CN108291212A - 多肽变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽变体以及用于获得变体的方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸;包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞;以及使用这些变体的方法。
Description
序列表的引用
本申请包括处于计算机可读形式的序列表,将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及相对于亲本DNA酶在一种或多种特性中展示出改变的新颖DNA酶变体,所述特性包括:清洗性能、洗涤剂稳定性和/或储存稳定性。本发明的变体适合用于在清洁过程和洗涤剂组合物中使用,如洗衣组合物和餐具清洗组合物,包括手洗和自动餐具清洗组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明的DNA酶变体变体的方法。
相关领域说明
在许多自然、工业和医疗环境中,微生物一般附着于表面而生存,由包括生物聚合物和高分子的细胞外物质进行囊化。经粘液囊化的微生物所产生的层被称为生物膜。生物膜是细菌在自然环境中生长的主要模式,并且在生物膜中生长的细菌表现出独特的生理性质。与其浮游生长的对应物相比,生物膜中的细菌更耐受抗生素、UV照射、洗涤剂和宿主免疫应答。
生物膜可以包括一种或多种微生物,包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌、藻类、原生动物、和/或酵母或丝状真菌和病毒和/或噬菌体。有问题的生物膜的实例是牙菌斑,医学植入物的上的感染,还有船体上的初始污染。生物膜归因于人类许多感染的发病机理,并且就暴露面的生物污着而论在工业中是一项显著问题,其中生物膜定植可以形成能够破坏并且干扰工业方法和组分的局部生态系统的基础组分。
当使用衣物(像T恤或运动衣)时,它们暴露于来自使用者的身体和来自它们使用的环境的其余部分的细菌。这些细菌中的一些能够粘附于衣物物品并且在该物品上形成生物膜。细菌的存在意味着,衣物物品变得粘稠,并且因此污垢粘附在粘稠区域上。这种污垢已经显示出难以通过可商购的洗涤剂组合物来去除。此外,当非常脏的衣物物品与不太脏的衣物物品一起洗涤时,洗涤液中存在的污物倾向于附着于生物膜上。其结果是,该衣物物品在洗涤后比洗涤前更“脏”。此外,这些细菌是难闻的气味的来源,在对衣物物品使用后产生难闻的气味。难闻的气味难以去除,并且即使在洗涤后仍可存在。这种难闻的气味的原因是细菌粘附到纺织品表面。由于粘附到纺织品上,即使洗涤后细菌仍可存在,并且继续成为难闻的气味的来源。
国际专利申请WO 2011/098579(纽卡斯尔大学(Newcastle UNIV.))和WO 2014/087011(诺维信公司(Novozymes A/S))涉及细菌脱氧核糖核酸酶化合物以及用于破坏和预防生物膜的方法。
发明内容
本发明涉及与SEQ ID NO:1相比具有至少一种改进的特性的DNA酶变体,该变体包含在选自以下列表的一个或多个位置处的修饰,该列表由以下组成:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220和221,其中该变体具有与SEQ ID NO:1具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列。
本发明进一步涉及与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的DNA酶亲本的变体,其中与SEQ ID NO:1相比,所述变体包含以下修饰中的至少一个:V1*、V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2*、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3*、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4*、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5*、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6*、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7*、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8*、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9*、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10*、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11*、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12*、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13*、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14*、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15*、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16*、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17*、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18*、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19*、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20*、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21*、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22*、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23*、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24*、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25*、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26*、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27*、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28*、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29*、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30*、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31*、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32*、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33*、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34*、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35*、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36*、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37*、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38*、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39*、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40*、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41*、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42*、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43*、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44*、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45*、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46*、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48*、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49*、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50*、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51*、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53*、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54*、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55*、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W、A55Y、P56*、P56A、P56D、P5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ID NO:1具有至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸;包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞;以及产生这些变体的方法。本发明进一步涉及包含这类变体的洗涤剂组合物。
定义
DNA酶(脱氧核糖核酸酶):术语“DNA酶”意指具有DNA酶活性的多肽,该多肽催化DNA中磷酸二酯键的水解断裂,从而降解DNA。DNA酶属于酯酶(EC-号3.1),水解酶的亚组。将DNA酶分类为EC 3.1.21.1。出于本发明的目的,根据在测定I中描述的程序确定DNA酶活性。在一个方面中,与亲本DNA酶相比,本发明的这些DNA酶变体具有改进的DNA酶活性。在一个方面中,与具有SEQ ID NO:1的多肽相比,本发明的这些DNA酶变体具有至少100%,例如至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、或至少200%的DNA酶活性。
术语“亲本”:术语亲本意指对其作出改变以产生本发明的这些DNA酶变体的具有DNA酶活性的任何多肽。因此,DNA酶亲本或前体DNA酶意指对其作出改变以产生本发明的这些DNA酶变体的DNA酶。在本申请中可以将术语亲本和前体可互换地使用。因此,亲本是具有与该变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个这些指定位置不具有改变的DNA酶。应当理解的是,在本发明上下文中“具有一致的氨基酸序列”的表达涉及100%序列一致性。在具体实施例中,该DNA酶亲本是与具有SEQ ID NO:1的多肽具有至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、例如至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6或100%一致性的DNA酶。
术语“DNA酶变体”意指具有DNA酶活性的DNA酶,并且与其亲本(例如与SEQ ID NO:1相比)相比,该DNA酶在一个或多个(或一个或若干个)位置处包括改变(即,取代、插入、和/或缺失)。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸置换;缺失意指去除占据一个位置的氨基酸;并且插入意指在与占据一个位置的氨基酸相邻处添加氨基酸,例如1至10个氨基酸,优选1-3个氨基酸。优选地,该变体是经过人为改变的。在一方面,该变体是至少1%纯的,例如至少5%纯的、至少10%纯的、至少20%纯的、至少40%纯的、至少60%纯的、至少80%纯的、以及至少90%纯的,如通过SDS PAGE所确定的。
术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生,并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一方面,如通过琼脂糖电泳法确定的,该分离的多核苷酸是至少1%纯的,例如至少5%纯的、至少10%纯的、至少20%纯的、至少40%纯的、至少60%纯的、至少80%纯的、至少90%纯的、以及至少95%纯的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。
术语“基本上纯的变体”意指按重量计包含最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%、以及最多0.5%的其他多肽材料的制剂,这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地,该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92%纯的,例如至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%纯的、至少99.5%纯的、以及100%纯的。本发明的这些变体优选以基本上纯的形式存在。例如,这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
术语“野生型DNA酶”意指由天然存在的有机体(例如在自然界中发现的真菌、细菌、古生菌、酵母、植物或动物)表达的DNA酶。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面,该成熟多肽对应于具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有DNA酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
术语“cDNA”意指可以通过从得自原核或真核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子反转录来制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起初的原始RNA转录本是mRNA的前体,其通过一系列的步骤(包括剪接)加工,然后作为成熟的剪接的mRNA出现。
术语“编码序列”意指直接指明其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由可读框确定,该可读框通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(如GTG和TTG)开始,并且以终止密码子(如TAA、TAG和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外存在的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体包含表达本发明编码序列所需要的控制序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
术语“可操作地连接”意指一种构型,在该构型中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置处,这样使得控制序列指导编码序列的表达。
术语“控制序列”意指对于表达编码本发明变体的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外源的,或者彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于:前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。在最低限度上,控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制性位点的目的,这些控制序列可以提供有多个接头。
术语“表达”包括涉及产生变体的任何步骤,包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
术语“表达载体”意指包括编码变体的多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的另外的核苷酸的线性或环形DNA分子。
术语“转录启动子”用于指为促进特定基因的转录的DNA区域的启动子。转录启动子典型地位于它们所调节的基因附近,在相同链上并且在上游(朝向有义链的5'区域)。
术语“转录终止子”用于指标记基因结束的基因序列区段或者在基因组DNA上用于转录的操纵子。
术语“宿主细胞”意指对用包括本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS,在65℃洗涤三次,每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次,每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次,每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次,每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次,每次15分钟。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次,每次15分钟。
术语“改进的特性”意指与变体有关的特征,该变体相比于亲本和/或相比于具有SEQ ID NO:1的DNA酶、或相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的DNA酶有所改进。这些改进的特性包括但不限于:稳定性(例如洗涤剂稳定性)、洗涤性能(例如深度清洁效果),术语“深度清洁”意指生物膜或生物膜的组分,例如多糖、蛋白、DNA、污垢或生物膜中存在的其他组分的破坏、减少或去除。
生物膜是在表面上,如纺织品、餐具或硬表面上,细胞彼此粘附在一起的任何群组的微生物。这些粘附细胞经常包埋在细胞外高聚物(EPS)的自身产生的基质内。生物膜EPS是一般由细胞外的DNA、蛋白、和多糖组成的聚合物团块。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生长的微生物细胞与同一有机体的浮游细胞(相比之下,浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或浮游的单个细胞)在生理上是不同的。生活在生物膜中的细菌通常具有与同一物种的自由漂浮细菌显著不同的特性,因为膜的密集并且受保护的环境允许它们以不同方式协作和相互作用。这种环境的一个益处是增加对洗涤剂和抗生素的抗性,因为,密集的细胞外基质和细胞的外层保护群落的内部。在衣物上,会发现产生生物膜的细菌是在以下物种中:不动杆菌属物种、气微菌属物种、短波单胞菌属物种、微杆菌属物种、滕黄微球菌、假单胞菌属物种、表皮葡萄球菌、和寡养单胞菌属物种。
术语“改进的DNA酶活性”在本文中被定义为例如通过增加在DNA中磷酸二酯键的水解切割改变的DNA酶活性,相对于(或与之比较)亲本DNA酶(例如与具有SEQ ID NO:1的DNA酶比较)的活性,DNA酶变体显示出活性的改变。
术语“稳定性”包括储存稳定性和在使用期间(例如在洗涤过程)中的稳定性,并且反应了作为时间函数的根据本发明的DNA酶变体的稳定性,例如当DNA酶变体置于溶液中尤其是在洗涤剂溶液中时,保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响,例如pH、温度、洗涤剂组合物,例如助洗剂、表面活性剂的量等等。可以如在实例2中所描述的来对DNA酶稳定性进行测量。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在本文中被定义为变体DNA酶相对于亲本DNA酶和/或相对于SEQ ID NO:1的稳定性显示在溶液中增加的稳定性。“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括洗涤剂稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”可以是与DNA酶亲本相比DNA酶活性的改进的稳定性。如在实例2中所描述的对DNA酶稳定性进行测量。
可以将术语“改进的洗涤性能”定义为改进的深度清洁效果,即根据本发明与DNA酶亲本或具有SEQ ID NO:1的DNA酶相比生物膜或DNA酶变体组分的破坏或去除。DNA酶变体还可以具有改进的恶臭去除。关于术语“恶臭”意指在清洁物品上不希望的气味。清洁的物品应气味清新并且干净,而没有附着在该物品上的恶臭。恶臭的一个实例是具有使人不愉快的气味的化合物,这些化合物可以是微生物产生的。另一个实例是令人不愉悦的气味可以是附着至已经与人类或动物接触的物品的汗味或体味。恶臭的另一个实例可以是来自香料的气味,其粘附于物品,例如气味强烈的咖喱或其他异国香料。测量物品附着恶臭的能力的一种方式是通过使用在此披露的测定II。
可以将洗涤性能表达为染污的小块布样的反射值。洗涤并冲洗之后,将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。在洗涤的次日评估所有洗涤小块布样。使用具有非常小孔径的Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计进行小块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的条件下进行测量,并提取460nm的反射率。
术语“洗涤”涉及家用洗涤和工业洗涤两者并且意指用一种含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗涤机进行或可以手动进行。
除非另外指明,术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉末状的通用或重垢洗涤剂,尤其是清洁洗涤剂;液体、凝胶或糊状的通用洗涤剂,尤其是所谓的重垢液体(HDL)类型;液体精细织物洗涤剂;手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂,尤其是高起泡类型的那些;机器餐具洗涤剂,包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型;液体清洁剂和消毒剂,包括抗菌手洗类型、清洁棒、肥皂棒、漱口水、义齿清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂;洗发香波和毛发染发剂;沐浴凝胶、泡沫浴液;金属清洁剂;以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型添加剂。就预期用于玷污的物体清洁的洗涤介质中的混合物而言,使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中,就洗涤织物和/或衣服而言,使用该术语(例如,“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中,该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。其并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是,除了根据本发明的变体以外,该术语涵盖了可能包含以下的洗涤剂:例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此,其意图是,该术语涵盖衣服,连同织物、纱线、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
术语“纺织品”是指编织织物,连同适合于转化为或用作纱线、编织、针织以及非编织织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如,制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如,衣服以及其他物品)的通用术语。
术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物,包括但不限于用于硬表面清洁的组合物,如餐具清洗洗涤剂组合物(手动餐具清洗组合物)、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。
术语“酶的有效量”是指在特定应用中,例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素,如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如,颗粒、棒)组合物等。术语变体的“有效量”是指达到所希望的水平的DNA酶活性(例如在定义的洗涤剂组合物中)的前述DNA酶变体的量。
如在此使用的术语“水硬度”或“硬度”或“dH”或“°dH”是指德国硬度。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。
在此使用术语“相关清洗条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件,具体是清洗温度、时间、清洗力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。
术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如,液体、颗粒、粉末、棒、糊、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料,这些材料也优选地与用于该组合物中的DNA酶变体酶可相容。在一些实施例中,颗粒组合物处于“压缩”形式,而在其他实施例中,液体组合物处于“浓缩”形式。
术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂,其中在清洗水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如,日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度系统。
术语“中洗涤剂浓度”系统包括以下洗涤剂,其中在清洗水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度系统。
术语“高洗涤剂浓度”系统包括以下洗涤剂,其中在清洗水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度系统。
变体命名惯例
出于本发明的目的,将SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽用以确定另一种DNA酶中的对应的氨基酸残基。将另一种DNA酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的多肽进行比对,并且基于该比对,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch),1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序,使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种DNA酶中的对应氨基酸残基的鉴定,所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较;版本3.5或更新版本;Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797),MAFFT(版本6.857或更新版本;Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066;Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518;Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374;Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64;Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:_1899-1900),以及采用ClustalW(1.83或更新版本;Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:1的多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615),可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得,这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱图)来搜索数据库。例如,PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱,并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表,甚至可以实现更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地,Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于使未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型,并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质,若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如,蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对,并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构,并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库,以便发现可能的结构同源物(例如,Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中,以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。氨基酸位置表示为#1、#2等。
取代:对于氨基酸取代,使用以下命名法:初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此,在位置#1处的缬氨酸被丙氨酸取代被表示为“Val#1Ala”或“V#1A”。多个突变由加号(“+”)或逗号(,)分开,例如,“Val#1Ala+“Pro#2Gly”或V#1A,P#2G分别代表在位置#1和#2处的缬氨酸(V)和脯氨酸被丙氨酸(A)和甘氨酸(G)取代。如果在给定位置中可以取代多于一种氨基酸,那么这些氨基酸被列于括号内(例如[X]或{X})或可替代地由逗号分开。因此,如果根据本发明Trp和Lys二者均可以被取代,代替占据位置#1的氨基酸,这被表示为X#1{W,K}、X#1[W,K]或X#1W,K;其中该X表示不同DNA酶的氨基酸残基,根据本发明这些DNA酶可以是亲本DNA酶,例如像具有SEQ ID NO:1的DNA酶或与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的的DNA酶。因此,在一些情况下,这些变体被表示为#1{W,K}或X#2P,表明待被取代的氨基酸依赖于亲本而变化。为了方便,当SEQ ID NO:1被用于对氨基酸取代进行编号时,用SEQ ID NO:1中对应位置处的氨基酸(例如V1A)表示。然而,本领域技术人员将清楚,包括V1A的DNA酶变体不限于在对应于SEQ ID NO:1的位置1的位置处具有缬氨酸的亲本DNA酶。在位置1处具有例如天冬酰胺的亲本DNA酶中,本领域技术人员将翻译突变规格V1A至N1A。在位置1处亲本DNA酶具有丙氨酸的情况下,本领域技术人员将认识到,亲本DNA酶在该位置处没有发生变化。
缺失:对于氨基酸缺失,使用以下命名法:初始氨基酸、位置、*。因此,在位置#1处的丝氨酸缺失表示为“Ser#1*”或“S#1*”。多个缺失由加号(“+”)或逗号分开,例如“Val#1*+Pro#2*”或“V#1*,P#2*”。
插入:另外的氨基酸残基的插入,例如像在Val#1后插入赖氨酸可以表示为:Val#1ValLys或V#1VK。可替代地,另外的氨基酸残基的插入,例如在V#1后插入赖氨酸可以表示为:*#1aK。当插入多于一个的氨基酸残基,例如像在#1后插入Lys和Gly,这种插入可以表示为:Ala#1AlaLysGly或A#1AKG。在此类情况下,还可以通过将小写字母添加到在插入的一个或多个氨基酸残基前的氨基酸残基位置编号处来对插入的一个或多个氨基酸残基进行编号,在这个实例中:*#1aK*#1bG。
多种改变:包含多种改变的变体由加号(“+”)或由逗号(,)分开,例如“Val#1Trp+Pro#2Gly”或“V#1W,P#2G”代表在位置#1和#2处的缬氨酸和脯氨酸分别如以上所描述的被色氨酸和甘氨酸取代。
不同的改变:可以在一个位置上引入不同的改变时,这些不同的改变由逗号分开,例如“Val#1Trp,Lys”或V#1W,K代表在位置#1处的缬氨酸被色氨酸或赖氨酸取代。因此,“Val#1Trp,Lys+Pro#2Asp”表示以下变体:“Val#1Trp+Pro#2Asp”、“Val#1Lys+Pro#2Asp”或V#1W,K+P#2D。
发明详述
本发明提供了获得自曲霉属(特别是米曲霉)的新颖的DNA酶。本发明的DNA酶与具有SEQ ID NO:1的多肽包括至少60%序列一致性,并且与具有SEQ ID NO:1的DNA酶相比,包括在至少一个氨基酸位置的改变。在一个实施例中,这些DNA酶变体具有氨基酸序列,该氨基酸序列在等同于SEQ ID NO:1中的位置的位置处包括做出的至少一个氨基酸取代。在一个实施例中,这些DNA酶变体具有氨基酸序列,该氨基酸序列在等同于SEQ ID NO:1中的位置的位置处包括做出的至少一个氨基酸缺失。在一个实施例中,这些DNA酶变体具有氨基酸序列,该氨基酸序列在等同于SEQ ID NO:1中的位置的位置处包括做出的至少一个氨基酸插入。本发明还涉及用于产生DNA酶变体的方法。本发明进一步涉及筛选方法,该筛选方法包括以下步骤:a)提供来自其的突变体核酸或变体多肽,b)确定突变核酸或变体多肽中的感兴趣的特性,以及c)将该特性与亲本核酸或多肽(即,不具有所述特定改变的核酸或多肽)的相同特性进行比较。由于取决于确定要筛选的特性,该筛选方法不限于任何特定的特性,这对于技术人员将是明显的。特别优选的筛选方法是高通量筛选,包括多个样品同时被筛选。可以被筛选的特性的实例包括洗涤性能(例如深层清洁性能)、恶臭减少、高或低pH性能、改进的低温性能、稳定性(例如在洗涤剂中的稳定性和/或储存稳定性)。它并不旨在使本发明限于任何具体的变体产生或筛选的方法。优选地,与亲本DNA酶相比(例如与SEQ IDNO:1相比),本发明的DNA酶具有至少一个改进的特性。特性包括但不限于在洗涤剂中的稳定性(包括储存、在洗涤中的稳定性和热稳定性),洗涤性能,特别是深层清洁性能,增加的表达水平或恶臭减少。
本发明的实施例涉及SEQ ID NO:1的DNA酶变体或与其具有至少60%一致性的DNA酶的变体,并且涉及用于产生SEQ ID NO:1的DNA酶变体或与其具有至少60%一致性的DNA酶的方法。
一个实施例涉及与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的DNA酶变体,这些变体具有DNA酶活性并且包括在选自以下列表的一个或多个位置处的改变,该列表由以下组成:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220和221,其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置。该改变独立地是取代、插入或缺失。在一个实施例中,这种改变是取代。在另一个实施例中,该改变是缺失。
本发明的一个实施例涉及DNA酶变体,该变体包括在选自下组的一个或多个位置处的取代,该组由以下组成:4、17、19、19、19、36、38、39、39、40、40、41、41、45、51、53、53、54、55、57、64、64、64、64、64、64、66、67、67、68、68、68、68、69、69、69、69、69、69、69、69、70、70、70、71、72、74、74、75、77、82、82、83、83、83、83、83、84、85、85、85、86、86、86、88、88、91、99、101、105、105、105、105、106、115、116、135、136、138、138、138、138、139、140、140、140、141、151、152、152、152、152、153、154、162、163、164、166、166、168、169、169、173、173、173、182、183、184、185、186、189、189、212、212和215,其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置。
在一些实施例中,该DNA酶变体与亲本DNA酶的氨基酸序列具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%,但小于100%的序列一致性。
在另一个实施例中,该变体与SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、例如至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%,但小于100%序列一致性。
如在“变体命名惯例”中所描述,使用Needleman-Wunsch算法确定百分比序列一致性(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)。
本发明进一步涉及包含SEQ ID NO:1的DNA酶亲本的变体,其中与SEQ ID NO:1相比,所述变体包括在选自对应于SEQ ID NO:1的位置的以下位置中的至少一个位置处的改变:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220和221,其中该变体具有与SEQ ID NO:1具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列。
本发明进一步涉及包含SEQ ID NO:1的DNA酶亲本的变体,其中与SEQ ID NO:1相比,所述变体包括在选自对应于SEQ ID NO:1的位置的以下位置中至少一个位置处的改变:4、17、19、19、19、36、38、39、39、40、40、41、41、45、51、53、53、54、55、57、64、64、64、64、64、64、66、67、67、68、68、68、68、69、69、69、69、69、69、69、69、70、70、70、71、72、74、74、75、77、82、82、83、83、83、83、83、84、85、85、85、86、86、86、88、88、91、99、101、105、105、105、105、106、115、116、135、136、138、138、138、138、139、140、140、140、141、151、152、152、152、152、153、154、162、163、164、166、166、168、169、169、173、173、173、182、183、184、185、186、189、189、212、212和215,其中该变体具有与SEQ ID NO:1具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列。
该改变独立地是取代、插入或缺失。在一个实施例中,这种改变是取代。在另一个实施例中,该改变是缺失。在一方面,在本发明的变体中的变化数目是1至20个,例如1至10个和1至5个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个变化。
在一些优选的实施例中,这些DNA酶变体与SEQ ID NO:1具有至少60%,例如至少70%、例如至少80%、例如至少90%但少于100%的序列一致性,具有DNA酶活性并且包含选自下组的一个或多个改变,该组由以下组成:V1*、V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2*、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3*、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4*、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5*、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6*、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7*、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8*、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9*、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10*、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11*、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12*、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13*、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14*、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15*、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16*、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17*、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18*、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19*、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20*、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21*、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22*、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23*、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24*、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25*、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26*、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27*、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28*、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29*、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30*、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31*、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32*、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33*、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34*、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35*、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36*、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37*、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38*、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39*、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40*、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41*、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42*、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43*、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44*、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45*、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46*、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48*、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49*、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50*、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51*、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53*、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54*、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55*、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N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ID NO:1的多肽的位置。
本发明的一些方面涉及DNA酶亲本的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1具有至少60%,例如至少70%、例如至少80%、例如至少90%、例如至少95%但少于100%序列一致性,其中该变体具有DNA酶活性,并且其中该变体包括选自下组的一个或多个取代,该组由以下组成:V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W、A55Y、P56A、P56D、P56E、P56F、P56G、P56H、P56I、P56K、P56L、P56M、P56N、P56Q、P56R、P56S、P56T、P56V、P56W、P56Y、N57A、N57D、N57E、N57F、N57G、N57H、N57I、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57R、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、V58A、V58D、V58E、V5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7S、Q157T、Q157V、Q157W、Q157Y、Q158A、Q158D、Q158E、Q158F、Q158G、Q158H、Q158I、Q158K、Q158L、Q158M、Q158N、Q158P、Q158R、Q158S、Q158T、Q158V、Q158W、Q158Y、T159A、T159D、T159E、T159F、T159G、T159H、T159I、T159K、T159L、T159M、T159N、T159P、T159Q、T159R、T159S、T159V、T159W、T159Y、K160A、K160D、K160E、K160F、K160G、K160H、K160I、K160L、K160M、K160N、K160P、K160Q、K160R、K160S、K160T、K160V、K160W、K160Y、G161A、G161D、G161E、G161F、G161H、G161I、G161K、G161L、G161M、G161N、G161P、G161Q、G161R、G161S、G161T、G161V、G161W、G161Y、T162A、T162D、T162E、T162F、T162G、T162H、T162I、T162K、T162L、T162M、T162N、T162P、T162Q、T162R、T162S、T162T、T162V、T162W、T162Y、W163A、W163D、W163E、W163F、W163G、W163H、W163I、W163K、W163L、W163M、W163N、W163P、W163Q、W163R、W163S、W163T、W163V、W163Y、F164A、F164D、F164E、F164G、F164H、F164I、F164K、F164L、F164M、F164N、F164P、F164Q、F164R、F164S、F164T、F164V、F164W、F164Y、Q165A、Q165D、Q165E、Q165F、Q165G、Q165H、Q165I、Q165K、Q165L、Q165M、Q165N、Q165P、Q165R、Q165S、Q165T、Q165V、Q165W、Q165Y、I166A、I166D、I166E、I166F、I166G、I166H、I166K、I166L、I166M、I166N、I166P、I166Q、I166R、I166S、I166T、I166V、I166W、I166Y、T167A、T167D、T167E、T167F、T167G、T167H、T167I、T167K、T167L、T167M、T167N、T167P、T167Q、T167R、T167S、T167V、T167W、T167Y、K168A、K168D、K168E、K168F、K168G、K168H、K168I、K168L、K168M、K168N、K168P、K168Q、K168R、K168S、K168T、K168V、K168W、K168Y、F169A、F169D、F169E、F169G、F169H、F169I、F169K、F169L、F169M、F169N、F169P、F169Q、F169R、F169S、F169T、F169V、F169W、F169Y、T170A、T170D、T170E、T170F、T170G、T170H、T170I、T170K、T170L、T170M、T170N、T170P、T170Q、T170R、T170S、T170V、T170W、T170Y、G171A、G171D、G171E、G171F、G171H、G171I、G171K、G171L、G171M、G171N、G171P、G171Q、G171R、G171S、G171T、G171V、G171W、G171Y、A172D、A172E、A172F、A172G、A172H、A172I、A172K、A172L、A172M、A172N、A172P、A172Q、A172R、A172S、A172T、A172V、A172W、A172Y、A173D、A173E、A173F、A173G、A173H、A173I、A173K、A173L、A173M、A173N、A173P、A173Q、A173R、A173S、A173T、A173V、A173W、A173Y、G174A、G174D、G174E、G174F、G174H、G174I、G174K、G174L、G174M、G174N、G174P、G174Q、G174R、G174S、G174T、G174V、G174W、G174Y、P175A、P175D、P175E、P175F、P175G、P175H、P175I、P175K、P175L、P175M、P175N、P175Q、P175R、P175S、P175T、P175V、P175W、P175Y、Y176A、Y176D、Y176E、Y176F、Y176G、Y176H、Y176I、Y176K、Y176L、Y176M、Y176N、Y176P、Y176Q、Y176R、Y176S、Y176T、Y176V、Y176W、K178A、K178D、K178E、K178F、K178G、K178H、K178I、K178L、K178M、K178N、K178P、K178Q、K178R、K178S、K178T、K178V、K178W、K178Y、A179D、A179E、A179F、A179G、A179H、A179I、A179K、A179L、A179M、A179N、A179P、A179Q、A179R、A179S、A179T、A179V、A179W、A179Y、L180A、L180D、L180E、L180F、L180G、L180H、L180I、L180K、L180M、L180N、L180P、L180Q、L180R、L180S、L180T、L180V、L180W、L180Y、G181A、G181D、G181E、G181F、G181H、G181I、G181K、G181L、G181M、G181N、G181P、G181Q、G181R、G181S、G181T、G181V、G181W、G181Y、S182A、S182D、S182E、S182F、S182G、S182H、S182I、S182K、S182L、S182M、S182N、S182P、S182Q、S182R、S182T、S182V、S182W、S182Y、N183A、N183D、N183E、N183F、N183G、N183H、N183I、N183K、N183L、N183M、N183P、N183Q、N183R、N183S、N183T、N183V、N183W、N183Y、D184A、D184E、D184F、D184G、D184H、D184I、D184K、D184L、D184M、D184N、D184P、D184Q、D184R、D184S、D184T、D184V、D184W、D184Y、K185A、K185D、K185E、K185F、K185G、K185H、K185I、K185L、K185M、K185N、K185P、K185Q、K185R、K185S、K185T、K185V、K185W、K185Y、S186A、S186D、S186E、S186F、S186G、S186H、S186I、S186K、S186L、S186M、S186N、S186P、S186Q、S186R、S186T、S186V、S186W、S186Y、V187A、V187D、V187E、V187F、V187G、V187H、V187I、V187K、V187L、V187M、V187N、V187P、V187Q、V187R、V187S、V187T、V187W、V187Y、D189A、D189E、D189F、D189G、D189H、D189I、D189K、D189L、D189M、D189N、D189P、D189Q、D189R、D189S、D189T、D189V、D189W、D189Y、K190A、K190D、K190E、K190F、K190G、K190H、K190I、K190L、K190M、K190N、K190P、K190Q、K190R、K190S、K190T、K190V、K190W、K190Y、N191A、N191D、N191E、N191F、N191G、N191H、N191I、N191K、N191L、N191M、N191P、N191Q、N191R、N191S、N191T、N191V、N191W、N191Y、K192A、K192D、K192E、K192F、K192G、K192H、K192I、K192L、K192M、K192N、K192P、K192Q、K192R、K192S、K192T、K192V、K192W、K192Y、N193A、N193D、N193E、N193F、N193G、N193H、N193I、N193K、N193L、N193M、N193P、N193Q、N193R、N193S、N193T、N193V、N193W、N193Y、I194A、I194D、I194E、I194F、I194G、I194H、I194K、I194L、I194M、I194N、I194P、I194Q、I194R、I194S、I194T、I194V、I194W、I194Y、A195D、A195E、A195F、A195G、A195H、A195I、A195K、A195L、A195M、A195N、A195P、A195Q、A195R、A195S、A195T、A195V、A195W、A195Y、G196A、G196D、G196E、G196F、G196H、G196I、G196K、G196L、G196M、G196N、G196P、G196Q、G196R、G196S、G196T、G196V、G196W、G196Y、D197A、D197E、D197F、D197G、D197H、D197I、D197K、D197L、D197M、D197N、D197P、D197Q、D197R、D197S、D197T、D197V、D197W、D197Y、W198A、W198D、W198E、W198F、W198G、W198H、W198I、W198K、W198L、W198M、W198N、W198P、W198Q、W198R、W198S、W198T、W198V、W198Y、G199A、G199D、G199E、G199F、G199H、G199I、G199K、G199L、G199M、G199N、G199P、G199Q、G199R、G199S、G199T、G199V、G199W、G199Y、F200A、F200D、F200E、F200G、F200H、F200I、F200K、F200L、F200M、F200N、F200P、F200Q、F200R、F200S、F200T、F200V、F200W、F200Y、D201A、D201E、D201F、D201G、D201H、D201I、D201K、D201L、D201M、D201N、D201P、D201Q、D201R、D201S、D201T、D201V、D201W、D201Y、P202A、P202D、P202E、P202F、P202G、P202H、P202I、P202K、P202L、P202M、P202N、P202Q、P202R、P202S、P202T、P202V、P202W、P202Y、A203D、A203E、A203F、A203G、A203H、A203I、A203K、A203L、A203M、A203N、A203P、A203Q、A203R、A203S、A203T、A203V、A203W、A203Y、K204A、K204D、K204E、K204F、K204G、K204H、K204I、K204L、K204M、K204N、K204P、K204Q、K204R、K204S、K204T、K204V、K204W、K204Y、W205A、W205D、W205E、W205F、W205G、W205H、W205I、W205K、W205L、W205M、W205N、W205P、W205Q、W205R、W205S、W205T、W205V、W205Y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ID NO:1的多肽的位置。
本发明的一些优选的方面涉及具有DNA酶活性的DNA酶变体,其中该变体包括选自下组的一个或多个取代,该组由以下组成:N4E、L17E、T19A、T19G、T19I、K36P、Q38P、S39V、S39R、A40P、A40H、L41T、L41H、V45H、L51G、K53T、K53P、G54P、A55P、N57H、E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I、E64S、T66H、K67A、K67T、N68V、N68P、N68I、N68H、S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y、S69Q、N70T、N70H、N70G、R71T、D72E、S74H、S74G、G75I、N77T、K82P、K82I、D83T、D83P、D83I、D83H、D83G、P84H、Q85T、Q85P、Q85H、K86T、K86P、K86H、G88P、G88H、A91P、W99T、A101W、K105E、K105N、K105T、K105D、S106T、S115T、L116I、Q135L、G136L、V138I、V138L、V138P、V138Q、L139A、N140R、N140L、N140A、G141L、F151R、D152Y、D152L、D152I、D152A、P153E、S154R、T162R、W163E、F164R、I166Y、I166R、K168N、F169R、F169E、A173I、A173R、A173T、S182R、N183E、D184I、K185Y、S186I、D189G、D189H、K212G、K212P和K215I,其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置,并且其中该变体与SEQ ID NO 1中显示的多肽具有至少80%序列一致性。
在一个优选的方面,本发明涉及与SEQ ID NO 1相比包括一个或多个缺失的DNA酶变体,其中在选自位置84、88、139、179和180中任一者的位置处的氨基酸是缺失的。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置1的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置1的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W和V1Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置2的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置2的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W和P2Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置3的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置3的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W和V3Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置4的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置4的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W和N4Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N4E,或由该取代N4E组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置5的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置5的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W和P5Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置6的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置6的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置7的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置7的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W和P7Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置8的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置8的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W和D8Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置9的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置9的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W和A9Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置10的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置10的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W和T10Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置11的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置11的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W和S11Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置12的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置12的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W和V12Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置13的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置13的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W和E13Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置14的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置14的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W和N14Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置15的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置15的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W和V15Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置16的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置16的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W和A16Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置17的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置17的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W和L17Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代L17E,或由该取代L17E组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置18的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置18的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W和K18Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置19的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置19的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W和T19Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代T19A、T19G或T19I中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置20的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置20的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W和G20Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置21的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置21的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W和S21Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置22的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置22的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W和G22Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置23的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置23的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W和D23Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置24的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置24的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W和S24Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置25的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置25的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W和Q25Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置26的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置26的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W和S26Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置27的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置27的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W和D27Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置28的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置28的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W和P28Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置29的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置29的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W和I29Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置30的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置30的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W和K30Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置31的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置31的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W和A31Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置32的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置32的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W和D32Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置33的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置33的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W和L33Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置34的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置34的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W和E34Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置35的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置35的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W和V35Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置36的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置36的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W和K36Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K36P,或由该取代K36P组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置37的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置37的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W和G37Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置38的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置38的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W和Q38Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代Q38P,或由该取代Q38P组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置39的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置39的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W和S39Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S39V或S39R中的任一者,或由取代S39V或S39R中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置40的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置40的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代A40P或A40H中的任一者,或由取代A40P或A40H中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置41的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置41的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W和L41Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代L41T或L41H中的任一者,或由取代L41T或L41H中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置42的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置42的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W和P42Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置43的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置43的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W和F43Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置44的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置44的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W和D44Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置45的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置45的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W和V45Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代V45H,或由该取代V45H组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置46的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置46的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W和D46Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置47的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置47的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W和C47Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置48的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置48的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V和W48Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置49的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置49的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W和A49Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置50的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置50的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W和I50Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置51的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置51的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W和L51Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代L51G,或由该取代L51G组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置53的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置53的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W和K53Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K53T或K53P中的任一者,或由取代K53T或K53P中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置54的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置54的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W和G54Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代G54P,或由该取代G54P组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置55的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置55的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W和A55Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代A55P,或由该取代A55P组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置56的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置56的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P56A、P56D、P56E、P56F、P56G、P56H、P56I、P56K、P56L、P56M、P56N、P56Q、P56R、P56S、P56T、P56V、P56W和P56Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置57的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置57的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N57A、N57D、N57E、N57F、N57G、N57H、N57I、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57R、N57S、N57T、N57V、N57W和N57Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N57H,或由该取代N57H组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置58的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置58的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V58A、V58D、V58E、V58F、V58G、V58H、V58I、V58K、V58L、V58M、V58N、V58P、V58Q、V58R、V58S、V58T、V58W和V58Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置59的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置59的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L59A、L59D、L59E、L59F、L59G、L59H、L59I、L59K、L59M、L59N、L59P、L59Q、L59R、L59S、L59T、L59V、L59W和L59Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置60的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置60的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q60A、Q60D、Q60E、Q60F、Q60G、Q60H、Q60I、Q60K、Q60L、Q60M、Q60N、Q60P、Q60R、Q60S、Q60T、Q60V、Q60W和Q60Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置61的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置61的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:R61A、R61D、R61E、R61F、R61G、R61H、R61I、R61K、R61L、R61M、R61N、R61P、R61Q、R61S、R61T、R61V、R61W和R61Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置62的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置62的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V62A、V62D、V62E、V62F、V62G、V62H、V62I、V62K、V62L、V62M、V62N、V62P、V62Q、V62R、V62S、V62T、V62W和V62Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置63的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置63的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N63A、N63D、N63E、N63F、N63G、N63H、N63I、N63K、N63L、N63M、N63P、N63Q、N63R、N63S、N63T、N63V、N63W和N63Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置64的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置64的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E64A、E64D、E64F、E64G、E64H、E64I、E64K、E64L、E64M、E64N、E64P、E64Q、E64R、E64S、E64T、E64V、E64W和E64Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I或E64S中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置65的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置65的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K65A、K65D、K65E、K65F、K65G、K65H、K65I、K65L、K65M、K65N、K65P、K65Q、K65R、K65S、K65T、K65V、K65W和K65Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置66的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置66的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T66A、T66D、T66E、T66F、T66G、T66H、T66I、T66K、T66L、T66M、T66N、T66P、T66Q、T66R、T66S、T66V、T66W和T66Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代T66H,或由该取代T66H组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置67的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置67的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K67A、K67D、K67E、K67F、K67G、K67H、K67I、K67L、K67M、K67N、K67P、K67Q、K67R、K67S、K67T、K67V、K67W和K67Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K67A或K67T中的任一者,或由取代K67A或K67T中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置68的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置68的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N68A、N68D、N68E、N68F、N68G、N68H、N68I、N68K、N68L、N68M、N68P、N68Q、N68R、N68S、N68T、N68V、N68W和N68Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N68V、N68P、N68I或N68H中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置69的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置69的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S69A、S69D、S69E、S69F、S69G、S69H、S69I、S69K、S69L、S69M、S69N、S69P、S69Q、S69R、S69T、S69V、S69W和S69Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y或S69Q中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置70的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置70的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N70A、N70D、N70E、N70F、N70G、N70H、N70I、N70K、N70L、N70M、N70P、N70Q、N70R、N70S、N70T、N70V、N70W和N70Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N70T、N70H或N70G中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置71的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置71的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:R71A、R71D、R71E、R71F、R71G、R71H、R71I、R71K、R71L、R71M、R71N、R71P、R71Q、R71S、R71T、R71V、R71W和R71Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代R71T,或由该取代R71T组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置72的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置72的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D72A、D72E、D72F、D72G、D72H、D72I、D72K、D72L、D72M、D72N、D72P、D72Q、D72R、D72S、D72T、D72V、D72W和D72Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代D72E,或由该取代D72E组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置73的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置73的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:R73A、R73D、R73E、R73F、R73G、R73H、R73I、R73K、R73L、R73M、R73N、R73P、R73Q、R73S、R73T、R73V、R73W和R73Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置74的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置74的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S74A、S74D、S74E、S74F、S74G、S74H、S74I、S74K、S74L、S74M、S74N、S74P、S74Q、S74R、S74T、S74V、S74W和S74Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S74H或S74G中的任一者,或由取代S74H或S74G中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置75的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置75的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G75A、G75D、G75E、G75F、G75H、G75I、G75K、G75L、G75M、G75N、G75P、G75Q、G75R、G75S、G75T、G75V、G75W和G75Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代G75I,或由该取代G75I组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置76的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置76的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A76D、A76E、A76F、A76G、A76H、A76I、A76K、A76L、A76M、A76N、A76P、A76Q、A76R、A76S、A76T、A76V、A76W和A76Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置77的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置77的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N77A、N77D、N77E、N77F、N77G、N77H、N77I、N77K、N77L、N77M、N77P、N77Q、N77R、N77S、N77T、N77V、N77W和N77Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N77T,或由该取代N77T组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置78的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置78的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K78A、K78D、K78E、K78F、K78G、K78H、K78I、K78L、K78M、K78N、K78P、K78Q、K78R、K78S、K78T、K78V、K78W和K78Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置79的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置79的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G79A、G79D、G79E、G79F、G79H、G79I、G79K、G79L、G79M、G79N、G79P、G79Q、G79R、G79S、G79T、G79V、G79W和G79Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置80的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置80的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P80A、P80D、P80E、P80F、P80G、P80H、P80I、P80K、P80L、P80M、P80N、P80Q、P80R、P80S、P80T、P80V、P80W和P80Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置81的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置81的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F81A、F81D、F81E、F81G、F81H、F81I、F81K、F81L、F81M、F81N、F81P、F81Q、F81R、F81S、F81T、F81V、F81W和F81Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置82的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置82的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K82A、K82D、K82E、K82F、K82G、K82H、K82I、K82L、K82M、K82N、K82P、K82Q、K82R、K82S、K82T、K82V、K82W和K82Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K82P或K82I中的任一者,或由取代K82P或K82I中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置83的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置83的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D83A、D83E、D83F、D83G、D83H、D83I、D83K、D83L、D83M、D83N、D83P、D83Q、D83R、D83S、D83T、D83V、D83W和D83Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代D83T、D83P、D83I、D83H或D83G中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置84的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置84的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P84A、P84D、P84E、P84F、P84G、P84H、P84I、P84K、P84L、P84M、P84N、P84Q、P84R、P84S、P84T、P84V、P84W和P84Y,或由这些取代中的任一者组成。.在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代P84H,或由取代P84H组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置85的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置85的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q85A、Q85D、Q85E、Q85F、Q85G、Q85H、Q85I、Q85K、Q85L、Q85M、Q85N、Q85P、Q85R、Q85S、Q85T、Q85V、Q85W和Q85Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代Q85T、Q85P或Q85H中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置86的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置86的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K86A、K86D、K86E、K86F、K86G、K86H、K86I、K86L、K86M、K86N、K86P、K86Q、K86R、K86S、K86T、K86V、K86W和K86Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K86T、K86P或K86H中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置87的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置87的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:W87A、W87D、W87E、W87F、W87G、W87H、W87I、W87K、W87L、W87M、W87N、W87P、W87Q、W87R、W87S、W87T、W87V和W87Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置88的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置88的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G88A、G88D、G88E、G88F、G88H、G88I、G88K、G88L、G88M、G88N、G88P、G88Q、G88R、G88S、G88T、G88V、G88W和G88Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代G88P或G88H中的任一者,或由取代G88P或G88H中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置89的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置89的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:I89A、I89D、I89E、I89F、I89G、I89H、I89K、I89L、I89M、I89N、I89P、I89Q、I89R、I89S、I89T、I89V、I89W和I89Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置90的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置90的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K90A、K90D、K90E、K90F、K90G、K90H、K90I、K90L、K90M、K90N、K90P、K90Q、K90R、K90S、K90T、K90V、K90W和K90Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置91的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置91的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A91D、A91E、A91F、A91G、A91H、A91I、A91K、A91L、A91M、A91N、A91P、A91Q、A91R、A91S、A91T、A91V、A91W和A91Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代A91P,或由取代A91P组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置92的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置92的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L92A、L92D、L92E、L92F、L92G、L92H、L92I、L92K、L92M、L92N、L92P、L92Q、L92R、L92S、L92T、L92V、L92W和L92Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置93的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置93的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P93A、P93D、P93E、P93F、P93G、P93H、P93I、P93K、P93L、P93M、P93N、P93Q、P93R、P93S、P93T、P93V、P93W和P93Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置94的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置94的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P94A、P94D、P94E、P94F、P94G、P94H、P94I、P94K、P94L、P94M、P94N、P94Q、P94R、P94S、P94T、P94V、P94W和P94Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置95的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置95的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K95A、K95D、K95E、K95F、K95G、K95H、K95I、K95L、K95M、K95N、K95P、K95Q、K95R、K95S、K95T、K95V、K95W和K95Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置96的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置96的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N96A、N96D、N96E、N96F、N96G、N96H、N96I、N96K、N96L、N96M、N96P、N96Q、N96R、N96S、N96T、N96V、N96W和N96Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置97的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置97的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P97A、P97D、P97E、P97F、P97G、P97H、P97I、P97K、P97L、P97M、P97N、P97Q、P97R、P97S、P97T、P97V、P97W和P97Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置98的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置98的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S98A、S98D、S98E、S98F、S98G、S98H、S98I、S98K、S98L、S98M、S98N、S98P、S98Q、S98R、S98T、S98V、S98W和S98Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置99的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置99的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:W99A、W99D、W99E、W99F、W99G、W99H、W99I、W99K、W99L、W99M、W99N、W99P、W99Q、W99R、W99S、W99T、W99V和W99Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代W99T,或由取代W99T组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置100的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置100的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S100A、S100D、S100E、S100F、S100G、S100H、S100I、S100K、S100L、S100M、S100N、S100P、S100Q、S100R、S100T、S100V、S100W和S100Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置101的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置101的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A101D、A101E、A101F、A101G、A101H、A101I、A101K、A101L、A101M、A101N、A101P、A101Q、A101R、A101S、A101T、A101V、A101W和A101Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代A101W,或由取代A101W组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置102的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置102的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q102A、Q102D、Q102E、Q102F、Q102G、Q102H、Q102I、Q102K、Q102L、Q102M、Q102N、Q102P、Q102R、Q102S、Q102T、Q102V、Q102W和Q102Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置103的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置103的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D103A、D103E、D103F、D103G、D103H、D103I、D103K、D103L、D103M、D103N、D103P、D103Q、D103R、D103S、D103T、D103V、D103W和D103Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置104的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置104的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F104A、F104D、F104E、F104G、F104H、F104I、F104K、F104L、F104M、F104N、F104P、F104Q、F104R、F104S、F104T、F104V、F104W和F104Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置105的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置105的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K105A、K105D、K105E、K105F、K105G、K105H、K105I、K105L、K105M、K105N、K105P、K105Q、K105R、K105S、K105T、K105V、K105W和K105Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K105E、K105N、K105T或K105D中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置106的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置106的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S106A、S106D、S106E、S106F、S106G、S106H、S106I、S106K、S106L、S106M、S106N、S106P、S106Q、S106R、S106T、S106V、S106W和S106Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S106T,或由取代S106T组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置107的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置107的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P107A、P107D、P107E、P107F、P107G、P107H、P107I、P107K、P107L、P107M、P107N、P107Q、P107R、P107S、P107T、P107V、P107W和P107Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置108的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置108的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E108A、E108D、E108F、E108G、E108H、E108I、E108K、E108L、E108M、E108N、E108P、E108Q、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W和E108Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置109的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置109的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E109A、E109D、E109F、E109G、E109H、E109I、E109K、E109L、E109M、E109N、E109P、E109Q、E109R、E109S、E109T、E109V、E109W和E109Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置110的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置110的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Y110A、Y110D、Y110E、Y110F、Y110G、Y110H、Y110I、Y110K、Y110L、Y110M、Y110N、Y110P、Y110Q、Y110R、Y110S、Y110T、Y110V和Y110W,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置111的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置111的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A111D、A111E、A111F、A111G、A111H、A111I、A111K、A111L、A111M、A111N、A111P、A111Q、A111R、A111S、A111T、A111V、A111W和A111Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置112的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置112的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F112A、F112D、F112E、F112G、F112H、F112I、F112K、F112L、F112M、F112N、F112P、F112Q、F112R、F112S、F112T、F112V、F112W和F112Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置113的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置113的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A113D、A113E、A113F、A113G、A113H、A113I、A113K、A113L、A113M、A113N、A113P、A113Q、A113R、A113S、A113T、A113V、A113W和A113Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置114的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置114的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S114A、S114D、S114E、S114F、S114G、S114H、S114I、S114K、S114L、S114M、S114N、S114P、S114Q、S114R、S114T、S114V、S114W和S114Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置115的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置115的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S115A、S115D、S115E、S115F、S115G、S115H、S115I、S115K、S115L、S115M、S115N、S115P、S115Q、S115R、S115T、S115V、S115W和S115Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S115T,或由取代S115T组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置116的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置116的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L116A、L116D、L116E、L116F、L116G、L116H、L116I、L116K、L116M、L116N、L116P、L116Q、L116R、L116S、L116T、L116V、L116W和L116Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代L116I,或由取代L116I组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置117的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置117的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q117A、Q117D、Q117E、Q117F、Q117G、Q117H、Q117I、Q117K、Q117L、Q117M、Q117N、Q117P、Q117R、Q117S、Q117T、Q117V、Q117W和Q117Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置118的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置118的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G118A、G118D、G118E、G118F、G118H、G118I、G118K、G118L、G118M、G118N、G118P、G118Q、G118R、G118S、G118T、G118V、G118W和G118Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置119的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置119的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G119A、G119D、G119E、G119F、G119H、G119I、G119K、G119L、G119M、G119N、G119P、G119Q、G119R、G119S、G119T、G119V、G119W和G119Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置120的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置120的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T120A、T120D、T120E、T120F、T120G、T120H、T120I、T120K、T120L、T120M、T120N、T120P、T120Q、T120R、T120S、T120V、T120W和T120Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置121的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置121的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N121A、N121D、N121E、N121F、N121G、N121H、N121I、N121I、N121K、N121L、N121M、N121P、N121Q、N121R、N121S、N121T、N121V、N121W和N121Y或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置122的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置122的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A122D、A122E、A122F、A122G、A122H、A122I、A122K、A122L、A122M、A122N、A122P、A122Q、A122R、A122S、A122T、A122V、A122W和A122Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置123的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置123的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:I123A、I123D、I123E、I123F、I123G、I123H、I123K、I123L、I123M、I123N、I123P、I123Q、I123R、I123S、I123T、I123V、I123W和I123Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置124的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置124的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L124A、L124D、L124E、L124F、L124G、L124H、L124I、L124K、L124M、L124N、L124P、L124Q、L124R、L124S、L124T、L124V、L124W和L124Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置125的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置125的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A125D、A125E、A125F、A125G、A125H、A125I、A125K、A125L、A125M、A125N、A125P、A125Q、A125R、A125S、A125T、A125V、A125W和A125Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置126的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置126的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P126A、P126D、P126E、P126F、P126G、P126H、P126I、P126K、P126L、P126M、P126N、P126Q、P126R、P126S、P126T、P126V、P126W和P126Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置127的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置127的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V127A、V127D、V127E、V127F、V127G、V127H、V127I、V127K、V127L、V127M、V127N、V127P、V127Q、V127R、V127S、V127T、V127W和V127Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置128的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置128的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N128A、N128D、N128E、N128F、N128G、N128H、N128I、N128K、N128L、N128M、N128P、N128Q、N128R、N128S、N128T、N128V、N128W和N128Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置129的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置129的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L129A、L129D、L129E、L129F、L129G、L129H、L129I、L129K、L129M、L129N、L129P、L129Q、L129R、L129S、L129T、L129V、L129W和L129Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置130的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置130的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A130D、A130E、A130F、A130G、A130H、A130I、A130K、A130L、A130M、A130N、A130P、A130Q、A130R、A130S、A130T、A130V、A130W和A130Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置131的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置131的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S131A、S131D、S131E、S131F、S131G、S131H、S131I、S131K、S131L、S131M、S131N、S131P、S131Q、S131R、S131T、S131V、S131W和S131Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置132的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置132的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q132A、Q132D、Q132E、Q132F、Q132G、Q132H、Q132I、Q132K、Q132L、Q132M、Q132N、Q132P、Q132R、Q132S、Q132T、Q132V、Q132W和Q132Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置133的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置133的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N133A、N133D、N133E、N133F、N133G、N133H、N133I、N133K、N133L、N133M、N133P、N133Q、N133R、N133S、N133T、N133V、N133W或N133Y,或由其组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置134的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置134的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S134A、S134D、S134E、S134F、S134G、S134H、S134I、S134K、S134L、S134M、S134N、S134P、S134Q、S134R、S134T、S134V、S134W和S134Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置135的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置135的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q135A、Q135D、Q135E、Q135F、Q135G、Q135H、Q135I、Q135K、Q135L、Q135M、Q135N、Q135P、Q135R、Q135S、Q135T、Q135V、Q135W和Q135Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代Q135L,或由取代Q135L组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置136的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置136的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G136A、G136D、G136E、G136F、G136H、G136I、G136K、G136L、G136M、G136N、G136P、G136Q、G136R、G136S、G136T、G136V、G136W和G136Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代G136L,或由取代G136L组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置137的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置137的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G137A、G137D、G137E、G137F、G137H、G137I、G137K、G137L、G137M、G137N、G137P、G137Q、G137R、G137S、G137T、G137V、G137W和G137Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置138的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置138的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V138A、V138D、V138E、V138F、V138G、V138H、V138I、V138K、V138L、V138M、V138N、V138P、V138Q、V138R、V138S、V138T、V138W和V138Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代V138I、V138L、V138P或V138Q中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置139的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置139的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L139A、L139D、L139E、L139F、L139G、L139H、L139I、L139K、L139M、L139N、L139P、L139Q、L139R、L139S、L139T、L139V、L139W和L139Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代L139A,或由取代L139A组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置140的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置140的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N140A、N140D、N140E、N140F、N140G、N140H、N140I、N140K、N140L、N140M、N140P、N140Q、N140R、N140S、N140T、N140V、N140W和N140Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N140R、N140L或N140A中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置141的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置141的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G141A、G141D、G141E、G141F、G141H、G141I、G141K、G141L、G141M、G141N、G141P、G141Q、G141R、G141S、G141T、G141V、G141W和G141Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代G141L,或由取代G141L组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置142的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置142的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F142A、F142D、F142E、F142G、F142H、F142I、F142K、F142L、F142M、F142N、F142P、F142Q、F142R、F142S、F142T、F142V、F142W和F142Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置143的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置143的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Y143A、Y143D、Y143E、Y143F、Y143G、Y143H、Y143I、Y143K、Y143L、Y143M、Y143N、Y143P、Y143Q、Y143R、Y143S、Y143T、Y143V和Y143W,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置144的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置144的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S144A、S144D、S144E、S144F、S144G、S144H、S144I、S144K、S144L、S144M、S144N、S144P、S144Q、S144R、S144T、S144V、S144W和S144Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置145的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置145的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A145D、A145E、A145F、A145G、A145H、A145I、A145K、A145L、A145M、A145N、A145P、A145Q、A145R、A145S、A145T、A145V、A145W和A145Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置146的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置146的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N146A、N146D、N146E、N146F、N146G、N146H、N146I、N146K、N146L、N146M、N146P、N146Q、N146R、N146S、N146T、N146V、N146W和N146Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置147的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置147的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K147A、K147D、K147E、K147F、K147G、K147H、K147I、K147L、K147M、K147N、K147P、K147Q、K147R、K147S、K147T、K147V、K147W和K147Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置148的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置148的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V148A、V148D、V148E、V148F、V148G、V148H、V148I、V148K、V148L、V148M、V148N、V148P、V148Q、V148R、V148S、V148T、V148W和V148Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置149的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置149的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A149D、A149E、A149F、A149G、A149H、A149I、A149K、A149L、A149M、A149N、A149P、A149Q、A149R、A149S、A149T、A149V、A149W和A149Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置150的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置150的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q150A、Q150D、Q150E、Q150F、Q150G、Q150H、Q150I、Q150K、Q150L、Q150M、Q150N、Q150P、Q150R、Q150S、Q150T、Q150V、Q150W和Q150Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置151的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置151的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F151A、F151D、F151E、F151G、F151H、F151I、F151K、F151L、F151M、F151N、F151P、F151Q、F151R、F151S、F151T、F151V、F151W和F151Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代F151R,或由取代F151R组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置152的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置152的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D152A、D152E、D152F、D152G、D152H、D152I、D152K、D152L、D152M、D152N、D152P、D152Q、D152R、D152S、D152T、D152V、D152W和D152Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代D152Y、D152L、D152I或D152A中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置153的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置153的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P153A、P153D、P153E、P153F、P153G、P153H、P153I、P153K、P153L、P153M、P153N、P153Q、P153R、P153S、P153T、P153V、P153W和P153Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代P153E,或由取代P153E组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置154的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置154的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S154A、S154D、S154E、S154F、S154G、S154H、S154I、S154K、S154L、S154M、S154N、S154P、S154Q、S154R、S154T、S154V、S154W和S154Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S154R,或由取代S154R组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置155的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置155的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K155A、K155D、K155E、K155F、K155G、K155H、K155I、K155L、K155M、K155N、K155P、K155Q、K155R、K155S、K155T、K155V、K155W和K155Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置156的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置156的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P156A、P156D、P156E、P156F、P156G、P156H、P156I、P156K、P156L、P156M、P156N、P156Q、P156R、P156S、P156T、P156V、P156W和P156Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置157的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置157的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q157A、Q157D、Q157E、Q157F、Q157G、Q157H、Q157I、Q157K、Q157L、Q157M、Q157N、Q157P、Q157R、Q157S、Q157T、Q157V、Q157W和Q157Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置158的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置158的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q158A、Q158D、Q158E、Q158F、Q158G、Q158H、Q158I、Q158K、Q158L、Q158M、Q158N、Q158P、Q158R、Q158S、Q158T、Q158V、Q158W和Q158Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置159的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置159的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T159A、T159D、T159E、T159F、T159G、T159H、T159I、T159K、T159L、T159M、T159N、T159P、T159Q、T159R、T159S、T159V、T159W和T159Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置160的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置160的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K160A、K160D、K160E、K160F、K160G、K160H、K160I、K160L、K160M、K160N、K160P、K160Q、K160R、K160S、K160T、K160V、K160W和K160Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置161的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置161的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G161A、G161D、G161E、G161F、G161H、G161I、G161K、G161L、G161M、G161N、G161P、G161Q、G161R、G161S、G161T、G161V、G161W和G161Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置162的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置162的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T162A、T162D、T162E、T162F、T162G、T162H、T162I、T162K、T162L、T162M、T162N、T162P、T162Q、T162R、T162S、T162T、T162V、T162W和T162Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代T162R,或由取代T162R组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置163的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置163的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:W163A、W163D、W163E、W163F、W163G、W163H、W163I、W163K、W163L、W163M、W163N、W163P、W163Q、W163R、W163S、W163T、W163V和W163Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代W163E,或由取代W163E组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置164的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置164的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F164A、F164D、F164E、F164G、F164H、F164I、F164K、F164L、F164M、F164N、F164P、F164Q、F164R、F164S、F164T、F164V、F164W和F164Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代F164R,或由取代F164R组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置165的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置165的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q165A、Q165D、Q165E、Q165F、Q165G、Q165H、Q165I、Q165K、Q165L、Q165M、Q165N、Q165P、Q165R、Q165S、Q165T、Q165V、Q165W和Q165Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置166的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置166的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:I166A、I166D、I166E、I166F、I166G、I166H、I166K、I166L、I166M、I166N、I166P、I166Q、I166R、I166S、I166T、I166V、I166W和I166Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代I166Y或I166R中的任一者,或由取代I166Y或I166R中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置167的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置167的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T167A、T167D、T167E、T167F、T167G、T167H、T167I、T167K、T167L、T167M、T167N、T167P、T167Q、T167R、T167S、T167V、T167W和T167Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置168的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置168的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K168A、K168D、K168E、K168F、K168G、K168H、K168I、K168L、K168M、K168N、K168P、K168Q、K168R、K168S、K168T、K168V、K168W和K168Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K168N,或由取代K168N组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置169的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置169的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F169A、F169D、F169E、F169G、F169H、F169I、F169K、F169L、F169M、F169N、F169P、F169Q、F169R、F169S、F169T、F169V、F169W和F169Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代F169R或F169E中的任一者,或由取代F169R或F169E中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置170的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置170的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:T170A、T170D、T170E、T170F、T170G、T170H、T170I、T170K、T170L、T170M、T170N、T170P、T170Q、T170R、T170S、T170V、T170W和T170Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置171的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置171的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G171A、G171D、G171E、G171F、G171H、G171I、G171K、G171L、G171M、G171N、G171P、G171Q、G171R、G171S、G171T、G171V、G171W和G171Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置172的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置172的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A172D、A172E、A172F、A172G、A172H、A172I、A172K、A172L、A172M、A172N、A172P、A172Q、A172R、A172S、A172T、A172V、A172W和A172Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置173的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置173的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A173D、A173E、A173F、A173G、A173H、A173I、A173K、A173L、A173M、A173N、A173P、A173Q、A173R、A173S、A173T、A173V、A173W和A173Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代A173I、A173R或A173T中的任一者,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置174的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置174的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G174A、G174D、G174E、G174F、G174H、G174I、G174K、G174L、G174M、G174N、G174P、G174Q、G174R、G174S、G174T、G174V、G174W和G174Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置175的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置175的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P175A、P175D、P175E、P175F、P175G、P175H、P175I、P175K、P175L、P175M、P175N、P175Q、P175R、P175S、P175T、P175V、P175W和P175Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置176的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置176的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Y176A、Y176D、Y176E、Y176F、Y176G、Y176H、Y176I、Y176K、Y176L、Y176M、Y176N、Y176P、Y176Q、Y176R、Y176S、Y176T、Y176V和Y176W,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置178的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置178的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K178A、K178D、K178E、K178F、K178G、K178H、K178I、K178L、K178M、K178N、K178P、K178Q、K178R、K178S、K178T、K178V、K178W和K178Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置179的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置179的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A179D、A179E、A179F、A179G、A179H、A179I、A179K、A179L、A179M、A179N、A179P、A179Q、A179R、A179S、A179T、A179V、A179W和A179Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置180的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置180的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:L180A、L180D、L180E、L180F、L180G、L180H、L180I、L180K、L180M、L180N、L180P、L180Q、L180R、L180S、L180T、L180V、L180W和L180Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置181的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置181的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G181A、G181D、G181E、G181F、G181H、G181I、G181K、G181L、G181M、G181N、G181P、G181Q、G181R、G181S、G181T、G181V、G181W和G181Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置182的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置182的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S182A、S182D、S182E、S182F、S182G、S182H、S182I、S182K、S182L、S182M、S182N、S182P、S182Q、S182R、S182T、S182V、S182W和S182Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S182Y,或由取代S182Y组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置183的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置183的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N183A、N183D、N183E、N183F、N183G、N183H、N183I、N183K、N183L、N183M、N183P、N183Q、N183R、N183S、N183T、N183V、N183W和N183Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代N183E,或由取代N183E组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置184的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置184的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D184A、D184E、D184F、D184G、D184H、D184I、D184K、D184L、D184M、D184N、D184P、D184Q、D184R、D184S、D184T、D184V、D184W和D184Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代D184I,或由取代D184I组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置185的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置185的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K185A、K185D、K185E、K185F、K185G、K185H、K185I、K185L、K185M、K185N、K185P、K185Q、K185R、K185S、K185T、K185V、K185W和K185Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K185Y,或由取代K185Y组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置186的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置186的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:S186A、S186D、S186E、S186F、S186G、S186H、S186I、S186K、S186L、S186M、S186N、S186P、S186Q、S186R、S186T、S186V、S186W和S186Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代S186I,或由取代S186I组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置187的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置187的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V187A、V187D、V187E、V187F、V187G、V187H、V187I、V187K、V187L、V187M、V187N、V187P、V187Q、V187R、V187S、V187T、V187W和V187Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置189的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置189的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D189A、D189E、D189F、D189G、D189H、D189I、D189K、D189L、D189M、D189N、D189P、D189Q、D189R、D189S、D189T、D189V、D189W和D189Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代D189G或D189H中的任一者,或由取代D189G或D189H中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置190的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置190的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K190A、K190D、K190E、K190F、K190G、K190H、K190I、K190L、K190M、K190N、K190P、K190Q、K190R、K190S、K190T、K190V、K190W和K190Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置191的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置191的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N191A、N191D、N191E、N191F、N191G、N191H、N191I、N191K、N191L、N191M、N191P、N191Q、N191R、N191S、N191T、N191V、N191W和N191Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置192的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置192的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K192A、K192D、K192E、K192F、K192G、K192H、K192I、K192L、K192M、K192N、K192P、K192Q、K192R、K192S、K192T、K192V、K192W和K192Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置193的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置193的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N193A、N193D、N193E、N193F、N193G、N193H、N193I、N193K、N193L、N193M、N193P、N193Q、N193R、N193S、N193T、N193V、N193W和N193Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置194的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置194的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:I194A、I194D、I194E、I194F、I194G、I194H、I194K、I194L、I194M、I194N、I194P、I194Q、I194R、I194S、I194T、I194V、I194W和I194Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置195的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置195的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A195D、A195E、A195F、A195G、A195H、A195I、A195K、A195L、A195M、A195N、A195P、A195Q、A195R、A195S、A195T、A195V、A195W和A195Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置196的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置196的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G196A、G196D、G196E、G196F、G196H、G196I、G196K、G196L、G196M、G196N、G196P、G196Q、G196R、G196S、G196T、G196V、G196W和G196Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置197的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置197的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D197A、D197E、D197F、D197G、D197H、D197I、D197K、D197L、D197M、D197N、D197P、D197Q、D197R、D197S、D197T、D197V、D197W和D197Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置198的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置198的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:W198A、W198D、W198E、W198F、W198G、W198H、W198I、W198K、W198L、W198M、W198N、W198P、W198Q、W198R、W198S、W198T、W198V和W198Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置199的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置199的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G199A、G199D、G199E、G199F、G199H、G199I、G199K、G199L、G199M、G199N、G199P、G199Q、G199R、G199S、G199T、G199V、G199W和G199Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置200的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置200的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F200A、F200D、F200E、F200G、F200H、F200I、F200K、F200L、F200M、F200N、F200P、F200Q、F200R、F200S、F200T、F200V、F200W和F200Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置201的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置201的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D201A、D201E、D201F、D201G、D201H、D201I、D201K、D201L、D201M、D201N、D201P、D201Q、D201R、D201S、D201T、D201V、D201W和D201Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置202的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置202的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:P202A、P202D、P202E、P202F、P202G、P202H、P202I、P202K、P202L、P202M、P202N、P202Q、P202R、P202S、P202T、P202V、P202W和P202Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置203的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置203的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A203D、A203E、A203F、A203G、A203H、A203I、A203K、A203L、A203M、A203N、A203P、A203Q、A203R、A203S、A203T、A203V、A203W和A203Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置204的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置204的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K204A、K204D、K204E、K204F、K204G、K204H、K204I、K204L、K204M、K204N、K204P、K204Q、K204R、K204S、K204T、K204V、K204W和K204Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置205的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置205的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:W205A、W205D、W205E、W205F、W205G、W205H、W205I、W205K、W205L、W205M、W205N、W205P、W205Q、W205R、W205S、W205T、W205V和W205Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置206的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置206的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:A206D、A206E、A206F、A206G、A206H、A206I、A206K、A206L、A206M、A206N、A206P、A206Q、A206R、A206S、A206T、A206V、A206W和A206Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置207的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置207的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Y207A、Y207D、Y207E、Y207F、Y207G、Y207H、Y207I、Y207K、Y207L、Y207M、Y207N、Y207P、Y207Q、Y207R、Y207S、Y207T、Y207V和Y207W,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置208的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置208的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Q208A、Q208D、Q208E、Q208F、Q208G、Q208H、Q208I、Q208K、Q208L、Q208M、Q208N、Q208P、Q208R、Q208S、Q208T、Q208V、Q208W和Q208Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置209的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置209的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Y209A、Y209D、Y209E、Y209F、Y209G、Y209H、Y209I、Y209K、Y209L、Y209M、Y209N、Y209P、Y209Q、Y209R、Y209S、Y209T、Y209V和Y209W,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置210的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置210的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:D210A、D210E、D210F、D210G、D210H、D210I、D210K、D210L、D210M、D210N、D210P、D210Q、D210R、D210S、D210T、D210V、D210W和D210Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置211的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置211的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:E211A、E211D、E211F、E211G、E211H、E211I、E211K、E211L、E211M、E211N、E211P、E211Q、E211R、E211S、E211T、E211V、E211W和E211Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置212的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置212的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K212A、K212D、K212E、K212F、K212G、K212H、K212I、K212L、K212M、K212N、K212P、K212Q、K212R、K212S、K212T、K212V、K212W和K212Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K212G或K212P中的任一者,或由取代K212G或K212P中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置213的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置213的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N213A、N213D、N213E、N213F、N213G、N213H、N213I、N213K、N213L、N213M、N213P、N213Q、N213R、N213S、N213T、N213V、N213W和N213Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置214的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置214的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N214A、N214D、N214E、N214F、N214G、N214H、N214I、N214K、N214L、N214M、N214P、N214Q、N214R、N214S、N214T、N214V、N214W和N214Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置215的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置215的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K215A、K215D、K215E、K215F、K215G、K215H、K215I、K215L、K215M、K215N、K215P、K215Q、K215R、K215S、K215T、K215V、K215W和K215Y,或由这些取代中的任一者组成。在优选的方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的取代K215I,或由取代K215I组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置216的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置216的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:F216A、F216D、F216E、F216G、F216H、F216I、F216K、F216L、F216M、F216N、F216P、F216Q、F216R、F216S、F216T、F216V、F216W和F216Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置217的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置217的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:N217A、N217D、N217E、N217F、N217G、N217H、N217I、N217K、N217L、N217M、N217P、N217Q、N217R、N217S、N217T、N217V、N217W和N217Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置218的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置218的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:Y218A、Y218D、Y218E、Y218F、Y218G、Y218H、Y218I、Y218K、Y218L、Y218M、Y218N、Y218P、Y218Q、Y218R、Y218S、Y218T、Y218V和Y218W,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置219的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置219的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:V219A、V219D、V219E、V219F、V219G、V219H、V219I、V219K、V219L、V219M、V219N、V219P、V219Q、V219R、V219S、V219T、V219W和V219Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置220的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置220的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:G220A、G220D、G220E、G220F、G220H、G220I、G220K、G220L、G220M、G220N、G220P、G220Q、G220R、G220S、G220T、G220V、G220W和G220Y,或由这些取代中的任一者组成。
在一些方面,该变体包括在对应于SEQ ID NO 1的位置221的位置处的改变,或由该改变组成。在另一方面,在对应于位置221的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代。在另一方面,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽的选自以下的取代中的任一者:K221A、K221D、K221E、K221F、K221G、K221H、K221I、K221L、K221M、K221N、K221P、K221Q、K221R、K221S、K221T、K221V、K221W和K221Y,或由这些取代中的任一者组成。
术语在SEQ ID NO:1中显示的“多肽的”意指在SEQ ID NO 1中以及在对应于SEQID NO 1的位置的位置处进行的取代。因此,上述变体是具有SEQ ID NO 1的DNA酶变体或与其具有至少80%序列一致性的DNA酶变体。上述提及的变体与在SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、例如至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%但少于100%的一致性。
本发明的一些方面涉及DNA酶变体,其中该变体具有DNA酶活性,其中该DNA酶变体与在SEQ ID NO 1中显示的多肽具有至少80%序列一致性,并且其中当与在SEQ ID NO 1中显示的多肽相比时,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽的以下位置中任一处的氨基酸缺失:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220或221,条件是与在SEQ ID NO 1中显示的成熟多肽相比,缺失的最大数目是10个氨基酸。本发明的一些优选的方面涉及DNA酶变体,其中该变体具有DNA酶活性,其中该DNA酶变体与在SEQ ID NO 1中显示的多肽具有至少80%序列一致性,并且其中当与在SEQ ID NO 1中显示的多肽相比时,该变体包括在SEQ ID NO:1中显示的多肽的位置84、88、139、179或180中任一处的氨基酸缺失。
当本发明的DNA酶变体包括一个或多个缺失时,与在SEQ ID NO 1中显示的多肽相比,该DNA酶变体优选地包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失,与在SEQ ID NO 1中显示的多肽相比,优选1个、优选2个、优选3个或优选4个缺失,其中该DNA酶变体具有DNA酶活性并且其中该DNA酶变体与在SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%,但少于100%一致性。
在一个实施例中,与参照DNA酶(例如SEQ ID NO:1)相比,本发明的这些DNA酶变体具有改进的DNA酶活性,其中在下文测定和洗涤剂组合物中描述的测定I中对活性进行了测试。
在一个实施例中,与参照DNA酶(例如SEQ ID NO:1)相比,本发明的这些DNA酶变体在洗涤剂中具有改进的稳定性,其中如在实例2中的描述对稳定性进行了测试。
在一个实施例中,与参照DNA酶(例如SEQ ID NO:1)相比,如上所述在文库中产生的这些DNA酶变体具有改进的深层清洁性能。
在一个实施例中,与参照DNA酶(例如SEQ ID NO:1)相比,本发明的这些DNA酶变体具有改进的深层清洁性能。
当使用物品(像T恤或运动衣)时,物品被暴露于来自使用者的身体和来自物品处于的使用环境中的其余部分的细菌。即使在洗涤该物品后,这能够引起物品上的恶臭。因此,本发明还涉及纺织品上的恶臭的去除或减少。该恶臭可能由产生具有令人不愉快气味的化合物的细菌引起。此类具有令人不愉快气味的化合物的一个实例是E-2-壬烯醛。该恶臭可以存在于新洗的仍是湿的纺织品上。或者该恶臭可以存在于新洗的基本上已经干了的纺织品上。该恶臭还可以存在于纺织品上,该纺织品在洗涤后储存了一段时间。本发明可涉及使用根据本发明的DNA酶变体从湿的或干的纺织品减少或去除恶臭(例如E-2-壬烯醛)。
在一个实施例中,与参照DNA酶(例如SEQ ID NO:1)相比,根据本发明的这些DNA酶变体具有改进的恶臭去除特性,其中如测定II中所描述对恶臭进行测量。
此外,本发明涉及根据本发明的DNA酶变体用于防止、减少或去除污垢在物品上的附着的用途。在一个实施例中,该物品是纺织品。当该污垢没有附着于该物品时,该物品显得更干净。因此,本发明进一步涉及根据本发明的DNA酶变体用于维持或改进该物品白度的用途。
本发明进一步涉及包含根据本发明的DNA酶变体的洗涤剂组合物,优选地具有洗涤剂佐剂成分。包含根据本发明的DNA酶变体的洗涤剂组合物可以用于从物品上防止、减少或去除生物膜,用于防止、减少或去除物品的粘性,用于预处理物品上的污渍,用于在洗涤循环过程中防止、用于减少或去除污垢在物品上的附着,用于维持或改进物品的白度并且用于防止、减少或去除物品的恶臭,如E-2-壬烯醛(如测定II中的描述)。
在一个实施例中,该洗涤剂组合物为液体或粉末衣物洗涤剂,适合例如在高温和/或高pH的洗涤,例如在或高于40℃和/或在或高于pH 8。在一个实施例中,该洗涤剂组合物为液体或粉末衣物洗涤剂,适合例如在低温和/或低pH的洗涤,例如在或低于20℃和/或pH6。该洗涤剂也可被配制成单位剂量洗涤剂和/或任选具有最少的水或无水的致密洗涤剂。该洗涤剂也可以是餐具清洗洗涤剂。优选地,衣物和餐具清洗洗涤剂是无磷的。该洗涤剂组合物可以进一步包括至少一种额外的酶,如碳水化合物活性酶,像糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶如金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶,例如漆酶、和/或过氧化物酶。
在一些另外的实施例中,本发明涉及与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的DNA酶变体,其中当在相关测定中进行测试时,该变体与SEQ ID NO:1相比具有至少一种改进的特性。本发明的一个实施例涉及当该DNA酶变体在相关测定中测试感兴趣的特性时具有高于1的改进因子的DNA酶变体,其中该参照DNA酶的特性被给予1的值。在一个实施例中,该特性是稳定性,如在洗涤剂中的储存稳定性。在另一个实施例中,该特性是洗涤性能,如深层清洁性能。
在一个实施例中,根据本发明的变体相对于亲本具有一个或多个改进的特性,测量这些改进的特性为大于1.0的改进因子(IF),其中该改进的特性是稳定性,例如在洗涤剂中的稳定性。
在一个实施例中,根据本发明的变体在如实例2所述的条件A或B的两个不同组的至少一个中具有大于1.0的改进因子(IF)。
在一个实施例中,根据本发明的变体在条件A和B的其中之一或二者中具有大于1.0的改进因子(IF)。
在一些方面,根据本发明的变体具有的改进因子(IF)至少为:1.1;1.2;1.3;1.4;1.5;1.6;1.7;1.8;1.9;2.0;2.1;2.3;2.4;2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在一些方面,根据本发明的变体具有的改进因子(IF)至少为:1.1;1.5;2.0;3.0、3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10。
用于制造变体的蛋白质内的氨基酸位置是如下那些位置,其中,如与未改变的蛋白质,即亲本相比,至少一个改变会导致表现出改进特征的变体,即IF>1.0。可以使用测定I或II或如实例2中所述来确定改进的特征。
本发明的一个实施例涉及与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的DNA酶变体,该变体具有DNA酶活性并且包括选自下组的一个或多个改变,该组由以下组成:V1*、V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2*、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3*、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4*、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5*、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6*、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7*、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8*、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9*、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10*、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11*、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12*、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13*、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14*、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15*、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16*、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17*、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18*、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19*、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20*、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21*、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22*、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23*、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24*、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25*、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26*、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27*、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28*、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29*、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30*、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31*、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32*、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33*、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34*、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35*、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36*、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37*、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38*、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39*、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40*、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41*、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42*、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43*、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44*、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45*、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46*、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48*、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49*、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50*、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51*、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53*、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54*、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55*、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55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ID NO 1的多肽的位置,并且其中当在以下测定和洗涤剂中所描述的活性测定I中测量时,如与参照DNA酶(例如SEQ ID NO 1)相比,该变体具有改进的活性。
本发明的一个实施例涉及与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的DNA酶变体,该变体具有DNA酶活性,并且包括选自下组的一个或多个取代,该组由以下组成:V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W、A55Y、P56A、P56D、P56E、P56F、P56G、P56H、P56I、P56K、P56L、P56M、P56N、P56Q、P56R、P56S、P56T、P56V、P56W、P56Y、N57A、N57D、N57E、N57F、N57G、N57H、N57I、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57R、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、V58A、V58D、V58E、V58F、V58G、V58H、V58I、V58K、V58L、V58M、V58N、V58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ID NO 1的多肽的位置,并且其中当如在实例2中所描述的稳定性测定中测量时,与参照DNA酶(例如SEQ ID NO 1)相比,该变体具有改进的稳定性(即,IF>1.0)。
本发明的一个实施例涉及与在SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少80%序列一致性的DNA酶变体,该变体具有DNA酶活性并且包括选自下组的一个或多个取代,该组由以下组成:N4E、L17E、T19A、T19G、T19I、K36P、Q38P、S39V、S39R、A40P、A40H、L41T、L41H、V45H、L51G、K53T、K53P、G54P、A55P、N57H、E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I、E64S、T66H、K67A、K67T、N68V、N68P、N68I、N68H、S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y、S69Q、N70T、N70H、N70G、R71T、D72E、S74H、S74G、G75I、N77T、K82P、K82I、D83T、D83P、D83I、D83H、D83G、P84H、Q85T、Q85P、Q85H、K86T、K86P、K86H、G88P、G88H、A91P、W99T、A101W、K105E、K105N、K105T、K105D、S106T、S115T、L116I、Q135L、G136L、V138I、V138L、V138P、V138Q、L139A、N140R、N140L、N140A、G141L、F151R、D152Y、D152L、D152I、D152A、P153E、S154R、T162R、W163E、F164R、I166Y、I166R、K168N、F169R、F169E、A173I、A173R、A173T、S182R、N183E、D184I、K185Y、S186I、D189G、D189H、K212G、K212P和K215I,其中每个位置对应于SEQ ID NO 1的多肽的位置,并且其中当如实例2中所描述在稳定性测定中测量时,如与参照DNA酶(例如SEQ ID NO1)相比,该变体具有改进的稳定性(即IF>1.0)。
根据本发明的变体可以具有改进的稳定性和/或还具有改进的深层清洁性能。因此,在优选的实施例中,与具有SEQ ID NO:1的DNA酶相比,根据本发明的变体具有改进的洗涤剂稳定性和/或改进的深层清洁性能。在优选的实施例中,该DNA酶变体包括在选自以下的一个或多个位置处的取代:N4E、L17E、T19A、T19G、T19I、K36P、Q38P、S39V、S39R、A40P、A40H、L41T、L41H、V45H、L51G、K53T、K53P、G54P、A55P、N57H、E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I、E64S、T66H、K67A、K67T、N68V、N68P、N68I、N68H、S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y、S69Q、N70T、N70H、N70G、R71T、D72E、S74H、S74G、G75I、N77T、K82P、K82I、D83T、D83P、D83I、D83H、D83G、P84H、Q85T、Q85P、Q85H、K86T、K86P、K86H、G88P、G88H、A91P、W99T、A101W、K105E、K105N、K105T、K105D、S106T、S115T、L116I、Q135L、G136L、V138I、V138L、V138P、V138Q、L139A、N140R、N140L、N140A、G141L、F151R、D152Y、D152L、D152I、D152A、P153E、S154R、T162R、W163E、F164R、I166Y、I166R、K168N、F169R、F169E、A173I、A173R、A173T、S182R、N183E、D184I、K185Y、S186I、D189G、D189H、K212G、K212P和K215I,其中每个位置对应于SEQID NO 1的多肽的位置,并且其中该变体与SEQ ID NO:1具有至少60%,例如至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
根据本发明的变体在一个或多个(例如,若干个)其他位置上可以进一步包括一个或多个另外的改变。这些氨基酸改变可以具有微小性质,即,不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;小缺失,典型地为1-5个氨基酸;小的氨基末端或羧基末端延伸,例如氨基末端的甲硫氨酸残基;多达20-25个残基的,位于氨基末端或羧基末端的小接头肽;或通过改变净电荷或另一功能,例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域,有利于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在下组的范围内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代在本领域是已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,在:The Proteins[蛋白质],学术出版社(AcademicPress),纽约中描述。常见的取代包括:Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地,这些氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如,氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的方法,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后一项技术中,在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变,并且对所得突变体分子的DNA酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见,Hilton等,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定,如通过这样的技术确定:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记,连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见,例如de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312;Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904;Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
大体上,如以上所述DNA酶变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在本文的上下文中,术语“一个或多个”与术语“若干个”可互换地使用。本发明的DNA酶变体可以进一步包括优选地具有微小性质的改变,例如不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的保守氨基酸取代以及其他取代;典型地为一个至约30个氨基酸的小缺失;和小的氨基末端或羧基末端延伸,例如氨基末端的甲硫氨酸残基,多达约20-25个残基的小接头肽、或有利于纯化的小的延伸(亲和标记物),如聚组氨酸段(tract)或蛋白质A(Nilsson等人,1985,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]4:1075;Nilsson等人,1991,Methods Enzymol.[酶学方法]198:3。通常还参见Ford等人,1991,Protein Expressionand Purification[蛋白表达与纯化]2:95-107。
尽管如上所述的这些改变优选地具有微小的性质,但是此类改变还可以是实质的性质,例如均作为氨基末端或羧基末端延伸的多达300个氨基酸或更多个氨基酸的较大的多肽的融合。
该亲本DNA酶可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位基因变体;或其具有DNA酶活性的片段,或由其组成。在一个方面中,该亲本DNA酶包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的优选的方面,该亲本DNA酶包含与在SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少60%,例如至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的多肽。
该亲本DNA酶可以是(a)与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60%序列一致性的多肽;(b)由以下多核苷酸所编码的多肽,该多核苷酸在中或高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交;或(c)
在另一方面,该亲本DNA酶是由在非常低严格条件下、低严格条件下、中严格条件下、或高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的(Sambrook等人,1989,MolecularCloning,A Laboratory Manual[分子克隆,实验室手册]第2版,冷泉港,纽约)。
可以使用多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:1的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言,此类探针可以遵循标准DNA印迹程序用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交,以便鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以明显短于完整序列,但是长度应为至少15,例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地,该核酸探针的长度为至少100个核苷酸,例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、或至少600个核苷酸。可以使用DNA和RNA两种探针。典型地将探针进行标记(例如,用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白),以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有DNA酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与编码SEQ ID NO:1或其子序列的多核苷酸杂交的克隆或DNA,在DNA印迹中使用载体材料。
出于本发明的目的,杂交表明多核苷酸在非常低、低严格条件、低-中严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件至非常高严格条件下与标记的核酸探针杂交,该探针对应于(i)成熟多肽编码序列;(ii)其cDNA序列;(iii)其全长互补体;或(iv)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
该亲本DNA酶可以从任何属的有机体中获得。出于本发明的目的,如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面,该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是真菌DNA酶。例如,该亲本可以是曲霉属DNA酶。在一个方面中,该亲本是米曲霉DNA酶,例如具有SEQ ID NO:1的DNA酶。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得,如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures,CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,NorthernRegional Research Center,NRRL)。
可以使用上文提及的探针从其他来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸,则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如,Sambrook等人,1989,见上文)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得与SEQ ID NO:1相比具有至少一个改进的特性的DNA酶变体的方法,该方法包括
a)将一个或多个位置处的改变引入与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的亲本DNA酶中,这些位置选自:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220和221,其中该变体具有与SEQ ID NO:1至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列;并且
b)回收该变体。
本发明涉及用于获得与SEQ ID NO:1相比具有至少一个改进的特性的DNA酶变体的方法,该方法包括将以下一个或多个位置处的改变引入与SEQ ID NO:1具有至少60%一致性的亲本DNA酶中:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220或221,其中该变体具有与SEQ ID NO:1至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列;并且回收该变体。
本发明还涉及用于获得与SEQ ID NO:1相比具有至少一个改进的特性的DNA酶变体的方法,该方法包括
a)将一个或多个位置处的改变引入与SEQ ID NO:1具有至少80%一致性的亲本DNA酶中,这些位置选自:N4E、L17E、T19A、T19G、T19I、K36P、Q38P、S39V、S39R、A40P、A40H、L41T、L41H、V45H、L51G、K53T、K53P、G54P、A55P、N57H、E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I、E64S、T66H、K67A、K67T、N68V、N68P、N68I、N68H、S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y、S69Q、N70T、N70H、N70G、R71T、D72E、S74H、S74G、G75I、N77T、K82P、K82I、D83T、D83P、D83I、D83H、D83G、P84H、Q85T、Q85P、Q85H、K86T、K86P、K86H、G88P、G88H、A91P、W99T、A101W、K105E、K105N、K105T、K105D、S106T、S115T、L116I、Q135L、G136L、V138I、V138L、V138P、V138Q、L139A、N140R、N140L、N140A、G141L、F151R、D152Y、D152L、D152I、D152A、P153E、S154R、T162R、W163E、F164R、I166Y、I166R、K168N、F169R、F169E、A173I、A173R、A173T、S182R、N183E、D184I、K185Y、S186I、D189G、D189H、K212G、K212P和K215I,其中该变体具有与SEQ IDNO:1至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致的氨基酸序列;并且
b)回收该变体。
本发明的这些变体还可以通过程序,如以下提到的那些来制备。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如,若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变,所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常,消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的,从而允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见例如,Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955;和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见,例如,美国专利申请公开号2004/0171154;Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776;Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290;以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行,如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试,这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156;WO 95/17413;或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837;US 5,223,409;WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145;Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子,并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此,基因的限定的区域可以从头合成,而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增,而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体,这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸,在与控制序列相容的条件下,这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体,在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可为合意的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。
该控制序列可为启动子,即,被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子含有转录控制序列,其介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸,包括突变型、截短型及杂合型启动子,并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中,适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下的启动子:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315),天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94中的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”;和在Sambrook等人,1989,见上文中描述。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中,用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下酶的基因的启动子:构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶,以及里氏木霉翻译延长因子,以及NA2tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子,其中未翻译的前导序列已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换;非限制性实例包括来自中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子,其中已经用来自丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列);及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中,有用的启动子从以下的基因获得:酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶。Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下的基因获得:克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下的基因获得:构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其他有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区,其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的:苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
该控制序列也可以是前导序列,一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5’末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从以下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列,可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下酶的基因获得的:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990。
控制序列也可为编码与多肽的N末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地,编码序列5’端可以含有对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下,可能需要外源信号肽编码序列。可替代地,外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而,可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物学评论]57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,见上文描述。
控制序列也可为编码处于多肽的N末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子的基因获得前肽编码序列。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下,该前肽序列位于紧邻多肽的N末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N末端。
也可能令人希望的是添加调节序列,这些调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中,可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中,这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中,编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体,其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地,多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时,该编码序列位于该载体中,这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。在另一个实施例中,已经通过核苷酸取代对多核苷酸序列密码子进行修饰,以对应于旨在用于产生本发明的多肽的宿主有机体的密码子使用。重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA程序,并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线状或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地,该载体可以是这样载体,当它被引入该宿主细胞中时,被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒,其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA,或可以使用转座子。
载体优选地含有一个或多个选择性标志,这些选择性标志容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标志是这样一种基因,该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因,或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于,adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标志可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标志系统。在一方面,双选择性标志是hph-tk双选择性标志系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中,该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地,该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性,整合的元件应含有足够数量的核酸,如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对,所述碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可为与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,这些整合元件可为非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面,载体可通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
对于自主复制,载体可进一步包括使该载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点,以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67;Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175;WO00/24883)。可根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目,其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等人,1989,见上文)。宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞,这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸,该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列,该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中,这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体,如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可为在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞,例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞,包括但不限于:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞,包括但不限于:类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞,包括但不限于:不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现:原生质体转化(参见例如,Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见,例如,Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829;或Dubnau以及Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见,例如,Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或者接合(参见,例如Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现:原生质体转化(参见,例如,Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见,例如,Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现:原生质体转化、电穿孔(参见,例如,Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见,例如,Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见,例如,Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现:电穿孔(参见,例如,Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见,例如,Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现:天然感受态(参见,例如,Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见,例如,Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见,例如,Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或者接合(参见,例如,Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而,可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可为真核生物,如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典],第8版,1995,CABInternational[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge,UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来发生变化,出于本发明的目的,酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞,如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等人,1995,见上文,所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding),而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如,丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞能以本身已知的方式的通过涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及细胞壁的再生的过程进行转化。用于转化曲霉以及木霉属宿主细胞的合适程序描述于EP238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物技术]6:1419-1422中。用于转化镰孢菌属(Fusarium)物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序来转化酵母:Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.),纽约;Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163;以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法,包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞,该细胞以其野生型形式产生该多肽;并且可任选地(b)回收该多肽。在一方面,该细胞是曲霉属细胞。在另一方面,该细胞是米曲霉细胞。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法,该方法包括:(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞;并且可任选地(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中培养的。例如,可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞,所述培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。该培养是使用本领域中已知的方法在合适的营养培养基中发生,所述营养培养基包括碳源和氮源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公开的组成(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中,那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌,那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如,可通过常规方法,包括但不限于,收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀,从营养培养基回收多肽。在一方面,回收包含多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽,这些程序包括但不限于:色谱(例如,离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如,制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见,例如,Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH出版公司,纽约,1989),以便获得基本上纯的多肽。
在一个替代的方面,不回收多肽,而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
在一个实施例中,本发明进一步包括通过培养重组宿主细胞产生多肽,该重组宿主细胞进一步包括编码感兴趣的第二多肽的多核苷酸;优选地感兴趣的酶;更优选感兴趣的分泌性酶;甚至更优选水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶;并且最优选地,该分泌性酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
在一个实施例中,该感兴趣的第二多肽是与宿主细胞异源的或同源的。
在一个实施例中,重组宿主细胞是真菌宿主细胞;优选地丝状真菌宿主细胞;更优选地枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞;最优选地泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
在一个实施例中,重组宿主细胞是细菌宿主细胞;优选地原核生物宿主细胞;更优选地革兰氏阳性宿主细胞;甚至更优选地芽胞杆菌属、梭状芽孢杆菌、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属宿主细胞;和最优选地嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)宿主细胞。
在一个实施例中,用于生产感兴趣的第二多肽的方法包括在有益于产生该感兴趣的第二多肽的条件下培养该宿主细胞。
在一个实施例中,该方法进一步包括回收该感兴趣的第二多肽。
组合物
本发明进一步涉及包含至少一种根据本发明的DNA酶变体以及优选地洗涤剂佐剂成分的洗涤剂组合物。洗涤剂组合物可以用于从物品上防止、减少或去除生物膜,用于防止、减少或去除物品的粘性,用于预处理物品上的污渍,用于在洗涤循环过程中防止、用于减少或去除污垢在物品上的附着,用于维持或改进物品的白度并且用于防止、减少或去除物品的恶臭,如E-2-壬烯醛(如测定II中的描述)。这些包含本发明的多肽的洗涤剂组合物克服了现有技术的问题。本发明的DNA酶变体在粉末和液体洗涤剂中是有用的。
本发明的一个实施例涉及包含DNA酶变体和洗涤剂佐剂的洗涤剂组合物,与SEQID NO:1相比,该DNA酶变体包括在选自下组的一个或多个位置处的改变,该组由以下组成:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220和221。
在本发明的一个实施例中,洗涤剂组合物包含DNA酶变体和洗涤剂佐剂,与SEQ IDNO:1相比,该DNA酶变体包括选自下组的一个或多个改变,该组由以下组成:V1*、V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2*、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3*、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4*、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5*、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6*、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7*、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8*、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9*、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10*、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11*、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12*、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13*、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14*、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15*、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16*、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17*、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18*、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19*、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20*、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21*、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22*、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23*、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24*、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25*、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26*、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27*、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28*、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29*、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30*、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31*、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32*、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33*、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34*、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35*、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36*、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37*、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38*、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39*、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40*、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41*、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42*、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43*、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44*、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45*、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46*、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48*、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49*、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50*、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51*、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53*、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54*、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55*、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W、A55Y、P5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在本发明的一个实施例中,该洗涤剂佐剂成分选自下组,该组由以下组成:表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合的分散剂、粘土去污剂/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物柔软剂、载体、助水溶物、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或颜料。
该洗涤剂佐剂成分可以是表面活性剂。在包括DNA酶变体的洗涤剂组合物中包括表面活性剂的一个优势是洗涤性能得以改进。在一个实施例中,该洗涤剂佐剂成分是助洗剂或粘土去污剂/抗再沉淀剂。
在一个实施例中,洗涤剂佐剂成分是酶。如以下指定的,该洗涤剂组合物可以包括一种或多种酶。该一种或多种酶可以选自下组,该组由以下组成:蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶。将适合用于本发明的洗涤剂组合物的特定的酶描述如下。
在一个实施例中,包含DNA酶变体的洗涤剂组合物能够减少选自下组的细菌粘附至表面,该组由以下组成:不动杆菌属物种、气微菌属物种(Aeromicrobium sp.)、短波单胞菌属物种(Brevundimonas sp.)、微杆菌属物种、滕黄微球菌、假单胞菌属物种、表皮葡萄球菌、和寡养单胞菌属物种,或能够使细菌从它们粘附至其上的表面释放。在衣物物品上的生物膜生长可以来源于如先前所描述的许多生物体。在生物膜中一种特别丰富的细菌来源于短波单胞菌属。本发明的DNA酶变体在降低细菌的生长和减少恶臭、由这些细菌导致的粘性和再沉积方面中特别有效。在本发明的一个实施例中,该表面是纺织品表面。该纺织品可以由棉、棉/聚酯、聚酯、聚酰胺、聚丙烯和/或丝绸制成。
该洗涤剂组合物可以被配制为条,均匀的片剂,以及具有两个或更多个层的片剂,具有一个或多个室的袋,规则的或压缩的粉末,颗粒,膏,凝胶,或规则的、压缩的或浓缩的液体。该洗涤剂组合物可以是液体洗涤剂、粉状洗涤剂或颗粒洗涤剂。
本发明的DNA酶变体适合用于在清洗例如衣物中使用。本发明进一步涉及用于湿洗物品的方法,该方法包括以下步骤:
a.将物品暴露于包含本发明的DNA酶变体的洗涤液中;
b.完成至少一个洗涤循环;并且
c.任选地冲洗该物品,
其中该物品是纺织品。
该液体溶液的pH在1至11的范围内,如在5.5至11的范围内,如在7至9的范围内,在7至8的范围内或在7至8.5的范围内。
该洗涤液可以具有在5℃到95℃范围内,或在10℃到80℃范围内,在10℃到70℃范围内,在10℃到60℃范围内,在10℃到50℃范围内,在15℃到40℃范围内或在20℃到30℃范围内的温度。在一个实施例中,该洗液的温度是30℃。
在本发明的一个实施例中,用于湿洗物品的方法进一步包括在完成洗涤周期后排掉洗涤液或部分洗涤液。然后可以将洗涤液在后续洗涤循环中或在后续漂洗循环中重复使用。在第一个和任选地第二个或第三个洗涤循环过程中,可以将该物品暴露于洗涤液。在一个实施例中,在暴露于洗涤液后,冲洗该物品。可以将该物品用水或用包括调节剂的水进行冲洗。本发明进一步涉及根据该方法洗涤的物品。
可以将本发明的DNA酶添加至洗液中。
洗涤液中DNA酶变体的浓度典型地在以下范围内:0.00004-100ppm酶蛋白,如在0.00008-100范围内、在0.0001-100范围内、在0.0002-100范围内、在0.0004-100范围内、在0.0008-100范围内、在0.001-100ppm酶蛋白的范围内、0.01-100ppm酶蛋白,优选地0.05-50ppm酶蛋白,更优选地0.1-50ppm酶蛋白,更优选地0.1-30ppm酶蛋白,更优选地0.5-20ppm酶蛋白,并且最优选地0.5-10ppm酶蛋白。
可以将本发明的DNA酶变体以一定量添加到洗涤剂组合物中,该量对应于至少0.002mg的DNA酶蛋白,如至少0.004mg的DNA酶蛋白、至少0.006mg的DNA酶蛋白、至少0.008mg的DNA酶蛋白、至少0.01mg的DNA酶蛋白、至少0.1mg的蛋白,优选地至少1mg的蛋白,更优选地至少10mg的蛋白,甚至更优选地至少15mg的蛋白,最优选地至少20mg的蛋白,并且甚至最优选地至少25mg的蛋白。因此,该洗涤剂组合物可以包含至少0.00008%DNA酶蛋白,优选地至少0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1.0%的DNA酶蛋白。
液体洗涤剂组合物
本发明的DNA酶变体还可以配制在液体衣物洗涤组合物(如液体衣物洗涤组合物)中,该组合物包括:
a)每升洗涤剂中至少0.005mg的活性DNA酶变体蛋白,
b)2wt%至60wt%的至少一种表面活性剂,以及
c)5wt%至50wt%的至少一种助洗剂。
该表面活性剂可以是在如上描述的非离子、阴离子和/或两性离子表面活性剂中选择的,优选地阴离子或非离子表面活性剂也可以使用两性离子表面活性剂。通常,优选是漂白剂稳定的表面活性剂。优选的阴离子表面活性剂是硫酸盐表面活性剂并且具体地烷基醚硫酸盐,特别是C-9-15醇醚硫酸盐、C12-15伯醇乙氧基化物、C8-C16酯硫酸盐和C10-C14酯硫酸盐,例如单十二烷基酯硫酸盐。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐,具体地是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES,也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸的二酯和单酯或脂肪酸的盐(皂)、及其组合。
阴离子表面活性剂优选地以盐的形式添加至洗涤剂中。在这些盐中的适合的阳离子为碱金属离子,例如钠、钾和锂以及铵盐,例如(2-羟基乙基)铵、二(2-羟基乙基)铵和三(2-羟基乙基)铵盐。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。可商购的非离子表面活性剂包括来自BASF公司的PlurafacTM、LutensolTM和PluronicTM,来自科宁公司(Cognis)的DehyponTM系列和来自科莱恩特公司(Clariant)的GenapolTM系列。
优选地,助洗剂选自磷酸盐、柠檬酸钠助洗剂、碳酸钠、硅酸钠、铝硅酸钠(沸石)。适合的助洗剂是碱金属或磷酸铵、聚磷酸盐、磷酸酯、聚磷酸酯、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、柠檬酸盐和聚羧酸盐。柠檬酸盐助洗剂,例如柠檬酸及其可溶性盐(特别是钠盐)是聚羧酸盐助洗剂。柠檬酸盐可以与沸石、硅酸盐如BRITESIL类型、和/或层状硅酸盐助洗剂组合使用。助洗剂优选以按重量计约0-65%(例如按重量计约5%至约50%)的量添加。在衣物洗涤剂中,助洗剂的水平通常为按重量计约40%-65%、特别是按重量计约50%-65%、特别是按重量计从20%至50%。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的、在清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)和(羧甲基)菊粉(CMI)及其组合。助洗剂的进一步的非限制性实例包括柠檬酸盐;螯合剂,例如氨基羧酸盐、氨基聚羧酸盐和膦酸盐;以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2"-次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸、N-(2-羟基乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(磺甲基谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及N'-(2-羟基乙基)-亚乙基二胺-N,N,N'-三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、及其组合和盐。适合本文使用的膦酸酯包括1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA或DTPMP)、次氮基三(亚甲基膦酸)(ATMP或NTMP)、2-膦酰基丁烷-1,2,4-三羧酸(PBTC)、六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(HDTMP)。
该组合物还可以含有按重量计0-50%,如约5%至约30%的洗涤剂共助洗剂。洗涤剂组合物可以包含单独的或与助洗剂组合的共助洗剂,例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物,如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)或聚天冬氨酸。进一步的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
在一个优选的实施例中,该助洗剂是基于非磷的助洗剂,例如柠檬酸和/或甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)和/或其盐。
在优选的助洗剂包括柠檬酸盐和/或甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)和/或其盐的情况下,该衣物洗涤组合物也可以是无磷酸盐的。
本发明的一个实施例涉及液体衣物洗涤组合物,该液体衣物洗涤组合物包含:
a)每升组合物中至少0.005mg的DNA酶变体,
b)按重量计1%至15%的至少一种表面活性剂,其中该表面活性剂是LAS、AEOS和/或SLES,以及
c)按重量计5%至50%的至少一种助洗剂,该助洗剂选自HEDP、DTMPA或DTPMPA。
该液体洗涤剂组合物可以典型地含有按重量计至少20%并且高达95%的水,如高达70%的水、高达50%的水、高达40%的水、高达30%的水、或高达20%的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体洗涤剂中。水性液体洗涤剂可以含有从0-30%的有机溶剂。液体洗涤剂甚至可以是非水性的,其中水含量低于10%,优选低于5%。
粉末组合物
该洗涤剂组合物还可以配制在用于衣物洗涤或餐具洗涤的颗粒洗涤剂中。本发明的一个实施例涉及颗粒状洗涤剂组合物,该洗涤剂组合物包含
a)每克组合物中至少0.005mg的DNA酶变体,
b)5wt%至50wt%阴离子表面活性剂
c)1wt%至8wt%非离子表面活性剂,以及
d)5wt%至40wt%助洗剂,例如碳酸盐、沸石、磷酸盐助洗剂、钙螯合助洗剂或络合剂。
该表面活性剂可以是在如上描述的非离子、阴离子和/或两性离子表面活性剂中选择的,优选地阴离子或非离子表面活性剂也可以使用两性离子表面活性剂。通常,优选是漂白剂稳定的表面活性剂。优选的阴离子表面活性剂是硫酸盐表面活性剂并且具体地烷基醚硫酸盐,特别是C-9-15醇醚硫酸盐、C12-15伯醇乙氧基化物、C8-C16酯硫酸盐和C10-C14酯硫酸盐,例如单十二烷基酯硫酸盐。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐,具体地是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES,也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸的二酯和单酯或脂肪酸的盐(皂)、及其组合。阴离子表面活性剂优选地以盐的形式添加至洗涤剂中。在这些盐中的适合的阳离子为碱金属离子,例如钠、钾和锂以及铵盐,例如(2-羟基乙基)铵、二(2-羟基乙基)铵和三(2-羟基乙基)铵盐。
非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
可商购的非离子表面活性剂包括来自BASF公司的PlurafacTM、LutensolTM和PluronicTM类、来自科宁公司(Cognis)的DehyponTM系列和来自科莱恩特公司(Clariant)的GenapolTM系列。
该助洗剂可以是非磷酸盐的,例如柠檬酸盐,优选为钠盐和/或沸石。膦酸酯助洗剂可以是上文描述的那些中的任一者。
如上所述,该助洗剂优选地选自磷酸盐、和柠檬酸钠助洗剂、碳酸钠、硅酸钠、铝硅酸钠(沸石)。适合的助洗剂是上文描述的并且包括碱金属或磷酸铵、聚磷酸盐、膦酸酯、聚膦酸酯、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、聚羟基磺酸盐、聚乙酸盐、羧酸盐、柠檬酸盐和聚羧酸盐。柠檬酸盐助洗剂,例如柠檬酸及其可溶性盐(特别是钠盐)是聚羧酸盐助洗剂。优选地该助洗剂以按重量计约0-65%、例如按重量计约5%至约50%、例如按重量计5%至40%、例如按重量计10%至40%、例如按重量计10%至30%、例如按重量计15%至20%或例如按重量计20%至40%的量添加。该助洗剂可以是膦酸酯助洗剂,包括1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、2-膦酰基丁烷-1,2,4-三羧酸(PBTC)、和六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(HDTMP)。优选的膦酸酯包括1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)和/或二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)。优选地膦酸酯以约在如下水平的量添加:组合物的按重量计从约0.01%至约10%、优选按重量计从0.1%至约5%、更优选地按重量计从0.5%至3%。
在优选的助洗剂包括柠檬酸盐、碳酸盐和/或铝硅酸钠(沸石)的情况下,衣物洗涤组合物也可以是无磷酸盐的。
洗涤剂可以包含按重量计0-30%,例如约1%至约20%的漂白系统。可以利用包含本领域已知的用于清洁洗涤剂中的组分的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括过氧化氢的来源;过酸的来源;和漂白催化剂或增效剂。
过氧化氢的来源:适合的过氧化氢的来源是无机过酸盐,包括碱金属盐例如过碳酸钠和过硼酸钠(通常是一水合物或四水合物),以及过氧化氢―尿素(1/1)。
过酸的来源:过酸可以是(a)直接作为预成型过酸掺入,或(b)从过氧化氢和漂白活化剂(过水解)在洗涤液中原位形成,或(c)从过氧化氢和过氧化氢酶和后者适合的底物(例如酯)在洗涤液中原位形成。
a)适合的预成型过酸包括但不限于:过氧羧酸例如过氧苯甲酸及其环取代的衍生物、过氧基-α-萘甲酸、过氧邻苯二甲酸、过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-邻苯二甲酰亚氨基过氧羊油酸[邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、和邻-羧基苯甲酰胺基过氧羊油酸;脂肪族和芳香族二过氧二羧酸例如二过氧十二烷二酸、二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧十三烷二酸、2-癸基二过氧丁二酸、以及二过氧邻苯二甲酸、二过氧间苯二甲酸和二过氧对苯二甲酸;过亚氨酸;过氧单硫酸;过氧二硫酸;过氧磷酸;过氧硅酸;以及所述化合物的混合物。应当理解的是,在有些情况下,所提到的过酸可能最好是作为适合的盐的添加,例如碱金属盐(例如)或碱土金属盐。
b)适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺、腈类或酸酐类别的那些,以及适用时,其盐。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸钠(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸钠、4-(癸酰基氧基)苯甲酸(DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸钠(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有它们是环境友好的优点。此外,乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性,并且是有效的漂白活化剂。最后,ATC是多功能的,因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。
漂白催化和增效剂:该漂白系统还可以包括漂白催化剂或增效剂。可用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂;特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物,具体地是Me3-TACN,如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂也可以是其他金属化合物,如铁或钴络合物。
在其中过酸的来源包括在内的一些实施例中,可以使用具有下式之一的有机漂白催化剂或漂白增效剂:
(iii)及其混合物;其中每个R1独立地是含有从9到24个碳的支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基,优选地每个R1独立地是含有从9到18个碳的支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基,更优选地每个R1独立地选自下组,该组由以下组成:2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。
其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(维生素K)和WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。
根据一个实施例和任一项前述实施例,本发明还涉及包含以下的洗涤剂组合物:
a)每克组合物中至少0.005mg的DNA酶变体,
b)10wt%-50wt%助洗剂,以及
c)至少一种漂白组分,其中该漂白剂是过氧化物并且该漂白催化剂是锰化合物。
氧漂白剂优选地是过碳酸盐和锰催化剂,优选地是1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷或乙酸锰(III)四水合物。
根据一个实施例和任一项前述实施例,本发明还涉及包含以下的清洁组合物:
a)至少0.005mg的活性DNA酶变体,
b)10wt%-50wt%助洗剂,该助洗剂选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物,以及
c)至少一种漂白组分,其中该漂白剂是氧漂白剂并且该漂白催化剂是锰化合物。
氧漂白剂优选地是过碳酸盐和锰催化剂,优选地是1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷或乙酸锰(II)四水合物。
根据一个实施例和任一项前述实施例,本发明还涉及包含以下的洗涤剂组合物:
a)每克组合物中至少0.005mg的活性DNA酶变体,
b)10wt%-50wt%助洗剂,该助洗剂选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物,以及
c)0.1wt%-40wt%、优选从0.5wt%-30wt%的漂白组分,其中该漂白组分是过氧化物,优选地是过碳酸盐和含金属的漂白催化剂,优选地是1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷或乙酸锰(II)四水合物(MnTACN)。
洗涤剂组分的选择可以包括(用于纺织品护理)有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类,但是这并不被解释为限制,因为如将被普通技术人员所理解,一种组分可以包括另外的功能性,包括以下列出的示例性、非限制性组分。
助水溶物
洗涤剂组合物可以包含按重量计0-10%,例如按重量计0-5%,例如约0.5%至约5%、或约3%至约5%的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶物。助水溶物的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。
聚合物
该洗涤剂组合物可以包含按重量计0-10%,如0.5%-5%、2%-5%、0.5%-2%或0.2%-1%的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用,或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物,如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂,如染料或色素,当配制在洗涤剂组合物中时,当所述织物与洗液接触时织物调色剂可以沉积在织物上,该洗液包含所述洗涤剂组合物,并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下,因为它们吸收至少一部分可见光光谱,所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物,并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料,该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成:直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物,例如如描述于WO 2005/03274、WO2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1876226(通过引用而特此结合)中。洗涤剂组合物优选包含从约0.00003wt%至约0.2wt%、从约0.00008wt%至约0.05wt%、或甚至从约0.0001wt%至约0.04wt%的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt%至0.2wt%的织物调色剂,当该组合物处于单位剂量袋的形式时,这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
酶
洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶,如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或过氧化酶。
一般而言,所选一种或多种酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即,最适pH,与其他酶和非酶成分的相容性等),并且这种或这些酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶,例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97%一致性的序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶或一种家族44木葡聚糖酶,该木葡聚糖酶是一种具有与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60%一致性的序列的木葡聚糖酶。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.)),以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些,例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。它可以是碱性蛋白酶,例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶,如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的亚组。枯草杆菌蛋白酶(subtilase)可以划分为6个亚部,即,枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibioticpeptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是获得自芽孢杆菌属的那些,例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌;和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如,猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中),以及从纤维单胞菌(Cellumonas)获得的的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO95/23221中所述)、以及其变体(例如在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶,例如获得自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体:WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264,尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体:3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274,使用BPN'进行编号。更优选地,这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变:S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些:DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、和(诺维信公司),以下列商品名出售的那些: PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafectEffectenzTm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(示于US 5352604的图29中的序列)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶,例如,如描述于EP 258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉);来自腐质霉属的角质酶,例如特异腐质霉(WO 96/13580);来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属),例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012);GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455);来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560);来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536);来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412);嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417);来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599);以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是例如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所描述的那些脂肪酶变体。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM;LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司),Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶,例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶
可以与本发明的DNA酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属,例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90%序列一致性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中,如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90%序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的获得自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90%序列一致性的变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些:G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的获得自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些:
M197T;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S;或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的适合的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90%序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的变体的那些:R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90%序列一致性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体的那些:140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476,使用WO 96/023873的SEQ ID NO.2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置中具有缺失的那些,例如位置181和182、182和183、或位置183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
其他可以使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或与WO 08/153815的SEQ ID NO:2或WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90%序列一致性的其变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些:176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90%序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C末端截短和/或在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些:Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代:Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K,和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些:
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K,其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包含取代和/或在位置180和/或位置181处包含缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90%序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些:R28、R118、N174;R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314;R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体,以及在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体:M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345及A339,最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司),以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternational Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶
根据本发明的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC 1.11.1.7包括的过氧化物酶,或获得自其中的表现出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属,例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486),及其变体,如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中描述的那些。
根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶,如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。卤过氧化物酶依据它们对卤离子的特异性来分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。
在一个实施例中,本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地,该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶,即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选方法中,将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。
已经从许多不同真菌,特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶,如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如,煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如,疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已经从细菌,如假单胞菌属(例如,吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如,金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选实施例中,该卤代过氧化物酶可源自弯孢属物种,特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)和不等弯孢,例如如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70;或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii,如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium物种。
根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或获得自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物,如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以获得自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶:曲霉属,脉孢菌属(例如,粗糙脉孢菌),柄孢壳菌属,葡萄孢属,金钱菌属(Collybia),层孔菌属(Fomes),香菇属,侧耳属,栓菌属(例如,长绒毛栓菌和变色栓菌),丝核菌属(例如,立枯丝核菌(R.solani)),拟鬼伞属(例如,灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis),小脆柄菇属(Psathyrella)(例如,白黄小脆柄菇(P.condelleana)),斑褶菇属(例如,蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)),毁丝霉属(例如,嗜热毁丝霉),Schytalidium(例如,S.thermophilum),多孔菌属(例如,P.pinsitus),射脉菌属(例如,射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如,毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。
来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是获得自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶;特别是获得自灰盖拟鬼伞的漆酶,如披露于WO 97/08325中;或源自嗜热毁丝霉,如披露于WO 95/33836中。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂,或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂,即单独的或组合的添加剂,可以配制成例如颗粒、液体、浆液等,优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒,特别是无粉尘颗粒;液体,特别是稳定化液体;或者浆液。
非尘化的颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生,并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是具有平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇,PEG);具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚;具有从12个至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇;脂肪醇;脂肪酸;以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
其他材料
还可以利用本领域中已知的用于在本发明的清洁组合物中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂,单独或组合使用。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。
分散剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体而言,粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐,其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列],第71卷,马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)。
染料转移抑制剂
本发明的清洁组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在受试组合物中存在时,染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从大约0.0001%至大约10%、从大约0.01%至大约5%或甚至从大约0.1%至大约3%的水平存在。
荧光增白剂
优选地,洗涤剂组合物还可以包含另外的组分,这些组分可以给正在清洁的物品着色,如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01%至约0.5%的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些:二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐:4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔,瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂,是可商购的Parawhite KX,由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals),孟买,印度供应。天来宝CBS-X是4.4'-双-(磺基苯乙烯基)-联苯基二钠盐,也称作二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠盐。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt%、从0.05wt%、从约0.1wt%或甚至从约0.2wt%的较低水平至0.5wt%或甚至0.75wt%的较高水平。
污物释放聚合物
洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物,这些聚合物帮助从织物(如棉和基于聚酯的织物)去除污垢,特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺,参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷,第7章,马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构,如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外,随机接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构,尤其是取代的纤维素结构,如修饰的纤维素衍生物,如EP1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂,如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。在以上污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以用作抗再沉积剂。
流变改性剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂,不同于降粘剂。流变改性剂选自下组,该组由以下组成:非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂,它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度,例如如在EP 2169040中所示。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式,例如棒,均匀的片剂,具有两层或更多层的片剂,规则的或压缩的粉末,颗粒,糊,凝胶,或规则的、压缩或浓缩的液体。
洗涤剂配制品形式:层(相同或不同的相)、袋、与用于机器剂量单位的形式。
可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料,例如在与水接触之前,不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成,它包含了内部体积。所述内部体积可以分成袋的室。优选的薄膜是高分子材料,优选被制成薄膜或薄片的形式的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯,最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地,聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60%。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物,该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物,如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在商品参考号M8630下,如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris CraftIn.Prod.)销售)加增塑剂,像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分以及/或者液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考文献:(US 2009/0011970 A1)
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。因此,可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中,每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征:
非单位给药的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的,典型地包含按重量计至少20%并且高达95%的水,如高达约70%的水、高达约65%的水、高达约55%的水、高达约45%的水、高达约35%的水。包括但不局限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30%的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
颗粒洗涤剂配制品
可以如WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中所描述的制备颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下中:WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO09/021813、WO 09/030632、和WO 09/015951、
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO 2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO 2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO2010003792、
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO 2010031607、WO 2010000636。
共颗粒中酶的配制品
该DNA酶可以被配制为颗粒,例如,配制为结合一种或多种酶的共颗粒。然后,每种酶将存在于多种颗粒中,这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度,不同酶的物理隔离。用于生产针对洗涤剂工业的多酶共颗粒的方法披露于IP.com公开内容IPCOM000200739D中。
通过使用共颗粒的酶的配制品的另一个实例披露于WO 2013/188331中,其涉及包含以下的洗涤剂组合物:(a)多酶共颗粒;(b)少于10wt沸石(无水基底);和(c)少于10wt磷酸盐(无水基底),其中所述酶共颗粒包含从10wt%至98wt%的水分汇组分,并且该组合物另外还包含从20wt%至80wt%的洗涤剂水分汇组分。WO 2013/188331还涉及处理和/或清洁表面的方法,优选织物表面,该方法包括以下步骤:(i)将所述表面与在含水洗液中如在此要求保护的并且描述的洗涤剂组合物接触,(ii)冲洗和/或干燥该表面。
在以下非限制性实施例中进一步描述本发明:
1.一个实施例涉及DNA酶变体,与SEQ ID NO:1相比,该DNA酶变体包括在一个或多个位置处的改变,这些位置对应于SEQ ID NO:1的以下位置:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220或221,其中该变体与SEQID NO:1具有至少60%的序列一致性,并且该变体具有DNA酶活性。
2.如实施例1所述的变体,与SEQ ID NO:1相比,该变体包括一个或多个改变,其中该一个或多个改变选自下组,该组由以下组成:V1*、V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2*、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3*、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4*、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5*、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6*、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7*、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8*、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9*、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10*、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11*、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12*、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13*、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14*、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15*、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16*、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17*、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18*、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19*、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20*、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21*、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22*、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23*、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24*、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25*、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26*、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27*、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28*、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29*、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30*、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31*、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32*、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33*、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34*、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35*、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36*、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37*、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38*、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39*、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40*、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41*、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42*、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43*、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44*、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45*、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46*、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48*、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49*、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50*、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51*、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53*、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54*、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55*、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W、A55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91M、N191P、N191Q、N191R、N191S、N191T、N191V、N191W、N191Y、K192*、K192A、K192D、K192E、K192F、K192G、K192H、K192I、K192L、K192M、K192N、K192P、K192Q、K192R、K192S、K192T、K192V、K192W、K192Y、N193*、N193A、N193D、N193E、N193F、N193G、N193H、N193I、N193K、N193L、N193M、N193P、N193Q、N193R、N193S、N193T、N193V、N193W、N193Y、I194*、I194A、I194D、I194E、I194F、I194G、I194H、I194K、I194L、I194M、I194N、I194P、I194Q、I194R、I194S、I194T、I194V、I194W、I194Y、A195*、A195D、A195E、A195F、A195G、A195H、A195I、A195K、A195L、A195M、A195N、A195P、A195Q、A195R、A195S、A195T、A195V、A195W、A195Y、G196*、G196A、G196D、G196E、G196F、G196H、G196I、G196K、G196L、G196M、G196N、G196P、G196Q、G196R、G196S、G196T、G196V、G196W、G196Y、D197*、D197A、D197E、D197F、D197G、D197H、D197I、D197K、D197L、D197M、D197N、D197P、D197Q、D197R、D197S、D197T、D197V、D197W、D197Y、W198*、W198A、W198D、W198E、W198F、W198G、W198H、W198I、W198K、W198L、W198M、W198N、W198P、W198Q、W198R、W198S、W198T、W198V、W198Y、G199*、G199A、G199D、G199E、G199F、G199H、G199I、G199K、G199L、G199M、G199N、G199P、G199Q、G199R、G199S、G199T、G199V、G199W、G199Y、F200*、F200A、F200D、F200E、F200G、F200H、F200I、F200K、F200L、F200M、F200N、F200P、F200Q、F200R、F200S、F200T、F200V、F200W、F200Y、D201*、D201A、D201E、D201F、D201G、D201H、D201I、D201K、D201L、D201M、D201N、D201P、D201Q、D201R、D201S、D201T、D201V、D201W、D201Y、P202*、P202A、P202D、P202E、P202F、P202G、P202H、P202I、P202K、P202L、P202M、P202N、P202Q、P202R、P202S、P202T、P202V、P202W、P202Y、A203*、A203D、A203E、A203F、A203G、A203H、A203I、A203K、A203L、A203M、A203N、A203P、A203Q、A203R、A203S、A203T、A203V、A203W、A203Y、K204*、K204A、K204D、K204E、K204F、K204G、K204H、K204I、K204L、K204M、K204N、K204P、K204Q、K204R、K204S、K204T、K204V、K204W、K204Y、W205*、W205A、W205D、W205E、W205F、W205G、W205H、W205I、W205K、W205L、W205M、W205N、W205P、W205Q、W205R、W205S、W205T、W205V、W205Y、A206*、A206D、A206E、A206F、A206G、A206H、A206I、A206K、A206L、A206M、A206N、A206P、A206Q、A206R、A206S、A206T、A206V、A206W、A206Y、Y207*、Y207A、Y207D、Y207E、Y207F、Y207G、Y207H、Y207I、Y207K、Y207L、Y207M、Y207N、Y207P、Y207Q、Y207R、Y207S、Y207T、Y207V、Y207W、Q208*、Q208A、Q208D、Q208E、Q208F、Q208G、Q208H、Q208I、Q208K、Q208L、Q208M、Q208N、Q208P、Q208R、Q208S、Q208T、Q208V、Q208W、Q208Y、Y209*、Y209A、Y209D、Y209E、Y209F、Y209G、Y209H、Y209I、Y209K、Y209L、Y209M、Y209N、Y209P、Y209Q、Y209R、Y209S、Y209T、Y209V、Y209W、D210*、D210A、D210E、D210F、D210G、D210H、D210I、D210K、D210L、D210M、D210N、D210P、D210Q、D210R、D210S、D210T、D210V、D210W、D210Y、E211*、E211A、E211D、E211F、E211G、E211H、E211I、E211K、E211L、E211M、E211N、E211P、E211Q、E211R、E211S、E211T、E211V、E211W、E211Y、K212*、K212A、K212D、K212E、K212F、K212G、K212H、K212I、K212L、K212M、K212N、K212P、K212Q、K212R、K212S、K212T、K212V、K212W、K212Y、N213*、N213A、N213D、N213E、N213F、N213G、N213H、N213I、N213K、N213L、N213M、N213P、N213Q、N213R、N213S、N213T、N213V、N213W、N213Y、N214*、N214A、N214D、N214E、N214F、N214G、N214H、N214I、N214K、N214L、N214M、N214P、N214Q、N214R、N214S、N214T、N214V、N214W、N214Y、K215*、K215A、K215D、K215E、K215F、K215G、K215H、K215I、K215L、K215M、K215N、K215P、K215Q、K215R、K215S、K215T、K215V、K215W、K215Y、F216*、F216A、F216D、F216E、F216G、F216H、F216I、F216K、F216L、F216M、F216N、F216P、F216Q、F216R、F216S、F216T、F216V、F216W、F216Y、N217*、N217A、N217D、N217E、N217F、N217G、N217H、N217I、N217K、N217L、N217M、N217P、N217Q、N217R、N217S、N217T、N217V、N217W、N217Y、Y218*、Y218A、Y218D、Y218E、Y218F、Y218G、Y218H、Y218I、Y218K、Y218L、Y218M、Y218N、Y218P、Y218Q、Y218R、Y218S、Y218T、Y218V、Y218W、V219*、V219A、V219D、V219E、V219F、V219G、V219H、V219I、V219K、V219L、V219M、V219N、V219P、V219Q、V219R、V219S、V219T、V219W、V219Y、G220*、G220A、G220D、G220E、G220F、G220H、G220I、G220K、G220L、G220M、G220N、G220P、G220Q、G220R、G220S、G220T、G220V、G220W、G220Y、K221*、K221A、K221D、K221E、K221F、K221G、K221H、K221I、K221L、K221M、K221N、K221P、K221Q、K221R、K221S、K221T、K221V、K221W以及K221Y,其中该变体与SEQ ID NO:1具有至少60%序列一致性,并且该变体具有DNA酶活性。
3.如实施例1-2中任一项所述的变体,与亲本相比或与具有SEQ ID NO:1的DNA酶相比,该变体具有改进的洗涤剂稳定性。
4.如实施例1-3中任一项所述的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性。
5.如实施例1-4中任一项所述的变体,其中相比于SEQ ID NO:1的改变的总数是1-20个,例如1-10个和1-5个,如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
6.一种洗涤剂组合物,其包含根据实施例1至5中任一项所述的变体。
7.如实施例6所述的洗涤剂组合物,其进一步包括一种或多种洗涤剂组分。
8.根据实施例6-7中任一项所述的洗涤剂组合物,其进一步包括选自下组的一种或多种另外的酶,该组由以下组成:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶,或其任何混合物。
9.根据实施例6-8中任一项所述的洗涤剂组合物,其处于以下形式:棒,均匀的片剂,具有两层或更多层的片剂,具有一个或多个室的袋,规则的或压缩的粉末,颗粒,膏,凝胶,或规则的、压缩的或浓缩的液体。
10.根据实施例6-9中任一项所述的洗涤剂组合物在清洁过程如洗衣或硬表面清洁如餐具清洗中的用途。
11.一种用于获得DNA酶变体的方法,该方法包括将在对应于以下位置的一个或多个位置处的改变引入亲本DNA酶:SEQ ID NO 1的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220或221,其中该变体具有与SEQ ID NO 1至少60%一致的氨基酸序列,并且回收该变体。
12.如实施例11所述的方法,其中与SEQ ID NO:1相比,该变体包括两个、三个、四个或五个改变。
13.根据实施例11或12中任一项所述的方法,其中与SEQ ID NO:1相比,该变体包括选自下组的一个或多个改变,该组由以下组成:V1*、V1A、V1D、V1E、V1F、V1G、V1H、V1I、V1K、V1L、V1M、V1N、V1P、V1Q、V1R、V1S、V1T、V1W、V1Y、P2*、P2A、P2D、P2E、P2F、P2G、P2H、P2I、P2K、P2L、P2M、P2N、P2Q、P2R、P2S、P2T、P2V、P2W、P2Y、V3*、V3A、V3C、V3D、V3E、V3F、V3G、V3H、V3I、V3K、V3L、V3M、V3N、V3P、V3R、V3S、V3T、V3W、V3Y、N4*、N4A、N4D、N4E、N4F、N4G、N4H、N4I、N4K、N4L、N4M、N4P、N4Q、N4R、N4S、N4T、N4V、N4W、N4Y、P5*、P5A、P5D、P5E、P5F、P5G、P5H、P5I、P5K、P5L、P5M、P5N、P5Q、P5R、P5S、P5T、P5V、P5W、P5Y、E6*、E6A、E6D、E6F、E6G、E6H、E6I、E6K、E6L、E6M、E6N、E6P、E6Q、E6R、E6S、E6T、E6V、E6W、E6Y、P7*、P7A、P7D、P7E、P7F、P7G、P7H、P7I、P7K、P7L、P7M、P7N、P7Q、P7R、P7S、P7T、P7V、P7W、P7Y、D8*、D8A、D8E、D8F、D8G、D8H、D8I、D8K、D8L、D8M、D8N、D8P、D8Q、D8R、D8S、D8T、D8V、D8W、D8Y、A9*、A9D、A9E、A9F、A9G、A9H、A9I、A9K、A9L、A9M、A9N、A9P、A9Q、A9R、A9S、A9T、A9V、A9W、A9Y、T10*、T10A、T10D、T10E、T10F、T10G、T10H、T10I、T10K、T10L、T10M、T10N、T10P、T10Q、T10R、T10S、T10V、T10W、T10Y、S11*、S11A、S11D、S11E、S11F、S11G、S11H、S11I、S11K、S11L、S11M、S11N、S11P、S11Q、S11R、S11T、S11V、S11W、S11Y、V12*、V12A、V12D、V12E、V12F、V12G、V12H、V12I、V12K、V12L、V12M、V12N、V12P、V12Q、V12R、V12S、V12T、V12W、V12Y、E13*、E13A、E13D、E13F、E13G、E13H、E13I、E13K、E13L、E13M、E13N、E13P、E13Q、E13R、E13S、E13T、E13V、E13W、E13Y、N14*、N14A、N14D、N14E、N14F、N14G、N14H、N14I、N14K、N14L、N14M、N14P、N14Q、N14R、N14S、N14T、N14V、N14W、N14Y、V15*、V15A、V15D、V15E、V15F、V15G、V15H、V15I、V15K、V15L、V15M、V15N、V15P、V15Q、V15R、V15S、V15T、V15W、V15Y、A16*、A16D、A16E、A16F、A16G、A16H、A16I、A16K、A16L、A16M、A16N、A16P、A16Q、A16R、A16S、A16T、A16V、A16W、A16Y、L17*、L17A、L17D、L17E、L17F、L17G、L17H、L17I、L17K、L17M、L17N、L17P、L17Q、L17R、L17S、L17T、L17V、L17W、L17Y、K18*、K18A、K18D、K18E、K18F、K18G、K18H、K18I、K18L、K18M、K18N、K18P、K18Q、K18R、K18S、K18T、K18V、K18W、K18Y、T19*、T19A、T19D、T19E、T19F、T19G、T19H、T19I、T19K、T19L、T19M、T19N、T19P、T19Q、T19R、T19S、T19V、T19W、T19Y、G20*、G20A、G20D、G20E、G20F、G20H、G20I、G20K、G20L、G20M、G20N、G20P、G20Q、G20R、G20S、G20T、G20V、G20W、G20Y、S21*、S21A、S21D、S21E、S21F、S21G、S21H、S21I、S21K、S21L、S21M、S21N、S21P、S21Q、S21R、S21T、S21V、S21W、S21Y、G22*、G22A、G22D、G22E、G22F、G22H、G22I、G22K、G22L、G22M、G22N、G22P、G22Q、G22R、G22S、G22T、G22V、G22W、G22Y、D23*、D23A、D23E、D23F、D23G、D23H、D23I、D23K、D23L、D23M、D23N、D23P、D23Q、D23R、D23S、D23T、D23V、D23W、D23Y、S24*、S24A、S24D、S24E、S24F、S24G、S24H、S24I、S24K、S24L、S24M、S24N、S24P、S24Q、S24R、S24T、S24V、S24W、S24Y、Q25*、Q25A、Q25D、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25N、Q25P、Q25R、Q25S、Q25T、Q25V、Q25W、Q25Y、S26*、S26A、S26D、S26E、S26F、S26G、S26H、S26I、S26K、S26L、S26M、S26N、S26P、S26Q、S26R、S26T、S26V、S26W、S26Y、D27*、D27A、D27E、D27F、D27G、D27H、D27I、D27K、D27L、D27M、D27N、D27P、D27Q、D27R、D27S、D27T、D27V、D27W、D27Y、P28*、P28A、P28D、P28E、P28F、P28G、P28H、P28I、P28K、P28L、P28M、P28N、P28Q、P28R、P28S、P28T、P28V、P28W、P28Y、I29*、I29A、I29D、I29E、I29F、I29G、I29H、I29K、I29L、I29M、I29N、I29P、I29Q、I29R、I29S、I29T、I29V、I29W、I29Y、K30*、K30A、K30D、K30E、K30F、K30G、K30H、K30I、K30L、K30M、K30N、K30P、K30Q、K30R、K30S、K30T、K30V、K30W、K30Y、A31*、A31D、A31E、A31F、A31G、A31H、A31I、A31K、A31L、A31M、A31N、A31P、A31Q、A31R、A31S、A31T、A31V、A31W、A31Y、D32*、D32A、D32E、D32F、D32G、D32H、D32I、D32K、D32L、D32M、D32N、D32P、D32Q、D32R、D32S、D32T、D32V、D32W、D32Y、L33*、L33A、L33D、L33E、L33F、L33G、L33H、L33I、L33K、L33M、L33N、L33P、L33Q、L33R、L33S、L33T、L33V、L33W、L33Y、E34*、E34A、E34D、E34F、E34G、E34H、E34I、E34K、E34L、E34M、E34N、E34P、E34Q、E34R、E34S、E34T、E34V、E34W、E34Y、V35*、V35A、V35D、V35E、V35F、V35G、V35H、V35I、V35K、V35L、V35M、V35N、V35P、V35Q、V35R、V35S、V35T、V35W、V35Y、K36*、K36A、K36D、K36E、K36F、K36G、K36H、K36I、K36L、K36M、K36N、K36P、K36Q、K36R、K36S、K36T、K36V、K36W、K36Y、G37*、G37A、G37D、G37E、G37F、G37H、G37I、G37K、G37L、G37M、G37N、G37P、G37Q、G37R、G37S、G37T、G37V、G37W、G37Y、Q38*、Q38A、Q38D、Q38E、Q38F、Q38G、Q38H、Q38I、Q38K、Q38L、Q38M、Q38N、Q38P、Q38R、Q38S、Q38T、Q38V、Q38W、Q38Y、S39*、S39A、S39D、S39E、S39F、S39G、S39H、S39I、S39K、S39L、S39M、S39N、S39P、S39Q、S39R、S39T、S39V、S39W、S39Y、A40*、A40D、A40E、A40F、A40G、A40H、A40I、A40K、A40L、A40M、A40N、A40P、A40Q、A40R、A40S、A40T、A40V、A40W、A40Y、L41*、L41A、L41D、L41E、L41F、L41G、L41H、L41I、L41K、L41M、L41N、L41P、L41Q、L41R、L41S、L41T、L41V、L41W、L41Y、P42*、P42A、P42D、P42E、P42F、P42G、P42H、P42I、P42K、P42L、P42M、P42N、P42Q、P42R、P42S、P42T、P42V、P42W、P42Y、F43*、F43A、F43D、F43E、F43G、F43H、F43I、F43K、F43L、F43M、F43N、F43P、F43Q、F43R、F43S、F43T、F43V、F43W、F43Y、D44*、D44A、D44E、D44F、D44G、D44H、D44I、D44K、D44L、D44M、D44N、D44P、D44Q、D44R、D44S、D44T、D44V、D44W、D44Y、V45*、V45A、V45D、V45E、V45F、V45G、V45H、V45I、V45K、V45L、V45M、V45N、V45P、V45Q、V45R、V45S、V45T、V45W、V45Y、D46*、D46A、D46E、D46F、D46G、D46H、D46I、D46K、D46L、D46M、D46N、D46P、D46Q、D46R、D46S、D46T、D46V、D46W、D46Y、C47A、C47D、C47E、C47F、C47G、C47H、C47I、C47K、C47L、C47M、C47N、C47P、C47Q、C47R、C47S、C47T、C47V、C47W、C47Y、W48*、W48A、W48D、W48E、W48F、W48G、W48H、W48I、W48K、W48L、W48M、W48N、W48P、W48Q、W48R、W48S、W48T、W48V、W48Y、A49*、A49D、A49E、A49F、A49G、A49H、A49I、A49K、A49L、A49M、A49N、A49P、A49Q、A49R、A49S、A49T、A49V、A49W、A49Y、I50*、I50A、I50D、I50E、I50F、I50G、I50H、I50K、I50L、I50M、I50N、I50P、I50Q、I50R、I50S、I50T、I50V、I50W、I50Y、L51*、L51A、L51D、L51E、L51F、L51G、L51H、L51I、L51K、L51M、L51N、L51P、L51Q、L51R、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、K53*、K53A、K53D、K53E、K53F、K53G、K53H、K53I、K53L、K53M、K53N、K53P、K53Q、K53R、K53S、K53T、K53V、K53W、K53Y、G54*、G54A、G54D、G54E、G54F、G54H、G54I、G54K、G54L、G54M、G54N、G54P、G54Q、G54R、G54S、G54T、G54V、G54W、G54Y、A55*、A55D、A55E、A55F、A55G、A55H、A55I、A55K、A55L、A55M、A55N、A55P、A55Q、A55R、A55S、A55T、A55V、A55W、A55Y、P56*、P56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N191Q、N191R、N191S、N191T、N191V、N191W、N191Y、K192*、K192A、K192D、K192E、K192F、K192G、K192H、K192I、K192L、K192M、K192N、K192P、K192Q、K192R、K192S、K192T、K192V、K192W、K192Y、N193*、N193A、N193D、N193E、N193F、N193G、N193H、N193I、N193K、N193L、N193M、N193P、N193Q、N193R、N193S、N193T、N193V、N193W、N193Y、I194*、I194A、I194D、I194E、I194F、I194G、I194H、I194K、I194L、I194M、I194N、I194P、I194Q、I194R、I194S、I194T、I194V、I194W、I194Y、A195*、A195D、A195E、A195F、A195G、A195H、A195I、A195K、A195L、A195M、A195N、A195P、A195Q、A195R、A195S、A195T、A195V、A195W、A195Y、G196*、G196A、G196D、G196E、G196F、G196H、G196I、G196K、G196L、G196M、G196N、G196P、G196Q、G196R、G196S、G196T、G196V、G196W、G196Y、D197*、D197A、D197E、D197F、D197G、D197H、D197I、D197K、D197L、D197M、D197N、D197P、D197Q、D197R、D197S、D197T、D197V、D197W、D197Y、W198*、W198A、W198D、W198E、W198F、W198G、W198H、W198I、W198K、W198L、W198M、W198N、W198P、W198Q、W198R、W198S、W198T、W198V、W198Y、G199*、G199A、G199D、G199E、G199F、G199H、G199I、G199K、G199L、G199M、G199N、G199P、G199Q、G199R、G199S、G199T、G199V、G199W、G199Y、F200*、F200A、F200D、F200E、F200G、F200H、F200I、F200K、F200L、F200M、F200N、F200P、F200Q、F200R、F200S、F200T、F200V、F200W、F200Y、D201*、D201A、D201E、D201F、D201G、D201H、D201I、D201K、D201L、D201M、D201N、D201P、D201Q、D201R、D201S、D201T、D201V、D201W、D201Y、P202*、P202A、P202D、P202E、P202F、P202G、P202H、P202I、P202K、P202L、P202M、P202N、P202Q、P202R、P202S、P202T、P202V、P202W、P202Y、A203*、A203D、A203E、A203F、A203G、A203H、A203I、A203K、A203L、A203M、A203N、A203P、A203Q、A203R、A203S、A203T、A203V、A203W、A203Y、K204*、K204A、K204D、K204E、K204F、K204G、K204H、K204I、K204L、K204M、K204N、K204P、K204Q、K204R、K204S、K204T、K204V、K204W、K204Y、W205*、W205A、W205D、W205E、W205F、W205G、W205H、W205I、W205K、W205L、W205M、W205N、W205P、W205Q、W205R、W205S、W205T、W205V、W205Y、A206*、A206D、A206E、A206F、A206G、A206H、A206I、A206K、A206L、A206M、A206N、A206P、A206Q、A206R、A206S、A206T、A206V、A206W、A206Y、Y207*、Y207A、Y207D、Y207E、Y207F、Y207G、Y207H、Y207I、Y207K、Y207L、Y207M、Y207N、Y207P、Y207Q、Y207R、Y207S、Y207T、Y207V、Y207W、Q208*、Q208A、Q208D、Q208E、Q208F、Q208G、Q208H、Q208I、Q208K、Q208L、Q208M、Q208N、Q208P、Q208R、Q208S、Q208T、Q208V、Q208W、Q208Y、Y209*、Y209A、Y209D、Y209E、Y209F、Y209G、Y209H、Y209I、Y209K、Y209L、Y209M、Y209N、Y209P、Y209Q、Y209R、Y209S、Y209T、Y209V、Y209W、D210*、D210A、D210E、D210F、D210G、D210H、D210I、D210K、D210L、D210M、D210N、D210P、D210Q、D210R、D210S、D210T、D210V、D210W、D210Y、E211*、E211A、E211D、E211F、E211G、E211H、E211I、E211K、E211L、E211M、E211N、E211P、E211Q、E211R、E211S、E211T、E211V、E211W、E211Y、K212*、K212A、K212D、K212E、K212F、K212G、K212H、K212I、K212L、K212M、K212N、K212P、K212Q、K212R、K212S、K212T、K212V、K212W、K212Y、N213*、N213A、N213D、N213E、N213F、N213G、N213H、N213I、N213K、N213L、N213M、N213P、N213Q、N213R、N213S、N213T、N213V、N213W、N213Y、N214*、N214A、N214D、N214E、N214F、N214G、N214H、N214I、N214K、N214L、N214M、N214P、N214Q、N214R、N214S、N214T、N214V、N214W、N214Y、K215*、K215A、K215D、K215E、K215F、K215G、K215H、K215I、K215L、K215M、K215N、K215P、K215Q、K215R、K215S、K215T、K215V、K215W、K215Y、F216*、F216A、F216D、F216E、F216G、F216H、F216I、F216K、F216L、F216M、F216N、F216P、F216Q、F216R、F216S、F216T、F216V、F216W、F216Y、N217*、N217A、N217D、N217E、N217F、N217G、N217H、N217I、N217K、N217L、N217M、N217P、N217Q、N217R、N217S、N217T、N217V、N217W、N217Y、Y218*、Y218A、Y218D、Y218E、Y218F、Y218G、Y218H、Y218I、Y218K、Y218L、Y218M、Y218N、Y218P、Y218Q、Y218R、Y218S、Y218T、Y218V、Y218W、V219*、V219A、V219D、V219E、V219F、V219G、V219H、V219I、V219K、V219L、V219M、V219N、V219P、V219Q、V219R、V219S、V219T、V219W、V219Y、G220*、G220A、G220D、G220E、G220F、G220H、G220I、G220K、G220L、G220M、G220N、G220P、G220Q、G220R、G220S、G220T、G220V、G220W、G220Y、K221*、K221A、K221D、K221E、K221F、K221G、K221H、K221I、K221L、K221M、K221N、K221P、K221Q、K221R、K221S、K221T、K221V、K221W以及K221Y。
14.根据实施例11-13中任一项所述的方法,其中该DNA酶变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少60%,例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。
测定和洗涤剂组合物
标准洗涤剂A组合物(液体)
成分:12%LAS、11%AEO Biosoft N25-7(NI)、7%AEOS(SLES)、6%MPG(丙二醇)、3%乙醇、3%TEA、2.75%可可皂、2.75%大豆皂、2%甘油、2%氢氧化钠、2%柠檬酸钠、1%甲酸钠、0.2%DTMPA和0.2%PCA(所有的百分数都是w/w)
标准洗涤剂T组合物(粉末)
成分:11%LAS、2%AS/AEOS、2%肥皂、3%AEO、15.15%碳酸钠、3%硅酸钠、18.75%沸石、0.15%螯合剂、2%柠檬酸钠、1.65%AA/MA共聚物、2.5%CMC和0.5%SRP(所有的百分数都是w/w)。
标准洗涤剂X组合物(粉末)
成分:16.5%LAS、15%沸石、12%二硅酸钠、20%碳酸钠、1%sokalan、35.5%硫酸钠(所有的百分数都是w/w)。
测定I:DNA酶活性测试
在具有甲基绿(BD公司,富兰克林湖,新泽西州,美国)的DNA酶测试琼脂上确定DNA酶活性。简言之,将21g琼脂溶于500ml水中,并且然后在121℃下高压灭菌15min。将高压蒸汽处理的琼脂在水浴中温和至48℃,并且将20ml的琼脂倒入培养皿并且允许在室温下通过孵育来固化。在固化的琼脂平板上,添加5μl的酶溶液,并且DNA酶活性被观察为斑点酶溶液周围的无色区域。
测定II:使用电子鼻分析纺织品上的E-2-壬烯醛。
一种测试纺织品上的恶臭的存在的方式是通过使用作为恶臭的标志物的E-2-壬烯醛,因为此化合物引起衣物上的恶臭。
将E-2-壬烯醛的溶液添加至5cm x 5cm纺织品小块布样上并且将该小块布样放入20mL玻璃小瓶中用于GC分析并且盖住该小瓶。在40℃孵育20分钟后,在来自法国阿尔法M.O.S.(Alpha M.O.S.)的Heracles II电子鼻中分析来自加帽小瓶的5mL顶部空间(具有2个FID的双柱气相色谱仪,柱1:MXT5并且柱2:MXT1701)。
方法
PCR、克隆、连接核苷酸等的一般方法是本领域普通技术人员熟知的并且可以例如发现于“Molecular cloning:A laboratory manual[分子克隆:实验室手册])”,Sambrook等人(1989),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor lab.),冷泉港,纽约;Ausubel,F.M.等人(编辑);“Current protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南])”,约翰威立父子公司(John Wiley and Sons),(1995);Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编辑);“DNACloning:A Practical Approach[DNA克隆:实用方法],I和II卷”,D.N.Glover编辑(1985);“Oligonucleotide Synthesis”[寡核苷酸合成]),M.J.Gait编辑(1984);“Nucleic AcidHybridization[核酸杂交]”,B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985);“A Practical GuideTo Molecular Cloning[分子克隆实用指南]”,B.Perbal(1984)。
实例
实例1:DNA酶变体的制备
使用包含所希望的新突变的特异性引物产生定点变体(SD)。所选择的新的密码子是具有针对在米曲霉中具体氨基酸的最高自然丰度的密码子。按两轮PCR制备转化底物:
1)相对于突变位点,分别扩增N-末端片段和C-末端片段。使用通用正向引物和位置特异性反向引物扩增N-末端片段。使用突变特异性正向引物和通用反向引物扩增C-末端片段。两种通用引物都与曲霉属基因组中同源整合所必需的序列互补。
2)通过融合(SOE)PCR组装N-末端和C-末端片段。
将所得转化底物转化到米曲霉中,并将通过在硝酸盐上生长而选择的转化体作为唯一的氮源。将每种类型的三个单菌落挑取到MTP中,并在30℃在对曲霉属特异性肉汤中使其生长4天。将上清液用于筛选。
实例2:测验DNA酶变体的稳定性
与具有SEQ ID NO:1的DNA酶相比,通过在限定的条件(“胁迫条件”)下,在标准洗涤剂溶液(标准洗涤剂A)中孵育DNA酶样品来测定DNA酶变体的稳定性。使用由温度和持续时间给出的两组不同的条件(胁迫条件)来测试变体。
A)选择A组,使得具有SEQ ID NO:1的DNA酶的剩余活性等于限定条件(“参照条件”)下孵育类似样品的活性的大约50%,该限定条件使相同持续时间的孵育时不会导致活性损失。如下所述将样品由活性标准化,并将经标准化的样品在PCR仪中在50℃进行应激持续20hrs。在胁迫条件或参照条件下使用以下所描述的粘度测定确定孵育后的活性。
B)选择B组,使得具有SEQ ID NO:1的DNA酶的剩余活性等于限定条件(“参照条件”)下孵育类似样品的活性的大约20%,该限定条件使相同持续时间的孵育时不会导致活性损失。如下所述将样品通过ELISA标准化,并将经标准化的样品在加热柜中在50℃进行应激持续72hrs。在胁迫条件或参照条件下使用以下所描述的粘度测定确定孵育后的活性。
由活性对样品进行标准化
将具有表达DNA酶变体的曲霉属培养物上清液的96孔板在BioSan Thermo-Shaker(PST-100HL)上以600rpm振摇2分钟,然后加载到装备有96通道TADM头的Hamilton STAR机器人上,这种头可以同时测量每个单独的移液器通道的顶部空间的压力。将来自96孔的每个孔中的10μl上清液转移至空板的96孔中,其中每个孔含有90μl 50mM Tris-HCl,pH 7。从96孔的每个孔中,将5μl的该10x稀释物转移至新的板中,其中每个孔含有195μl的DNA底物(3.3mg DNA/ml,50mM Tris-HCl,5mM MgCl2pH 7;DNA:来自鲑鱼测试的脱氧核糖核酸钠盐,Sigma D1626)。
如在(WO 2011/107472A1)中的描述使用ViPr测定技术,在全部的96孔溶液中持续30min以1min时间间隔通过用标准清洁CORE 300μl吸头以50μl/s的速度吸入100μl,Hamilton STAR测量粘度,在第二测量后另外添加稀释的DNA酶样品。以10μl/s将溶液分配回到初始孔中。
收集吸入步骤过程中来自全部96个孔的压力数据,并且在吸入开始后取在1000ms处的压力值用于以相对单位(RU)计算DNA酶活性,该相对单位来自加载到每个板上的标准品。在每个板上的标准品是1ppm wt、5ppm wt和10ppm wt DNA酶,并且并且是复制品。通过将缓冲值(空白;1000ms)除以给定样本的压力值(1000ms)减去1来计算相对单位。绘制标准曲线的相对单位与浓度的关系曲线,并应用线性曲线拟合。从样品的RU值,可以使用标准曲线获得以ppm为单位的浓度。基于浓度测定,将初始样品标准化为在50mM Tris HCL pH 7中10ppm或对于随后的稳定性筛选,在低表达变体的情况下标准化为最大可获得的浓度。
通过ELISA测定法对样品进行标准化用于蛋白质含量测定
通过ELISA,在TBS-T缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl,0.1v/v Tween 20,pH 7.5)中将上清液9750-倍稀释后,可替代地测定DNA酶变体和参照DNA酶(SEQ ID NO:1)浓度。对于蛋白质定量,使用夹心ELISA技术。包被有兔多克隆抗蛋白质抗体的微板孔构成固相。测试样品,标准样和对照被添加至包被的孔中,并与孵育缓冲液一起孵育。如果感兴趣的蛋白存在于测试样品中,它将会被捕获并通过包被在孔中的蛋白质特异性抗体固定。孵育和洗涤后,将另一种多克隆抗蛋白抗体添加至孔中。用辣根过氧化物酶(HRP)标记此抗体。HRP标记的抗体结合至感兴趣的固定的蛋白质,从而形成夹心。孵育和洗涤后,将酶底物添加至孔中并且孵育。固定的HRP的酶活性的程度是通过在620nm,测量孔中氧化酶产物的光密度来确定。在620nm的吸光度是与测试样品中的蛋白质的量成比例的。一组标准样被用于产生吸光度对比蛋白质浓度的标准曲线。该曲线用于计算测试样品和对照的浓度。基于浓度测定,将初始样品标准化为在50mM Tris HCL pH 7中10ppm。
稳定性测定
将DNA酶标准品(0ppm、5ppm和10ppm)添加至含有标准化为10+ppm或当低于10ppm下的最大可获得的浓度的样品的标准板中。将来自标准化板的12μl样品添加至在标准96孔微量滴定板的孔中的228μl标准洗涤剂A中。通过以2000rpm振摇90秒使用安装在HamiltonSTAR上的汉密尔顿加热摇床(Hamilton Heater Shaker)(HHS)将洗涤剂和样品混合。混合后,吸入200μl的样品并且将80μl的样品添加至两个96孔PCR板的所有孔中。将这些板密封并且将一个板在4℃(未应激的)储存,同时将复制平板分别在PCR仪中在50℃(应激的)孵育持续20小时,或在加热柜中孵育持续72小时。
残余活性测定
分别将来自柱1-6或7-12来自应激的和未应激的平板的10μl的样品转移至标准的96孔板中,其中将每个孔填充有190μl的DNA酶底物(3.3mg DNA/ml,50mM Tris-HCl,5mMMgCl2pH 7;DNA:来自鲑鱼测试的脱氧核糖核酸钠盐,Sigma D1626)。随后通过连续5次吸入和100μl体积的分配步骤将应激的和未应激的样品进行混合。将这些平板混合后在37℃孵育持续1.5h,随后在室温孵育持续30min。
随后通过连续5次吸入和100μl体积的分配步骤以及在装备有96通道TADM头的Hamilton STAR中使用VIPR(WO 2011/107472A1)以吸入速度为50μl/s对粘度进行测量。收集吸入步骤过程中来自全部96个孔的压力数据,并且针对4次最后的吸入步骤在吸入开始后计算1000ms处的平均压力值;同时针对包含缓冲空白和置于每个板中的参照样品(SEQID NO:1)的应激的和未应激的样品计算平均压力值。通过将缓冲值(空白;1000ms)除以给定样本的压力值(1000ms)减去1来计算相对单位。同时针对应激的和未应激的样品来计算。针对应激的和未应激的样品以百分比计算RU之间的比率,该比率等同于残余活性(RA%)。
半衰期改进因子
半衰期改进因子(IF)将DNA酶变体的残余活性百分比(RA%)与参照DNA酶(SEQ IDNO:1)的残余活性百分比(RA%)向关联。按照以下公式基于残余活性百分比计算改进因子:
IF=(ln(0.5)/ln(变体的RA%))/(ln(0.5)/ln(SEQ ID NO:1的RA%))
所使用的参照DNA酶(SEQ ID NO:1)的RA%值总是从与DNA酶变体相同的筛选板上存留的样品计算。将以下标准用于限制给定样品的数据:针对未应激的样品的样品的压力值(1000ms)必须低于-400Pa,针对未应激的样品的计算的相对单位必须在0.2和2之间,计算的残余活性百分比(RA%)应该在0和100%之间,以及参照DNA酶的RA%必须在10%和60%之间。
改进因子大于1(IF>1)表明与对照相比,变体的改进的稳定性,而IF为1(IF=1)鉴定与对照具有同等水平的变体,并且小于1(IF<1)的IF鉴定比对照更不稳定的变体。
使用考虑三个生物重复之间计算的改进因子的变化的等级,将改进因子以从1-3的等级进行排列。另外,使用两种不同的等级来解释当改变筛选条件时A组和B组之间的IF变化。用于从A组排列IF的间隔是:
1:IF<1.25
2:1.25<=IF<2
3:2<=IF
用于从B组排列IF的间隔是:
1:IF<1.5
2:1.5<=IF<3
3:3<=IF
对于每种变体,将来自三个生物重复的排列合并为总分。当可以计算所有三个生物重复的值时,使用排列的中位数。当代表两个生物复制时使用最低排列,而当仅获得单数值时排列被忽略。
用于选择DNA酶变体的测定排列和得分列于下表1中:
表1
序列表
<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)
<120> 多肽变体
<130> 14031-WO-PCT
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 221
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 1
Val Pro Val Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Ser Val Glu Asn Val Ala
1 5 10 15
Leu Lys Thr Gly Ser Gly Asp Ser Gln Ser Asp Pro Ile Lys Ala Asp
20 25 30
Leu Glu Val Lys Gly Gln Ser Ala Leu Pro Phe Asp Val Asp Cys Trp
35 40 45
Ala Ile Leu Cys Lys Gly Ala Pro Asn Val Leu Gln Arg Val Asn Glu
50 55 60
Lys Thr Lys Asn Ser Asn Arg Asp Arg Ser Gly Ala Asn Lys Gly Pro
65 70 75 80
Phe Lys Asp Pro Gln Lys Trp Gly Ile Lys Ala Leu Pro Pro Lys Asn
85 90 95
Pro Ser Trp Ser Ala Gln Asp Phe Lys Ser Pro Glu Glu Tyr Ala Phe
100 105 110
Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Thr Asn Ala Ile Leu Ala Pro Val Asn
115 120 125
Leu Ala Ser Gln Asn Ser Gln Gly Gly Val Leu Asn Gly Phe Tyr Ser
130 135 140
Ala Asn Lys Val Ala Gln Phe Asp Pro Ser Lys Pro Gln Gln Thr Lys
145 150 155 160
Gly Thr Trp Phe Gln Ile Thr Lys Phe Thr Gly Ala Ala Gly Pro Tyr
165 170 175
Cys Lys Ala Leu Gly Ser Asn Asp Lys Ser Val Cys Asp Lys Asn Lys
180 185 190
Asn Ile Ala Gly Asp Trp Gly Phe Asp Pro Ala Lys Trp Ala Tyr Gln
195 200 205
Tyr Asp Glu Lys Asn Asn Lys Phe Asn Tyr Val Gly Lys
210 215 220
Claims (16)
1.一种DNA酶变体,其包括在对应于以下位置的一个或多个位置处的取代:SEQ ID NO:1的4、17、19、19、19、36、38、39、39、40、40、41、41、45、51、53、53、54、55、57、64、64、64、64、64、64、66、67、67、68、68、68、68、69、69、69、69、69、69、69、69、70、70、70、71、72、74、74、75、77、82、82、83、83、83、83、83、84、85、85、85、86、86、86、88、88、91、99、101、105、105、105、105、106、115、116、135、136、138、138、138、138、139、140、140、140、141、151、152、152、152、152、153、154、162、163、164、166、166、168、169、169、173、173、173、182、183、184、185、186、189、189、212、212和215,其中该变体与SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少80%的序列一致性,其中该变体具有DNA酶活性,并且其中与SEQ ID NO 1相比,该变体具有改进的稳定性。
2.如权利要求1所述的DNA酶变体,其中该变体包括选自下组的一个或多个取代,该组由以下组成:N4E、L17E、T19A、T19G、T19I、K36P、Q38P、S39V、S39R、A40P、A40H、L41T、L41H、V45H、L51G、K53T、K53P、G54P、A55P、N57H、E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I、E64S、T66H、K67A、K67T、N68V、N68P、N68I、N68H、S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y、S69Q、N70T、N70H、N70G、R71T、D72E、S74H、S74G、G75I、N77T、K82P、K82I、D83T、D83P、D83I、D83H、D83G、P84H、Q85T、Q85P、Q85H、K86T、K86P、K86H、G88P、G88H、A91P、W99T、A101W、K105E、K105N、K105T、K105D、S106T、S115T、L116I、Q135L、G136L、V138I、V138L、V138P、V138Q、L139A、N140R、N140L、N140A、G141L、F151R、D152Y、D152L、D152I、D152A、P153E、S154R、T162R、W163E、F164R、I166Y、I166R、K168N、F169R、F169E、A173I、A173R、A173T、S182R、N183E、D184I、K185Y、S186I、D189G、D189H、K212G、K212P和K215I,其中这些位置对应于SEQ ID NO 1的位置。
3.根据权利要求1或2所述的DNA酶变体,其中与在SEQ ID NO:1中显示的多肽相比,该DNA酶变体具有至少为1.1;1.5;2.0;3.0、3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10的改进因子(IF)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体,其中与SEQ ID NO:1相比,改变的总数目是1-20个,例如1-10个和1-5个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
6.一种组合物,其包括根据权利要求1至5中任一项所述的DNA酶变体,其中该组合物包括:
a)至少0.002ppm DNA酶变体,任选地
b)2wt%至60wt%的至少一种表面活性剂,任选地
c)5wt%至50wt%的至少一种助洗剂,和/或任选地至少一种另外的酶。
7.如权利要求6所述的组合物,其中该组合物是洗涤剂组合物。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的组合物,其中该组合物进一步包括选自下组的一种或多种另外的酶,该组由以下组成:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶,或其任何混合物。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的组合物,其处于以下形式:棒,均匀的片剂,具有两层或更多层的片剂,具有一个或多个室的袋,规则的或压缩的粉末,颗粒,膏,凝胶,或者规则的、压缩的或浓缩的液体。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的组合物在清洁过程如洗衣或硬表面清洁如餐具清洗中的用途。
11.一种用于获得DNA酶变体的方法,该方法包括
(a)将一个或多个位置处的改变引入亲本DNA酶中,这些位置对应于SEQ ID NO:1的以下位置:4、17、19、19、19、36、38、39、39、40、40、41、41、45、51、53、53、54、55、57、64、64、64、64、64、64、66、67、67、68、68、68、68、69、69、69、69、69、69、69、69、70、70、70、71、72、74、74、75、77、82、82、83、83、83、83、83、84、85、85、85、86、86、86、88、88、91、99、101、105、105、105、105、106、115、116、135、136、138、138、138、138、139、140、140、140、141、151、152、152、152、152、153、154、162、163、164、166、166、168、169、169、173、173、173、182、183、184、185、186、189、189、212、212或215,其中该变体具有与SEQ ID NO 1至少80%一致的氨基酸序列,并且
(b)回收该变体。
12.如权利要求11所述的方法,其中与SEQ ID NO:1相比,该变体包括两个、三个、四个或五个改变。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法,其中与SEQ ID NO:1相比,该DNA酶变体包括选自下组的一个或多个取代,该组由以下组成:N4E、L17E、T19A、T19G、T19I、K36P、Q38P、S39V、S39R、A40P、A40H、L41T、L41H、V45H、L51G、K53T、K53P、G54P、A55P、N57H、E64A、E64Q、E64R、E64T、E64I、E64S、T66H、K67A、K67T、N68V、N68P、N68I、N68H、S69A、S69D、S69E、S69K、S69L、S69W、S69Y、S69Q、N70T、N70H、N70G、R71T、D72E、S74H、S74G、G75I、N77T、K82P、K82I、D83T、D83P、D83I、D83H、D83G、P84H、Q85T、Q85P、Q85H、K86T、K86P、K86H、G88P、G88H、A91P、W99T、A101W、K105E、K105N、K105T、K105D、S106T、S115T、L116I、Q135L、G136L、V138I、V138L、V138P、V138Q、L139A、N140R、N140L、N140A、G141L、F151R、D152Y、D152L、D152I、D152A、P153E、S154R、T162R、W163E、F164R、I166Y、I166R、K168N、F169R、F169E、A173I、A173R、A173T、S182R、N183E、D184I、K185Y、S186I、D189G、D189H、K212G、K212P和K215I。
14.根据权利要求11或12所述的方法,其中引入该亲本DNA酶中的改变是在位置84、88、139、179或180的一个或多个中的氨基酸缺失。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法,其中该亲本DNA酶是包含在SEQ ID NO1中显示的氨基酸序列的多肽或与其具有至少80%序列一致性的多肽。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法,其中该DNA酶变体与在SEQ ID NO:1中显示的多肽具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。
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