ES2496568T3 - Variantes de alfa-amilasa - Google Patents

Abstract

Alfa-amilasa i) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 o 8 en la presente, o ii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 o figura 2, o iii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3, o iv) alfa-amilasa que muestra al menos el 90% de homología con las alfa-amilasas de i), ii) o iii), donde la alfa-amilasa comprende una de las siguientes alteraciones: T49L, F, V, Y o I y donde la posición 49 corresponde a la posición 49 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 4.

Description

Variantes de alfa-amilasa

Campo de la invención 5

[0001] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes nuevas de alfa-amilasas progenitoras tipo Termamyl, sobre todo a variantes que presentan propiedades alteradas, en particular un modelo de seccionamiento alterado (con respecto al progenitor) que es ventajoso con respecto a las aplicaciones de las variantes, en particular, en el tratamiento del almidón industrial (p. ej., licuefacción o sacarificación del almidón). 10

Antecedentes de la invención

[0002] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan4-hidrolasas, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados. 15

[0003] Hay un cuerpo muy extenso de patentes y bibliografía científica relacionadas con esta clase de enzimas industrialmente muy importantes. Varias alfa-amilasas tales como las variantes de las alfa-amilasas tipo Termamyl son conocidas a partir de, p. ej., WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96/23874 y WO 97/41213.

[0004] La reciente descripción relacionada con las alfa-amilasas comprende el documento WO 96/23874 el cual proporciona datos estructurales de cristales tridimensionales por rayos X para una alfa-amilasa tipo Termamyl, a la que se hace referencia como BA2, que consiste en 300 residuos de aminoácidos N-terminales de alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 6 en la presente y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la alfa-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de 25 aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente (estando disponible comercialmente con el nombre comercial TermamylTM), y que está por tanto muy relacionada con las alfa-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en este contexto se incluyen dentro del significado de los términos "alfa-amilasas de tipo Termamyl", y que incluyen, entre otros, las alfa-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus). El documento WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, basándose en un análisis de la estructura de una alfa-amilasa 30 progenitora tipo Termamyl, variantes de la alfa-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas relativas al progenitor.

[0005] WO 96/23874 y WO 97/41213 (Novo Nordisk) exponen variantes de la alfa-amilasa tipo Termamyl con un modelo de seccionamiento alterado que contiene mutaciones en los residuos de aminoácidos V54; D53; Y56; Q333; 35 G57 y A52 de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente.

Breve descripción de la invención

[0006] La presente invención se refiere a alfa-amilasas tal y como se define en la reivindicación 1, que son ventajosas 40 con respecto al tratamiento industrial del almidón (licuefacción del almidón, sacarificación y similares).

[0007] Los inventores han encontrado de forma sorprendente variantes con propiedades alteradas, en particular un modelo de seccionamiento alterado que tiene una capacidad reducida mejorada para seccionar un sustrato cerca del punto de ramificación, y que además tienen una especificidad de sustrato mejorada y/o una actividad específica 45 mejorada, en comparación con el WO 96/23874 y WO 97/41213 (Novo Nordisk) descrita como variantes de alfa-amilasa de tipo Termamyl con un modelo de seccionamiento alterado que contiene mutaciones en los residuos de aminoácidos V54;D53;Y56;Q333;G57 y A52 de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente.

[0008] La invención además se refiere a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a composición que 50 comprende alfa-amilasas de la invención, a vectores de expresión recombinantes que transportan los constructos de ADN, a las células transformadas con los constructos de ADN, y al uso de alfa-amilasas y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas alfa-amilolíticas, en varios procesos industriales, p. ej., en la licuefacción del almidón, y en composiciones de detergentes, tales como composiciones de limpieza para la ropa, para lavavajillas y para superficies duras; para la producción de etanol, como la producción de etanol para combustible, para 55 bebidas e industrial; para el desencolado de telas, tejidos o prendas etc.

Nomenclatura

[0009] En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos convencionales de una sola letra y de tres 60 letras para residuos de aminoácidos. Para mayor facilidad de referencia, las variantes de alfa-amilasa de la invención se describen usando la nomenclatura siguiente:

Aminoácido(s) original(es):posición(es):aminoácido(s) substituido(s)

[0010] Según esta nomenclatura, por ejemplo la sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 se indica como:

Ala30Asn o A30N

una deleción de alanina en la misma posición está mostrada como:

Ala30* o A30* 5

y la inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como la lisina, se indica como:

* 30aLys o *30aK

[0011] Una deleción de un segmento consecutivo de residuos de aminoácidos, tal como los residuos de aminoácidos 30-33, se indica como (30-33)* o (A30-N33) o delta(A30-N33). 10

[0012] Cuando una alfa-amilasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras alfa-amilasas y se hace una inserción en esa posición esto se indica como:

* 36aAsp o *36aD

para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36 15

Las mutaciones múltiples están separadas por signos de suma, por ejemplo:

Ala30Asp + Glu34Ser o A30N+E34S

representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo la alanina y el ácido glutámico por asparraguina y serina, respectivamente. Las mutaciones múltiples pueden también ser separadas como sigue, es decir, significando lo mismo que la suma: 20

Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S

[0013] Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición esto se indica como

A30N,E o 25

A30N o A30E

[0014] Además, cuando una posición adecuada para la modificación está identificada en la presente sin que se haya sugerido una modificación específica, o A30X, se entenderá que cualquier residuo de aminoácido puede ser sustituido por el residuo de aminoácido presente en la posición. Así, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una 30 alanina en la posición 30, pero no se especifica, o se especifica como "X", se entenderá que la alanina puede ser delecionada o sustituida por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquier: R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

Descripción detallada de la invención

[0015]

Figura 1 muestra SEC ID NO:1 de WO95/26397.

Figura 2 muestra SEC ID NO:2 de WO95/26397.

Figura 3 muestra la secuencia de Bacillus sp. #707 alfa-amilasa de Tsukamoto et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, FSI (1988), págs. 25-31. 40

Alfa-amilasa tipo Termamyl

[0016] Es bien sabido que varias alfa-amilasas producidas por Bacillus spp. son muy homólogas a nivel aminoácido. Por ejemplo, se ha encontrado que la alfa-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos 45 mostrada en la SEC ID NO: 4 (comercialmente disponible como TermamylTM) tiene un 89% de homología con la alfa-amilasa de B.amiloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 6 y aproximadamente un 79% de homología con la alfa-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 8. Además las alfa-amilasas homólogas incluyen una alfa-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289; NCIB 12512; NCIB 12513 o DSM 9375; todas ellas están descritas de forma 50 detallada en WO 95/26397; y la alfa-amilasa #707 descrita por Tsukamoto et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31.

[0017] Además las alfa-amilasas homólogas incluyen la alfa-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en EP 0252666 (ATCC 27811), y las alfa-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras alfa-amilasas 55 comerciales tipo Termamyl de B. licheniformis son OptithermTM y TakathermTM (disponibles por Solvay), MaxamylTM (disponible por Gist-Brocades/Genencor), Spezym AATM y Spezyme Delta AATM (disponible por Genencor), y KeistaseTM (disponible por Daiwa).

[0018] Debido a la homología sustancial encontrada entre estas alfa-amilasas, se considera que éstas pertenecen a la 60 misma clase de alfa-amilasas, es decir a la clase de "alfa-amilasas de tipo Termamyl".

[0019] Por consiguiente, en el presente contexto, el término "alfa-amilasa tipo Termamyl" se destina a indicar una alfa-amilasa, que a nivel aminoácido muestra una homología sustancial al TermamylTM, es decir, la alfa amilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente. En otras palabras, una alfa-65 amilasa tipo Termamyl es una alfa-amilasa, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 u 8 en

la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1 o 2 de WO 95/26397 (ver figuras 1 y 2; respectivamente) o en Tsukamoto et al.; 1988 (ver figura 3), o i) que muestra al menos el 90%, incluso especialmente más preferido al menos el 95% de homología, más preferiblemente al menos el 97%, más preferiblementte al menos el 99% de homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos.

[0020] En relación con la propiedad i), la "homología" se determina usando el progama GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para penalizaciones de GAP, es decir una penalización por la creación de GAP de 3.0 y una penalización por la extensión de GAP de 0.1; (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

[0021] Un alineamiento estructural entre Termamyl y una alfa-amilasa tipo Termamyl puede ser usado para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras alfa-amilasas tipo Termamyl. Un método para obtener dicho alineamiento estructural es el uso del programa Pile Up del paquete GCG usando valores por defecto para penalizaciones de gap, es decir, una penalización por la creación de espacios de 3.0 y una penalización por la extensión de espacios de 0.1. Otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis del cluster hidrofóbico (Gaboriaud et 15 Al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) y el enhebrado inverso (Huber, T ; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998).

[0022] En este contexto, "derivado de" está destinado a indicar no sólo una alfa-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una alfa-amilasa codificada por una secuencia de DMA aislada de esta 20 cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término se destina a indicar una alfa-amilasa, que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tiene las características de identificación de la alfa-amilasa en cuestión. El término está también destinado a indicar que la alfa-amilasa progenitora puede ser una variante de una alfa-amilasa de origen natural, es decir una variante, que es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, eliminación) de uno o más residuos de aminoácidos de la alfa-25 amilasa de origen natural.

Alfa-amilasas progenitoras híbridas

[0023] La alfa-amilasa progenitora puede ser una alfa-amilasa híbrida, es decir, una alfa-amilasa, que comprende una 30 combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos alfa-amilasas.

[0024] La alfa-amilasa híbrida progenitora puede ser una, que en base a la homología del aminoácido y/o a la reacción cruzada inmunológica y/o a la hibridación del ADN (tal como se ha definido anteriormente) puede ser determinada como perteneciente a la familia de la alfa-amilasa tipo Termamyl. En este caso, la alfa-amilasa híbrida está normalmente 35 compuesta al menos por una parte de una alfa-amilasa tipo Termamyl y parte(s) de una o más alfa-amilasas seleccionadas de alfa-amilasas tipo Termamyl o alfa-amilasas no de tipo Termamyl de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero.

[0025] Así, la alfa-amilasa híbrida progenitora puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos 40 parciales que derivan de al menos dos alfa-amilasas tipo Termamyl, o de al menos una alfa-amilasa tipo Termamyl y al menos una alfa-amilasa bacteriana no de tipo Termamyl, o de al menos una alfa-amilasa de tipo Termamyl y al menos una alfa-amilasa fúngica. La alfa-amilasa tipo Termamyl de la cual deriva una secuencia de aminoácidos parcial puede, p. ej., ser cualquiera de estas alfa-amilasa específicas tipo Termamyl a las que se hace referencia en la presente.

[0026] Por ejemplo, la alfa-amilasa progenitora puede comprender una parte C-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, y una parte N-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B. stearothermophilus.

[0027] La alfa-amilasa que no es del tipo Termamyl puede, p. ej., ser una alfa-amilasa fúngica, una alfa-amilasa 50 mamífera o vegetal o una alfa-amilasa bacteriana (diferente de una alfa-amilasa tipo Termamyl). Ejemplos específicos de alfa-amilasas de este tipo incluyen la TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, la alfa-amilasa ácida de A. niger, la alfa-amilasa de Bacillus subtilis, la alfa-amilasa porcina pancreática y una alfa-amilasa de cebada. Todas estas alfa-amilasas tienen estructuras dilucidadas, que son marcadamente diferentes de la estructura de una alfa-amilasa tipo Termamyl típica según se ha hecho referencia en la presente. 55

[0028] Las alfa-amilasas fúngicas mencionadas arriba, es decir, derivadas de A. Niger y A. oryzae, son muy homólogas a nivel aminoácido y generalmente consideradas como pertenecientes a la misma familia de las alfa-amilasas. La alfa-amilasa fúngica derivada de Aspergillus oryzae está comercialmente disponible bajo el nombre comercial FungamylTM.

[0029] Además, cuando se hace referencia a una variante particular de una alfa-amilasa tipo Termamyl (variante de la invención) - de una manera convencional - por referencia a la modificación (p. ej., deleción o sustitución) de residuos de aminoácidos específicos en la secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa específica tipo Termamyl, debe entenderse que variantes de otras alfa-amilasas tipo Termamyl modificadas en la(s) posición(es) equivalente(s) (según está determinado a partir del mejor alineamiento posible de las secuencias de aminoácidos entre las secuencias de 65 aminoácidos respectivas) están comprendidas por la presente.

[0030] Una forma de realización preferida de una variante de la invención es una derivada de una alfa-amilasa de B. licheniformis (como la alfa-amilasa progenitora tipo Termamyl), p. ej., una de aquellas a las que se ha hecho referencia antes, tal como la alfa-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4.

Construcción de variantes de la invención

[0031] La construcción de la variante de interés puede ser realizada mediante el cultivo de un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son propicias para producir la variante. La variante puede ser recuperada posteriormente del resultante caldo de cultivo. Esto será descrito con más detalle a 10 continuación.

Propiedades alteradas

[0032] A continuación se discute la relación entre las mutaciones, que pueden estar presentes en las variantes de la 15 invención, y las alteraciones deseables en las propiedades (relativas a las de una alfa-amilasa progenitora tipo Termamyl), que pueden resultar de las mismas.

[0033] En una forma de realización preferida las variantes anteriores de la invención comprenden una mutación en una posición correspondiente al menos a una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la 20 SEC ID NO: 4:

T49L, T49F, T49V, T49Y, T491, A52S+V54N+T49L o

T49L+A52V+G107A+A111V

[0034] También se han descrito variantes que comprenden al menos una mutación que corresponde a las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4:

T49L+G107A;

T49I+G107A; 30

T49L+G107A+V54I;

T49I+G107A+V54I;

A52S+V54N+T49L+G107A;

A52S+V54I+T49L+G107A;

A52S+T49L+G107A; 35

A52T+T49L+G107A;

A52S+V54N+T49I+G107A;

A52S+V54I+T49I+G107A;A52S+T49I+G107A;

T49L+G108A;

T49I+G108A; 40

T49L+G108A+V54I;

T49I+G108A+V54I.

[0035] Todas las variantes de la invención mencionadas arriba tienen propiedades alteradas (lo que significa propiedades aumentadas o disminuidas), en particular al menos una de las siguientes propiedades relativa a la alfa-45 amilasa progenitora: capacidad reducida para disociar un sustrato cerca del punto de ramificación, especificidad de sustrato mejorada y/o actividad específica mejorada, unión del sustrato alterada, termoestabilidad alterada, perfil de pH/actividad alterado, perfil de pH/estabilidad alterado, estabilidad alterada hacia la oxidación, dependencia del Ca2+ alterada.

Estabilidad

[0036] En el contexto de la presente invención, las mutaciones (incluyendo las sustituciones y/o deleciones de aminoácidos) importantes con respecto al logro de la estabilidad, en particular la estabilidad mejorada (es decir, más alta o más baja), a un pH especialmente bajo (es decir, pH 4-6) incluyen cualquiera de las mutaciones mencionadas en 55 la sección ''propiedades alteradas'', más arriba y las variantes mencionadas justo abajo.

[0037] Las variantes siguientes: Q360A, K; N102A, N326A,L, N190G, N190K; Y262A,K,E (usando la numeración BAN, es decir, SEC ID N: 6) fueron también evaluadas por la estabilidad del pH. Una alfa-amilasa progenitora preferida puede ser BA2 anteriormente descrita. La estabilidad del pH fue determinada como se describe en la sección "Materiales & Métodos".

Estabilidad de Ca2+

[0038] Una estabilidad de Ca2+ alterada significa que la estabilidad de la enzima bajo la depleción de Ca2+ ha sido mejorada, es decir, mayor o menor estabilidad. En el contexto de la presente invención, las mutaciones (incluso las sustituciones del aminoácido) importantes con respecto al logro de la estabilidad de Ca2+ alterada, en particular 10 estabilidad de Ca2+ mejorada, es decir, mayor o menor estabilidad, a un pH especialmente bajo (es decir, pH 4-6) incluyen cualquiera de las mutaciones mencionadas en la sección "propiedades alteradas" más arriba.

Actividad específica

[0039] En otro aspecto de la presente invención, las mutaciones importantes con respecto al logro de las variantes que presentan una actividad específica alterada, en particular una actividad específica aumentada o disminuida, especialmente a temperaturas entre 60-100°C, preferiblemente 70-95°C, especialmente 80-90°C, incluyen cualquiera de las mutaciones catalogadas en la sección " propiedades alteradas" más arriba.

[0040] La actividad específica de LE174 y LE429 fue determinada a 16,000 NU/mg usando el ensayo de Fadebas® descrito en la sección "Materiales y Métodos".

Modelo de seccionamiento alterado

[0041] En el proceso de la licuefacción del almidón es deseable usar una alfa-amilasa, que sea capaz de degradar las moléculas de almidón en oligosacáridos ramificados largos, más que una alfa-amilasa, dando lugar a la formación de oligosacáridos ramificados más cortos (como las alfa-amilasas tipo Termamyl convencionales). Los oligosacáridos ramificados cortos (precursores de la panosa) no son hidrolizados de manera satisfactora por las pululanasas, las cuales se usan después del tratamiento de la alfa-amilasa en el proceso de licuefacción, o simultáneamente con una 30 amiloglucosidasa de sacarificación (glucoamilasa), o antes de añadir una amiloglucosidasa de sacarificación (glucoamilasa). Así, en presencia de los precursores de panosa, la mezcla del presente producto después del tratamiento con glucoamilasa contiene una proporción significante de la llamada dextrina límite, corta y ramificada, es decir, el trisacárido panosa. La presencia de panosa reduce el rendimiento de la sacarificación significativamente y es por lo tanto indeseable. 35

[0042] Se ha indicado anteriormente (patente estadounidense 5,234,823) que, durante la sacarificación con glucoamilasa y pululanasa, la presencia de actividad alfa-amilasa residual que surge del proceso de licuefacción, puede llevar a rendimientos más bajos de glucosa, si la alfa-amilasa no es inactivada antes de la fase de sacarificación. Esta inactivación puede ser normalmente realizada ajustando el pH por debajo de 4.7 a 95°C, antes de reducir la temperatura 40 a 60°C para la sacarificación.

[0043] La razón de este efecto negativo en el rendimiento de la glucosa no está completamente entendido, pero se asume que la alfa-amilasa licuefactante (por ejemplo Termamyl 120 L de B. licheniformis) genera "dextrinas límites" (que son sustratos pobres en pululanasa), mediante la hidrolización de enlaces 1,4-alfa-glucosídicos cerca y en ambos 45 lados de los puntos de ramificación en la amilopectina. Las hidrólisis de estas dextrinas límite por la glucoamilasa conduce a una generación del trisacárido panosa, que es sólo lentamente hidrolizado por la glucoamilasa.

[0044] El desarrollo de una alfa-amilasa termoestable, que no tenga esta desventaja, sería una mejora significante, puesto que no se requeriría una inactivación por separado. 50

[0045] Así, el objetivo de la presente invención es conseguir una alfa-amilasa mutante con características de degradación del almidón modificadas de forma apropiada pero que conserve la termostabilidad de la alfa-amilasa progenitora tipo Termamyl.

[0046] Por consiguiente, la invención se refiere a una variante de una alfa-amilasa tipo Termamyl, con una capacidad reducida mejorada para disociar un sustrato cerca del punto de ramificación, y que además tiene especificidad de sustrato mejorada y/o actividad específica mejorada.

[0047] Es de particular interés una variante, que secciona un sustrato de amilopectina, desde el extremo reductor, más 60 de una unidad de glucosa desde el punto de ramificación, preferiblemente más de dos o tres unidades de glucosa desde el punto de ramificación, es decir, a mmás distancia desde el punto de ramificación que aquella que se obtiene usando una alfa-amilasa de B. licheniformis de tipo salvaje.

[0048] Se puede mencionar aquí que según WO 96/23874, se prevén variantes que comprenden al menos una de las 65 siguientes mutaciones para prevenir un seccionamiento cerca del punto de ramificación:

V54L, I, F, Y, W, R, K, H, E, Q;

D53L, I, F,Y,W;

Y56W;

Q333W;

G57, todos los residuos de aminoácidos posibles; 5

A52, residuos de aminoácidos más grandes que A, p. ej., A52W, Y, L, F, I.

[0049] Las mutaciones de interés particular en relación con la obtención de variantes según la invención con una capacidad reducida mejorada para seccionar un sustrato cerca del punto de ramificación, y teniendo además una especificidad de sustrato mejorada y/o una actividad específica mejorada, incluyen las mutaciones en las siguientes 10 posiciones en la alfa-amilasa B. licheniformis, SEC ID NO: 4:

H156;A181;N190;A209;Q264 y I201.

[0050] También, la alfa-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 que comprende una o más de las siguientes mutaciones puede ser usada como esqueleto (usando la SEC ID NO: 4 para la numeración de las 15 mutaciones):

E119C;

S130C;

D124C;

R127C; 20

A52todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular;

S85todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular;

N96todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular;

V129todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular;

A269todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular; 25

A378todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular;

S148todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular S148N;

E211todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular E211Q;

N188todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular N188S, N188P M197todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular M197T, M197A, M197G, M197I, M197L, M197Y, M197F, M197I; 30

W138all possible amino acid residues, in particular W138Y;

D207todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular D207Y;

H133todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular H133Y;

H205todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular H205H, H205C, H205R;

S187todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular S187D; 35

A210todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular A210S, A210T;

H405todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular H405D;

K176todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular K176R;

F279todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular F279Y;

Q298todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular Q298H; 40

G299todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular G299R;

L308todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular L308F;

T412todos los residuos de aminoácidos posibles, en particular T412A;

[0051] Además, la alfa-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 comprendiendo al menos una de las 45 siguientes mutaciones puede ser usada como esqueleto:

M15todos los residuos de aminoácidos posibles;

A33todos los residuos de aminoácidos posibles;

[0052] En una forma de realización preferida una variante de la invención comprende al menos una mutación en una 50 posición correspondiente a las mutaciones siguientes en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4:

T49L, A52S+V54N+T49L; or

T49V, T49I, T49Y, T49F.

[0053] En una forma de realización preferida una variante de la invención comprende al menos una mutación en una posición correspondiente a las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4:

T49L+G107A;

T49I+G107A;

T49L+G107A+V54I;

T49I+G107A+V54I;

A52S+V54N+T49L+G107A; 10

A52S+V54I+T49L+G107A;

A52S+T49L+G107A;

A52T+T49L+G107A;

A52S+V54N+T49I+G107A;

A52S+V54I+T49I+G107A; 15

A52S+T49I+G107A;

T49L+G108A;

T49I+G108A;

T49L+G108A+V54I; 20

T49I+G108A+V54I.

Mutaciones generales en variantes de la invención

[0054] Puede ser preferido que una variante de la invención comprenda una o más modificaciones además de las 25 perfiladas arriba. Así, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina presente(s) en la parte de la variante de la alfa-amilasa que es modificada sea/sean sustituido(s) con un residuo que no sea de prolina que puede ser cualquiera de los posibles residuos de origen natural que no sean de prolina, y que preferiblemente sea una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina.

[0055] Análogamente, puede ser preferido que uno o más residuos de cisteína presentes entre los residuos de aminoácidos con los cuales la alfa-amilasa progenitora es modificada sea/sean sustituido(s) con un residuo que no sea de cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina.

[0056] Además, una variante de la invención puede - en combinación con cualquiera de las modificaciones perfiladas 35 arriba - ser modificada de modo que uno o más Asp y/o Glu presente en un fragmento del aminoácido correspondiente al fragmento del aminoácido 185-209 de la SEC ID n°. 4 sea sustituido por Asn y/o Gln, respectivamente. También es de interés la sustitución, en la alfa-amilasa de tipo Termamyl, de uno o más de los residuos de Lys presentes en un fragmento e aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209 de la SEC ID NO: 4 por un Arg.

[0057] Será entendido que la presente invención comprende variantes que incorporan dos o más de las modificaciones perfiladas arriba.

[0058] Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas en la presente. 45

Métodos para preparar variantes de la alfa-amilasa

[0059] Diferentes métodos para introducir mutaciones en genes son conocidos en la técnica. Después de una breve discusión sobre la clonación de secuencias de ADN que codifican la alfa-amilasa, se discutirán unos métodos para 50 generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia de codificación de la alfa-amilasa.

Clonación de una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa

[0060] La secuencia de ADN codificadora de una alfa-amilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o 55 microorganismo que produzca la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debería construir una biblioteca de ADN genómico y/o de ADNc usando ADN cromosómico o ARN

mensajero del organismo productor de la alfa-amilasa que debe ser estudiada. Después, si la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa es conocida, se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos homólogas y marcadas y se pueden utilizar para identificar clones codificadores de la alfa-amilasa de una biblioteca genómica preparada a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada conteniendo secuencias homólogas a un gen de alfa-amilasa conocido podría ser usada como una sonda para identificar clones codificadores de 5 la alfa-amilasa, usando condiciones de hibridación y de lavado de astringencia más bajas.

[0061] Otro método para identificar clones codificadores de la alfa-amilasa implican la inserción de fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, la transfomación de bacterias alfa-amilasa-negativas con la resultante biblioteca de ADN genómico, y después la colocación en placas de las bacterias transformadas en agar 10 contendiendo un sustrato para alfa-amilasa, de ese modo permitiendo identificar los clones que codifican la alfa-amilasa.

[0062] De forma alternativa, la secuencia de ADN codificadora de la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos estándar, p. ej., el método de la fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Mattes et al. (1984). En el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej., en un 15 sintetizador de ADN automático, purificados, anillados, ligados y clonados en los vectores apropiados.

[0063] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, de origen mezclado sintético y de ADNc o de origen mezclado genómico y de ADNc, preparado ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (si fuera apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN 20 entera), de acuerdo con las técnicas estándar. La secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988).

Mutagénesis sitio dirigida 25

[0064] Una vez que una secuencia de ADN codificadora de la alfa-amilasa haya sido aislada, y que se hayan identificado los sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones usando los oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios para la mutación deseados; los nucleótidos mutantes son insertados durante la síntesis de los oligonucleótidos. En un método específico, 30 un espacio monocatenario de ADN, que conecta la secuencia codificadora de la alfa-amilasa, es creado en un vector que transporta el gen de la alfa-amilasa. A continuación el nucleótido sintético, que contiene la mutación deseada, es anillado hasta una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante es luego rellenado con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y el constructo es ligado usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método está descrito en Morinaga et al. (1984). US 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican las mutaciones múltiples 35 mediante la realización de alteraciones mínimas del casete. No obstante, una variedad incluso superior de mutaciones puede ser introducida en cualquier momento por el método de Morinaga, ya que se puede introducir una multitud de oligonucleótidos de varias longitudes.

[0065] Otro método para introducir mutaciones en las secuencias de ADN codificadoras de la alfa-amilasa está descrito 40 en Nelson y Long (1989). Implica la generación en 3 fases de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR. A partir del fragmento generado por reacción en cadena de la polimerasa, un fragmento de ADN que transporta la mutación puede ser aislado por el seccionamiento con endonucleasas de restricción y reinsertados en un plásmido de expresión. 45

Mutagénesis aleatoria

[0066] La mutagénesis aleatoria se realiza de manera adecuada bien como una mutagénesis aleatoria localizada o región-específica en al menos tres partes del gen que traduce la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o 50 dentro del gen entero.

[0067] La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora puede ser convenientemente realizada usando cualquier método conocido en la técnica.

[0068] En relación con lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una alfa-amilasa progenitora, p. ej., donde la variante muestra una capacidad reducida de seccionamiento de un sustrato oligosacárido cerca del punto de ramificación, y además presenta especificidad de sustrato mejorada y/o una actividad específica mejorada con respecto al progenitor, el método:

(a) sometiendo una secuencia de ADN codificadora de la alfa-amilasa progenitora a una mutagénesis aleatoria, 60

(b) expresando la secuencia de ADN mutada obtenida en la fase (a) en una célula huésped, y

(c) seleccionando las células huéspedes que expresan una variante de la alfa-amilasa con una propiedad alterada (es decir, termoestabilidad) con respecto a la alfa-amilasa progenitora

[0069] La fase (a) del método anterior de la invención es preferiblemente realizado usando cebadores dopados. Por 65 ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado,

usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno, que induce transiciones, transversiones, inversiones, aleatorizaciones, deleciones, y/o inserciones.

[0070] Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para este propósito incluyen la irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos nucleótidos. Cuando estos agentes son usados, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora que debe ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para que ocurra la 10 mutagénesis, y seleccionando el ADN mutado que tenga las propiedades deseadas. Cuando la mutagénesis se realiza por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje o adicionado puede hacerse de modo que se eviten los codones para los aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado puede ser incorporado en el ADN que codifica la enzima alfa-amilasa mediante cualquier técnica publicada, 15 usando p. ej., PCR, LCR o cualquier ADN-polimerasa y ligasa según se considere apropiado. Preferiblemente, el dopaje se realiza usando un "dopaje aleatorio constante", donde el porcentaje de tipo salvaje y mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje puede estar dirigido hacia una preferencia para introducir ciertos nucleótidos, y por tanto hacia una preferencia para introducir uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje puede hacerse, p. ej., para permitir la introducción del 90% de tipo salvaje y el 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración 20 adicional para la elección de un esquema de dopaje se basa en la genética así como en las limitaciones estructurales de las proteínas. El esquema del dopaje puede hacerse usando el programa DOPE, que, entre otras cosas, asegura que se evita la introducción de codones de parada. Cuando se utiliza la mutagénesis generada por PCR, bien un gen tratado o no tratado químicamente que codifica una alfa-amilasa progenitora es sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15). Una cepa 25 mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet.; 133, 1974; págs. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano puede ser usada para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la alfa-amilasa por, p. ej., transformando un plásmido que contenga la glicosilasa progenitora en la cepa mutágena, haciendo crecer la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el organismo de expresión. La secuencia de ADN para ser mutagenizada puede estar 30 convenientemente presente en una biblioteca genómica o de ADNc obtenida a partir de un organismo que expresa la alfa-amilasa progenitora. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o, por el contrario, puede ser expuesto al agente mutagenizante. El ADN que debe ser mutagenizado puede también estar presente en una célula huésped bien estando integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector contenido en la célula. Finalmente, el 35 ADN que debe ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que debe ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico. En algunos casos puede ser conveniente el hecho de amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de expresión b) o la fase de selección c). Tal amplificación puede ser realizada de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido es la amplificación generada por PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados en 40 base a la secuencia de ADN o secuencia de aminoácidos de la enzima madre. Después de la incubación con o exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado mediante el cultivo de una célula huésped adecuada que transporta la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que fuera transportada por la secuencia de ADN codificadora de la enzima madre durante 45 el tratamiento por mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas son las siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas tales como E. coli. La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten la 50 expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada

[0071] La mutagénesis aleatoria puede estar ventajosamente localizada en una parte de la alfa-amilasa progenitora en 55 cuestión. Esto puede, p. ej., ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas por ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se modifican se prevé que resulten en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima madre ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.

[0072] La mutagénesis aleatoria localizada, o, región-específica se realiza convenientemente usando técnicas de mutagénesis generada por PCR según el modo descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que debe ser modificada puede ser aislada, p. ej., por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente. 65

Métodos alternativos para proporcionar variantes de la alfa-amilasa

[0073] Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen el método de redistribución de genes conocido en la técnica incluyendo p. ej. los métodos, descritos en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S). 5

Expresión de variantes de la alfa-amilasa

[0074] Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por los métodos descritos anteriormente, o por cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede ser expresada, en forma enzimática, 10 usando un vector de expresión que normalmente incluye las secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión del ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0075] El vector de expresión recombinante que transporta la secuencia de ADN que codifica una variante de la alfa-15 amilasa de la invención puede ser cualquier vector, que puede convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe ser introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector 20 puede ser uno que, al introducirse en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se haya integrado.

[0076] En el vector, la secuencia de ADN debería ser operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestre actividad transcripcional en la célula 25 huésped de elección y puede derivar de proteínas codificadoras de genes bien homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN codificadora de una variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E.coli, los promotores del gen de la agarasa dagA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de la alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de la amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus 30 stearothermophilus, los promotores de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. para la transcripción en un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de A. niger, la alfa-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. 35 nidulans.

[0077] El vector de expresión de la invención puede comprender también un terminador de la transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de la alfa-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden de manera adecuada 40 derivar de las mismas fuentes que el promotor.

[0078] El vector puede además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de secuencias de este tipo son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702. 45

[0079] El vector puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej., un gen cuyo producto implementa una carencia en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera resistencia a los antibióticos tal como resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o a la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de la selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que de lugar a 50 la resistencia a la higromicina, o la selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej., como se describe en WO 91/17243.

[0080] Mientras que la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej., cuando se usan ciertas bacterias como las células huéspedes, es generalmente preferido que la expresión sea extracelular. En general, las 55 alfa-amilasas de Bacillus mencionadas aquí comprenden una prerregión que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si fuera deseable, esta prerregión puede ser sustituida por una prerregión diferente o una secuencia señal, convenientemente realizada por la sustitución de las secuencias de ADN que codifican las prerregiones respectivas.

[0081] Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de alfa-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et Al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

[0082] La célula de la invención, que comprende sea un constructo de ADN o sea un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, se utiliza ventajosamente como una célula huésped para la producción recombinante de una variante de alfa-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración está generalmente considerada como una ventaja puesto que la secuencia 5 de ADN tiene más probabilidad de ser mantenida de manera estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según métodos convencionales, p. ej., por recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula puede ser transformada con un vector de expresión según el modo descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.

[0083] La célula de la invención puede ser una célula de un organismo mayor tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, p. ej., una célula bacteriana o fúngica (incluida la levadura).

[0084] Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias gram-positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus 15 coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E.coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, efectuarse mediante la transformación del protoplasto o usando células competentes según cierto modo conocido per se.

[0085] El organismo de la levadura puede ser seleccionado de forma favorable de unas especies de Saccharomyces o Schizosacaromyces, p. ej., Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede ventajosamente ser una especie de Aspergillus, p. ej., Aspergillus oryzae o Aspergillus Niger. Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación del protoplasto y la transformación de los protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células 25 huéspedes de Aspergillus está descrito en EP 238 023.

[0086] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de la alfa-amilasa de la invención, dicho método comprende el cultivo de una célula huésped según el modo descrito anteriormente bajo las condiciones propicias para la producción de la variante y la recuperación de la variante de las células y/o del medio de 30 cultivo.

[0087] El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de la alfa-amilasa de la invención. Los medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden ser preparados según las recetas publicadas (p. 35 ej., como se describe en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo).

[0088] La variante de la alfa-amilasa segregada a partir de las células huéspedes puede convenientemente ser recuperada del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, y la precipitación de componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato 40 de amonio, seguido del uso de procedimientos cromatográficos tal como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.

Aplicaciones industriales

[0089] Las variantes de la alfa-amilasa de esta invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, variantes enzimáticas de la invención son aplicables como un componente para composiciones de detergentes para el lavado, para lavavajillas y para la limpieza de superficies duras. Numerosas variantes son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol, p. ej., etanol para combustible, para bebidas o industrial, a partir de almidón, y/o para el desencolado textil. Las condiciones para los procesos de conversión 50 del almidón convencionales, incluyendo la licuefacción del almidón y/o procesos de sacarificación, están descritos en, p. ej., 3,912,590 y en las publicaciones de patentes EP Nos. 252 730 y 63 909.

Producción de edulcorantes a partir de almidón:

[0090] Un proceso "tradicional" para la conversión de almidón en jarabes de fructosa normalmente consiste en tres procesos consecutivos enzimáticos, es decir, un proceso de licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón es degradado en dextrinas por una alfa-amilasa (p. ej., TermamylTM) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a temperaturas de 95-160°C durante un periodo de aprox. 2 horas. Para asegurar la estabilidad enzimática bajo estas condiciones; se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones de 60 calcio libre).

[0091] Después del proceso de licuefacción las dextrinas son convertidas en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa (p. ej., AMGTM) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej., PromozymeTM). Antes de esta fase el pH es reducido a un valor inferior a 4.5, manteniendo la temperatura elevada (por 65

encima de 95°C), y la actividad licuefactante de la alfa-amilasa es desnaturalizada. La temperatura es reducida a 60°C, y se añaden la enzima glucoamilasa y la desramificante. El proceso de sacarificación continua durante 24-72 horas.

[0092] Después del proceso de sacarificación el pH es aumentado a un valor en la gama de 6-8, preferiblemente pH 7.5, y el calcio se elimina por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en jarabe rico en fructosa 5 usando, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como SweetzymeTM).

[0093] Al menos una mejora enzimática de este proceso podría ser prevista: reducción de la dependencia del calcio de la alfa-amilasa licuefactante. Se requiere la adición de calcio libre para asegurar una estabilidad adecuadamente alta de la alfa-amilasa, pero el calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa y necesita ser eliminado, 10 mediante una operación individual cara, hasta el punto de reducir el nivel de calcio libre por debajo de 3-5 ppm. Se podrían obtener ahorros en el coste si esta operación pudiera ser evitada y el proceso de licuefacción fuera realizado sin la adición de iones de calcio libre.

[0094] Para conseguirlo, se requiere una alfa-amilasa menos calcio-dependiente del tipo Termamyl que sea estable y 15 muy activa a concentraciones bajas de calcio libre (< 40 ppm). Tal alfa-amilasa tipo Termamyl debería tener un pH óptimo a un pH en la gama de 4.5-6.5, preferiblemente en la gama de 4.5-5.5.

[0095] La invención también se refiere a una composición que comprende una mezcla de una o más variantes de la invención derivadas de (igual que la alfa-amilasa progenitora tipo Termamyl) la alfa-amilasa de B. stearothermophilus 20 que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y una alfa-amilasa tipo Termamyl derivada de la alfa-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4.

[0096] Una variante de la alfa-amilasa de la invención o una composición de la invención puede en cierto aspecto de la invención ser usada para la licuefacción del almidón, en una composición de detergente, como composiciones para el 25 lavado de la ropa, de la vajilla y para la limpieza de superficies duras, para la producción de etanol, como la producción de etanol para combustible, para bebidas e industrial, para el desencolado textil, de tejidos y prendas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Enzimas:

LE174: variante de la alfa-amilasa híbrida:

[0097] LE174 es una alfa-amilasa tipo Termamyl híbrida que es idéntica a la secuencia de Termamyl, es decir, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, a excepción de que los 35 residuos de los aminoácidos 35 N-terminales (de la proteína madura) han sido sustituidos por los 33 residuos de BAN N-terminales (proteína madura), es decir, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 6, que además tiene las mutaciones siguientes:

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEC ID NO: 4).

LE429 variante de la alfa-amilasa híbrida:

[0098] LE429 es una alfa-amilasa tipo Termamyl híbrida que es idéntica a la secuencia de Termamyl, es decir, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, a excepción de que los 35 residuos de los aminoácidos N-terminales (de la proteína madura) han sido sustituidos por los 33 residuos de BAN N-terminales (proteína madura), 45 es decir, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 6, que además tiene las mutaciones siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEC ID NO: 4). LE429 está mostrada como la SEC ID NO: 2 y fue construida por SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351).

[0099] DextrozymeTM E: una mezcla equilibrada de glucoamilasa (AMG) y pululanasa obtenible a partir de cepas 50 seleccionadas de Aspergillus Niger y Bacillus deramificans (disponible por Novo Nordisk A/S)

Fermentación y purificación de variantes de la alfa-amilasa

[0100] Una cepa de B. subtilis que alberga el plásmido de expresión pertinente es alineada en una placa de LB-agar con 55 10 micro g/ml de canamicina de stock a -80°C , y se deja crecer durante toda la noche a 37°C.

[0101] Las colonias son transferidas a 100 ml de medios de BPX suplementados con 10 micro g/ml de canamicina en un matraz de agitación de 500 ml.

Composición de medio de BPX :

Almidón de patata

100 g/l

Harina de cebada

50 g/l

BAN 5000 SKB

0.1 g/l

Caseinato sódico

10 g/l

Harina de soja

20 g/l

Na2HPO4, 12 H2O

9 g/l

PluronicTM

0.1 g/l

[0102] El cultivo se agita a 37°C a 270 rpm durante 5 días.

[0103] Las células y el detrito celular son eliminados del caldo de fermentación por centrifugado a 4500 rpm en 20-25 minutos. Después el sobrenadante es filtrado para obtener una solución completamente clara. El producto filtrado es 5 concentrado y lavado en un filtro UF (membrana con 10000 cortes) y el tampón es cambiado a 20mM de acetato a pH 5.5. El producto filtrado de UF es aplicado en una S-Sepharose F.F. y la elución se realiza por fases con 0.2M de NaCl en el mismo tampón. El eluato es dializado contra 10mM de Tris, pH 9.0 y aplicado en una Q-Sepharose F.F. y eluido con un gradiente lineal de 0-0.3M de NaCl por 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad (medida por el ensayo de Phadebas) son agrupadas, el pH fue ajustado a pH 7.5 y el color restante fue eliminado por un 10 tratamiento con 0.5% P/vol. de carbón activo en 5 minutos.

Determinación de la actividad - (KNU)

[0104] Una Unidad Kilo de alfa-amilasa (1 KNU) es la cantidad de enzima que rompe 5.26 g de almidón (Merck, 15 Amylum Solubile, Erg. B 6, lote 9947275) por hora en el método estándar de Novo Nordisk para la determinación de alfa-amilasa basándose en la condición siguiente:

Sustrato

almidón soluble

Contenido de calcio en solvente

0.0043 M

Tiempo de reacción

7-20 minutos

Temperatura

37°C

pH

5.6

[0105] La descripción detallada del método analítico de Novo Nordisk (AF 9) está disponible bajo petición. 20

Ensayo para la actividad alfa-amilasa

[0106] La actividad alfa-amilasa está determinada por un método que utiliza comprimidos de Phadebas® como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (Test de Amilasa de Phadebas®, suministrado por Pharmacia Diagnostic) 25 contiene un polímero de almidón de color azul insoluble reticulado, que ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia tampón y dispuesto en comprimidos.

[0107] Para cada medición individual un comprimido es suspendido en un tubo que contiene 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético; 50 mM de ácido fosfórico; 50 mM de ácido bórico; 0.1 mM de CaCl2, pH 30 ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba se realiza al baño maría a la temperatura de interés. La alfa-amilasa que debe evaluarse es diluida en x ml de tampón Britton-Robinson 50 mM. 1 ml de esta solución de alfa-amilasa se añade a los 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la alfa-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbencia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de la alfa-amilasa. 35

[0108] Es importante que la absorbencia de 620 nm medida después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de testado) esté en la gama de 0.2 a 2.0 unidades de absorbencia a 620 nm. En este rango de absorbencia hay linealidad entre actividad y absorbencia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe en consecuencia ser ajustada para cumplir este criterio. Bajo un grupo especifico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones del tampón) 1 40 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y un color azul será producido. La intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbencia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de la alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión según el grupo de condiciones dado.

Determinación de la actividad específica 45

[0109] La actividad específica se determina usando el ensayo de Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima.

Medición del perfil de actividad del pH (estabilidad del pH)

[0110] La variante es almacenada en 20 mM de Tris pH 7.5, 0.1 mM, CaCl2 y evaluada a 30°C; 50 mM de Britton-Robinson; 0.1 mM de CaCl2. La actividad del pH es medida a pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 7.0, 8.0, 9.5, 9.5, 10; y 10.5; usando el ensayo Phadebas anteriormente descrito.

Determinación de la actividad de AGU y como AGU/mg 55

[0111] Una unidad Novo de amiloglucosidasa (AGU) se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 37°C y pH 4.3. Una descripción detallada del método analítico (AEL-SM-0131) está disponible bajo petición por Novo Nordisk.

[0112] La actividad está determinada como AGU/ml por un método modificado después de (AEL-SM-0131) usando el kit Glucose GOD-Perid de Boehringer Mannheim; 124036. Estándar: AMG estándar, lote 7-1195, 195 AGU/ml.

[0113] 375 microL de sustrato (maltosa al 1 % en 50 mM de acetato sódico, pH 4.3) es incubado 5 minutos a 37°C. Se añaden 25 microL de enzima diluidos en acetato sódico. La reacción es detenida después de 10 minutos añadiendo 100 5 microL de NaOH 0.25 M. 20 microL son transferidos a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se añaden 200 microL de solución GOD-Perid. Después de 30 minutos a la temperatura ambiente, la absorbencia es medida a 650 nm y la actividad calculada en AGU/ml a partir del ANG estándar.

[0114] La actividad específica en AGU/mg es luego calculada a partir de la actividad (AGU/ml) dividida con la 10 concentración proteínica (mg/ml).

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 (ejemplo referencial) 15

Construcción de variantes de Termamyl según la invención

[0115] Termamyl (alfa-amilasa de B. licheniformis de la SEC ID NO: 4) es expresada en B. subtilis a partir de un plásmido denominado pDN1528. Este plásmido contiene el gen completo que codifica Termamyl, amyL, cuya expresión es dirigida por su propio promotor. Además, el plásmido contiene el origen de replicación, ori, del plásmido pUB110 y el 20 gen cat del plásmido pC194 lo que confiere resistencia al cloranfenicol. pDN1528 está mostrado en la Fig. 9 de WO 96/23874. Se preparó un vector específico de la mutagénesis conteniendo una mayor parte de la región de codificación de la SEC ID NO: 3. Las características más importantes de este vector, denominado pJeEN1, incluyen un origen de replicación derivado de los plásmidos pUC, el gen cat que confiere resistencia al cloranfenicol, y una versión conteniendo un desplazamiento del marco de lectura del gen bla, cuyo tipo salvaje normalmente confiere resistencia a la 25 ampicilina (fenotipo ampR). Esta versión mutada resulta en un fenotipo amp. El plásmido pJeEN1 está mostrado en la Fig. 10 de WO 96/23874, y el origen de replicación de E. coli , ori, bla, cat, la versión truncada en 5' del gen de la amilasa de Termamyl y sitios de restricción seleccionados están indicados en el plásmido.

[0116] Se introducen mutaciones en amyL por el método descrito por Deng y Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, págs. 30 81-88) a excepción de que los plásmidos con el "cebador de selección" (cebador #6616; ver más abajo) incorporados están seleccionados en base al fenotipo ampR de células transformadas de E. coli que contienen un plásmido con un gen bla reparado, en vez de utilizar la selección por digestión de la enzima de restricción perfilada por Deng y Nickoloff. Los productos químicos y enzimas usados para la mutagénesis fueron obtenidos a partir del kit de mutagénesis ChameleonÔ de Stratagene (número de fabricación 200509). 35

[0117] Después de la verificación de la secuencia de ADN en los plásmidos variantes, el gen truncado, conteniendo la alteración deseada, es subclonado en pDN1528 como un fragmento PstI-EcoRI y transformado en la cepa SHA273 pobre en proteasa y amilasa de Bacillus subtilis (descrita en WO92/11357 y WO95/10603) para expresar la enzima variante. 40

[0118] La variante de Termamyl V54W fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5' a 3', de izquierda a derecha):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG (SEC ID NO: 9)

[0119] La variante de Termamyl A52W + V54W fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5' a 3', de izquierda a derecha):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG (SEC ID NO: 10)

Cebador #6616 (escrito 5' a 3', de izquierda a derecha; P se refiere a un 5' fosfato):

P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C (SEC ID NO: 11) 50

[0120] La variante de Termamyl V54E fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG (SEC ID NO: 12)

[0121] La variante de Termamyl V54M fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG (SEC ID NO: 13)

[0122] La variante de Termamyl V54I fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de 60 izquierda a derecha):

PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG (SEC ID NO: 14)

[0123] Las variantes de Termamyl Y290E y Y290K fueron construidas usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): 65

PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C (SEC ID NO:15)

[0124] Y representa una mezcla igual de C y T. La presencia de un codón que codifica bien glutamato o lisina en la posición 290 fue verificada por la secuenciación del ADN.

[0125] La variante de Termamyl N190F fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de 5 izquierda a derecha):

PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C (SEC ID NO: 16)

[0126] La variante de Termamyl N188P+N190F fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): 10

PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC (SEC ID NO: 17)

[0127] La variante de Termamyl H140K+H142D fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG (SEC ID NO: 18) 15

[0128] La variante de Termamyl H156Y fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG (SEC ID NO: 19)

[0129] La variante de Termamyl A181T fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC (SEC ID NO: 20)

[0130] La variante de Termamyl A209V fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de 25 izquierda a derecha):

PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC (SEC ID NO: 21)

[0131] La variante de Termamyl Q264S fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): 30

PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC (SEC ID NO: 22)

[0132] La variante de Termamyl S187D fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC (SEC ID NO: 23) 35

[0133] La variante de Termamyl DELTA(K370-G371-D372) (es decir, delecionada de los residuos de aminoácidos nos. 370, 371 y 372) fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC (SEC ID NO: 24)

[0134] La variante de Termamyl DELTA(D372-S373-Q374) fue construida usando el siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):

PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C (SEC ID NO: 25)

[0135] Las variantes de Termamyl A181T y A209V fueron combinadas a A181T+A209V mediante la digestión del 45 plásmido tipo pDN1528 conteniendo A181T (es decir, pDN1528 conteniendo dentro de amyL la mutación dando como resultado la alteración de A181T) y el plásmido tipo pDN1528 conteniendo A209V (es decir, pDN1528 conteniendo dentro de amyL la mutación dando como resultado la alteración de A209V) con la enzima de restricción ClaI que corta los plásmidos tipo pDN1528 dos veces dando como resultado un fragmento de 1116 pares de bases y la parte del vector (es decir que contiene el origen de replicación del plásmido) de 3850 pares de bases. El fragmento que contiene 50 la mutación A209V y la parte del vector conteniendo la mutación de A181T fueron purificados por el kit de extracción en gel QIAquick (adquirido de Qiagen) después de la separación en un gel de agarosa. El fragmento y el vector fueron ligados y transformados en la cepa de Bacillus subtilis baja en proteasa y amilasa a la que se ha hecho referencia más arriba. El plásmido de amy+ (zonas de aclarado en placas de agar con contenido en almidón) y transformantes resistentes al cloranfenicol fueron analizados para la presencia de ambas mutaciones en el plásmido. 55

[0136] De forma similar según se ha descrito anteriormente, H156Y y A209V fueron combinados utilizando las endonucleasas de restricción Acc65I y EcoRI, dando H156Y+A209V.

[0137] H156Y +A209V y A181T+A209V fueron combinados en H156Y+ A181T+A209V usando las endonucleasas de 60 restricción Acc65I y HindIII.

[0138] Los 35 residuos N-terminales de la parte madura de la variante de Termamyl H156Y+ A181T+A209V fueron sustituidos por los 33 residuos N-terminales de alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens (SEC ID NO: 4) (que en este contexto se denomina BAN) por un enfoque de SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351) como 65 sigue:

Cebador 19364 (secuencia 3' 5': CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG (SEQ ID NO: 26)

Cebador 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG (SEC ID NO: 27)

Cebador 19363: CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC (SEC ID NO: 28)

Cebador 1C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC (SEC ID NO: 29)

[0139] Una PCR estándar, reacción en cadena de la polimerasa, se efectuó usando la polimerasa Pwo termoestable de Boehringer Mannheim según las instrucciones del fabricante y el ciclo de temperatura: 5 minutos a 94°C; 25 ciclos de (94°C durante 30 segundos; 50°C durante 45 segundos; 72°C durante 1 minuto ); 72°C durante 10 minutos.

[0140] Un fragmento de aproximadamente 130 bp fue amplificado en una primera PCR denominada PCR1 con los 10 cebadores 19364 y 19362 en un fragmento de ADN conteniendo el gen codificador de la alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens.

[0141] Un fragmento de aproximadamente 400 bp fue amplificado en otra PCR denominada PCR2 con los cebadores 19363 y 1C en el molde pDN1528. 15

[0142] PCR1 y PCR2 fueron purificadas a partir de un gel de agarosa y usadas como moldes en PCR3 con los cebadores 19364 y 1C, que dieron como resultado un fragmento de aproximadamente 520 bp. Este fragmento contiene así una parte del ADN que codifica el N-término de BAN fusionado a una parte del ADN que codifica el Termamyl a partir del 35º aminoácido. 20

[0143] El fragmento de 520 bp fue subclonado en un plásmido tipo pDN1528 (conteniendo la variante de Termamyl del gen que codifica H156Y+ A181T+A209V) mediante la digestión con las endonucleasas de restricción PstI y SacII, la ligadura y la transformación de la cepa de B. subtilis tal y como se ha descrito anteriormente. La secuencia de ADN entre los sitios de restricción PstI y SacII fue verificada por la secuenciación del ADN en los plásmidos extraídos de 25 amy+ y los transformantes resistentes al cloranfenicol.

[0144] El constructo final conteniendo el N-término correcto de BAN y H156Y+ A181T+A209V fue denominado BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V.

[0145] N190F fue combinado con BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V dando BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V realizando la mutagénesis según el modo descrito anteriormente a excepción de que la secuencia de amyL en pJeEN1 fue sustituida por la variante de Termamyl de la secuencia de ADN que codificaba BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V

[0146] Q264S fue combinado con BAN(1-35)+ H156y+ A181T+A209V dando BAN(1-35)+ H156y+ A181T+A209V+Q264S realizando la mutagénesis según el modo descrito anteriormente a excepción de que la secuencia de amyL en pJeEN fue sustituida por la variante de Termamyl de la secuencia de ADN que codificaba BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V

[0147] BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V+Q264S y BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V fueron combinados en BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V+Q264S utilizando las endonucleasas de restricción BsaHI (el sitio BsaHI fue introducido cerca de la mutación de A209V) y PstI.

[0148] I201F fue combinado con BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V+Q264S dando BAN(1-35)+ H156Y+ 45 A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEC ID NO: 2) realizando la mutagénesis según el modo descrito anteriormente. Se utilizó el cebador de la mutagénesis AM100, se introdujo la sustitución I201F y se eliminó simultáneamente un sitio de restricción ClaI, facilitando la identificación de los mutantes.

[0149] cebador AM100: 50

5'GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3' (SEC ID NO: 30

EJEMPLO 2 (ejemplo referencial)

Construcción de variantes de la alfa-amilasa tipo Termamyl con un modelo de seccionamiento alterado según la invención 55

[0150] La variante de la alfa-amilasa termoestable de B. licheniformis consistente comprendiendo los 445 residuos de los aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de los aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 6, y comprendiendo además las mutaciones siguientes: 60

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (la construcción de esta variante está descrita en el ejemplo 1, y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2)

tiene una capacidad reducida de seccionar un sustrato cerca del punto de ramificación.

[0151] En un intento de mejorar adicionalmente la capacidad reducida de seccionar un sustrato cerca del punto de ramificación de dicha variante de la alfa-amilasa, se efectuó una mutagénesis sitio dirigida usando el método Mega-primer como se describe por Sarkar y Sommer; 1990 (BioTechniques 8: 404-407).

Construcción de LE313: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S+V54N: 5

[0152] El cebador específico del gen 27274 y el cebador mutagénico AM115 se utilizan para amplificar por PCR un fragmento de ADN de aproximadamente 440 bp a partir de un plásmido tipo pDN1528 (albergando las mutaciones BAN(1-35) +H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S en el gen que codifica la amilasa de la SEC ID NO: 4).

[0153] El fragmento de 440 bp es purificado a partir de un gel de agarosa y se usa como Mega-primer junto con el cebador 113711 en una segunda PCR realizada en el mismo molde.

[0154] El fragmento resultante de aproximadamente 630 bp es digerido con las enzimas de restricción EcoR V y Acc65 I y el fragmento de ADN resultante de aproximadamente 370 bp es purificado y ligado con el plásmido tipo pDN1528 15 digerido con las mismas enzimas. Las células competentes SHA273 de Bacillus subtilis (bajas en amilasa y proteasa) son transformadas con la ligadura y los transformantes resistentes al cloranfenicol son controlados por la secuenciación del ADN para verificar la presencia de las mutaciones correctas en el plásmido.

Cebador 27274:

5' CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3' (SEC ID NO: 31) 20

Cebador 1B:

5' CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3' (SEC ID NO: 32)

Cebador AM115:

5' GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEC ID NO:33)

[0155] Construcción de LE314: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM116.

AM116:

5' GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3' (SEC ID NO: 34)

[0156] Construcción de LE315: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S+V54N se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM117.

AM117:

5' GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEC ID NO: 35)

[0157] Construcción de LE316: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + T49L se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM118.

A.M118:

5' GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3' (SEC ID NO: 36)

[0158] Construcción LE317: híbrido BAN/ Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + T49L+G107A se realiza en una vía similar, a excepción de que se usan el cebador mutagénico AM118 y el cebador mutagénico AN119 simultáneamente.

AM119:

5' CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3' (SEC ID NO: 37) 45

[0159] Construcción de LE318: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S+V54N+T49L+G107A se realiza en una vía similar, a excepción de que se usan el cebador mutagénico AM120 y el cebador mutagénico AM119 simultáneamente.

AM120: 50

5' GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEC ID NO: 38)

[0160] Construcción de LE319: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S+A52S+V54N+T49L se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM120.

[0161] Construcción de LE320: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + G107A se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM119.

[0162] Construcción de LE322: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S + Q51R+A52S se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM121. 60

AM121:

5' GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3' (SEC ID NO:39)

[0163] Construcción de LE323: híbrido BAN/Termamyl + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52N se realiza en una vía similar, a excepción de que se usa el cebador mutagénico AM122. 65

AM122:

5' GAACGAGCCAAAACGACGTGGGCTACGG 3' (SEC ID NO: 40)

EJEMPLO 3 (ejemplo referencial)

Testado de variantes LE429 (sacarificación)

[0164] Las condiciones de reacción estándares fueron: 5

Concentración del sustrato

30 % p/p

Temperatura

60°C

pH Inicial (a 60°C)

5.5

Dosificación enzimática

Glucoamilasa 0.18 AGU/g DS

Pululanasa 0.06 PUN/g DS

alfa-Amilasa 10 micro g enzima/g DS

DextrozymeTM E fue usada para obtener actividades glucoamilasa y pululanasa

[0165] Los sustratos para la sacarificación fueron preparados disolviendo almidón de maíz común en agua desionizada 10 y ajustando la sustancia seca a aproximadamente 30% p/p. El pH fue ajustado a 5.5 (medido a 60°C), y partes alícuotas de sustrato correspondientes a 10 g por peso en seco fueron transferidas a frascos de vidrio con tapón azul.

[0166] Los frascos fueron luego colocados al baño María con agitación equilibrado a 60°C, y las enzimas fueron añadidas. El pH se reajustó a 5.5 cuando fue necesario. Las muestras fueron tomadas después de 48 horas de 15 sacarificación; el pH fue ajustado a aproximadamente 3.0, y luego se calentaron al baño María con ebullición durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Tras el enfriamiento, las muestras fueron tratadas con aproximadamente 0.1 g de resina de intercambio iónico de lecho mezclado (BIO-RAD 501 X8 (D) durante 30 minutos en un mezclador giratorio para eliminar las sales y N soluble. Después de la filtración, la composición de carbohidratos fue determinada por HPLC. Se obtuvieron los siguientes resultados: 20

[0167] La alfa-amilasa progenitora para las variantes es LE429.

Variantes de alfa-amilasa añadidas

DP1 DP2 DP3 SPEC. ACT. (NU/mg)

V54N

96.1 1.75 1.18

A52S

95.9 1.80 1.11

A52S+V54N

96.3 1.84 1.08

T49L

96.3 1.77 1.11

T49L+G107A

96.4 1.87 0.72

A52S+V54N+T49L+G107A

80.5 2.55 0.43

A52S+V54N+T49L

95.8 1.76 0.84

G107A

94.4 1.89 1.04

Q51R+A52S

95.9 1.77 1.27

A52N

95.5 1.89 1.56

LE174 (CONTROL)

95.9/ 95.8 1.87/ 1.83 1.17/ 1.35

[0168] En comparación con el control, la presencia de una variante de alfa-amilasa activa de la invención durante la 25 licuefacción resulta en niveles de panosa disminuidos (DP3).

[0169] Especialmente la variante T49L+G107A de LE429 y la variante A52S+V54N+T49L de LE429, respectivamente, suponen un nivel de panosa drásticamente disminuido (DP3). Si estas variantes de la alfa-amilasa son usadas para la licuefacción del almidón, no será necesario inactivar la enzima antes del inicio de la sacarificación. 30

EJEMPLO 4

Licuefacción y sacarificación de las variantes de LE429

[0170] El experimento del ejemplo 3 fue repetido para otras variantes de LE429 bajo las mismas condiciones.

[0171] El resultado está mostrado a continuación:

Perfil variante/azúcar

DP1 DP2 DP3 DP4+

T49V+G107A

95.9% 1.72% 1.27% 1.11%

T49Y+G107A

95.3% 1.73% 1.29% 1.65%

T49N+G107A

95.7% 1.64% 1.51% 1.18%

T49L+A52S+G107A

95.7% 1.73% 0.95% 1.67%

T49L+A52T+G107A

95.8% 1.66% 1.03% 1.48%

T49L+A52F+G107A

95.7% 1.69% 1.16% 1.42%

T49L+A52L+G107A

95.5% 1.70% 1.40% 1.38%

T49L+A52I+G107A

95.9% 1.72% 1.31% 1.07%

T49L+A52V+G107A

94.7% 1.69% 1.16% 2.44%

T49L+A52V+G107A+A111V

94.5% 1.75% 0.72% 2.99%

LE429

94.9% 1.71% 1.85% 1.51%

Ejemplo 5

[0172] El experimento del ejemplo 3 fue repetido para varias variantes de LE429 con la excepción de que la licuefacción se efectuó a 95°C, pH 6.0 y la sacarificación a 60°C, pH 4.5, 40 ppm de CaCl2, seguido de la inactivación. La variante a 5 la que se hace referencia más abajo es la variante de LE429. Los resultados encontrados son los siguientes:

Perfil variante/azúcar

DP4+ DP3 DP2 DP1

T49F

1.15 0.92 1.83 96.12

T49D+G107A

0.84 1.03 1.82 96.3

T49I+G107A

0.97 0.64 1.84 96.55

T49L+G107A

0.96 0.81 1.82 96.42

T49L+A52S+G107A

1.37 0.75 1.88 96.01

T49L+A52T+G107A

0.87 0.81 1.8 96.52

T49L+A52F+G107A

0.98 0.83 1.87 96.31

T49V+G107A

0.65 0.8 2.13 96.43

T49Y+G107A

0.83 0.94 1.89 96.35

LE429

1.16 1.21 1.77 95.87

REFERENCIAS CITADAS 10

[0173]

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LISTADO DE SECUENCIAS

[0174]

<110> Novo Nordisk A/S 45

<120>

<130>

<160> 40

<170> Patent In Ver. 2.1

<210> 1

<211> 1443

<212> ADN 10

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1443) 15

<400> 1

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens 5

<400> 2

<210> 3

<211> 1920

<212> ADN

<213> Bacillus licheniformis 5

<220>

<221> CDS

<222> (421)..(1872)

<400> 3

<210> 4

<211> 483

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis 5

<400> 4

<210> 5

<211> 2604

<212> ADN

<213> Bacillus amyloliquefaciens 5

<220>

<221> -10 señal

<222> (707)..(712)

<220>

<221> -35 señal

<222> (729)..(734)

<220> 15

<221> RBS

<222> (759)..(762)

<220>

<221> sig_péptido 20

<222> (770)..(862)

<220>

<221> mat_péptido

<222> (863)..(2314) 25

<220>

<221> terminador

<222> (2321)..(2376)

<220>

<221> CDS

<222> (863)..(2314)

<400> 5 35

<210> 6

<211> 483

<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens 5

<400> 6

<210> 7

<211> 1548

<212> ADN

<213> Bacillus stearothermophilus 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1598)

<400> 7

<210> 8

<211> 515

<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus 5

<400> 8

<210> 9

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 9 10

ggtcgtaggc accgtagccc caatccgctt g 31

<210> 10

<211> 36

<212> ADN 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 10

ggtcgtaggc accgtagccc caatcccatt ggctcg 36

<210> 11

<211> 28 25

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 11

ctgtgactgg tgagtactca accaagtc 28 5

<210> 12

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 12 15

ggtcgtaggc accgtagccc tcatccgctt g 31

<210> 13

<211> 31

<212> ADN 20

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 13

ggtcgtaggc accgtagccc atatccgctt g 31

<210> 14

<211> 31 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 35

<400> 14

ggtcgtaggc accgtagcca atatccgctt g 31

<210> 15 40

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 15

gcagcatgga actgctiatg aagaggcacg tcaaac 36

<210> 16

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 16

catagttgcc gaattcattg gaaacttccc 30 60

<210> 17

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 65

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 17

catagttgcc gaattcaggg gaaacttccc aatc 34 5

<210> 18

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 18 15

ccgcgccccg ggaaatcaaa ttttgtccag gctttaatta g 41

<210> 19

<211> 32

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 19

caaaatggta ccaataccac ttaaaatcgc Tg 32

<210> 20

<211> 29 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 35

<400> 20

cttcccaatc ccaagtcttc ccttgaaac 29

<210> 21 40

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 21

cttaatttct gctacgacgt caggatggtc ataatc 36

<210> 22

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 22

cgcccaagtc attcgaccag tactcagcta ccgtaaac 38 60

<210> 23

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 65

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 23

gccgttttca ttgtcgactt cccaatccc 29 5

<210> 24

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 24 15

ggaatttcgc gctgactagt cccgtacata tcccc 35

<210> 25

<211> 36

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 25

ggcaggaatt tcgcgacctt tcgtcccgta catatc 36

<210> 26

<211> 36 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 35

<400> 26

cctcattctg cagcagcagc cgtaaatggc acgctg 36

<210> 27 40

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 27

tatccgataa de la gtaataccga de la ccagacggca atgttccg 38

<210> 28

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 28

cggatatcgg tattactgcc gtctggattc 30 60

<210> 29

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 65

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 29

ctcgtcccaa tcggttccgt c 21 5

<210> 30

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 30 15

gatgtatgcc gacttcgatt atgacc 26

<210> 31

<211> 30

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 31

catagttgcc gaattcattg gaaacttccc 30

<210> 32

<211> 24

<212> ADN 30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 32

ccgattgctg acgctgttat ttgc 24

<210> 33

<211> 25

<212> ADN 40

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 33

gccaagcgga taacggctac ggtgc 25

<210> 34

<211> 28 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 55

<400> 34

gaacgagcca atcggacgtg ggctacgg 28

<210> 35

<211> 32 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 65

<400> 35

ggaacgagcc aatcggataa cggctacggt gc 32

<210> 36

<211> 25 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 10

<400> 36

gcatataagg gactgagcca agcgg 25

<210> 37

<211> 25 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 20

<400> 37

caaccacaaa gccggcgctg atgcg 25

<210> 38

<211> 41 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 30

<400> 38

gcatataagg gactgagcca atcggataac ggctacggtg c 41

<210> 39 35

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 40

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 39

gaacgagccg atcggacgtg ggctacgg 28

<210> 40

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 40

gaacgagcca aaacgacgtg ggctacgg 28 55

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Alfa-amilasa

   i) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 o 8 en la presente, o

   ii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 o figura 2, o 5

   iii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3, o

   iv) alfa-amilasa que muestra al menos el 90% de homología con las alfa-amilasas de i), ii) o iii),

   donde la alfa-amilasa comprende una de las siguientes alteraciones: T49L, F, V, Y o I y donde la posición 49 corresponde a la posición 49 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 4.
2. 2. Alfa-amilasa según la reivindicación 1, que comprende una mutación en una posición correspondiente a una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4:

   A52S+V54N+T49L , y T49L+A52V+G107A+A111V.
3. 3. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa según la 15 reivindicación 1 o 2.
4. 4. Vector de expresión recombinante que transporta un constructo de ADN según la reivindicación 3.
5. 5. Célula transformada con un constructo de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4. 20
6. 6. Célula según la reivindicación 5, que es un microorganismo, en particular una bacteria o un hongo, tal como una bacteria Gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis. 25
7. 7. Composición que comprende:

   (i) una mezcla de la alfa-amilasa de B. licheniformis teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 con una o más alfa-amilasas según la reivindicación 1 o 2 derivada de la alfa-amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8; o 30

   (ii) una mezcla de la alfa-amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 con una o más alfa-amilasas según la reivindicación 1 o reivindicación 2 derivada de una o más otras alfa-amilasas; o

   (iii) una mezcla de una o más alfa-amilasas según la reivindicación 1 o 2 derivada de la alfa amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 con una o más alfa-amilasas según la 35 reivindicación 1 o 2 derivada de una o más otras alfa-amilasas progenitoras.
8. 8. Composición según la reivindicación 7 que comprende:

   una mezcla de una o más alfa-amilasas de la reivindicación 1 o 2 derivada de la alfa amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y alfa-amilasa derivada de la alfa-40 amilasa de B. licheniformis teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4.
9. 9. Uso de una alfa-amilasa según la reivindicación 1 o 2 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 o 8 para la licuefacción del almidón; en una composición de detergente, tal como composiciones para el lavado de la ropa, para lavavajillas y para la limpieza de superficies duras; para la 45 producción de etanol, como la producción de etanol para combustible, para bebidas e industrial; para el desencolado de telas, tejidos o prendas.