JP3715320B2 - プロテアーゼ変異体及び組成物 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、洗剤組成物の配合において有用で、且つそれらの洗浄性能を保持し又は改良しながら改良された貯蔵安定性を示す新規変異酵素又は酵素変異体；前記酵素を含む清浄及び洗剤組成物；適切な細胞又は生物中に挿入された場合に前記酵素の発現をコードする変異された遺伝子；及び前記遺伝子により形質転換され、そしてそれを発現することができるそのような宿主細胞に関する。
発明の背景
洗剤産業において、酵素は30年以上もの間、洗浄配合物に利用されて来た。そのような配合物に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及び他の酵素、又はそれらの混合物である。商業的には、プロテアーゼが最も重要である。
プロテアーゼは、30年以上の間、洗剤産業において使用されて来たが、それらの酵素がたとえば洗剤組成物に存在する基質及び／他の物質といかにして反応するの詳細について多くは未知のままである。特定の残留物に関する及び一定の性質、たとえば一般的には酸化及び熱安定性に影響を及ぼすいくつかの要因は解明されているが、しかし多くは見出されないまま存続する。また、どの物理的又は化学的特徴が特定の洗剤組成物におけるプロテアーゼの良好な洗浄性能又は安定性を担当するかは、まだ正確には知られていない。
現在使用されるプロテアーゼは、多くの場合、自然からプロテアーゼを単離し、そして洗剤配合物においてそれらを試験することによって見出されて来た。
商業的に使用されているプロテアーゼとして、その対応する天然に存在する野生型プロテアーゼのタンパク質工学により処理された変異体が増加しつつあり、たとえばDURAZYM▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）, RELASE▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）, MAXAPEM▲Ｒ▼（Gist-Brocades N. V.）, PURAFECT▲Ｒ▼（Genencor International, Inc.）である。
従って、本発明の目的は、特に洗剤産業への使用のために改良されたタンパク質工学により処理されたプロテアーゼ変異体を提供することである。
プロテアーゼ
タンパク質基質におけるアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、又は（互換的に）ペプチダーゼとして分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3を参照のこと）。バシラスの種の細菌は、２種の細胞外プロテアーゼ、すなわち中性又はメタロプロテアーゼ、及び機能的にはセリンエンドペプチダーゼであり、そして通常、スブチリシンとして言及されるアルカリプロテアーゼを分泌する。それらのプロテアーゼの分泌は、細菌増殖サイクルに連鎖しており、胞子形成も生じている定常期の間、プロテアーゼの発現が高い。Jolifteなど、（1980）J. Bacteriol 141, 1199-1208は、バシラスプロテアーゼが細胞壁のターンオーバーにおいて機能することを示唆している。
サブチラーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そしてその活性部位に必須のセリン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973“Principles of Biochemistry, ”Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272）。
細菌性セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ドルトンの範囲の分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、そして活性において、真核生物のキモトリプシン（セリンプロテアーゼの一種でもある）に類似している。サブグループを包含する、より狭い範囲の用語であるアルカリプロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの、pH9.0〜11.0の高い最適pHを反映している（レビューのためには、Priest（1977）Bocteriological Rev. 41, 711-753を参照のこと）。
スブチラーゼとして仮に命名されたセリンプロテアーゼのサブグループが、Siezenなど., Protein Engng. 4（1991）719-737により提案されている。それらは、スブチリシン様プロテアーゼとしてこれまで言及されているセリンプロテアーゼの40種以上のアミノ酸配列の相同分析により定義される。スブチリシンは、グラム陽性細菌又は真菌類により生成されるセリンプロテアーゼとしてこれまで定義されており、そしてSiezenなどによれば、スブチラーゼのサブグループである。広範囲の種類のスブチリシンが同定されており、そして多くのスブチリシンのアミノ酸配列が定義されて来た。それらは、バシラス株からの６種以上のスブチリシン、すなわちスブチリシン168、スブチリシンBPN'、スブチリシンCarlsberg、スブチリシンＹ、スブチリシン・アミロサッカリチカス（amylosacchariticus）及びメセンテリコペプチダーゼ（mesentericopeptidase）（Kuriharaなど.（1972）J. Biol. Chem. 247, 5629-5631；Wellsなど.（1983）Nuclic Acids Res. 11, 7911-7925；Stahl and Ferrari（1984）J. Bacteriol. 159, 811-819；Jacobsなど.（1985）Nucl. Acids Res. 13, 8913-8926；Nedkovなど.（1985）Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 421-430；Svendsenなど.（1986）FEBS Lett. 196,228-232）、アクチノマイセタレス（actinomycetales）からの１種のスブチリシン、サーモアクチノマイセス・バルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）からのサーミターゼ（Melounなど.（1985）FEBS Lett. 198, 195-200）、及び１種の真菌スブチリシン、すなわちトリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）からのプロテアーゼＫ（Jang and Mayer（1985）Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 484-492）を包含し、さらなる参照のためには、Siezenなどからの表Ｉが下記に示されている。
スブチリシンは物理的且つ化学的に十分に特徴づけられている。それらの酵素の一次構造（アミノ酸配列）の知識の他に、基質の結合、遷移状態、生成物、少なくとも３種の異なったプロテアーゼインヒビターを明確にし、そして天然の変動についての構造上の結果を定義する、スブチリシンの50以上の高い解像度Ｘ−線構造が定義されている（Kraut（1977）Ann. rev. Biochem. 46, 331-358）。
本出願において、基質は、スブチリシンプロテアーゼによる加水分解に対して感受性の少なくとも１つのペプチド結合を含む化合物を含んで成るものとしてその広い形で解釈されるべきである。
また、“生成物”なる表現は、本発明の文脈において、スブチリシンプロテアーゼが関与する加水分解反応の生成物を包含するものとして解釈されるべきである。生成物は、続く加水分解反応において基質であり得る。
スブチラーゼの１つのサブグループであるＩ−Ｓ１は、“古典的な”スブチリシン、たとえばスブチリシン168、スブチリシンBPN'、スブチリシンCarlsberg（ALCALASE▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）及びスブチリシンDYを含んで成る。
スブチラーゼの追加のサブグループであるＩ−Ｓ２が、Siezenなど.（前記）により認識されている。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは、たとえばスブチリシンPB92（MAXACAL▲Ｒ▼, Gist-Brocades NV）、スブチリシン309（SAVINASE▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、スブチリシン147（ESPERASE▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、及びアルカリエラスターゼYaBのごとき酵素を含んで成り、高いアルカリ性スブチリシンとして記載されている。
本発明の文脈において、スブチラーゼ変異体又は変異誘発されたスブチラーゼは、元の遺伝子又は親遺伝子を有しそして対応する親酵素を生成する親微生物に由来する変異遺伝子を発現する生物により生成されるスブチラーゼを意味し、ここで前記親遺伝子は変異遺伝子を生成するために突然変異誘発されており、この変異した遺伝子が適切な宿主において発現される場合に前記変異誘発されたスブチリシンプロテアーゼが生成される。
スブチラーゼ遺伝子のランダム突然変異誘発及び特定部位突然変異誘発は、酵素の物理的及び化学的性質の知識、並びにスブチラーゼの触媒活性、基質特異性、三次構造、等に関する与えられた情報の両者から生じた（Wellsなど.（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 1219-1223；Wellsなど.（1986）Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317, 415-423；Hwang and Warshel（1987）Biochem. 26, 2669-2673；Raoなど.（1987）Nature 328, 551-554）。
この分野を包含するより最近の出版物は、基質中の特定の標的配列（位置24及び64）を切断する変異体の設計に関する、Carterなど.（1989）Proteins 6, 240-248（これは、これまで公表された多くの結果を論じている）、Graycarなど.（1992）Annals of the New York Academy of Sciences 672, 71-79（これまでに公表された多くの結果を論じている）、並びにTakagi（1993）Int. J. Biochem. 25, 307-312（やはり、今までの結果を段説している）である。
スブチリシン遺伝子の特に部位特異的突然変異誘発が大きく注目され、そして種々の突然変異が次の特許出願及び特許に記載されている：
“カルボニル ヒドロラーゼ”における部位特異的に又はランダムに生成された突然変異誘発、並びに種々の性質、たとえばKcat／Km比、pH−活性プロフィール及び酸化安定性についての突然変異誘発された酵素の続くスクリーニングに関するヨーロッパ特許第130756号公報（GENENTECH）（アメリカ特許第34,606（GENENTECH）に対応する）。この出版物は、部位特異的突然変異誘発は実施可能であり、そして特定された位置、すなわち-1Try, 32Asp, 155Asn, 104Tyr, 222Met, 166Gly, 64His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, 221Ser, 217Tyr, 156Glu又は152AlaにおけるスブチリシンBPN'の突然変異が変更された性質を示す酵素を供給することを示す。位置−１を除くすべてのそれらの位置はこの出願の前から、酵素の機能に関与することが知られており、そしてそれ故に、選択することが自明であるので、この出願は、所望の性質を有する酵素を得るために突然変異を導入する位置を決定する問題を解決するのに多くの貢献をしていない。
ヨーロッパ特許第214435号公報（HENKEL）は、スブチリシンCarlsbergのクローニング及び発現、並びにその２種の変異体に言及している。この出願においては、158Aspから158Serへの及び161Serから161Aspへの突然変異についての理由は提供されていない。
国際特許第WO87/04461号公報（AMGEN）においては、改良されたpH及び熱安定性を示す突然変異誘発された酵素を得るために親酵素に存在するAsn−Gly配列の数を減じることが提案されており、この出願においては、スブチリシンBPN'における109Asn及び218Asn残基の除去、突然変異誘発又は修飾が強調されている。Gly−残基の欠失又は修飾についての例は提供されていない。
国際特許第WO87/05050号公報（GENEX）は、ランダム突然変異、及びそれに続く、改良された性質のためのスブチリシンBPN'の多数の変異体のスクリーニングを開示する。この出願においては、位置218Asn, 131Gly, 254Thr, 166Gly, 116Ala, 188Ser, 126Leu及び53Serにおける突然変異が記載されている。
ヨーロッパ特許第251446号公報（GENENCOR）においては、一次及び三次構造レベルの両方での相同性の考慮が、保存されているか又は保存されていない同等のアミノ酸残基を同定するためにいかに適用されるかについて記載されている。この情報は、スブチリシンBPN'の三次構造についての発明者の知識と一緒になって変更された性質を有する突然変異体を得ることの期待と共に、発明者をして、突然変異に対して感受性の多くの位置の選択をさせる。そのような同定される位置は、124Met, 222Met, 104Tyr, 152Ala, 156Glu, 166Gly, 169Gly, 189Phe, 217Tyrである。さらに155Asn, 21Tyr, 22Thr, 24Ser, 32Asp, 33Ser, 36Asp, 46gly, 48Ala, 49Ser, 50Met, 77Asn, 87Ser, 94Lys, 95Val, 96Leu, 107Ile, 110Gly, 170Lys, 171Tyr, 172Pro, 197Asp, 199Met, 204Ser, 213Lys、及び221Serが酵素の種々の性質に影響を及ぼすことが予測されるものとして同定される。また、多くの突然変異誘発が、それらの提案を支持するために例示される。これらの位置における単一の突然変異誘発の他に、発明者はまた、多くの複数突然変異誘発を行なった。さらに、発明者は、興味あるものとして、215Gly, 67His, 126Leu, 135Leu、並びにセグメント97−123, 126−129, 213−215、及び152−172内のアミノ酸残基を注目すべきものとして同定するが、しかしそれらの位置のいづれにおいても、突然変異誘発は例示されない。
本発明のために特に興味あることには、ヨーロッパ特許第251446号の発明者は、170Lys（スブチリシンBPN'、タイプＩ−Ｓ１における）を置換することを示唆しており、特に彼らは、元のLysの代りにGlu又はArgを導入することを示唆している。Glu変異体が生成されたことは明らかであり、そして自己分解に対してひじょうに敏感であることが見出された（48, 121, 123ページ（表XXIは明らかな誤りを含んでいるが、しかし86分から13分への自己分解半減期の短縮を示している）並びに図32を参照のこと）。
ヨーロッパ特許第260105号公報（GENENCOR）は、触媒トライアド（triad）から約15Å内のアミノ酸残基を選択し、そしてその選択されたアミノ酸残基をもう１つの残基により置換することによって、触媒トライアドを含む酵素の一定の性質を変性することを記載する。この明細書に記載されるスブチラーゼ型の酵素は、触媒トライアドを含む酵素の種類に属するものとして特別に言及されている。スブチリシンにおいて、位置222及び217は、置換のための好ましい位置として示されている。
また、スブチリシンBPN'における99Aspから99Serへの変換がその酵素のpH依存性を変えることが、Thomas, Russell and Fersht（1985）Nature 318, 375-376により示されている。
続く文献（1987）J. Mol. Biol. 193, 803-813において、同じ著者はまた、156Gluから156Serへの置換を論じている。
それらの両突然変異誘発は、活性64Hisから約15Åの距離内に存在する。
Nature 328, 496-500（1987）において、Russel及びFershtは、表面電荷の変化を得るために酵素を突然変異誘発することによりpH−活性プロフィールを変えることについてのそれらの実験の結果及び存在する規則を論じている。
WO88/08028（Genex）及びWO88/08033（Amgen）の両者は、スブチリシンBPN'のカルシウム結合部位におけるアミノ酸残基の修飾について言及する。前記酵素は、元の残基をより負に荷電された残基により置換することによって安定化されると言われている。
WO89/06279（NOVO NORDISK A/S）においては、位置170が興味あるものとして示されており、そして存在する残基をTyrにより置換することが提案されている。しかしながら、そのような変異体に関するデータは与えられていない。WO91/00345（NOVO NORDISK A/S）においては、同じ提案が示されており、そしてスブチリシン309（タイプＩ−Ｓ２）における位置170のTyr変異体が約８のpHで洗剤として改良された洗浄性能を示すことが示されている（表III, IV, Ｖ, VI, VII, Ｘにおける変異体S003）。他の位置における他の置換と組み合わせての前記置換は、前記出願の一般的な概念にすべて従えば、改良された洗浄性能を示す（同じ表及び表VIIにおけるS004, S011−S014, S022−S024, S019, S020, S203, S225, S227）。
ヨーロッパ特許第525610A1号（SOLVAY）においては、酵素の一定の表面領域における疎水性を下げることによって、イオン性テンジド（tensides）に対する酵素（スブチリシンPB92に密接に関連するタイプＩ−Ｓ２スブチラーゼ）の安定性を改良することが示唆されている。結果的には、位置164（BPN'番号付けを用いる場合、170）におけるArgの代りにGlnを置換することが提案されている。この置換を含んで成る変異体はその出願には開示されていない。
WO94/02618（GIST-BROCADES N. V.）においては、Ｉ−Ｓ２型スブチリシンPB92の位置164（BPN'番号付けを用いる場合、170）の多くの変異体が記載されている。元のArgの代りにMet, Val, Tyr, Ileを置換することを示す例が提供されている。それらの変異体の粉末洗剤における洗浄性能試験は、わずかな改良を示唆している。特に、カカオに対するIle変異体の洗浄性能試験については、約20〜30％の改良性が示されている。安定性のデータは提供されていない。
WO95/30011, WO95/30010、及びWO95/29979（PROCTER & GAMBLE COMPANY）は表面に結合した土壌への酵素の吸着性を変える（すなわち、低める）ことが企画されている、スブチリシンBPN'及びスブチリシン309の両者における６個の領域、特に位置199-220（BPN'番号付け）を記載する。基質への酵素の低下した吸着性は、良好な洗剤洗浄性能をもたらす。提案された変異体に関する特定の洗剤洗浄性能のデータは提供されていない。
WO95/27049（SOLVAY S. A.）は、次の突然変異：N43R＋N116R＋N117R（BPN'番号付け）を有するスブチリシン309型プロテアーゼを記載する。データは、その対応する変異体が、野生型に比較して改良された安定性を有することを示唆する。
スブチラーゼの産業上の用途
プロテアーゼは、たとえばスブチリシンは、タンパク質性染色を除去するのに有用であるので、産業、特に洗剤配合に高い利用性を見出している。
現在、少なくとも次のプロテアーゼが商業的に入手できることが知られており、そしてそれらの多くは世界の多くの国々において多量に市販されている：
NOVO又は、SIGMA, St. Louis, U. S. A.から入手できるスブチリシンBPN'、
ALCALASE▲Ｒ▼としてNOVO NORDISK A/S（Denmark）により、又はMAXATASE▲Ｒ▼としてGist-Brocades N. V.（Holland）から市販されているスブチリシンCarlsberg。これらの両者は、スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ１に属する。
スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ２の中には、次のものが市販されていることが知られている：
SAVINASE▲Ｒ▼としてNOVO NORDISK A/S（Denmark）により市販されているバシラス・レンタス（Bacillus lentas）スブチリシン、すなわちスブチリシン309（この酵素のタンパク質工学的に処理された変異体は、DURAZYM▲Ｒ▼として市販されている）、
SAVINASE▲Ｒ▼と密接に類似する酵素、たとえばGist-Brocades N.V.により市販されているMAXACAL▲Ｒ▼（この酵素のタンパク質工学的に処理された変異体はMAXAPEM▲Ｒ▼として市販されている）、SOLVAY et Cieにより市販されているOPTICLEAN▲Ｒ▼、及びGENENCOR Internationalにより市販されているPURAFECT▲Ｒ▼、
バシラス・レンタス スブチリシン、すなわちESPERASE▲Ｒ▼としてNOVO NORDISK A/S（Denmark）により市販されているスブチリシン147。
しかしながら、効果的であるためには、そのような酵素は、洗浄条件下で、活性を示すべきであるのみならず、さらに、洗剤の製造及び貯蔵の間、他の洗剤成分と適合性できるべきである。
たとえば、スブチリシンは、他の基質に対して活性である他の酵素と組合して使用され得、そしてその選択されたスブチリシンはそのような酵素に対して安定性を有すべきであり、そしてまた、その選択されたスブチリシンは好ましくは、他の酵素の分解を触媒すべきではない。また、選択されたスブチリシンは、洗剤配合物における他の成分、たとえば漂白剤、酸化剤、等からの作用に対して耐性であるべきであり、特に洗剤配合物に使用されるべき酵素は、貯蔵の間、洗剤における、及び洗浄の間、洗浄流体における非酵素成分によりもたらされる、酸化力、カルシウム結合性質及びpH条件に対して安定性であるべきである。
たとえば洗浄の間、清浄されるべき物体上に存在する種々の天然に存在する基質の分解を触媒する酵素の能力は、しばしば、その洗浄能力（washing ability）、洗濯適性（washability）、洗浄力（detergecy）又は洗浄性能（washing performance）として言及される。本出願を通して、用語、洗浄性能（wash performance）がこの性質を包含するために使用されるであろう。
使用される前（通常、洗浄工程において水を添加することにより）に、洗剤組成物の他の成分の存在下で活性のままに存続する酵素の能力は通常、貯蔵安定性又は保存寿命として言及される。それはしばしば、半減期、ｔ1/2として測定される。我々は、この性質を包含するために本出願を通してこの性質のための表現、貯蔵安定性を用いるであろう。
天然に存在するスブチリシンは、たとえばpHの変動下でのそれらの洗浄力又は能力のごときパラメーターに関してひじょうに可変性である性質を有することが見出された。上記の市販の洗剤プロテアーゼのいくつかは、実際、約20年前に市販されたプロテアーゼよりも良好な性能を有するが、しかし最適な性能のためには、個々の酵素は、配合及び洗浄条件に関してそれ自体の特定の条件、たとえばpH、温度、イオン強度（Ｉ）、活性システム（テンジド（tenside）、界面活性剤、漂白剤、等）、ビルダー、等を有する。
結果として、低いpH及び低いＩのもとで所望の性質を有する酵素はよりアルカリ性の条件及び高いＩのもとではほとんど魅力的なものではなく、あるいは高いpH及び高いＩのもとで良好な性質を示す酵素は低いpH及び低いＩ条件下でほとんど魅力的なものではないことが見出された。
また、貯蔵安定性は酵素間で異なることが見出されたが、しかし特定の酵素は、多くのパラメーター、たとえばpH, pI, 漂白システム、テンジド等、及び粉末、ダスト又は液体形で存在することができる洗剤組成物の物理的状態に依存して、洗剤配合物が異るごとに貯蔵安定性の大きな変動を示すことがさらに見出された。さらに、それは濃縮され得又は希釈することができる。
組換えDNA技法の出現及び発達は、タンパク質化学の分野に多大な影響を有した。
この技法の適用を通して、所望のアミノ酸配列を有する酵素を構成することが現在、可能であり、そして上記のようにして、相当量の研究が変更された性質を有するスブチリシンの企画に向けられて来た。
それらの提案の中で、ヨーロッパ特許第130756号公報（GENENTECH）（アメリカ再発行特許第34,606号（GENENCOR））及び国際特許第WO87/05050号公報（GENEX）に記載されるような多数の突然変異誘発された酵素の生成及びスクリーニング技法は、天然の酵素を単離する古典的な方法にかなりの程度対応し、古典的な突然変異誘発プログラムに従い（放射性又は化学突然変異誘発物質を用いて）、そしてそれらの性質についてスクリーンする。それらの方法が特定の位置において置換されている多数の変異酵素の存在の知識を通してより効果的である点において、相違がある。
スブチリシン酵素は典型的には、約275個のアミノ酸残基を含んで成る。個々の残基は、20個の可能な天然に存在するアミノ酸のうちの１つであり得る。
従って、この方法における１つのひじょうに重大な欠点は、それらの性質を決定するために多くの予備スクリーニングにゆだねられるべきひじょうに多くの突然変異が生成されることである。
従って、それらの特許出題に概略されるような方法は、長年知られている伝統的なランダム突然変異方法よりも単にわずかに良好であろう。
他の知られている技法は、特定の性質、たとえば酸化安定性、熱安定性、Ca−安定性、エステル交換及び加水分解速度（ヨーロッパ特許第260105号公報（GENENCOR））, pH−活性プロフィール（Thomas, Russell and Fersht, 前記）、及び基質特異性（国際特許出願第WO88/07578号公報（GENENTECH））の変更に関する。それらの出版物のいづれも、酵素の洗浄性能又はそれらの貯蔵安定性のいづれかの変更について言及していない。
国際特許出願番号PCT/DK88/00002（NOVO NORDISK A/S）においては、アミノ酸位置が突然変異誘発のために選択され、そしてアミノ酸が洗浄性能における所望する変化を得るためにそれらの位置において置換されるべきことを決定するために相同性比較の概念を用いることが提案されている。
そのような方法を用いるこにより、生成される変異体の数がより少ないので、スクリーニングの仕事が激的に減じられるが、しかしその方法によれば、親酵素と比較に使用される酵素との組合された有用な性質を示す酵素が得られることが予測されるにすぎない。
従って、上記に示されたように、酵素の十分に定義された性質、たとえば上記性質と、種々の洗剤組成物における酵素の洗浄性能及び貯蔵安定性との間の関係がまだ同定されていない。
問題は、多くの研究が酵素活性の機構を示すことに向けられて来たが、特に酵素が複雑な混合物に存在する場合、それらの特徴のほとんどに関して酵素の性質、たとえば洗剤における貯蔵安定性を決定する、構造体における要因及びアミノ酸の組合せについてまだほとんど知られていないことであるように思われる。
従って、洗剤システムのための酵素のさらなる改良及び調整のための必要性、及び洗浄又は洗剤組成物の実際的な使用におけるプロテアーゼ作用及び分解の機構の最良の理解の必要性がまだ存在する。そのような理解は、洗剤組成物において特定の条件下で改良された貯蔵安定性を示す酵素を、適切な程度の確実性を伴ってもたらすであろう突然変異を選択するために適用され得る規則を提供するであろう。
発明の要約
洗剤において改良された貯蔵安定性及び／又は改良された性能を有するスブチラーゼ変異体が、親スブチラーゼの疎水性ドメインに位置するか又はそのドメイン付近に位置する１又は複数のアミノ酸残基を、元の残基よりもより疎水性のアミノ酸残基により置換することによって得られることが、今や、驚くべきことには見出され、ここで前記疎水性ドメインはBLS309の残基P129, P131, I165, Y167, Y171（BASBPN番号付けにおける）に対応する残基を含んで成り、そして前記ドメイン付近の残基がBLS309の残基E136, G159, S164, R170, A194及びG195に対応する残基を含んで成り、但し、BABP92のR170M, R170I及びR170V変異体を除く。
従って、本発明は、その第１の観点において洗剤において改良された安定性及び／又は改良された洗浄性能を示す酵素変異体に関する。
その第２の観点において、本発明は、前記第１の観点のスブチリシン酵素を発現するように導かれる宿主細胞中に適切な態様で挿入される場合、その第１の観点の酵素を発現することができるDNA構造体に関する。
第３の観点において、本発明は、適切な宿主中に前記第２の観点のDNA構造体を挿入し、所望のスブチラーゼ酵素を発現するために前記宿主を培養し、そして酵素生成物を回収することによる、本発明のスブチリシン酵素の製造に関する。
本発明は、スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ２酵素及び上記のような、続く酵素変異体を発現する遺伝子の変異体に一部、関するが、但し、それらだけには限定されない。本発明により包含される他のスブチラーゼ遺伝子変異体は、スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ１、たとえばスブチリシンBPN'及びスブチリシンCarlsberg遺伝子の変異体、並びにさらに濃縮された液体洗剤において改良された安定性を示す、スブチリシンBPN'、プロテアーゼＫ及びスブチリシンCarlsberg変異体酵素である。
本発明により包含されるさらに追加のスブチラーゼ遺伝子変異体は、たとえばプロテアーゼＫ及び他の遺伝子、並びにさらに濃縮された液体洗剤において改良された安定性を示す、プロテアーゼＫ及び／他のスブチラーゼ変異体酵素である。
本発明に従って、変性され得る親スブチラーゼ酵素の他の例は、表Ｉに列挙される。
さらに、本発明は、洗浄組成物への前記変異体酵素の使用及び前記変異体酵素を含んで成る洗浄組成物、特に前記変異体スブチリシン酵素を含んで成る洗剤組成物にも関する。特に、本発明は、そのような酵素変異体を含んで成る濃縮された液体洗剤組成物に関する。
略語
アミノ酸
Ａ＝Ala＝アラニン
Ｖ＝Val＝バリン
Ｌ＝Leu＝ロイシン
Ｉ＝Ile＝イソロイシン
Ｐ＝Pro＝プロリン
Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン
Ｗ＝Trp＝トリプトファン
Ｍ＝Met＝メチオニン
Ｇ＝Gly＝グリシン
Ｓ＝Ser＝セリン
Ｔ＝Thr＝トレオニン
Ｃ＝Cys＝システイン
Ｙ＝Tyr＝チロシン
Ｎ＝Asn＝アスパラギン
Ｑ＝Gln＝グルタミン
Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸
Ｅ＝Glu＝グルタミン酸
Ｋ＝Lys＝リシン
Ｒ＝Arg＝アルギニン
Ｈ＝His＝ヒスチジン
Ｘ＝Xaa＝いづれかのアミノ酸
核酸塩基
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン（DNAにおいてのみ）
Ｕ＝ウラシル（RNAにおいてのみ）
変異体
本発明に従って製造され又は企画される種々の酵素変異体を記載する場合、言及を容易にするために次の命名法が適合される：
元のアミノ酸 位置 置換されるアミノ酸。
これによれば、位置195でのグリシンに代わるグルタミン酸の置換は次のように記載され：
Gly 195 Glu又はG195E、
同じ位置でのグリシンの欠失は次のように記載され：
Gly 195*又はG195*、そして
追加のアミノ酸残基、たとえばリシンの挿入は次のように記載される：
Gly 195 Gly Lys、又はG195GK。
前記番号付けのために使用される配列に比較しての欠失が示される場合、そのような位置での挿入は次のように示される：
位置36でのアスパラギン酸の挿入のためには、
*36Asp又は*36D。
複数の突然変異はプラス（＋）により分離され、すなわち：
Arg 170 Tyr＋Gly 195 Glu、又はR170Y＋G195Eは、それぞれアルギニン及びグリシンに代ってチロシン及びグルタミン酸が存在する位置170及び195での突然変異を表わす。
位置
本出願及び付随する請求の範囲において変異体を記載する場合、Siezenなど., 前記におけるように整列された種々のスブチラーゼが使用される。スブチラーゼに関する他の出版物においては、特定の酵素の他の整列又は番号付けが用いられて来た。本明細書に使用される番号付けにおいて特定の残基の位置を確立することは当業者に通常の出来事である。多数のスブチラーゼから本発明のために適切な一連の残基を示す図１をも参照のこと。多くのスブチラーゼから本発明のために適切な一連の残基を示すWO91/00345の表Ｉもまた参照のこと。
表Ｉのために使用される参照
アミノ酸に対する参照（Gen Bank▲Ｒ▼／EMBL Data Bank受託番号が括弧に示されている）：
ARB172：Kamekura and Seno,（1990）Biochem. Cell. Biol. 68, 352-359（成熟プロテアーゼ残基1-35のアミノ酸配列決定；残基I4は決定されていない）。
BSS168：Stahl. and Ferrari.（1984）J. Bacteriol. 158, 411-418（KO1988）. Yoshimoto, Oyamaなど.（1988）J. Biochem. 103, 1060-1065（Ｂ. サブチリスvar. アミロサッカロチカスからの成熟スブチリシンは、T130S及びT162Sを有することで異なる）。Svendsen, など.（1986）FEBS Lett. 196, 228-232（PIR A23624；アミノ酸配列決定；Ｂ. メセンテクカスからの成熟アルカリメセンテリコペプチダーゼはS85A, A88S, S89A, S183A及びN259Sを有することで異なる）。
BASBPN：Wells, など.（1983）Nucl. Acids Res. 11, 7911-7925（X00165）. Vasanthaなど.,（1984）J. Bacteriol. 159, 811-814（K02496）。
BSSDY：Nedkovなど.（1983）Hoppe-Seyler&s Z. Physiol. Chem. 364, 1537-1540（PIR A00969；アミノ酸配列決定）。
BLSCAR：Jacobsなど.（1985）Nucleic Acids Res. 13 8913-8926（X03341）. Smithなど.（1968）J. Biol. Chem. 243, 2184-2191（PIR A00968；アミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼ配列は、T103S, P129A, S158N, N161S and S212Nを有することにおいて異なる）。
BLS147：Hastrupなど.（1989）PCT Patent Appl. WO 8906279, Pub. July 13 1989.（Ｂ. レンタスからのEsperase▲Ｒ▼）。Takamiなど.（1990）Appl. Microbiol. Biotechnol., 33, 519-523（バシラスsp. 番号AH-101からの成熟プロテアーゼ残基1-20のアミノ酸配列決定；この配列はN11Sを有することにおいてBLS147と異なる）。
BABP92：van der Laanなど.（1991）Appl. Environ. Microbiol. 57, 901-909.（Maxacal▲Ｒ▼）. Hastrupなど.（1989）PCT Patent Appl. WO 8906279. Pub. 13 Jul 1989.（Ｂ. レンタスからのスブチリシン309 Savinase▲Ｒ▼は、N875を有することにおいてのみ異なる）。Godetteなど.（1991）Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 6, Baltimore：抄録M8（Ｂ. レンタスからの高−アルカリプロテアーゼは、N87S, S99D, S101R, S103A, V104I及びG159Sを有することにおいて異なる）。
BDSM48：Rettenmaierなど.（1990）PCT Patent Appl. WO90/04022. Publ. April 19, 1990。
BYSYAB：Kanekoなど.（1989）J. Bacteriol. 171 5232-5236（M28537）。
BSEPR：Slomaなど.（1988）J. Bacteriol. 170 5557-5563（M22407）. Bruckner（1990）Mol. Gen. Genet. 221, 486-490（X53307）。
BSBPF：Slomaなど.（1990）J. Bacteriol. 172, 1470-1477（M29035；訂正されている）。Wuなど.（1990）J. Biol. Chem. 265, 6845-6850（J05400；この配列は、フレームシフトのために、A169V及び586以下のＣ−末端残基を有することにおいて異なる）。
BSISP1：Koideなど.（1986）J. Bacteriol. 167, 110-116（M13760）。
BSIA50：Stronginなど.（1978）J. Bacteriol. 133, 1401-1411（成熟プロテアーゼ残基1-54のアミノ酸配列決定：残基３, 39, 40, 45, 46, 49及び50は決定されなかった）。
BTFINI：Chestukhinaなど（1985）Biokhimiya. 50, 1724-1730（Ｂ. ツリンジエンシス変種イスラエリエンシルからの成熟プロテアーゼ残基１−14及び変種フィニティマスからの残基1-16及び223-243のアミノ酸配列決定）。Kunitateなど.（1989）Agric. Biol. Chem. 53, 3251-3256（変種クルスタキBTKURSからの成熟プロテアーゼ残基6-20のアミノ酸配列決定）。
BCESPR：Chestukhinaなど（1985）Biokhimiya 50, 1724-1730（成熟残基1-16及び223-243のアミノ酸配列決定）。
NDAPII：Tsujiboなど.（1990）Agric. Biol. Chem. 54, 2177-2179（成熟残基1-26のアミノ酸配列決定）。
TVTHER：Melounなど（1985）FEBS Lett. 183, 195-200（PIRA00973；成熟プロテアーゼ残基1-274のアミノ酸配列決定）。
EFCYLA：Segarraなど.（1991）Infect. Immun. 59, 1239-1246。
SEEPIP：Schnellなど.（1991）personal communication（Siezenなど.（前記））。
SPSCPA：Chenなど.（1990）J. Biol. Chem. 265, 3161-3167（J05224）。
DNEBPR：Korttなど.（1991）Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 22-26, Baltimore. 抄録S76。
LLSK11：Vosなど.（1989）J. Biol. Chem. 264, 13579-13585（J04962）. Kokなど.（1988）Appl. Environ. Microbiol. 54, 231-238（M24767；Wg２株からの配列は、プロテアーゼドメインにおける18の差異及び残基1617-1676の欠失を包含する、44の位置において異なる）。Kiwakiなど.（1989）Mol. Microbiol., 3, 359-369（X14130；NCD0763株からの配列は、プロテアーゼドメインにおける22の差異及び残基1617-1676の欠失を包含する、46の位置において異なる）。
XCEXPR：Liuなど.（1990）Mol. Gen. Genet. 220, 433-440。
SMEXSP：Yanagidaなど.（1986）J. Bacteriol. 166, 937-994（M13469）。
TAAQUA：Teradaなど.（1990）J. Biol. Chem. 265, 6576-6581（J054I4）。
TRT41A：McHaleなど.（1990）Abstracts 5th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen, Munck and Villadsen（eds）, Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen。
VAPROA：Deaneなど.（1989）Gene 76, 281-288（M25499）。
SRESPD：Lavrenovaなど.（1984）Biochemistry USSR. 49, 447-454（残基1-23のアミノ酸配列決定；残基13, 18及び19は決定されていない）。
AVPRCA：Maldenerなど.（1991）Mol. Gen. Genet. 225, 113-120（公開された配列は、フレームシフト読み取り誤差のために位置200-210近くで28個の不確定残基を有する）。
TAPROK：Gunkel and Gassen（1989）Eur. J. Biochem. 179, 185-194（X14688/XI4689）. Janyなど.（1986）J. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 87（PIR A24541；アミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼは、S745G, SILST204-208DSL及びVNLL264-267FNLを有することにおいて異なる）。
TAPROR：Samalなど.（1990）Mol. Microbiol. 4, 1789-1792（X56116）。
TAPROT：Samalなど.（1989）Gene 85, 329-333。
AOALPR：Tatsumiなど.（1989）Mol. Gen. Genet. 219, 33-38。Cheevadhanarahなど.（1991）EMBL Data Library（X54726）。
MPTHMY：Gaucher and Stevenson（1976）Methods Enzymol. 45, 415-433（残基1-28、及び活性部位セリンを有するヘキサペプチドLSGTSMのアミノ酸配列決定）。
ACALPR：Isogaiなど.（1991）Agric. Biol. Chem. 55, 471-477。Stepanovなど.（1986）Int. J. Biochem. 18, 369-375（残基1-27のアミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼはH13［1］Qは、R13［2］N及びS13［6］Aを有することにおいて異なる）。
KEX1：Tanguy-Rougeau, Wesolowski-Louvel and Fukuhara（1988）FEBS lett. 234, 464-470（X07038）。
SCKEX2：Mizunoなど.（1988）Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254（M24201）。
SCPRB1：Moehleなど.（1987）Mol. Cell. Biol. 7, 4390-4399（M18097）。
YLXYPR2：Davidowなど.（1987）J. Bacteriol. 169, 4621-4629（M17741）。Matobaなど.（1988）Mol. Cell Biol. 8, 4904-4916（M23353）。
CEBL14：Peters and Rose（1991）The Worm Breeder's Gezette 11, 28。
DMFUR1：Roebroekなど.（1991）FEBS Lett. 289, 133-137（X59384）。
DMFUR2：Roebroekなど.（1992）267, 17208-17215。
CMCUCU：Kanedaなど.（1984）J. Biochem. 95, 825-829（活性部位セリンを有するオクタペプチドNIISGTSMのアミノ酸配列決定）。
HSFURI：van den Ouwelandなど.（1990）Nucl. Acids Res. 18, 664（X04329）（マウス フリンの配列は、触媒ドメインにおける次の５つの残基を包含する51の位置において異なる：A15E, Y21F, S223F, A232V及びN258［2］D）。Misumiなど.（1990）Nucl. Acids Res. 18, 6719（X55660：ラット フリンの配列は、触媒ドメインにおける次の３つの残基を包含する49の位置において異なる：A15E, Y21F, H24R）。
HSIPC2：Smeekens and Steiner（1990）J. Biol. Chem. 265, 2997-3000（J05252）。Seidahなど.（1990）DNA Cell Biol. 9, 415-424（マウス下垂体PC２プロテアーゼの配列は、プロテアーゼドメインにおける次の７つの残基を包含する23の位置において異なる：I4F, S42[2]Y, E45D, N76S, D133E, V134L及びG239[1]D）。
MMPPC3：Smeekensなど.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 340-344（M58507）。Seidahなど.（1990）DNA Cell Biol. 9, 415-424（M55668/M55669；部分配列）。
HSTPP：Tomkinson and Jonsson（1991）Biochemistry 30, 168-174（J05299）。
【図面の簡単な説明】
図面において、図１は表Ｉに言及される一連の多くのスブチラーゼを示す。
図２は、疎水性ドメインの位置、及び本発明に従って置換されるその近くのアミノ酸残基のいくつかを示すスブチリシン309の３次元表示である。
発明の特定の記載
スブチラーゼの洗剤における貯蔵安定性及び／又は改良された性能が、スブチリシン309の残基P129, P131, I165, Y167, Y171を含んで成る疎水性ドメインに位置するか又はそのドメインの近くに位置するアミノ酸残基がより疎水性の残基により置換される場合、一般的に改良されることが、驚くべきことには見出された。問題の残基は特に、E136, G159, S164, R170, A194及びG195である。
さらに、前記変異体は、液体洗剤及び成形された固体形の洗剤において、特に高い改良された安定性を示す。
図２は、スブチリシン309における疎水性ドメイン、及び前記ドメインの疎水性を高めるために置換される予定である、前記ドメインの近くに位置する残基の幾つかを示す。これは、非疎水性残基を疎水性残基により置換することにより、及び／又は親酵素におけるよりもより一層、疎水性になるように残基を置換することによって達成され得る。
同じ原理が他のスブチラーゼにおけるその対応するドメインに適用され、この同定は、当業者の範囲内である。図２におけるような図表示は、本発明に従って置換される標的残基を決定するために他のスブチラーゼに適用できる。
その多くが下記表IIに示される：
表IIは、図２に示される配列を用いて構成された。他のスブチラーゼを包含する類似する又はより大きな表が当業者により容易に製造され得ることは、明白である。
従って、本発明は、スブチリシン酵素の遺伝子の突然変異誘発によりアミノ酸配列が変更されているスブチラーゼ変異体に関し、ここで、位置129, 131, 165, 167, 171, 136, 159, 164, 170, 194及び195におけるアミノ酸残基の発現を担当するコドンにおいて親酵素又は遺伝子を変性することが所望され、前記残基は親酵素における残基よりもより疎水性であり、特に、比較的長い疎水性側鎖、たとえばIle, Leu及びValを含んで成るような疎水性残基であり、それにより、突然変異誘発された遺伝子が発現される場合、アミノ酸残基が、ドメイン自体の疎水性を高めるより一層疎水性の残基により置換される。
疎水性アミノ酸残基は一般的に次のものである：Val（V）, Ile（I）, Leu（L）, Met（M）, Phe（F）, Pro（P）及びTrp（W）。それらの中で、Val, Ile及びLeuが好ましい。
表IIを参照し、そして本発明の原理を適用することによって、置換のための多くの候補体が明確になる。
BASBPN及びBLSCARの両者に関しては、位置129, 131, 136, 159, 164, 167, 170, 171及び195で置換を行なうことが適切であるように思える。BLS309においては、位置136, 164, 167, 170及び171が最初の選択であり、そして位置159及び159はまた、第２の選択であろう。BLS147においては、位置129, 131, 136, 167, 170, 171及び195が最初の選択であり、そして位置159及び164が第２の選択である。最後に、TVTHERにおいては、位置129, 131, 136, 167, 171及び194が最初の選択であり、そして位置164が第２の選択である。
本発明によれば、疎水性ドメインにおけるGly残基を、よりバルキー（bulky）で且つより疎水性の残基に置換することが利点を必然的に伴う。
そのような考慮は、上記位置のいづれかを占めることができるいづれかの親水性又は疎水性残基のために適用でき、これは疎水性のいくらかの上昇が好都合であるように思えることを意味する。これは、たとえば、ひじょうに親水性の残基、たとえば荷電された残基Arg（R）, Asp（D）, Glu（E）又はLys（K）が低い親水性であるいづれかの残基により置換され得ることを意味する。そのような低い親水性残基は、残基Gly（G）, Cys（C）, Ser（S）, Ala（A）, Thr（T）, Tyr（Y）, Gln（Q）, His（H）又はAsn（N）を含んで成る。それは、Tyr（Y）がより疎水性の残基、たとえばPhe（F）, Leu（L）又はIle（I）により置換され得ることもまた意味する。
類似する考慮が、酵素の表面のこの部分に疎水性ドメインを有する他のスブチラーゼに適用され得る。
本発明においては、スブチラーゼは、Siezenなど、前記、に従って定義される。本発明の多くの態様に適用できるより狭い意味においては、興味あるスブチラーゼは、サブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２に属するものである。より特定の意味においては、本発明の態様の多くは、上記表Ｉに列挙されるスブチラーゼと、それらの一次構造において実質的に明白な相同性にすることができるグラム陽性細菌のセリンプロテアーゼに関係する。
本発明はまた、親酵素のアミノ酸配列へのいづれか他の置換、欠失又は付加と組み合わせての、前に記載した位置におけるいづれか１又は複数の置換も含んで成る。特に、酵素に改良された性質を付与することが知られている他の置換との組合せが考えられる。
そのような組合せは、位置：222（酸化安定性を改良する）、218（熱安定性を改良する）、酵素を安定化するCa−結合部位例えば76での置換、及び従来技術から明らかである多くの他の位置を含んで成る。
さらに、ヨーロッパ特許第405901号に言及される変異体との組合せもまた、特に予測される。
変異体
Ａ：単一の変異体：
スブチリシンBPN′, スブチリシンCarlsberg, スブチリシン168, 及びスブチリシンDY変異体：
サーミターゼ変異体：
スブチリシン309, スブチリシン147, 及びバシラスPB92プロテアーゼ変異体：
（BLS309を除く）, R170V（BAPB92を除く）, R170I（BAPB92を除く）, R170L, R170M（BAPB92を除く）, R170F, R170G, R170C,
Ｂ．組合せの変異体：
上記変異体のいづれかが、下記位置のいづれかにおいて他の変異体と組合される場合、好都合であると予測される：27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
特に、次のELS309及びBAPB92変異体は、組合せのために適切であると思われる：K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L、及びT274A。
また、上記のいづれか１又は複数の他の置換、欠失、及び／又は挿入と組み合わせて、X167V, X167M, X167F, X167L, X167I, X170V, X170M, X170F, X170L、及び／又はX170Iのいづれか１又は２の置換を含んで成るそのような変異体は好都合である。
さらに、上記のいづれか１又は複数の置換、欠失及び／又は挿入と組み合わせて、変異体V104N＋S101G, K27R＋V104Y＋N123S＋T274A、又はN76D＋V104A、又はそれらの突然変異との他の組合せのいづれか（V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A）を含んで成る変異体は、改良された性質を示すと思われる。
言及される特定の組合せは次の通りである：
変異体酵素を含んで成る洗剤組成物
本発明はまた、清浄及び洗浄組成物への本発明の変異体酵素の使用、及び変異体スブチリシン酵素を含んで成るそのような組成物を含んで成る。そのような清浄及び洗浄組成物は、原則としていづれの物理形でも有することができるが、しかしスブチラーゼ変異体は好ましくは、改良された酵素安定性又は性能を示す、直接的な適用のための棒、錠剤、スチック及び同様のものの形で液体洗浄組成物又は洗浄組成物に組込まれる。
本発明の液体組成物の中には、たとえば均質な物理的特性を有する水性液体洗剤が存在し、たとえばそれらは、連続した水性相、いわゆる等方性液体における界面活性剤のミセル溶液から成ることができる。
他方、それらは不均質な物理的相を有することができ、そしてそれらは、ヨーロッパ特許出願第346995（Unilever）（引用により本明細書に組込まれる）に記載されるように、１つの親水性主鎖及び少なくとも１つの疎水性側鎖を有する解膠性ポリマーを含んで成る、連続した水性相における層状液滴の分散体から構成され、たとえばそれらから成ることができる。それらの後者の液体は、不均質性であり、そして懸濁された固形粒子、たとえば下記種類のビルダー材料の粒子を含むことができる。
粉末洗浄組成物に関して、そのような組成物は、本発明のいづれかの前記観点におけるいづれか１又は複数のスブチリシン酵素変異体の他に、当業者に良く知られているような組成物に含まれるいづれかの通常の成分を単独で又は組合して含んで成る。
そのような成分は、ビルダー、たとえばホスフェート又はゼオライトビルダー、界面活性剤、たとえばアニオン、カチオン、非イオン又は両性イオン型界面活性剤、ポリマー、たとえばアクリル又は同等のポリマー、漂白剤システム、たとえば過硼酸塩−又はアミノ−含有漂白剤前駆体又は活性剤、構造活性剤（structurants）、たとえばシリケート構造活性剤、pHを調整するためのアルカリ又は酸、保湿剤、及び／又は中性無機塩を包含する。
さらに、多くの他の成分、たとえば、下記成分が、本発明の組成物に通常、存在する：
Ａ．補助界面活性剤
Ｂ．タルトレート スクシネート ビルダー
Ｃ．中和システム
Ｄ．泡抑制剤
Ｅ．他の酵素
Ｆ．他の任意の成分。
アニオン界面活性剤：非イオン界面活性剤の重量比は、好ましくは１：１〜５：１である。組成物は、20℃で水中、10重量％溶液において7.0〜9.0のpH, 200ppmよりも低いか又はそれに等しい臨界ミセル濃度、及び蒸留水において35℃及び臨界ミセル濃度で、32ダイン／cmよりも低いか又はそれに等しい空気／水界面張力を有する。組成物は好ましくは、透明で、均質で且つ相安定性であり、そして良好な清浄性能及び酵素安定性を有する。
種々の成分：
１．アニオン性界面活性剤
本発明の組成物は、約10重量％〜約50重量％、好ましくは約15重量％〜約50重量％、より好ましくは約20重量％〜40重量％、及び最とも好ましくは20重量％〜約30重量％の天然又は合成のアニオン性界面活性剤を含む。適切な天然又は合成のアニオン性界面活性剤は、たとえば石鹸及びアメリカ特許第4,285,841号及び第3,929,678号に開示されるものである。
有用なアニオン性界面活性剤は、水溶性塩、特に、それらの分子構造体に、約10〜約20個の炭素原子を含むアルキル基及び硫酸又は硫酸エステル基を有する有機硫酸反応生成物の、アルカリ金属、アンモニウム及びアルキロールアンモニウム（たとえば、モノエタノールアンモニウム又はトリエタノールアンモニウム）塩を包含する。（用語“アルキル”とは、アリール基のアルキル部分を包含する。）合成界面活性剤のこのグループの例は、アルキルスルフェート、特に、高級アルコール（Ｃ8−Ｃ18の炭素原子）、たとえば牛脂又はヤシ油のグリセリドを還元することによって生成されるものを硫酸化することによって得られるもの；及びアルキル基が直鎖又は枝分れ鎖の形状で約９〜約15個の炭素原子を含むアルキルベンゼンスルホネート、たとえばアメリカ特許第2,220,099号及び第2,477,383号に記載されるタイプのものである。アルキル基における炭素原子の平均数が約11〜14である直鎖アルキルベンゼンスルホネートが特に価値がある。
本明細書における他のアニオン性界面活性剤は、水溶性塩、たとえば８〜約24個（好ましくは、約12〜18個）の炭素原子を含むパラフィンスルホネート；アルキルグリセリルエーテルスルホネート、特にＣ8−Ｃ18のアルコール（たとえば、牛脂及びヤシ油に由来するもの）のそれらのエーテル；分子当たり１〜約４単位の酸化エチレン及びアルキル基に８〜12個の炭素原子を含むアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート；及び分子当たり１〜４単位の酸化エチレン及びアルキル基に10〜20個の炭素原子を含むアルキルエチレンオキシドエーテルスルフェートである。
他の有用なアニオン性界面活性剤は、脂肪酸基に６〜20個の炭素原子及びエステル基に１〜10個の炭素原子を含む、α−スルホン化された脂肪酸のエステルの水溶性塩；アシル基に２〜９個の炭素原子及びアルカン成分に９〜23個の炭素原子を含む２−アシルオキシ−アルカン−１−スルホン酸の水溶性塩；12〜24個の炭素原子を含むオレフィンスルホネートの水溶性塩；及びアルキル基に１〜３個の炭素原子及びアルカン成分に８〜20個の炭素原子を含むβ−アルキルオキシアルカンスルホネートを包含する。
好ましいアニオン性界面活性剤は、石鹸、アルキルスルホネートの分子当たり平均４個までの酸化エチレンを含むＣ10−Ｃ18アルキルスルホネート及びアルキルエトキシスルホネート、Ｃ11−Ｃ13線状アルキルベンゼンスルホネート、及びそれらの混合物である。
２．非イオン性界面活性剤
もう１つの任意の成分は、２〜14重量％、好ましくは２〜８重量％、最とも好ましくは３〜５重量％の任意にエトキシル化された非イオン性界面活性剤である。天然又は合成のアニオン性界面活性剤（酸塩基に基づく）：非イオン性界面活性剤の重量比は、１：１〜５：１、好ましくは２：１〜５：１、最とも好ましくは３：１〜４：１である。これは、脂肪性／油性の土壌の良好な除去を提供するために空気／水の界面での十分な硬度の界面活性剤の形成及び吸着を確保することである。
任意にエトキシル化された非イオン性界面活性剤は、式R1（OC2H4）nOH（式中、Ｒ1はＣ10−Ｃ16アルキル基又はＣ8−Ｃ12アルキルフェニル基であり、ｎは３〜９である）のものであり、そして前記非イオン性界面活性剤は、６〜14、好ましくは10〜13のHLB（親水性−親油性バランス）を有する。それらの界面活性剤は、アメリカ特許第4,285,841号及び第4,284,532号により詳しく記載されている。特に好ましくは、アルコール１モル当たり酸化エチレン３〜８モルと、Ｃ12−Ｃ15アルコールとの縮合生成物、たとえばアルコール１モル当たり酸化エチレン約6.5モルにより縮合されたＣ12−Ｃ13アルコールである。言及される他の非イオン性界面活性剤は、APG, EGE及びグルカミド界面活性剤である。
３．洗浄ビルダー
本発明の洗浄組成物に通常の量で依存することができる通常の洗浄成分の中には次のものが存在する：組成物は増強されても又は増強されなくても良く、そしてゼロ−Ｐ型（すなわち、いづれのリン含有ビルダーをも含まない）のものであり得る。従って、組成物は、たとえば１〜50重量％、たとえば少なくとも約５重量％及びしばしば、約35〜40重量％の１又は複数の有機及び／又は無機ビルダーを、凝集体として含むことができる。ビルダーの典型的な例は、すでに上記で言及されたものを包含し、そしてより広くは、アルカリ金属のオルト、ピロ及びトリポリホスフェート、アルカリ金属のカーボネート（単独又は方解石と組合して）、アルカリ金属のシトレート、アルカリ金属のニトリロトリアセテート、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライト、ポリアセタールカルボキシレート及び同様のものを包含する。
より特定には、本明細書に記載される組成物は、10〜18個の炭素原子を含む脂肪酸であり得る洗浄ビルダー５〜20重量％、好ましくは10〜50重量％、及び／又はポリカルボキシレート、ゼオライト、ポリホスホネート及び／又はポリホスフェートビルダーを含む。好ましくは、12〜14個の炭素原子を含む、０〜10重量％（より好ましくは、３〜10重量％）の飽和脂肪酸、及び０〜10重量％、より好ましくは２〜８重量％、最とも好ましくは２〜５重量％のポリカルボキシレートビルダーであり、最とも好ましくは、１：１〜３：１の重量比でのクエン酸である。
本発明におけるタンパク質分解性酵素は、ビルダー：水の硬度の比が１に近い場合、他の酵素に対して最適な貯蔵安定性利点を付与すると思われるので、組成物は好ましくは、前記硬度の水１ガロン当たり２〜10、好ましくは３〜８個の粒子を金属イオン封鎖するのに十分なビルダーを含む。
適切な飽和脂肪酸は、天然源、たとえば植物又は動物エステル（たとえばヤシ種子油、パーム油及びヤシ油）から得られ、又は合成的に調製され得る（たとえば、石油の酸化又はFisher-Tropsch法を通しての一酸化炭素の水素化を通して）。本発明の組成物に使用するための適切な飽和脂肪酸の例は、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ヤシ油及びパーム種子脂肪酸を包含する。飽和ヤシ脂肪酸；ラウリン酸：ミリスチン酸の５：１〜１：１（好ましくは約３：１）の重量比の混合物；少量（たとえば合計の脂肪酸の１〜30％）のオレイン酸と上記のものとの混合物；及びヤシ種子脂肪酸が好ましい。
本発明における組成物は好ましくは、また、アメリカ特許第4,284,532号に記載されるポリカルボキシレート、ポリホスホネート及びポリホスフェートビルダーを含む。水溶性ポリカルボキシレートビルダー、特に、シトレートは、このグループの中で好ましいものである。適切なポリカルボキシレートビルダーは、種々のアミノポリカルボキシレート、シクロアルカンポリカルボキシレート、エーテルポリカルボキシレート、アルキルポリカルボキシレート、エトキシポリカルボキシレート、テトラヒドロフランポリカルボキシレート、ベンゼンポリカルボキシレート／及びポリアセタールポリカルボキシレートを包含する。
そのようなポリカルボキシレートビルダーの例は、ナトリウム及びカリウムエチレンジアミンテトラアセテート；ナトリウム及びカリウムニトリロトリアセテート；アメリカ特許第1,739,942号に開示される、フィチン酸の水溶性塩、たとえばフィチンナトリウム及びカリウム、アメリカ特許第3,364,103号に記載されるポリカルボキシレート材料；アメリカ特許第3,308,067号に記載されるポリカルボキシレートポリマー及びコポリマーの水溶性塩である。
他の有用な洗浄ビルダーは、次の構造的及び物理的特徴を有するポリマー性脂肪族ポリカルボン酸の水溶性塩を包含する：（ａ）酸形に関して計算される場合、約350の最少分子量；（ｂ）酸形に関して計算される場合、50〜80の当量；（ｃ）２よりも多くない炭素原子によりお互い分離されている少なくとも２個のカルボキシル基を有するモノマー種少なくとも45モル％；（ｄ）次のカルボキシル含有基の結合の部位からのポリマー鎖にそって３個よりも多くない炭素原子により分離されるいづれかのカルボキシル含有基のポリマー鎖の結合の部位。そのようなビルダーの特定の例は、イタコン酸、アコニット酸、マレイン酸、メサコン酸、フマル酸、メチレンマロン酸及びシトラコン酸のポリマー及びコポリマーである。
他の適切なポリカルボキシレートビルダーは、メリット酸、クエン酸、ピロメリット酸、ベンゼンペンタカルボン酸、オキシ二酢酸、カルボキシメチルオキシ琥珀酸、カルボキシメチルオキシマロン酸、シス−シクロヘキサンヘキサカルボン酸、シス−シクロペンタンテトラカルボン酸及びオキシ琥珀酸の水溶性塩、特にナトリウム及びカリウム塩である。
他のポリカルボキシレートは、アメリカ特許第4,144,226号及び第4,146,495号に記載されるポリアセタールカルボキシレートである。
他の洗浄ビルダーは、ゼオライト、たとえばアメリカ特許第4,405,483号に記載されるアルミノシリケートイオン交換材料を包含する。
他の好ましいビルダーは、一般式Ｒ−CH（COOH）CH2（COOH）（式中、ＲはＣ10−Ｃ20、好ましくはＣ12−Ｃ16のアルキル又はアルケニルであり、又はＲはヒドロキシル、スルホ、スルホキシ又はスルホン置換基により置換され得る）で表わされるもの、すなわち琥珀酸の誘導体である。それらのスクシネートビルダーは好ましくは、それらの水溶性塩、たとえばナトリウム、カリウム及びアルカノールアンモニウム塩の形で使用される。スクシネートビルダーの特定の例は次のものを包含する：ラウリルスクシネート、ミリスチルスクシネート、パルミチルスクシネート、２−ドデセニルスクシネート及び同様のもの。
４．タンパク質分解性酵素
本発明の酵素は、洗浄組成物において良く知られた標準の量で使用され得る。その量は、ひじょうに広い範囲であり、たとえば洗浄組成物１ｇ当たり約0.0002〜0.1、たとえば0.005〜0.05のAnson単位である。他の単位で表わす場合、プロテアーゼは、洗浄配合物１mg当たり約0.1〜100GUmg（たとえば１〜50、特に５〜20GU／mg）の量で、又は洗浄配合物１mg当たり約0.01〜４、たとえば0.1〜0.4KNPUの広い範囲のいづれかの量で組成物に含まれ得る。
洗浄流体１ｌ当たり酵素約0.25mgの割合で本発明の酵素を使用することが適切であり、それは１ｌ当たり0.08KNPUの酵素活性に対応する。対応する洗浄配合物は、たとえば0.1〜0.4KNPU／ｇの量で酵素を含むことができる。
他においては、本発明の組成物は、約0.01〜約５重量％、好ましくは約0.1〜約２重量％の本発明のタンパク質分解性酵素を含む。
その記載されるタンパク質分解性酵素は好ましくは、組成物１ｇ当たり0.05〜約1.0、より好ましくは約0.1〜0.75、最とも好ましくは約0.125〜約0.5mgの活性酵素の活性を提供するのに十分な量で含まれる。
酵素成分は、いづれか便利な形で、たとえば溶液、スラリー、LDPスラリー又は結晶の形で、他の成分に添加され得る。
５．酵素安定化システム
本発明の液体洗剤は、カルシウムイオン、硼酸、プロピレングリコール及び／又は短鎖カルボン酸を含んで成る酵素安定化システムを含んで成る。酵素安定化システムは、組成物中、約0.5〜約15重量％を占める。
組成物は好ましくは、１ｌ当たり約0.01〜約50、好ましくは約0.1〜約30、より好ましくは約１〜20ｍモルのカルシウムイオンを含む。カルシウムイオンのレベルは、組成物において、ビルダー、等との錯化を可能にした後、酵素のために利用できる最少レベルで常に依存するよう選択されるべきである。いづれかの水溶性カルシウム塩；たとえば塩化カルシウム、蟻酸カルシウム及び酢酸カルシウムが、カルシウムイオンの源として使用され得る。一般的に約0.05〜0.4ｍモル／ｌの最少量のカルシウムイオンがしばしば、酵素スラリー及び配合水におけるカルシウムのために組成物に存在する。約0.03％〜約0.6％の蟻酸カルシウムが好ましい。
第２の好ましい酵素安定剤は、炭素、水素及び酸素原子のみを含むポリオールである。それらは好ましくは、２〜６個の炭素原子及び２〜６個のヒドロキシ基を含む。例としては、プロピレングリコール（特に、１，２−プロパンシオールが好ましい）、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びグルコースを挙げることができる。ポリオールは、一般的に、組成物の約0.5〜15重量％、好ましくは約1.5〜約８重量％を占める。好ましくは、添加されるポリオール：いづれかの硼酸の重量比は、少なくとも１、より好ましくは、少なくとも1.3である。
組成物は好ましくは、また、アメリカ特許第4,318,818号に記載される水溶性短鎖カルボキシレートを含む。蟻酸塩は好ましく、そして組成物中、約0.05〜約５重量％、好ましくは約0.2〜約２重量％、最とも好ましくは0.4〜1.5重量％のレベルで使用され得る。
本発明の組成物はまた、任意に、約0.25〜約５重量％、最とも好ましくは、約0.5〜約３重量％の硼酸を含む。硼酸は、組成物において硼酸を形成することができる化合物により形成され得るが、しかし好ましいことではない。硼酸が好ましいが、但し、他の化合物、たとえば酸化硼酸、硼砂及び他のアルカリ金属の硼酸塩（たとえば、オルト−、メタ−及びピロ硼酸ナトリウム、及び五硼酸ナトリウム）も適切である。置換された硼酸（たとえば、フェニル硼酸、ブタン硼酸、及びｐ−ブロモフェニル硼酸）もまた、硼酸の代わりに使用され得る。
６．水
本発明の液体組成物は、水性液体でも又は非水性液体でもあり得る。水性液体である場合、それらは約15〜約60重量％、好ましくは約25〜約45重量％の水を含む。
追加の任意の成分
Ａ．補助界面活性剤
上記非イオン性界面活性剤と共に使用するための任意の補助界面活性剤は、下記一般式：
〔式中、Ｒ1は８〜20個の炭素原子を含むアルキル、ヒドロキシアルキル又はアルケニル基であり、そしてＲ2及びＲ3は水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピルから成る群から選択され、そして前記基はさらに、５個までの酸化エチレン単位を含み、但し、Ｒ2及びＲ3の少なくとも１つはヒドロキシル基を含む〕で表わされるアミドを含む。
好ましいアミドは、Ｃ8−Ｃ20脂肪酸アルキロールアミド（ここで、個々のアルキロール基は１〜３個の炭素原子を含み、そしてさらに、２個までの酸化エチレン単位を含むことができる）である。特に好ましくは、Ｃ12−Ｃ16脂肪酸モノエタノール及びジエタノールアミドである。
使用される場合、アミドは好ましくは、上記エトキシル化された非イオン性界面活性剤：アミド界面活性剤が４：１〜１：４、好ましくは３：１〜１：３の重量比で存在するようなレベルで存在する。
0.15％〜１％のレベルで使用される好ましく且つ任意の補助界面活性剤は、アメリカ特許第4,507,219号に記載される、第四アンモニウム、アミン及び酸化アミン界面活性剤である。
上記のうち、Ｃ10−Ｃ14アルキルトリメチルアンモニウム塩、たとえばデシルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド並びにココナツトリメチルアンモニウムクロリド及びメチルスルフェートが好ましい。0.2〜0.8％のモノアルキルトリメチルアンモニウムクロリドが好ましい。
Ｂ．タルトレーンスクシネートビルダー
本発明の組成物は好ましくは、酸に基づいて０〜約10重量％、好ましくは０〜約６重量％の、下記群から選択されたタルトレートスクシネートビルダー材料を含む：
〔式中、Ｘは塩形成性カチオンである〕；
〔式中、Ｘは塩形成性カチオンである〕；及び
iii）それらの混合物。
本発明において使用されるタルトレートスクシネート化合物は、アメリカ特許第4,663,071号に記載される。
Ｃ．中和システム
本発明の組成物はまた、任意に、組成物100ｇ当たり約０〜約0.04モル、好ましくは約0.01〜0.035モル、より好ましくは約0.015〜約0.03モルの、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン及びそれらの混合物から選択されたアルカノールアミンを含むことができる。低レベルのアルカノールアミン、特にモノエタノールアミンが、生成物の安定性、洗浄性能及び臭気を増強するために好ましい。しかしながら、アルカノールアミンの量は、最良の塩素漂白剤適合性のためには最少であるべきである。
さらに、組成物は、アニオン種を中和し、そして所望する生成物のpHを付与するために十分なレベルで、ナトリウムイオン及び好ましくはカリウムイオンを含む。
Ｄ．泡抑制剤
本明細書に記載される液体洗剤に使用するためのもう１つの任意の成分は、０〜約1.5重量％、好ましくは約0.5〜約1.0重量％のシリコーン基材の泡抑制剤である。シリコーンは広く知られており、そしてひじょうに効果的な泡調節剤としての使用について教授されている。たとえば、アメリカ特許第3,455,839号は、少量のポリジメチルシロキサン流体をその中に組込むことによる脱泡水溶液についての組成物及び方法を言及する。
有用な泡調節シリコーンは、たとえばドイツ特許出願DOS2, 124, 526に記載されるような、シリコーン及びシラン化されたシリカの混合物である。
シリコーン脱泡剤及び泡調節剤は、アメリカ特許第3,933,672号及び第4,652,392号におけるように、それらを洗浄界面活性剤から保護することによって顆粒状洗浄組成物中に都合良く導入されて来た。
本発明に使用するための好ましいシリコーン基材の泡抑制剤は、下記のものから実質的に成る、泡抑制量の泡調節剤である：
（ｉ）25℃で約20cs.〜約1500cs.の粘度を有するポリジメチルシロキサン流体；
（ii）（ｉ）100重量部当たり約５〜約50重量部のシロキサン樹脂（約0.6：１〜約1.2：１の比での（CH3）3SiO1/2単位：SiO2単位から構成される）；及び
（iii）（ｉ）100重量部当たり約１〜約20重量部の固体シリカゲル。
“泡抑制量”とは、組成物の配合者が泡を所望する程度に調節するであろうこの泡調節剤の量を選択することができることを意味する。泡調節の量は、選択される洗浄界面活性剤により変化するであろう。たとえば、高い泡界面活性剤に関しては、比較的多くの泡調節剤が、低い発泡界面活性剤に関してよりも所望する泡調節を達成するために使用される。
Ｅ．他の酵素
本発明の洗浄組成物はまた、追加の酵素も含むことができる。
たとえば、リパーゼは、キャリヤー材料と共に、タンパク質分解性酵素の溶液又はスラリーの形で有用に添加され得る（たとえば、ヨーロッパ特許第258,068号公報（Novo Nordisk A/S）におけるような）。
添加されるリパーゼの量は、広範囲内から、たとえば界面活性剤システム又は洗浄組成物１ｇ当たり50〜30,000LU、たとえばしばしば少なくとも100LU／ｇ、ひじょうに通常には少なくとも500LU／ｇ、時々、好ましくは1000LU／ｇ以上、2000LU／ｇ以上又は4000LU／ｇ以上、従ってひじょうにしばしば50〜4000LU／ｇ以内、及びたぶん200〜1000LU／ｇの範囲内から選択され得る。本明細書においては、リパーゼ単位は、ヨーロッパ特許第258,068号公報に定義されている。
タンパク質分解性酵素は、広範囲のリパーゼ間から選択され得る。特に、次の特許明細書に記載されるリパーゼ：ヨーロッパ特許第214,761（Novo Nordisk A/S）及び第258,068号公報、及び特に、ヨーロッパ特許第205,208号及び第206,390号公報に記載される、サーモミセスラヌジノサス（Thermomyces lanuginosus）ATCC22070からのリパーゼに対して生ぜしめられた抗血清との免疫学的交差反応性を示すリパーゼ、及び特に、クロモバクタービスコサムvar（Chromobacter viscosum var）タンパク質分解性NRRL Ｂ−3673からのリパーゼ又はアルカリゲネス（Alcaligenes）PL−679, ATCC31371及びFERM−Ｐ3783からのリパーゼに対して生ぜしめられた抗血清と免疫学的交差反応性を示すリパーゼ、及びまた、WO87/00859（Gist−Brocades）及びヨーロッパ特許第204,284号（Sapporo Breweries）公報に記載されるリパーゼを挙げることができる。特に、たとえば次の市販のリパーゼ調製物も適切である：Lipolase▲Ｒ▼ Novo Nordisk A/S, AminoリパーゼCE, Ｐ, Ｂ, AP, Ｍ−AP, AML及びCES、及びMeitoリパーゼMY−30, OF及びPL、またEsterase▲Ｒ▼ MM（Novo Nordisk A/S）, Lipozym, SP225, SP285（すべて、Novo Nordisk A/S製）、Saikenリパーゼ、Enzecoリパーゼ、Toyo Jozoリパーゼ及びDiosynthリパーゼ（Trade Marks）, Lumafast▲Ｒ▼（Genencor Inc.）, Lipomax▲Ｒ▼（Gist-Brocades N. V.）、及びWO94/03578（Unilever）に記載されるリパーゼ。
アミラーゼは、所望には、洗浄組成物１ｇ当たり約１〜約100MU（マルトース単位）の範囲の量（又は0.014〜1.4、たとえば0.07〜0.7KNU／ｇ（Novo単位））で使用され得る。適切なアミラーゼは、たとえばTermamyl▲Ｒ▼及びBAN（Novo Nordisk A/S）である。たとえば、セルラーゼは、所望には、洗浄組成物１ｇ当たり約0.3〜約35CEVU単位の範囲の量で使用され得る。適切なセルラーゼは、たとえばCelluzyme▲Ｒ▼及びCarezyme▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）である。
本発明に使用されるよう企画された他の酵素は、オキシダーゼ及びペルオキシダーゼである。
Ｆ．他の任意の成分
本発明の液体洗剤に使用するための他の任意の成分は、土壌除去剤、土壌開放ポリマー、抗再付着剤、たとえばテトラエチレンペンタミンエトキシレート（約0.5〜３重量％、好ましくは約１〜約３重量％）、泡調節剤、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、クレー及びヒドロトロープ、たとえばナトリウムクメンスルホネート、不透明剤、酸化防止剤、殺細菌剤、染料、香料、及び当業界において知られている増白剤を包含する。そのような任意の成分は一般的に、組成物の約15重量％以下、好ましくは約0.5〜10重量％、より好ましくは約１〜約10重量％を占める。
組成物は、０〜約８重量％、好ましくは０〜約５重量％のＣ12−Ｃ14アルケニル琥珀酸又はその塩を含むことができる。それらの材料は一般式Ｒ−CH（COOX）CH2（COOX）〔式中、ＲはＣ12−Ｃ14アルケニル基であり、そして個々のＸはＨ又は適切なカチオン、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム又はアルカノールアンモニウム（たとえば、一、二又は三エタノールアンモニウムである〕で表わされるものである。
特定の例は、２−ドデセニルスクシネート（好ましくは）及び２−テトラデセニルスクシネートである。
本発明の組成物は任意に、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、エチレンジアミン四酢酸（好ましい）、又はジエチレントリアミン五酢酸（最とも好ましい）の水溶性塩約0.1〜約１重量％、好ましくは約0.2〜約0.6重量％を、布を不備処理する場合、洗浄性能を増強するために含む。
さらに、洗浄組成物は、１〜35重量％の漂白剤又は漂白前駆体、又は漂白剤及び／又は前駆体を含んで成るシステムを、そのための活性剤と共に含むことができる。
さらなる任意の成分は、起泡増進剤、抗腐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、金属イオン封鎖剤、抗−土壌再付着剤及び同様のものである。
本発明の組成物は好ましくは、約10重量％までのエタノールを含む。
Ｇ．他の性質
本発明の組成物は通常、20℃での10重量％の水溶液において、約7.0〜9.0、好ましくは約8.0〜約8.5のpHを有する。
本発明の組成物はまた、35℃で蒸留水中において、200ppm以下か又はそれに等しい臨界ミセル濃度（CMC）、及び32ダイン／cm以下か又はそれに等しい、好ましくは約30以下か又はそれに等しい空気／水界面張力を有することができる。それらの測定は、“Measuremen of Interfacial Tension and Surface Tension-General Review of Practical Man”, C. Weser, GIT Fachzeitschrift fur das Laboratorium 24（1980）642-648及び734-742, FIT Verlag Ernst Giebeler, Darmstadt、及び“Interfacial Phenomena-Equilibrium and Dynamic Effects”, C. A. Miller and P. Neogi, Chapter 1, pp. 29-36（1985）, Marcel Dekker, Inc. New Yorkに記載されている。
本発明の組成物は、繊維材料、特に綿及びポリエステル基材の生地、及びそれらの混合物（但し、それらだけには限定されない）の洗浄のために使用され得る。たとえば、約60〜65℃又はそれ以下、たとえば約30〜35℃又はそれ以下の温度で実施される洗浄工程が特に適切である。洗浄流体において、たとえば0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤を供給するのに十分な割合で組成物を使用することがひじょうに適切であるが、但し、もちろん、所望には、それよりも低いか又は高い濃度を用いることも可能である。制限しない場合、たとえば約１〜10ｇ／ｌ、たとえば約３〜６ｇ／ｌの洗浄配合物からの使用割合が、その配合物が実質的に例におけるようにして存在する場合での使用のために適切であることが言及され得る。
この観点において、本発明は特に下記に関連している：
ａ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、保湿剤、有機酸、苛性アルカリを含んで成る、９〜10の間の値に調節されたpHを有する水性洗浄液体として配合された洗浄組成物。
ｂ）アルコキシル化された線状第一アルコールから実質的に成る液体非イオン性界面活性剤、トリアセチン、ナトリウムトリホスフェート、苛性アルカリ、過硼酸塩−水和物、漂白剤前駆体及び第三アミン漂白活性剤を含んで成る、約９〜10の間の値に調節されたpHを有する非水性洗浄液体として配合された洗浄組成物。
ｃ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、洗浄流体に９又はそれ以下のpHを付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
ｄ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、洗浄流体に8.5又はそれ以上のpHを付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
ｅ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、0.03又はそれ以下、たとえば0.02又はそれ以下の洗浄流体イオン強度を付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
ｆ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、0.01又はそれ以上、たとえば0.02又はそれ以上の洗浄流体イオン強度を付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
本発明のスブチラーゼ変異体はまた、布、硬質の表面又はいづれか他の表面への直接的な適用のために棒、錠剤、スティック及び同様のものの形で洗浄組成物に有用に組込まれ得ることが見出された。特に、それらは、著しい酵素安定性を示す、棒形での石鹸又は石鹸／合成組成物中に組込まれ得る。直接的な適用のための棒、錠剤、スティック及び同様のものの形での洗浄組成物は、引用により本明細書に組込まれるサウスアフリカ特許第93／7274号に記載されている。
従って、本発明の好ましい棒状物は、スブチラーゼで変異体の他に、次のものを含んで成る：
ｉ）石鹸、又は石鹸及び合成洗浄活性剤の混合物である、無水物として見なされる洗浄活性剤25〜80重量％、最とも好ましくは25〜70重量％；
ii）水０〜50重量％、最とも好ましくは10〜30重量％；
iii）充填剤０〜35重量％、最とも好ましくは0.1〜30重量％。
一般的に、本発明のそのような組成物に含まれるスブチラーゼ変異体の量は、組成物に基づいて0.1〜100GU／mg、好ましくは0.5〜20GU／mg、最とも好ましくは1.0〜10GU／mg（ここで、GU／mgはグリシン単位／mgである）のタンパク質分解活性に対応する量である。
スブチラーゼ遺伝子における突然変異を生成するための方法
遺伝子中に突然変異を導入するための多くの方法は、当業界においてよく知られている。クローニングスブチラーゼ遺伝子の簡単な論議の後、スブチラーゼ遺伝子内のランダム部位及び特定の部位において突然変異を誘発するための方法が論ぜられるであろう。
スブチラーゼ遺伝子のクローニング
スブチラーゼをコードする遺伝子が、当業界において良く知られている種々の方法により、表Ｉに示される生物のいづれか、特にグラム陽性細菌又は菌類からクローン化され得る。最初に、DNAのゲノム及び／又はcDNAライブラリーが、研究されるべきスブチラーゼを生成する生物からの染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構成されるべきである。次に、スブチラーゼのアミノ酸配列が知られる場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして細菌性DNAのゲノムライブラリー、又はcDNAライブラリーからのスブチリシン−コードのクローンを同定するために使用され得る。他方では、他の細菌株又は生物からのスブチラーゼに相同の配列を含む、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、低い緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、スブチラーゼ−コードのクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。スブチラーゼ生成クローンを同定するためのさらにもう１つの方法は、発現ベクター、たとえばプラスミド中にゲノムDNAのフラグメントを挿入し、得られるゲノムDNAライブラリーによりプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、スブチラーゼのための基質たとえば脱脂乳を含む寒天上に前記形質転換された細菌をプレートすることを包含する。スブチラーゼ生産性プラスミドを含むそれらの細菌は、分泌されたスブチラーゼによる脱脂乳の消化により、透明な寒天の円形により取り囲まれたコロニーを生成するであろう。
スブチラーゼ遺伝子におけるランダム突然変異の生成
スブチラーゼ遺伝子が適切なベクター、たとえばプラスミド中にクローン化された後、いくつかの方法がその遺伝子中にランダム突然変異を導入するために使用され得る。
１つの方法は、Ｅ. コリのミューテーター株中に、回収可能なベクターの一部として、クローン化されたスブチラーゼ遺伝子を組込むことである。
もう１つの方法は、スブチラーゼ遺伝子の一本鎖形を生成し、そして次に、スブチラーゼ遺伝子の一部が一本鎖のまま存続するようもう１つのDNAフラグメントによりスブチラーゼ遺伝子を含むDNAのフラグメントをアニールすることを包含する。次に、この分離した一本鎖領域が多くの突然変異誘発剤のいづれか、たとえば亜硫酸水素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸、又はヒドララジン（但し、これらのみには限定されない）に暴露される。ランダム突然変異を生成するためのこの方法の特定の例は、Shortle and Nathans（1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 2170-2174）により記載されている。このShortle and Nathansの方法によれば、スブチラーゼ遺伝子を担持するプラスミドが、その遺伝子内を切断する制限酵素によりニック化される。このニックは、DNAポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ作用を用いて、ギャップ中に拡大される。得られる一本鎖ギャップが、上記突然変異誘発剤のいづれか１つを用いて、突然変異誘発され得る。
他方では、天然のプロモーター及び他の制御配列を含むバシラス種からのスブチリシン遺伝子が、Ｅ. コリ及びＢ. スブチリスの両者のためのレプリコン、選択可能な表現型マーカー、及び複製のＭ13起点を含むプラスミドベクター中に、ヘルパーファージIR１による重感染に基づいての一本鎖プラスミドDNAの生成のためにクローン化される。クローン化されたスブチリシン遺伝子を含む一本鎖プラスミドDNAが、単離され、そしてスブチリシンのコード領域ではなく、ベクター配列を含むDNAフラグメントによりアニールされ、ギャップドされた重複分子が得られる。突然変異誘発が、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸又は蟻酸により、又は上記のようなＥ. コリのミューテーター株における複製によりスブチリシン遺伝子中に導入される。亜硫酸水素ナトリウムは一本鎖DNAにおいてシトシンと独占的に反応するので、この突然変異誘発物質により創造される突然変異は、そのコード領域に対してのみ制限される。反応時間及び亜硫酸水素の濃度は、１〜５種の突然変異がスブチリシン遺伝子当たり平均して創造されるように異なった実験において変えられる。400mlの反応体積において37℃で９分間の、４Ｍの亜硫酸水素ナトリウム（pH6.0）中、10mgのギャップ付与された重複DNAのインキュベーションは、一本鎖領域における約１％のシトシンを脱アミノ化する。成熟スブチリシンのコード領域は、DNA鎖に依存して約200個のシトシンを含む。好都合には、反応時間は、約４分（約１／200の突然変異頻度を生成するために）〜約20分（約５／200の同様の頻度を生成するために）である。
突然変異誘発の後、そのギャップ付与された分子は、十分な二本鎖分子を製造し、そしてその突然変異を固定するために、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によりインビトロで処理される。次に、コンピテントＥ. コリが、突然変異スブチリシンの増幅されたライブラリーを生成するために、突然変異誘発されたDNAにより形質転換される。増幅された突然変異ライブラリーはまた、その誤りがちなDNAポリメラーゼにより、突然変異誘発の範囲を高めるＥ. コリのMut Ｄ株においてプラスミドDNAを増殖することによっても製造され得る。
突然変異誘発物質の亜硝酸及び蟻酸はまた、突然変異ライブラリーを生成するためににも使用され得る。それらの化学物質は亜硫酸水素ナトリウムと同じように一本鎖DNAに対して特異的ではないので、突然変異誘発反応は、次の方法に従って行なわれる。スブチリシン遺伝子のコード部分が標準の方法によりＭ13ファージにおいてクローン化され、そして一本鎖ファージDNAが調製される。次に、その一本鎖DNAが、23℃で15〜60分間、pH4.3の１Ｍの亜硝酸と、又は23℃で１〜５分間、2.4Ｍの蟻酸と反応せしめられる。反応時間のそれらの範囲は、１／1000〜５／1000の突然変異頻度を生成する。突然変異誘発の後、ユニバーサルプライマーがＭ13 DNAにアニールされ、そして重複DNAが鋳型として突然変異誘発された一本鎖DNAを用いて合成され、その結果、スブチリシン遺伝子のコード部分が十分に二本鎖化になる。この点で、コード領域が制限酵素によりＭ13ベクターから切断され、そして未突然変異誘発性発現ベクター中に連結され、その結果、突然変異が制限フラグメントにおいてのみ生じる（Myersなど., Science 229, 242-257（1985））。
スブチラーゼ遺伝子における特定部位の突然変異誘発の生成
スブチラーゼ遺伝子がクローン化され、そして突然変異のための所望する部位が同定され、そして元の残基を置換するための残基が決定された後すぐに、それらの突然変異が合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を両端に有するヌクレオチド配列を含み；突然変異ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間、挿入される。好ましい方法においては、スブチラーゼ遺伝子を架橋する、DNAの一本鎖ギャップが、スブチラーゼ遺伝子を担持するベクターにおいて創造される。次に、所望する突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNAの相同部分にアニールされる。次に、残るギャップが、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によりフィルインされ、そしてその構造体がＴ４リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例は、Morinagaなど.,（1984, Biotechnology 2, 639-646）に記載されている。Morinagaなどによれば、遺伝子内のフラグメントが制限エンドヌクレアーゼを用いて除去される。次に、現在、ギャップを含むベクター／遺伝子が変性され、そしてギャップを含む代わりに、そのギャップに含まれる領域外の部位でのもう１つの制限エンドヌクレアーゼにより切断されているベクター／遺伝子にハイブリダイズされる。次に、遺伝子の一本鎖領域が、変異誘発されたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのために利用でき、残るギャップはDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによりフィルインされ、挿入体はＴ４ DNAリガーゼにより連結され、そして１サイクルの複製の後、所望する突然変異を担持する二本鎖プラスミドが生成される。Morinagaの方法は、新規の制限部の構成の追加の操作を明らかにし、そして従って、複数の部位での突然変異の発生を促進する。1994年５月10日に発行された、Estellなどによるアメリカ特許第34,606号は、カセットの少々の変更を行なうことにより、複数の突然変異を担持するオリゴヌクレオチドを導入することができるが、しかしながら、ひじょうに多くの種類の突然変異は、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、Morinagaの方法により一度に導入され得る。
スブチラーゼ変異体の発現
本発明によれば、上記方法又は当業界において知られているいづれか他の方法により生成される突然変異誘発されたスブチラーゼ遺伝子が、発現ベクターを用いて、酵素形で発現され得る。発現ベクターは一般的に、クローニングベクターの定義下にある。なぜならば、発現ベクターは通常、典型的なクローニングベクターの成分、すなわち微生物のゲノムに無関係な微生物におけるベクターの自主複製を可能にする成分、及び選択目的のための１又は複数の表現型を含むからである。発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制限配列を含む。発現されたタンパク質の分泌を可能にするために、“シグナル配列”をコードするヌクレオチドが、遺伝子のコード配列の前に挿入され得る。制御配列の指図下での発現のためには、本発明に従って処理されるべき標的遺伝子は、適切に読み取り枠を整合して制御配列に操作可能的に連結される。プラスミドベクター中に組込まれ得、そして変異体スブチラーゼ遺伝子の転写を支持することができるプロモーター配列は、原核β−ラクタマーゼプロモーター（Villa−Kamaroff, など.（1978）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 3727-3731）及びtacプロモーター（DeBoer, など.（1983）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 21-25）を含むが、但し、これらのみには限定されない。さらなる参照はまた、“Usefal Proteins from Recombinant Bacteria”in Scientific America（1980）242, 74-94にも見出され得る。
１つの態様によれば、Ｂ. サブチリスは、変異誘発されたDNAを担持する発現ベクターにより形質転換される。発現が分泌性微生物、たとえばＢ. サブチリスにおいて起こる予定である場合、シグナル配列の後に翻訳開始シグナルが続き、そして興味あるDNA配列が先に続く。シグナル配列は、分泌に基づいて生成物から分解される細胞壁に発現生成物を輸送するよう作用する。上記で定義されるような用語“制御配列”は、それが存在する場合、シグナル配列を含むことを意図する。
当業者に知られている他の宿主システムはまた、本発明のプロテアーゼ変異体の発現及び生成のためにも企画される。そのような宿主システムは、菌類、たとえば糸状菌、植物、鳥類、及び哺乳類細胞、並びに他のものを含んで成る。
材料及び方法
菌株：
Ｂ. サブチリス309及び147は、NCIBに寄託され、そして受託番号NCIB 10309及び10147を付与されている、バシラスレンタスの変異体であり、そして引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第3,723,250号に記載されている。
Ｅ. コリMC 1000ｒ-, ｍ+（M. J. Casadaban and S. N. Cohen（1980）, J. Mol. Biol. 138, 179-207）は、従来の方法により製造され、そしてアメリカ特許出願番号第039,298号にも記載されている。
タンパク質分解活性
本発明においては、タンパク質分解活性は、Kilo Novo Protease Units（KNPU）で表わされる。その活性は、酵素基準（SAVINASEO）に相対的に決定され、そしてその決定は標準条件、すなわち50℃, pH8.3, ９分の反応時間、３分の測定時間で、タンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（DMC）溶液の消化に基づかれる。フォルダーAF 220／１は、Novo Nordisk A/S, Denmarkへの要求に基づいて入手でき、このフォルダーは引用により本明細書に含まれる。
GUは、基質としてのＮ−アセチルカゼインと共に40℃での15分間のインキュベーションの間、標準条件下で、グリシン１ｍモルに相当するNH2−基の量を生成するタンパク質分解酵素活性として定義されるグリシン単位である。
酵素活性はまた、Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T. M., Goodlander, B. D., Garrison, P. H., and Smith, L. A.,（1988）に記載される、可溶性基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラ−ニトリフェノールとの反応に従って、DNAアッセイを用いても測定され得る。
例
本発明の酵素変異体の生成のためには、WO89/06279（Novo Nordisk A/S）, EP130,756（Genentech）, EP479,870（Novo Nordisk A/S）, EP214,435（Henkel）, WO87/04461（Amgen）, WO87/05050（Genex）, EP出願第87303761号（Genentech）, EP260,105（Genencor）, WO88/06624（Gist−Brocades NV）, WO88/07578（Genentech）, WO88/08028（Genex）, WO88/08033（Amgen）, WO88/08164（Genex）, Thomasなど.（1985）Nature, 318, 375-376；Thomasなど.（1987）J. Mol. Biol., 193, 803-813；Russel and Fersht（1987）Nature 328, 496-500に記載されるのと同じ材料及び方法が使用され得る。当業界において十分に確立されている他の方法もまた使用され得る。
例１
酵素変異体の構成及び発現：
スブチラーゼ309及びその変異体をコードする合成遺伝子に適切なベクターを構成した。それは実質的にpUC19プラスミド〔Yanish−Perron and Messing（1985）Gene：33, 103-119〕であり、ここで複数のクローニング部位が遺伝子を構成する５種のサブフラグメントを分離するために使用される制限部位を含むリンカーにより置換されている。新規のリンカーを、EcoRＩ−HindIIIにより切断されたpUC19中に挿入し、それにより、それらの部位を破壊した。この構成の詳細は、WO92/19729号のページ25〜26及びその図１（シート１／７−７／７）に記載されており、その内容は引用により本明細書に含まれる。
個々のサブフラグメントを、６〜12個のオリゴヌクレオチドから製造した。そのオリゴヌクレオチドは、調節されたガラス支持体上で、ホスホラミジット化学を用いて自動DNA合成機により合成された〔Beaucage and Carruthers（1981）；Tetrahedron Letters 22, 1959-1869〕。
５種のサブフラグメントを、２％アガロースゲル上で単離し、そしてpSX191中に挿入した。その配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。フラグメントＡ−Ｅを単離し、そしてKpnＩ−BamHＩにより切断されたpSX191と共に連結した。その連結混合物を用いて、コンピテント Ｅ. コリMC 1000ｒ-, ｍ＋を形質転換し、耐アンピシリン性について選択する。次に、酵素の成熟部分をコードするスブチリシン309遺伝子の部分を構成する850bpのKpnＩ−BamHＩフラグメントを用いて、pSX212上の野生型遺伝子を置換し、pSX222を生成し、次にこれを用いて、コンピテントＢ. スブチリス株を形質転換した。その形質転換された株の発酵及び酵素の精製の後、その生成物は野生型生成物とは区別がつかないことが示された。
合成遺伝子に由来するプロテアーゼ変異体は、突然変異が所望される場所で、変更された配列を有する（たとえば下記に与えられるような配列を有する）オリゴヌクレオチドを用い、そしてそれらと合成遺伝子に特有のオリゴヌクレオチドの残りとを混合することによって製造される。変異体遺伝子のアセンブリーは、上記態様に類似する他の態様で変異体材料により実施される。合成遺伝子に対するさらなる情報は一般的なAgarvalなど（1970）, Nature, 227, 27-34から入手できる。
KpnＩ部位を、酵素の成熟部分をコードするスブチラーゼ309合成遺伝子の開始部分に導入した。使用される方法は、オリゴヌクレオチド指図された二本鎖切断修復突然変異誘発と呼ばれ、そしてMandecki（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181により記載されている。pSX172を、スブチラーゼ309遺伝子の成熟部分の開始部分でNcoＩにより開環し、そしてオリゴヌクレオチドNOR789（WO92/19729を参照のこと）と共に混合し、100℃に加熱し、０℃に冷却し、そしてそれを用いてＥ. コリを形質転換した。再形質転換の後、組換え体を、32−Ｐ−ラベルされたNOR789を用いてコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。スクリーニングの間、陽性であることがわかった組換え体は、アミノ酸配列を変更しないで２つの塩基を変更することによってNcoＩの前の右側に導入されるKpnＩ部位を有した。そのようにして創造されたKpnＩ部位を、400bpのPvuＩ−NheＩフラグメントに基づくpSX120中に挿入し、pSX212を得る。pSX120はまた、ヨーロッパ特許第405,901号公報にも記載されている。
合成遺伝子をpSX212上のKpnＩ〜BamHＩ間に挿入し、pSX222を得る。
オリゴヌクレオチドの突然変異及び対応する配列の例は、次の通りである：
R170L（フラグメントＤ１）
R170I（フラグメントＤ１）
S57P（フラグメントＢ１）
それらのオリゴヌクレオチドを、変更されていない合成遺伝子からのオリゴヌクレオチドの残りと共に組み合わせた。
例２
酵素変異体の精製：
この方法は、スブチリシン147酵素、スブチリシン309酵素又はそれらの変異体の10ｌ規模の発酵の精製に関する。
約８ｌの発酵ブイヨンを、１ｌビーカーにおいて5000rpmで35分間、遠心分離した。上清液を、10％酢酸を用いてpH6.5に調節し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で濾過した。
濾液を、Amicon S1Y10 UFカートリッジを備え付けられたAmicon CH 2A UFユニットを用いて約400mlに濃縮した。UF濃縮物を遠心分離し、そして濾過し、その後、pH７でのBacitracin親和性カラム上に室温で吸収した。プロテアーゼを、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.1Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝溶液（pH７に調節されている）中、25％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムの溶液を用いて、室温でBacitracinカラムから溶離した。
Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そして0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む、pH6.5に調節された緩衝液により平衡化された570mlのSephadex G25カラム（５cmの直径）に適用した。
Sephadex G25カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を組合し、そして0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸、及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む、pH6.5に調節された緩衝液により平衡化された150mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交換カラム（５cmの直径）に適用した。
プロテアーゼを、２ｌの同じ緩衝液中、０〜0.1Ｍの塩化ナトリウム線状グラジエント（スブチリシン147の場合、０〜0.2Ｍの塩化ナトリウム）を用いて溶離した。
最終段階においては、CM Sepharoseカラムからの画分を含むプロテアーゼを組合し、そしてGR81PP膜（Danish Sugar Factories Inc.からの）を備え付けられたAmicon限外濾過セルにおいて濃縮した。
構成についての例１の技法及び上記単離方法を用いることによって、次のスブチリシン309変異体を生成し、そして単離した：
例３
酵素変異体を含んで成る洗浄組成物における安定性
例Ｄ１：
本発明の態様の（等方性）水性洗浄液体を、下記成分を含むように配合する：
pHは7.1に調節される。
表IIIから、変異体S57P＋R170L＋N218Sはこのタイプの洗剤において著しく改良された安定性を示すことが明らかである。さらに、変異体S57P＋R170L＋N218Sは、リパーゼに対して卓越した適合性を有する。
上記表IVから、プロテアーゼの安定の他に、プロテアーゼの適合性もまた、改良されることが明らかである。
例Ｄ２：
本発明の態様の非水性洗浄液体を、4.9モル／モルの酸化エチレン及び2.7モル／モルの酸化プロピレンによりアルコキシル化された、38.5％ Ｃ13−Ｃ15線状一次アルコール、５％トリアセチン、30％ナトリウムトリホスフェート、４％ソーダ灰、少量のオキソボレートを含む15.5％過硼酸ナトリウム−水和物、４％ TAED, 0.25％ EDTA（この0.1％がホスホン酸である）、Aerosil 0.6％, SCMC１％、及び0.6％プロテアーゼを用いて配合する。pHは、９〜10、たとえば約9.8の値に調節される。
例Ｄ３：
構成された液体洗剤はたとえば、本明細書に記載されるようなプロテアーゼの他に、２〜15％非イオン性界面活性剤、非イオン性及び任意のアニオン性界面活性剤を含んで成る５〜40％の合計界面活性剤、５〜35％ホスフェート含有又は非ホスフェート含有ビルダー、0.2〜0.8％ポリマー増粘剤、たとえば106以上の分子量を有する架橋されたアクリルポリマー、たとえば中性水ガラスとしての少なくとも10％の珪酸ナトリウム、所望するpH、好ましくは９〜10又はそれ以上の範囲でのpH、たとえばpH11以上に調節するためのアルカリ（たとえばカリウム含有アルカリ）を含むことができ、そしてナトリウムカチオン：珪酸塩アニオン（遊離シリカとして）の重量比は0.7：１以下であり、そして0.3〜30Pas（20℃で）の粘度を有する。
適切な例は、約５％の非イオン性界面活性剤、すなわち１モル当たり約５個のEO基及び１モル当たり約2.7個のPO基によりアルコキシル化されたＣ13−Ｃ15のアルコール、シリカ及び酸化ナトリウム間の重量比が3.5である15〜23％の中性水ガラス、13〜19％のKOH, ８〜23％ STPP, ０〜11％の炭酸ナトリウム、0.5％のCarbopol 941（TM）を含む。
プロテアーゼは、たとえば0.5％で組込まれ得る。
表Ｖから、R170L変異体が洗剤のこの型において著しく改良された安定性を示すことが明らかである。
表VIから、試験された変異体がこの型の洗剤において、野生型酵素に比較して、改良された安定性を示すことが見出され得る。
表VIIから、変異体S57P＋R170L＋N218Sがこの型の洗剤において著しく改良された安定性を示すことが明らかである。さらに、変異体S57P＋R170L＋N218Sは、リパーゼに対する卓越した適合性を有する。
例Ｄ６：
49.7wt.の80／20牛脂／ヤシ石鹸、49.0％水、20％クエン酸ナトリウム、1.0％クエン酸及び0.031％プロテアーゼを含む石鹸棒を生成した。石鹸棒の調製の後、それらを周囲温度で貯蔵し、そして特定時間の間隔の後、サンプルを取り、そしてプロテアーゼ活性について測定した。その安定性のデータが下記に与えられている：
上記表から、スブチラーゼ変異体R170L, R170L＋N218S＋S57P、及びR170L＋Y167Iがこの型の洗剤において著しく改良された安定性を示すことが明らかである。
例Ｄ７：
63.88％の80／20牛脂／ヤシ石鹸、１％ヤシ脂肪酸、25.1％水、10％クエン酸ナトリウム及び0.021％プロテアーゼを含む石鹸棒を製造した。その洗濯石鹸棒を37℃で貯蔵し、そして特定の時間の間隔の後、サンプルを取り、そしてプロテアーゼ活性について測定した。
上記表から、スブチラーゼ変異体R170L＋N218S＋S57Pがこの型の洗剤において著しく改良された安定性を示すことが明らかである。
例４
酵素変異体を含んで成る洗浄組成物の洗浄性能
次の例は、下記に示される条件下で行なわれた多くの洗浄試験からの結果を提供する。
実験条件：
洗浄に続いて、布を水道水でフラッシュし、そして空気乾燥せしめた。
上記モデルの洗剤は、単純な洗浄配合物である。最とも特徴的な特性は、STPがビルダーとして使用され、そしてアニオン性テンシド（LAS）の含有量がきわめて高いことである。さらに、pHは、粉末洗剤のためには低い9.5に調節される。
pHは9.5に調節される。
試験材料に対する規約反射率（Ｒ）の測定を、Elrepho 2000光度計を用いて460nmで行なった（UVなし）。測定された値を、下記表現に適合せしめる：
改良因子は、
の初期傾斜の使用により計算される。
DRは、規約反射率単位での酵素の洗浄効果である。
ａは、適合された曲線の初期傾斜である（ｃ▲Ｒ▼０）。
ａref.は、対照の酵素についての初期傾斜である。
ｃは、mg／ｌでの酵素濃度である。
DRmaxは、規約反射率単位（ｃ▲Ｒ▼￥）での酵素の理論的最大の洗浄効果である。
表ＸIIから見出され得るように、本発明のスブチリシン309変異体のすべては、洗浄性能において改良性を示す。
表ＸIIIから見出され得るように、本発明のスブチリシン309変異体のすべては、洗浄性能において改良性を示す。
本発明は、洗剤組成物の配合において有用で、且つそれらの洗浄性能を保持し又は改良しながら改良された貯蔵安定性を示す新規変異酵素又は酵素変異体；前記酵素を含む清浄及び洗剤組成物；適切な細胞又は生物中に挿入された場合に前記酵素の発現をコードする変異された遺伝子；及び前記遺伝子により形質転換され、そしてそれを発現することができるそのような宿主細胞に関する。
発明の背景
洗剤産業において、酵素は30年以上もの間、洗浄配合物に利用されて来た。そのような配合物に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及び他の酵素、又はそれらの混合物である。商業的には、プロテアーゼが最も重要である。
プロテアーゼは、30年以上の間、洗剤産業において使用されて来たが、それらの酵素がたとえば洗剤組成物に存在する基質及び／他の物質といかにして反応するの詳細について多くは未知のままである。特定の残留物に関する及び一定の性質、たとえば一般的には酸化及び熱安定性に影響を及ぼすいくつかの要因は解明されているが、しかし多くは見出されないまま存続する。また、どの物理的又は化学的特徴が特定の洗剤組成物におけるプロテアーゼの良好な洗浄性能又は安定性を担当するかは、まだ正確には知られていない。
現在使用されるプロテアーゼは、多くの場合、自然からプロテアーゼを単離し、そして洗剤配合物においてそれらを試験することによって見出されて来た。
商業的に使用されているプロテアーゼとして、その対応する天然に存在する野生型プロテアーゼのタンパク質工学により処理された変異体が増加しつつあり、たとえばDURAZYM▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）, RELASE▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）, MAXAPEM▲Ｒ▼（Gist-Brocades N. V.）, PURAFECT▲Ｒ▼（Genencor International, Inc.）である。
従って、本発明の目的は、特に洗剤産業への使用のために改良されたタンパク質工学により処理されたプロテアーゼ変異体を提供することである。
プロテアーゼ
タンパク質基質におけるアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、又は（互換的に）ペプチダーゼとして分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3を参照のこと）。バシラスの種の細菌は、２種の細胞外プロテアーゼ、すなわち中性又はメタロプロテアーゼ、及び機能的にはセリンエンドペプチダーゼであり、そして通常、スブチリシンとして言及されるアルカリプロテアーゼを分泌する。それらのプロテアーゼの分泌は、細菌増殖サイクルに連鎖しており、胞子形成も生じている定常期の間、プロテアーゼの発現が高い。Jolifteなど、（1980）J. Bacteriol 141, 1199-1208は、バシラスプロテアーゼが細胞壁のターンオーバーにおいて機能することを示唆している。
サブチラーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そしてその活性部位に必須のセリン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973“Principles of Biochemistry, ”Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272）。
細菌性セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ドルトンの範囲の分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、そして活性において、真核生物のキモトリプシン（セリンプロテアーゼの一種でもある）に類似している。サブグループを包含する、より狭い範囲の用語であるアルカリプロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの、pH9.0〜11.0の高い最適pHを反映している（レビューのためには、Priest（1977）Bocteriological Rev. 41, 711-753を参照のこと）。
スブチラーゼとして仮に命名されたセリンプロテアーゼのサブグループが、Siezenなど., Protein Engng. 4（1991）719-737により提案されている。それらは、スブチリシン様プロテアーゼとしてこれまで言及されているセリンプロテアーゼの40種以上のアミノ酸配列の相同分析により定義される。スブチリシンは、グラム陽性細菌又は真菌類により生成されるセリンプロテアーゼとしてこれまで定義されており、そしてSiezenなどによれば、スブチラーゼのサブグループである。広範囲の種類のスブチリシンが同定されており、そして多くのスブチリシンのアミノ酸配列が定義されて来た。それらは、バシラス株からの６種以上のスブチリシン、すなわちスブチリシン168、スブチリシンBPN'、スブチリシンCarlsberg、スブチリシンＹ、スブチリシン・アミロサッカリチカス（amylosacchariticus）及びメセンテリコペプチダーゼ（mesentericopeptidase）（Kuriharaなど.（1972）J. Biol. Chem. 247, 5629-5631；Wellsなど.（1983）Nuclic Acids Res. 11, 7911-7925；Stahl and Ferrari（1984）J. Bacteriol. 159, 811-819；Jacobsなど.（1985）Nucl. Acids Res. 13, 8913-8926；Nedkovなど.（1985）Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 421-430；Svendsenなど.（1986）FEBS Lett. 196,228-232）、アクチノマイセタレス（actinomycetales）からの１種のスブチリシン、サーモアクチノマイセス・バルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）からのサーミターゼ（Melounなど.（1985）FEBS Lett. 198, 195-200）、及び１種の真菌スブチリシン、すなわちトリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）からのプロテアーゼＫ（Jang and Mayer（1985）Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 484-492）を包含し、さらなる参照のためには、Siezenなどからの表Ｉが下記に示されている。
スブチリシンは物理的且つ化学的に十分に特徴づけられている。それらの酵素の一次構造（アミノ酸配列）の知識の他に、基質の結合、遷移状態、生成物、少なくとも３種の異なったプロテアーゼインヒビターを明確にし、そして天然の変動についての構造上の結果を定義する、スブチリシンの50以上の高い解像度Ｘ−線構造が定義されている（Kraut（1977）Ann. rev. Biochem. 46, 331-358）。
本出願において、基質は、スブチリシンプロテアーゼによる加水分解に対して感受性の少なくとも１つのペプチド結合を含む化合物を含んで成るものとしてその広い形で解釈されるべきである。
また、“生成物”なる表現は、本発明の文脈において、スブチリシンプロテアーゼが関与する加水分解反応の生成物を包含するものとして解釈されるべきである。生成物は、続く加水分解反応において基質であり得る。
スブチラーゼの１つのサブグループであるＩ−Ｓ１は、“古典的な”スブチリシン、たとえばスブチリシン168、スブチリシンBPN'、スブチリシンCarlsberg（ALCALASE▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）及びスブチリシンDYを含んで成る。
スブチラーゼの追加のサブグループであるＩ−Ｓ２が、Siezenなど.（前記）により認識されている。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは、たとえばスブチリシンPB92（MAXACAL▲Ｒ▼, Gist-Brocades NV）、スブチリシン309（SAVINASE▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、スブチリシン147（ESPERASE▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、及びアルカリエラスターゼYaBのごとき酵素を含んで成り、高いアルカリ性スブチリシンとして記載されている。
本発明の文脈において、スブチラーゼ変異体又は変異誘発されたスブチラーゼは、元の遺伝子又は親遺伝子を有しそして対応する親酵素を生成する親微生物に由来する変異遺伝子を発現する生物により生成されるスブチラーゼを意味し、ここで前記親遺伝子は変異遺伝子を生成するために突然変異誘発されており、この変異した遺伝子が適切な宿主において発現される場合に前記変異誘発されたスブチリシンプロテアーゼが生成される。
スブチラーゼ遺伝子のランダム突然変異誘発及び特定部位突然変異誘発は、酵素の物理的及び化学的性質の知識、並びにスブチラーゼの触媒活性、基質特異性、三次構造、等に関する与えられた情報の両者から生じた（Wellsなど.（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 1219-1223；Wellsなど.（1986）Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317, 415-423；Hwang and Warshel（1987）Biochem. 26, 2669-2673；Raoなど.（1987）Nature 328, 551-554）。
この分野を包含するより最近の出版物は、基質中の特定の標的配列（位置24及び64）を切断する変異体の設計に関する、Carterなど.（1989）Proteins 6, 240-248（これは、これまで公表された多くの結果を論じている）、Graycarなど.（1992）Annals of the New York Academy of Sciences 672, 71-79（これまでに公表された多くの結果を論じている）、並びにTakagi（1993）Int. J. Biochem. 25, 307-312（やはり、今までの結果を段説している）である。
スブチリシン遺伝子の特に部位特異的突然変異誘発が大きく注目され、そして種々の突然変異が次の特許出願及び特許に記載されている：
“カルボニル ヒドロラーゼ”における部位特異的に又はランダムに生成された突然変異誘発、並びに種々の性質、たとえばKcat／Km比、pH−活性プロフィール及び酸化安定性についての突然変異誘発された酵素の続くスクリーニングに関するヨーロッパ特許第130756号公報（GENENTECH）（アメリカ特許第34,606（GENENTECH）に対応する）。この出版物は、部位特異的突然変異誘発は実施可能であり、そして特定された位置、すなわち-1Try, 32Asp, 155Asn, 104Tyr, 222Met, 166Gly, 64His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, 221Ser, 217Tyr, 156Glu又は152AlaにおけるスブチリシンBPN'の突然変異が変更された性質を示す酵素を供給することを示す。位置−１を除くすべてのそれらの位置はこの出願の前から、酵素の機能に関与することが知られており、そしてそれ故に、選択することが自明であるので、この出願は、所望の性質を有する酵素を得るために突然変異を導入する位置を決定する問題を解決するのに多くの貢献をしていない。
ヨーロッパ特許第214435号公報（HENKEL）は、スブチリシンCarlsbergのクローニング及び発現、並びにその２種の変異体に言及している。この出願においては、158Aspから158Serへの及び161Serから161Aspへの突然変異についての理由は提供されていない。
国際特許第WO87/04461号公報（AMGEN）においては、改良されたpH及び熱安定性を示す突然変異誘発された酵素を得るために親酵素に存在するAsn−Gly配列の数を減じることが提案されており、この出願においては、スブチリシンBPN'における109Asn及び218Asn残基の除去、突然変異誘発又は修飾が強調されている。Gly−残基の欠失又は修飾についての例は提供されていない。
国際特許第WO87/05050号公報（GENEX）は、ランダム突然変異、及びそれに続く、改良された性質のためのスブチリシンBPN'の多数の変異体のスクリーニングを開示する。この出願においては、位置218Asn, 131Gly, 254Thr, 166Gly, 116Ala, 188Ser, 126Leu及び53Serにおける突然変異が記載されている。
ヨーロッパ特許第251446号公報（GENENCOR）においては、一次及び三次構造レベルの両方での相同性の考慮が、保存されているか又は保存されていない同等のアミノ酸残基を同定するためにいかに適用されるかについて記載されている。この情報は、スブチリシンBPN'の三次構造についての発明者の知識と一緒になって変更された性質を有する突然変異体を得ることの期待と共に、発明者をして、突然変異に対して感受性の多くの位置の選択をさせる。そのような同定される位置は、124Met, 222Met, 104Tyr, 152Ala, 156Glu, 166Gly, 169Gly, 189Phe, 217Tyrである。さらに155Asn, 21Tyr, 22Thr, 24Ser, 32Asp, 33Ser, 36Asp, 46gly, 48Ala, 49Ser, 50Met, 77Asn, 87Ser, 94Lys, 95Val, 96Leu, 107Ile, 110Gly, 170Lys, 171Tyr, 172Pro, 197Asp, 199Met, 204Ser, 213Lys、及び221Serが酵素の種々の性質に影響を及ぼすことが予測されるものとして同定される。また、多くの突然変異誘発が、それらの提案を支持するために例示される。これらの位置における単一の突然変異誘発の他に、発明者はまた、多くの複数突然変異誘発を行なった。さらに、発明者は、興味あるものとして、215Gly, 67His, 126Leu, 135Leu、並びにセグメント97−123, 126−129, 213−215、及び152−172内のアミノ酸残基を注目すべきものとして同定するが、しかしそれらの位置のいづれにおいても、突然変異誘発は例示されない。
本発明のために特に興味あることには、ヨーロッパ特許第251446号の発明者は、170Lys（スブチリシンBPN'、タイプＩ−Ｓ１における）を置換することを示唆しており、特に彼らは、元のLysの代りにGlu又はArgを導入することを示唆している。Glu変異体が生成されたことは明らかであり、そして自己分解に対してひじょうに敏感であることが見出された（48, 121, 123ページ（表XXIは明らかな誤りを含んでいるが、しかし86分から13分への自己分解半減期の短縮を示している）並びに図32を参照のこと）。
ヨーロッパ特許第260105号公報（GENENCOR）は、触媒トライアド（triad）から約15Å内のアミノ酸残基を選択し、そしてその選択されたアミノ酸残基をもう１つの残基により置換することによって、触媒トライアドを含む酵素の一定の性質を変性することを記載する。この明細書に記載されるスブチラーゼ型の酵素は、触媒トライアドを含む酵素の種類に属するものとして特別に言及されている。スブチリシンにおいて、位置222及び217は、置換のための好ましい位置として示されている。
また、スブチリシンBPN'における99Aspから99Serへの変換がその酵素のpH依存性を変えることが、Thomas, Russell and Fersht（1985）Nature 318, 375-376により示されている。
続く文献（1987）J. Mol. Biol. 193, 803-813において、同じ著者はまた、156Gluから156Serへの置換を論じている。
それらの両突然変異誘発は、活性64Hisから約15Åの距離内に存在する。
Nature 328, 496-500（1987）において、Russel及びFershtは、表面電荷の変化を得るために酵素を突然変異誘発することによりpH−活性プロフィールを変えることについてのそれらの実験の結果及び存在する規則を論じている。
WO88/08028（Genex）及びWO88/08033（Amgen）の両者は、スブチリシンBPN'のカルシウム結合部位におけるアミノ酸残基の修飾について言及する。前記酵素は、元の残基をより負に荷電された残基により置換することによって安定化されると言われている。
WO89/06279（NOVO NORDISK A/S）においては、位置170が興味あるものとして示されており、そして存在する残基をTyrにより置換することが提案されている。しかしながら、そのような変異体に関するデータは与えられていない。WO91/00345（NOVO NORDISK A/S）においては、同じ提案が示されており、そしてスブチリシン309（タイプＩ−Ｓ２）における位置170のTyr変異体が約８のpHで洗剤として改良された洗浄性能を示すことが示されている（表III, IV, Ｖ, VI, VII, Ｘにおける変異体S003）。他の位置における他の置換と組み合わせての前記置換は、前記出願の一般的な概念にすべて従えば、改良された洗浄性能を示す（同じ表及び表VIIにおけるS004, S011−S014, S022−S024, S019, S020, S203, S225, S227）。
ヨーロッパ特許第525610A1号（SOLVAY）においては、酵素の一定の表面領域における疎水性を下げることによって、イオン性テンジド（tensides）に対する酵素（スブチリシンPB92に密接に関連するタイプＩ−Ｓ２スブチラーゼ）の安定性を改良することが示唆されている。結果的には、位置164（BPN'番号付けを用いる場合、170）におけるArgの代りにGlnを置換することが提案されている。この置換を含んで成る変異体はその出願には開示されていない。
WO94/02618（GIST-BROCADES N. V.）においては、Ｉ−Ｓ２型スブチリシンPB92の位置164（BPN'番号付けを用いる場合、170）の多くの変異体が記載されている。元のArgの代りにMet, Val, Tyr, Ileを置換することを示す例が提供されている。それらの変異体の粉末洗剤における洗浄性能試験は、わずかな改良を示唆している。特に、カカオに対するIle変異体の洗浄性能試験については、約20〜30％の改良性が示されている。安定性のデータは提供されていない。
WO95/30011, WO95/30010、及びWO95/29979（PROCTER & GAMBLE COMPANY）は表面に結合した土壌への酵素の吸着性を変える（すなわち、低める）ことが企画されている、スブチリシンBPN'及びスブチリシン309の両者における６個の領域、特に位置199-220（BPN'番号付け）を記載する。基質への酵素の低下した吸着性は、良好な洗剤洗浄性能をもたらす。提案された変異体に関する特定の洗剤洗浄性能のデータは提供されていない。
WO95/27049（SOLVAY S. A.）は、次の突然変異：N43R＋N116R＋N117R（BPN'番号付け）を有するスブチリシン309型プロテアーゼを記載する。データは、その対応する変異体が、野生型に比較して改良された安定性を有することを示唆する。
スブチラーゼの産業上の用途
プロテアーゼは、たとえばスブチリシンは、タンパク質性染色を除去するのに有用であるので、産業、特に洗剤配合に高い利用性を見出している。
現在、少なくとも次のプロテアーゼが商業的に入手できることが知られており、そしてそれらの多くは世界の多くの国々において多量に市販されている：
NOVO又は、SIGMA, St. Louis, U. S. A.から入手できるスブチリシンBPN'、
ALCALASE▲Ｒ▼としてNOVO NORDISK A/S（Denmark）により、又はMAXATASE▲Ｒ▼としてGist-Brocades N. V.（Holland）から市販されているスブチリシンCarlsberg。これらの両者は、スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ１に属する。
スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ２の中には、次のものが市販されていることが知られている：
SAVINASE▲Ｒ▼としてNOVO NORDISK A/S（Denmark）により市販されているバシラス・レンタス（Bacillus lentas）スブチリシン、すなわちスブチリシン309（この酵素のタンパク質工学的に処理された変異体は、DURAZYM▲Ｒ▼として市販されている）、
SAVINASE▲Ｒ▼と密接に類似する酵素、たとえばGist-Brocades N.V.により市販されているMAXACAL▲Ｒ▼（この酵素のタンパク質工学的に処理された変異体はMAXAPEM▲Ｒ▼として市販されている）、SOLVAY et Cieにより市販されているOPTICLEAN▲Ｒ▼、及びGENENCOR Internationalにより市販されているPURAFECT▲Ｒ▼、
バシラス・レンタス スブチリシン、すなわちESPERASE▲Ｒ▼としてNOVO NORDISK A/S（Denmark）により市販されているスブチリシン147。
しかしながら、効果的であるためには、そのような酵素は、洗浄条件下で、活性を示すべきであるのみならず、さらに、洗剤の製造及び貯蔵の間、他の洗剤成分と適合性できるべきである。
たとえば、スブチリシンは、他の基質に対して活性である他の酵素と組合して使用され得、そしてその選択されたスブチリシンはそのような酵素に対して安定性を有すべきであり、そしてまた、その選択されたスブチリシンは好ましくは、他の酵素の分解を触媒すべきではない。また、選択されたスブチリシンは、洗剤配合物における他の成分、たとえば漂白剤、酸化剤、等からの作用に対して耐性であるべきであり、特に洗剤配合物に使用されるべき酵素は、貯蔵の間、洗剤における、及び洗浄の間、洗浄流体における非酵素成分によりもたらされる、酸化力、カルシウム結合性質及びpH条件に対して安定性であるべきである。
たとえば洗浄の間、清浄されるべき物体上に存在する種々の天然に存在する基質の分解を触媒する酵素の能力は、しばしば、その洗浄能力（washing ability）、洗濯適性（washability）、洗浄力（detergecy）又は洗浄性能（washing performance）として言及される。本出願を通して、用語、洗浄性能（wash performance）がこの性質を包含するために使用されるであろう。
使用される前（通常、洗浄工程において水を添加することにより）に、洗剤組成物の他の成分の存在下で活性のままに存続する酵素の能力は通常、貯蔵安定性又は保存寿命として言及される。それはしばしば、半減期、ｔ1/2として測定される。我々は、この性質を包含するために本出願を通してこの性質のための表現、貯蔵安定性を用いるであろう。
天然に存在するスブチリシンは、たとえばpHの変動下でのそれらの洗浄力又は能力のごときパラメーターに関してひじょうに可変性である性質を有することが見出された。上記の市販の洗剤プロテアーゼのいくつかは、実際、約20年前に市販されたプロテアーゼよりも良好な性能を有するが、しかし最適な性能のためには、個々の酵素は、配合及び洗浄条件に関してそれ自体の特定の条件、たとえばpH、温度、イオン強度（Ｉ）、活性システム（テンジド（tenside）、界面活性剤、漂白剤、等）、ビルダー、等を有する。
結果として、低いpH及び低いＩのもとで所望の性質を有する酵素はよりアルカリ性の条件及び高いＩのもとではほとんど魅力的なものではなく、あるいは高いpH及び高いＩのもとで良好な性質を示す酵素は低いpH及び低いＩ条件下でほとんど魅力的なものではないことが見出された。
また、貯蔵安定性は酵素間で異なることが見出されたが、しかし特定の酵素は、多くのパラメーター、たとえばpH, pI, 漂白システム、テンジド等、及び粉末、ダスト又は液体形で存在することができる洗剤組成物の物理的状態に依存して、洗剤配合物が異るごとに貯蔵安定性の大きな変動を示すことがさらに見出された。さらに、それは濃縮され得又は希釈することができる。
組換えDNA技法の出現及び発達は、タンパク質化学の分野に多大な影響を有した。
この技法の適用を通して、所望のアミノ酸配列を有する酵素を構成することが現在、可能であり、そして上記のようにして、相当量の研究が変更された性質を有するスブチリシンの企画に向けられて来た。
それらの提案の中で、ヨーロッパ特許第130756号公報（GENENTECH）（アメリカ再発行特許第34,606号（GENENCOR））及び国際特許第WO87/05050号公報（GENEX）に記載されるような多数の突然変異誘発された酵素の生成及びスクリーニング技法は、天然の酵素を単離する古典的な方法にかなりの程度対応し、古典的な突然変異誘発プログラムに従い（放射性又は化学突然変異誘発物質を用いて）、そしてそれらの性質についてスクリーンする。それらの方法が特定の位置において置換されている多数の変異酵素の存在の知識を通してより効果的である点において、相違がある。
スブチリシン酵素は典型的には、約275個のアミノ酸残基を含んで成る。個々の残基は、20個の可能な天然に存在するアミノ酸のうちの１つであり得る。
従って、この方法における１つのひじょうに重大な欠点は、それらの性質を決定するために多くの予備スクリーニングにゆだねられるべきひじょうに多くの突然変異が生成されることである。
従って、それらの特許出題に概略されるような方法は、長年知られている伝統的なランダム突然変異方法よりも単にわずかに良好であろう。
他の知られている技法は、特定の性質、たとえば酸化安定性、熱安定性、Ca−安定性、エステル交換及び加水分解速度（ヨーロッパ特許第260105号公報（GENENCOR））, pH−活性プロフィール（Thomas, Russell and Fersht, 前記）、及び基質特異性（国際特許出願第WO88/07578号公報（GENENTECH））の変更に関する。それらの出版物のいづれも、酵素の洗浄性能又はそれらの貯蔵安定性のいづれかの変更について言及していない。
国際特許出願番号PCT/DK88/00002（NOVO NORDISK A/S）においては、アミノ酸位置が突然変異誘発のために選択され、そしてアミノ酸が洗浄性能における所望する変化を得るためにそれらの位置において置換されるべきことを決定するために相同性比較の概念を用いることが提案されている。
そのような方法を用いるこにより、生成される変異体の数がより少ないので、スクリーニングの仕事が激的に減じられるが、しかしその方法によれば、親酵素と比較に使用される酵素との組合された有用な性質を示す酵素が得られることが予測されるにすぎない。
従って、上記に示されたように、酵素の十分に定義された性質、たとえば上記性質と、種々の洗剤組成物における酵素の洗浄性能及び貯蔵安定性との間の関係がまだ同定されていない。
問題は、多くの研究が酵素活性の機構を示すことに向けられて来たが、特に酵素が複雑な混合物に存在する場合、それらの特徴のほとんどに関して酵素の性質、たとえば洗剤における貯蔵安定性を決定する、構造体における要因及びアミノ酸の組合せについてまだほとんど知られていないことであるように思われる。
従って、洗剤システムのための酵素のさらなる改良及び調整のための必要性、及び洗浄又は洗剤組成物の実際的な使用におけるプロテアーゼ作用及び分解の機構の最良の理解の必要性がまだ存在する。そのような理解は、洗剤組成物において特定の条件下で改良された貯蔵安定性を示す酵素を、適切な程度の確実性を伴ってもたらすであろう突然変異を選択するために適用され得る規則を提供するであろう。
発明の要約
洗剤において改良された貯蔵安定性及び／又は改良された性能を有するスブチラーゼ変異体が、親スブチラーゼの疎水性ドメインに位置するか又はそのドメイン付近に位置する１又は複数のアミノ酸残基を、元の残基よりもより疎水性のアミノ酸残基により置換することによって得られることが、今や、驚くべきことには見出され、ここで前記疎水性ドメインはBLS309の残基P129, P131, I165, Y167, Y171（BASBPN番号付けにおける）に対応する残基を含んで成り、そして前記ドメイン付近の残基がBLS309の残基E136, G159, S164, R170, A194及びG195に対応する残基を含んで成り、但し、BABP92のR170M, R170I及びR170V変異体を除く。
従って、本発明は、その第１の観点において洗剤において改良された安定性及び／又は改良された洗浄性能を示す酵素変異体に関する。
その第２の観点において、本発明は、前記第１の観点のスブチリシン酵素を発現するように導かれる宿主細胞中に適切な態様で挿入される場合、その第１の観点の酵素を発現することができるDNA構造体に関する。
第３の観点において、本発明は、適切な宿主中に前記第２の観点のDNA構造体を挿入し、所望のスブチラーゼ酵素を発現するために前記宿主を培養し、そして酵素生成物を回収することによる、本発明のスブチリシン酵素の製造に関する。
本発明は、スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ２酵素及び上記のような、続く酵素変異体を発現する遺伝子の変異体に一部、関するが、但し、それらだけには限定されない。本発明により包含される他のスブチラーゼ遺伝子変異体は、スブチラーゼサブグループＩ−Ｓ１、たとえばスブチリシンBPN'及びスブチリシンCarlsberg遺伝子の変異体、並びにさらに濃縮された液体洗剤において改良された安定性を示す、スブチリシンBPN'、プロテアーゼＫ及びスブチリシンCarlsberg変異体酵素である。
本発明により包含されるさらに追加のスブチラーゼ遺伝子変異体は、たとえばプロテアーゼＫ及び他の遺伝子、並びにさらに濃縮された液体洗剤において改良された安定性を示す、プロテアーゼＫ及び／他のスブチラーゼ変異体酵素である。
本発明に従って、変性され得る親スブチラーゼ酵素の他の例は、表Ｉに列挙される。
さらに、本発明は、洗浄組成物への前記変異体酵素の使用及び前記変異体酵素を含んで成る洗浄組成物、特に前記変異体スブチリシン酵素を含んで成る洗剤組成物にも関する。特に、本発明は、そのような酵素変異体を含んで成る濃縮された液体洗剤組成物に関する。
略語
アミノ酸
Ａ＝Ala＝アラニン
Ｖ＝Val＝バリン
Ｌ＝Leu＝ロイシン
Ｉ＝Ile＝イソロイシン
Ｐ＝Pro＝プロリン
Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン
Ｗ＝Trp＝トリプトファン
Ｍ＝Met＝メチオニン
Ｇ＝Gly＝グリシン
Ｓ＝Ser＝セリン
Ｔ＝Thr＝トレオニン
Ｃ＝Cys＝システイン
Ｙ＝Tyr＝チロシン
Ｎ＝Asn＝アスパラギン
Ｑ＝Gln＝グルタミン
Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸
Ｅ＝Glu＝グルタミン酸
Ｋ＝Lys＝リシン
Ｒ＝Arg＝アルギニン
Ｈ＝His＝ヒスチジン
Ｘ＝Xaa＝いづれかのアミノ酸
核酸塩基
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン（DNAにおいてのみ）
Ｕ＝ウラシル（RNAにおいてのみ）
変異体
本発明に従って製造され又は企画される種々の酵素変異体を記載する場合、言及を容易にするために次の命名法が適合される：
元のアミノ酸 位置 置換されるアミノ酸。
これによれば、位置195でのグリシンに代わるグルタミン酸の置換は次のように記載され：
Gly 195 Glu又はG195E、
同じ位置でのグリシンの欠失は次のように記載され：
Gly 195*又はG195*、そして
追加のアミノ酸残基、たとえばリシンの挿入は次のように記載される：
Gly 195 Gly Lys、又はG195GK。
前記番号付けのために使用される配列に比較しての欠失が示される場合、そのような位置での挿入は次のように示される：
位置36でのアスパラギン酸の挿入のためには、
*36Asp又は*36D。
複数の突然変異はプラス（＋）により分離され、すなわち：
Arg 170 Tyr＋Gly 195 Glu、又はR170Y＋G195Eは、それぞれアルギニン及びグリシンに代ってチロシン及びグルタミン酸が存在する位置170及び195での突然変異を表わす。
位置
本出願及び付随する請求の範囲において変異体を記載する場合、Siezenなど., 前記におけるように整列された種々のスブチラーゼが使用される。スブチラーゼに関する他の出版物においては、特定の酵素の他の整列又は番号付けが用いられて来た。本明細書に使用される番号付けにおいて特定の残基の位置を確立することは当業者に通常の出来事である。多数のスブチラーゼから本発明のために適切な一連の残基を示す図１をも参照のこと。多くのスブチラーゼから本発明のために適切な一連の残基を示すWO91/00345の表Ｉもまた参照のこと。
アミノ酸に対する参照（Gen Bank▲Ｒ▼／EMBL Data Bank受託番号が括弧に示されている）：
ARB172：Kamekura and Seno,（1990）Biochem. Cell. Biol. 68, 352-359（成熟プロテアーゼ残基1-35のアミノ酸配列決定；残基I4は決定されていない）。
BSS168：Stahl. and Ferrari.（1984）J. Bacteriol. 158, 411-418（KO1988）. Yoshimoto, Oyamaなど.（1988）J. Biochem. 103, 1060-1065（Ｂ. サブチリスvar. アミロサッカロチカスからの成熟スブチリシンは、T130S及びT162Sを有することで異なる）。Svendsen, など.（1986）FEBS Lett. 196, 228-232（PIR A23624；アミノ酸配列決定；Ｂ. メセンテクカスからの成熟アルカリメセンテリコペプチダーゼはS85A, A88S, S89A, S183A及びN259Sを有することで異なる）。
BASBPN：Wells, など.（1983）Nucl. Acids Res. 11, 7911-7925（X00165）. Vasanthaなど.,（1984）J. Bacteriol. 159, 811-814（K02496）。
BSSDY：Nedkovなど.（1983）Hoppe-Seyler&s Z. Physiol. Chem. 364, 1537-1540（PIR A00969；アミノ酸配列決定）。
BLSCAR：Jacobsなど.（1985）Nucleic Acids Res. 13 8913-8926（X03341）. Smithなど.（1968）J. Biol. Chem. 243, 2184-2191（PIR A00968；アミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼ配列は、T103S, P129A, S158N, N161S and S212Nを有することにおいて異なる）。
BLS147：Hastrupなど.（1989）PCT Patent Appl. WO 8906279, Pub. July 13 1989.（Ｂ. レンタスからのEsperase▲Ｒ▼）。Takamiなど.（1990）Appl. Microbiol. Biotechnol., 33, 519-523（バシラスsp. 番号AH-101からの成熟プロテアーゼ残基1-20のアミノ酸配列決定；この配列はN11Sを有することにおいてBLS147と異なる）。
BABP92：van der Laanなど.（1991）Appl. Environ. Microbiol. 57, 901-909.（Maxacal▲Ｒ▼）. Hastrupなど.（1989）PCT Patent Appl. WO 8906279. Pub. 13 Jul 1989.（Ｂ. レンタスからのスブチリシン309 Savinase▲Ｒ▼は、N875を有することにおいてのみ異なる）。Godetteなど.（1991）Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 6, Baltimore：抄録M8（Ｂ. レンタスからの高−アルカリプロテアーゼは、N87S, S99D, S101R, S103A, V104I及びG159Sを有することにおいて異なる）。
BDSM48：Rettenmaierなど.（1990）PCT Patent Appl. WO90/04022. Publ. April 19, 1990。
BYSYAB：Kanekoなど.（1989）J. Bacteriol. 171 5232-5236（M28537）。
BSEPR：Slomaなど.（1988）J. Bacteriol. 170 5557-5563（M22407）. Bruckner（1990）Mol. Gen. Genet. 221, 486-490（X53307）。
BSBPF：Slomaなど.（1990）J. Bacteriol. 172, 1470-1477（M29035；訂正されている）。Wuなど.（1990）J. Biol. Chem. 265, 6845-6850（J05400；この配列は、フレームシフトのために、A169V及び586以下のＣ−末端残基を有することにおいて異なる）。
BSISP1：Koideなど.（1986）J. Bacteriol. 167, 110-116（M13760）。
BSIA50：Stronginなど.（1978）J. Bacteriol. 133, 1401-1411（成熟プロテアーゼ残基1-54のアミノ酸配列決定：残基３, 39, 40, 45, 46, 49及び50は決定されなかった）。
BTFINI：Chestukhinaなど（1985）Biokhimiya. 50, 1724-1730（Ｂ. ツリンジエンシス変種イスラエリエンシルからの成熟プロテアーゼ残基１−14及び変種フィニティマスからの残基1-16及び223-243のアミノ酸配列決定）。Kunitateなど.（1989）Agric. Biol. Chem. 53, 3251-3256（変種クルスタキBTKURSからの成熟プロテアーゼ残基6-20のアミノ酸配列決定）。
BCESPR：Chestukhinaなど（1985）Biokhimiya 50, 1724-1730（成熟残基1-16及び223-243のアミノ酸配列決定）。
NDAPII：Tsujiboなど.（1990）Agric. Biol. Chem. 54, 2177-2179（成熟残基1-26のアミノ酸配列決定）。
TVTHER：Melounなど（1985）FEBS Lett. 183, 195-200（PIRA00973；成熟プロテアーゼ残基1-274のアミノ酸配列決定）。
EFCYLA：Segarraなど.（1991）Infect. Immun. 59, 1239-1246。
SEEPIP：Schnellなど.（1991）personal communication（Siezenなど.（前記））。
SPSCPA：Chenなど.（1990）J. Biol. Chem. 265, 3161-3167（J05224）。
DNEBPR：Korttなど.（1991）Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 22-26, Baltimore. 抄録S76。
LLSK11：Vosなど.（1989）J. Biol. Chem. 264, 13579-13585（J04962）. Kokなど.（1988）Appl. Environ. Microbiol. 54, 231-238（M24767；Wg２株からの配列は、プロテアーゼドメインにおける18の差異及び残基1617-1676の欠失を包含する、44の位置において異なる）。Kiwakiなど.（1989）Mol. Microbiol., 3, 359-369（X14130；NCD0763株からの配列は、プロテアーゼドメインにおける22の差異及び残基1617-1676の欠失を包含する、46の位置において異なる）。
XCEXPR：Liuなど.（1990）Mol. Gen. Genet. 220, 433-440。
SMEXSP：Yanagidaなど.（1986）J. Bacteriol. 166, 937-994（M13469）。
TAAQUA：Teradaなど.（1990）J. Biol. Chem. 265, 6576-6581（J054I4）。
TRT41A：McHaleなど.（1990）Abstracts 5th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen, Munck and Villadsen（eds）, Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen。
VAPROA：Deaneなど.（1989）Gene 76, 281-288（M25499）。
SRESPD：Lavrenovaなど.（1984）Biochemistry USSR. 49, 447-454（残基1-23のアミノ酸配列決定；残基13, 18及び19は決定されていない）。
AVPRCA：Maldenerなど.（1991）Mol. Gen. Genet. 225, 113-120（公開された配列は、フレームシフト読み取り誤差のために位置200-210近くで28個の不確定残基を有する）。
TAPROK：Gunkel and Gassen（1989）Eur. J. Biochem. 179, 185-194（X14688/XI4689）. Janyなど.（1986）J. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 87（PIR A24541；アミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼは、S745G, SILST204-208DSL及びVNLL264-267FNLを有することにおいて異なる）。
TAPROR：Samalなど.（1990）Mol. Microbiol. 4, 1789-1792（X56116）。
TAPROT：Samalなど.（1989）Gene 85, 329-333。
AOALPR：Tatsumiなど.（1989）Mol. Gen. Genet. 219, 33-38。Cheevadhanarahなど.（1991）EMBL Data Library（X54726）。
MPTHMY：Gaucher and Stevenson（1976）Methods Enzymol. 45, 415-433（残基1-28、及び活性部位セリンを有するヘキサペプチドLSGTSMのアミノ酸配列決定）。
ACALPR：Isogaiなど.（1991）Agric. Biol. Chem. 55, 471-477。Stepanovなど.（1986）Int. J. Biochem. 18, 369-375（残基1-27のアミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼはH13［1］Qは、R13［2］N及びS13［6］Aを有することにおいて異なる）。
KEX1：Tanguy-Rougeau, Wesolowski-Louvel and Fukuhara（1988）FEBS lett. 234, 464-470（X07038）。
SCKEX2：Mizunoなど.（1988）Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254（M24201）。
SCPRB1：Moehleなど.（1987）Mol. Cell. Biol. 7, 4390-4399（M18097）。
YLXYPR2：Davidowなど.（1987）J. Bacteriol. 169, 4621-4629（M17741）。Matobaなど.（1988）Mol. Cell Biol. 8, 4904-4916（M23353）。
CEBL14：Peters and Rose（1991）The Worm Breeder's Gezette 11, 28。
DMFUR1：Roebroekなど.（1991）FEBS Lett. 289, 133-137（X59384）。
DMFUR2：Roebroekなど.（1992）267, 17208-17215。
CMCUCU：Kanedaなど.（1984）J. Biochem. 95, 825-829（活性部位セリンを有するオクタペプチドNIISGTSMのアミノ酸配列決定）。
HSFURI：van den Ouwelandなど.（1990）Nucl. Acids Res. 18, 664（X04329）（マウス フリンの配列は、触媒ドメインにおける次の５つの残基を包含する51の位置において異なる：A15E, Y21F, S223F, A232V及びN258［2］D）。Misumiなど.（1990）Nucl. Acids Res. 18, 6719（X55660：ラット フリンの配列は、触媒ドメインにおける次の３つの残基を包含する49の位置において異なる：A15E, Y21F, H24R）。
HSIPC2：Smeekens and Steiner（1990）J. Biol. Chem. 265, 2997-3000（J05252）。Seidahなど.（1990）DNA Cell Biol. 9, 415-424（マウス下垂体PC２プロテアーゼの配列は、プロテアーゼドメインにおける次の７つの残基を包含する23の位置において異なる：I4F, S42[2]Y, E45D, N76S, D133E, V134L及びG239[1]D）。
MMPPC3：Smeekensなど.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 340-344（M58507）。Seidahなど.（1990）DNA Cell Biol. 9, 415-424（M55668/M55669；部分配列）。
HSTPP：Tomkinson and Jonsson（1991）Biochemistry 30, 168-174（J05299）。
【図面の簡単な説明】
図面において、図１は表Ｉに言及される一連の多くのスブチラーゼを示す。
図２は、疎水性ドメインの位置、及び本発明に従って置換されるその近くのアミノ酸残基のいくつかを示すスブチリシン309の３次元表示である。
発明の特定の記載
スブチラーゼの洗剤における貯蔵安定性及び／又は改良された性能が、スブチリシン309の残基P129, P131, I165, Y167, Y171を含んで成る疎水性ドメインに位置するか又はそのドメインの近くに位置するアミノ酸残基がより疎水性の残基により置換される場合、一般的に改良されることが、驚くべきことには見出された。問題の残基は特に、E136, G159, S164, R170, A194及びG195である。
さらに、前記変異体は、液体洗剤及び成形された固体形の洗剤において、特に高い改良された安定性を示す。
図２は、スブチリシン309における疎水性ドメイン、及び前記ドメインの疎水性を高めるために置換される予定である、前記ドメインの近くに位置する残基の幾つかを示す。これは、非疎水性残基を疎水性残基により置換することにより、及び／又は親酵素におけるよりもより一層、疎水性になるように残基を置換することによって達成され得る。
同じ原理が他のスブチラーゼにおけるその対応するドメインに適用され、この同定は、当業者の範囲内である。図２におけるような図表示は、本発明に従って置換される標的残基を決定するために他のスブチラーゼに適用できる。
その多くが下記表IIに示される：
従って、本発明は、スブチリシン酵素の遺伝子の突然変異誘発によりアミノ酸配列が変更されているスブチラーゼ変異体に関し、ここで、位置129, 131, 165, 167, 171, 136, 159, 164, 170, 194及び195におけるアミノ酸残基の発現を担当するコドンにおいて親酵素又は遺伝子を変性することが所望され、前記残基は親酵素における残基よりもより疎水性であり、特に、比較的長い疎水性側鎖、たとえばIle, Leu及びValを含んで成るような疎水性残基であり、それにより、突然変異誘発された遺伝子が発現される場合、アミノ酸残基が、ドメイン自体の疎水性を高めるより一層疎水性の残基により置換される。
疎水性アミノ酸残基は一般的に次のものである：Val（V）, Ile（I）, Leu（L）, Met（M）, Phe（F）, Pro（P）及びTrp（W）。それらの中で、Val, Ile及びLeuが好ましい。
表IIを参照し、そして本発明の原理を適用することによって、置換のための多くの候補体が明確になる。
BASBPN及びBLSCARの両者に関しては、位置129, 131, 136, 159, 164, 167, 170, 171及び195で置換を行なうことが適切であるように思える。BLS309においては、位置136, 164, 167, 170及び171が最初の選択であり、そして位置159及び159はまた、第２の選択であろう。BLS147においては、位置129, 131, 136, 167, 170, 171及び195が最初の選択であり、そして位置159及び164が第２の選択である。最後に、TVTHERにおいては、位置129, 131, 136, 167, 171及び194が最初の選択であり、そして位置164が第２の選択である。
本発明によれば、疎水性ドメインにおけるGly残基を、よりバルキー（bulky）で且つより疎水性の残基に置換することが利点を必然的に伴う。
そのような考慮は、上記位置のいづれかを占めることができるいづれかの親水性又は疎水性残基のために適用でき、これは疎水性のいくらかの上昇が好都合であるように思えることを意味する。これは、たとえば、ひじょうに親水性の残基、たとえば荷電された残基Arg（R）, Asp（D）, Glu（E）又はLys（K）が低い親水性であるいづれかの残基により置換され得ることを意味する。そのような低い親水性残基は、残基Gly（G）, Cys（C）, Ser（S）, Ala（A）, Thr（T）, Tyr（Y）, Gln（Q）, His（H）又はAsn（N）を含んで成る。それは、Tyr（Y）がより疎水性の残基、たとえばPhe（F）, Leu（L）又はIle（I）により置換され得ることもまた意味する。
類似する考慮が、酵素の表面のこの部分に疎水性ドメインを有する他のスブチラーゼに適用され得る。
本発明においては、スブチラーゼは、Siezenなど、前記、に従って定義される。本発明の多くの態様に適用できるより狭い意味においては、興味あるスブチラーゼは、サブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２に属するものである。より特定の意味においては、本発明の態様の多くは、上記表Ｉに列挙されるスブチラーゼと、それらの一次構造において実質的に明白な相同性にすることができるグラム陽性細菌のセリンプロテアーゼに関係する。
本発明はまた、親酵素のアミノ酸配列へのいづれか他の置換、欠失又は付加と組み合わせての、前に記載した位置におけるいづれか１又は複数の置換も含んで成る。特に、酵素に改良された性質を付与することが知られている他の置換との組合せが考えられる。
そのような組合せは、位置：222（酸化安定性を改良する）、218（熱安定性を改良する）、酵素を安定化するCa−結合部位例えば76での置換、及び従来技術から明らかである多くの他の位置を含んで成る。
さらに、ヨーロッパ特許第405901号に言及される変異体との組合せもまた、特に予測される。
変異体
Ａ：単一の変異体：
スブチリシンBPN′, スブチリシンCarlsberg, スブチリシン168, 及びスブチリシンDY変異体：
上記変異体のいづれかが、下記位置のいづれかにおいて他の変異体と組合される場合、好都合であると予測される：27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
特に、次のELS309及びBAPB92変異体は、組合せのために適切であると思われる：K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L、及びT274A。
また、上記のいづれか１又は複数の他の置換、欠失、及び／又は挿入と組み合わせて、X167V, X167M, X167F, X167L, X167I, X170V, X170M, X170F, X170L、及び／又はX170Iのいづれか１又は２の置換を含んで成るそのような変異体は好都合である。
さらに、上記のいづれか１又は複数の置換、欠失及び／又は挿入と組み合わせて、変異体V104N＋S101G, K27R＋V104Y＋N123S＋T274A、又はN76D＋V104A、又はそれらの突然変異との他の組合せのいづれか（V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A）を含んで成る変異体は、改良された性質を示すと思われる。
言及される特定の組合せは次の通りである：
本発明はまた、清浄及び洗浄組成物への本発明の変異体酵素の使用、及び変異体スブチリシン酵素を含んで成るそのような組成物を含んで成る。そのような清浄及び洗浄組成物は、原則としていづれの物理形でも有することができるが、しかしスブチラーゼ変異体は好ましくは、改良された酵素安定性又は性能を示す、直接的な適用のための棒、錠剤、スチック及び同様のものの形で液体洗浄組成物又は洗浄組成物に組込まれる。
本発明の液体組成物の中には、たとえば均質な物理的特性を有する水性液体洗剤が存在し、たとえばそれらは、連続した水性相、いわゆる等方性液体における界面活性剤のミセル溶液から成ることができる。
他方、それらは不均質な物理的相を有することができ、そしてそれらは、ヨーロッパ特許出願第346995（Unilever）（引用により本明細書に組込まれる）に記載されるように、１つの親水性主鎖及び少なくとも１つの疎水性側鎖を有する解膠性ポリマーを含んで成る、連続した水性相における層状液滴の分散体から構成され、たとえばそれらから成ることができる。それらの後者の液体は、不均質性であり、そして懸濁された固形粒子、たとえば下記種類のビルダー材料の粒子を含むことができる。
粉末洗浄組成物に関して、そのような組成物は、本発明のいづれかの前記観点におけるいづれか１又は複数のスブチリシン酵素変異体の他に、当業者に良く知られているような組成物に含まれるいづれかの通常の成分を単独で又は組合して含んで成る。
そのような成分は、ビルダー、たとえばホスフェート又はゼオライトビルダー、界面活性剤、たとえばアニオン、カチオン、非イオン又は両性イオン型界面活性剤、ポリマー、たとえばアクリル又は同等のポリマー、漂白剤システム、たとえば過硼酸塩−又はアミノ−含有漂白剤前駆体又は活性剤、構造活性剤（structurants）、たとえばシリケート構造活性剤、pHを調整するためのアルカリ又は酸、保湿剤、及び／又は中性無機塩を包含する。
さらに、多くの他の成分、たとえば、下記成分が、本発明の組成物に通常、存在する：
Ａ．補助界面活性剤
Ｂ．タルトレート スクシネート ビルダー
Ｃ．中和システム
Ｄ．泡抑制剤
Ｅ．他の酵素
Ｆ．他の任意の成分。
アニオン界面活性剤：非イオン界面活性剤の重量比は、好ましくは１：１〜５：１である。組成物は、20℃で水中、10重量％溶液において7.0〜9.0のpH, 200ppmよりも低いか又はそれに等しい臨界ミセル濃度、及び蒸留水において35℃及び臨界ミセル濃度で、32ダイン／cmよりも低いか又はそれに等しい空気／水界面張力を有する。組成物は好ましくは、透明で、均質で且つ相安定性であり、そして良好な清浄性能及び酵素安定性を有する。
種々の成分：
１．アニオン性界面活性剤
本発明の組成物は、約10重量％〜約50重量％、好ましくは約15重量％〜約50重量％、より好ましくは約20重量％〜40重量％、及び最とも好ましくは20重量％〜約30重量％の天然又は合成のアニオン性界面活性剤を含む。適切な天然又は合成のアニオン性界面活性剤は、たとえば石鹸及びアメリカ特許第4,285,841号及び第3,929,678号に開示されるものである。
有用なアニオン性界面活性剤は、水溶性塩、特に、それらの分子構造体に、約10〜約20個の炭素原子を含むアルキル基及び硫酸又は硫酸エステル基を有する有機硫酸反応生成物の、アルカリ金属、アンモニウム及びアルキロールアンモニウム（たとえば、モノエタノールアンモニウム又はトリエタノールアンモニウム）塩を包含する。（用語“アルキル”とは、アリール基のアルキル部分を包含する。）合成界面活性剤のこのグループの例は、アルキルスルフェート、特に、高級アルコール（Ｃ8−Ｃ18の炭素原子）、たとえば牛脂又はヤシ油のグリセリドを還元することによって生成されるものを硫酸化することによって得られるもの；及びアルキル基が直鎖又は枝分れ鎖の形状で約９〜約15個の炭素原子を含むアルキルベンゼンスルホネート、たとえばアメリカ特許第2,220,099号及び第2,477,383号に記載されるタイプのものである。アルキル基における炭素原子の平均数が約11〜14である直鎖アルキルベンゼンスルホネートが特に価値がある。
本明細書における他のアニオン性界面活性剤は、水溶性塩、たとえば８〜約24個（好ましくは、約12〜18個）の炭素原子を含むパラフィンスルホネート；アルキルグリセリルエーテルスルホネート、特にＣ8−Ｃ18のアルコール（たとえば、牛脂及びヤシ油に由来するもの）のそれらのエーテル；分子当たり１〜約４単位の酸化エチレン及びアルキル基に８〜12個の炭素原子を含むアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート；及び分子当たり１〜４単位の酸化エチレン及びアルキル基に10〜20個の炭素原子を含むアルキルエチレンオキシドエーテルスルフェートである。
他の有用なアニオン性界面活性剤は、脂肪酸基に６〜20個の炭素原子及びエステル基に１〜10個の炭素原子を含む、α−スルホン化された脂肪酸のエステルの水溶性塩；アシル基に２〜９個の炭素原子及びアルカン成分に９〜23個の炭素原子を含む２−アシルオキシ−アルカン−１−スルホン酸の水溶性塩；12〜24個の炭素原子を含むオレフィンスルホネートの水溶性塩；及びアルキル基に１〜３個の炭素原子及びアルカン成分に８〜20個の炭素原子を含むβ−アルキルオキシアルカンスルホネートを包含する。
好ましいアニオン性界面活性剤は、石鹸、アルキルスルホネートの分子当たり平均４個までの酸化エチレンを含むＣ10−Ｃ18アルキルスルホネート及びアルキルエトキシスルホネート、Ｃ11−Ｃ13線状アルキルベンゼンスルホネート、及びそれらの混合物である。
２．非イオン性界面活性剤
もう１つの任意の成分は、２〜14重量％、好ましくは２〜８重量％、最とも好ましくは３〜５重量％の任意にエトキシル化された非イオン性界面活性剤である。天然又は合成のアニオン性界面活性剤（酸塩基に基づく）：非イオン性界面活性剤の重量比は、１：１〜５：１、好ましくは２：１〜５：１、最とも好ましくは３：１〜４：１である。これは、脂肪性／油性の土壌の良好な除去を提供するために空気／水の界面での十分な硬度の界面活性剤の形成及び吸着を確保することである。
任意にエトキシル化された非イオン性界面活性剤は、式R1（OC2H4）nOH（式中、Ｒ1はＣ10−Ｃ16アルキル基又はＣ8−Ｃ12アルキルフェニル基であり、ｎは３〜９である）のものであり、そして前記非イオン性界面活性剤は、６〜14、好ましくは10〜13のHLB（親水性−親油性バランス）を有する。それらの界面活性剤は、アメリカ特許第4,285,841号及び第4,284,532号により詳しく記載されている。特に好ましくは、アルコール１モル当たり酸化エチレン３〜８モルと、Ｃ12−Ｃ15アルコールとの縮合生成物、たとえばアルコール１モル当たり酸化エチレン約6.5モルにより縮合されたＣ12−Ｃ13アルコールである。言及される他の非イオン性界面活性剤は、APG, EGE及びグルカミド界面活性剤である。
３．洗浄ビルダー
本発明の洗浄組成物に通常の量で依存することができる通常の洗浄成分の中には次のものが存在する：組成物は増強されても又は増強されなくても良く、そしてゼロ−Ｐ型（すなわち、いづれのリン含有ビルダーをも含まない）のものであり得る。従って、組成物は、たとえば１〜50重量％、たとえば少なくとも約５重量％及びしばしば、約35〜40重量％の１又は複数の有機及び／又は無機ビルダーを、凝集体として含むことができる。ビルダーの典型的な例は、すでに上記で言及されたものを包含し、そしてより広くは、アルカリ金属のオルト、ピロ及びトリポリホスフェート、アルカリ金属のカーボネート（単独又は方解石と組合して）、アルカリ金属のシトレート、アルカリ金属のニトリロトリアセテート、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライト、ポリアセタールカルボキシレート及び同様のものを包含する。
より特定には、本明細書に記載される組成物は、10〜18個の炭素原子を含む脂肪酸であり得る洗浄ビルダー５〜20重量％、好ましくは10〜50重量％、及び／又はポリカルボキシレート、ゼオライト、ポリホスホネート及び／又はポリホスフェートビルダーを含む。好ましくは、12〜14個の炭素原子を含む、０〜10重量％（より好ましくは、３〜10重量％）の飽和脂肪酸、及び０〜10重量％、より好ましくは２〜８重量％、最とも好ましくは２〜５重量％のポリカルボキシレートビルダーであり、最とも好ましくは、１：１〜３：１の重量比でのクエン酸である。
本発明におけるタンパク質分解性酵素は、ビルダー：水の硬度の比が１に近い場合、他の酵素に対して最適な貯蔵安定性利点を付与すると思われるので、組成物は好ましくは、前記硬度の水１ガロン当たり２〜10、好ましくは３〜８個の粒子を金属イオン封鎖するのに十分なビルダーを含む。
適切な飽和脂肪酸は、天然源、たとえば植物又は動物エステル（たとえばヤシ種子油、パーム油及びヤシ油）から得られ、又は合成的に調製され得る（たとえば、石油の酸化又はFisher-Tropsch法を通しての一酸化炭素の水素化を通して）。本発明の組成物に使用するための適切な飽和脂肪酸の例は、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ヤシ油及びパーム種子脂肪酸を包含する。飽和ヤシ脂肪酸；ラウリン酸：ミリスチン酸の５：１〜１：１（好ましくは約３：１）の重量比の混合物；少量（たとえば合計の脂肪酸の１〜30％）のオレイン酸と上記のものとの混合物；及びヤシ種子脂肪酸が好ましい。
本発明における組成物は好ましくは、また、アメリカ特許第4,284,532号に記載されるポリカルボキシレート、ポリホスホネート及びポリホスフェートビルダーを含む。水溶性ポリカルボキシレートビルダー、特に、シトレートは、このグループの中で好ましいものである。適切なポリカルボキシレートビルダーは、種々のアミノポリカルボキシレート、シクロアルカンポリカルボキシレート、エーテルポリカルボキシレート、アルキルポリカルボキシレート、エトキシポリカルボキシレート、テトラヒドロフランポリカルボキシレート、ベンゼンポリカルボキシレート／及びポリアセタールポリカルボキシレートを包含する。
そのようなポリカルボキシレートビルダーの例は、ナトリウム及びカリウムエチレンジアミンテトラアセテート；ナトリウム及びカリウムニトリロトリアセテート；アメリカ特許第1,739,942号に開示される、フィチン酸の水溶性塩、たとえばフィチンナトリウム及びカリウム、アメリカ特許第3,364,103号に記載されるポリカルボキシレート材料；アメリカ特許第3,308,067号に記載されるポリカルボキシレートポリマー及びコポリマーの水溶性塩である。
他の有用な洗浄ビルダーは、次の構造的及び物理的特徴を有するポリマー性脂肪族ポリカルボン酸の水溶性塩を包含する：（ａ）酸形に関して計算される場合、約350の最少分子量；（ｂ）酸形に関して計算される場合、50〜80の当量；（ｃ）２よりも多くない炭素原子によりお互い分離されている少なくとも２個のカルボキシル基を有するモノマー種少なくとも45モル％；（ｄ）次のカルボキシル含有基の結合の部位からのポリマー鎖にそって３個よりも多くない炭素原子により分離されるいづれかのカルボキシル含有基のポリマー鎖の結合の部位。そのようなビルダーの特定の例は、イタコン酸、アコニット酸、マレイン酸、メサコン酸、フマル酸、メチレンマロン酸及びシトラコン酸のポリマー及びコポリマーである。
他の適切なポリカルボキシレートビルダーは、メリット酸、クエン酸、ピロメリット酸、ベンゼンペンタカルボン酸、オキシ二酢酸、カルボキシメチルオキシ琥珀酸、カルボキシメチルオキシマロン酸、シス−シクロヘキサンヘキサカルボン酸、シス−シクロペンタンテトラカルボン酸及びオキシ琥珀酸の水溶性塩、特にナトリウム及びカリウム塩である。
他のポリカルボキシレートは、アメリカ特許第4,144,226号及び第4,146,495号に記載されるポリアセタールカルボキシレートである。
他の洗浄ビルダーは、ゼオライト、たとえばアメリカ特許第4,405,483号に記載されるアルミノシリケートイオン交換材料を包含する。
他の好ましいビルダーは、一般式Ｒ−CH（COOH）CH2（COOH）（式中、ＲはＣ10−Ｃ20、好ましくはＣ12−Ｃ16のアルキル又はアルケニルであり、又はＲはヒドロキシル、スルホ、スルホキシ又はスルホン置換基により置換され得る）で表わされるもの、すなわち琥珀酸の誘導体である。それらのスクシネートビルダーは好ましくは、それらの水溶性塩、たとえばナトリウム、カリウム及びアルカノールアンモニウム塩の形で使用される。スクシネートビルダーの特定の例は次のものを包含する：ラウリルスクシネート、ミリスチルスクシネート、パルミチルスクシネート、２−ドデセニルスクシネート及び同様のもの。
４．タンパク質分解性酵素
本発明の酵素は、洗浄組成物において良く知られた標準の量で使用され得る。その量は、ひじょうに広い範囲であり、たとえば洗浄組成物１ｇ当たり約0.0002〜0.1、たとえば0.005〜0.05のAnson単位である。他の単位で表わす場合、プロテアーゼは、洗浄配合物１mg当たり約0.1〜100GUmg（たとえば１〜50、特に５〜20GU／mg）の量で、又は洗浄配合物１mg当たり約0.01〜４、たとえば0.1〜0.4KNPUの広い範囲のいづれかの量で組成物に含まれ得る。
洗浄流体１ｌ当たり酵素約0.25mgの割合で本発明の酵素を使用することが適切であり、それは１ｌ当たり0.08KNPUの酵素活性に対応する。対応する洗浄配合物は、たとえば0.1〜0.4KNPU／ｇの量で酵素を含むことができる。
他においては、本発明の組成物は、約0.01〜約５重量％、好ましくは約0.1〜約２重量％の本発明のタンパク質分解性酵素を含む。
その記載されるタンパク質分解性酵素は好ましくは、組成物１ｇ当たり0.05〜約1.0、より好ましくは約0.1〜0.75、最とも好ましくは約0.125〜約0.5mgの活性酵素の活性を提供するのに十分な量で含まれる。
酵素成分は、いづれか便利な形で、たとえば溶液、スラリー、LDPスラリー又は結晶の形で、他の成分に添加され得る。
５．酵素安定化システム
本発明の液体洗剤は、カルシウムイオン、硼酸、プロピレングリコール及び／又は短鎖カルボン酸を含んで成る酵素安定化システムを含んで成る。酵素安定化システムは、組成物中、約0.5〜約15重量％を占める。
組成物は好ましくは、１ｌ当たり約0.01〜約50、好ましくは約0.1〜約30、より好ましくは約１〜20ｍモルのカルシウムイオンを含む。カルシウムイオンのレベルは、組成物において、ビルダー、等との錯化を可能にした後、酵素のために利用できる最少レベルで常に依存するよう選択されるべきである。いづれかの水溶性カルシウム塩；たとえば塩化カルシウム、蟻酸カルシウム及び酢酸カルシウムが、カルシウムイオンの源として使用され得る。一般的に約0.05〜0.4ｍモル／ｌの最少量のカルシウムイオンがしばしば、酵素スラリー及び配合水におけるカルシウムのために組成物に存在する。約0.03％〜約0.6％の蟻酸カルシウムが好ましい。
第２の好ましい酵素安定剤は、炭素、水素及び酸素原子のみを含むポリオールである。それらは好ましくは、２〜６個の炭素原子及び２〜６個のヒドロキシ基を含む。例としては、プロピレングリコール（特に、１，２−プロパンシオールが好ましい）、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びグルコースを挙げることができる。ポリオールは、一般的に、組成物の約0.5〜15重量％、好ましくは約1.5〜約８重量％を占める。好ましくは、添加されるポリオール：いづれかの硼酸の重量比は、少なくとも１、より好ましくは、少なくとも1.3である。
組成物は好ましくは、また、アメリカ特許第4,318,818号に記載される水溶性短鎖カルボキシレートを含む。蟻酸塩は好ましく、そして組成物中、約0.05〜約５重量％、好ましくは約0.2〜約２重量％、最とも好ましくは0.4〜1.5重量％のレベルで使用され得る。
本発明の組成物はまた、任意に、約0.25〜約５重量％、最とも好ましくは、約0.5〜約３重量％の硼酸を含む。硼酸は、組成物において硼酸を形成することができる化合物により形成され得るが、しかし好ましいことではない。硼酸が好ましいが、但し、他の化合物、たとえば酸化硼酸、硼砂及び他のアルカリ金属の硼酸塩（たとえば、オルト−、メタ−及びピロ硼酸ナトリウム、及び五硼酸ナトリウム）も適切である。置換された硼酸（たとえば、フェニル硼酸、ブタン硼酸、及びｐ−ブロモフェニル硼酸）もまた、硼酸の代わりに使用され得る。
６．水
本発明の液体組成物は、水性液体でも又は非水性液体でもあり得る。水性液体である場合、それらは約15〜約60重量％、好ましくは約25〜約45重量％の水を含む。
追加の任意の成分
Ａ．補助界面活性剤
上記非イオン性界面活性剤と共に使用するための任意の補助界面活性剤は、下記一般式：
好ましいアミドは、Ｃ8−Ｃ20脂肪酸アルキロールアミド（ここで、個々のアルキロール基は１〜３個の炭素原子を含み、そしてさらに、２個までの酸化エチレン単位を含むことができる）である。特に好ましくは、Ｃ12−Ｃ16脂肪酸モノエタノール及びジエタノールアミドである。
使用される場合、アミドは好ましくは、上記エトキシル化された非イオン性界面活性剤：アミド界面活性剤が４：１〜１：４、好ましくは３：１〜１：３の重量比で存在するようなレベルで存在する。
0.15％〜１％のレベルで使用される好ましく且つ任意の補助界面活性剤は、アメリカ特許第4,507,219号に記載される、第四アンモニウム、アミン及び酸化アミン界面活性剤である。
上記のうち、Ｃ10−Ｃ14アルキルトリメチルアンモニウム塩、たとえばデシルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド並びにココナツトリメチルアンモニウムクロリド及びメチルスルフェートが好ましい。0.2〜0.8％のモノアルキルトリメチルアンモニウムクロリドが好ましい。
Ｂ．タルトレーンスクシネートビルダー
本発明の組成物は好ましくは、酸に基づいて０〜約10重量％、好ましくは０〜約６重量％の、下記群から選択されたタルトレートスクシネートビルダー材料を含む：
iii）それらの混合物。
本発明において使用されるタルトレートスクシネート化合物は、アメリカ特許第4,663,071号に記載される。
Ｃ．中和システム
本発明の組成物はまた、任意に、組成物100ｇ当たり約０〜約0.04モル、好ましくは約0.01〜0.035モル、より好ましくは約0.015〜約0.03モルの、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン及びそれらの混合物から選択されたアルカノールアミンを含むことができる。低レベルのアルカノールアミン、特にモノエタノールアミンが、生成物の安定性、洗浄性能及び臭気を増強するために好ましい。しかしながら、アルカノールアミンの量は、最良の塩素漂白剤適合性のためには最少であるべきである。
さらに、組成物は、アニオン種を中和し、そして所望する生成物のpHを付与するために十分なレベルで、ナトリウムイオン及び好ましくはカリウムイオンを含む。
Ｄ．泡抑制剤
本明細書に記載される液体洗剤に使用するためのもう１つの任意の成分は、０〜約1.5重量％、好ましくは約0.5〜約1.0重量％のシリコーン基材の泡抑制剤である。シリコーンは広く知られており、そしてひじょうに効果的な泡調節剤としての使用について教授されている。たとえば、アメリカ特許第3,455,839号は、少量のポリジメチルシロキサン流体をその中に組込むことによる脱泡水溶液についての組成物及び方法を言及する。
有用な泡調節シリコーンは、たとえばドイツ特許出願DOS2, 124, 526に記載されるような、シリコーン及びシラン化されたシリカの混合物である。
シリコーン脱泡剤及び泡調節剤は、アメリカ特許第3,933,672号及び第4,652,392号におけるように、それらを洗浄界面活性剤から保護することによって顆粒状洗浄組成物中に都合良く導入されて来た。
本発明に使用するための好ましいシリコーン基材の泡抑制剤は、下記のものから実質的に成る、泡抑制量の泡調節剤である：
（ｉ）25℃で約20cs.〜約1500cs.の粘度を有するポリジメチルシロキサン流体；
（ii）（ｉ）100重量部当たり約５〜約50重量部のシロキサン樹脂（約0.6：１〜約1.2：１の比での（CH3）3SiO1/2単位：SiO2単位から構成される）；及び
（iii）（ｉ）100重量部当たり約１〜約20重量部の固体シリカゲル。
“泡抑制量”とは、組成物の配合者が泡を所望する程度に調節するであろうこの泡調節剤の量を選択することができることを意味する。泡調節の量は、選択される洗浄界面活性剤により変化するであろう。たとえば、高い泡界面活性剤に関しては、比較的多くの泡調節剤が、低い発泡界面活性剤に関してよりも所望する泡調節を達成するために使用される。
Ｅ．他の酵素
本発明の洗浄組成物はまた、追加の酵素も含むことができる。
たとえば、リパーゼは、キャリヤー材料と共に、タンパク質分解性酵素の溶液又はスラリーの形で有用に添加され得る（たとえば、ヨーロッパ特許第258,068号公報（Novo Nordisk A/S）におけるような）。
添加されるリパーゼの量は、広範囲内から、たとえば界面活性剤システム又は洗浄組成物１ｇ当たり50〜30,000LU、たとえばしばしば少なくとも100LU／ｇ、ひじょうに通常には少なくとも500LU／ｇ、時々、好ましくは1000LU／ｇ以上、2000LU／ｇ以上又は4000LU／ｇ以上、従ってひじょうにしばしば50〜4000LU／ｇ以内、及びたぶん200〜1000LU／ｇの範囲内から選択され得る。本明細書においては、リパーゼ単位は、ヨーロッパ特許第258,068号公報に定義されている。
タンパク質分解性酵素は、広範囲のリパーゼ間から選択され得る。特に、次の特許明細書に記載されるリパーゼ：ヨーロッパ特許第214,761（Novo Nordisk A/S）及び第258,068号公報、及び特に、ヨーロッパ特許第205,208号及び第206,390号公報に記載される、サーモミセスラヌジノサス（Thermomyces lanuginosus）ATCC22070からのリパーゼに対して生ぜしめられた抗血清との免疫学的交差反応性を示すリパーゼ、及び特に、クロモバクタービスコサムvar（Chromobacter viscosum var）タンパク質分解性NRRL Ｂ−3673からのリパーゼ又はアルカリゲネス（Alcaligenes）PL−679, ATCC31371及びFERM−Ｐ3783からのリパーゼに対して生ぜしめられた抗血清と免疫学的交差反応性を示すリパーゼ、及びまた、WO87/00859（Gist−Brocades）及びヨーロッパ特許第204,284号（Sapporo Breweries）公報に記載されるリパーゼを挙げることができる。特に、たとえば次の市販のリパーゼ調製物も適切である：Lipolase▲Ｒ▼ Novo Nordisk A/S, AminoリパーゼCE, Ｐ, Ｂ, AP, Ｍ−AP, AML及びCES、及びMeitoリパーゼMY−30, OF及びPL、またEsterase▲Ｒ▼ MM（Novo Nordisk A/S）, Lipozym, SP225, SP285（すべて、Novo Nordisk A/S製）、Saikenリパーゼ、Enzecoリパーゼ、Toyo Jozoリパーゼ及びDiosynthリパーゼ（Trade Marks）, Lumafast▲Ｒ▼（Genencor Inc.）, Lipomax▲Ｒ▼（Gist-Brocades N. V.）、及びWO94/03578（Unilever）に記載されるリパーゼ。
アミラーゼは、所望には、洗浄組成物１ｇ当たり約１〜約100MU（マルトース単位）の範囲の量（又は0.014〜1.4、たとえば0.07〜0.7KNU／ｇ（Novo単位））で使用され得る。適切なアミラーゼは、たとえばTermamyl▲Ｒ▼及びBAN（Novo Nordisk A/S）である。たとえば、セルラーゼは、所望には、洗浄組成物１ｇ当たり約0.3〜約35CEVU単位の範囲の量で使用され得る。適切なセルラーゼは、たとえばCelluzyme▲Ｒ▼及びCarezyme▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）である。
本発明に使用されるよう企画された他の酵素は、オキシダーゼ及びペルオキシダーゼである。
Ｆ．他の任意の成分
本発明の液体洗剤に使用するための他の任意の成分は、土壌除去剤、土壌開放ポリマー、抗再付着剤、たとえばテトラエチレンペンタミンエトキシレート（約0.5〜３重量％、好ましくは約１〜約３重量％）、泡調節剤、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、クレー及びヒドロトロープ、たとえばナトリウムクメンスルホネート、不透明剤、酸化防止剤、殺細菌剤、染料、香料、及び当業界において知られている増白剤を包含する。そのような任意の成分は一般的に、組成物の約15重量％以下、好ましくは約0.5〜10重量％、より好ましくは約１〜約10重量％を占める。
組成物は、０〜約８重量％、好ましくは０〜約５重量％のＣ12−Ｃ14アルケニル琥珀酸又はその塩を含むことができる。それらの材料は一般式Ｒ−CH（COOX）CH2（COOX）〔式中、ＲはＣ12−Ｃ14アルケニル基であり、そして個々のＸはＨ又は適切なカチオン、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム又はアルカノールアンモニウム（たとえば、一、二又は三エタノールアンモニウムである〕で表わされるものである。
特定の例は、２−ドデセニルスクシネート（好ましくは）及び２−テトラデセニルスクシネートである。
本発明の組成物は任意に、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、エチレンジアミン四酢酸（好ましい）、又はジエチレントリアミン五酢酸（最とも好ましい）の水溶性塩約0.1〜約１重量％、好ましくは約0.2〜約0.6重量％を、布を不備処理する場合、洗浄性能を増強するために含む。
さらに、洗浄組成物は、１〜35重量％の漂白剤又は漂白前駆体、又は漂白剤及び／又は前駆体を含んで成るシステムを、そのための活性剤と共に含むことができる。
さらなる任意の成分は、起泡増進剤、抗腐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、金属イオン封鎖剤、抗−土壌再付着剤及び同様のものである。
本発明の組成物は好ましくは、約10重量％までのエタノールを含む。
Ｇ．他の性質
本発明の組成物は通常、20℃での10重量％の水溶液において、約7.0〜9.0、好ましくは約8.0〜約8.5のpHを有する。
本発明の組成物はまた、35℃で蒸留水中において、200ppm以下か又はそれに等しい臨界ミセル濃度（CMC）、及び32ダイン／cm以下か又はそれに等しい、好ましくは約30以下か又はそれに等しい空気／水界面張力を有することができる。それらの測定は、“Measuremen of Interfacial Tension and Surface Tension-General Review of Practical Man”, C. Weser, GIT Fachzeitschrift fur das Laboratorium 24（1980）642-648及び734-742, FIT Verlag Ernst Giebeler, Darmstadt、及び“Interfacial Phenomena-Equilibrium and Dynamic Effects”, C. A. Miller and P. Neogi, Chapter 1, pp. 29-36（1985）, Marcel Dekker, Inc. New Yorkに記載されている。
本発明の組成物は、繊維材料、特に綿及びポリエステル基材の生地、及びそれらの混合物（但し、それらだけには限定されない）の洗浄のために使用され得る。たとえば、約60〜65℃又はそれ以下、たとえば約30〜35℃又はそれ以下の温度で実施される洗浄工程が特に適切である。洗浄流体において、たとえば0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤を供給するのに十分な割合で組成物を使用することがひじょうに適切であるが、但し、もちろん、所望には、それよりも低いか又は高い濃度を用いることも可能である。制限しない場合、たとえば約１〜10ｇ／ｌ、たとえば約３〜６ｇ／ｌの洗浄配合物からの使用割合が、その配合物が実質的に例におけるようにして存在する場合での使用のために適切であることが言及され得る。
この観点において、本発明は特に下記に関連している：
ａ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、保湿剤、有機酸、苛性アルカリを含んで成る、９〜10の間の値に調節されたpHを有する水性洗浄液体として配合された洗浄組成物。
ｂ）アルコキシル化された線状第一アルコールから実質的に成る液体非イオン性界面活性剤、トリアセチン、ナトリウムトリホスフェート、苛性アルカリ、過硼酸塩−水和物、漂白剤前駆体及び第三アミン漂白活性剤を含んで成る、約９〜10の間の値に調節されたpHを有する非水性洗浄液体として配合された洗浄組成物。
ｃ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、洗浄流体に９又はそれ以下のpHを付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
ｄ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、洗浄流体に8.5又はそれ以上のpHを付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
ｅ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、0.03又はそれ以下、たとえば0.02又はそれ以下の洗浄流体イオン強度を付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
ｆ）0.4〜0.8ｇ／ｌの界面活性剤に対応する割合で使用される場合、0.01又はそれ以上、たとえば0.02又はそれ以上の洗浄流体イオン強度を付与するように配合された酵素液体洗浄組成物。
本発明のスブチラーゼ変異体はまた、布、硬質の表面又はいづれか他の表面への直接的な適用のために棒、錠剤、スティック及び同様のものの形で洗浄組成物に有用に組込まれ得ることが見出された。特に、それらは、著しい酵素安定性を示す、棒形での石鹸又は石鹸／合成組成物中に組込まれ得る。直接的な適用のための棒、錠剤、スティック及び同様のものの形での洗浄組成物は、引用により本明細書に組込まれるサウスアフリカ特許第93／7274号に記載されている。
従って、本発明の好ましい棒状物は、スブチラーゼで変異体の他に、次のものを含んで成る：
ｉ）石鹸、又は石鹸及び合成洗浄活性剤の混合物である、無水物として見なされる洗浄活性剤25〜80重量％、最とも好ましくは25〜70重量％；
ii）水０〜50重量％、最とも好ましくは10〜30重量％；
iii）充填剤０〜35重量％、最とも好ましくは0.1〜30重量％。
一般的に、本発明のそのような組成物に含まれるスブチラーゼ変異体の量は、組成物に基づいて0.1〜100GU／mg、好ましくは0.5〜20GU／mg、最とも好ましくは1.0〜10GU／mg（ここで、GU／mgはグリシン単位／mgである）のタンパク質分解活性に対応する量である。
スブチラーゼ遺伝子における突然変異を生成するための方法
遺伝子中に突然変異を導入するための多くの方法は、当業界においてよく知られている。クローニングスブチラーゼ遺伝子の簡単な論議の後、スブチラーゼ遺伝子内のランダム部位及び特定の部位において突然変異を誘発するための方法が論ぜられるであろう。
スブチラーゼ遺伝子のクローニング
スブチラーゼをコードする遺伝子が、当業界において良く知られている種々の方法により、表Ｉに示される生物のいづれか、特にグラム陽性細菌又は菌類からクローン化され得る。最初に、DNAのゲノム及び／又はcDNAライブラリーが、研究されるべきスブチラーゼを生成する生物からの染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構成されるべきである。次に、スブチラーゼのアミノ酸配列が知られる場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして細菌性DNAのゲノムライブラリー、又はcDNAライブラリーからのスブチリシン−コードのクローンを同定するために使用され得る。他方では、他の細菌株又は生物からのスブチラーゼに相同の配列を含む、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、低い緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、スブチラーゼ−コードのクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。スブチラーゼ生成クローンを同定するためのさらにもう１つの方法は、発現ベクター、たとえばプラスミド中にゲノムDNAのフラグメントを挿入し、得られるゲノムDNAライブラリーによりプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、スブチラーゼのための基質たとえば脱脂乳を含む寒天上に前記形質転換された細菌をプレートすることを包含する。スブチラーゼ生産性プラスミドを含むそれらの細菌は、分泌されたスブチラーゼによる脱脂乳の消化により、透明な寒天の円形により取り囲まれたコロニーを生成するであろう。
スブチラーゼ遺伝子におけるランダム突然変異の生成
スブチラーゼ遺伝子が適切なベクター、たとえばプラスミド中にクローン化された後、いくつかの方法がその遺伝子中にランダム突然変異を導入するために使用され得る。
１つの方法は、Ｅ. コリのミューテーター株中に、回収可能なベクターの一部として、クローン化されたスブチラーゼ遺伝子を組込むことである。
もう１つの方法は、スブチラーゼ遺伝子の一本鎖形を生成し、そして次に、スブチラーゼ遺伝子の一部が一本鎖のまま存続するようもう１つのDNAフラグメントによりスブチラーゼ遺伝子を含むDNAのフラグメントをアニールすることを包含する。次に、この分離した一本鎖領域が多くの突然変異誘発剤のいづれか、たとえば亜硫酸水素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸、又はヒドララジン（但し、これらのみには限定されない）に暴露される。ランダム突然変異を生成するためのこの方法の特定の例は、Shortle and Nathans（1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 2170-2174）により記載されている。このShortle and Nathansの方法によれば、スブチラーゼ遺伝子を担持するプラスミドが、その遺伝子内を切断する制限酵素によりニック化される。このニックは、DNAポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ作用を用いて、ギャップ中に拡大される。得られる一本鎖ギャップが、上記突然変異誘発剤のいづれか１つを用いて、突然変異誘発され得る。
他方では、天然のプロモーター及び他の制御配列を含むバシラス種からのスブチリシン遺伝子が、Ｅ. コリ及びＢ. スブチリスの両者のためのレプリコン、選択可能な表現型マーカー、及び複製のＭ13起点を含むプラスミドベクター中に、ヘルパーファージIR１による重感染に基づいての一本鎖プラスミドDNAの生成のためにクローン化される。クローン化されたスブチリシン遺伝子を含む一本鎖プラスミドDNAが、単離され、そしてスブチリシンのコード領域ではなく、ベクター配列を含むDNAフラグメントによりアニールされ、ギャップドされた重複分子が得られる。突然変異誘発が、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸又は蟻酸により、又は上記のようなＥ. コリのミューテーター株における複製によりスブチリシン遺伝子中に導入される。亜硫酸水素ナトリウムは一本鎖DNAにおいてシトシンと独占的に反応するので、この突然変異誘発物質により創造される突然変異は、そのコード領域に対してのみ制限される。反応時間及び亜硫酸水素の濃度は、１〜５種の突然変異がスブチリシン遺伝子当たり平均して創造されるように異なった実験において変えられる。400mlの反応体積において37℃で９分間の、４Ｍの亜硫酸水素ナトリウム（pH6.0）中、10mgのギャップ付与された重複DNAのインキュベーションは、一本鎖領域における約１％のシトシンを脱アミノ化する。成熟スブチリシンのコード領域は、DNA鎖に依存して約200個のシトシンを含む。好都合には、反応時間は、約４分（約１／200の突然変異頻度を生成するために）〜約20分（約５／200の同様の頻度を生成するために）である。
突然変異誘発の後、そのギャップ付与された分子は、十分な二本鎖分子を製造し、そしてその突然変異を固定するために、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によりインビトロで処理される。次に、コンピテントＥ. コリが、突然変異スブチリシンの増幅されたライブラリーを生成するために、突然変異誘発されたDNAにより形質転換される。増幅された突然変異ライブラリーはまた、その誤りがちなDNAポリメラーゼにより、突然変異誘発の範囲を高めるＥ. コリのMut Ｄ株においてプラスミドDNAを増殖することによっても製造され得る。
突然変異誘発物質の亜硝酸及び蟻酸はまた、突然変異ライブラリーを生成するためににも使用され得る。それらの化学物質は亜硫酸水素ナトリウムと同じように一本鎖DNAに対して特異的ではないので、突然変異誘発反応は、次の方法に従って行なわれる。スブチリシン遺伝子のコード部分が標準の方法によりＭ13ファージにおいてクローン化され、そして一本鎖ファージDNAが調製される。次に、その一本鎖DNAが、23℃で15〜60分間、pH4.3の１Ｍの亜硝酸と、又は23℃で１〜５分間、2.4Ｍの蟻酸と反応せしめられる。反応時間のそれらの範囲は、１／1000〜５／1000の突然変異頻度を生成する。突然変異誘発の後、ユニバーサルプライマーがＭ13 DNAにアニールされ、そして重複DNAが鋳型として突然変異誘発された一本鎖DNAを用いて合成され、その結果、スブチリシン遺伝子のコード部分が十分に二本鎖化になる。この点で、コード領域が制限酵素によりＭ13ベクターから切断され、そして未突然変異誘発性発現ベクター中に連結され、その結果、突然変異が制限フラグメントにおいてのみ生じる（Myersなど., Science 229, 242-257（1985））。
スブチラーゼ遺伝子における特定部位の突然変異誘発の生成
スブチラーゼ遺伝子がクローン化され、そして突然変異のための所望する部位が同定され、そして元の残基を置換するための残基が決定された後すぐに、それらの突然変異が合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を両端に有するヌクレオチド配列を含み；突然変異ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間、挿入される。好ましい方法においては、スブチラーゼ遺伝子を架橋する、DNAの一本鎖ギャップが、スブチラーゼ遺伝子を担持するベクターにおいて創造される。次に、所望する突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNAの相同部分にアニールされる。次に、残るギャップが、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によりフィルインされ、そしてその構造体がＴ４リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例は、Morinagaなど.,（1984, Biotechnology 2, 639-646）に記載されている。Morinagaなどによれば、遺伝子内のフラグメントが制限エンドヌクレアーゼを用いて除去される。次に、現在、ギャップを含むベクター／遺伝子が変性され、そしてギャップを含む代わりに、そのギャップに含まれる領域外の部位でのもう１つの制限エンドヌクレアーゼにより切断されているベクター／遺伝子にハイブリダイズされる。次に、遺伝子の一本鎖領域が、変異誘発されたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのために利用でき、残るギャップはDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによりフィルインされ、挿入体はＴ４ DNAリガーゼにより連結され、そして１サイクルの複製の後、所望する突然変異を担持する二本鎖プラスミドが生成される。Morinagaの方法は、新規の制限部の構成の追加の操作を明らかにし、そして従って、複数の部位での突然変異の発生を促進する。1994年５月10日に発行された、Estellなどによるアメリカ特許第34,606号は、カセットの少々の変更を行なうことにより、複数の突然変異を担持するオリゴヌクレオチドを導入することができるが、しかしながら、ひじょうに多くの種類の突然変異は、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、Morinagaの方法により一度に導入され得る。
スブチラーゼ変異体の発現
本発明によれば、上記方法又は当業界において知られているいづれか他の方法により生成される突然変異誘発されたスブチラーゼ遺伝子が、発現ベクターを用いて、酵素形で発現され得る。発現ベクターは一般的に、クローニングベクターの定義下にある。なぜならば、発現ベクターは通常、典型的なクローニングベクターの成分、すなわち微生物のゲノムに無関係な微生物におけるベクターの自主複製を可能にする成分、及び選択目的のための１又は複数の表現型を含むからである。発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制限配列を含む。発現されたタンパク質の分泌を可能にするために、“シグナル配列”をコードするヌクレオチドが、遺伝子のコード配列の前に挿入され得る。制御配列の指図下での発現のためには、本発明に従って処理されるべき標的遺伝子は、適切に読み取り枠を整合して制御配列に操作可能的に連結される。プラスミドベクター中に組込まれ得、そして変異体スブチラーゼ遺伝子の転写を支持することができるプロモーター配列は、原核β−ラクタマーゼプロモーター（Villa−Kamaroff, など.（1978）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 3727-3731）及びtacプロモーター（DeBoer, など.（1983）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 21-25）を含むが、但し、これらのみには限定されない。さらなる参照はまた、“Usefal Proteins from Recombinant Bacteria”in Scientific America（1980）242, 74-94にも見出され得る。
１つの態様によれば、Ｂ. サブチリスは、変異誘発されたDNAを担持する発現ベクターにより形質転換される。発現が分泌性微生物、たとえばＢ. サブチリスにおいて起こる予定である場合、シグナル配列の後に翻訳開始シグナルが続き、そして興味あるDNA配列が先に続く。シグナル配列は、分泌に基づいて生成物から分解される細胞壁に発現生成物を輸送するよう作用する。上記で定義されるような用語“制御配列”は、それが存在する場合、シグナル配列を含むことを意図する。
当業者に知られている他の宿主システムはまた、本発明のプロテアーゼ変異体の発現及び生成のためにも企画される。そのような宿主システムは、菌類、たとえば糸状菌、植物、鳥類、及び哺乳類細胞、並びに他のものを含んで成る。
材料及び方法
菌株：
Ｂ. サブチリス309及び147は、NCIBに寄託され、そして受託番号NCIB 10309及び10147を付与されている、バシラスレンタスの変異体であり、そして引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第3,723,250号に記載されている。
Ｅ. コリMC 1000ｒ-, ｍ+（M. J. Casadaban and S. N. Cohen（1980）, J. Mol. Biol. 138, 179-207）は、従来の方法により製造され、そしてアメリカ特許出願番号第039,298号にも記載されている。
タンパク質分解活性
本発明においては、タンパク質分解活性は、Kilo Novo Protease Units（KNPU）で表わされる。その活性は、酵素基準（SAVINASEO）に相対的に決定され、そしてその決定は標準条件、すなわち50℃, pH8.3, ９分の反応時間、３分の測定時間で、タンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（DMC）溶液の消化に基づかれる。フォルダーAF 220／１は、Novo Nordisk A/S, Denmarkへの要求に基づいて入手でき、このフォルダーは引用により本明細書に含まれる。
GUは、基質としてのＮ−アセチルカゼインと共に40℃での15分間のインキュベーションの間、標準条件下で、グリシン１ｍモルに相当するNH2−基の量を生成するタンパク質分解酵素活性として定義されるグリシン単位である。
酵素活性はまた、Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T. M., Goodlander, B. D., Garrison, P. H., and Smith, L. A.,（1988）に記載される、可溶性基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラ−ニトリフェノールとの反応に従って、DNAアッセイを用いても測定され得る。
例
本発明の酵素変異体の生成のためには、WO89/06279（Novo Nordisk A/S）, EP130,756（Genentech）, EP479,870（Novo Nordisk A/S）, EP214,435（Henkel）, WO87/04461（Amgen）, WO87/05050（Genex）, EP出願第87303761号（Genentech）, EP260,105（Genencor）, WO88/06624（Gist−Brocades NV）, WO88/07578（Genentech）, WO88/08028（Genex）, WO88/08033（Amgen）, WO88/08164（Genex）, Thomasなど.（1985）Nature, 318, 375-376；Thomasなど.（1987）J. Mol. Biol., 193, 803-813；Russel and Fersht（1987）Nature 328, 496-500に記載されるのと同じ材料及び方法が使用され得る。当業界において十分に確立されている他の方法もまた使用され得る。
例１
酵素変異体の構成及び発現：
スブチラーゼ309及びその変異体をコードする合成遺伝子に適切なベクターを構成した。それは実質的にpUC19プラスミド〔Yanish−Perron and Messing（1985）Gene：33, 103-119〕であり、ここで複数のクローニング部位が遺伝子を構成する５種のサブフラグメントを分離するために使用される制限部位を含むリンカーにより置換されている。新規のリンカーを、EcoRＩ−HindIIIにより切断されたpUC19中に挿入し、それにより、それらの部位を破壊した。この構成の詳細は、WO92/19729号のページ25〜26及びその図１（シート１／７−７／７）に記載されており、その内容は引用により本明細書に含まれる。
個々のサブフラグメントを、６〜12個のオリゴヌクレオチドから製造した。そのオリゴヌクレオチドは、調節されたガラス支持体上で、ホスホラミジット化学を用いて自動DNA合成機により合成された〔Beaucage and Carruthers（1981）；Tetrahedron Letters 22, 1959-1869〕。
５種のサブフラグメントを、２％アガロースゲル上で単離し、そしてpSX191中に挿入した。その配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。フラグメントＡ−Ｅを単離し、そしてKpnＩ−BamHＩにより切断されたpSX191と共に連結した。その連結混合物を用いて、コンピテント Ｅ. コリMC 1000ｒ-, ｍ＋を形質転換し、耐アンピシリン性について選択する。次に、酵素の成熟部分をコードするスブチリシン309遺伝子の部分を構成する850bpのKpnＩ−BamHＩフラグメントを用いて、pSX212上の野生型遺伝子を置換し、pSX222を生成し、次にこれを用いて、コンピテントＢ. スブチリス株を形質転換した。その形質転換された株の発酵及び酵素の精製の後、その生成物は野生型生成物とは区別がつかないことが示された。
合成遺伝子に由来するプロテアーゼ変異体は、突然変異が所望される場所で、変更された配列を有する（たとえば下記に与えられるような配列を有する）オリゴヌクレオチドを用い、そしてそれらと合成遺伝子に特有のオリゴヌクレオチドの残りとを混合することによって製造される。変異体遺伝子のアセンブリーは、上記態様に類似する他の態様で変異体材料により実施される。合成遺伝子に対するさらなる情報は一般的なAgarvalなど（1970）, Nature, 227, 27-34から入手できる。
KpnＩ部位を、酵素の成熟部分をコードするスブチラーゼ309合成遺伝子の開始部分に導入した。使用される方法は、オリゴヌクレオチド指図された二本鎖切断修復突然変異誘発と呼ばれ、そしてMandecki（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181により記載されている。pSX172を、スブチラーゼ309遺伝子の成熟部分の開始部分でNcoＩにより開環し、そしてオリゴヌクレオチドNOR789（WO92/19729を参照のこと）と共に混合し、100℃に加熱し、０℃に冷却し、そしてそれを用いてＥ. コリを形質転換した。再形質転換の後、組換え体を、32−Ｐ−ラベルされたNOR789を用いてコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。スクリーニングの間、陽性であることがわかった組換え体は、アミノ酸配列を変更しないで２つの塩基を変更することによってNcoＩの前の右側に導入されるKpnＩ部位を有した。そのようにして創造されたKpnＩ部位を、400bpのPvuＩ−NheＩフラグメントに基づくpSX120中に挿入し、pSX212を得る。pSX120はまた、ヨーロッパ特許第405,901号公報にも記載されている。
合成遺伝子をpSX212上のKpnＩ〜BamHＩ間に挿入し、pSX222を得る。
オリゴヌクレオチドの突然変異及び対応する配列の例は、次の通りである：
R170L（フラグメントＤ１）
例２
酵素変異体の精製：
この方法は、スブチリシン147酵素、スブチリシン309酵素又はそれらの変異体の10ｌ規模の発酵の精製に関する。
約８ｌの発酵ブイヨンを、１ｌビーカーにおいて5000rpmで35分間、遠心分離した。上清液を、10％酢酸を用いてpH6.5に調節し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で濾過した。
濾液を、Amicon S1Y10 UFカートリッジを備え付けられたAmicon CH 2A UFユニットを用いて約400mlに濃縮した。UF濃縮物を遠心分離し、そして濾過し、その後、pH７でのBacitracin親和性カラム上に室温で吸収した。プロテアーゼを、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.1Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝溶液（pH７に調節されている）中、25％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムの溶液を用いて、室温でBacitracinカラムから溶離した。
Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そして0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む、pH6.5に調節された緩衝液により平衡化された570mlのSephadex G25カラム（５cmの直径）に適用した。
Sephadex G25カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を組合し、そして0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸、及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む、pH6.5に調節された緩衝液により平衡化された150mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交換カラム（５cmの直径）に適用した。
プロテアーゼを、２ｌの同じ緩衝液中、０〜0.1Ｍの塩化ナトリウム線状グラジエント（スブチリシン147の場合、０〜0.2Ｍの塩化ナトリウム）を用いて溶離した。
最終段階においては、CM Sepharoseカラムからの画分を含むプロテアーゼを組合し、そしてGR81PP膜（Danish Sugar Factories Inc.からの）を備え付けられたAmicon限外濾過セルにおいて濃縮した。
構成についての例１の技法及び上記単離方法を用いることによって、次のスブチリシン309変異体を生成し、そして単離した：
酵素変異体を含んで成る洗浄組成物における安定性
例Ｄ１：
本発明の態様の（等方性）水性洗浄液体を、下記成分を含むように配合する：
例Ｄ２：
本発明の態様の非水性洗浄液体を、4.9モル／モルの酸化エチレン及び2.7モル／モルの酸化プロピレンによりアルコキシル化された、38.5％ Ｃ13−Ｃ15線状一次アルコール、５％トリアセチン、30％ナトリウムトリホスフェート、４％ソーダ灰、少量のオキソボレートを含む15.5％過硼酸ナトリウム−水和物、４％ TAED, 0.25％ EDTA（この0.1％がホスホン酸である）、Aerosil 0.6％, SCMC１％、及び0.6％プロテアーゼを用いて配合する。pHは、９〜10、たとえば約9.8の値に調節される。
例Ｄ３：
構成された液体洗剤はたとえば、本明細書に記載されるようなプロテアーゼの他に、２〜15％非イオン性界面活性剤、非イオン性及び任意のアニオン性界面活性剤を含んで成る５〜40％の合計界面活性剤、５〜35％ホスフェート含有又は非ホスフェート含有ビルダー、0.2〜0.8％ポリマー増粘剤、たとえば106以上の分子量を有する架橋されたアクリルポリマー、たとえば中性水ガラスとしての少なくとも10％の珪酸ナトリウム、所望するpH、好ましくは９〜10又はそれ以上の範囲でのpH、たとえばpH11以上に調節するためのアルカリ（たとえばカリウム含有アルカリ）を含むことができ、そしてナトリウムカチオン：珪酸塩アニオン（遊離シリカとして）の重量比は0.7：１以下であり、そして0.3〜30Pas（20℃で）の粘度を有する。
適切な例は、約５％の非イオン性界面活性剤、すなわち１モル当たり約５個のEO基及び１モル当たり約2.7個のPO基によりアルコキシル化されたＣ13−Ｃ15のアルコール、シリカ及び酸化ナトリウム間の重量比が3.5である15〜23％の中性水ガラス、13〜19％のKOH, ８〜23％ STPP, ０〜11％の炭酸ナトリウム、0.5％のCarbopol 941（TM）を含む。
プロテアーゼは、たとえば0.5％で組込まれ得る。
例Ｄ６：
49.7wt.の80／20牛脂／ヤシ石鹸、49.0％水、20％クエン酸ナトリウム、1.0％クエン酸及び0.031％プロテアーゼを含む石鹸棒を生成した。石鹸棒の調製の後、それらを周囲温度で貯蔵し、そして特定時間の間隔の後、サンプルを取り、そしてプロテアーゼ活性について測定した。その安定性のデータが下記に与えられている：
例Ｄ７：
63.88％の80／20牛脂／ヤシ石鹸、１％ヤシ脂肪酸、25.1％水、10％クエン酸ナトリウム及び0.021％プロテアーゼを含む石鹸棒を製造した。その洗濯石鹸棒を37℃で貯蔵し、そして特定の時間の間隔の後、サンプルを取り、そしてプロテアーゼ活性について測定した。
例４
酵素変異体を含んで成る洗浄組成物の洗浄性能
次の例は、下記に示される条件下で行なわれた多くの洗浄試験からの結果を提供する。
実験条件：
上記モデルの洗剤は、単純な洗浄配合物である。最とも特徴的な特性は、STPがビルダーとして使用され、そしてアニオン性テンシド（LAS）の含有量がきわめて高いことである。さらに、pHは、粉末洗剤のためには低い9.5に調節される。
試験材料に対する規約反射率（Ｒ）の測定を、Elrepho 2000光度計を用いて460nmで行なった（UVなし）。測定された値を、下記表現に適合せしめる：
DRは、規約反射率単位での酵素の洗浄効果である。
ａは、適合された曲線の初期傾斜である（ｃ▲Ｒ▼０）。
ａref.は、対照の酵素についての初期傾斜である。
ｃは、mg／ｌでの酵素濃度である。
DRmaxは、規約反射率単位（ｃ▲Ｒ▼￥）での酵素の理論的最大の洗浄効果である。
Claims (12)
- 置換：Y167Iと、置換：R170Lとを含んでなるBLS309ズブチラーゼの変異体。
- 前記置換が、置換：A194P及びN218Sの１個又は複数個と組み合わされている、請求項１に記載の変異体。
- 下記変異体：
Y167I＋R170L
Y167I＋R170L＋A194P
Y167I＋R170L＋N218S
Y167I＋R170L＋A194P＋N218S
の群から選択される、請求項１に記載の変異体。 - 請求項１〜３のいずれか１項に記載のズブチラーゼ変異体をコードするDNA。
- 請求項４に記載のDNAを含んで成るベクター。
- 請求項５に記載のベクターにより形質転換された微生物宿主。
- 前記微生物宿主が細菌である、請求項６に記載の微生物宿主。
- 前記細菌がバシルス（Bacillus）である、請求項７に記載の微生物宿主。
- 前記微生物宿主が、菌類又は酵母である、請求項６に記載の微生物宿主。
- 前記菌類が糸状菌である、請求項９に記載の微生物宿主。
- 前記糸状菌がアスペルギルス（Aspergillus）である、請求項10に記載の微生物宿主。
- 請求項６〜11のいずれか１項に記載の宿主を、前記変異体の発現及び分泌、並びに前記変異体の回収を進める条件下で培養することを含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体の製造方法。
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