pCLEAN4 restriktiokarttaa.

Kuvio 3 esittää esimerkkejä kohdennetussa mutageneesissä käytettyjen, synteettisten oligonukleotidien DNA-sekvensseistä, ja siinä on esitetty yksittäisten restriktioendonukleaasien eliminoidut tai lisätyt tunnistuskohdat; lähtöproteaasin alkuperäisen DNA-sekvenssin suhteen aiheutetut nukleotidimuutok-set on esitetty merkitsemällä muuttuneet nukleotidit pienillä kirjaimilla.

Kuvio 4 esittää vektorin pCLMUTNl restriktiokarttaa.

Kuvio 5 esittää vektorin pCLMUTCl restriktiokarttaa.

Kuvio 6 esittää vektorin pUBC132 restriktiokarttaa.

Kuvio 7 esittää plasmidin pAllP restriktiokarttaa.

Kuvio 8 esittää tyyppiä pALlNC olevien ilmentämisvektoreiden restriktiokarttaa, joita vektoreita käytetään mutaation avulla stabiloitujen, erittäin alkalisten proteaasien ja mutatoimat-tomien, erittäin alkalisten lähtöproteiinien ilmentämiseen.

Kuvio 9 esittää esittää tasaista hydrofobista aluetta aseman Ile 43 läheisyydessä.

Kuvio 10 esittää hydrofobista, syvälle entsyymin sisään työntyvää reikää, johon korvautuvat, polaariset, varauksettomat aminohapot His 118 ja Asn 237 rajoittuvat.

Kuvio 11 esittää hydrofobista aluetta asemien Vai 261 - Leu 262 läheisyydessä.

Kuvio 12 esittää hydrofobista, syvälle entsyymin sisään työntyvää reikää, jonka lähellä korvautuva, ioninen aminohappo Arg 143 sijaitsee.

19 106315

Keksintöä havainnollistetaan seuraavassa keksinnön tyypillisten, esimerkkeinä toimivien suoritusmuotojen avulla, jotka suoritusmuodot kohdistuvat esimerkkinä toimivaan Bacillus ai -calo-ohilus HAl-bakteerin erittäin alkaliseen proteaasiin, näiden esimerkkien rajoittamatta keksintöä kuitenkaan millään tavalla.

Esimerkkien yksinkertaistamiseksi eräät esimerkeissä usein käytetyt menetelmät ja toimenpiteet kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisemmin, jolloin yksittäisissä esimerkeissä voidaan vain lyhyesti viitata niihin. Samoin, mikäli toisin ei olla mainittu, esimerkeissä käytettiin yleisesti menetelmiä, jotka on kuvattu Maniatistin et ai. teoksessa (so. T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) .

Ohessa käytettyjä vektoreita on saatavana kaupallisesti rajoittamattomina määrinä; tai niitä voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä käytettävissä olevista vektoreista.

Esimerkiksi faagimidejä, joista käytetään merkintää pBS (esim. pBS(+), pBS(-), jne.), saatiin yhtiöstä Stratagene, La Jolla, Kalifornia; auttajafaagi M13K07 saatiin yhtiöstä Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia; vektori M13tgl31 saatiin yhtiöstä Amersham, Buckinghamshire, Englanti; plasmidi pUC18 saatiin yhtiöstä Pharmacia LKB, Uppsala, Ruotsi.

Erilaiset käytetyt restriktioendonukleaasit ovat tekniikan nykytason mukaisia ja niitä on saatavana kaupallisesti. Näitä tunnettuja restriktioendonukleaaseja käytettäessä kulloinkin : - tarvittavat reaktio-, kofaktori- ja muut olosuhteet ovat sa moin tunnettuja.

Sen jälkeen, kun vektorit on leikattu restriktioendonukleaa-seilla, päättävä 5'-fosfaattijäännös voidaan mahdollisesti hydrolysoida alkalisella fosfataasilla (defosforylaatio). Tällä tavalla voidaan välttää se, etteivät leikkaamisen seu- 20 106315 rauksena syntyneet rajatun vektorin päät yhdisty toisiinsa, mikä estäisi vieraan DNA-kappaleen toivotun istuttamisen res-triktiokohtaan. Mikäli esimerkeissä on toteutettu 5'-pään defosforylaatio, se toteutettiin tunnetulla tavalla. Defosfo-rylaatio ja siinä tarvittavat reagenssit on kuvattu yksityiskohtaisemmin teoksessa Maniatis et ai. (s. 133-134) .

Osittaisella hydrolyysillä tarkoitetaan DNA.-n epätäydellistä pilkkomista restriktioendonukleaasilla. Reaktio-olosuhteet valitaan tällöin siten, että DNA-substraatissa eräät käytetyn restriktioendonukleaasin tunnistuskohdat, eivät kuitenkaan kaikki, pilkkoutuvat.

Tiettyjen DNA-kappaleiden talteensaamiseksi ja eristämiseksi, esimerkiksi sen jälkeen, kun DNA:ta on käsitelty restriktio-endonukleaaseilla, syntyneet DNA-kappaleet erotettiin sinänsä tunnetulla tavalla elektroforeettisesti (esim. agaroosigee-lillä), minkä jälkeen ne tunnistettiin molekyylipainon avulla (määritetty vertaamalla viite-DNA-kappaleisiin, joiden molekyy-lipaino tunnetaan), minkä jälkeen toivotut DNA-kappaleet irrotettiin vastaavista geelivyöhykkeistä.

Käsitteleminen E. coli:sta saadun DNA-polymeraasin I Klenow-kappaleella on eräs menetelmä kaksijuosteisen DNA:n sisempien 3'-päiden täyttämiseksi nukleotideillä, jotka ovat DNA-kaksois-juosteen kummassakin irrallisessa 5'-päässä olevia nukleotidejä täydentäviä vastinnukleotidejä. Klenow-kappale ja Klenow-käsittelyyn tarvittavat reagenssit ovat tekniikan nykytason mukaisia ja niitä on saatavana kaupallisesti. Klenow-käsittely on kuvattu yksityiskohtaisesti esimerkiksi Maniatis:in et ai. teoksessa (sivut 107-108).

t

Ligaatio tarkoittaa menetelmää fosfodiesterisidosten muodostamiseksi DNA-kappaleiden väliin (katso esim. Maniatis et ai., sivu 146) . Ligaatiot voidaan toteuttaa sinänsä tunnetuissa olosuhteissa, esimerkiksi puskurissa, joka sisältää noin 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia ligatoitavien DNA-kappaleiden, joita on läsnä suurin piirtein samansuuruinen moolimäärä, jokaista 21 106315 0,5 μg:aa kohden.

Transformaatiolla tarkoitetaan DNA:n istuttamista mikro-organismiin siten, että tämä DNA kykenee replikoitumaan tai ilmentymään siinä. E. coli:n transformointiin sopii esimerkiksi kalsiumkloridimenetelmä, joka on kuvattu julkaisussa Mandel et ai., 1970, J. Mol. Biol. 53: 159, tai edellä mainitussa Ma- niatis:in et ai. teoksessa (sivut 250-251). Bacillus-lajin tapauksessa voidaan käyttää esimerkiksi menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Anagnostopoulos et ai., 1961, J. Bact. 81: 741-746.

Kytkijä on lyhytketjuinen kaksijuosteinen DNA-kappale, jossa on muutamia restriktioendonukleaasien tunnistuskohtia ja joka kykenee sitoutumaan DNA-kappaleisiin. Kytkijöitä käytetään esimerkiksi yhdistettäessä DNA-kappaleita vektoriin, ja niiden avulla tiettyjä restriktioendonukleaasien tunnistamiskohtia voidaan istuttaa tähän vektoriin.

Polykloonauskohta (polykytkijä) on pituudeltaan lyhyestä keski-pituiseen oleva kaksijuosteinen DNA-kappale, joka käsittää lukuisia restriktioendonukleaasien tunnistamiskohtia hyvin lähellä toisiaan. Eräs esimerkeissä käytetty, vektorista M13tgl31 peräisin oleva polykloonauskohta on noin 0,07 kilo-emäsparin (KB) kokoinen, ja se käsittää 14 erilaisen restrik-tioendonukleaasin tunnistamiskohdan.

Esimerkissä 1 käytetty ja Bacillus alcalophilus HAlrksi nimetty Bacillus alcaloohilus-kanta on talletettu 28. kesäkuuta 1989 kantakokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM) talletusnumerolla DSM 5466. Muita käytettyjä mikro-orga-·- - nismeja on saatavana kaupallisesti, esim. seuraavasti: Bacil lus subtilis BD 244 (Bacillus Genetic Stock Center IA 46) tai Bacillus subtilis BD 366 (Bacillus Genetic Stock Center IE 6).

Esimerkki 1

Perimän DNA-kirjaston valmistus ja entsyymiä koodaavan geenin eristäminen käyttäen esimerkkinä B. alcalophilus-bakteeria ja 22 106315 sen erittäin alkalista proteaasia

Luonnosta löydetyn Bacillus alcalophilus HAl-bakteerin (talletettu kantakokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen talletusnumerolla DSM 5466) kromosomaalinen DNA eristettiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Saito et ai., 1963, Biochim. Biophvs. Acta. 72: 619-629, ja se hydrolysoitiin osittain restriktioendonukleaasilla Sau3A. Restriktiokappaleet erotettiin toisistaan elektroforeettisesti agaroosigeelillä, ja 3-8 kiloemäsparin (KB) kokoiset kappaleet eristettiin.

Nämä Bacillus alcalophilus HAl.-stä eristetyt ja koon mukaan valikoidut DNA-kappaleet yhdistettiin uudestaan in vitro plas-midin pUBHO (saatu esimerkissä 7 kuvatulla tavalla) vektori-DNA: hän.

Tätä tarkoitusta varten plasmidi pUBHO pilkottiin ensin restriktioendonukleaasilla BamHI, minkä jälkeen se defosforyloi-tiin vasikan suolistosta saadulla alkalisella fosfataasilla. Tämän jälkeen 2 μg pilkottua ja defosforyloitua vektori-DNA:ta ja 8 fig Bacillus alcalophilus DNA-kappaletta inkuboitiin 100 μΐ.-η kokonaistilavuudessa yhdessä T4-DNA-ligaasin kanssa 24 tunnin ajan 16 °C:n lämpötilassa.

Sitten tällä saadulla in vitro uudestaan yhdistetyllä DNA:11a transformoitiin Bacillus subtilis BD224-kannan protoplasteja käyttäen menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa S. Chang ja N. Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet.. 168: 111-115. Transformantit valikoitiin neomysiiniä sisältävillä maljoilla, ja siten ne siirrettiin rasvattomasta maidosta tehtyyn alustaan. 13800 tutkitun transformantin joukosta löydettiin yksi, jonka ympä-·* . rille muodostui selvästi muita suurempi kirkkaan alueen rasvattomasta maidosta tehdyn agarin proteolyysin seurauksena. Tästä kloonista eristettiin plasmidi-DNA Maniatis:in et ai. menetelmällä. Tämän plasmidin sisältämä, B. alcalonhilus-bakteerin DNA:sta saatu kloonattu kappale oli kooltaan 4,1 KB ja se sisälsi kaikki Bacillus alcalophilus HAl:n erittäin alkalista proteaasia varten tarvittavat tiedot.

23 106315

Seuraavien toimenpiteiden yksinkertaistamiseksi tämän 4,1 KB:n suuruisen DNA-kappaleen kokoa pienennettiin ensin. Tätä tarkoitusta varten tämän DNA-kappaleen käsittämät restriktioendo-nukleaasien tunnustamiskohdat määritettiin pilkkomalla plasmi-di erilaisilla restriktioendonukleaaseilla ja erottamalla pilkotun DNA:n kappaleet elektroforeettisesti agaroosigeelil-lä. Tällä tavalla löydettiin 2,3 KB:n suuruinen, restriktioen-donukleaasien Aval ja Hindlll irtileikkaama DNA-kappale, joka sisälsi kaikki erittäin alkalista proteaasia varten tarvittavat tiedot ja jota käytettiin jatkotoimenpiteissä. Tätä tarkoitusta varten edellä kuvattu, 4,1 KB:n kappaleen sisältävä plasmidi pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Aval ja Hindlll. 2,3 KB:n suuruinen DNA-kappale eristettiin ja se liga-toitiin vektoriin pUB131 {saatu esimerkissä 7 kuvatulla tavalla) , joka oli myös ensin leikattu endonukleaaseilla Aval ja Hindlll.

Saatu plasmidi, josta käytettiin merkintää pCLEAN4, istutettiin B. subtilis BD224-kantaan. Transformantit kykenivät erittämään erittäin alkalista proteaasia, mistä nähdään, että AvaI/-HindIII-kappale sisältää B. alcalonhilus HAl:n erittäin alkalisen proteaasin täydellisen rakennegeenin. Plasmidin pCLEAN4 restriktiokartta on esitetty kuviossa 2.

' Esimerkki 2

Rakennegeenien sekvenssimääritys käyttäen esimerkkinä B. alca-lophilus-bakteerin erittäin alkalista proteaasia

Yksijuosteisen DNA:n valmistamiseksi proteaasin rakennegeenis-tä plasmidi pCLEAN4 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Aval ja Hindlll ja noin 2,3 KB:n suuruinen Aval/Hindi11- DNA-kappale (proteaasin rakennegeeni) istutettiin faagimidiin pBS(+) tai pBS(-). Eristettyjen yksijuosteisten faagimidien sisältämän proteaasigeenin nukleotidisekvenssi määritettiin dideoksi-ketjunpäättäjämenetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Sanger et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74: 5463, sekä yksijuosteisen DNA:n emässpesifiseen kemialliseen 24 106315 pilkkomiseen perustuvalla menetelmällä Maxam:in et ai. mukaisesti (1980, Methods in Enzymology, Grossmann, L., Moldave K., toimittajat, Academic Press Inc., New York ja Lontoo, voi. 65, 499). Kuviossa 1 on esitetty selville saatu nukleotidisekvens-si sekä sitä vastaava proteaasin aminohapposekvenssi. Kypsän erittäin alkalisen proteaasin aminohapposekvenssin alkaminen nukleotidi-sekvenssin asemasta 1190 saatiin selville määrittämällä aminohappojärjestys erittäin alkalisen proteaasin N-päätteen päässä.

Esimerkki 3

Mutatoitujen DNA-sekvenssien valmistus kohdennetulla mutage-neesillä

Kohdennettuja mutaatioita aiheutettiin proteaasin rakennegee-nin DNA-osasekvensseissä "alukkeen jatkamiseen" perustuvalla tekniikalla, joka on kuvattu julkaisussa Kunkel, T.A., 1985,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492. Tähän tarkoitukseen käytettiin plasmideja pCLMUTNl (valmistus kuvattu esimerkissä 4) ja pCLMUTCl (valmistus kuvattu esimerkissä 5), jotka muunnettiin ensin jäljempänä kuvatulla tavalla urasyloiduiksi, yksi juosteisiksi analogeiksi. Nämä lähtövektorit pCLMUTNl ja pCLMUTCl eivät sisällä B. alcalophilus HAI-bakteerista peräisin olevan, proteaasin rakennegeenin koko DNA-sekvenssiä, vaan ainoastaan sen N-päätteen puolikkaan (pCLMUTNl) tai sen C-päätteen puolikkaan (pCLMUTCl).

Erään faagimidin jälkeläisinä nämä vektorit kykenevät tietyissä rajoissa muodostamaan yksijuosteista vektori-DNA:ta, jota erittyi ohessa käytetyissä olosuhteissa replikaatioon käytetys-tä isäntäorganismista ja joka voitiin eristää.

Kumpikin vektori istutettiin Maniatis:in et ai. mukaisesti (sivut 250-251) CaCl2~menetelmällä E. coli CJ236-kantaan, joka toimi isäntäorganismina.

Koska E. coli CJ236-bakteeri (urasiili-N-glykosylaasin suhteen puutteellinen mutantti) liittää vektoreiden replikoituessa 25 106315 tymiinin sijasta urasiili-nukleotidin vektorin DNA-sekvens-siin, niin edellä mainittuja transformantteja viljelemällä saatiin vektorin pCLMUTNl tai pCLMUTCl:n urasiilipitoinen analogi. Nämä urasiilia sisältävät vektorit eivät erotu in vitro-reaktioissa tavallisista tymiiniä sisältävistä vektoreista. Vektori-DNA:n sisältämä urasiili ei häiritse in vitro DNA-synteesiä, kosta urasiili ei ole in vitro eikä in vivo mutageeninen ja koska urasiili koodaa samalla tavalla kuin tyrniini. Urasyloituneita vektoreita voidaan käyttää edullisesti seuraavissa kohdennetun mutageneesin in vitro-reaktjoissa. Näiden reaktioiden päättymisen jälkeen urasiilipitoinen DNA-yksijuoste, joka toimi matriisina mutatoituneiden DNA-juostei-den (vektoreiden) tuottamiseksi, voidaan poistaa urasiili-N-glykosylaasilla käsittelemällä, mutanttien fenotyyppisen valikoinnin ollessa tarpeeton. Glykosylaasikäsittely voidaan toteuttaa sekä eristetyllä entsyymillä että vektori-DNA:11a transformoidulla E. coli-kannalla, jolla on urasiili-N-glyko-sylaasi-aktiivisuutta.

Kohdennetussa mutageneesissä matriisina tarvittava urasyloitu, vektoreiden pCLMUTNl ja pCLMUTCl yksijuosteinen DNA valmistettiin viljelemällä yhdellä näistä vektoreista transformoituja E. coli CJ236-bakteereita, jotka oli lisäksi infektoitu autta-jafaagilla M13K07.

9 • Itse auttajafaagi ei ole juurikaan lisääntymiskykyinen, eikä sillä todeta häiritsevää vuorovaikutusta vektoreiden pCLMUTNl tai pCLMUTCl vektori-DNA:n kanssa. Sen tehtävänä on muodostunutta, urasyloitunutta yksijuosteista vektori-DNA:ta varten tarkoitettujen kuoriproteiinien synteesi. Kuoren käsittävä yksijuosteinen vektori-DNA poistuu isäntäorganismista E. coli . · CJ236, ja se voidaan eristää viljelyalustasta. Näiden auttaja-faagien avulla yksijuosteisen (tässä urasyloituneen) vekto-ri-DNA:n kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen saanto saadaan olennaisesti paremmaksi.

Nämä eristetyt, urasyloidut yksijuosteiset DNA-vektorit pCLMUTNl ja pCLMUTCl hybridisoitiin esimerkin 6 mukaisesti 26 106315 valmistettujen, synteettisten oligonukleotidien kanssa, joissa oligonukleotideissä oli yksi mutaatiokohta ja jotka toimivat samalla alukkeena seuraavassa vaiheessa sekvenssin täydentämiseksi täydelliseksi, mutaation käsittäväksi DNA-kaksoisjuos-teeksi.

Toisen DNA-juosteen synteesi toteutettiin nukleotidejä lisäämällä T4 DNA-polymeraasin avulla ja tätä seuraava, juuri muodostetun juosteen ligaatio toteutettiin T4 DNA-ligaasin avulla (Kunkel et ai., 1987, Methods in Enzymology, 154, 367-382).

Muodostettu kaksijuosteinen vektori-DNA transformoitiin E. coli MC1061-kantaan ja mutatoituneet vektorit tunnistettiin selvittämällä vastaavien, ainoiden, restriktioendonukleaasien tunnistuskohtien, jotka olivat joko ilmaantuneet tai poistuneet synteettisten oligonukleotidien mukana, läsnäolo.

Esimerkki 4

Vektorin pCLMUTNl muodostaminen

Esimerkissä 1 valmistettu plasmidi pCLEAN4 pilkottiin entsyymillä Aval. Irralliset päät ("tahmeat päät") täydennettiin kaksijuosteiseksi DNA:ksi lisäämällä tarvittavaa nukleotidiä ja käyttämällä apuna E. coli:n DNA-polymeraasin I Klenow-kappa-letta (Maniatis et ai., s. 114). Tämä DNA leikattiin restrik-tio-endonukleaasilla Xbal, minkä jälkeen proteaasigeenin N-päätteen kappale, joka käsitti 1618 emäsparia, eristettiin ja kloonattiin pBS:n Smal/Xbal-kohtaan. Tuloksena olevasta vektorista käytetään merkintää pCLMUTNl. Tämän vektorin res-triktiokartta on esitetty kuviossa 4.

Esimerkki 5 9

Vektorin pCLMUTCl muodostaminen

Esimerkissä 1 valmistettu plasmidi pCLEAN4 pilkottiin restrik-tioendonukleaaseilla Xbal ja Asp7l8. 658 emäsparia käsittävä kaksijuosteinen Xbal/Asp718-DNA-kappale, joka sisältää pro-teaasin rakennegeenin C-päätteen puolikkaan, kloonattiin pBS:n Xbal/Asp7l8-kohtaan. Tuloksena olevasta vektorista käytetään 27 106315 merkintää pCLMUTCl. Tämän vektorin restriktiokartta on esitetty kuviossa 5.

Esimerkki 6

Keinotekoisen oligonukleotidin synteesi kohdennettua mutage-neesiä varten

Synteettiset oligonukleotidit valmistettiin julkaisussa Beau-cage, S.L. ja Caruthers, M.H., 1981, Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, kuvatulla menetelmällä, käyttäen b-syanoetyylifos-foramidiittia, syklonisyntetisaattorissa (Biosearch). Saadut oligonukleotidit puhdistettiin eluoimalla polyakryyliamidigee-leistä, minkä jälkeen suola poistettiin Sephadex-G25-pylväiden avulla. Esimerkkejä syntetisoiduista nukleotidisekvensseistä ja niiden ominaisuuksista on esitetty kuviossa 3. Synteettisten oligonukleotidien, joita käytettiin esimerkin 3 mukaisessa menetelmässä mutaatioiden aikaansaamiseksi proteaasigeeniin, sekvenssit oli valittu siten, että ne täyttivät seuraavat ehdot: - synteettisten oligonukleotidien DNA-sekvenssi täydensi prote-aasigeenin vastaavaa sekvenssiä vielä sen verran, että nämä sekvenssit kykenivät vielä hybridisoitumaan riittävästi toisiinsa .

- yhden tai useamman nukleotidin vaihtaminen vaihdettavaa aminohappoa koodaavassa kodonissa toisiin nukleotideihin siten, että tämä mutatoitunut kodoni saadaan nyt koodaamaan aminohappoa, jolla on enemmän tilaa vievä ja/tai ioninen amino-happojäännös (mutaatioita). Uutta aminohappoa varten käytettiin sellaista kodonia, jonka on todettu esiintyvän proteaasi-geenissä useimmiten vastaavaa aminohappoa varten.

- muiden nukleotidien vaihtaminen muissa kodoneissa siten, että aminohapon alkuperäinen koodaus säilyi, mutta joko läsnäolevia restriktioendonukleaasien tunnistamissekvenssejä poistui proteaasigeenistä tai uusia tunnistamissekvenssejä syntyi siihen. Tämä helpotti esimerkissä 3 kuvatun menetelmän mukais- 28 106315 ta seulontaa, jolla etsittiin uusia, erittäin aikalisiä prote-aaseja vastaavia, DNA-sekvenssiltään mutatoituneita vektoreita .

Esimerkki 7

Plasmidin pUBHO eristäminen ja puhdistaminen sekä vektorin pUB131 muodostaminen

Bacillus subtilis BD366-kannasta eristettiin plasmidi pUBHO menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa T.J. Gryczan et ai., 1978, J. Bacteriol.. 134: 318-329, minkä jälkeen tämä plasmidi puhdistettiin Maniatis:in et ai. mukaisesti (s. 93) keesium- kloridin tiheys-gradienttiin perustuvalla sentrifugoinnilla. Vektori pUBHO sisältää yhden, vain kertaalleen esiintyvän restriktioendonukleaasin BamHI restriktiokohdan sekä merkit-simenä DNA-sekvenssin, johon on koodautunut neomysiiniantibioo-tin vastustuskyky, sekä Bacillus-lajeissa tapahtuvassa repii-kaatiossa tarvittavat DNA-sekvenssit ("replikaation alkamiskohta") .

Edellä saatu plasmidi pUBHO pilkottiin endonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Pienempi kappale (790 bp) korvattiin 67 emäs-parista muodostuvalla polykytkijällä, joka oli ensin eristetty vektorista M13tgl31 EcoRI/BglII-kappaleena. Täten saatu vektori, josta käytetään merkintää pUB131, on näin ollen pUB110:n ’ johdannainen, josta pUBHOrsta on hävinnyt noin 0,8 KB:n suu ruinen EcoRI/BamHI-kappale, jonka häviämän paikalle on istutettu polykloonauskohta.

Esimerkki 8

Vektoreiden pUBCl31 ja pUBC132 muodostaminen

Plasmidi pUC18 leikattiin endonukleaaseilla Aatll ja PvuII 1990 emäsparin suuruinen kappale, joka käsitti b-laktamaasi-geenin ja E. coli:n "replikaation alkamiskohdan", eristettiin. Irralliset päät ("tarttuvat päät") täytettiin tarpeellisia nukleotidejä lisäämällä DNA-kaksoisjuosteeksi E. coli DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappaleen avulla (Maniatis et ai., s.

29 106315 114) . Tämä kappale istutettiin sitten esimerkin 7 mukaisesti saadun vektorin pUB131 SnaBI-kohtaan, jolloin saatiin vektori pUBC131.

Edellä saadun vektorin pUBC131 2187 emäsparia käsittävä Eco-RI/BglII-kappale alikloonattiin pBS (+):n EcoRI/BamHI-kohtaan, jolloin saatiin vektori, josta käytettiin merkintää pBSREPU. Tämän jälkeen Ncol- ja Styl-tunnistamiskohdat, jotka ovat läsnä vektorissa pBSREPU repU-polypeptidin DNA-sekvenssissä (I. Maciag et ai., 1988, Mol. Gen. Genet. 212: 232-240), eliminoitiin kohdennetulla mutageneesillä siten, että nukleotidi-sekvenssi CCA TGG korvattiin nukleotidisekvenssillä CCG TGG (molemmat nukleotidisekvenssit koodaavat aminohappojonoa tryp-tofaani-proliini). Tässä meneteltiin analogisesti esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Tätä tarkoitusta varten kohdennetun muta-geneesin matriisiksi valmistettiin vektorin pBSREPU urasyloi-tua yksijuosteista DNA:ta Ncol- ja Styl-tunnistamiskohtien eliminoimiseksi. Sitten tämä matriisi täydennettiin kaksijuos-teiseksi DNA-vektoriksi analogisesti esimerkissä 3 kuvatulla "alukkeen jatkamis"-tekniikalla käyttäen seuraavaa synteettistä oligonukleotidiä (valmistettu ja puhdistettu analogisesti esimerkissä 6 synteettisten oligonukleotidien valmistamiseki kuvatun menetelmän kanssa)

NcoI/StvI

- · Pro Trp

alkuperäinen repU-sekvenssi : AAA GTG AGA CCA TGG AGA GAA AA synteettinen repU-sekvenssi: AAA GTG AGA CCg TGG AGA GAA AA

ja E. cpli MC1061:n transformoinnin ja viljelyn jälkeen saatiin eristetyksi vektoreita, jotka eivät käsittäneet Ncol- l « eikä StyI-tunnistamiskohtia. Eristetyn vektorin 1726 emäsparin EcoRI/Apal-kappale istutettiin pUBC131:n EcoRI/Apal-kohtaan. Tästä uudesta vektorista, jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 6, käytettiin merkintää pUBC132.

Esimerkki 9

Plasmidin pALIP muodostaminen 30 106315

Plasmidi pALIP valmistettiin ligatoimalla seuraavat kolme elementtiä: 2218 emäsparin suuruinen Aval/Ncol-kappale plasmidista pCLEAN4; kappale sisältää promoottorin sekä erittäin alkalisen lähtöproteaasin prepro-alueen.

- seuraavan synteettisen kytkijän, joka käsittää restriktio-endonukleaasien Ncol, Xbal ja Asp718 yksittäiset tunnistamis-kohdat, jotka tekevät mahdolliseksi vektoreista pCLMUTl, vastaavasti pCLMUTCl peräisin olevan, proteaasigeenin mutatoitu-neen N-päätteen tai C-päätteen puolikkaan istuttamiseksi tai plasmidista pCLEAN4 saatavan, lähtöproteaasin koko geenin istuttamisen; 5’ - CCATGGTCTAGAGGTACCA - 3' 3’ - CAGATCTCCATGGTTCGAA - 5' A Λ A Λ

Ncol Xbal Asp718

Hindlll

Edellä esitetty kaksijuosteinen synteettinen kytkijä, jossa on irralliset 5'-päät, saatiin valmistamalla ensin toisistaan erillään kumpikin yksijuosteinen DNA-sekvenssi analogisesti esimerkissä 6 synteettisten oligonukleotidien syntetisoimisek-si esitetyllä tavalla ja puhdistamalla nämä sekvenssit. Tällä tavalla saadut yksijuosteet hybridisoitiin sitten keskenään kaksoisjuosteeksi.

· - 5776 emäsparin suuruinen Aval/Hindlll-kappale esimerkissä 8 valmistetusta vektorista pUBC132; tämä kappale sisältää DNA-sekvenssit E. coli:ssa tapahtuvaa replikaatiota varten sekä valikoitavan merkitsimen, sekä DNA-sekvenssit B. subtilis. B. licheniformis ja Β^_ alcalophilus-bakteereissa tapahtuvaa replikaatiota varten sekä valikoitavan merkitsimen.

Vektori pALIP muodostettiin E. coli MC1061-kannassa ja vektori 31 106315 eristettiin ampisilliinille vastustuskykyisistä Ej_ coli-trans-formanteista. Saadun vektorin restriktiokartta on esitetty kuviossa 7.

Esimerkki 10

Plasmidien pALIN ja pALlC muodostaminen

Vektorit pALIN ja pALlC muodostettiin E. coli MC1061-kannassa, eristäen nämä vektorit ampisilliinille vastustuskykyisistä E. coli-transformanteista.

Plasmidi pALIN muodostettiin pilkkomalla ensin esimerkissä 1 saatu vektori pCLEAN4 restriktioendonukleaaseilla Ncol ja Xbal, minkä jälkeen saatu NcoI/Xbal-kappale kloonattiin vektorin pAElP (valmistettu esimerkin 9 mukaisesti) NcoI/Xbal-koh-taan. Valmistettu vektori sisälsi kypsää entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin N-päätteen osan sekä erittäin alkalisen prote-aasin kopioinnille ja luennalle välttämättömät säätelyelemen-tit ja signaalisekvenssin ja jatkokäsittely- (processing-) sekvenssin.

Plasmidi pALlC muodostettiin siten, että ensin esimerkissä 1 saatu vektori pCLEAN4 leikattiin restriktioendonukleaaseilla Xbal ja Asp7l8 ja saatu Xbal/Asp718-kappale kloonattiin vektorin pALlP (valmistettu esimerkin 9 mukaisesti) XbaI/Asp718-koh-taan. Valmistettu vektori sisälsi kypsää proteaasia koodaavan DNA-sekvenssin C-päätteen osan sekä erittäin alkalisen proteaa-sin kopioinnille ja luennalle välttämättömät säätelyelementit ja signaalisekvenssin ja jatkokäsittely- (processing-) sekvenssin.

-«

Esimerkki 11

Ilmentämisvektoreiden pALINC muodostaminen

Esimerkissä valmistettiin ilmentämisvektoreita, jotka käsittivät mutaatioita proteaasin DNA-sekvenssin C-päätteen osassa, ilmentämisvektoreita, jotka käsittivät mutaatioita proteaasin DNA-sekvenssin N-päätteen osassa, sekä vertailun mahdollis- 32 106315 tamiseksi myös ilmentämisvektoreita, jotka eivät käsittäneet mutaatioita proteaasin DNA-sekvenssissä.

Kolme seuraavassa kuvattavaa ilmentämisvektoria muodostettiin kulloinkin E. coli MC1061-kannassa. Ilmentämisvektorit eristettiin ampisilliinille vastustuskykyisistä Eh. coli-transforman-teista. Näiden mutatoitujen ja mutatoimattomien proteaasigee-nien ilmentämiseksi nämä tässä esimerkissä valmistetut ja eristetyt ilmentämisvektorit istutettiin B. subtilis BD224-kantaan. Valikointi tapahtui nyt neomysiinin tai fleomysiinin vastustuskyvyn perusteella. Nämä transformantit kykenivät tuottamaan mutaation seurauksena stabiloitunutta (tämän esimerkin kohtien A ja B mukaisia vektoreita käsittävät transforman-tit) tai mutatoitumatonta (tämän esimerkin kohdan C mukaisen vektorin käsittävät transformantit) erittäin alkalista proteaa-sia. Valmistettujen, tyyppiä pALINC olevien vektoreiden res-triktiokartta on esitetty kuviossa 8.

A. Ilmentämisvektori, joka käsittää mutaatioita proteaasin DNA-sekvenssin N-päätteen osassa

Esimerkissä 3 kohdennetulla mutageneesillä saatu mutatoitu vektori pCLMUTNl leikattiin restriktioendonukleaaseilla Ncol ja Xbal. Eristetty Ncol/Xbal-kappale (proteaasin rakenne-geenin mutatoitunut N-päätteen osa, käsittäen mutaatiot K27Q, I43R, I43K, I43Q, I43E, H118W, H118Y) kloonattiin esimerkin 10 mukaisesti saadun plasmidin pALlC Ncol/Xbal-kohtaan. Saadut vektorit olivat täydellisiä ilmentämisvektoreita, joissa oli sopiva lukukehys mutaation seurauksena stabiloituneiden prote-aasien ilmentämistä varten.

B. Ilmentämisvektori, joka käsittää mutaatioita proteaasin DNA-sekvenssin C-päätteen osassa

Esimerkissä 3 kohdennetulla mutageneesillä saatu mutatoitu vektori pCLMUTCl leikattiin restriktioendonukleaaseilla Xbal ja Asp718. Eristetty Xbal/Asp7l8-kappale (proteaasin rakenne-geenin mutatoitunut C-päätteen osa, käsittäen mutaatiot R143N, 33 106315 R143S, R143T, R164Q, N237P, T249R, T249K, T249Q, T249E) kloonattiin esimerkin 10 mukaisesti saadun plasmidin pALlNXbal/-Asp718-kohtaan. Saadut vektorit olivat täydellisiä ilmentämis-vektoreita, joissa oli sopiva lukukehys mutaation seurauksena stabiloituneiden proteaasien ilmentämistä varten.

C.Ilmentämisvektori, joka käsittää lähtöproteaasin mutatoitu-mattoman DNA-sekvenssin

Ilmentämisvektori, joka käsitti proteaasin mutatoitumattoman lähtörakennegeenin, saatiin siten, että joko esimerkissä _l saadusta plasmidista pCLEAN4 peräisin oleva mutatoitumaton Ncol/Xbal-kappale kloonattiin pALlC:n (esimerkistä 10} Ncol/-Xbal-kohtaan; tai siten, että esimerkissä 1 saadusta plasmidista pCLEAN4 peräisin oleva Xbal/Asp718-kappale kloonattiin pALIN:n (esimerkistä 10) Xbal/Asp718-kohtaan. Täten saadut vektorit olivat täydellisiä ilmentämisvektoreita, joissa oli sopiva lukukehys lähtöproteaasin ilmentämistä varten.

Esimerkki 12

Mutaation seurauksena stabiloituneiden, erittäin alkalisten proteaasien sekä vertailun mahdollistamiseksi myös stabiloimattomien lähtöproteaasien valmistus 50 ml:aan esiviljelyalustaa (20 g tryptonia, 10 g hiivauutet- ta, 5 g NaCl, 75 g liukoista tärkkelystä, 10 ml maissin liotus- lientä yhtä litraa kohden) siirrostettiin testattavan kannan yksi pesäke (kulloinkin esimerkin 11 mukaisesti valmistetulla vektorilla pALINC transformoitu B. subtilis BD224). Viljelmää inkuboitiin 16 tuntia 37 °C:n lämpötilassa, sekoittaen nopeu- ” della 250 kierr./min. Tästä viljelmästä otettu 2,5 ml:n annos > · siirrostettiin 50 ml:aan varsinaista viljelmää (30 g soijajauhoa, 90 g perunatärkkelystä, 10 g Na-kaseinaattia ja 10 ml maissin liotuslientä litraa kohden). Varsinaista viljelmää inkuboitiin samanlaisissa olosuhteissa kuin esiviljelmääkin. Viljelmät sentrifugoitiin 72 tunnin kuluttua. Muodostuneet proteaasit saostettiin supernatanteista asetonilla ja puhdistettiin sitten seuraavasti: kationinvaihtaja Mono S, FPLC; 34 106315 eluointi ammonium-asetaatin, pH = 6, kasvavalla gradientilla 20 mM-200 mM.

Tällä tavalla saatiin toisaalta lähtöproteaasia ja toisaalta stabiloituneita proteaaseja, joilla on kuvion 1 mukainen aminohapposekvenssi, joka käsittää kuitenkin mutaatiot K27Q, I43K, I43Q, I43E, H118W, H118Y, R143N, R143S, R143T, R164Q, N237P, T249R, T249K, T249Q ja T249E.

Esimerkki 13

Mutaation avulla stabiloitujen, erittäin alkalisten proteaa-sien pesuteho

Keksinnön mukaisesti stabiloitujen proteaasien pesuteho selvitettiin pesukokeissa, joissa käytettiin erilaisia pesuaineita sekä eri tavalla likaantuneita kudoksia.

Esimerkki 13a

Proteaasien pesuteho määritettiin pesukokeessa käyttäen EY-PC-tyyppistä koekudosta (munankeltuainen/piirustusväri-lika poly-esteri-puuvilla-sekoitekudoksessa - oma valmiste) ja labora-toriopesukonetta (tyyppi: Polycolor). Tätä tarkoitusta varten koekudos pestiin vesipitoisella pesuliuoksella, johon oli lisätty kulloinkin tutkittavaa proteaasia pitoisuudeksi 0,71 mg/1. Pesuaineena käytettiin jauhemaiselle täyspesuaineelle ta-vanomaista pesuainekoostumusta, joka sisälsi tyypillisiä pesu-ainekomponentteja (18,4 % zeoliittia, 7,3 % Na2CC>3, 4,8 % lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia, 3,3 % ei-ionisia aineita, 3,3 % saippuaa, 0,1 % vaahdonestoainetta, 1,5 % karboksime-tyyliselluloosaa, 0,15 % optisia kirkasteita, 3,8 % natrium-·· disilikaattia, 25 % perboraattia, 1,5 % TAED, 30,85 % Na2S04).

Pesuainekoostumusta annosteltiin pesuliuokseen 6 g/1. Käytetyn veden kovuus oli 15° dH (°dH = saksalainen kovuusyksikkö). Pesu tapahtui lämpötila-alueella 15-60 °C 45 minuutin ajan (2 °C/min.; 22,5 minuutin pito 60 °C:ssa). Entsyymipitoinen pesu-liuos vaikutti koekudokseen pyörivässä näyteastiassa, jonka lämpötilaa säädettiin lämpötilaohjelmaa vastaavalla tavalla vesihauteen avulla. Pesutoimenpiteen jälkeen koekudoshuuhdot- 35 106315 tiin kahdesti vesijohtovedellä, minkä jälkeen kudokset silitettiin .

Pesuteho määritettiin mittaamalla pestyn koekudoksen aiheuttama heijastuminen remissiofotometrillä. Vertailun mahdollistamiseksi määritettiin myös muuten samoissa olosuhteissa, vain pelkällä pesuainekoostumuksella ilman proteaasilisäystä pestyn koekudoksen aiheuttama heijastuminen.

Pesukokeissa, joissa käytettiin aminohapposekvenssiin aiheutetulla korvauksella N237P stabiloitua proteaasia, todettiin 6,8 % voimakkaampi heijastuminen koekudoksesta verrattuna ilman proteaasilisäystä pestyyn koekudokseen.

Esimerkki 13b

Pesukokeet toteutettiin esimerkissä 13a esitetyllä tavalla. Pesuaineena käytettiin pesuainevalmistajalta saatavaa entsyymi-töntä pesuainekoostumusta, joka on tavanomainen jauhemaisen tiivistetyn täyspesuaineen tapauksessa. Pesuainevalmistetta annosteltiin pesuliuokseen 3 g/1. Näissä kokeissa pesu tapahtui lämpötila-alueella 15-40 °C 45 minuutin ajan (2 °C/min.; 32,5 minuutin pito 40 °C:ssa). Koekudoksena käytettiin verellä, maidolla ja piirustusvärillä liattua polyesteri-puuvilla-sekoitekudosta (EMPA 117, saatu tutkimuslaitoksesta Eidgenössi-sche Materialpriifungsanstalt, St. Gallen, Sveitsi).

«

Kokeissa tutkittiin seuraavassa taulukossa 1 mainittujen prote-aasien pesutehoja. Pestystä koekudoksesta tapahtuneen heijastumisen voimistuminen on saatu vertaamalla muuten samoissa olosuhteissa, mutta ilman proteaasilisäystä vain pesuainekoostumuksella pestyyn koekudokseen.

* ·

Taulukko 1

Keksinnön mukaisesti stabiloitujen proteaasien pesuteho pesu-kokeissa, joissa käytettiin koekudosta EMPA 117 sekä jauhemaiselle tiivistetylle täyspesuaineelle tavanomaista pesuaine-koostumusta 36 106315

Proteaasi, joka on Koekudoksen aiheuttaman stabiloitu aminohapposek- heijastumisen voimistuminen venssiin aiheutetulla verrattuna ilman proteaasia korvauksella_pestyyn koekudokseen. %_ I43Q 21,3 I43K 20,9 N114R/N237P 20,7

Esimerkki 13c

Pesukokeet toteutettiin esimerkissä 13b kuvatulla tavalla. Kokeissa käytettiin kuitenkin koekudosta EY-PC (munankeltuai-sella/piirustusvärillä liattu polyesteri-puuvilla-sekoitekudos - oma valmiste).

Kokeissa tutkittiin seuraavassa taulukossa 2 mainittujen prote-aasien pesutehoja. Kuten edellä on mainittu, pestystä koekudok-sesta tapahtuneen heijastumisen voimistuminen on saatu vertaamalla muuten samoissa olosuhteissa, mutta ilman proteaasili-säystä vain pesuainekoostumuksella pestyyn koekudokseen.

Taulukko 2

Keksinnön mukaisesti stabiloitujen proteaasien pesuteho pesu-kokeissa, joissa käytettiin koekudosta EY-PC sekä jauhemaiselle tiivistetylle täyspesuaineelle tavanomaista pesuaine-koostumusta

Proteaasi, joka on Koekudoksen aiheuttaman .. stabiloitu aminohapposek- heijastumisen voimistuminen • · venssiin aiheutetulla verrattuna ilman proteaasia korvauksella:_pestyyn koekudokseen. %_ I43Q 11,0 I43K 7,7 37 106315

Esimerkki 13d

Pesukokeet toteutettiin esimerkissä 13a esitetyllä tavalla. Pesuaineena käytettiin pesuaine-valmistajalta saatavaa ent-syymitöntä pesuainekoostumusta, joka on tavanomainen nestemäisen täyspesuaineen tapauksessa. Pesuainevalmistetta annosteltiin pesuliuokseen 4 g/1. Näissä kokeissa pesu tapahtui lämpötila-alueella 15-40 °C 45 minuutin ajan (2 °C/min.; 32,5 minuutin pito 40 °C:ssa). Koekudoksena käytettiin kooekudosta EY-PC (munankeltuaisella ja piirustusvärillä liattu polyesteri-puu-villa-sekoitekudos, oma valmiste).

Kokeissa tutkittiin seuraavassa taulukossa 3 mainittujen pro-teaasien pesutehoja. Pestystä koekudoksesta tapahtuneen heijastumisen voimistuminen on saatu vertaamalla muuten samoissa olosuhteissa, mutta ilman proteaasilisäystä vain pesuainekoos-tumuksella pestyyn koekudokseen.

Taulukko 3

Keksinnön mukaisesti stabiloitujen proteaasien pesuteho pesu-kokeissa, joissa käytettiin koekudosta EY-PC sekä nestemäiselle täyspesuaineelle tavanomaista pesuainekoostumusta

Proteaasi, joka on Koekudoksen aiheuttaman stabiloitu aminohapposek- heijastumisen voimistuminen venssiin aiheutetulla verrattuna ilman proteaasia korvauksella:_pestyyn koekudokseen. %_ T249K 4,0 T249E 5,3 I43E 4,5 • ·

Kaikissa toteutetuissa pesukokeissa keksinnön mukaisia prote-aaseja lisäämällä pestyillä koekudoksilla saatiin suurempi heijastuminen kuin pesuainekoostumuksella pestyn koekudoksen tapauksessa. Tämä osoittaa keksinnön mukaisesti stabiloitujen proteaasien erittäin hyvät pesuominaisuudet, jotka johtivat erilaisten proteiinilikojen ongelmattomaan poistoon kudoksesta pesuvaiheen aikana.

Claims (6)

38 1 0 6 3 1 5

1. Ionisten tensidien destabiloivia vaikutuksia vastaan stabiloitu erittäin alkalinen proteaasientsyymi, jossa on vähintään 90-prosenttisesti homologinen kuviossa l esitetyn aminohapposekvenssin kanssa oleva aminohapposekvenssi, tunnet- t u siitä, että aminohapposekvenssissä vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 on hydrofiilinen aminohappo.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ionisten tensidien des.tabi-loivia vaikutuksia vastaan stabiloitu erittäin alkalinen proteaasientsyymi, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssissä vähintään yhdessä asemassa 43, 47, 77, 80, 111, 235 tai 256 on aminohappo, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat asparagiinihappo, glutamiinihappo, lysiini, arginiini, asparagiini ja glutamiini.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen proteaasientsyymi, tunnettu siitä, että entsyymissä on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 95-prosenttisesti homologinen kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen proteaasientsyymi, tunnettu siitä, että aminohappo aminohapposekvenssin asemassa 43 on aminohappo arginiini, lysiini, glutamiini tai glutamiinihappo.

5. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa jotain patenttivaatimusten 1-4 mukaista erittäin alkalista proteaasientsyymiä.

6. Pesu- ja puhdistusainekoostumukset, jotka sisältävät erityisesti ionisia tensidejä, edullisesti anionisia tensidejä ja mahdollisesti muita sinänsä tyypillisiä pesu- ja puhdistu-sainekomponentteja, tunnettu siitä, että koostumukset sisältävät vähintään yhtä, jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisesti stabiloitua entsyymiä. Patentkrav 106315