JP6185243B2 - キレート剤存在下で高安定な変異体及び変異体含有組成物 - Google Patents

キレート剤存在下で高安定な変異体及び変異体含有組成物 Download PDF

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Description

本発明は、キレート剤に対する安定性が親酵素と比べて改善されたα−アミラーゼの変異体、当該変異体を含む組成物、当該変異体をコード化する核酸、当該変異体を製造する方法、及び、当該変異体を使用する方法に関する。
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、E.C. 3.2.1.1）は、でんぷん等の直鎖及び分岐鎖の１，４−グルコシドオリゴ糖及び多糖類の加水分解を触媒する酵素群である。
α−アミラーゼの産業用途、例えば洗剤、ベーキング、醸造、でんぷん液化及び糖化、例えばブドウ糖果糖液糖（high fructose syrups）等の調製、又はでんぷんからのエタノール産生の一部としての用途には、長い歴史がある。これらに代表されるα−アミラーゼの用途の多くは、微生物由来のα−アミラーゼ、特に細菌性のα−アミラーゼを利用する。
初めて利用された細菌性α−アミラーゼの１つであるＢ．リケニホルミス（B. licheniformis）由来のα−アミラーゼ、通称ターマミル（Termamyl）は、特徴付けが進んでおり、この酵素の結晶構造が決定されている。アルカリ性アミラーゼ、例えば国際公開第９５／２６３９７号等に開示のバシラス属（Bacillus sp.）由来のα−アミラーゼ等は、洗剤への応用がなされてきた特定のα−アミラーゼ類である。これら公知の細菌性アミラーゼの多くは、特定の用途における機能性を向上させるべく、修飾がなされてきた。
ターマミル及び高効率α−アミラーゼの多くは、活性となるためにカルシウムを必要とする。ターマミルの結晶構造は、負帯電アミノ酸残基によって配位されたα−アミラーゼ構造内に４つのカルシウム原子が結合したものであった。他のα−アミラーゼでは、当該構造内に結合するカルシウムイオン数は異なる場合がある。このようにカルシウムを必須とする点は、例えば洗剤への使用や全粒粉からのエタノール産生等のように、強キレート化合物が存在する用途では不利であった。
上述のように、多くの酵素が、活性及び安定性の両面で、カルシウムや他の金属イオン、例えばマグネシウム又は亜鉛等に依存していることが知られている。このため、例えばキレート剤を含む洗剤やバイオ燃料の産生に使用される組成物（植物材料や含でんぷん材料は、例えばフィチン酸等のキレート剤を天然成分として含有する）等のキレート剤含有組成物内でも、安定であると同時に優れた性能を示す酵素を開発するのは、困難な課題である。キレート剤は例えば、洗浄時の水硬度の低減や、漂白剤が存在する場合にはこれを保護するために、添加又は含入される。また、キレート剤は、一部の汚れの除去にも直接影響を与える。洗剤中のカルシウム依存酵素の安定性は、洗剤にカルシウムを添加することによって改善される場合があるものの、これによって汚れ除去効果が損なわれる場合も多い。更に、液体洗剤にカルシウムを加えると、製剤上の課題、即ち洗剤の物理的安定性に関する課題を生じる場合もある。
従って、キレート剤に対して安定であるとともに、好ましくは親α−アミラーゼと比較して、洗浄性能が維持又は増強された組成物及びα−アミラーゼの変異体を提供できれば、有益だと考えられる。
即ち、本発明の第１の側面は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
別の側面は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ８で測定した場合に、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸（citrate）濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
本発明は更に、ポリペプチドを調製する方法であって、
（ａ）アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を用意し、
（ｂ）配列番号６の成熟ポリペプチドの位置195、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置を占める１又は２以上のアミノ酸を選択すると共に、更に位置116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447又は458に対応する１又は２以上の位置を選択し、
（ｃ）前記選択されたアミノ酸残基の置換若しくは欠失、又は前記選択されたアミノ酸残基に隣接する１又は２以上のアミノ酸残基の挿入により前記配列を修飾し、
（ｄ）前記修飾された配列を有する変異ポリペプチドを生成し、
（ｅ）前記変異ポリペプチドをアミラーゼ活性及び安定性について検証し、
（ｆ）アミラーゼ活性を有すると共に、前記親ポリペプチドと比較してキレート剤存在下の安定性が向上した変異ポリペプチドを選択し、
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、方法に関する。
好ましい側面によれば、本発明は、親α−アミラーゼの変異体であって、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含むと共に、更に116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（i） 前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii） 前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体に関する。
別の側面によれば、本発明は、親α−アミラーゼの変異体であって、181、182、183、又は184のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、更に116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（i） 前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii） 前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体に関する。
本発明は更に、本発明の変異体をコード化する単離ヌクレオチド配列、及び、本発明に係る変異体をコード化するヌクレオチド配列を含む組換宿主細胞に関する。
定義
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、E.C. 3.2.1.1）は、でんぷん等の直鎖及び分岐鎖の１，４−グルコシドオリゴ糖及び多糖類の加水分解を触媒する酵素群である。α−アミラーゼは種々の生物から得られることが知られている。例としては細菌、例えばバシラス属（the genus Bacillus）の各種、例えばバシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）；真菌の各種、例えばアスペルギウス・オリザエ（Aspergillus oryzae）（ＴＡＫＡ−アミラーゼ）又はアスペルギウス・ニジェール（Aspergillus niger）；植物、例えば大麦；及び哺乳類等が挙げられる。
野生型酵素：「野生型」（wild-type）α−アミラーゼという語は、天然微生物、例えば天然に見出される細菌、酵母又は糸状菌等によって発現されるα−アミラーゼを意味する。「野生型酵素」（wild-type enzyme）という語と「親酵素」（parent enzyme）という語は、親酵素が変異体酵素でない場合、相互交換可能に使用し得る。
変異体酵素：本明細書において「変異体」（variant）という語は、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドであって、親又は野生型α−アミラーゼの１又は２以上の（或いは１又は数個の）特定の位置における１又は２以上の（或いは１又は数個の）アミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失等の改変を含むポリペプチドとして定義される。修飾数は５０未満が好ましく、３０未満がより好ましい。改変α−アミラーゼは親α−アミラーゼの修飾により人為的に得られる。
親酵素：本明細書で使用される「親」（parent）α−アミラーゼという語は、本発明の変異体α−アミラーゼを産生するべく修飾を施す対象となるα−アミラーゼを意味する。この語はまた、本発明の変異体の比較対象となるポリペプチドも指す。親は天然（野生型）ポリペプチドであってもよく、任意の適切な手法で調製されたその変異体であってもよい。例えば、親タンパク質は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列が修飾又は改変された変異体であってもよい。即ち、親α−アミラーゼは、１又は２以上の（或いは１又は数個の）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有していてもよい。即ち、親α−アミラーゼは、親α−アミラーゼの変異体であってもよい。また、親は対立遺伝子多型であってもよい。対立遺伝子多型（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の何れかによってコードされるポリペプチドである。
改善された特性：本明細書において「改善された特性」（improved property）とは、変異体に伴う特性であって、親α−アミラーゼと比較して改善された特性として定義される。斯かる改善された特性としては、これらに限定されるものではないが、本明細書の実施例に記載の EnzChek アッセイ又は PNP-G7 アッセイで測定した場合に、向上したアミロース分解活性、例えば向上した洗浄性能、例えばよごれ性能、例えばでんぷん含有よごれに対する性能、汚れ除去、退色防止、安定性、例えば熱安定性、ｐＨ安定性、キレート剤等の助剤（builder）存在下での安定性、粉末、液体又はゲルの洗剤処方又は食器洗い組成物中での安定性、改変された温度依存性能及び活性プロファイル、ｐＨ活性、基質特異性、生成物特異性、及び化学的安定性等が挙げられる。洗浄性能及び／又は食器洗浄性能は、本明細書の「材料及び方法」の記載に従って測定可能である。本発明の変異体は、改善された特性の組み合わせ、例えば、改善された安定性、改善された洗浄性能、改善された食器洗浄性能及び／又は改善された洗剤中での活性を有することが好ましい。改善された安定性には、保存時の濃縮洗剤製品中における安定性と、洗浄時の希釈洗剤中における安定性の双方が含まれる。改善された特性には、低温での改善された洗浄又は食器洗浄性能が含まれる。
活性：本発明との関連において「活性」（activity）という語は、アミロース分解活性のことをいう。これは、３以上の１，４−α−結合Ｄ−グルコース単位を含む多糖（でんぷん等）について、単位時間当たり単位量の酵素タンパク質によって特定条件下で加水分解される１，４−α−Ｄ−グリコシド結合の数によって測定される活性であり、例えば単位量の酵素タンパク質の酵素サンプル１ｍＬ当たり特定条件下で得られる活性である。活性は例えば、本明細書の「材料及び方法」に記載の EnzChek アッセイ又は PNP-G7 アッセイで測定することができる。本願において「活性」（activity）という語は、「アミロース分解活性」（amylolytic activity）と相互交換可能に使用される。「比活性」（specific activity）という語は、酵素タンパク質１ｍＬ（単位量）当たり得られる最大活性を表すのにしばしば用いられる。
改善された化学的安定性：本明細書において「改善された化学的安定性」（improved chemical stability）という語は、親酵素の酵素活性を低減する１又は複数の（天然又は合成の）化学物質の存在下で一定期間インキュベートした後に、酵素活性が維持される変異体酵素として定義される。改善された化学的安定性は、斯かる化学物質の存在下でも首尾よく反応を触媒し得る変異体にも繋がる。本発明の特定の側面によれば、改善された化学的安定性は、洗剤において、特に液体洗剤において改善された安定性である。改善された洗剤安定性は特に、キレート剤を含む液体洗剤処方（ここで液体にはゲルやペーストも含まれる）に本発明のα−アミラーゼ変異体を混合した場合における、α−アミラーゼ活性の改善された安定性である。ここで液体洗剤処方は、洗濯又は自動食器洗浄プロセスにおいて添加される濃縮洗剤や、洗浄溶液（即ち水溶液に濃縮洗剤を添加してなる溶液）等の希釈洗剤をも指すものとする。
本発明において、液体洗剤は、特に洗濯用液体洗剤として有用である。
安定性：「安定性」（stability）という語は、保存安定性、及び使用の間の、例えば洗浄プロセス又は別の産業プロセスの間の安定性を含み、時間に応じたアミラーゼの安定性、例えばアミラーゼが溶液中、特に洗剤溶液中に保存された場合にどの程度の活性が保持されるのか、を反映する。例えば、α−アミラーゼ変異体は、３１℃で１８時間後に、７０％超の残存活性、即ちどの程度の活性が保持されるか、を有し得る。安定性は、多くの要因、例えばｐＨ、温度、洗剤組成物、例えば助剤、界面活性剤等の量及び種類により、影響を受ける。アミラーゼ安定性は、「材料及び方法」に記載の EnzCheck アッセイ又は PNP-G7 アッセイのいずれかを用いて測定される。
改善された安定性：本明細書において「改善された安定性」（improved stability）という語は、例えば、「材料及び方法」の記載に従い EnzCheck アッセイにおいて測定された場合、３１℃、１．５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡの存在下で、ｐＨ８において１８時間後に、７０％超の残存活性を有すること、又は親と比較して残存活性の少なくとも１０ｐｐ改善を有することにより、親α−アミラーゼの安定性よりも高い、向上した安定性を示す変異体酵素として定義される。親と比較した変異体の残存活性の％ポイント（percentage point：ｐｐ）改善は、「材料及び方法」の記載に従い、変異体の残存活性と親の残存活性との差異として計算される。
助剤：助剤（builder）は、溶液中でｐＨ８において水硬度を２．０ｍＭ（ＣａＣＯ３換算）から０．１０ｍＭまで低減するのに必要な最低助剤レベルを決定する、M.K.Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September 1984), pp. 1475-1478に記載の試験により分類され得る。助剤は、具体的には、例えばカルシウム及びマグネシウムイオンと水溶性錯体を形成するキレート剤でもよい。
キレート剤（chelating agents）又はキレーター（chelators）は、特定の金属イオンと分子を形成して、当該イオンが他の要素と反応できないようにこれを不活性化する化学物質であり、従って、キレートを形成することにより化学的活性を抑制する結合剤である。キレート化（chelation）とは、リガンドと一つの中心原子との間に二つ又はそれ以上の分離した結合が形成されること、又は存在することをいう。リガンドは、任意の有機化合物、シリケート又はホスフェートでもよい。本発明との関連において、「キレート剤」（chelating agents）という語は、キーラント（chelants）、キレート剤（chelating agent, chelating agents）、錯化剤（complexing agents）、又は、金属イオン（例えばカルシウムやマグネシウム等）と水溶性錯体を形成する封鎖剤（sequestering agents）、を含む。キレート効果（chelate effect）とは、ある金属イオンに対するキレート化リガンドの親和性が、同じ金属に対する類似の非キレート化リガンド群の親和性と比較して増大していることを意味する。金属イオン、特にカルシウム（Ｃａ２＋）イオンとの結合能を有するキレート剤は、一般的に、洗浄、例えば、洗濯又は食器洗浄のための洗剤及び組成物に広く用いられている。しかしながら、キレート剤はそれら自身が酵素活性を阻害することを示している。キレート剤（chelating agent）という語は、本願において、「錯化剤（complexing agent）」又は「キレート剤（chelating agent）」又は「キーラント（chelant）」と相互交換可能に用いられる。
多くのα−アミラーゼはカルシウム感受性であるので、キレート剤の存在下では酵素活性を損なう場合がある。α−アミラーゼのカルシウム感受性は、強キレート剤の存在下で所定のα−アミラーゼをインキュベートし、当該α−アミラーゼの活性に対するこのインキュベーションの影響を分析することにより測定することができる。カルシウム感受性α−アミラーゼは、インキュベーションの間にその活性の大部分又は全てを失う。
キレート剤の特徴付け（Characterizing chelating agents）：上述のように、キレート効果（chelate effect or chelating effect）は、ある金属イオンに対するキレート化リガンドの親和性が、同じ金属に対する類似の非キレート化リガンド群の親和性と比較して、増大していることを意味する。しかしながら、このキレート効果の強度は、様々な種類のアッセイ又は測定方法により測定することができ、これにより、キレート剤をそのキレート効果（又は強度）に従って差別化又はランク付けすることができる。
好ましいアッセイによれば、キレート剤は、例えばM. K. Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September 1984), pp. 1475-1478に記載の方法に基づいた試験を用いることにより、ｐＨ８．０において、遊離カルシウムイオンの濃度（Ｃａ２＋）を２．０ｍＭから０．１０ｍＭ以下まで低減させる能力により特徴付けることができる。Nagarajanらに基づく方法を用いたキレート剤の特徴付けの例は、実施例２ａに記述される。好ましくは、本発明のキレート剤は、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度で、２１℃でｐＨ８．０において測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭ以下まで低減し得るキレート剤を含む。
好ましくは、本発明のキレート剤は、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度で、２１℃でｐＨ８において、８０ｍＭ塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ（（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸））中で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭまで低減し得るキレート剤を含む。特に好ましい実施形態によれば、キレート剤は、ｐＨ８及び２１℃において、８０ｍＭ塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中で測定され、「材料及び方法」の記載に従い遊離カルシウム濃度の測定にカルシウムイオン選択電極を用いた場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭ以下まで低減し得る。従って、好ましくは、キレート剤は、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い、ｐＨ８．０及び21℃で試験した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭまで低減し得るキレート剤を含む。
特に好ましい実施形態によれば、キレート剤は、９ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは９ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは７ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは６ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは４ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは３ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは９．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは８．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは７．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは６．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは５．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは４．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは３．０〜１．５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭ〜１．０ｍＭ、好ましくは２．０ｍＭ〜１．１ｍＭ、好ましくは１．８５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度で、ｐＨ８及び２１℃で８０ｍＭ 塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
２．０ｍＭ Ｃａ２＋から０．１０ｍＭまでの遊離カルシウムイオン濃度の低減は、２００ｐｐｍ（酸性ＣＯ２の存在下でＣａ（ＨＣＯ３）２の形態でのＣａＣＯ３換算）から１０ｐｐｍまで水硬度を低減することに相当する。最低助剤レベルは、１００％乾燥キレート剤に基づいて、キレート剤のナトリウム塩から計算される。
キレート剤のキレート効果は、クエン酸を基準として測定することもできる。遊離カルシウムイオン濃度の量を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸の濃度に１の値を割り当て、キレート剤の結果をこの値と比較する。本発明の好ましいキレート剤は、ｐＨ８．０及び２１℃で測定した場合に、クエン酸の濃度に対する比で、０．９未満、例えば０．８未満、例えば０．７未満、例えば０．６未満、例えば０．５未満、例えば０．４未満、例えば０．３未満、例えば０．２未満、例えば０．１未満という低い濃度で、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。本発明の好ましいキレート剤は、ｐＨ８．０及び２１℃で８０ｍＭ塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中で測定した場合、遊離カルシウム濃度の測定にカルシウムイオン選択電極を用いて８．０及び２１℃中で測定した場合に、クエン酸の濃度に対する比で、０．９未満、例えば０．８未満、例えば０．７未満、例えば０．６未満、例えば０．５未満、例えば０．４未満、例えば０．３未満、例えば０．２未満、例えば０．１未満という低い濃度で、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
特に好ましい実施形態によれば、前記キレート剤は、ｐＨ８．０及び２１℃で測定した場合に、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸の濃度に対する比で、１．０〜０．１、例えば０．９〜０．１、例えば０．８〜０．１、例えば０．７〜０．１、例えば０．６〜０．１、例えば０．５〜０．１、例えば０．４〜０．１、例えば０．３５〜０．１、例えば０．３〜０．１という低いキレート剤濃度で、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
従って、本発明の好ましい実施形態は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて１９３〜２１３の範囲において１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が２１℃及びｐＨ８で測定した場合に、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸の濃度の０．９倍未満のキレート剤の濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
本発明のさらに好ましい実施形態は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体α−アミラーゼが、配列番号６に従う番号付けを用いて１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
本発明のさらに好ましい実施形態は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体α−アミラーゼが、配列番号６に従う番号付けを用いて１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、任意により洗浄助剤（cleaning adjunct）を含んでいてもよい、組成物に関する。
本発明のさらに好ましい実施形態は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体α−アミラーゼが、配列番号６と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、更に配列番号６に従う番号付けを用いて１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
従って、本発明のキレート剤は、同一の条件で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減させるのに必要なクエン酸の濃度よりも低い濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
あるいは、キレート剤と金属イオン（例えばカルシウム及び／又はマグネシウム）とで形成された錯体の強度は、ｌｏｇＫ値（平衡又は結合又は解離又は安定性定数）で表される。この定数は、所定のｐＨ、所定の温度、及び所定のイオン強度で測定され得る。
上述のように、キレート剤と金属イオン（例えばカルシウム及び／又はマグネシウム）とで形成された錯体の強度は、ｌｏｇＫ値（平衡又は結合又は解離又は安定性定数）で表され、前記定数は、A. Nielsen et al., Anal. Biochem. Vol. 314, (2003), pp 227-234に記載のように等温滴定熱量計（ＩＴＣ）により、Ｋ値から求めることができる（ｌｏｇＫは、底を１０とするＫ値の対数として計算される）。この方法により測定されるｌｏｇＫ値は、温度、ｐＨ、イオン強度に依存するので、ｌｏｇＫ値を比較する場合には、それらが同様の条件、好ましくは同一の条件で測定されたものであることが重要である。更に、参照として標準（例えばクエン酸等）を導入することにより、実験時の変動による影響を軽減することができる。好ましくは、ｌｏｇＫは、本願の「材料及び方法」の記載に従い測定され、従って本発明の一つの実施形態によれば、本発明の組成物中のキレート剤は、ｌｏｇＫが「材料及び方法」の記載に従い、ｐＨ１０及び１９℃で測定された場合、少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１のｌｏｇＫを有する。本発明の組成物中のキレート剤のｌｏｇＫ値はまた、３〜１１、例えば３〜１０、例えば３〜９、例えば３〜８、例えば４〜１１、例えば５〜１１、例えば６〜１１、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば４〜９、例えば５〜９、例えば４〜８、特に５〜８の範囲でもよい。好ましくは、本発明の組成物中のキレート剤のｌｏｇＫはまた、「材料及び方法」の記載に従い測定されるクエン酸のｌｏｇＫの少なくとも１、例えば少なくとも１．３３、例えば少なくとも１．６７、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．３３、例えば少なくとも２．６７、例えば少なくとも３、例えば少なくとも３．３３、例えば少なくとも３．６７倍である。本発明の組成物中のキレート剤はまた、「材料及び方法」の記載に従い測定されるクエン酸のｌｏｇＫの１〜３．６７、例えば１〜３．３３、例えば１〜３．００、例えば１〜２．６７、例えば１．３３〜３．６７、例えば１．３３〜３．３３、例えば１．３３〜３．００、例えば１．３３〜２．６７、例えば１．６７〜３．６７、例えば１．６７〜３．３３、例えば１．６７〜３、特に１．６７〜２．６７倍の範囲内でもよい。
有用なキレート剤としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−（１，２−ジカルボキシ−エチル）−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸（ＩＤＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノジ酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノ酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノジ酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ、Ｎ−ジ酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ、Ｎ−ジ酢酸（ＴＵＤＡ）、スルホメチル−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチレンジアミントリ酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）等が挙げられる。
好ましいキレート剤は、アミノ基を含んでもよく、例えば、アミノ−ポリカルボン酸塩又はホスホン酸塩でもよい。それは、１、２、又は３のアミノ基（典型的には、第二級又は第３級アミノ基）を含む単量体分子でもよく、また、２、３、４、又は５のカルボキシル基、更にはそれ以上のカルボキシル基を含んでもよい。キレート剤はリンを含有するものでもよく、この場合、リン光体を含んでいてもいなくてもよい。キレート剤を分類する方法は多数存在するが、その一つは例えば以下のとおりである。
キレート剤は、カルボキシレートであるか、又はカルボキシレート基を有するものでもよい。例としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＮＴＡ（２，２’，２”−ニトリロトリ酢酸）、クエン酸、２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボン酸、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＭＧＤＡ（メチルグリシンジ酢酸又はＮ，Ｎ’−ビス（カルボキシメチル）アラニン）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールテトラ酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸）、ＧＬＤＡ（Ｌ−グルタミン酸、Ｎ，Ｎ−ジ酢酸）、ポリカルボキシレート、例えばＰＡＡ［ポリ（アクリル酸）］、ＰＡＡ／ＰＭＡ［コポリ（アクリル酸／マレイン酸）］等が挙げられる。
リンを含むキレート剤としては、ポリホスフェート又はホスフォネート、例えばトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰ）、ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸）、ＥＤＴＭＰ［ビス（ホスホノメチル）アミノ］メチルホスホン酸］又は（エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸））、ＥＤＴＭＰＡ（エチレンジアミンテトラメチレンテトラホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、ＤＴＭＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））等が挙げられる。キレート剤は窒素を含んでいてもよく、例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＰＤＴＡ、ＧＬＤＡ、ＭＧＤＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＭＰ、ＥＤＴＭＰＡ、及びＤＴＰＭＰ又はＡＳＭＡ、ＡＳＤＡ、ＡＳＭＰ、ＩＤＡ、ＳＭＡＳ、ＳＥＡＳ、ＳＭＧＬ、ＳＥＧＬ、ＭＩＤＡ、α−ＡＬＤＡ、ＳＥＤＡ、ＩＳＤＡ、ＰＨＤＡ、ＡＮＤＡ、ＳＬＤＡ、ＴＵＤＡ、ＳＭＤＡ、ＨＥＤＴＡ、ＤＥＧ、ＡＴＭＰ、又はそれらの混合物等の形態であってもよい。
従って、好ましいキレート剤としては、これらに限定されるものではないが、エチレン−ジアミン−テトラ−酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＭＰＡ、ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシエタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシンジ酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミンテトラ酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、メチルグリシンジ酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリウム塩（ＧＬＤＡ）及びニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）又はそれらの混合物等が挙げられる。キレート剤は、その酸形態として存在しても、塩として存在してもよいが、ナトリウム、アンモニウム、又はカリウム塩として存在することが好ましい。
更なるキレート剤としては、植物原料由来のキレート剤、例えば、以下に詳述するようなでんぷん含有物質に由来するキレート剤等が挙げられる。斯かる天然キレート剤の例としては、これらに限定されるものではないが、フィチン酸（別称イノシトール六リン酸（ＩＰ６）、又はフィチン、又は塩の場合はフィチン酸塩（フィテート：phytate））、イノシトール二リン酸、イノシトール三リン酸又はイノシトール五リン酸等が挙げられる。
キレート剤は、０．０００１ｗｔ％〜２０ｗｔ％で、好ましくは０．０１〜１０ｗｔ％で、より好ましくは０．１〜５ｗｔ％の量で組成物中に存在し得る。
親α−アミラーゼ（parent alpha-amylase）：親α−アミラーゼは、保存中又は使用時、例えば洗浄中又はでんぷん加水分解プロセスにおいて、改善された安定性を有する変異体の調製が望まれるものであれば、原則として任意のα−アミラーゼでよい。即ち、改善された安定性は、例えば、保存時のアミロース分解活性の損失の減少として、又は、使用時の活性及び性能の増加として現れる。公知のα−アミラーゼとしては、細菌（例えばバシラス属の種（Bacillus spp.）、例えばバシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）等）；真菌（例えばアスペルギウス・オリザエ（Aspergillus oryzae）（ＴＡＫＡ−アミラーゼ）又はアスペルギウス・ニジェール（Aspergillus niger）等）；植物（例えばオオムギ等）及び哺乳類等、多種多様な生物に由来するものが存在する。親α−アミラーゼは、原則として由来に関わりなく、このようなα−アミラーゼの何れであってもよい。
バシラス属により産生される多数のα−アミラーゼが、アミノ酸レベルで高い同一性を有することはよく知られている。これらのα−アミラーゼは、それらの間で見出される実質的な同一性のために、同一分類のα−アミラーゼ、すなわち「ターマミル様α−アミラーゼ」の分類に属すると考えられる。
従って、本発明との関連において、「ターマミル様（Termamyl-like）α−アミラーゼ」という語は、本明細書で配列番号２０（Termamyl（商標））に示されるアミノ酸配列を有するＢ．リケニホルミスα−アミラーゼと、アミノ酸レベルにおいて、実質的な、即ち少なくとも６０％の同一性を示すα−アミラーゼ、特にバシラス属α−アミラーゼを示すことを意図する。
ターマミル様α−アミラーゼ
多数の公知のバシラス属α−アミラーゼの同一性を下記の表１に示す。
Figure 0006185243
例えば、配列番号２０（Termamyl（商標）として市販）に示されるアミノ酸配列を含むＢ．リケニホルミスα−アミラーゼは、配列番号１４（ＢＡＮ）に示されるアミノ酸配列を含むＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）α−アミラーゼと約８１％相同、配列番号１６（ＢＳＧ）に示されるアミノ酸配列を含むＢ．ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）α−アミラーゼと約６５％相同であることが見出されている。更なる相同のα−アミラーゼとしては、国際公開第９５／２６３９７号に開示され、更に本明細書でそれぞれ配列番号６及び配列番号１２で表されるＳＰ７２２及びＳＰ６９０が挙げられる。他のアミラーゼとしては、配列番号１０に表されるバシラス属由来のＡＡ５６０ α−アミラーゼ、及び配列番号８に示され、Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 （1988）, pp. 25-31に記述される、バシラス属由来のＳＰ７０７又は＃７０７ α−アミラーゼが挙げられる。更なる相同のα−アミラーゼとしては、国際公開第９７／００３２４号（KAO Corporationによる）、配列番号１８に開示されるＫＳＭ ＡＰ１３７８ α−アミラーゼが挙げられる。さらに別の相同のα−アミラーゼとしては、配列番号２２を含むＳＰ．７−７ α−アミラーゼが挙げられる。別の好適な親アミラーゼとしては、配列番号２のＫ３８、又は国際公開第２００５／００１０６４号に開示され、配列番号４及び配列番号２４を含むＢ．サーキュランス アミラーゼが挙げられる。
更に別の興味深いα−アミラーゼとしては、欧州特許第０２５２６６６号明細書に記述されるＢ．リケニホルミス株により産生されるα−アミラーゼ（ＡＴＣＣ２７８１１）、及び国際公開第９１／００３５３号及び国際公開第９４／１８３１４号に同定されるα−アミラーゼが挙げられる。他の市販のターマミル様α−アミラーゼとしては、商品名Optitherm（商標）及びTakatherm（商標）（Solvay）；Maxamyl（商標）（Gist-brocades/Genencorから入手可能）、Spezym AA（商標）及びSpezyme Delta AA（商標）（Genencorから入手可能）、及びKeistase（商標）（Daiwaから入手可能）、Dex lo、GC 521 （Genencorから入手可能）及びUltraphlow（Enzyme Biosystemsから）、Purastar（商標）ST 5000E、PURASTRA（商標）HPAM L、POWERASE（商標）、Spezyme FRED、GC358、ClearFlow AA（Daniscoから）、又はα−アミラーゼTS-23（配列番号２６（Lin et al, J.App.Microbiol. 1997, 82, 325-334））として販売されている製品に含まれるものが挙げられる。
非ターマミル様α−アミラーゼとしては、例えば、真菌性α−アミラーゼ、哺乳類又は植物性α−アミラーゼ、又は（ターマミル様α−アミラーゼとは異なる）細菌性α−アミラーゼが挙げられる。斯かるα−アミラーゼの具体例としては、アスペルギウス・オリザエＴＡＫＡα−アミラーゼ、Ａ．ニジェール酸α−アミラーゼ、バシラス・サブティリスα−アミラーゼ、ブタ膵臓α−アミラーゼ、及びオオムギα−アミラーゼが挙げられる。これらのα−アミラーゼはいずれも、本明細書で言及されるような典型的なターマミル様α−アミラーゼの構造とは著しく異なる構造を有することが明らかになっている。
上述の真菌性α−アミラーゼ、即ちＡ．ニジェール及びＡ．オリザエ由来の真菌性α−アミラーゼは、アミノ酸レベルで高い同一性を有し、一般的にα−アミラーゼの同一のファミリーに属すると考えられている。アスペルギウス・オリザエ由来の真菌性α−アミラーゼは、Fungamyl（商標）の商標名の下で市販されている。
親ハイブリッドα−アミラーゼ
親α−アミラーゼは、ハイブリッドα−アミラーゼ、即ち、少なくとも２つのα−アミラーゼ由来の部分的なアミノ酸配列の組み合わせを含むα−アミラーゼでもよい。
親ハイブリッドα−アミラーゼは、（上述のような）アミノ酸相同性及び／又は免疫学的交差反応性及び／又はＤＮＡハイブリダイゼーションに基づいて、ターマミル様α−アミラーゼファミリーに属すると決定され得るものでもよい。この場合、ハイブリッドα−アミラーゼは、典型的に、少なくとも１のターマミル様α−アミラーゼの部分と、微生物（細菌又は真菌）及び／又は哺乳類由来のターマミル様α−アミラーゼ又は非ターマミル様α−アミラーゼから選択される１又は２以上の他のα−アミラーゼの（１又は２以上の）部分とからなる。
従って、親ハイブリッドα−アミラーゼは、少なくとも２のターマミル様α−アミラーゼ由来、又は少なくとも１のターマミル様及び少なくとも１の非ターマミル様細菌性α−アミラーゼ由来、又は少なくとも１のターマミル様及び少なくとも１の真菌性α−アミラーゼ由来の部分的アミノ酸配列の組み合わせを含み得る。部分的アミノ酸配列が由来するターマミル様α−アミラーゼは、本明細書で言及されるそれらの任意のターマミル様α−アミラーゼでもよい。
一つの実施形態によれば、親ターマミル様α−アミラーゼは、（成熟タンパク質の）Ｎ−末端の３５アミノ酸残基が、配列番号１４に示されるバシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼの成熟タンパク質のＮ−末端の３３アミノ酸残基と置き換えられることを除いて、配列番号２０に示されるバシラス・リケニホルミスα−アミラーゼと同一のハイブリッドターマミル様α−アミラーゼであり、前記ハイブリッドは、更にＬＥ１７４と称される以下の変異：１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ（配列番号６における番号付けを用いて）を有する。別の実施形態によれば、変異Ｇ４８Ａ、Ｔ４９Ｉ、Ｇ１０７Ａ、Ｉ２０１Ｆをさらに含むＬＥ１７４は、ＬＥ３９９と称される。一つの実施形態によれば、親は、変異Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９５Ｆを有する配列番号１６である。
本発明の好ましい側面によれば、親α−アミラーゼは、本明細書で配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼである。別の好ましい側面によれば、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の成熟ポリペプチドの６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の相同性を示すα−アミラーゼである。
一側面によれば、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の成熟ポリペプチドと、１又は数個のアミノ酸により、好ましくは１０個のアミノ酸により、より好ましくは９、８、７、６、５個のアミノ酸により、より好ましくは４個のアミノ酸により、さらにより好ましくは３個のアミノ酸により、最も好ましくは２個のアミノ酸により、さらに最も好ましくは１個のアミノ酸により異なる（例えば、欠失、挿入又は置換）アミノ酸配列を有する。
親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６からなる群より選択されるアミノ酸配列の１つを有するα−アミラーゼに対して産生された抗体と免疫学的交差反応を示すα−アミラーゼでもよい。好ましい実施形態によれば、親α−アミラーゼは、当該親α−アミラーゼに対して産生された抗体が、競合アッセイ技術、例えば、ELISA又はBiaCoreのそれぞれにおいて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有するα−アミラーゼに対して親和性（affinity）又はアビディティー（avidity）を示す、又は親α−アミラーゼに匹敵する親和性又はアビディティーを示すα−アミラーゼであって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有するα−アミラーゼに対して産生された抗体が、前記競合アッセイ技術において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有するα−アミラーゼに対する親和性又はアビディティーに匹敵する親α−アミラーゼに対して親和性又はアビディティーを示すα−アミラーゼである。更なる実施形態によれば、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの一つを有するα−アミラーゼの親和性又はアビディティーの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも１２０％、特に好ましくは少なくとも１２５％である親和性又はアビディティーを有するα−アミラーゼである。
親α−アミラーゼはまた、本願の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５から明らかである上記の特定のα−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコード化されるα−アミラーゼでもよい。従って、一つの実施形態は、親α−アミラーゼの変異体α−アミラーゼに関し、前記親α−アミラーゼは、
（Ａ）Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、バシラス属又はＫＳＭ ＡＰ１３７８の株に由来し、
（Ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列を有する群から選択され、
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６のうちの一つと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９７％、及びより一層好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、又は
（Ｄ）低、好ましくは中、好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５のうちの１つの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
一側面によれば、アミロース分解増強活性を有する親ポリペプチドは、（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ii）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（ｉ）又は（ii）の全長相補鎖、とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチド；又は（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドである。
親α−アミラーゼの特定の変異体を、（従来どおり）特定のα−アミラーゼのアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の修飾（例えば、欠失又は置換）を用いて表す場合、その中には、（各アミノ酸配列間の可能な限り最良のアミノ酸配列アライメントで決定される）同等の（１又は２以上の）位置において修飾された別のα−アミラーゼの変異体も含まれるものと解される。
本発明の特定の側面によれば、親α−アミラーゼは、任意の適切な手法により調製された天然（野生型）の変異体である。例えば、親α−アミラーゼは、天然α−アミラーゼのアミノ酸配列が修飾又は改変された変異体でもよい。
親α−アミラーゼは、１又は２以上の（数個の）アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る、実質的に相同な親α−アミラーゼでもよい。これらの変化は軽微なものであることが好ましい。すなわち、後述のような保存的アミノ酸置換、及び、タンパク質又はポリペプチドの三次元折り畳み又は活性に著しい影響を与えない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０のアミノ酸；及び小さなアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド、又は精製を容易にする小さい伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジン鎖、又はタンパク質Ａである（Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3）。また、概説として、Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107を参照のこと。
上述の変化は軽微なものであることが好ましいが、斯かる変化は実質的なものであってもよい。例えば、最大３００又はそれ以上のアミノ酸からなる大きいポリペプチドの融合による、アミノ末端又はカルボキシル末端の双方の伸長等であってもよい。
親α−アミラーゼの特定の変異体（本発明の変異体）を、（従来どおり）特定の親α−アミラーゼのアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の修飾（例えば、欠失又は置換）を用いて表す場合、その中には、（各アミノ酸配列間の可能な限り最良のアミノ酸配列アライメントで決定される）同等の（１又は２以上の）位置において修飾された別の親α−アミラーゼの変異体も含まれるものと解される。
相同性（配列同一性）
相同性は、第一の配列が第二の配列に由来すること（derivation）を示す、二つの配列間の同一性の程度として決定され得る。本発明の目的において、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）により実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いて決定される。用いられる任意のパラメーターは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleのアウトプット（-nobriefオプションを用いて得られる）は、％同一性として用いられ、以下の式に従い計算される。
（同一の残基×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上）のNeedleプログラム、好ましくはバージョン３.０.０以降、により実行されるように、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を用いて決定される。用いられる任意のパラメーターは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー、０.５のギャップ・エクステンション・ペナルティー、及びEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されたNeedleのアウトプット（-nobriefオプションを用いて得られる）は、％同一性として用いられ、以下の式に従い計算される。
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
また、相同性又は配列同一性は、第一の配列が第二の配列に由来することを示す、二つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該技術分野において知られている旧来のコンピュータープログラムの方法、例えばGCGプログラムパッケージに提供されるGAPにより適切に決定され得る。従って、Gap GCGv8は、同一性についてのデフォルトスコアリングマトリックス及び以下のデフォルトパラメーター：核酸配列比較についてそれぞれ、５．０のギャップ・クリエーション・ペナルティー（GAP creation penalty）、及び０.３のギャップ・エクステンション・ペナルティー、並びにタンパク質配列比較についてそれぞれ、３．０のギャップ・クリエーション・ペナルティー、及び０.１のギャップ・エクステンション・ペナルティー、を用いて使用され得る。GAPは、アライメントを作成するために、及び同一性を計算するために、Needleman and Wunsch, （1970）, J.Mol. Biol. 48, p.443-453 の方法を用いる。
例えば、ターマミルとα−アミラーゼと間の構造アライメントを、他のα−アミラーゼにおける同等の／対応の位置を特定するために用いてもよい。前記構造アライメントを得る一つの方法は、ギャップ・ペナルティーのデフォルト値、即ち、３．０のギャップ・クリエーション・ペナルティー、及び０.１のギャップ・エクステンション・ペナルティーを用いたGCGパッケージからのPile Upプログラムを使用することである。他の構造アライメント方法は、疎水性クラスター分析（Gaboriaud et al., （1987）, FEBS LETTERS 224, pp. 149-155）及びリバーススレッディング（reverse threading）（Huber, T ； Torda. AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 （1998））を含む。α−アミラーゼの特性、即ち、免疫学的交差反応性は、関連するターマミル様α−アミラーゼの少なくとも１のエピトープに対する、又は反応性を有する抗体を用いてアッセイされ得る。モノクローナル又はポリクローナルのいずれかでもよい抗体は、当該技術分野において知られている方法、例えば、Hudson et al., Practical Immunology, Third edition （1989）, Blackwell Scientific Publications に記述されるように、産生され得る。免疫学的交差反応性は、当該技術分野において知られているアッセイを用いて決定され得、その例は、例えば、Hudson et al., 1989により記述されるような、ウェスタンブロッティング又は放射免疫拡散アッセイである。
ハイブリダイゼーション
一側面によれば、アミロース分解活性を有する親ポリペプチドは、極めて低いストリンジェンシー条件、好ましくは低いストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度ないし高いストリンジェンシー条件、より一層好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは極めて高いストリンジェンシー条件の下で、（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ii）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、（iii）（ｉ）若しくは（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ）、（ii）、若しくは（iii）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化される（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。サブ配列は、アミロース分解活性を有するポリペプチドフラグメントをコード化し得る。一側面によれば、相補鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコーディング配列の全長相補鎖である。
所望の特性（例えばα−アミラーゼ活性）に基づくα−アミラーゼの特徴付けに用いられるオリゴヌクレオチドプローブは、当該α−アミラーゼの全長又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて、適切に調製することができる。
ハイブリダイゼーションを試験するための好適な条件は、５×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム、０．１６５０Ｍ ＮａＣｌに対して、１×ＳＳＣ）に予浸すること、２０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、及び５０ｍｇの変性され超音波処理された仔牛胸腺ＤＮＡの溶液中に約４０℃で１時間プレハイブリダイゼーションすること、続いて１００ｍＭ ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）が添加された同一の溶液中で、約４０℃で１８時間ハイブリダイゼーションすること、続いて４０℃で３０分間（低いストリンジェンシー）、好ましくは５０℃で（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃で（高いストリンジェンシー）、より一層好ましくは約７５℃で（極めて高いストリンジェンシー）、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中でフィルターを３回洗浄すること、を含む。ハイブリダイゼーション方法についての詳細は、Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989に見ることができる。
本発明との関連において、「由来する」（derived from）は、対象となる生物の株により産生される又は産生され得るα−アミラーゼのみではなく、斯かる株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、前記ＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物において産生されるα−アミラーゼをも指すことが意図される。従って、この用語は、合成及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、当該α−アミラーゼを特定する特徴を有するα−アミラーゼをも意味することが意図される。また、この用語は、親α−アミラーゼが、天然α−アミラーゼの変異体、即ち天然α−アミラーゼの１又は２以上のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体でもよいことを意味する。
α−アミラーゼ変異体を調製するための方法
本技術分野において、遺伝子に変異を導入するための方法は幾つか知られている。α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列のクローニングについて簡単に説明した後、α−アミラーゼをコード化する配列中の特定部位に変異を生成する方法について説明する。
α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列のクローニング
親α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列は、当該α−アミラーゼを産生する任意の細胞又は微生物から、本技術分野で周知の様々な方法を用いて単離することができる。最初に、研究されるα−アミラーゼを産生する生物の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築すべきである。その後、例えば、α−アミラーゼのアミノ酸配列が公知の場合、対応する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いて、当該生物から調製されたゲノムライブラリーからα−アミラーゼをコード化するクローンを同定することができる。あるいは、既知のα−アミラーゼ遺伝子と対応する配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブをプローブとして用い、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、α−アミラーゼをコード化するクローンを同定することができる。
α−アミラーゼをコード化するクローンを同定するためのさらに別の方法は、発現ベクター、例えばプラスミドにゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入すること、得られたゲノムＤＮＡライブラリーを用いてα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換すること、及びα−アミラーゼの基質を含むアガー上に形質転換された細菌をプレーティングすること、その結果α−アミラーゼを発現するクローンを同定すること、を含む。
あるいは、酵素をコード化するＤＮＡ配列を、確立されている標準的な方法、例えば、S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, 1981, Tetrahedron Letters 22： 1859に記述されるアミド亜りん酸エステル法、又はMatthes et al., 1984, EMBO J. 3 801-805により記述される方法により合成的に調製してもよい。アミド亜りん酸エステル法によれば、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置によって合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、適切なベクターにクローン化する。
最終的に、ＤＮＡ配列は、標準的な技術に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のフラグメント（必要に応じて、ＤＮＡ配列全体の様々な部分に対応するフラグメント）をライゲートすることにより調製された、ゲノム及び合成由来の混成、合成及びｃＤＮＡ由来の混成、又は、ゲノム及びｃＤＮＡ由来の混成のＤＮＡ配列でもよい。ＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書又はR.K. Saiki et al., 1988, Science Vol. 239 no. 4839 pp. 487-491に記述されるような、特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製され得る。
部位特異的変異誘発法
α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列を単離し、変異のための所望の部位を特定したら、合成オリゴヌクレオチドを用いて変異を導入してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含み、変異体ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成時に挿入される。特定の方法によれば、α−アミラーゼ遺伝子を有するベクター内に、α−アミラーゼをコード化する配列に架かるＤＮＡの一本鎖ギャップを生成する。その結果、所望の変異を含む合成ヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡの相同な部分にアニールされる。残っているギャップは、その後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow フラグメント）を用いて塞がれ、コンストラクトは、Ｔ４リガーゼを用いてライゲートされる。この方法の具体例は、Morinaga et al., 1984、Biotechnology 2, pp. 636-639に記載されている。米国特許第４，７６０，０２５号明細書は、カセットに小さな改変を加えることにより、複数の変異をコード化するオリゴヌクレオチドを導入する手法を開示する。しかしながら、Morinaga法によれば、様々な長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、より多くの種類の変異を導入することも可能である。
α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列に変異を導入するための別の方法は、Nelson and Long (1989)に記載される。この方法は、化学合成されたＤＮＡ鎖をＰＣＲ反応のプライマーの一つとして用いることにより所望の変異が導入されたＰＣＲフラグメントの３段階生成を含む。ＰＣＲで生成されたフラグメントから、変異を有するＤＮＡフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼでの切断により単離し、発現プラスミドに再挿入することができる。
ランダム変異誘発法
ランダム変異誘発法は、局所的又は領域特異的ランダム変異誘発の何れかにより、対象となるアミノ酸配列に翻訳される遺伝子の少なくとも３つの部分において、又は全遺伝子内において、好適に行われる。
親α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列のランダム変異誘発は、当該技術分野において知られている任意の方法の使用により便宜的に行われ得る。
上記に関して、本発明の更なる側面は、親α−アミラーゼの変異体であって、例えば、親に対して改変されたでんぷん親和性を示す変異体、を生成するための方法であって、
（ａ）親α−アミラーゼをコード化するＤＮＡ配列をランダム変異誘発に供すること、
（ｂ）宿主細胞において、ステップ（ａ）で得られる変異誘発されたＤＮＡ配列を発現すること、及び
（ｃ）親α−アミラーゼと比較して改変されたでんぷん親和性を有するα−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞についてスクリーニングすること、
を含む、方法に関する。
本発明の上記方法のステップ（ａ）は、好ましくは、ドープされた（doped）プライマーを用いて行われる。例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的又は化学的変異誘発剤を使用することにより、好適なオリゴヌクレオチドを使用することにより、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発法に供することにより行うことができる。更に、ランダム変異誘発法は、これらの変異誘発剤の任意の組み合わせを用いて行うこともできる。変異誘発剤は、例えば、転移、転換、反転、スクランブリング、欠失、及び／又は挿入を誘発するものでもよい。
本目的に適した物理的又は化学的変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログが挙げられる。斯かる試薬を使用する場合、変異誘発は、変異誘発の対象となる親酵素をコード化するＤＮＡ配列を、選択された変異誘発剤の存在下、所望の変異誘発を生じさせるのに適した条件下でインキュベートすること、及び、所望の性質を有する変異誘発されたＤＮＡを選択すること、により行われる。オリゴヌクレオチドを用いて変異誘発を行う場合、変更すべき位置でのオリゴヌクレオチドの合成時に、３つの非親ヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドをドープ（doped）又はスパイク（spiked）してもよい。ドーピング（doping）又はスパイキング（spiking）は、望ましくないアミノ酸のコドンを避けるように行ってもよい。ドープ又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ又は適切と見なされた任意のＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いた任意の公知の技術により、α−アミラーゼ酵素をコード化するＤＮＡに組み込まれ得る。好ましくは、ドーピングは、各位置における野生型及び変異の百分率が予め定義されている「定数ランダムドーピング」（constant random doping）を用いて行われる。更に、ドーピングは、特定のヌクレオチドの導入についての優先度、ひいては、１又は２以上の特定のアミノ酸残基の導入についての優先度を高めるように実施してもよい。例えば、ドーピングは、各位置に野生型が９０％、変異が１０％の比率で導入されるように実施することができる。ドーピングスキームの選択において更に考慮すべきは、遺伝子及びタンパク質の構造的な制約についてである。ドーピングスキームは、ＤＯＰＥプログラムを用いて行ってもよい。これにより、とりわけ、停止コドンの導入を確実に避けることができる。ＰＣＲ生成変異誘発を用いる場合、親α−アミラーゼをコード化する化学的処理又は未処理の遺伝子を、ヌクレオチドの誤取り込みを増加させる条件下でＰＣＲに供する（Deshler 1992, Genetic Analysis： Biomolecular Engineering, 9（4）, pp 103-106； Leung et al., 1989, Technique, Vol.1, pp. 11-15）。Ｅ．コリ（E. coli）（Fowler et al., 1974, Molec. Gen. Genet., 133, pp. 179-191）、Ｓ．セレヴィシエ（S. cereviseae）又は任意の他の微生物の変異誘発株を用いて、例えば、変異誘発株に親グリコシダーゼを含むプラスミドを形質転換し、プラスミドを含む変異誘発株を培養し、変異誘発株から変異誘発されたプラスミドを単離することにより、α−アミラーゼをコード化するＤＮＡのランダム変異誘発を実施することができる。変異誘発されたプラスミドは、続いて発現生物に形質転換され得る。変異誘発されたＤＮＡ配列は、親α−アミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はｃＤＮＡライブラリーに存在するのが好適である。あるいは、ＤＮＡ配列は、好適なベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在してもよく、これをそのまま変異誘発剤とインキュベートし、或いは別の手法で変異誘発剤に曝露してもよい。また、変異誘発されたＤＮＡは、前記細胞のゲノムに統合されることにより、又は細胞内に取り込まれたベクター上に存在することにより、宿主細胞内に存在してもよい。最終的に、変異誘発されたＤＮＡは、単離された形態でもよい。ランダム変異誘発に供されるＤＮＡ配列は、好ましくはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列であると理解される。場合によっては、発現ステップｂ）又はスクリーニングステップｃ）を行う前に、変異誘発されたＤＮＡ配列を増幅することが好都合である。斯かる増幅は、本技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。現在好まれている手法は、親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ生成増幅である。変異誘発剤とのインキュベート又は曝露に続いて、変異誘発されたＤＮＡは、当該ＤＮＡ配列を有する好適な宿主細胞を、発現を可能とする条件下で培養することにより発現される。この目的のために用いられる宿主細胞は、変異誘発されたＤＮＡ配列（任意によりベクター上に存在してもよい）で形質転換されたものや、変異誘発処理時に親酵素をコード化するＤＮＡ配列が導入されたものが挙げられる。好適な宿主細胞の例は、以下：グラム陽性細菌、例えばバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バシラス・リケニホルミス、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・ロータス（Bacillus lautus）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトマイセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）；及びグラム陰性細菌、例えばＥ．コリである。変異誘発されたＤＮＡ配列は、変異誘発されたＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコード化するＤＮＡ配列をさらに含み得る。
局所的ランダム変異誘発法
ランダム変異誘発法は、親α−アミラーゼの所望の部分に対して局所的に実施するのが有利である。これは例えば、酵素の特定の領域が、酵素の所定の特性に特に重要であることが特定されており、当該領域が修飾された場合に、改善された特性を有する変異体が得られると予測される場合等に有用である。斯かる領域は、通常、親酵素の三次構造が解明されている、及び酵素の機能に関連している場合に、特定され得る。
局所的又は領域特異的ランダム変異誘発は、上述のＰＣＲ生成変異誘発技術、又は当該技術分野において知られている任意の他の好適な技術の使用により、都合良く行なわれる。あるいは、修飾されるＤＮＡ配列の部分をコード化するＤＮＡ配列は、例えば、好適なベクターへの挿入により単離され得、前記部分は上述の任意の変異誘発法の使用により続いて変異誘発に供され得る。
α−アミラーゼ変異体を用意する代替の方法
本発明の変異体を用意するための代替の方法は、例えば、国際公開第９５／２２６２５号（Affymax Technologies N.V.による）及び国際公開第９６／００３４３号（Novo Nordisk A/Sによる）に記述される方法を含む、当該技術分野において知られている遺伝子シャッフリング法を含む。
α−アミラーゼ変異体の発現
本発明に従って、上述の方法により、又は当該技術分野において知られている任意の代替の方法により生産される変異体をコード化するＤＮＡ配列は、典型的に、プロモータ、オペレータ、リボゾーム結合部位、及び翻訳開始シグナルをコード化する調節配列を含むと共に、更には任意により、抑制遺伝子又は様々な活性化遺伝子を含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現され得る。
本発明のα−アミラーゼ変異体をコード化するＤＮＡ配列を有する組換発現ベクターは、組換ＤＮＡ手順に好適に供され得るベクターであれば任意であるが、ベクターの選択は多くの場合、その導入対象となる宿主細胞に依存する。従って、ベクターは、自律複製ベクター（autonomously replicating vector）、即ち、染色体外物質（extracheomosomal entity）として存在し、その複製が、染色体複製から独立しているベクターであってもよい。その例としては、、プラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子（extracheomosomal element）、微小染色体又は人工染色体等が挙げられる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞ゲノムに統合され、それが統合された（１又は２以上の）染色体と共に複製されるものであってもよい。
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、好適なプロモータ配列と作動式に（operably）連結されるべきである。プロモータは、選択された宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であれば任意であり、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれのタンパク質をコード化する遺伝子に由来するものでもよい。特に細菌宿主において、本発明のα−アミラーゼ変異体をコード化するＤＮＡ配列の転写のために好適なプロモータの例は、Ｅ．コリのｌａｃオペロンのプロモータ、ストレプトマイセス・セリカラー（ストレプトマイセス・セリカラー）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモータ、バシラス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモータ、バシラス・ステアロサーモフィラスマルトース生成型アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモータ、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモータ、バシラス・サブティリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモータ等である。真菌宿主における転写について、有用なプロモータの例は、Ａ．オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニジェール中性α−アミラーゼ、Ａ．ニジェール酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニジェールグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、Ａ．オリザエアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニデュランス（A. nidulans）アセトアミダーゼをコード化する遺伝子由来のものである。
本発明の発現ベクターはまた、好適な転写ターミネータ、及び真核生物において、本発明のα−アミラーゼ変異体をコード化するＤＮＡ配列と作動式に連結されるポリアデニル化配列を含み得る。終結及びポリアデニル化配列は、好適には、プロモータとして同一の起源由来でもよい。
ベクターは、所望の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を更に含んでもよい。斯かる配列の例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点が挙げられる。
ベクターはまた、選択可能なマーカー、例えば、宿主細胞の欠損を補う遺伝子産物を生成する遺伝子を含んでいてもよい。その例としては、Ｂ．サブティリス又はＢ．リケニホルミス由来のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。更に、ベクターは、アスペルギルス属選択マーカー、例えばａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣ、ハイグロマイシン耐性を与えるマーカーを含んでいてもよい。或いは、例えば国際公開第９１／１７２４３号等に記載の共形質転換により、選択を達成してもよい。
細胞内発現は幾つかの点で（例えば宿主細胞として特定の細菌を用いた場合等に）有利な場合もあるものの、通常は発現が細胞外であることが好まれる。一般的に、本明細書で言及されるバシラス属のα−アミラーゼは、発現されたプロテアーゼの培地への分泌を可能とするプレ領域を含む。必要であれば、このプレ領域を、異なるプレ領域又はシグナル配列に置き換えてもよい。これは好適には、各プレ領域をコード化するＤＮＡ配列の置換により達成される。
α−アミラーゼ変異体をコード化する本発明のＤＮＡコンストラクトを、プロモータ、ターミネータ及び他の要素とそれぞれライゲートし、更に複製に必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために用いられる手順は、当業者には周知である（例えば、Sambrook et al.， Molecular Cloning： A Laboratory Manual， 2nd Ed.， Cold Spring Harbor， 1989を参照のこと）。
上記で定義されたような、本発明のＤＮＡコンストラクト又は発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換生産における宿主細胞として有利に用いられる。変異体をコード化する本発明のＤＮＡコンストラクトによるこの細胞の形質転換は、好適には、ＤＮＡコンストラクトを（１又は２以上のコピーとして）宿主染色体に統合することにより達成することができる。この統合は、一般的に、ＤＮＡ配列が細胞中に安定的に維持される可能性が高いので有利であると考えられている。ＤＮＡコンストラクトの宿主染色体への統合は、従来の方法に従って、例えば、相同又は非相同組み換えにより行ってもよい。あるいは、細胞は、宿主細胞の様々な種類に関連して、上述のような発現ベクターを用いて形質転換されてもよい。
本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞でもよいが、好ましくは、微生物細胞、例えば細菌又は真菌（酵母を含む）細胞である。
好適な細菌の例は、グラム陽性細菌、例えばバシラス・サブティリス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・レンタス、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・アルカロフィラス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・コアグランス、バシラス・サーキュランス、バシラス・ロータス、バシラス・メガテリウム、バシラス・チューリンゲンシス、又はストレプトマイセス・リビダンス若しくはストレプトマイセス・ムリヌス、又はグラム陰性細菌、例えばＥ．コリである。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により、又はコンピテント細胞を用いることにより、それ自体公知の方法で実施してもよい。
酵母生物は、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、又はシゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）の種、例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）から選択することが望ましい。糸状菌は、アスペルギウス属の種、例えばアスペルギウス・オリザエ又はアスペルギウス・ニジェールに属するものが有利である。真菌細胞は、プロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、続いてそれ自体公知の手法による細胞壁の再生を含むプロセスにより、形質転換されてもよい。アスペルギルス属宿主細胞の形質転換についての好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書に記述される。
なお、更なる側面によれば、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体を生産する方法に関し、その方法は、変異体の産生をもたらす条件下で上述のような宿主細胞を培養すること、及び、細胞及び／又は培養培地からの変異体を回収することを含む。
細胞を培養するための培地としては、対象となる宿主細胞を培養し、本発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るのに適した培地であれば、任意の従来の培地を用いることができる。好適な培地は、商業的供給者から入手可能であり、或いは公開されているレシピ（例えば、the American Type Culture Collectionのカタログ参照）に従って調製してもよい。
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は、遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離すること、及び塩、例えば硫酸アンモニウムの手法により培地のタンパク質成分を沈殿させること、続いて、クロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の使用を含む、周知の手順により、培養培地から簡便に回収され得る。
変異体の命名についての規約
配列番号６に開示されるα−アミラーゼのアミノ酸配列を、他の多数のα−アミラーゼのアミノ酸配列とアラインすることにより得られた番号付けシステムを用いることにより、構造的相同性の領域において、α−アミラーゼのアミノ酸残基の位置を示すことが可能である。
本発明の様々なα−アミラーゼ変異体を記述するにあたり、参照の便宜のため、以下に説明する命名法を採用する。いずれの場合も、認められているＩＵＰＡＣの１文字又は３文字のアミノ酸の略称が用いられる。
本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての従来の１文字又は３文字のコードを用いる。参照の便宜のために、本発明のα−アミラーゼ変異体は、以下の命名法を用いて記載する。
（１又は２以上の）元のアミノ酸：（１又は２以上の）位置：（１又は２以上の）置換後のアミノ酸
この命名法によれば、例えば位置３０におけるアラニンのアスパラギンへの置換は：
Ａｌａ３０Ａｓｎ又はＡ３０Ｎ
として表され、
同一の位置におけるアラニンの欠失は：
Ａｌａ３０＊又はＡ３０＊
として表され、
位置３０の後ろへの更なるアミノ酸残基、例えばリジンの挿入は：
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓ又はＡ３０ＡＫ
として表される。
アミノ酸残基の連続した範囲、例えばアミノ酸残基３０−３３の欠失は、
（３０−３３）＊又はΔ（Ａ３０−Ｎ３３）
として表される。一つのアミノ酸残基の欠失は、単純に３０＊と表してもよい。
ある特定のα−アミラーゼが、他のα−アミラーゼとの比較において「欠失」を含み、斯かる位置に挿入がされる場合、例えば、位置３６におけるアスパラギン酸の挿入であれば：
＊３６Ａｓｐ又は＊３６Ｄ
として表される。
多重変異は、プラス記号により、又はスペースを用いて区切られる。即ち：
Ａｌａ３０Ａｓｎ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
Ａｌａ３０Ａｓｎ Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ Ｅ３４Ｓ
は、位置３０及び３４のアラニン及びグルタミン酸を、それぞれアスパラギン及びセリンに置換する変異を表す。
あるいは、多重変異は、カンマ又はセミコロンにより区切ってもよい。即ち：
Ａｌａ３０Ａｓｎ，Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ，Ｅ３４Ｓ。
より簡略化する場合、多重変異は、スペース等により区切ってもよい。
あるいは、多重変異は、カンマ又はセミコロンにより区切ってもよい。即ち：
Ａｌａ３０Ａｓｎ Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ Ｅ３４Ｓ。
所定の位置に１又は２以上の代替のアミノ酸残基が挿入され得る場合：
Ａ３０Ｎ，Ｅ又は
Ａ３０Ｎ又はＡ３０Ｅ
として表される。
あるいは、所定の位置に１又は２以上の代替のアミノ酸残基が挿入され得る場合：
Ａ３０［Ｎ，Ｅ］又はＡ３０［Ｎ Ｅ］、あるいはＡ３０｛Ｎ，Ｅ｝又はＡ３０｛Ｎ Ｅ｝
として表される。
簡略化のために、特定の位置で置換され得る代替のアミノ酸は、以下：
Ａ３０Ｎ，Ｅ，Ｈ，Ｌ又はＶ
として表してもよい。
更に、本明細書において、具体的な修飾を特定することなく、修飾に好適な位置のみが表示されている場合、その位置に存在するアミノ酸残基が任意のアミノ酸残基で置換され得るものと解される。従って、例えば、位置３０のアラニンの修飾が言及されているが、修飾が特定されていない場合、アラニンが欠失され、又は任意の他のアミノ酸、即ち：
Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ａ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ
のうちのいずれかで置換され得ると解される。
更に、「Ａ３０Ｘ」は、以下の置換：
Ａ３０Ｒ，Ａ３０Ｎ，Ａ３０Ｄ，Ａ３０Ｃ，Ａ３０Ｑ，Ａ３０Ｅ，Ａ３０Ｇ，Ａ３０Ｈ，Ａ３０Ｉ，Ａ３０Ｌ，Ａ３０Ｋ，Ａ３０Ｍ，Ａ３０Ｆ，Ａ３０Ｐ，Ａ３０Ｓ，Ａ３０Ｔ，Ａ３０Ｗ，Ａ３０Ｙ，又はＡ３０Ｖ；又は簡潔に：Ａ３０Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ，
又は、例えばＡ３０［Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ］
のうちの任意の一つを意味する。
当業者には周知のとおり、例えば配列番号６に従う番号付けを用いることは、必ずしも親が配列番号６であることを意味するものではなく、単に改変される位置が配列番号６に従って定義されることを意味するにすぎない。それ故、特定の置換を記述する別の方法は、Ｘを用いて改変されるアミノ酸を示すことである。すなわち、Ｘ３０Ｎは、位置３０に存在する任意のアミノ酸がＮで置換され得ることを意味し、親α−アミラーゼとして様々なα−アミラーゼが用いられ得ることを反映している。
従って、「Ｘ３０Ｎ」又は「Ｘ３０Ｖ」の命名は、親α−アミラーゼ中の位置３０に存在する任意のアミノ酸が、アスパラギン又はバリンにより置換されることを意味する。
アミノ酸残基の特性
帯電アミノ酸：
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
負帯電アミノ酸（一番目が最も負の残基）：
Ａｓｐ、Ｇｌｕ
正帯電アミノ酸（一番目が最も正の残基）：
Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
中性アミノ酸：
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
疎水性アミノ酸残基（最後に挙げた残基が最も疎水性の残基）：
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
親水性アミノ酸（最後に挙げた残基が最も親水性の残基）：
Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
この命名法は特に、特定の共通の特性を有するアミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失を含む修飾に関連する。斯かる修飾は、保存的アミノ酸修飾と呼ばれる。保存的修飾の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の各群内で行われる修飾が挙げられる。比活性を大きく改変しないアミノ酸修飾は、本技術分野では周知であり、例えば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New Yorkに記載されている。最も一般的に行なわれる変換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにその逆である（Taylor, 1986, Journal of Theoretical Biology 119: 205-218)。
本発明の変異体
好ましい実施形態によれば、変異体は、親α−アミラーゼの領域１９３〜２１３における１又は２以上の（或いは１又は数個の）アミノ酸残基の（１又は２以上の）改変を含む。特に好ましい実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、さらに１９３〜２１３のアミノ酸領域内に、１又は２以上の（或いは１又は数個の）アミノ酸残基の改変を含む（ここで、番号付けは、配列番号６の成熟ポリペプチドに対応する、即ち配列番号６の番号付けを用いる）。本発明者等は、斯かる改変によって得られる変異体が、キレート剤を含む組成物において、向上した安定性を有し得ることを見出した。斯かる安定性は、特にキレート剤が、「材料及び方法」の記載に従って、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９．０ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８．０ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７．０ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６．０ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５．０ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４．０ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３．０ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２．０ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１．０ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るものである場合に顕著である。
本発明の第一の側面は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて範囲１９３〜２１３において１又は２以上の位置に置換を含み、更に前記組成物が少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
本発明の第一の側面は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて範囲１９３〜２１３において１又は２以上の位置に置換を含み、更に前記組成物が少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、任意により洗浄助剤を含んでいてもよい、組成物に関する。
第二の側面は、親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体α−アミラーゼが、配列番号６、８、１０、１２、１８、及び２２と、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含み、更に配列番号６に従う番号付けを用いて１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１又は２以上の位置に置換を含み、更に前記組成物が少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物を提供する。
更なる側面は、（配列番号６に従う番号付けを用いて）１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１又は２以上の位置に置換を含む変異体を含む組成物であって、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物を提供する。
更なる側面は、（配列番号６に従う番号付けを用いて）１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１又は２以上の位置に置換を含む変異体を含む組成物であって、前記変異体が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１８、又は配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物を提供する。
更なる側面は、（配列番号６に従う番号付けを用いて）１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１又は２以上の位置に置換を含む変異体を含む組成物であって、前記変異体が配列番号１４、配列番号１６又は配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物を提供する。
第三の側面は、２１℃及びｐＨ８．０で、８０ｍＭ塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中で測定した場合に、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
第三の側面は、「材料及び方法」に記載のアッセイで測定した場合に、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
従って、本発明の好ましい側面によれば、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置１９３〜２１３に対応する範囲の１又は２以上の位置に少なくとも１の置換を含む。本願において、「〜に従う番号付けを用いて」（using the numbering according to ...）又は「〜に対応する」（corresponding to ...）という語は、相互交換可能に用いられ、本願において用いられる番号付けシステムを意味する。従って、位置１９５は、配列番号６の位置１９５に対応するアミノ酸である。従って、（各アミノ酸配列間の可能な限り最良のアミノ酸配列アラインメントにより決定される）同等の（１又は２以上の）位置で修飾された他の親α−アミラーゼの変異体も、含まれることになる。欠失が存在する場合は、欠失が存在しないものと仮定して、番号付けを決定する。
特に好ましい実施形態によれば、組成物は変異体を含み、その変異体は、（配列番号６の番号付けを用いて）１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含む。
特に好ましい実施形態によれば、組成物は変異体を含み、その変異体は、（配列番号６の番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される位置に対応する１若しくは２以上の、又は１若しくは数個の位置に改変を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群より選択される位置に対応する１若しくは２以上の、又は１若しくは数個の位置に改変を含む。
本発明の一側面によれば、組成物は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の（或いは１又は数個の）位置に置換を含む親α−アミラーゼの変異体を含み、前記変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２を含む任意の配列でもよい、親α−アミラーゼのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有し、前記変異体は、残存活性がキレート剤（前記キレート剤が、後述のように、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、１０ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る）の存在下で EnzChek 又は PNP-G7 アッセイ（詳細については「材料及び方法」を参照のこと）に記述されるようにｐＨ８及び３１℃で１８時間後に測定される場合に、少なくとも７０％の残存活性、好ましくは少なくとも７５％の残存活性、好ましくは少なくとも８０％の残存活性、好ましくは少なくとも８５％の残存活性、好ましくは少なくとも９０％の残存活性、好ましくは少なくとも９５％の残存活性、好ましくは少なくとも１００％の残存活性、好ましくは少なくとも１０５％の残存活性、好ましくは少なくとも１１０％の残存活性を有する、又は親α−アミラーゼの残存活性と比較して少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有する。
本発明の組成物は、好ましくは、α−アミラーゼを含み、ここで親α−アミラーゼが、以下の置換：位置１９３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置１９８の［Ｑ又はＮ］による；位置２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，又はＨ］による；位置２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］又は位置２１３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による置換の少なくとも１により修飾され、前記位置は、配列番号６を有する成熟ポリペプチドの位置に対応し、更に前記組成物は、少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
本発明の組成物は、好ましくは、α−アミラーゼ変異体を含み、前記変異体が１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、ここで親α−アミラーゼが以下の置換：１９３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置１９８の［Ｑ又はＮ］による；位置２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，又はＨ］による；位置２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による；位置２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］、位置２１３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］又は位置２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換のうち少なくとも１つにより修飾され、前記位置が、配列番号６を有する成熟ポリペプチドの位置に対応し、更に前記組成物は、少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
特に、本発明は、α−アミラーゼを含む組成物に関し、ここでアミノ酸配列が以下の置換：１９３のＴによる；位置１９５のＦ又はＹによる；位置１９７のＦ又はＬによる；位置１９８のＮによる；位置２００のＦによる；位置２０３のＦによる；位置２０６のＦ、Ｌ又はＹによる；位置２１０のＹによる；位置２１２のＶによる；位置２１３のＡによる；位置２４３のＦによる置換の少なくとも１つにより修飾され、前記位置が、配列番号６を有する成熟ポリペプチドの位置に対応し、更に、前記組成物が少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
更なる側面によれば、組成物は、α−アミラーゼ変異体を含み、前記変異体が１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される２若しくはそれ以上の、又は２若しくは数個の位置での置換を含み、前記位置が、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応し、更に、前記組成物が少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
更に別の側面によれば、組成物は、α−アミラーゼ変異体を含み、前記変異体が１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも２若しくはそれ以上、又は少なくとも３若しくはそれ以上の欠失を含み、更に１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される２又はそれ以上の位置に置換を含み、前記位置が、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応し、更に、前記組成物が少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得、ここで、キレート剤（前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、後述のように、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る）の存在下で、 EnzChek 又はPNP-G7 アッセイ（詳細については「材料及び方法」を参照のこと）に記述されるように、残存活性がｐＨ８及び３１℃で１８時間後に測定された場合、前記変異体が、少なくとも７０％の残存活性、好ましくは少なくとも７５％の残存活性、好ましくは少なくとも８０％の残存活性、好ましくは少なくとも８５％の残存活性、好ましくは少なくとも９０％の残存活性、好ましくは少なくとも９５％の残存活性、好ましくは少なくとも１００％の残存活性、好ましくは少なくとも１０５％の残存活性、好ましくは少なくとも１１０％の残存活性を有し、又は親α−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有する。
好ましい実施形態によれば、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内の少なくとも２の欠失は、１８１＊＋１８２＊；１８１＊＋１８３＊、１８２＊＋１８３＊；１８１＊＋１８４＊、１８２＊＋１８４＊及び１８３＊＋１８４＊からなる群より選択される。
更に別の側面によれば、組成物は、α−アミラーゼ変異体を含み、前記変異体が（配列番号６の番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失含み、更に１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される２又はそれ以上の位置に置換を含み、前記位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応し、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群より選択される位置に対応する１若しくは又は２以上の、又は１又若しくは数個の位置に改変を含み、更に、前記組成物は少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
本発明の一側面によれば、組成物は、少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得、以下のアミラーゼ変異体；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ
ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ、
ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ、
の１又は２以上（或いは１又は数個）、を含む。
有用な実施形態によれば、本発明の組成物は、親α−アミラーゼの変異体であるアミラーゼを含み、ここで、親α−アミラーゼが配列番号６の配列であり、前記変異体が欠失Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊、並びに以下の一組の変異：（ａ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙ；（ｂ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ，Ｈ，Ｙ；（ｃ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ，Ｆ＋Ｈ２１０Ｙ；（ｄ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ；（ｅ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ２４３Ｆ；（ｆ）Ｓ１９３Ｔ＋Ｖ２０６Ｌ；（ｇ）Ｇ１３３Ｅ＋Ｇ１４９Ｒ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２０３Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ；（ｈ）Ｖ２０６Ｌ，Ｙ；（ｉ）Ｙ２４３Ｆ；（ｊ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆ；（ｋ）Ｎ１９５Ｆ；又は（ｌ）Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆのうちの一つを含む。
本発明の別の実施形態は、「材料及び方法」に記載の EnzChek 又は PNP-G7 アッセイの記述に従って、ｐＨ８及び３１℃で１８時間後に残存活性を決定した場合に、変異体の残存活性が、親α−アミラーゼと比較して、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％、例えば少なくとも１０５％、例えば少なくとも１１０％、例えば少なくとも１１５％の残存活性であり、且つ、「材料及び方法」の記載に従って２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、前記キレート剤が１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。
本発明のさらなる実施形態は、「材料及び方法」に記載の EnzChek 又は PNP-G7 アッセイの記述に従い、ｐＨ８及び３１℃で１８時間後に残存活性を決定した場合に、変異体の残存活性が、キレート剤の存在下で親α−アミラーゼ残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善され、且つ、「材料及び方法」の記載に従って２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、前記キレート剤が１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物に関する。親と比較した変異体の残存活性の％ポイント（ｐｐ）の向上は、変異体の残存活性と親の残存活性との差として計算される。
従って、本発明の特定の側面によれば、組成物は、リン含有、リン不含有、カルボキシレート含有、窒素含有、又は窒素不含有のキレート剤からなる群より選択されるキレート剤を含み、好ましいキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ、ＨＥＤＰ、及びそれらの混合物である。
本発明の好ましい側面によれば、変異体は、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応する。
本発明の特に好ましい側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含みむ（前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応する）。好ましい実施形態によれば、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも２の欠失は、１８１＊＋１８２＊；１８１＊＋１８３＊、１８２＊＋１８３＊；１８１＊＋１８４＊、１８２＊＋１８４＊及び１８３＊＋１８４＊からなる群より選択される。
本発明の別の好ましい側面によれば、変異体は、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群より選択される１又は２以上の（或いは１又は数個の）位置に置換を含む（前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応する）。
本発明のさらに好ましい側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応する。
更なる側面によれば、変異体は、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２３５、２４３、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群より選択される２又は３以上の位置に置換を含み、前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応する。
更に別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２３５、２４３、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群より選択される２又は３以上の位置に置換を含み、前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応する。
好ましくは、１又は２以上の上述の特定された位置に改変を含む変異体は、親α−アミラーゼと比較して、キレート剤を含む組成物中、例えば洗剤中、好ましくは液体洗剤中で向上した安定性を有する。
従って、本発明の変異体は、好ましい実施形態によれば、１又は２以上のキレート剤の存在下でその親アミラーゼと比較して改善された安定性を有する。好ましい側面によれば、本発明の変異体は、１又は２以上のキレート剤及び低カルシウム濃度の存在下で、その親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有する。さらに好ましい側面によれば、本発明の変異体は、キレート剤（前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る）の存在下で、その親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有する。
特定の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置の置換、及び１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３８、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群より選択される１又は２以上の位置の置換を含み、前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応し、残存活性が、「材料及び方法」の記載に従い EnzChek アッセイ又は PNP-G7 アッセイに記述されるように３１℃及びｐＨ８．０で、１８時間後に測定される場合、キレート剤の存在下で、前記変異体は、更に、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の残存活性を有し、前記キレート剤は１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭの未満の濃度で、後述のように２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。好ましい実施形態によれば、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも２の欠失は、１８１＊＋１８２＊；１８１＊＋１８３＊、１８２＊＋１８３＊；１８１＊＋１８４＊、１８２＊＋１８４＊及び１８３＊＋１８４＊からなる群より選択される。
別の特定の側面によれば、変異体は、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記位置は配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に対応し、更に、「材料及び方法」の記載に従い EnzChek アッセイ又は PNP-G7 アッセイに記述されるように、３１℃でＤＴＰＡの存在下で、ｐＨ８で１８時間後に残存活性を決定した場合に、キレート剤の存在下で、前記変異体が、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の残存活性を有する、又は親α−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有し、且つ、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、前記キレート剤が１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭの未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
本発明の変異体は、それらの親α−アミラーゼと比較して、強キレート剤に対してより安定であるという利点を有するが、しかしながら、それらは同時に、親α−アミラーゼの性能特性、例えば洗浄性能又は食器洗浄性能を保持している。好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、キレート剤に対してより安定である利点を有し、前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で、８０ｍＭ塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中で測定された場合、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。これらの好ましいキレート剤は、限定されるものではないが、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ ＨＥＤＰ及びそれらの混合物から選択することができる。
従って、本発明の変異体は、それらの親α−アミラーゼと比較して、金属イオン、特にカルシウムイオンと結合するキレート剤の存在下で、向上した安定性を有する。洗剤においては、洗濯プロセスにおける有益な効果のために、キレート剤を含むことは一般的であるが、向上した安定性は、天然のキレート剤、例えば、フィチン酸又はクエン酸を含む植物材料が存在する条件下でも存在し得る。特に、強キレート剤は、カルシウムイオンに対してカルシウム感受性α−アミラーゼと競合し、α−アミラーゼの構造中のカルシウムイオン結合をある程度奪ってしまう結果、α−アミラーゼの安定性又は活性が減少する。
従って、本発明の変異体は、それらの親α−アミラーゼと比較して、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ ＨＥＤＰ及びそれらの混合物の存在下で、改善された安定性及び／又は活性を有する。
親α−アミラーゼと比較してキレート剤に対する向上した安定性に加えて、本発明の変異体は、親α−アミラーゼと比較した場合、保持された又は改善された洗浄性能を有する。改善された洗浄性能は、「材料及び方法」の記載に従い、ＡＭＳＡ、又はビーカーを用いた洗浄性能試験において測定され得る。
従って、本発明の特定の実施形態によれば、残存活性がキレート剤（前記キレート剤は、１０ｍＭ未満の濃度で、後述のように２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る）の存在下で、 EnzChek 又は PNP-G7 アッセイ（詳細については「材料及び方法」を参照のこと）の記載に従いｐＨ８及び３１℃で１８時間後に測定される場合、変異体が、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の残存活性、好ましくは少なくとも７０％の残存活性、好ましくは少なくとも７５％の残存活性、好ましくは少なくとも８０％の残存活性、好ましくは少なくとも８５％の残存活性、好ましくは少なくとも９０％の残存活性、好ましくは少なくとも９５％の残存活性を有し、又は親α−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有し、「材料及び方法」の記載に従い、ＡＭＳＡ又はビーカーを用いた洗浄性能試験において測定された場合、及び変異体が、更に、親α−アミラーゼと比較して、少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％改善された洗浄性能を有する。
本発明の好ましい側面によれば、実施例２ａの記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、並びに残存活性が「材料及び方法」に記載の EnzChek 又は PNP-G7 アッセイの記載に従い、３１℃でｐＨ８で、１８時間後に測定された場合に、組成物は、キレート剤（前記キレート剤が、１０ｍＭ未満好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る）の存在下で、親α−アミラーゼと比較して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の残存活性を有する変異体を含む。
従って、本発明の特定の側面によれば、組成物は、リン含有、リン不含有、窒素含有、又は窒素不含有のキレート剤からなる群より選択されるキレート剤を含み、好ましいキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ、ＨＥＤＰ及びそれらの混合物である。
好ましい側面によれば、本発明の変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の配列でもよい、親α−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置の置換を含み、前記変異体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の配列でもよい、親α−アミラーゼのアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換含み、前記変異体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の配列でもよい、親α−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の一つの更なる側面によれば、変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記変異体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の別の側面によれば、変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１又は２以上の位置１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３又は２４３に置換を含み、１又は２以上の位置１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８に置換を含み、前記変異体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の配列でもよい、親α−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％の、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の別の側面によれば、変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、１又は２以上の位置１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３又は２４３に置換、及び１又は２以上の位置１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８に置換を含み、前記変異体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の配列でもよい、親α−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。
一側面によれば、本発明の変異体中のアミノ酸置換の数は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を含む任意の配列でもよい、親α−アミラーゼと比較して、１０置換未満、例えば９置換未満、例えば８置換未満、例えば７置換未満、例えば６置換未満、例えば５置換未満、例えば４置換未満、例えば３置換未満、例えば２置換未満である、及び／又は欠失の数が、１０欠失未満、例えば９欠失未満、例えば８欠失未満、例えば７欠失未満、例えば６欠失未満、例えば５欠失未満、例えば４欠失未満、例えば３欠失未満、例えば２欠失未満、例えば１欠失未満である、又は前記変異体が欠失を含まない、及び／又は挿入の数が、１０挿入未満、例えば９挿入未満、例えば８挿入未満、例えば７挿入未満、例えば６挿入未満、例えば５挿入未満、例えば４挿入未満、例えば３挿入未満、例えば２挿入未満、例えば１挿入未満である、又は前記変異体が挿入を含まない。
一側面によれば、変異体は、位置１９３に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの、位置１９３に対応する位置の［Ｇ，Ａ，Ｔ又はＭ］による置換を含む。一つの特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｓ１９３Ｔを含み、ここで、親α−アミラーゼが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置１９５に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置１９５にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は置換Ｎ１９５Ｆを含み、ここで、親は配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９５に置換としてＹを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙを含み、ここで親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置１９５にＦを含み、別のさらに好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆを含み、ここで親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９５にＹを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｙを含み、ここで親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置１９７に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置１９７にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９７Ｆを含み、ここで親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９７に置換としてＬを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９７Ｌを含み、ここで、親α−アミラーゼが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９７に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置１９７の［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置１９７にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９７Ｆを含み、ここで、親が配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９７に置換としてＬを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９７Ｌを含み、ここで、親α−アミラーゼが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置１９８に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置１９８の［Ｑ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｋ又はＨ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置１９８にＮを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ１９８Ｎを含み、ここで、親α−アミラーゼが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８、２０又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９８に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置１９８の［Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ又はＨ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置１９８にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ１９８Ｎを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２００に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２００にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ２００Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２００に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２００にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ２００Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２０３に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２０３にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ２０３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２０３に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２０３にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ２０３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２０６に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｈ，Ｑ，Ｄ，又はＥ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２０６にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２０６にＹを含み、更に別の側面によれば、変異体は、位置２０６にＬを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｙを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｙを含む。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｆを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｆを含む。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｌを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｌを含む。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｈを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｈを含む。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２０６に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｈ，Ｑ，Ｄ，又はＥ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２０６にＦを含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２０６にＹを含む。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｙを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｙを含む。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｌを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｌを含む。
一つの特定の実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｈを含む。別の特定の実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｈを含む。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２１０に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２１０にＹを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｈ２１０Ｙを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内にに少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２１０に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は位置２１０にＹを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｈ２１０Ｙを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２１２に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２１２にＶを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｅ２１２Ｖを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２１２に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２１２にＶを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｅ２１２Ｖを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２１３に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２１３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２１３にＡを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｖ２１３Ａを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２１３に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２１３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２１３ににＡを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｖ２１３Ａを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、位置２４３に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２４３にＦを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ２４３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
一側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２４３に置換を含み、好ましい側面によれば、変異体は、位置２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含み、別の好ましい側面によれば、変異体は、位置２４３にＡを含み、更に別の好ましい側面によれば、変異体は、置換Ｙ２４３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、変異体は、位置１９３及び１９５に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９３及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｍ又はＱ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３及び１９５に、置換としてＴ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３及び１９５に、置換としてＴ及びＹを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９３及び１９５に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９３及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｍ又はＱ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３及び１９５に置換としてＴ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３及び１９５にＴ及びＹを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、位置１９５及び１９８に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５及び１９８の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ又はＱ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び１９８に、置換としてＦ及びＮを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ１９８Ｎを含み、ここで、親は、配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び１９８に置換としてＹ及びＮを含む。別の側面によれば、変異体は置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ１９８Ｎを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び１９８に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び１９８の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ又はＱ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び１９８に置換としてＦ及びＮを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ１９８Ｎを含み、ここで、親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び１９８に置換としてＹ及びＮを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ１９８Ｎを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、位置１９５及び２０６に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｅ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２０６に置換としてＦ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，又はＨ］を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、１９５及び２０６に置換としてＹ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び２０６に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｅ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２０６に置換としてＦ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６［Ｆ又はＹ］を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２０６に置換としてＹ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５及び２１０に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５及び２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２１０に置換としてＦ及びＹを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙを含み、ここで、親は、配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９５及び２１０に置換としてＹを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｈ２１０Ｙを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び２１０に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２１０に置換としてＦ及びＹを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９５及び２１０に対応する位置に置換としてＹを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｈ２１０Ｙを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、位置１９８及び２０６に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９８及び２０６の［Ｎ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｅ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９８及び２０６に置換としてＮ及び［Ｆ又はＹ］を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ又はＮ］を含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９８及び２０６に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９８及び２０６の［Ｎ，Ｑ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｄ，Ｅ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９８及び２０６に置換としてＮ及び［Ｆ又はＹ］を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ又はＮ］を含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置２０６及び２１３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２０６及び２１３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置２０６及び２１０に置換として［Ｆ又はＹ］及びＡを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｆ又はＹ＋Ｖ２１３Ａを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの。置換Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］＋Ｖ２１３Ａを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に位置２０６及び２１３に置換を含む。
別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２０６及び２１３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置２０６及び２１０に置換として［Ｆ又はＹ］及びＡを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］、Ｖ２１３Ａを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］＋Ｖ２１３Ａを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５及び２４３に［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２４３に置換としてＦを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２４３に置換としてＹ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び２４３に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５及び２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２４３に置換としてＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５及び２４３に置換としてＹ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２０６及び２４３の［Ｈ，Ｄ，Ｅ，Ｎ，Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置２０６及び２４３に置換としてＬ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置２０６及び２４３の［Ｈ，Ｄ，Ｅ，Ｎ，Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置２０６及び２４３に置換としてＬ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９３、１９５、及び１９７に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９３、１９５、及び１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に対応する位置に置換としてＴ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に置換としてＴ、Ｆ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｌを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、位置１９３、１９５、及び１９７に対応する位置に置換としてＴ、Ｙ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に対応する位置に、置換としてＴ、Ｙ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｌを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８、２０又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９３、１９５、及び１９７に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９３、１９５、及び１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に置換としてＴ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に置換としてＴ、Ｆ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｌを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に置換としてＴ、Ｙ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｆを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９３、１９５、及び１９７に置換としてＴ、Ｙ及びＬを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｌを含み、ここで、親α−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは配列番号６、８、１０又は１２を有する任意の成熟ポリペプチドである。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＦ、Ｙ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に、置換としてＹ、Ｙ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＦ、Ｌ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｌ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＦ、Ｎ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に、置換としてＹ、Ｎ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に、置換としてＦ、Ｈ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｈ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＦ、Ｆ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｆ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に、置換としてＦ、Ｙ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｙ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＦ、Ｌ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｌ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に、置換としてＦ、Ｎ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｎ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３の［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に、置換としてＦ、Ｈ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｈ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の側面によれば、親α−アミラーゼの変異体は、配列番号６に従う番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、位置１９５、２０６及び２４３に、［Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｖ，Ｙ，Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｔ又はＨ］による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＦ、Ｆ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、それぞれ、位置１９５、２０６、及び２４３に置換としてＹ、Ｆ及びＦを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の側面によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
本発明の一側面によれば、変異体は、配列番号１０の成熟ポリペプチド配列の、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び１又は２以上の以下の置換、Ｎ１９５［Ｆ又はＹ］、Ｎ１９７［Ｆ又はＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｉ２０６［Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｆ、又はＹ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ又はＧ］、Ｖ２１３Ａ、及び１又は２以上の位置における置換、Ｍ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｋ１４２Ｒ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｎ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｎ１７４Ｒ、Ｇ１８６Ｒ、Ｙ２４３Ｆ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｒ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖを含む、又はアミノ酸配列は、配列番号１０を有するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有する。
本発明の別の側面によれば、変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチド配列の１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び１又は２以上の以下の置換、Ｎ１９５［Ｆ又はＹ］、Ｎ１９７［Ｆ又はＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｉ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ又はＧ］、Ｖ２１３Ａ、及び１又は２以上の位置における置換、Ｍ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｔ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｎ１７４Ｒ、Ａ１８６Ｒ、Ｙ２４３Ｆ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｒ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖを含む、又はアミノ酸配列は、配列番号８を有するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有する。
本発明の一側面によれば、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチド配列の１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び１又は２以上の以下の置換、Ｎ１９５［Ｆ又はＹ］、Ｎ１９７［Ｆ又はＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ又はＧ］、Ｖ２１３Ａ、又はＹ２４３Ｆ、及び１又は２以上の位置における置換、Ｉ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｋ１４２Ｒ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｎ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｑ１７４Ｒ、Ａ１８６Ｒ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｋ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖを含む、又はアミノ酸配列は、配列番号６を有するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有する。
本発明の一側面によれば、変異体は、配列番号１２の成熟ポリペプチド配列の１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、及び１又は２以上の以下の置換、Ｎ１９５［Ｆ又はＹ］、Ｎ１９７［Ｆ又はＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｖ２０６［Ｆ，Ｙ，Ｌ，Ｈ，又はＮ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ又はＧ］、Ｖ２１３Ａ又はＹ２４３Ｆ、及び１又は２以上の位置における置換、Ｉ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｋ１４２Ｒ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｎ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｑ１７４Ｒ、Ａ１８６Ｒ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｋ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖを含む、又はアミノ酸配列は、配列番号１２を有するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくともの同一性の程度を有する。
従って、本発明の一つの側面は、親α−アミラーゼの変異体であって、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（ｉ）前記位置のすぐ下流のアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii）前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し；及び
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体に関する。
従って、本発明の一つの側面は、親α−アミラーゼの変異体であって、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（ｉ）前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii）前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し；及び
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体に関する。
好ましくは、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは配列番号１４、１６又は２０、好ましくは配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２、又は２０のうちの一つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、１又は２以上の上記の特定された位置に改変を含む変異体は、キレート剤を含む組成物、例えば産業用組成物、例えば洗剤、好ましくは液体洗剤中において、親α−アミラーゼと比較して、向上した安定性を有する。
本発明者等は、これらの変異体が、キレート剤（前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、、「材料及び方法」の記載に従い、２１℃及びｐＨ８．０において、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る）を含む組成物中で、親α−アミラーゼと比較して、改善された安定性を有することを見出した。
従って、本発明の別の側面は、ポリペプチドを調製する方法であって、
（ａ）アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を用意し；
（ｂ）配列番号６の成熟ポリペプチドの位置１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３に対応する１又は２以上の位置を占める１又は２以上のアミノ酸を選択すると共に、更に位置１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８に対応する１又は２以上の位置を選択し；
（ｃ）前記選択されたアミノ酸残基の置換若しくは欠失、又は前記選択されたアミノ酸残基の下流側に隣接する１又は２以上のアミノ酸残基の挿入により前記配列を修飾し；
（ｄ）前記修飾された配列を有する変異ポリペプチドを生成し；
（ｅ）前記変異ポリペプチドをアミラーゼ活性及び安定性について検証し；及び
（ｆ）アミラーゼ活性を有すると共に、前記親ポリペプチドと比較してキレート剤存在下の安定性が向上した変異ポリペプチドを選択し、
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、方法に関する。
好ましくは、変異体は、３の位置、より好ましくは４の位置、さらにより好ましくは５の位置、及び最も好ましくは６の位置に改変を含み、特に好ましい実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び更に、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３（配列番号６の番号付けを用いて）からなる群より選択される親α−アミラーゼの位置に対応する１又は２以上の位置に１又は２以上の置換を含む。
従って、好ましい側面は、親α−アミラーゼの変異体であって、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、更に、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４１３、４３４、４４７、４５８からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（ｉ）前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii）前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し；及び
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体に関する。
好ましい実施形態によれば、変異体α−アミラーゼは、１又は２以上の（数個の）アミノ酸欠失及び／又は置換及び／又は挿入を有する。特に好ましい実施形態によれば、変異体α−アミラーゼは、本明細書で配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、更に以下の改変：Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊（位置１８３及び１８４で欠失）を含むα−アミラーゼを含み、この変異体が洗剤中で優れた性能を示し、キレート剤の存在下で改善された安定性を有する。
好ましい実施形態によれば、変異体α−アミラーゼは、ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊のいずれかを含むＳＰ７０７（配列番号８）を含む。
別の好ましい実施形態によれば、変異体α−アミラーゼは、ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊のいずれかを含むＳＰ７２２（配列番号６）を含む。
更なる別の好ましい実施形態によれば、変異体α−アミラーゼは、ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊のいずれかを含むＡＡ５６０（配列番号１０）を含む。
別の好ましい実施形態によれば、親α−アミラーゼは、ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊のいずれかを含むＳＰ６９０（配列番号１２）を含む。
「ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊」とは、バシラス属α−アミラーゼＳＰ７２２が、位置Ｒ１８１及びＧ１８２において欠失により変異誘発されていることを意味し、ここで、番号付けは、配列番号６に対応する。
従って、本発明の一側面によれば、変異体α−アミラーゼは、以下：
ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊、ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊＋Ｄ１８３＊、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、
ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｔ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｔ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｔ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ、
ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；
ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ、
のいずれかを含む、以下：ＳＰ７２２、ＳＰ６９０、ＳＰ７０７又はＡＡ５６０のいずれか一つを含む。
「ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ」とは、バシラス属α−アミラーゼＳＰ７２２が以下：位置Ｒ１８１及びＧ１８２における欠失及び位置１９５におけるＡｓｎ（Ｎ）からＰｈｅ（Ｆ）への置換、のように変異誘発されていることを意味し、ここで、番号付けは配列番号６に対応する（欠失した位置が未だ存在するかのように数える、即ち２つの位置を欠失する場合、番号付けは、下方に２つシフトしない）。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、改変は、以下の置換：
Ｘ１９３Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＳ１９３Ｔ；
Ｘ１９５Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＮ１９５［Ｆ又はＹ］；
Ｘ１９７Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＮ１９７［Ｆ又はＬ］；
Ｘ１９８Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＹ１９８Ｎ；
Ｘ２００Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＹ２００Ｆ；
Ｘ２０３Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＹ２０３Ｆ．
Ｘ２０６Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＶ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、又はＮ］；
Ｘ２１０Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＨ２１０Ｙ；
Ｘ２１２Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＥ２１２［Ｖ又はＧ］；及び
Ｘ２１３Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ、好ましくはＶ２１３Ａ．
Ｘ２４３Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＹ２４３Ｆ、
から選択される。
別の好ましい実施形態によれば、変異体は、３の位置、より好ましくは４の位置、より好ましくは５の位置、及びより好ましくは６の位置に改変を含み、特に好ましい実施形態によれば、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、及び更に、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３、からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置における改変、及び１１６、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２４４、３０３、３２０、３５９、４１８、４４７からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置における改変を含む（配列番号６の番号付けを用いて）。
従って、本発明の特に好ましい実施形態によれば、改変は、以下の置換：
Ｘ１１６Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＮ１１６Ｔ
Ｘ１１８Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＲ１１８Ｋ
Ｘ１２９Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＱ１２９Ｌ
Ｘ１３３Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＧ１３３Ｅ
Ｘ１３４Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＤ１３４Ｙ
Ｘ１４２Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＫ１４２Ｒ
Ｘ１４６Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＰ１４６Ｓ
Ｘ１４７Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＧ１４７Ｅ
Ｘ１４９Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＧ１４９Ｒ
Ｘ１５１Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＴ１５１Ｒ
Ｘ１５２Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＹ１５２Ｈ
Ｘ１６９Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＱ１６９Ｅ
Ｘ１７４Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＱ１７４Ｒ
Ｘ１８６Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＡ１８６Ｒ
Ｘ２３５Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＩ２３５Ｎ
Ｘ２４４Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＳ２４４Ｑ
Ｘ３０３Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＧ３０３Ｖ
Ｘ３２０Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＫ３２０Ｎ Ｘ３３９Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＳ３３９Ｐ
Ｘ３５９Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＲ３５９Ｉ
Ｘ４１８Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＮ４１８Ｄ
Ｘ４３１Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＳ４３１Ｔ
Ｘ４３４Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＰ４３４Ｔ
Ｘ４４７Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＡ４４７Ｖ
Ｘ４５８Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ、好ましくはＲ４５８Ｋ
から選択される。
特に好ましい実施形態によれば、変異体は、更に、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の変異体中のアミノ酸置換の数は、好ましくは１７置換、より好ましくは１６置換、より好ましくは１５置換、より好ましくは１４置換、より好ましくは１３置換、より好ましくは１２置換、より好ましくは１１置換、より好ましくは１０置換、より好ましくは９置換、より好ましくは８置換、より好ましくは７置換、より好ましくは６置換、より好ましくは５置換、より好ましくは４置換、より一層好ましくは３置換、及び最も好ましくは２置換である。別の好ましい実施形態によれば、本発明の変異体中のアミノ酸置換の数は、好ましくは１７置換、より好ましくは１６置換、より好ましくは１５置換、より好ましくは１４置換、より好ましくは１３置換、より好ましくは１２置換、より好ましくは１１置換、より好ましくは１０置換、より好ましくは９置換、より好ましくは８置換、より好ましくは７置換、より好ましくは６置換、より好ましくは５置換、より好ましくは４置換、より一層好ましくは３置換、及び最も好ましくは２置換からなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、様々な改変の組み合わせを含む。従って、好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、好ましくは位置１８３及び１８４における欠失を含み、更に、改変の以下の組み合わせ、位置１８６及び１９５における置換；位置１７４及び２１２における置換；位置２０６及び２１２における置換；位置２０６、２１２及び３０４における置換；位置２０６、２１２、３０４及び４４７における置換；位置１１６及び１３３における置換；位置２３５及び３３９における置換；位置１９３及び２０６における置換；位置１１６、１３３及び１４２における置換；位置１１６、１３３、１４２及び１９８における置換；位置１１６、１３３、１４２、１９８及び２０６における置換；位置１３３及び１９５における置換；位置１３３、１９５及び１９８における置換；位置１３３、１９５、１９８及び２００における置換；位置１１６及び１９５における置換；位置１１６、１９５及び１９８における置換；位置１４２及び１４６における置換；位置１４２、１４６及び１４９における置換；位置１４２、１４６、１４９及び１９５における置換；位置１４２、１４６、１４９、１９５及び１９８における置換；位置１４２、１４６、１４９、１９５、１９８及び２０６における置換；位置１５１及び２１０における置換；位置１５１、２１０及び３２０における置換；位置１８６、１９５、２１２及び２１３における置換；位置１５１、２１０、３２０及び３５９における置換；位置１５１、２１０、３２０、３５９及び４１８における置換；位置１４７及び１４９における置換；位置１４７、１４９及び１６９における置換；位置１４７、１４９、１６９及び１９８における置換；位置１４７、１４９、１６９、１９８及び２０３における置換；位置１４７、１４９、１６９、１９８、２０３及び２０６における置換；位置１３３及び１４９における置換；位置１３３、１４９及び１９５における置換；位置１３３、１４９、１９５及び１９８における置換；位置１３３、１４９、１９５、１９８及び２０３における置換；位置１４７及び１５２における置換；位置１４７、１５２及び１６９における置換；位置１４７、１５２、１６９及び１９８における置換；位置１４７、１５２、１６９、１９８及び２０６における置換；位置１９５及び２０６における置換；位置１９５及び２４３における置換；位置１９５及び２１０における置換；位置２０６及び２１０における置換；位置１８６及び１９５における置換；位置１９５及び２０６における置換；位置１９５、２０６及び２４３における置換；位置２０６及び２４３における置換；位置１３３及び１４９における置換；位置１３３、１４９及び１９８における置換；位置１３３、１４９、１９８及び２０６における置換；位置１１６及び１３３における置換；位置１１６、１３３及び１４７における置換；位置１１６、１３３、１４７及び１５２における置換；位置１１６、１３３、１４７、１５２及び１９８における置換；位置１１６、１３３、１４７、１５２、１９８及び２０３における置換；位置１１６、１３３、１４７、１５２、１９８、２０３及び２０６における置換；位置１４７及び１４９における置換；位置１４７、１４９及び１９５における置換；位置１４７、１４９、１９５及び１９８における置換；位置１４７、１４９、１９５、１９８及び２０６における置換；位置１３３及び１４２における置換；位置１３３、１４２及び１９５における置換；位置１３３、１４２、１９５及び１９８における置換；位置１３３及び１４９における置換；位置１３３、１４９及び１５２における置換；位置１３３、１４９、１５２及び１９５における置換；位置１３３、１４９、１５２、１９５及び１９８における置換；位置１３３、１４９、１５２、１９５、１９８及び２０６における置換；位置１１６及び１２９における置換；位置１１６、１２９及び１４２における置換；位置１１６、１２９、１４２及び１９５における置換；位置１１６、１２９、１４２、１９５及び１９８における置換；位置１１６、１２９、１４２、１９５、１９８及び２０３における置換；位置１１６、１２９、１４２、１９５、１９８、２０３及び２０６における置換；位置１３３及び１４９における置換；位置１３３、１４９及び１５２における置換；位置１３３、１４９、１５２及び１９５における置換；位置１３３、１４９、１５２、１９５及び１９８における置換；位置１３３、１４９、１５２、１９５、１９８及び２０３における置換；位置１３３、１４９、１５２、１９５、１９８、２０３及び２０６における置換；位置１１６及び１３３における置換；位置１１６、１３３及び１４９における置換；位置１１６、１３３、１４９及び１９８における置換；位置１１６、１３３、１４９、１９８及び２０３における置換；位置１１６、１３３、１４９、１９８、２０３及び２０６における置換；位置１９５及び１９８における置換；位置１９５、１９８及び２０３における置換；位置１９５、１９８、２０３及び２０６における置換；位置１３３、１４９、１９５、２０３、及び２０６における置換、のうちの一つを含む。
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、様々な改変の組み合わせを含む。従って、好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失、好ましくは位置１８３及び１８４における欠失を含み、更に、改変の以下の組み合わせ、位置１８６の［Ｒ，Ｔ，Ｋ，Ｈ，Ｅ，Ｄ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１７４の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｅ，Ｄ，Ｑ，又はＮ］による及び２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置２０６の［Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による及び２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による、２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び３０４の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による、２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による、３０４の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び４４７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による及び１３３の［Ｅ又はＤ］による置換；位置２３５の［Ｎ又はＬ］による及び３３９の［Ｐ］による置換；位置１９３の［Ｇ，Ａ，Ｔ又はＭ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による、１３３の［Ｅ又はＤ］による及び１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による、１３３の［Ｅ又はＤ］による、１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９８の［Ｑ又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による、１３３の［Ｅ又はＤ］による、１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による、１９８の［Ｑ又はＮ］による［Ｑ又はＮ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１３３の［Ｅ又はＤ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ又はＤ］による、１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ又はＮ］による置換；位置１８６の［Ｒ，Ｔ，Ｋ，Ｈ，Ｅ，Ｄ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２１３の［Ａ］による置換；位置１３３の［Ｅ又はＤ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ又はＮ］による及び２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ又はＮ］による置換；位置１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１４６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による置換；位置１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１４６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１４６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１４６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１４６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，Ｎ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１５１の［Ｒ］による及び２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１５１の［Ｒ］による，２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び３２０の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１５１の［Ｒ］による，２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，３２０の［Ｑ，Ｎ］による及び３５９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１５１の［Ｒ］による，２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，３２０の［Ｑ，又はＮ］による，３５９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び４１８の［Ｅ，又はＤ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１６９の［Ｅ，又はＤ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１６９の［Ｅ，又はＤ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１６９の［Ｅ，又はＤ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１６９の［Ｅ，又はＤ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による及び１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１６９の［Ｅ，又はＤ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１６９の［Ｅ，又はＤ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１６９の［Ｅ，又はＤ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による及び２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１８６の［Ｒ，Ｔ，Ｋ，Ｈ，Ｅ，Ｄ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，２０６及び２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置２０６及び２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０６の置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による及び１３３の［Ｅ，又はＤ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による及び１４７の［Ｅ，又はＤ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４７の［Ｅ，又はＤ］による及び１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１４７の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０６の置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による 及び１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０６の置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による及び１２９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１２９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１２９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１２９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，
又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１２９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１２９の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１４２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１５２の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による及び１３３の［Ｅ，又はＤ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による及び１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１１６の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，又はＭ］による，１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び１９８の［Ｑ，又はＮ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による及び２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による置換；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，１９８の［Ｑ，又はＮ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換；位置１３３の［Ｅ，又はＤ］による，１４９の［Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｑ，又はＮ］による，１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，又はＶ］による，及び２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｎ，Ｑ，又はＨ］による置換、のうちの一つを含む。
特に有用な本発明の変異体は、以下：Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｐ４３４Ｔ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ｓ３３９Ｐ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ、Ｎ１９５Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；Ｎ１１６Ｔ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；Ｄ１３４Ｙ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；Ｔ１５１Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｋ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ Ｑ４９０Ｈ；Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｎ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ、Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ Ｖ２０６Ｌ、Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、を含む（配列番号６の番号付けを用いて）。
好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、
ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｐ４３４Ｔ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ｓ３３９Ｐ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７２２＋Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；ＳＰ７２２＋Ｄ１３４Ｙ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ７２２＋Ｔ１５１Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｋ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＳＰ７２２＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋ Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋ Ｎ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、
を含む。
一つの好ましい実施形態によれば、変異体は、以下：ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｎ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｈ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、から選択される。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、
ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ４３４Ｔ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ａ３３９Ｐ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ、Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７０７＋Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；ＳＰ７０７＋Ｅ１３４Ｙ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ７０７＋Ｔ１５１Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｒ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＳＰ７０７＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１４７Ｅ Ｑ１６９Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋ Ｍ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ、
を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、
ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ４３４Ｔ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ａ３３９Ｐ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１８６Ｒ、Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＡＡ５６０＋Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｉ；ＡＡ５６０＋Ｅ１３４Ｙ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＡＡ５６０＋Ｔ１５１Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｒ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＡＡ５６０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋ Ｍ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ、
を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、
ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｐ４３４Ｔ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ａ３３９Ｐ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ６９０＋Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；ＳＰ６９０＋Ｅ１３４Ｙ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ６９０＋Ｎ１５１Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｋ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＳＰ６９０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋ Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋ Ｎ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｎ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｈ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、
を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の変異体は、親α−アミラーゼの変異体を含み、ここで、親α−アミラーゼは配列番号６の配列であり、前記変異体は、欠失Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊並びに変異の以下のセット：（ａ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙ；（ｂ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ、Ｈ，Ｙ；（ｃ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ、Ｆ＋Ｈ２１０Ｙ；（ｄ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ；（ｅ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ２４３Ｆ；（ｆ）Ｓ１９３Ｔ＋Ｖ２０６Ｌ；（ｇ）Ｇ１３３Ｅ＋Ｇ１４９Ｒ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２０３Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ；（ｈ）Ｖ２０６Ｌ，Ｙ；（ｉ）Ｙ２４３Ｆ；（ｊ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆ；（ｋ）Ｎ１９５Ｆ；又は（ｌ）Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆ、のうちの一つを含む。
洗剤組成物（detergent composition）：本発明によれば、上述のα−アミラーゼ変異体は、典型的に、洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物又は食器洗浄洗剤組成物の成分であり得る。本発明の特別な実施形態によれば、組成物は、更に、強キレート剤、又は錯化剤を含む。従って、本発明の一つの側面は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置１９３〜２１３に対応する範囲中の１又は２以上の位置に置換を含む親α−アミラーゼの変異体を含み、更に、前記キレート剤を含む、組成物に関し、前記キレート剤は１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」の記載に従い２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る。
別の実施形態によれば、本組成物が含有するキレート剤は、限定されるものではないが、以下のものから選択される。即ち、キレート剤は、アミノ基を含んでもよく、例えば、アミノ−ポリカルボン酸塩又はホスホン酸塩でもよい。それは、１、２、又は３のアミノ基（典型的には、第二級又は第三級アミノ基）を含む単量体分子でもよく、また、２、３、４、又は５又はそれ以上のカルボキシル基を含んでいてもよい。キレート剤としては、限定されるものではないが、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシエタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシンジ酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミンテトラ酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はエチレンジニトリロテトラキス（メチレンホスホン酸）Ｎ，Ｎ，−ジオキシド、メチルグリシンジ酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−ジ酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、及びニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）又はそれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、典型的に、洗剤中に、０．１重量％〜７５重量％のレベルで存在する。
本発明の洗剤組成物は、更に、上述のようなキレート剤でない洗浄／洗剤助剤を含んでもよく、好ましくは、成分の混合物を含む。典型的には、洗浄助剤は、０．００１〜９９．９ｗｔ％、より典型的には、０．０１〜８０ｗｔ％の洗浄助剤の量で、組成物中に存在する。好適な洗浄助剤は以下：界面活性剤、洗浄助剤、漂白剤（bleaches）、漂白触媒、着色剤、漂白増強剤、染料移動剤、付着助剤（deposition aids）、分散剤、更なる酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、光学的光沢剤、光活性化剤、蛍光剤、布地色調剤（fabric hueing agents）、柔軟剤（fabric conditioners）、予調製過酸、ポリマー状分散剤、土壌粘土除去／再付着防止剤（anti-redeposition agents）、充填剤塩、ヒドロトロープ（hydrotropes）、光沢剤（brighteners）、消泡剤、可塑剤、柔軟剤（fabric softeners）、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、縮み防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、変色防止剤、防腐剤、アルカリ源、溶解剤、担体、処理助剤、顔料、染料、香料、及びｐＨ調整剤を含む。例えば、それらは、以下：漂白成分、例えばイミン漂白増強剤；過酸化水素源、例えば過炭酸塩及び／又は過ホウ酸塩、特に材料でコートされた過炭酸塩、例えば炭酸塩及び／又は硫酸塩、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、及びそれらの任意の混合物；カプセル化形態中の予調製過酸を含む、予調製過酸；遷移金属触媒；消泡剤又は消泡系、例えばシリコーン系消泡剤及び／又は脂肪酸系消泡剤；柔軟剤（fabric−softeners）、例えば粘土、シリコーン及び／又は第４級アンモニウム化合物；凝集剤、例えばポリエチレンオキシド；染料移動阻害剤、例えばポリビニルピロリドン、ポリ４−ビニルピリジンＮ−オキシド及び／又はビニルピロリドン及びビニルイミダゾールのコポリマー；布地統合成分（fabric integrity components）、例えばイミダゾール及びエピクロルヒドリンの縮合により生成されたオリゴマー；よごれ分散剤及びよごれ再付着防止剤、例えばアルコキシル化ポリアミン及びエトキシ化エチレンイミンポリマー；再付着防止成分、例えばポリエステル；カルボン酸系ポリマー、例えばマレイン酸ポリマー又はマレイン酸及びアクリル酸のコポリマー；香料、例えば香料マイクロカプセル、でんぷんカプセル化剤（accords）、スプレー式香料；石鹸リング（soap rings）；美的粒子（aesthetic particles）；染料；充填剤、例えば硫酸ナトリウム、もっとも、組成物は実質的に遊離の充填剤であることが好ましい；ケイ酸塩、例えば１．６Ｒ及び２．０Ｒケイ酸ナトリウムを含むケイ酸ナトリウム、又はメタケイ酸ナトリウム；ジカルボン酸とジオールのコポリエステル；セルロース系ポリマー、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエトキシセルロース、又は他のアルキル又はアルキルアルコキシセルロース；溶媒、例えば１，２プロパンジオール、モノエタノールアミン；ジエチレングリコール、エタノール、及びそれらの任意の混合物；ヒドロトロープ、例えばクメンスルホン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、及び任意の混合物；有機酸、例えばクエン酸；及びそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
従って、組成物は、更に助剤、例えば、炭酸酸、重炭酸塩、又はケイ酸塩系助剤を含んでもよく、それは、ゼオライト、例えばゼオライトＡ、ゼオライトＭＡＰ（最小アルミニウムＰ型）（Miximum Aluminium type P）でもよい。洗濯に有用なゼオライトは、好ましくは、式Ｎａ１２（ＡｌＯ２）１２（ＳｉＯ２）１２・２７Ｈ２Ｏを有し、粒子径は、通常、ゼオライトＡについて１〜１０μｍ、ゼオライトＭＡＰついて通常０．７−２μｍである。他の助剤は、メタケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３・ｎＨ２Ｏ又はＮａ２Ｓｉ２Ｏ５・ｎＨ２Ｏ）強アルカリ性であり、好ましくは食器洗浄に用いられる。好ましい実施形態によれば、洗剤助剤の量は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、又は５０％超でもよく、８０％、６５％未満でもよい。食器洗浄洗剤において、助剤のレベルは、典型的には４０〜６５％、具体的には５０〜６５％、更には７５〜９０％である。
別の好ましい側面によれば、組成物は、１又は２以上の界面活性剤を含み、それは、半極性含む非イオン性、及び／又はアニオン性、及び／又はカチオン性、及び／又は双イオン性、及び／又は両イオン性、及び／又は半極性非イオン性、及び／又はそれらの混合物でもよい。界面活性剤は典型的には、洗剤組成物の重量に対して、０．１〜６０重量％のレベルで存在し、一方代替の実施形態では、約１％〜約５０％のレベルであり、一方更に別の実施形態では、約５％〜約４０％のレベルである。
その中に含まれる場合、洗剤は、通常、約１％〜約４０％のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、２級アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含む。
その中に含まれる場合、洗剤は、通常、約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）を含む。
更なる適切なアニオン性界面活性剤は、石鹸、及び硫酸基又はスルホン酸基を含むものである。考慮されるスルホン酸型の界面活性剤は、（Ｃ９−Ｃ１３−アルキル）ベンゼンスルホン酸塩及びオレフィンスルホン酸塩であり、後者は、例えば、末端又は内部に位置する二重結合を有するＣ１２−Ｃ１８モノオレフィンのスルホン酸化により得られるような、アルケンスルホン酸塩及びヒドロキシアルカンスルホン酸塩及び同ジスルホン酸塩の混合物であると理解される。また、（Ｃ１２−Ｃ１８）アルカンスルホネート、及びα−スルホ脂肪酸のエステル（エステルスルホネート）、例えば典型的に、植物油又は動物油からのトリグリセリドの鹸化により、続いてメチル化及びスルホン化により製造される、水素添加されたココナッツ、パーム核又は獣脂の脂肪酸のα−スルホン酸化メチルエステルは、適切であり、用いられ得る。
更に適切なアニオン性界面活性剤は、モノ−、ジ−及びトリ−エステル並びにそれらの混合物を含む、スルホン酸化された脂肪酸グリセロールエステルである。
好適なアルキル（アルケニル）硫酸塩は、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪アルコール、例えば、ココナッツ脂肪アルコール、獣脂脂肪アルコール、ラウリル、ミリスチル、セチル若しくはステアリルアルコールの、又はＣ１０−Ｃ２０オキソアルコールの硫酸モノエステル、及びその鎖長を有する２級アルコールの硫酸モノエステル、のアルカリ金属塩及びナトリウム塩である。洗浄技術の観点から、とりわけ好適なのはＣ１２−Ｃ１６アルキルスルホン酸塩、及びＣ１２−Ｃ１５アルキルスルホン酸塩、及びまたＣ１４−Ｃ１５アルキルスルホン酸塩である。好適なアニオン性界面活性剤はまた、例えば米国特許第３，２３４，２５８号明細書又は米国特許第５，０７５，０４１号明細書に従って調製されるアルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）である。
また、１〜６モルのエチレンオキシドでエトキシ化された直鎖又は分岐のＣ７−Ｃ２１アルコール、例えば平均３．５モルのエチレンオキシド（ＥＯ）を含む２−メチル−分岐Ｃ９−Ｃ１１アルコール、又は１〜４ＥＯを含むＣ１２−Ｃ１８脂肪アルコールの硫酸モノエステルは、適切である。それらの高い発泡特性のため、それらは、通常は洗浄及び清浄組成物において比較的低いレベルでのみ、例えば１重量％〜５重量％のレベルで用いられる。
アニオン性界面活性剤はまた、スルホコハク酸とＣ８−Ｃ１８脂肪アルコール残基とのジエステル及び／又はモノエステルの塩、或いはそれらの混合物を含んでいてもよい。脂肪アルコール残基が狭い鎖長分布を有するスルホコハク酸塩は、とりわけ好まい。好ましくはアルキル（アルケニル）鎖内に８〜１８個のＣ原子を有するアルキル（アルケニル）スルホコハク酸又はそれらの塩を使用することはまた、同様に可能である。
考慮される更なるアニオン性界面活性剤は、アミノ酸、例えばメチルタウリンの誘導体（タウリド（taurides））及び／又はメチルグリシンの誘導体（サルコシド（sarcosides））ある。考慮される更なるアニオン性界面活性剤は石鹸である。飽和脂肪酸石鹸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、水素化エルカ酸及びベヘン酸の塩、並びに天然脂肪酸、例えばココナッツ、パーム核又は獣脂脂肪酸由来の石鹸混合物。石鹸を含むアニオン性界面活性剤は、それらのナトリウム、カリウム又はアンモニウム塩の形態、及び有機塩基、例えばモノ−、ジ−又はトリエタノールアミンの可溶性塩の形態で存在してもよい。アニオン性界面活性剤はそれらのナトリウム又はカリウム塩の形態で存在してもよい。非イオン性界面活性剤として、８〜１８個のＣ原子を有し、アルコール１モルに対して平均１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）及び／又は１〜１０モルのプロピレンオキシド（ＰＯ）を有する、好ましくはアルコキシル化された、有利にはエトキシ化された、及び／又はプロポキシ化された、特に１級アルコールは、用いられる。Ｃ８−Ｃ１６アルコールアルコキシレート、有利にはエトキシ化及び／又はプロポキシ化されたＣ１０−Ｃ１５アルコールアルコキシレート、特に２〜１０の、又は３〜８のエトキシ化の程度、及び／又は１〜６の、又は１．５〜５のプロポキシ化の程度を有するＣ１２−Ｃ１４アルコールアルコキシレートは、とりわけ好ましい。アルコール残基は、好ましくは、直鎖、若しくは特に２位のメチル分岐鎖でもよく、又はオキソアルコールに通常存在するように、直鎖とメチル分岐鎖の混合物を含んでもよい。しかしながら、１２〜１８個のＣ原子（例えばココナッツ、パーム及び獣脂脂肪アルコール又はオレイルアルコール等）、及びアルコール１モルあり平均２〜８のＥＯを含む、天然由来の直鎖アルコール由来のアルコールエトキシレートは、とりわけ好ましい。
エトキシ化アルコールは、例えば、３ＥＯ又は４ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１４アルコール、７ＥＯを有するＣ９−Ｃ１１アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ、７ＥＯ又は８ＥＯを有するＣ１３−Ｃ１５アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ又は７ＥＯを有するＣ１２−１８アルコール、それらの混合物、例えば３ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１４アルコールと５ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１８アルコールとの混合物を含む。エトキシ化及びプロポキシ化の上述の程度は、統計学的平均を表し、特定の製品において、それは整数又は小数でもあり得る。好ましいアルコールエトキシレート及びプロポキシレートは、限定された同族体分布を有する（狭い範囲のエトキシレート／プロポキシレート、ＮＲＥ／ＮＲＰ）。これらの非イオン性界面活性剤に加えて、１２超のＥＯを有する脂肪アルコールエトキシレートは、用いられ得る。それらの例は、１４ＥＯ、２５ＥＯ、３０ＥＯ又は４０ＥＯを有する獣脂脂肪アルコールエトキシレートである。
また、エトキシ化及び／又はプロポキシ化された、１アルキル鎖当たり１〜１８個のＣ原子を有し、平均でアミン１モル当たり１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）及び／又は１〜１０モルのプロピレンオキシド（ＰＯ）を有する、特に１級及び２級アミンである、アルコキシル化されたアミンは、適切である。
加えて、更なる非イオン性界面活性剤として、一般式Ｒ１Ｏ（Ｇ）ｘ（式中、Ｒ１は、８〜２２個の、好ましくは１２〜１８個のＣ原子を有する１級直鎖又はメチル分岐（特に２位メチル分岐鎖）アルキル基であり、記号「Ｇ」は、５又は６のＣ原子を有するグリコース（単糖）単位を指し、好ましくは、Ｇはグルコースである。オリゴマー化の程度ｘは、グリコース単位の平均数を指し、一般的には１〜１０に亘り；ｘは、好ましくは、１．２〜１．４である。）のアルキルポリグリコシドもまた使用され得る。
単独の非イオン性界面活性剤として、又は他の非イオン性界面活性剤と組み合わせて使用される、用いられる非イオン性界面活性剤の更なる種類は、アルキル鎖中に１〜４個のＣ原子をする、アルコキシル化、好ましくはエトキシ化、又はエトキシ化、及びプロポキシ化脂肪酸アルキルエステル、特には、例えば特開昭５８−２１７５９８に記載されるような脂肪酸メチルエステルである。
アミンオキシド型の非イオン性界面活性剤、例えばＮ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシド及びＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシド、並びに脂肪酸アルカノールアミド又はエトキシ化脂肪酸アルカノールアミド型の非イオン性界面活性剤はまた、適切である。
より好ましい実施形態によれば、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、４級アンモニウム化合物、ヨウ化アルキルピリジニウム、Tween 80、Tween 85、Triton X-100、Brij 56、生物学的界面活性剤、ラムノリピド（rhamnolipid）、サーファクチン（surfactin）、ビスコンシン（visconsin）、又はスルホン酸である。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、洗浄において、少なくとも１つの界面活性剤の濃度が、布地１グラム当たり、０〜５００、０．００００１〜１００、０．０００１〜５０、０．０００１〜４０、０．００１〜３０、０．０１〜２０、０．１〜１５、１〜１０ミリグラムである組成物に関する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの界面活性剤の濃度が、溶液１Ｌ当たり、０〜５０、０．０００１〜４０、０．００１〜３０、０．０１〜２０、０．１〜１０、又は１〜５ｇである組成物に関する。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に適した洗濯助剤組成物、及びリンスが添加された柔軟剤組成物を含む、手洗い用若しくは機械用洗濯洗剤組成物として調製され、又は一般家庭用の硬表面清浄作業に使用のための洗剤組成物として調製され、又は手洗い用若しくは機械用食器洗浄作業のために調製され得る。洗剤は、粉末若しくは又は顆粒形態でもよく、又はそれは、液体、ゲル若しくはペーストの形態、又は単一用量製品、例えば錠剤若しくは多区画パウチを含むパウチの形態でもよく、又は洗剤は、シートの形態でもよい。
洗剤組成物は、１又は２以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のアミロース分解酵素、例えば、別のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、ＣＧＴａｓｅ及び／又はセルラーゼ、マンナナーゼ（例えば、Novozymes, Denmark製MANNAWAY（商標））、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ、及び／又はラッカーゼを含んでもよい。
一般的に、選択された酵素（単数又は複数）の特性は、選択された洗剤と適合するべきであり、（即ち、最適ｐＨ、他の酵素成分及び非酵素成分との適合性等）、酵素（単数又は複数）は有効量で存在すべきである。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、及び／又は中性又はアルカリ性微生物性セリンプロテアーゼ、例えばサブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）を含むセリンプロテアーゼを含む。好適なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物由来のものを含む。一側面によれば、斯かる好適なプロテアーゼは、微生物由来でもよい。好適なプロテアーゼは、前述の好適なプロテアーゼの化学的に又遺伝子学的に修飾された変異体を含む。一側面によれば、好適なプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、例えばアルカリ性微生物性プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼでもよい。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例は、以下：
（ａ）米国特許第６，３１２，９３６Ｂ１号明細書、米国特許第５，６７９，６３０号明細書、米国特許第４，７６０，０２５号明細書、米国特許第７，２６２，０４２号明細書及び国際公開第０９／０２１８６７号に記述される、バシラス属、例えばバシラス・レンタス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、及びバシラス・ギブソニイ（Bacillus gibsonii）由来のものを含む、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、
（ｂ）国際公開第８９／０６２７０号に記述される、フザリウム属（Fusarium）プロテアーゼ、及び国際公開第０５／０５２１６１号及び国際公開第０５／０５２１４６号に記述される、セルロモナス属（Cellumonas）由来のキモトリプシンプロテアーゼを含む、トリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ、例えばトリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、
（ｃ）国際公開第０７／０４４９９３Ａ２号に記述されているバシラス・アミロリケファシエンス由来のものを含む、メタロプロテアーゼ、
を含む。
好ましいプロテアーゼは、バシラス・ギブソニイ又はバシラス・レンタス由来のものを含む。
好適な市販のプロテアーゼ酵素は、Novozymes A/S （Denmark）によりAlcalase（登録商標）、Savinase（登録商標）、Primase（登録商標）、Durazym（登録商標）、Polarzyme（登録商標）、Kannase（登録商標）、Liquanase（登録商標）、Liquanase Ultra（登録商標）、Savinase Ultra（登録商標）、Ovozyme（登録商標）、Neutrase（登録商標）、Everlase（登録商標）及びEsperase（登録商標）の商標名の下に販売されているもの、Genencor InternationalによりMaxatase（登録商標）、Maxacal（登録商標）、Maxapem（登録商標）、Properase（登録商標）、Purafect（登録商標）、Purafect Prime（登録商標）、Purafect Ox（登録商標）、FN3（登録商標） 、FN4（登録商標）、Excellase（登録商標）及びPurafect OXP（登録商標）の商標名のもとに販売されているもの、Solvay EnzymesによりOpticlean（登録商標）及びOptimase（登録商標）商標名のもとに販売されているもの、Henkel/ Kemiraから入手可能なもの、即ち、ＢＬＡＰ（以下の変異Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１ Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを有する米国特許第５，３５２，６０４号明細書の図２９に示される配列、以下ＢＬＡＰという）、ＢＬＡＰ Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）−全てHenkel/Kemiraによる；及びKaoによるＫＡＰ（変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するバシラス・アルカロフィラスサブチリシン）を含む。
リパーゼ：好適なリパーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む。化学修飾された又はタンパク質工学により操作された変異体は含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ属（Humicola）（シノニム・テルモミセス（synonym Thermomyces））由来、例えば欧州特許第２５８０６８号明細書及び欧州特許第３０５２１６号明細書に記述されるようなＨ．ラヌギノーサ（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノーサス（T.lanuginosus））由来、又は国際公開第９６／１３５８０号に記述されるようなＨ．インソレンス（H. insolens）由来のリパーゼ、シュードモナス属（Pseudomonas）リパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）又はＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）（欧州特許第218 272号明細書）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．シュトゥッツェリ（P. stutzeri）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレスセンス（P. fluorescens）、シュードモナス種株ＳＤ７０５（国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensis）（国際公開第９６／１２０１２号）由来、バシラス属リパーゼ、例えば、Ｂ．サブティリス由来（Dartois et al.（1993）, Biochemica et Biophysica Acta, 1131、253-360）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（特開昭64−744992号公報）又はＢ．プミルス（B. Pumilus）（国際公開第９１／１６４２２号）由来を含む。
リパーゼは、「第一サイクルリパーゼ（first cycle lipases）」、例えば、米国特許第６，９３９，７０２Ｂ１号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２１７４６４号明細書に記述されたものでもよい。一側面によれば、リパーゼは、第一洗浄リパーゼ、好ましくはＴ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒ変異を含むサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）由来の野生型リパーゼの変異体でもよい。野生型配列は、Swissprot登録番号 Swiss-Prot O59952（サーモミセス・ラヌギノサス（フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa））由来）の２６９のアミノ酸（アミノ酸２３−２９１）である。好ましいリパーゼは、Lipex（登録商標）、Lipolex（登録商標）及びLipoclean（登録商標）の商標名の下に販売されるものを含む。セルラーゼ：好ましいセルラーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む。化学修飾された又はタンパク質工学により操作された変異体は含まれる。好ましいセルラーゼは、バシラス属、シュードモナス属、フミコラ属、フザリウム属（Fusarium）、チエラビア属（Thielavia）、アクレモニウム属（Acremonium）由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書及び国際公開第８９／０９２５９号に開示されるフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）から生産される真菌性セルラーゼを含む。
セルラーゼ：好ましいセルラーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む。化学修飾された又はタンパク質工学により操作された変異体は含まれる。好ましいセルラーゼは、バシラス属、シュードモナス属、フミコラ属、フザリウム属（Fusarium）、チエラビア属（Thielavia）、アクレモニウム属（Acremonium）由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書及び国際公開第８９／０９２５９号に開示されるフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）から生産される真菌性セルラーゼを含む。
特に好適なセルラーゼは、色彩の面で利点を有するアルカリ性又は中性セルラーゼである。斯かるセルラーゼの例は、欧州特許第０４９５２５７号明細書、欧州特許第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、国際公開第９８／０８９４０号に記述されたセルラーゼである。他の例は、セルラーゼ変異体、例えば国際公開第９４／０７９９８号、欧州特許第０５３１３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６、米国特許第５，６８６，５９３、米国特許第５，７６３，２５４、国際公開第９５／２４４７１号、国際公開第９８／１２３０７号及びＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記述されたものである。
市販のセルラーゼとしては、CELLUZYME（登録商標）、及びCAREZYME（登録商標）（Novozymes A/S）、CLAZINASE（登録商標）、及びPURADAX HA（登録商標）（Genencor International Inc.）、及びKAC-500（B）（登録商標）（Kao Corporation）が挙げられる。
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は真菌由来のものを含む。化学修飾された又はタンパク質工学により操作された変異体は含まれる。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス属（Coprinus）由来、例えばＣ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及び国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記述されるもののようなそれらの変異体を含む。
市販なペルオキシダーゼは、GUARDZYME（登録商標）（Novozymes A/S）を含む。
他の酵素：他の好ましい酵素は、Pectawash（登録商標）、Pectaway（登録商標）の商標名のもとに販売されるペクチン酸リアーゼ、及びMannaway（登録商標）（全てNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkによる）、及びPurabrite（登録商標）（Genencor International Inc., Palo Alto, California）の商標名のもとに販売されるマンナナーゼを含む。
洗剤酵素（単数又は複数）は、１又は２以上の酵素を含む分離した助剤を添加することにより、又はこれらの酵素の全てを含む合わされた助剤を添加することにより、洗剤組成物に含まれ得る。本発明の洗剤助剤、即ち、分離した助剤又は合わされた助剤は、例えば、顆粒、液体、スラリー等に調製され得る。好ましい洗剤助剤調製物は、顆粒、特に非粉状顆粒、液体、特に安定化された液体、又はスラリーである。
非粉状顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書及び同第４，６６１，４５２号明細書の開示に従って製造されてもよく、当該技術分野において知られている方法により任意にコートされてもよい。ワックスコーティング材料の例は、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；１２〜２０個の炭素原子を有するアルコールであり、１５〜８０エチレンオキシド単位を含むエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に好適なフィルム形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号明細書に与えられる。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示された方法に従って調製され得る。
本発明の洗剤組成物は、任意の便利な形態、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒、ペースト、ゲル、液体、汎用粉末形態、「強力（heavy-duty）」洗浄剤、汎用ペースト形態、強力液体型、液体高級布地用（fine-fabric）、手洗い用食器洗浄剤、簡易用（light duty）食器洗浄剤、高泡立ち型、機械用食器洗浄剤、様々な錠剤、食器洗浄顆粒、食器洗浄液体、リンス補助型でもよい。組成物はまた、当該技術分野において知られているもの、及び水溶性、水不溶性及び／又は水透過性であるものを含む、単位用量パッケージであり得る。液体洗剤は、典型的には最大７０％の水、及び０〜３０％の有機溶媒を含む水性、又は非水性、又は０．５ｇ／Ｌ超の洗剤組成物を含む溶液でもよい。本発明の組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に好適な洗濯助剤組成物及びリンスが添加された柔軟剤組成物を含む、手洗い用若しくは機械用洗濯洗剤組成物として調製され得、又は一般家庭用の硬表面清浄作業に使用のための洗剤組成物として調製されてもよく、又は手洗い用若しくは機械用食器洗浄作業のために調製されてもよい。洗剤は、粉末若しくは顆粒形態でもよく、又はそれは、液体、ゲル若しくはペーストの形態、又は単一用量製品、例えば錠剤若しくは多区画パウチを含むパウチの形態でもよく、又は洗剤は、シートの形態でもよい。
組成物は、布地色調剤（fabric hueing agent）を含んでいてもよい。好適な布地色調剤としては、好ましくは本明細書において後述する試験方法１の要件を満たす、染料、染料−粘土（dye-clay）複合物、及び顔料が挙げられる。好適な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット及びベーシックレッドの色指数（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料からなる群より選択される小分子染料、又はそれらの混合物が挙げられる。例を以下に示す。
（１）式：
Figure 0006185243
 のトリス−アゾダイレクトブルー染料
［式中、Ａ、Ｂ及びＣのナフチル環の少なくとも２つは、スルホン酸基により置換され、Ｃ環は、ＮＨ２又はＮＨＰｈ基により５位で置換されていてもよく、Ｘは、最大２のスルホン酸基で置換されたベンジル又はナフチル環であり、これは２位でＯＨ基により置換されていてもよく、また、ＮＨ２又はＮＨＰｈ基により置換されていてもよい。］。
（２）式：
Figure 0006185243
 のビス−アゾダイレクトバイオレット染料
［式中、ＺはＨ又はフェニルであり、Ａ環は、矢印により示された位置で、好ましくはメチル及びメトキシ基により置換され、Ａ環はまた、ナフチル環でもよく、Ｙ基はベンジル又はナフチル環であり、それは硫酸基により置換されるとともに、任意によりメチル基により一又は二置換されていてもよい。］。
（３）式：
Figure 0006185243
 のブルー又はレッド酸性染料
［式中、Ｘ及びＹの少なくとも１つは芳香族基である。一側面によれば、双方の芳香族基が、置換されたベンジル又はナフチル基でもよく、これは更に、非水溶性基、例えばアルキル又はアルキルオキシ又はアリールオキシ基で置換されていてもよく、Ｘ及びＹは、水溶性基、例えばスルネート又はカルボネートで置換されていなくともよい。別の側面によれば、Ｘはニトロ置換ベンジル基であり、Ｙはベンジル基である。］。
（４）構造：
Figure 0006185243
 のレッド酸性染料
［式中、Ｂは、非水溶性基、例えばアルキル又はアルキルオキシ又はアリールオキシ基で置換されていてもよいナフチル又はベンジル基であり、Ｂは、水溶性基、例えばスルネート又はカルボネートで置換されていなくともよい。］。
（５）構造：
Figure 0006185243
 のジス−アゾ染料、及びこれらの対応する塩、並びにこれらの混合物
［式中、Ｘ及びＹは、互いに独立に、それぞれ水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル又はＣ１−Ｃ４−アルコキシであり、Ｒαは、水素又はアリールであり、Ｚは、Ｃ１−Ｃ４アルキル；Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ；ハロゲン；ヒドロキシル又はカルボキシルであり、ｎは、１又は２であり、ｍは０、１又は２である。］。
（６）以下の構造：
Figure 0006185243
 のトリフェニルメタン染料並びにそれらの混合物。
別の側面によれば、好適な小分子染料は、色指標（Society of Dyers and Colourists、Bradford、UK）番号、ダイレクトバイオレット９、ダイレクトバイオレット３５、ダイレクトバイオレット４８、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトバイオレット６６、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトブルー８０、ダイレクトブルー２７９、アシッドレッド１７、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドバイオレット１５、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット２４、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドバイオレット４９、アシッドブルー１５、アシッドブルー１７、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４０、アシッドブルー４５、アシッドブルー７５、アシッドブルー８０、アシッドブルー８３、アシッドブルー９０及びアシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ベーシックバイオレット１、ベーシックバイオレット３、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット３５、ベーシックブルー３、ベーシックブルー１６、ベーシックブルー２２、ベーシックブルー４７、ベーシックブルー６６、ベーシックブルー７５、ベーシックブルー１５９及びそれらの混合物からなる群より選択される小分子染料を含む。別の側面によれば、好適な小分子染料は、色指標（Society of Dyers and Colourists、Bradford、UK）番号、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４５、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１及びそれらの混合物からなる群より選択される小分子染料を含む。別の側面によれば、好適な小分子染料は、色指標（Society of Dyers and Colourists、Bradford、UK）番号、アシッドバイオレット１７、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトブルー１、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２９、アシッドブルー１１３又はそれらの混合物からなる群より選択される小分子染料を含む。
好適なポリマー染料は、複合体化した色原体を含むポリマー（染料−ポリマー複合体）、及びポリマーの主鎖にコポリマー化した色原体を含むポリマー並びにそれらの混合物、からなる群より選択されるポリマー染料を含む。
別の側面によれば、好適なポリマー染料は、商品名Liquitint（登録商標）（Milliken、Spartanburg、South Carolina、USA）として販売されている布地材料着色剤（fabric-substantive colorants）、少なくとも１の反応性染料及びヒドロキシル部分、一級アミン部分、二級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群より選択される部分を含むポリマーからなる群より選択されるポリマーから形成される染料−ポリマー複合体、からなる群から選択されるポリマー染料を含む。さらに別の側面によれば、好適なポリマー染料は、Liquitint（登録商標）（Milliken、Spartanburg、South Carolina、USA）バイオレットＣＴ、リアクティブブルー、リアクティブバイオレット又はリアクティブレッド染料と複合体化したカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、例えば商品名AZO-CM-CELLULOSE、製品コードS-ACMCの下でMegazyme, Wicklow, Irelandにより販売されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９と複合体化したＣＭＣ、アルコキシル化トリフェニル−メタンポリマー着色剤、アルコキシル化チオフェンポリマー着色剤、及びそれらの混合物からなる群より選択されるポリマー染料を含む。
好適な染料粘土複合体は、少なくとも１のカチオン性/塩基性染料及びスメクタイト粘土、及びそれらの混合物を含む群から選択される染料粘土複合体を含む。別の側面によれば、好適な染料粘土複合体は、Ｃ．Ｉ．ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１からなる群より選択される一つのカチオン性／塩基性染料、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土からなる群より選択される粘土からなる群より選択される染料粘土複合体、及びそれらの混合物を含む。さらに別の側面によれば、好適な染料粘土複合体は、以下：モンモリロナイト ベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５ 複合体、モンモリロナイト ベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５ 複合体、モンモリロナイト ベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５ 複合体、モンモリロナイト ベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０ 複合体、モンモリロナイト ベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０ 複合体、モンモリロナイト Ｃ．Ｉ．ベーシックブラック２ 複合体、ヘクトライト ベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５ 複合体、ヘクトライト ベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５ 複合体、ヘクトライト ベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５ 複合体、ヘクトライト ベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０ 複合体、ヘクトライト ベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０ 複合体、ヘクトライト Ｃ．Ｉ．ベーシックブラック２ 複合体、サポナイト ベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５ 複合体、サポナイト ベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５ 複合体、サポナイト ベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５ 複合体、サポナイト ベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０ 複合体、サポナイト ベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０ 複合体、サポナイト Ｃ．Ｉ．ベーシックブラック２ 複合体からなる群より選択される、染料粘土複合体及びそれらの混合物を含む。
適切な顔料は、フラバントロン、インダントロン、１〜４個の塩素原子を有する塩素化インダントロン、ピラントロン、ジクロロピラントロン、モノブロモジクロロピラントロン、ジブロモジクロロピラントロン、テトラブロモピラントロン、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基は、未置換、またはＣ１〜Ｃ３−アルキル若しくはフェニル或いは複素環式ラジカルで置換されていてもよく、フェニルおよび複素環式ラジカルは更に水溶性を付与しない置換基を有していてもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン、イソビオラントロン、ジオキサジン顔料、銅フタロシアニン（１分子当たり最大２個の塩素原子を有していてもよい）、ポリクロロ−銅フタロシアニン、又はポリブロモクロロ−銅フタロシアニン（１分子当たり最大１４個の臭素原子を有する）、及びこれらの混合物からなる群より選択される顔料を含む。
別の側面によれば、好適な顔料は、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．ピグメントブルー２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．ピグメントバイオレット１５）及びそれらの混合物からなる群より選択される顔料を含む。
前述の布地色調剤は、組み合わせて用いることができる（布地色調剤の任意の混合物が使用できる）。好適な布地色調剤は、例えばAldrich、Milwaukee、Wisconsin、USA； Ciba Specialty Chemicals, Basel, Switzerland；BASF, Ludwigshafen, Germany；Dayglo Color Corporation, Mumbai, India；Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, USA；Dystar, Frankfurt, Germany；Lanxess, Leverkusen, Germany；Megazyme, Wicklow, Ireland； Clariant, Muttenz, Switzerland；Avecia, Manchester, UKから購入し、及び／又は本明細書に記載の実施例に従って作製することができる。好適な色調剤は、米国特許第７，２０８，４５９号Ｂ２に詳細に記載されている。
試験方法１
染料又は顔料材料が本発明の目的に適した布地色調剤であるかどうかを特定するためのプロトコールをここに記す。
１）２つのターゴトメーターポットを８００ｍｌのNewcastle upon Tyne, UK の水道水（米国ガロンあたり約１２グレインの総硬度、Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, UKにより供給される）で満たす。
２）ポットはターゴトメーターに挿入され、試験中、水温は３０℃に制御され、攪拌は４０ｒｐｍに設定される。
３）各ポットにwfk, Bruggen-Bracht, Germanyより供給された４．８ｇのIEC-B洗剤（IEC60456洗濯機用参照用基準洗剤タイプＢ）を加える。
４）２分後、第１のポットに２．０ｍｇの活性着色剤を加える。
５）１分後、５ｃｍ×５ｃｍの材料標本に切断された５０ｇの平坦な綿肌着（Warwick Equest, Consett, County Durham, UKにより供給される）を各ポットに加える。
６）１０分後、ポットを排水し、３：１のカルシウム対マグネシウムモル比を有する１４．４のEnglish Clark Degrees Hardnessの水硬度を有する冷水（１６℃）で再び満たす。
７）２分間すすいだ後、布地を取り除く。
８）同一の処理を用いて、ステップ３〜７を更に３サイクル繰り返す。
９）布地を回収し、屋内で１２時間自然乾燥させる。
１０）D65光源及びＵＶＡ遮断フィルターを取り付けたHunter Miniscanスペクトロメーターを用いて材料標本を分析し、Hunter a（赤−緑軸）及びHunter b（黄−青軸）値を得る。
１１）各セットの布地についてHunter a及びHunter b値を平均する。評価において、着色剤で処理された布地がａ軸またはｂ軸のいずれか上で、０．２単位より大きい色調の平均の差を示した場合、本発明の目的の布地色調剤であるとみなされる。
組成物は、カプセル化物を含んでもよい。一側面によれば、カプセル化物は、コアを含み、シェルは内部及び外部表面を有し、前記シェルは前記コアをカプセル化する。
前記カプセル化物の一側面によれば、前記コアは、香料；光沢剤；染料；防虫剤；シリコーン；ワックス；香料；ビタミン；柔軟剤；スキンケア剤、一側面によれば、パラフィン；酵素；抗細菌剤；漂白剤；五感で知覚されるもの（sensates）；及びそれらの混合物からなる群より選択される材料を含んでもよく、前記シェルは、ポリエチレン；ポリアミド；ポリスチレン；ポリイソプレン；ポリカーボネート；ポリエステル；ポリアクリレート；アミノプラストからなる群より選択される材料を含んでもよく、一側面によれば、前記アミノプラストは、ポリウレア、ポリウレタン、及び／又はポリウレアウレタンを含んでもよく、一側面によれば前記ポリウレアは、ポリオキシメチレンウレア及び／又はメラミンホルムアルデヒド；ポリオレフィン；多糖を含んでもよく、一側面によれば前記多糖は、アルギネート及び／又はキトサン；ゼラチン；シェラック；エポキシ樹脂；ビニルポリマー；水不溶性無機物；シリコーン；及びそれらの混合物を含んでもよい。
前記カプセル化物の一側面によれば、前記コアは、香料を含んでもよい。
前記カプセル化物の一側面によれば、前記シェルは、メラミンホルムアルデヒド及び／又は交差架橋されたメラミンホルムアルデヒドを含んでもよい。
一側面によれば、好適なカプセル化物は、コア材料、及びシェルを含んでもよく、前記コア材料を少なくとも部分的に包む前記シェルは、開示される。少なくとも７５％、８５％又はさらに９０％の前記カプセル化物は、約０．２ＭＰａ〜約１０ＭＰａ、約０．４ＭＰａ〜約５ＭＰａ、約０．６ＭＰａ〜約３．５ＭＰａ、又はさらに約０．７ＭＰａ〜約３ＭＰａの破壊強度；及び０％〜約３０％、０％〜約２０％、又はさらに０％〜約５％の有益剤漏出を有し得る。
一側面によれば、少なくとも７５％、８５％又はさらに９０％の前記カプセル化物は、約１ミクロン〜約８０ミクロン、約５ミクロン〜６０ミクロン、約１０ミクロン〜約５０ミクロン、又はさらに約１５ミクロン〜約４０ミクロンの粒子径を有し得る。
一側面によれば、少なくとも７５％、８５％又はさらに９０％の前記カプセル化物は、約３０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、又はさらに約１００ｎｍ〜約１６０ｎｍの粒子壁の厚さを有し得る。
一側面によれば、前記カプセル化物のコア材料は、香料原料からなる群より選択される材料、及び／又は、任意で、ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、グレープ油、菜種油、大豆油、コーン油、パーム油、アマニ油、サフラワー油、オリーブ油、ピーナッツ油、ココナッツ油、パーム核油、ヒマシ油、レモン油及びそれらの混合物を含む原液及び／又は混合された植物油を含む植物油；植物油のエステル、アジピン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、アジピン酸ブチルベンジル、アジピン酸ベンジルオクチル、リン酸トリクレジル、リン酸トリオクチルを含むエステル、及びそれらの混合物；約８０℃超の沸点を有するこれらの直鎖又分岐鎖の炭化水素を含む直鎖又分岐鎖の炭化水素；
部分的に水素化されたテルフェニル、ジアルキルフタレート、モノイソプロピルビフェニルを含むアルキルビフェニル、ジプロピルナフタレンを含むアルキル化されたナフタレン、灯油、鉱物油及びそれらの混合物を含む石油スピリット；ベンゼン、トルエンを含む芳香族溶媒、及びそれらの混合物；シリコーン油；及びそれらの混合物、からなる群より選択される物質を含む。
一側面によれば、前記カプセル化物の壁材料は、アルデヒド及びアミンの反応生成物を含む好適な樹脂を含んでもよく、適切なアルデヒドは、ホルムアルデヒドを含む。好適なアミンは、ウレア、ベンゾグアナミン、グリコールウリル、及びそれらの混合物を含む。好適なメラミンは、メチロールメラミン、メチル化メチロールメラミン、イミノメラミン、及びそれらの混合物を含む。好適なウレアは、ジメチロールウレア、メチル化ジメチロールウレア、ウレア−レゾルシノール、及びそれらの混合物を含む。
一側面によれば、好適なホルムアルデヒドスカベンジャーは、カプセル化物と共に、例えばカプセルスラリー中に使用してもよく、及び／又は、カプセル化物の消費者製品への添加前、添加時、又は添加後に、斯かる消費者製品に添加してもよい。
好適なカプセルは、米国特許出願公開第２００８／０３０５９８２Ａ１号；及び／又は米国特許出願公開第２００９／０２４７４４９Ａ１号の教示に従って作製することができる。あるいは、適切なカプセルは、Appleton、Wisconsin USAのAppleton Papers Incから購入することができる。
加えて、前述のカプセル化物を作るための材料は、Solutia Inc.（St Louis, Missouri U.S.A.）、Cytec Industries（West Paterson, New Jersey U.S.A.）、sigma-Aldrich （St. Louis、Missouri U.S.A.）、San Diego, California, USAのCP Kelco Corp.； Ludwigshafen, GermanyのBASF AG； Cranbury, New Jersey, USA のRhodia Corp.； Wilmington、Delaware, USAのHercules Corp.； Calgary, Alberta, CanadaのAgrium Inc.、New Jersey U.S.A.のISP, Chicago、IL、USAのAkzo Nobel；Bremen, GermanyのStroever Shellac Bremen； Midland, MI, USAのDow Chemical Company； Leverkusen, GermanyのBayer AG；St. Louis, Missouri, USAの Sigma-Aldrich Corp.から入手し得る。
一側面によれば、組成物は、（ａ）カルシウム塩、マグネシウム塩及びそれらの混合物からなる群より選択される無機塩；（ｂ）オリゴ糖、多糖及びそれらの混合物からなる群より選択される糖質；（ｃ）フェニルボロン酸及びそれらの誘導体からなる群より選択される質量効率の高い（mass efficient）可逆的プロテアーゼ阻害剤；及び（ｄ）それらの混合物からなる群より選択される酵素安定化剤を含んでもよい。
別の実施形態によれば、組成物は、以下：（１）可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えばホウ素を含む化合物；（２）１−２プロパンジオール；（３）ギ酸カルシウム及び／又はギ酸ナトリウム；及び（４）それらの任意の組み合わせを含む。
一側面によれば、組成物はジグリセリド及びトリグリセリド、ジステアリン酸エチレングリコール、微結晶性セルロース、セルロース系材料、微小繊維セルロース、生体ポリマー、キサンタンゴム、ジェランガム、及びそれらの混合物からなる群より選択される構造物を含んでもよい。
洗剤は、１又は２以上のポリマーを含んでいてもよい。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。
洗剤は、漂白系を含んでいてもよく、それはＨ２Ｏ２源、例えば過ホウ酸塩又は過カルボン酸塩等含んでいてもよく、それは過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホンと組み合わせられてもよい。あるいは、漂白系は、例えばアミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでいてもよい。一般的に、漂白剤が使用される場合、本発明の組成物は、対象清浄組成物の重量比で、約０．１％〜約５０％、又更には約０．１％〜約２５％の漂白剤を含んでもよい。本発明の酵素変異体は、従来の安定化剤又はプロテアーゼ阻害剤、例えば、ポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、異なる塩、例えばＮａＣｌ及びＫＣｌ；乳酸、ギ酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、又はフェニルホウ酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ酸、又はペプチドアルデヒド、例えばジ−、トリ−又はテトラペプチドアルデヒド又はアルデヒドアナログ（形態Ｂ１−Ｂ０−Ｒ（式中、ＲはＨ、ＣＨ３、ＣＸ３、ＣＨＸ２、又はＣＨ２Ｘ（Ｘ＝ハロゲン）であり、Ｂ０は単一のアミノ酸残基（好ましくは、任意で置換された脂肪族又は芳香族側鎖を有する）であり；及びＢ１は、１又は２以上（好ましくは１、２又は３つ）のアミノ酸残基からなり、任意でＮ末端保護基を有する、又は国際公開第０９１１８３７５号及び国際公開第９８／１３４５９号に記載のもののいずれか）、又はタンパク質型のプロテアーゼ阻害剤、例えばＲＡＳＩ、ＢＡＳＩ、ＷＡＳＩ（米、大麦及び小麦の二機能性α−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤）又はＣＩ２又はＳＳＩを用いて安定化され得る。
組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号、及び国際公開第９２／１９７０８号又は米国特許６，４７２，３６４号の記載に従って調製され得る。いくつかの実施形態によれば、本明細書で用いられる酵素は、最終的な組成物において、水溶性の亜鉛（II）、カルシウム（II）及び／又はマグネシウム（II）イオン源の存在により安定化され、それは、斯かるイオン、及びその他の金属イオン（例えばバリウム（II）、スカンジウム（II）、鉄（II）、マンガン（II）、アルミニウム（III）、錫（II）、コバルト（II）、銅（II）、ニッケル（II）、及びオキソバナジウム（IV）等）を酵素に提供する。
洗剤はまた、他の従来の洗剤成分、例えば、粘土を含む柔軟剤、泡増強剤、消泡剤、抗腐食剤、よごれ懸濁剤、よごれ再付着防止剤、染料、殺菌剤、光学的光沢剤、ヒドロトロープ、退色阻害剤、有機溶媒、例えばエタノール、又は香料を含んでもよい。更に、洗剤は、染み抜き剤（pre-spotter）又は増強剤（booster）を含み得、それは一般的な清浄レベル向上させるために洗浄に添加され、これらの助剤のいくつかはまた、洗浄ステップの前に、布地に適用される前処理剤として用いられ得る。
洗剤組成物中に、任意の酵素、特に本発明の酵素は、１リットルの洗浄溶液あたり０．００１〜１００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは１リットルの洗浄溶液あたり０．００５〜５ｍｇの酵素タンパク質、より好ましくは１リットルの洗浄溶液あたり０．０１〜１ｍｇの酵素タンパク質、特に、１リットルの洗浄溶液あたり０．１〜１ｍｇの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在熟考される。しかしながら、本発明の洗剤組成物は、少なくとも０．０００１〜約０．１重量％、例えば約０．０００１％〜約０．０１％、約０．００１％〜約０．０１％、又は約０．００１％〜約０．０１％の純粋な酵素タンパク質を含む。しかしながら、調製された酵素を用いる場合、洗剤組成物は、約０．０２％〜約２０重量％、例えば約０．０５％〜約１５重量％、又は約０．０５〜約２０％、又は約０．０５％〜約５％、又は約０．０５％〜約３％含む。
本発明のα−アミラーゼ変異体は、参照により本明細書に援用される国際公開第９７／０７２０２号に開示される洗剤調製物にさらに援用され得る。
組成物は、典型的には他の洗浄成分を含む。好適な洗剤成分は、以下：漂白剤；イミン漂白増強剤；過酸化水素源、例えば過炭酸塩及び／又は過ホウ酸塩、特に材料、例えば炭酸塩及び／又は硫酸塩、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、及びそれらの任意混合物でコートされた過炭酸塩；カプセル化形態中の予調製過酸を含む、予調製過酸；遷移金属触媒；消泡剤系、例えばシリコーン系消泡剤、及び／又は脂肪酸系消泡剤；光沢剤；光退色剤；柔軟剤、例えば粘土、シリコーン及び／又は第４級アンモニウム化合物；凝集剤、例えばポリエチレンオキシド；染料移動阻害剤、例えばポリビニルピロリドン、ポリ４−ビニルピリジンＮ−オキシド、及び／又はビニルピロリドン及びビニルイミダゾールのコポリマー；布地統合成分（fabric integrity components）、例えばイミダゾール及とエピクロルヒドリンの縮合により生成されたオリゴマー；よごれ分散剤及びよごれ再付着防止剤、例えばアルコキシル化ポリアミン及びエトキシ化エチレンイミンポリマー；再付着防止成分、例えばポリエステル；カルボン酸ポリマー、例えばマレイン酸ポリマー又はマレイン酸及びアクリル酸のコポリマー；香料、例えば香料マイクロカプセル、でんぷんカプセル化剤（accords）、スプレー式香料；石鹸リング（soap rings）；美的粒子（aesthetic particles）；染料；充填剤、例えば硫酸ナトリウム、もっとも、組成物は実質的に遊離の充填剤であることが好ましい；ケイ酸塩、例えば１．６Ｒ及び２．０Ｒケイ酸ナトリウムを含むケイ酸ナトリウム、又はメタケイ酸ナトリウム；ジカルボン酸及びジオールのコポリエステル；セルロースポリマー、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエトキシセルロース、又は他のアルキル又はアルキルアルコキシセルロース；溶媒、例えば１，２プロパンジオール、モノエタノールアミン；ジエチレングリコール、エタノール、及びそれらの任意の混合物；ヒドロトロープ、例えばクメンスルホン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、及び任意の混合物；有機酸、例えばクエン酸；及びそれらの任意の組み合わせを含む。
洗濯洗剤組成物の例
以下は、トップ−ローディング自動洗濯機（１及び２）及びフロントローディング洗濯機（３）に適した液体洗濯洗剤組成物である。
Figure 0006185243
組成物４〜８ 自動食器洗浄用ゲル
Figure 0006185243
食器洗浄洗剤組成物
本発明の酵素はまた、食器洗浄洗剤組成物に用いられ得、以下を含む：
１）粉末自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
２）粉末自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
３）粉末自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
４）粉末自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
５）粉末自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
６）清浄界面活性剤系を含む粉末及び液体食器洗い組成物
Figure 0006185243
７）非水性液体自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
８）非水性液体食器洗い組成物
Figure 0006185243
９）揺変性液体自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
１０）液体自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
１１）保護された漂白粒子を含む液体自動食器洗い組成物
Figure 0006185243
１２）１）、２）、３）、４）、６）及び１０）に記載の組成物において、過ホウ酸塩を過炭酸塩に置き換えた自動食器洗い組成物。
１３）マンガン触媒をさらに更に含む、１）〜６）に記載の自動食器洗い組成物。マンガン触媒としては、例えば、「低温度漂白のための有効的なマンガン触媒」、Nature、369, 1994, pp. 637-639に記載の化合物の何れかが挙げられる。
産業利用
本発明はまた、α−アミラーゼ変異体を用いるための方法を対象とする。
変異体α−アミラーゼは、好ましくは、洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物、例えば家庭用洗濯洗剤組成物、特に液体洗濯洗剤組成物に組み込まれ、及び／又は一緒に用いられる。特に、洗剤は、少なくとも１のキレート剤を含み、洗剤組成物は、典型的に、従来の洗剤成分、例えば界面活性剤（アニオン製、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、両性イオン性）、助剤、漂白剤、ポリマー、他の酵素及び例えば国際公開第２００７／１３０５６２号及び国際公開第２００７／１４９８０６号（それは、その全体において参照により本明細書に援用される）に記述されるような他の成分、を含む。
アルカリ性ｐＨ値におけるそれらの活性のために、本発明のα−アミラーゼは、様々な産業プロセスにおける使用に適しており、特に、酵素は、洗浄、食器洗浄及び硬表面清浄洗剤組成物の成分として潜在的な用途を発見するが、それはまた、甘味料、シロップ、例えばグルコース等、プラスチック前駆体、発酵製品、特にエタノール、ブタノール及びメエタノール、及びバイオガス、例えばメタン、又は任意の他のでんぷん由来の製品の産生に有用である。従来のでんぷん変換プロセス及び液化及び／又は糖化プロセスについての条件は、例えば、米国特許第３，９１２，５９０号及び欧州特許出願公開第２５２，７３０号明細書及び欧州特許出願公開第６３，９０９号明細書に記述される。
本発明のα−アミラーゼ変異体は、特にｐＨ７超で再パルプ化が起こり、アミラーゼが強化するでんぷんの分解を通して古紙材料の分解を容易にする、でんぷんで強化された古紙及びボール紙からの、リグノセルロース物質、例えば、パルプ、紙、及びボール紙の製造に用いられ得る。本発明のα−アミラーゼ変異体はまた、酵素的に修飾されたでんぷんが、アルカリ性充填剤、例えば炭酸カルシウム、カオリン及び粘土と共に製紙に用いられる、修飾でんぷんにおいて有用であり得る。
従って、上述の組成物は更に、非洗剤成分、発酵生物、例えば酵母、好ましくはサッカロミセス属の株、植物材料、又はでんぷんを含む物質、例えば塊茎、根、茎、全粒粉、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、ミロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、コメ、マメ、サツマイモ、又はそれらの混合物、又は穀物、糖を含む原料、例えば糖液、果物、サトウキビ、又はサトウダイコン、ポテト、及びセルロースを含む物質、例えば木又は植物遺体、又はそれらの混合物を含んでもよい。
本発明のα−アミラーゼ変異体はまた、布地糊抜きに有用であり得る。布地加工産業において、α−アミラーゼは、織込みの間、横糸上に保護コーティングとして役立つ、でんぷんを含む糊の除去を容易にするために、糊抜きプロセスにおいて補助物として、伝統的に用いられている。
織込み後、糊コーティングの完全な除去は、布地が洗浄され、脱色され、染色されるその後のプロセスにおける最適な結果を確かにするために重要である。それは布地材料への何らかの悪影響を含まないので、酵素的でんぷん分解は好ましい。
加工コストを減少させる、及び工場処理量を増加させるために、糊抜きプロセスは、しばしば洗浄及び漂白ステップと組み合わされる。斯かる場合では、伝統的なα−アミラーゼは、高いｐＨレベル及び漂白剤と非常に適合しないため、非酵素補助物、例えばアルカリ又は酸化剤は、典型的にでんぷんを分解するために用いられる。でんぷん糊の非酵素的分解は、用いられるより攻撃的な化学物質のために、いくらかの繊維損傷を導く。
従って、それらはアルカリ性溶液で改善された性能を有するので、本発明のα−アミラーゼ変異体を使用することが望まれる。α−アミラーゼ変異体は、単独で、又はセルロースを含む布地又は布地を糊抜きする場合、セルラーゼと組み合わせて用いられ得る。
一つの実施形態によれば、本発明は、空気ケア（air care）についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、車ケア（car care）についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、食器洗浄についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、布地柔軟化（fabric conditioning）（柔軟化（softening）を含む）についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、洗濯洗浄力についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、洗濯及び濯ぎ助剤及び／又はケア（care）についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、硬表面清浄及び／又は処理、及び消費者用又は業務用の他の清浄についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。一つの実施形態によれば、本発明は、空気ケア（air care）、車ケア（car care）、食器洗浄、布地柔軟化（fabric conditioning）（柔軟化（softening）を含む）、洗濯洗浄力、洗濯及び濯ぎ助剤及び／又はケア（care）、硬表面清浄及び／又は処理、及び消費者用又は業務用の他の清浄についてではない、請求された組成物についての製品及び／又は方法及び／又は使用に関する。
材料及び方法
酵素：
ＳＰ７２２：配列番号６、Novozymesより入手可能、国際公開第９５／２６３９７号に開示。
ＳＰ７０７又は＃７０７：配列番号８
ＡＡ５６０：配列番号１０
一般的な分子生物学的方法：
別途記載しない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は、分子生物学の標準的な方法（Sambrook et al.（1989）； Ausubel et al.（1995）； Harwood and Cutting（1990））を用いて実施した。
α−アミラーゼ及び変異体の発酵
発酵は、本技術分野で周知の方法、又は以下の方法により行われ得る。適切な発現プラスミドを含むＢ．サブティリス株を、適切な抗生物質を含むＬＢアガープレート上に縞状播種し、３７℃で一晩培養する。
コロニーを、５００ｍｌ撹拌フラスコ中の適切な抗生物質（例えば１０ｍｇ／ｌクロラムフェニコール）を含む１００ｍｌ ＢＰＸ培地に移送する。
ＢＰＸ培地の組成：
Figure 0006185243
 培養物を、３７℃、２７０ｒｐｍで、４〜５日間振盪する。
細胞及び細胞残屑を、４５００ｒｐｍで２０〜２５分の遠心分離により、発酵培養液から除去する。その後、上清を濾過し、完全に清明な溶液を得る。濾液をＵＦ−フィルター（１００００カットオフ膜）で濃縮し、洗浄し、バッファを透析又はゲル濾過等により２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．５に変更する。ＵＦ濾液をS-sepharose F.F. （General Electric製、陽イオン交換、マトリックス：架橋アガロース、官能基：−ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３）に適用し、溶出は同一のバッファ中で、０．２Ｍ ＮａＣｌを用いたステップ溶出により行う。溶出液を、１０ｍＭトリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール）、ｐＨ９．０に対して透析し、Q-sepharose F.F.（General Electric製、陰イオン交換、マトリックス：架橋アガロース、官能基：−ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）に適用し、０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの線形グラジエンドを用いて６カラム容量まで溶出する。活性（EnzCheck アッセイにより測定）を含む画分をプールし、ｐＨを７．５に調整し、５分間の０．５％ｗ／ｖｏｌ．活性炭処理により残留色素分を除去する。更には、バッファ交換ステップを加え、例えば透析又はゲル濾過等により、それ自体は洗浄結果に影響を与えないバッファシステム、例えば、ＥＰＰＳ−バッファ、グリシン−バッファ、酢酸バッファ等、好ましくは保存時にアミラーゼを安定化するための低濃度のカルシウム（例えば０．１ｍＭ）、及び、容器及びピペットへの酵素タンパク質の吸着のリスクを減少させるための約０．０１％ Triton X-100を含むバッファに交換することが好ましい。
洗剤モデル
洗剤モデルＡの組成物：
Figure 0006185243
洗剤モデルＢの組成物：
Figure 0006185243
遊離カルシウムイオンの測定のためのアッセイ
以下のアッセイは、溶液中の遊離カルシウムイオンの測定のために、惹いては、遊離カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の濃度をｐＨ８で、例えば２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで減少させるキレート剤の能力の測定に用いられ得る。
アッセイ原理：
種々の量のキレート剤を、２．０ｍＭ Ｃａ２＋の溶液に添加し、一定のｐＨ及び温度において、カルシウムイオン選択電極を用いることにより、遊離のＣａ２＋濃度を測定する。測定された遊離カルシウム濃度のキレート剤の濃度に対するプロットから、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで減少するのに必要なキレート剤の濃度を決定することができる。本アッセイによれば、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで減少するのに必要なキレート剤の濃度は、塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中、ｐＨ８、２１℃で測定される。
溶液：
電解質溶液：超純水（Milli-Q水）中４Ｍ塩化カリウム。
ｐＨ８バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、最小量の１Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８．０に調整。
カルシウムストック溶液：ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏから作製したｐＨ８バッファ中２５ｍＭ Ｃａ２＋。
キレート剤ストック溶液：ｐＨ８バッファ中１５ｍＭキレート剤（１００％乾燥キレート剤換算）、最小量の１Ｍ ＮａＯＨ又は１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ８．０に再調整。
全てのバッファ及び溶液の調製に超純水（MilliQ水）を用いる。
装置：
Thermo Scientific製カルシウムイオン選択電極（cat. No. 9720BNWP）を、塩化カルシウム標準溶液を用いて校正。電極の校正は、電極添付のガイドラインの記載に従い行う。
手順：
各々４ｍｌのカルシウムストック溶液（最終濃度２．０ｍＭ）、１ｍＬ電解質溶液（最終濃度８０ｍＭ塩化カリウム）、様々な量（０〜４５ｍＬ）のキレート剤ストック溶液を含み、ｐＨ８バッファを用いて全容量を５０ｍＬに調製した一連のバイアルを用意する。アッセイにおけるＥＰＰＳの最終濃度は４９ｍＭである。
混合後、遊離Ｃａ２＋の濃度をカルシウム電極により測定する。試験対象キレート剤の各々について、十分な数の種々のキレート剤濃度について、遊離カルシウム濃度の決定を行うことにより、得られるデータセットが、２．０ｍＭの遊離カルシウムイオンから０．１０ｍＭ未満の値まで、又はアッセイにおける最終キレート剤濃度である１０．０ｍＭ超まで、全体の範囲を確実に網羅するようにすべきである。データ点の好適な数は、８又はそれ以上である。初期の２．０ｍＭの遊離カルシウムイオンを０．１０ｍＭまで低減するために要求されるキレート剤濃度は、内挿により、キレート剤濃度に対する測定された遊離カルシウムイオン濃度のプロットから得られる。
溶液を所望の温度に平衡化する。本アッセイでは２１℃である。
ｌｏｇＫの測定
キレート剤は、キレート剤とカルシウムイオンとの結合定数によっても特徴付けることができる。この定数は、AD Nielsen, CC Fuglsang and P Westh, Analytical Biochemistry Vol. 314 （2003） page 227-234及びT Wiseman, S Williston, JF Brandts及びL-N Lin, Analytical Biochemistry Vol. 179 （1989） page 131-137.の記載に従って、ＩＴＣ（等温滴定熱量計）により測定することができる。
使用する全てのガラス製品及びプラスチックボトルは、１％（ｗ／ｗ）ＥＤＴＡ溶液で洗浄し、続いて、Chelex 100で処理された超純水（Milli-Q水）中で完全に濯ぐ。溶液はプラスチックボトル中に保存し、使用時まで５℃で維持する。
バッファ：
超純水（Milli-Q水）で調製された２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ８
超純水（Milli-Q水）で調製された２０ｍＭグリシン、ｐＨ１０
溶液：
− ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中１２５μＭキレート剤、又は２０ｍＭグリシン、ｐＨ１０中１２５μＭキレート剤
− ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中４ｍＭ ＣａＣｌ２、又は２０ｍＭグリシン、ｐＨ１０中４ｍＭ ＣａＣｌ２
− 超純水（Milli-Q水）
全てのバッファは、カルシウムイオンを除去するために、Chelex 100カラム（Sigma Aldrich C-7901、マトリックス１％架橋ポリスチレンマトリックス 活性基 イミノジ酢酸（ナトリウム形態） マトリックス メチル基を介して芳香族環に付着）を通される。
装置：
MCS-ITC（MicroCal Inc., Northampton, MA, USA）
手順
参照セルを超純水（Milli-Q水）で満たす。サンプルセルを、前記の選択されたｐＨのキレート剤溶液で満し、シリンジを選択されたｐＨのカルシウム溶液で満す。溶液を所望の温度、例えば１９℃に平衡化する。
次に、サンプルセル中のキレート剤溶液を、８μＬのカルシウム溶液の３０〜４０分割量で滴定する。
続いて、ＩＴＣから得られた信号を、MicroCal Inc.により供給される独自のソフトウェアを用いて積分する。結合等温線を得るために、同一のソフトウェアパッケージを用いて回帰ルーチンを実施する。次に、これらのデータを、Originソフトウェアに組み込まれたルーチンを用いて、モデルにフィッティングする。現時点で好ましいのは、一般的に用いられるキレート剤の大部分について最適なフィッティングを与える「ワンサイト（OneSites）」モデルである。即ち、残差はゼロ付近に均等に分布される。ｌｏｇＫは、底を１０とするＫ値の対数として計算される。
洗浄性能を測定するためのアッセイ
洗剤組成物中のα−アミラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために、洗浄実験を実施してもよい。酵素は、自動機械ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）、又はビーカーを用いた洗浄性能試験を用いて試験される。ＡＭＳＡ試験によれば、少量ずつ多数の酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験することができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、これらのスロットの全ての開口に対して、洗浄対象となる布地材料標本標本を堅く絞るリッドとを有する。洗浄時間の間、プレート、試験溶液、布地、及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を布地に接触させるとともに、定期的且つ周期的な振動による機械的応力を印加する。更なる記述については、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４ページの「Special method embodiments」のパラグラフを参照のこと。
一般的な洗浄性能説明：
水（１５°ｄＨ）、０．８ｇ／Ｌ洗剤、例えば上述のような洗剤モデルＡ若しくはＢ、又は５０ｍＭ ＨＣＯ３ −、及び本発明の酵素、例えば濃度０、０．２、０．４、０．８及び／又は１．２ｍｇ／Ｌの酵素タンパク質を含む試験溶液を調製する。でんぷん（例えばCenter For Testmaterials BV、P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, The Netherlands製 CS-28）で汚れた布地を加え、２０℃で３０分間洗浄する。水道水の流水で濯ぎ、暗所で乾燥した後、続いて汚れた布地の光強度又は反射率を、洗浄性能の尺度として測定する。０ｍｇ／Ｌの酵素タンパク質を用いた試験をブランクとして実施し、デルタ減少（remission）値を得る。洗浄ステップ時には、布地と共に洗浄溶液に対して、機械的動作を例えば振盪、回転、又は撹拌等の形態で適用することが好ましい。
ＡＭＳＡ洗浄性能実験は、例えば以下に示す実験条件で実施する。
Figure 0006185243
試験系へのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ −＝４：１：７．５、モル基準）の添加により、水硬度を１５゜ｄＨに調整した。洗浄後、布地を水道水で洗浄し、暗所で乾燥した。
酵素変異体の性能は、その特定のアミラーゼで洗浄された布地の色の明るさとして測定される。明るさはまた、サンプルへの白色光の照射時に、サンプルにより反射される光の強度としても表すことができる。サンプルが汚れた場合、反射光の強度は、清浄サンプルの反射光よりも減少する。従って、反射光の強度を用いて、アミラーゼの洗浄性能を測定することができる。
色測定は、プロフェッショナル・フラッドベッド・スキャナー（professional flatbed scanner）（Kodak iQsmart、Kodak）を用いて、洗浄された布地の画像を撮影することにより行われる。
スキャン画像から光強度の値を抽出するには、画像の２４ビットの画素値を、赤（ｒ）、緑（ｇ）及び青（ｂ）の値（別名ＲＧＢ値）に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクトルとして加算し、得られるベクトルの長さを求めることにより算出される。
Figure 0006185243
布地：布地サンプルＣＳ−２８（コメでんぷん付着綿）は、Center For Test materials BV、P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlandsから得ることができる。
ビーカーを用いた洗浄性能試験は、上部ロード型洗浄機の小スケールモデルとなるアッセイであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために用いられる。ビーカー洗浄性能試験は、２５０ｍＬビーカーを用いるとともに、１分あたり８０の頻度で、各方向に１８０°の周期的な回転的動作を提供するパドル攪拌機を使用して行われ、以下のステップを含む。即ち、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３及び０．４ｍｇ／Ｌ酵素を含む１００ｍＬ洗浄溶液（６℃、１５°ｄＨ、ｐＨ８．０）を用意し；ＣＳ−２８（５×５ｃｍ）の二つの材料標本及びEMPA 162（５×５ｃｍ）の二つの材料標本を、洗浄溶液に加えて洗浄を開始し；撹拌速度を８０ｒｐｍに設定し；６０分後に撹拌を停止し、冷たい水道水の流水で材料標本を濯ぎ；濯がれた材料標本を暗所で一晩乾燥させ：及び後述のようにColor Eyeを用いて４６０ｎｍにおける入射光の低減を測定することにより、洗浄性能を評価する。
装置及び材料
循環機を備えた水槽（５℃）；ガラスビーカー（２５０ｍＬ）；洗浄溶液容量１００ｍＬのビーカー１つあたり１の回転アーム；試験材料標本： Center for Testmaterials BV, Vlaardingen、The Netherlands製ＣＳ−２８（綿上のコメでんぷん）、及びEMPA Testmaterials AG、St. Gallen, Switzerland 製EMPA 162 （コメでんぷん付着綿／ポリエステル）、材料標本は５×５ｃｍに切断される。
洗浄溶液：５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファ、ｐＨ８．０、水硬度：１５°ｄＨ、カルシウム：マグネシウム比は４：１。
アミラーゼストック溶液：１ｍｌあたり１ｍｇ酵素タンパク質。−超純水（MilliQ水）中０．１％（ｗ／ｖ）Triton X-100及び０．１ｍＭ ＣａＣｌ２の溶液は、アミラーゼの希釈に用いられる（アミラーゼ希釈バッファ）。
Color Eye測定
洗浄性能は、デルタ減少値（ΔＲｅｍ）として表される。材料標本の光反射評価は、極小の（即ち０．７ｃｍ２（約０．７×１．０ｃｍ））楕円開口部を有するMacbeth Color Eye 7000 反射分光光度計を用いて行った。測定はＵＶを含まない入射光で実施し、４６０ｎｍにおける減少を抽出した。測定開口に対して材料標本を押圧するピストンからの反射を減少するべく、測定前に、測定対象となる材料標本を、同一の種類の別の材料標本の上に配置した。個別の材料標本のデルタ減少値は、アミラーゼを用いて洗浄された材料標本の減少値から、アミラーゼを添加することなく洗浄された材料標本（対照）の減少値を減算することにより算出した。
アミロース分解活性（α−アミラーゼ活性）の測定のためのアッセイ
EnzChek アッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性は、以下の EnzCheck アッセイにより測定され得る。基質としてトウモロコシでんぷん誘導体であるDQ（登録商標）でんぷん（トウモロコシでんぷんBODIPY FL複合体）を用いる。これは、蛍光が消光される程度までBODIPY（登録商標）ＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアゾ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）染料で標識されたトウモロコシでんぷんである。約１ｍｇの凍結乾燥された基質を含む一つのバイアルを、１００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０に溶解させる。バイアルを約２０秒間ボルテックスし、時折攪拌しながら、溶解するまで室温で暗所に放置する。その後、９５０μＬの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／Ｖ）Triton X100（（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９〜１０））、ｐＨ５．０を添加し、十分にボルテックスし、使用時まで室温で暗所に保存する。この溶液１ｍＬを、５ｍＬ ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％（ｗ／Ｖ）Triton X100、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０と混合することにより、基質作用溶液を調製した。
洗剤を含む酵素を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％ Triton X100、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０中１５ｎｇ酵素タンパク質／ｍｌ（６８２６．７倍希釈）の濃度に希釈する。アッセイ用に、２５μＬの基質作用溶液を、黒色３８４ウェルマイクロタイタープレート中で、２５μＬの希釈された酵素と１０秒間混合する。蛍光強度を、２５℃で、各ウェルについて隔分毎に１回、３０分間測定し（励起：４８５ｎｍ、発光：５５５ｎｍ）、Ｖｍａｘを時間に対する蛍光強度のプロットの傾きとして算出する。プロットは線形である必要があるため、希釈された参照酵素溶液が活性アッセイの線形範囲内となるように、残存活性アッセイを調整する。
場合によっては、アッセイが、アミラーゼを含まない洗剤から著しい干渉を受ける場合がある。斯かる場合には、代替のアミラーゼアッセイを用いることができる。アミラーゼアッセイに対する洗剤からの干渉は、洗剤に既知の量のアミラーゼを二つのレベルで添加し、その後二つのサンプルの活性を測定することにより試験することができる。測定された活性の差異が、添加されたアミラーゼ間のレベルの差異と対応すれば、保存後のアミラーゼの残存活性を測定するためにそのアッセイを用いることができる。
PNP-G7 アッセイ
α−アミラーゼ活性は、PNP-G7 基質を用いる方法により測定することができる。PNP-G7 は、４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ１）−α，Ｄ−マルトヘプタオシドの略称である。これは、α−アミラーゼ等のエンドアミラーゼにより切断され得るブロック化オリゴ糖である。切断後、キットに含まれるα−グルコシダーゼによって、加水分解された基質を消化し、遊離ＰＮＰ分子を放出させる。遊離ＰＮＰ分子は黄色を呈するため、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）での可視分光測定により測定することができる。PNP-G7 基質及びα−グルコシダーゼを含むキットは、Roche/Hitachi（cat. No.11876473）により製造されている。
試薬：
このキットのＧ７−ＰＮＰ基質は、２２ｍＭ ４，６−エチリデン−Ｇ７−ＰＮＰ及び５２．４ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０を含む。
α−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８７ｍＭ ＮａＣｌ、１２．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０７５ｍＭ ＣａＣｌ２、≧４ｋＵ／Ｌ α−グルコシダーゼを含む。
基質作用溶液は、１ｍＬのα−グルコシダーゼ試薬と０．２ｍＬのＧ７−ＰＮＰ基質を混合することにより調製される。この基質作用溶液の調製は、使用の直前に行う。
希釈バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９〜１０）））、１ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７．０。
手順：
分析対象となるアミラーゼサンプルを希釈バッファで希釈し、希釈されたサンプルのｐＨが７であることを確認した。希釈された酵素サンプル２０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに移送し、８０μｌの基質作用溶液を添加してアッセイを行った。溶液を混合し、室温で１分間プレインキュベートし、２０秒毎に５分間に亘り、ＯＤ４０５ｎｍで吸光度を測定した。
時間依存吸収曲線の傾き（１分あたりの吸光度）は、所定の条件群の下では、当該α−アミラーゼの比活性（酵素１ｍｇあたりの活性）に直接比例する。アミラーゼサンプルは、傾きが１分あたり０．４吸光度単位未満であるレベルまで希釈すべきである。
％ポイント（ｐｐ）の測定
親と比較しての変異体の残存活性（安定性）の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との差異、即ち、変異体の残存活性引く親の残存活性として計算される。
実施例
実施例１：変異体の調製
配列番号６のアミラーゼ変異体（ＳＰ７２２）は、標準的な手順、手短に言えば：遺伝子へのランダム及び／又は部位特異的な変異を導入すること、変異誘発された遺伝子でバシラス・サブティリス宿主細胞を形質転換すること、形質転換された宿主細胞（例えば国際公開第２００４／１１１２２０号の実施例１に開示されるように）を発酵させること、及び発酵培地からアミラーゼを精製すること、により調整された。参照アミラーゼ（配列番号６）は、同様の方法でバシラス・サブティリスにおいて組み換え的に生産された。
実施例２：キレート剤の特徴付け
実施例２ａ．
遊離カルシウムイオンの測定
キレート剤（chelating agents）（キレート剤（chelants））は、M.K.Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61、no. 9 （September 1984）, pp. 1475-1478に記載の方法から導出された、ｐＨ８において、２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで遊離カルシウムイオンの濃度（Ｃａ２＋）を低減させる能力に基づいてランク付けすることができる。遊離カルシウムイオンの測定には、上記「材料及び方法」で説明したアッセイを用いた。即ち、水硬度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減させるのに必要なキレート剤の濃度を、上述のように測定した。実験は、２１℃で、ｐＨ８バッファを用いて行った。
用いられたキレート剤の最終濃度及び測定された遊離Ｃａ２＋濃度を、以下の表２．１に示す。
Figure 0006185243
これらのデータから、遊離Ｃａ２＋濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭ未満まで低減させるために必要なキレート剤の濃度を、内挿により決定した。
このアッセイを用いて、多数のキレート剤を特徴付けした。４９ｍＭ ＥＰＰＳバッファ及び８０ｍＭ塩化カリウム中で、ｐＨ８．０において、遊離カルシウムイオンの濃度２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減させるために必要なキレート剤の濃度を、表２．２に示す。
Figure 0006185243
実施例２ｂ．
ｌｏｇＫの測定
あるいは、キレート剤（chelating agents）は、キレート剤とカルシウムイオンとの結合定数により特徴付けることができる。この定数は、AD Nielsen, CC Fuglsang and P Westh, Analytical Biochemistry Vol. 314 （2003） page 227-234及びT Wiseman, S Williston, JF Brandts and L-N Lin, Analytical Biochemistry Vol. 179 （1989） page 131-137の記載に従って、ＩＴＣ（等温滴定熱量計）により測定することができる。ｌｏｇＫの測定のための手順は、上記の「材料及び方法」に詳細に記載したとおりである。
ｌｏｇＫの測定のためのこの手順を用いて、幾つかのキレート剤について、ｐＨ１０におけるｌｏｇＫ値を、以下のとおり決定した（表２．３）。
Figure 0006185243
実施例３：キレート剤とインキュベーション後の残存活性
EnzChek アッセイ
本発明において、アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性は、上述のように EnzCheck アッセイにより測定される。概略として、洗剤モデルＢにおける残存アミラーゼ活性を、３１℃で１８時間のインキュベーション後に測定し、得られた活性を、その後、上述のように４℃で１８時間インキュベーションされた参照の活性と比較した。
キレート剤として１．５％ＤＴＰＡを含む洗剤中のアミラーゼ変異体の安定性の試験
洗剤中のアミラーゼ安定性の測定のために、試験対象となる酵素を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／Ｖ）TritonX100、ｐＨ８．０で希釈し、酵素タンパク質濃度を０．６ｍｇ／ｍＬに調整された。当初のアミラーゼ濃度が低過ぎる場合は、１０ｋＤａのカットオフを有するＵＦ膜を用いた限外濾過（ＵＦ）により濃縮してもよい。
２５μＬのアミラーゼ溶液及び１２５μＬの洗剤（洗剤モデルＢ）を、同一実験につき４連ずつ、９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。各ウェル内に小型の磁石（５×２ｍｍ）を１つずつ配置し、磁気攪拌機を用いて、混合物を室温で５分間混合した。同一のプレートを２つ調製した。一方のプレートは４℃で１８時間インキュベートし（参照サンプル）、他方のプレートは、３１℃で１８時間インキュベートした（３１℃サンプル）。
インキュベーション直後、プレート上のサンプルのアミラーゼ活性を、洗剤中の残存アミラーゼ活性の測定のためのEnzCheck アッセイの記載に従い分析した。ここで留意すべきは、アッセイに対する酵素以外の他の洗剤成分の干渉を減少させるために、参照及び３１℃サンプルの双方を、同一のタンパク質濃度に希釈した点である。参照サンプル及び３１℃サンプルの双方の活性を、同一の３８４−ウェルプレート上で測定した。全ての試験マイクロタイタープレートに参照アミラーゼが含まれているのを確認した。残存活性は、１００＊Ｖｍａｘ（３１℃サンプル）／Ｖｍａｘ（参照サンプル）として計算した。
参照アミラーゼ（親）としてＳＰ７２２又はＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊のいずれかを用いた結果を表３．１に示す。親に対する変異体の残存活性の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との差異として計算される。
Figure 0006185243
この結果は、本発明の変異体が、参照α−アミラーゼと比較して、強キレート剤の存在に対して著しく優れた耐性を有することを明らかに示している。極少数の例においては、残存活性は１００超であるが、これはアッセイの分析上の誤差を反映したものである。
また、この結果は、本発明の変異体が、ｐＨ８．０において、参照α−アミラーゼ（即ち、配列番号６（ＳＰ７２２）、又は配列番号６＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊、即ち、配列番号６のアミノ酸１８３及び１８４の欠失体）と比較して、改善された安定性を有することを示している。
実施例４：ｐＨ８及びｐＨ１０におけるキレート剤とのインキュベーション後の残存活性
この実施例では、上述の PNP-G7 アッセイを用いて、キレート剤ＤＴＰＡの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を測定する。その原理は、上述の EnzCheck アッセイを用いた活性の測定の場合と同一である。概略として、残存アミラーゼ活性を、上述の「材料及び方法」に従って記述されるように、ｐＨ８及び４９℃又はｐＨ１０及び４２℃のいずれかで、キレート剤を含むバッファ中で、１時間のインキュベーション後に測定し、得られた活性を、その後、４℃で１時間インキュベートされた参照の活性と比較する。
バッファ中でのｐＨ８及びｐＨ１０におけるキレート剤とインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性の試験
原理：
酵素サンプルは、最終濃度１．５％のＤＴＰＡを含むバッファｐＨ８．０において、４９℃で１ｈインキュベートし、参照サンプルは４℃で１ｈインキュベートした。加えて、酵素サンプルは、最終濃度１．５％のＤＴＰＡを含むバッファｐＨ１０．０において、４２℃で１ｈインキュベートし、それらの参照サンプルは４℃で１ｈインキュベートした。インキュベーション後、残存活性を、PNP-G7 アミラーゼ活性アッセイを用いて測定した。
試薬：
ＤＴＰＡを含むｐＨ８バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％Triton X100、１．８７５％ ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、cas no.67-43-6）、ｐＨ８．０
ＤＴＰＡを含むｐＨ１０バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％Triton X100、１．８７５％ ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、cas no.67-43-6）、ｐＨ１０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％Triton X-100、ｐＨ８．０中０．２５及び０．５ｍｇ活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ
手順：
１６０μＬバッファ（ＤＴＰＡを含むｐＨ８バッファ又はＤＴＰＡを含むｐＨ１０バッファ）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、同一実験につき２連ずつ、９６−ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。ＤＴＰＡの最終濃度は、各ウェルにおいて１．５％である。各ウェルの２０μｌを、新しいＰＣＲマイクロタイタープレート（ＰＣＲ ＭＴＰ）に移し、４℃で維持した（参照サンプル）。ＰＣＲ ＭＴＰは、バッファがｐＨ８．０である場合、４９℃で１時間（ｐＨ８、４９℃サンプル）、バッファがｐＨ１０．０である場合、４２℃で１時間（ｐＨ１０、４２℃サンプル）、ＰＣＲ装置中でインキュベートされた。
インキュベーションの直後、ＰＣＲプレート上のサンプルを、希釈バッファで１０倍に希釈し、PNP-G7 アッセイの記述に従い、アミラーゼ活性について分析した。ここで留意すべきは、アッセイに対するキレート剤（ここではＤＴＰＡ）の干渉を減少させるべく、参照及びｐＨ８、４９℃サンプル／ｐＨ１０、４２℃サンプルの双方を、残存活性の試験前に、同一の濃度に希釈した点である。参照サンプル及びｐＨ８、４９℃サンプル又はｐＨ１０、４２℃サンプルの双方の活性を、同一の９６ウェルプレート上で測定した。全ての試験マイクロタイタープレート上に親アミラーゼが含まれていることを確認した。残存活性は、１００＊Ｖｍａｘ（ｐＨ８、４２℃又はｐＨ１０、４９℃サンプル）／Ｖｍａｘ（参照サンプル）として計算した。結果を表４．１に示す。％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性から親の残存活性を減算して算出される。
Figure 0006185243
この結果は、本発明の変異体が非常に安定的であり、変異体の残存活性を親のものと比較した場合、及び変異体の％ポイントで見た場合の双方で、ｐＨ８、４９℃で、及びｐＨ１０、４２℃で１時間の双方でのインキュベーション後、高い残存活性を有することを明らかに示している。これに対して、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊アミラーゼの残存活性は２０％であり、ＳＰ７２２は更に低い残存活性を有する。
実施例５：ｐＨ８及びｐＨ１０において１．５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡを含むバッファ中でインキュベートした後の残存活性
この実施例では、上述の PNP-G7 アッセイを用いて、キレート剤ＤＴＰＡの存在下でインキュベートした後、ＳＰ７２２変異体の残存アミラーゼ活性を決定する。一般的に、残存アミラーゼ活性は、上述の「材料及び方法」の記載に従って、所定の温度及びインキュベーション時間において、ｐＨ８又はｐＨ１０のいずれかで、キレート剤を含むバッファ中でインキュベートした後に測定し、得られた活性を、その後、４℃でインキュベートされた参照の活性と比較する。
バッファ中でのｐＨ８及びｐＨ１０におけるキレート剤とのインキュベート後のアミラーゼ変異体の安定性の試験
原理：
酵素サンプルを、所定の温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡを含むバッファｐＨ８．０中でインキュベートし、参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。加えて、酵素サンプルは、所定の温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡを含むバッファｐＨ１０．０中でインキュベートし、それらの参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。インキュベーション後、残存活性は、PNP-G7 アミラーゼ活性アッセイを用いて測定した。
試薬：
ＤＴＰＡを含むｐＨ８バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、cas no. 67-43-6）、ｐＨ８．０
ＤＴＰＡを含むｐＨ１０バッファ：５０ｍＭグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、cas no. 67-43-6）、ｐＨ１０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％Triton X-100、ｐＨ８．０中０．２５及び０．５ｍｇ／ｍＬ活性アミラーゼタンパク質
手順：
１６０μＬバッファ（ＤＴＰＡを含むｐＨ８バッファ又はＤＴＰＡを含むｐＨ１０バッファ）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、同一実験につき２連ずつ、９６−ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。ＤＴＰＡの最終濃度は、各ウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。各ウェルの２０μｌを、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、４℃に維持した（参照サンプル）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス負荷サンプル）を、下記の表に記載のとおり、ＰＣＲ装置中でインキュベートされた。
インキュベーションの直後、ＰＣＲプレート上のサンプルを、希釈バッファで１０倍に希釈し、PNP-G7 アッセイの記載に従ってアミラーゼ活性を分析した。ここで留意すべきは、アッセイに対するキレート剤（ここではＤＴＰＡ）の干渉を減少させるために、参照及びストレス負荷サンプルの双方を、残存活性の試験前に、同一の濃度に希釈した点である。参照サンプル及びストレス負荷サンプルの双方の活性は、同一の９６ウェルプレート上で測定した。親アミラーゼが、全ての試験マイクロタイタープレートに含まれていることを確認した。残存活性は、１００＊Ｖｍａｘ（ストレス負荷サンプル）／Ｖｍａｘ（参照サンプル）として計算した。親に対する変異体の安定性の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性から親の残存活性を減算することにより算出される。結果を表５．１に示す。
Figure 0006185243
得られた残存活性から、ＳＰ７２２の変異体は、ＤＴＰＡの存在下でより安定的であることが明らかである。これは、親に対する変異体の安定性の％ポイント改善にも反映されている。
実施例６：ｐＨ１０におけるＨＥＤＰとのインキュベーション後の残存活性
この実施例では、上述の PNP-G7 アッセイを用いて、キレート剤ＨＥＤＰの存在下でインキュベーション後、残存アミラーゼ活性を測定する。概略として、残存アミラーゼ活性は、上述のような材料及び方法に従って、所定の温度及びインキュベーション時間で、ｐＨ１０でキレート剤を含むバッファ中でのインキュベーション後に測定し、得られた活性を、その後、４℃でインキュベートされた参照の活性と比較する。
バッファ中でのｐＨ１０におけるキレート剤とインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性の試験
原理：
酵素サンプルは、所定の温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰを含むバッファｐＨ１０．０中でインキュベートし、参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。インキュベーション後、残存活性は、PNP-G7 アミラーゼ活性アッセイを用いて測定した。
試薬：
ＨＥＤＰを含むｐＨ１０バッファ：５０ｍＭグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、cas no 2809-21-4）、ｐＨ１０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X-100、ｐＨ８．０中０．２５及び０．５ｍｇ活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ
手順：
１６０μＬバッファ（ＨＥＤＰを含むｐＨ１０バッファ）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、同一実験につき２連ずつ、９６−ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。ＨＥＤＰの最終濃度は、各ウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。各ウェルから２０μｌをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、４℃に維持した（参照サンプル）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス負荷サンプル）を、下記の表６．１に指示されるようにＰＣＲ装置中でインキュベートした。残存活性は、１００＊Ｖｍａｘ（ストレス負荷サンプル）／Ｖｍａｘ（参照サンプル）として計算した。親と比較した変異体の安定性の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性から親の残存活性を減算することにより算出される。
Figure 0006185243
この結果は、変異体が、親と比較して、ＨＥＤＰの存在下でインキュベートされた場合、より安定的であることを明らかに示している。
実施例７：１．５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰとＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊及びそれらの変異体の安定性
この実施例では、上述の PNP-G7 アッセイを用いて、キレート剤ＨＥＤＰの存在下でインキュベーション後、残存アミラーゼ活性を測定する。概略として、残存アミラーゼ活性は、上述の材料及び方法に従って、所定の温度及びインキュベーション時間で、ｐＨ８又はｐＨ１０のいずれかでキレート剤を含むバッファ中でのインキュベーション後に測定し、得られた活性を、その後、４℃でインキュベートされた参照の活性と比較する。
バッファ中でのｐＨ８及びｐＨ１０におけるキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性の試験
原理：
酵素サンプルを、所定の温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰを含むバッファｐＨ８．０中でインキュベートし、参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。加えて、酵素サンプルは、所定の温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰを含むバッファｐＨ１０．０中でインキュベートし、参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。インキュベーション後、残存活性を、PNP-G7 アミラーゼ活性アッセイを用いて測定した。
試薬：
ＨＥＤＰを含むｐＨ８バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、cas no 2809-21-4）、ｐＨ８．０
ＨＥＤＰを含むｐＨ１０バッファ：５０ｍＭグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、cas no 2809-21-4）、ｐＨ１０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X-100、ｐＨ８．０中０．２５及び０．５ｍｇ／ｍＬ活性アミラーゼタンパク質
手順：
１６０μＬバッファ（ＨＥＤＰを含むｐＨ８バッファ又はＨＥＤＰを含むｐＨ１０バッファ）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、同一実験につき２連ずつ、９６−ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。ＨＥＤＰの最終濃度は、各ウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。各ウェルから２０μｌを、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、４℃で維持した（参照サンプル）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス負荷サンプル）は、下記の表７．１に記載のようにＰＣＲ装置中でインキュベートした。残存活性は、１００＊Ｖｍａｘ（ストレス負荷サンプル）／Ｖｍａｘ（参照サンプル）として計算した。親と比較した変異体の安定性の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性から親の残存活性を減算することにより算出される。
Figure 0006185243
この結果は、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊の変異体が、キレート剤としてＨＥＤＰの存在下でインキュベートした場合、より一層安定であることを明らかに示している。
実施例８：１．５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡ又は１．５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰの存在下でのＡＡ５６０変異体の安定性
この実施例では、上述の PNP-G7 アッセイは、キレート剤ＤＴＰＡ又はＨＥＤＰの存在下でインキュベーション後、残存アミラーゼ活性を測定するために用いられる。一般的に、残存アミラーゼ活性は、上述のような材料及び方法に従って、所定の温度及びインキュベーション時間で、ｐＨ８又はｐＨ１０のいずれかでキレート剤を含むバッファ中でのインキュベーション後に測定し、得られた活性を、その後、４℃でインキュベートされた参照の活性と比較する。
バッファ中でのｐＨ８及びｐＨ１０におけるキレート剤とインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性の試験
原理：
酵素サンプルは、指示される温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ又はＨＥＤＰを含むバッファｐＨ８．０中でインキュベートし、参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。加えて、酵素サンプルは、指示される温度及びインキュベーション時間で、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ又はＨＥＤＰを含むバッファｐＨ１０．０中でインキュベートされ、参照サンプルは、４℃で同一のインキュベーション時間でインキュベートした。インキュベーション後、残存活性を、PNP-G7 アミラーゼ活性アッセイを用いて測定した。
試薬：
ＤＴＰＡを含むｐＨ８バッファ：５０ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、cas no.67-43-6）、ｐＨ８．０
ＤＴＰＡを含むｐＨ１０バッファ：５０ｍＭグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、cas no.67-43-6）、ｐＨ１０．０
ＨＥＤＰを含むｐＨ８バッファ：５０ｍＭＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、cas no 2809-21-4）、ｐＨ８．０
ＨＥＤＰを含むｐＨ１０バッファ：５０ｍＭグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X100、１．８７５％（ｗ／ｖ）ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、cas no 2809-21-4）、ｐＨ１０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭ ＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Triton X-100、ｐＨ８．０中０．２５及び０．５ｍｇ／ｍＬ活性アミラーゼタンパク質
手順：
１６０μＬバッファ（ＤＴＰＡ若しくはＨＥＤＰを含むｐＨ８バッファ又はＤＴＰＡ若しくはＨＥＤＰを含むｐＨ１０バッファ）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、同一実験につき２連ずつ、９６−ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。ＤＴＰＡ又はＨＥＤＰの最終濃度は、各ウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。各ウェルから２０μｌをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、４℃に維持した（参照サンプル）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス負荷サンプル）は、下記の表８．１及び８．２に記載されるようにＰＣＲ装置中でインキュベートした。残存活性は、１００＊Ｖｍａｘ（ストレス負荷サンプル）／Ｖｍａｘ（参照サンプル）として計算した。親と比較した変異体の安定性の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性から親の残存活性を減算することにより算出される。
Figure 0006185243
Figure 0006185243
本明細書では種々の参考文献を引用するが、これらの文献の開示内容は、その全体が、参照により援用される。
実施例９：キレート剤を含む洗剤中でインキュベーション後の残存活性
この実施例では、PNP-G7 アッセイを用いて、上述の「材料及び方法」に従って、キレート剤の存在下において洗剤中でインキュベーション後、残存アミラーゼ活性を測定する。
概略として、残存アミラーゼ活性を、ｐＨ８．２においてキレート剤ＤＴＰＭＰ及びＨＥＤＰを含む洗剤Ｃ中で、３０℃で、３週間及び６週間インキュベーション後に測定した（表９．１）。得られたアミラーゼの残存活性を、その後、後述のように０日（インキュベーション前）における作りたての洗剤中のアミラーゼの活性と比較する。
Figure 0006185243
ｐＨ８．２においてキレート剤を含む洗剤Ｃ中でインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性の試験
方法
本発明のアミラーゼ変異体、又は、二つの欠失Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊を含む配列番号６（ＳＰ７２２）のアミラーゼ変異体（別名ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊）を夫々含む洗剤Ｃ（ｐＨ８．２）のサンプルを調製した。それぞれの洗剤サンプルについて、インキュベーション前における初期の残存酵素活性を測定した（参照サンプル）。
各サンプルの残存酵素活性を、３０℃で３週間及び６週間インキュベーション後に測定し、それらの参照サンプルと比較した。残存活性は、PNP-G7 アミラーゼ活性アッセイを用いて測定した。
アミラーゼ溶液：１００ｇ洗剤Ｃ、ｐＨ８．２中１３．７７ｍｇ活性アミラーゼタンパク質
手順：
アミラーゼを含む洗剤Ｃ（５ｇ、ｐＨ８．２）を、同一実験につき２連ずつ、密閉蓋を有する７ｍｌガラスバイアル中に入れた。初期サンプルの残存酵素活性を、インキュベーション前に二重に測定された。
サンプルを、３０℃で３週間及び６週間、インキュベーター内で維持した。インキュベーションの直後、PNP-G7 アッセイの記述に従って、サンプルの残存アミラーゼ活性を分析された。この試験によれば、１００％の残存活性は、インキュベーション前の初期残存酵素活性（参照サンプル）と比較して、アミラーゼ活性の損失がないことに対応する。親に対する変異体の残存活性（安定性）の％ポイント（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との差異として計算される。
Figure 0006185243
これらの結果は、本発明の変異体が、３０℃で３週間及び６週間、ｐＨ８．２の洗剤Ｃ中でのインキュベーション後、非常に安定的であり、高い残存活性を有したことを明らかに示している。これに対して、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３ Ｇ１８４＊アミラーゼは、３週間後に１９％、６週間後に３％の残存活性を有する。
本明細書では種々の参考文献を引用するが、これらの文献の開示内容は、その全体が、参照により援用される。
本明細書で開示される物理量及び値は、記載された数値そのものに厳密に限定されるもの解すべきではない。代わりに、別途支持されない限り、斯かる物理量は、記載された値と、その値を含む機能的に均等の範囲の双方を意味することが意図される。例えば、「４０ｍｍ」として開示された物理量は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるべきではない。これらの実施形態は、本発明の幾つかの側面の実例として意図したものであるからである。本発明の範囲には、任意の均等の実施形態が含まれることが意図される。実際、本明細書で提示及び記載されるものに加えて、本発明の様々な変形例が、先の記述から当業者に明らかとなるであろう。斯かる変形例は、また、添付される特許請求の範囲内に含まれることが意図される。矛盾がある場合には、定義を含む本開示が優先される。

Claims (14)

  1. 親α−アミラーゼの変異体であって、配列番号６の番号付けを用いて、１９５の位置に置換を含むと共に、２０６及び／又は２４３の位置に更に置換を含み、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、且つ、前記親α−アミラーゼが配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記変異体が配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、更に、前記変異体における１９５の位置の置換がＦ、Ｌ又はＹによる置換であり、２０６の位置の置換がＬ、Ｉ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｎ、Ｈ、Ｆ又はＳによる置換であり、２４３の位置の置換がＦによる置換であるか、或いは、１９５の位置の置換がＦによる置換であり、２０６の位置の置換がＧによる置換であり、２４３の位置の置換がＦによる置換である、変異体。
  2. 配列番号６の番号付けを用いて、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、及び４５８からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に更に改変を含み、
    前記改変が各々独立に、
    （i）前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
    （ii）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
    （iii）前記位置を占めるアミノ酸の置換である、請求項１に記載の変異体。
  3. 配列番号６の番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含む、請求項１又は２に記載の変異体。
  4. 前記親α−アミラーゼの配列が、位置１９３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］による；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換；位置１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置１９８の［Ｑ又はＮ］による；位置２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｈ，Ｑ，Ｄ又はＥ］による；位置２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２１３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］；又は位置２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換のうち、少なくとも１つの置換により修飾される、請求項１〜３の何れか一項に記載の変異体。
  5. 前記変異体が、キレート剤を含む組成物中で、親α−アミラーゼと比較して改善された安定性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜４の何れか一項に記載の変異体。
  6. 前記変異体が、ｐＨ８で、キレート剤の存在下１８時間維持した後に、少なくとも６０％の残存活性をし、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜５の何れか一項に記載の変異体。
  7. 前記変異体が、自動機械ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）で測定した場合に、親α−アミラーゼと比較して改善された洗浄性能を有する、請求項１〜６の何れか一項に記載の変異体。
  8. アミロース分解活性を有する前記変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドと、少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項１〜７の何れか一項に記載の変異体。
  9. 請求項１〜８の何れか１項に記載の変異体をコード化する単離ポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む組換宿主細胞。
  11. 請求項１〜８の何れか１項に記載の変異体を含む組成物であって、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物。
  12. 前記変異体が、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下１８時間維持した後に、少なくとも６０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記変異体が、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下１８時間維持した後に、少なくとも７０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１１又は１２に記載の組成物。
  14. ポリペプチドを調製する方法であって、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有し、アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を用意し、
    （ｂ）配列番号６のアミノ酸配列の１９５の位置、並びに、２０６及び／又は２４３の位置を占めるアミノ酸を選択し、
    （ｃ）前記選択されたアミノ酸残基を置換することにより前記配列を修飾し、
    （ｄ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、前記修飾された配列を有する変異ポリペプチドを生成し、
    （ｅ）前記変異ポリペプチドをアミラーゼ活性及び安定性について検証し、
    （ｆ）アミラーゼ活性を有すると共に、前記親ポリペプチドと比較してキレート剤存在下の安定性が向上した変異ポリペプチドを選択し、
    前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、方法。
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