ES2322825T3 - Mutantes de alfa-amilasa. - Google Patents

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ES2322825T3 ES98947417T ES98947417T ES2322825T3 ES 2322825 T3 ES2322825 T3 ES 2322825T3 ES 98947417 T ES98947417 T ES 98947417T ES 98947417 T ES98947417 T ES 98947417T ES 2322825 T3 ES2322825 T3 ES 2322825T3
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Torben Vedel Borchert
Henrik Bisgard-Frantzen
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Abstract

Una variante de una {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl, donde la {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl es seleccionada entre: (i) SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8; (ii) una {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl que tiene al menos el 80% de homología para una de las secuencias en (i); y donde la variante tiene actividad {alpha}-amilasa y comprende las mutaciones siguientes 1181* y G182* y N193F en SEC ID NO: 3 o en posiciones correspondientes en otra {alpha}-amilasa parental tipo Termamyl.

Description

Mutantes de \alpha-amilasa.
Campo de la invención
La presente invención está relacionada, entre otras cosas, con las variantes nuevas (mutantes) de \alpha-amilasas parentales tipo Termamyl, sobre todo variantes que presentan termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca^{2+} (con respecto a la parental) que es ventajoso con respecto a las aplicaciones de las variantes en el tratamiento industrial del almidón particularmente (p. ej. licuefacción o sacarificación del almidón).
Antecedentes de la invención
Las \alpha-amilasas (\alpha-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3,2,1,1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.
Hay un cuerpo muy extenso de patentes y de bibliografía científica acerca de esta clase de enzimas muy importante industrialmente. Varias \alpha-amilasas tales como variantes de \alpha-amilasas tipo Termamyl son conocidas a partir de p. ej. WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.
Entre las descripciones más recientes referentes a las \alpha-amilasas, WO 96/23874 proporciona datos estructurales tridimensionales en cristales de rayos X para una \alpha-amilasa tipo Termamyl que consiste en 300 residuos de aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la \alpha-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos (estando disponible comercialmente bajo el nombre comercial Termamyl^{TM}), y que está así cercanamente relacionada con las \alpha-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en el contexto presente están incluidas dentro del significado del término "\alpha-amilasas tipo Termamyl", y que incluyen, entre otras cosas, las \alpha-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus). WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, basándose en un análisis de la estructura de una \alpha-amilasa parental tipo Termamyl, variantes de la \alpha-amilasa parental tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas con respecto a la parental.
WO 95/35382 (Gist Brocades B.V.) se refiere a enzimas amilolíticas derivadas de B. licheniformis con propiedades mejoradas que permiten la reducción de la concentración de Ca^{2+} bajo la aplicación sin una pérdida de rendimiento de la enzima. La enzima amilolítica comprende uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones seleccionadas del grupo de 104, 128, 187, 188 de la secuencia de \alpha-amilasa de B. licheniformis.
WO 96/23873 (Novo Nordisk) expone variantes de \alpha-amilasa tipo Termamyl que tienen termoestabilidad aumentada obtenida por la deleción de pares en la región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC ID NO: 1 de la misma.
Descripción breve de la invención
La presente invención se refiere a nuevas variantes (mutantes) \alpha-amilolíticas de una \alpha-amilasa tipo Termamyl, en particular variantes que presentan termoestabilidad aumentada (con respecto a la parental) que es ventajosa en relación con el tratamiento industrial del almidón (licuefacción, sacarificación del almidón y similares).
Los inventores han descubierto sorprendentemente que en el caso de combinar dos o tres mutaciones (se describirá más abajo), la termoestabilidad de las \alpha-amilasas tipo Termamyl es aumentada a pH ácido y/o a baja concentración de Ca^{2+} en comparación con mutaciones únicas, tal como la mutación descrita en WO 96/23873 (Novo Nordisk), es decir, eliminación de pares en la región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1 de la presente.
La invención se refiere adicionalmente a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a la composición que comprende variantes de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de las variantes y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas \alpha-amilolíticas, en varios procesos industriales, p. ej., licuefacción de almidón.
Breve descripción del dibujo
Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de seis \alpha-amilasas parentales tipo Termamyl en el contexto de la invención. Los números en el extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas como sigue:
1: SEC ID NO: 2,
2: Kaoamyl,
3: SEC ID NO: 1,
4: SEC ID NO: 5,
5: SEC ID NO: 4,
6: SEC ID NO: 3.
Descripción detallada de la invención La \alpha-amilasa tipo Termamyl
Es bien sabido que varias \alpha-amilasas producidas por Bacillus spp. son altamente homólogas a nivel aminoácido. Por ejemplo, la \alpha-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 (comercialmente disponible como Termamyl^{TM}) se ha descubierto que es aproximadamente un 89% homóloga a la \alpha-amilasa de B. amiloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 5 y aproximadamente un 79% homóloga a la \alpha-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 3. \alpha-amilasas homólogas adicionales incluyen una \alpha-amilasa derivada de una cepa NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375 de Bacillus sp., todas las cuales están descritas con detalle en WO 95/26397, y la \alpha-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31.
Otras \alpha-amilasas homólogas adicionales incluyen la \alpha-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en EP 0252666 (ATCC 27811), y las \alpha-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras \alpha-amilasas de B. licheniformis comerciales tipo Termamyl son Optitherm^{TM} y Takatherm^{TM} (disponible de Solvay), Maxamyl^{TM} (disponible de Gist-Brocades/Genencor), Spezym AA^{TM} y Spezyme Delta AA^{TM} (disponible de Genencor), y Keistase^{TM} (disponible de Daiwa).
Por la homología sustancial descubierta entre estas \alpha-amilasas, éstas se consideran que pertenecen a la misma clase de \alpha-amilasas, es decir la clase de "\alpha-amilasas tipo Termamyl".
Por consiguiente, en el contexto presente, el término "\alpha-amilasa tipo Termamyl" se destina a indicar una \alpha-amilasa que, a nivel aminoácido, muestra una homología sustancial a Termamyl^{TM}, es decir, la \alpha-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 de la presente. En otras palabras, una \alpha-amilasa tipo termamyl es una \alpha-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 en la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1 de WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 7 aquí) o en la SEC ID NO: 2 de WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 8 aquí) o en Tsukamoto et al., 1988, (que la secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID NO: 6 aquí) o i) que muestra al menos un 80%, especialmente al menos un 85%, especialmente preferido al menos un 90%, incluso especialmente más preferido al menos un 95% de homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nos 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 o 8.
En relación con la propiedad i), la "homología" puede ser determinada usando cualquier algoritmo convencional, preferiblemente usando el programa GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para penalizaciones de espacio, que es una penalización por creación de espacio de 3.0 y penalización por extensión de espacio de 0.1, (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).
Un alineamiento estructural entre Termamyl y una \alpha-amilasa tipo Termamyl puede ser usado para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras \alpha-amilasas tipo Termamyl. Un método de obtención de dicho alineamiento estructural es mediante el uso del programa Pile Up del paquete GCG usando valores por defecto de penalizaciones de espacio, es decir, una penalización por creación de espacio de 3.0 y penalización por extensión de espacio de 0.1. otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis de agregados hidrofóbicos (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) y enroscado inverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998).
En el contexto presente, "derivado de" está destinado no sólo a indicar una \alpha-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una \alpha-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de esta cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término se destina a indicar una \alpha-amilasa que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tiene las características de identificación de la \alpha-amilasa en cuestión. El término está también destinado a indicar que la \alpha-amilasa parental puede ser una variante de \alpha-amilasa de origen natural, es decir, una variante que es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, deleción) de uno o más residuos aminoácidos de la \alpha-amilasa de origen natural.
\alpha-amilasas híbridas parentales
La \alpha-amilasa parental puede ser una \alpha-amilasa híbrida, es decir una \alpha-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivada de al menos dos \alpha-amilasas.
La \alpha-amilasa parental híbrida puede ser una que basándose en la homología de aminoácidos y/o reactividad cruzada y/o hibridación del ADN (como se ha definido arriba) puede ser determinada para pertenecer a la familia de \alpha-amilasas tipo Termamyl. En este caso, la \alpha-amilasa híbrida está normalmente compuesta de al menos una parte de una \alpha-amilasa tipo Termamyl y parte(s) de una o varias otras \alpha-amilasas seleccionadas de las \alpha-amilasas tipo Termamyl o \alpha-amilasas no de tipo Termamyl de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero.
Así, la \alpha-amilasa híbrida parental puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos parciales que derivan de al menos dos \alpha-amilasas tipo Termamyl, o de al menos una \alpha-amilasa tipo Termamyl y al menos una \alpha-amilasa bacteriana no de tipo Termamyl, o de al menos una \alpha-amilasa tipo Termamyl y al menos una fúngica. La \alpha-amilasa tipo Termamyl de la cual deriva una secuencia de aminoácidos parcial puede, p. ej., ser cualquiera de estas \alpha-amilasas tipo Termamyl específicas a las que se hace referencia en este caso.
Por ejemplo, la \alpha-amilasa parental puede comprender una parte C-terminal de una \alpha-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformilicheniformis y una parte N-terminal de una \alpha-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B. stearothermophilus. Por ejemplo, la \alpha-amilasa parental puede comprender al menos 430 residuos de aminoácidos de la parte C-terminal de la \alpha-amilasa de B. licheniformis, y puede, p. ej. comprender a) un segmento de aminoácido correspondiente a los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 5 y un segmento de aminoácido correspondiente a 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la \alpha-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº. 4, o b) un segmento de aminoácido correspondiente a los 68 residuos de aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 3 y un segmento de aminoácido correspondiente a los 415 residuos de aminoácidos C-terminales de la \alpha-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4.
La \alpha-amilasa no de tipo Termamyl puede, p. ej., ser una \alpha-amilasa fúngica, una \alpha-amilasa mamífera o vegetal o una \alpha-amilasa bacteriana (diferente de una \alpha-amilasa tipo Termamyl). Ejemplos específicos de tales \alpha-amilasas incluyen la TAKA \alpha-amilasa de Aspergillus oryzae, la \alpha-amilasa ácida de A. niger, la \alpha-amilasa de Bacillus subtilis, la \alpha-amilasa pancreática porcina y una \alpha-amilasa de cebada. Todas estas \alpha-amilasas han dilucidado estructuras que son marcadamente diferentes de la estructura de una \alpha-amilasa típica tipo Termamyl como se ha hecho referencia en este caso.
Las \alpha-amilasas fúngicas mencionadas arriba, es decir, derivadas de A. niger y A. oryzae, son altamente homólogas a nivel aminoácido y se considera generalmente que pertenecen a la misma familia de \alpha-amilasas. La \alpha-amilasa fúngica derivada de Aspergillus oryzae está comercialmente disponible bajo el nombre comercial Fungamyl^{TM}.
Además, cuando se hace referencia a una variante particular de una \alpha-amilasa (variante de la invención) tipo Termamyl - en una manera convencional - por referencia a la modificación (p. ej. deleción o sustitución) de residuos de aminoácidos específicos en la secuencia de aminoácidos de una \alpha-amilasa específica tipo Termamyl, debe entenderse que otras variantes de \alpha-amilasa tipo Termamyl modificadas en la(s) posición(es) equivalente(s) (según está determinado a partir de la secuencia de aminoácidos el mejor alineamiento posible entre las secuencias de aminoácidos respectivas) están incluidas de ese modo.
Una forma de realización preferida de una variante de la invención es una derivada de una \alpha-amilasa de B. licheniformis (como la \alpha-amilasa parental tipo Termamyl), p. ej. una de aquellas a las que se hace referencia arriba, tal como la \alpha-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4.
Construcción de variantes de la invención
La construcción de la variante de interés puede ser realizada para cultivar un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son propicias para producir la variante. La variante puede luego ser recuperada posteriormente del caldo de cultivo resultante. Esto se describe con más detalle abajo.
Propiedades alteradas de variantes de la invención
A continuación se discute la relación entre mutaciones que pueden estar presentes en variantes de la invención, y alteraciones deseables en propiedades (relativas a las de la \alpha-amilasa parental tipo Termamyl) que pueden resultar de las mismas.
Termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a baja concentración de Ca^{2+}
Mutaciones de relevancia particular en relación con la obtención de variantes según la invención con termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a baja concentración de Ca^{2+} incluyen mutaciones en las posiciones siguientes (relativas a \alpha-amilasa de B. licheniformis, SEC ID NO: 4): N190, E211.
En el contexto de la invención el término "pH ácido" significa un pH debajo de 7.0, especialmente debajo del margen de pH, donde se realizan normalmente los procesos industriales de licuefacción del almidón, que está entre pH 5.5 y 6.2.
En el contexto de la presente invención el término "baja concentración de calcio" significa concentraciones por debajo del nivel normal usado en la licuefacción del almidón industrial. Las concentraciones normales varían dependiendo de la concentración de Ca^{2+} libre en el maíz. Normalmente se añade una dosificación correspondiente a 1 mM (40 ppm) que con el nivel en el maíz da entre 40 y 60 ppm de Ca^{2+} libre.
En el contexto de la invención el término "temperaturas elevadas" significa temperaturas entre 95ºC y 160ºC, especialmente el rango de temperatura donde se realizan normalmente los procesos industriales de licuefacción del almidón que está entre 95ºC y 105ºC.
Los inventores han descubierto ahora que la termoestabilidad a pH ácido y/o a baja concentración de Ca^{2+} puede ser aumentada incluso más combinando ciertas mutaciones que incluyen las mutaciones anteriormente mencionadas y/o I201 entre sí.
Dichas "ciertas" mutaciones son las siguientes (relativas a la \alpha-amilasa de B. licheniformis, SEC ID NO: 4): N190 y E211.
Dicha mutación puede además ser combinada con deleciones en dos posiciones como se describe en WO 96/23873 (es decir, en las posiciones R181, G182, T183, G184 en SEC ID NO: 1 de la presente). Según la invención las variantes de una \alpha-amilasa parental tipo Termamyl con actividad \alpha-amilasa comprendiendo mutaciones en dos o tres de las posiciones anteriores están contempladas.
Debe ser enfatizado que no sólo las \alpha-amilasas tipo Termamyl mencionadas específicamente abajo están contempladas. También otras \alpha-amilasas comerciales tipo Termamyl están contempladas. Una lista no exhaustiva de estas \alpha-amilasas es la siguiente:
\alpha-amilasas producidas por la cepa de B. licheniformis descrita en EP 0252666 (ATCC 27811), y las \alpha-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras \alpha-amilasas comerciales tipo Termamyl de B. licheniformis son Optitherm^{TM} y Takatherm^{TM} (disponibles de Solvay), Maxamyl^{TM} (disponible de Gist-Brocades/Genencor), Spezym AA^{TM} Spezyme Delta AA^{TM} (disponible de Genencor), y Keistase^{TM} (disponible de Daiwa).
Se puede mencionar aquí que los residuos de aminoácidos, respectivamente, en posiciones correspondientes a N190, I201, D207 y E211, respectivamente, en la SEC ID NO: 4 constituyen residuos de aminoácidos que son conservadas en numerosas \alpha-amilasas tipo Termamyl. Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de estos residuos en las secuencias de aminoácidos de varias \alpha-amilasas tipo Termamyl que han sido ya mencionadas (véase supra) son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
1
Mutaciones de estos residuos de aminoácidos conservados son muy importantes en relación con la mejora de la termoestabilidad a pH ácido y/o a baja concentración de calcio, y las mutaciones siguientes son de interés particular a este respecto (con referencia a la numeración de la secuencia de aminoácidos de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4).
Deleciones de aminoácidos emparejados en posiciones correspondientes a R179-G182 en la SEC ID NO: 3 correspondientes a un espacio en la SEC ID NO: 4. cuando se alinea con numerosas \alpha-amilasas tipo Termamyl. Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de estos residuos en las secuencias de aminoácidos de varias \alpha-amilasas tipo Termamyl que ya han sido mencionadas (véase supra) son las siguientes:
TABLA 2
3
Cuando se usa la SEC ID NO: 1 a la SEC ID NO: 6 como el esqueleto (es decir, como la \alpha-amilasa parental tipo Termamyl) dos o tres mutaciones pueden según la invención ser hechas en las siguientes regiones/posiciones para aumentar la termoestabilidad a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca^{2+} (relativas a la parental):
(relativas a SEC ID NO: 1 aquí):
1: T183*, G184*
2: N195F,
3: E216Q;
\vskip1.000000\baselineskip
(relativo a la SEC ID NO: 2 aquí):
1: D183*, G184*
2: N195F;
3: E216, Q,
\vskip1.000000\baselineskip
(relativo a SEC ID NO: 3 aquí):
1: 1181 *, G 182*
2: N193, F,;
3: E214Q;
\vskip1.000000\baselineskip
Relativo a SEC ID NO: 4 aquí):
1: Q178*, G179*
2: N190F;
3: E211 Q,;
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(relativo a SEC ID NO: 5 aquí):
1: E178, G179*
2: N 190, F,;
3: E211, Q,
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(relativo a SEC ID NO: 6 aquí):
1: H183*, G184*
2: N195F;
3: E216Q;
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Está contemplada según la presente invención la combinación de tres o cuatro mutaciones.
Mutaciones específicas dobles para el esqueleto SEC ID N: 1 a SEC ID NO: 6 están catalogadas a continuación.
Usando la SEC ID NO: 1 como el esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- T183*/G184*/N195F,
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID NO: 2 como el esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- D 183*/G 184*/N 195 F,
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID nº. 3 como el esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- 1181 */G 182*/N 193 F,
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la SEC ID nº. 4 como el esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
N190F/E211 Q;
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Usando la SEC ID NO: 5 como el esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- E 178*/G 179*/N 190 F;
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Usando la SEC ID NO: 6 como el esqueleto, las mutaciones siguientes dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- H 183*/G 184*/N 195F;
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Todas las \alpha-amilasas tipo Termamyl definidas arriba pueden ser usadas de manera adecuada como el esqueleto para preparar variantes de la invención.
La variante de la invención comprende las mutaciones siguientes: 1181*/G182*/N193F en SEC ID NO: 3
(TVB146) o en posiciones correspondientes en otras \alpha-amilasas parentales tipo Termamyl. Dicha variante puede además comprender una sustitución en la posición E214Q.
En una forma de realización preferida de la invención, la \alpha-amilasa parental tipo termamyl es una \alpha-amilasa híbrida de la SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 5. Específicamente, la \alpha-amilasa parental híbrida tipo Termamyl puede ser una alfa-amilasa híbrida que comprende los 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la \alpha-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, que puede de manera adecuada tener adicionalmente las mutaciones siguientes: H 156Y+A181 T+N 190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4). Éste híbrido mencionado se usa en los ejemplos abajo y se le hace referencia como LE174.
Mutaciones generales en variantes de la invención
Puede ser preferido que una variante de la invención comprenda una o más modificaciones además de estas perfiladas arriba. Así, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina presentes en la parte de la variante de \alpha-amilasa que está modificada sea/n sustituido(s) con un residuo sin prolina que puede ser cualquiera de los residuos sin prolina posibles de origen natural, y que preferiblemente es una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina.
De forma análoga, puede ser preferido que uno o más residuos de cisteína presentes entre los residuos de aminoácidos con el cual la \alpha-amilasa parental es modificada sea/n sustituidos por un residuo sin cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina.
Además, una variante de la invención puede -bien como la única modificación o en combinación con cualquiera de las modificaciones perfiladas anteriores- ser modificada de modo que uno o más Asp y/o Glu presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209 de la SEC ID NO: 4 sea sustituido por un Asn y/o Gln, respectivamente. También de interés es la sustitución, en la \alpha-amilasa tipo Termamyl, de uno o más de los residuos de Lys presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209 de la SEC ID NO: 4 por un Arg.
Será entendido que la presente invención comprende variantes que incorporan dos o más de las modificaciones perfiladas arriba.
Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas aquí.
Métodos para preparar variantes de \alpha-amilasa
Diferentes métodos para introducir mutaciones en genes son conocidos en la técnica. Después de una discusión breve de la clonación de las secuencias de ADN que codifican la \alpha-amilasa, métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica la \alpha-amilasa serán discutidos.
Clonación de una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa
La secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa parental puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produce la \alpha-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o biblioteca de ADNc debería ser construido usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la \alpha-amilasa que debe ser estudiada. Luego, si la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa es conocida, homólogos, sondas de oligonucleótidos marcadas pueden ser sintetizadas y usadas para identificar clones de codificación de \alpha-amilasa de una genoteca obtenida a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a un gen de \alpha-amilasa conocido podría ser usada como una sonda para identificar clones de codificación de \alpha-amilasa, usando condiciones de hibridación y de lavado de menor astringencia.
Otro método adicional para identificar clones de codificación de \alpha-amilasa implica insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar las bacterias \alpha-amilasa-negativas con la biblioteca resultante de ADN genómico, y luego disponer en placas las bacterias transformadas sobre agar con un sustrato para \alpha-amilasa, de ese modo permitiendo que los clones que expresan la \alpha-amilasa sean identificados.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, purificados, anillados, ligados y clonados en vectores apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, de origen mezclado sintético y de ADNc o de origen mezclado genómico y de ADNc, preparada para ligar fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN entera), conforme a las técnicas estándares. La secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988).
Mutagénesis dirigida
Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN de codificación de \alpha-amilasa, y se han identificado los sitios deseables para la mutación, las mutaciones pueden ser introducidas usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son insertados durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, un espacio monocatenario de ADN, que enlaza la secuencia de codificación de \alpha-amilasa, está creado en un soporte de vector del gen de \alpha-amilasa. Luego el nucleótido sintético, que soporta la mutación deseada, es anillado a una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante es luego rellenado con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo es ligado usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). US 4,760,025 expone la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del casete. No obstante, una variedad incluso superior de mutaciones puede ser introducida en cualquier momento por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, pueden ser introducidas.
Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN de codificación de \alpha-amilasa está descrita en Nelson y Long (1989). Esto implica la generación en 3 fases de un fragmento de la PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR. Del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN portador de la mutación puede ser aislado por seccionamiento con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.
Mutagénesis aleatoria
Mutagénesis aleatoria es realizada de manera adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica en al menos tres partes del gen que traduce para la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.
La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa parental puede ser convenientemente realizada usando cualquier método conocido en la técnica.
En relación con lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una \alpha-amilasa parental, p. ej. donde la variante muestra termoestabilidad alterada o aumentada con respecto a la parental, el método comprendiendo:
(a) someter una secuencia de ADN que codifica la \alpha-amilasa parental a mutagénesis aleatoria,
(b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la fase (a) en una célula huésped, y
(c) seleccionar las células huéspedes que expresan una variante de \alpha-amilasa que tiene una propiedad alterada (es decir, termoestabilidad) con respecto a la \alpha-amilasa parental
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Fase (a) del método anterior de la invención es preferiblemente realizado usando cebadores dopados.
Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno que induce transiciones, transversiones, inversiones, aleatorización, deleciones, y/o inserciones.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano de sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando tales agentes son usados, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima madre para ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para que la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando el ADN mutado con las propiedades deseadas.
Cuando la mutagénesis es realizada por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje o adicionado puede ser hecho de modo que los codones para los aminoácidos indeseados sean evitados. Los oligonucleótidos dopados o adicionados pueden ser incorporados en el ADN que codifica la enzima \alpha-amilasa por cualquier técnica publicada, usando p. ej. PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa según se estime apropiado.
Preferiblemente, el dopaje se realiza usando el "dopaje aleatorio constante", donde el porcentaje de tipo salvaje y la mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la introducción de nucleótidos determinados, y de ese modo una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje puede ser hecho, p. ej., para permitir la introducción del 90% de tipo salvaje y del 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se basa en limitaciones genéticas así como en estructurales de las proteínas. El esquema de dopaje puede ser hecho usando el programa DOPE que, entre otras cosas, asegura que se evita la introducción de codones de parada.
Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR, bien un gen tratado químicamente o que codifica una \alpha-amilasa parental no tratada es sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler 1992. Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, págs. 11-15).
Una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano puede ser usada para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la \alpha-amilasa por, p. ej., transformación de un plásmido conteniendo la glicosilasa parental en la cepa mutágena, crecimiento de la cepa mutágena con el plásmido y aislamiento del plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el organismo de expresión.
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La secuencia de ADN para ser mutagenizada puede estar convenientemente presente en una biblioteca genómica o de ADNc obtenida a partir de un organismo que expresa la \alpha-amilasa parental. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o expuesto de otra manera al agente mutagenizante. El ADN para ser mutagenizado puede también estar presente en una célula huésped bien siendo integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN para ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN para ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.
En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de expresión b) o la fase de selección c). Tal amplificación puede ser realizada conforme a métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido siendo la amplificación generada por PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados basándose en la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima madre.
Después de la incubación con o exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado mediante cultivo de una célula huésped adecuada llevando la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que lleve la secuencia de ADN que codifica la enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas son los siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas tales como E. coli.
La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.
Mutagénesis localizada aleatoria
La mutagénesis aleatoria puede estar ventajosamente localizada en una parte de la \alpha-amilasa parental en cuestión. Esto puede, p. ej., ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas para ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se modifican se prevé que resultarán en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima madre ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.
La mutagénesis aleatoria localizada, o específica es convenientemente realizada usando técnicas de mutagénesis generada por PCR como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN para ser modificada puede ser aislada, p. ej., por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.
Métodos alternativos de suministro de variantes de \alpha-amilasa
Métodos alternativos para suministrar variantes de la invención incluyen el método de transposición de genes conocido en la técnica incluyendo los métodos p. ej. descritos en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S).
Expresión de variantes de \alpha-amilasa
Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por métodos anteriormente descritos, o por cualesquiera métodos alternativos conocidos en la técnica, pueden ser expresados, en forma enzimática, usando un vector de expresión que normalmente incluye las secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe ser introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.
En el vector, la secuencia de ADN debería ser operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser derivada de genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores del gen dagA de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de \alpha-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la \alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son estos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la \alpha-amilasa neutra de A. niger, la \alpha-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans.
El vector de expresión de la invención puede también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en eucariotas, las secuencias de poliadenilación conectadas operativamente a la secuencia de ADN que codifica la variante de \alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden derivar de manera adecuada de las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede además comprender una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
El vector puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto implementa una falta en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, la canamicina, el cloranfenicol o la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que da lugar a la resistencia a la higromicina, o la selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91/17243.
Mientras que la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej. cuando se usan bacterias determinadas como las células huéspedes, es generalmente preferido que la expresión sea extracelular. En general, las \alpha-amilasas de Bacillus mencionadas aquí comprenden una prerregión que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta prerregión puede ser sustituida por una prerregión diferente o secuencia señal, convenientemente realizada por sustitución de las secuencias de ADN que codifican las prerregiones respectivas.
Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de \alpha-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación, son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
La célula de la invención, bien comprendiendo un constructo de ADN o un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, es usado ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante de una variante de \alpha-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración está generalmente considerada como una ventaja puesto que la secuencia de ADN es más propensa a ser mantenida de forma estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula de un organismo mayor tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, p. ej. una célula bacteriana o una fúngica (incluyendo la levadura).
Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram-negativas tales como E. coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplastos o usando células competentes de una manera conocida per se.
El organismo de levadura puede ser seleccionado favorablemente de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede ventajosamente pertenecer a una especie de Aspergillus, p. ej. Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huéspedes de Aspergillus está descrito en EP 238 023.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de \alpha-amilasa de la invención, dicho método comprende el cultivo de una célula huésped como se ha descrito anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la variante y la recuperación de la variante de las células y/o del medio de cultivo.
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El medio usado para cultivar las células pueden ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de la célula huésped en cuestión y la obtención de la expresión de la variante de \alpha-amilasa de la invención. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas publicadas (p. ej. como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).
La variante de \alpha-amilasa segregada de las células huéspedes pueden ser recuperadas convenientemente del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado o por filtración, y la precipitación de los componentes proteináceos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
Aplicaciones industriales
Las variantes de \alpha-amilasa de esta invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las variantes de la enzima de la invención son aplicables como un componente en composiciones de detergentes para lavar la ropa, la vajilla y de limpieza de superficies duras. Numerosas variantes son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol del almidón, y/o para el desencolado textil. Condiciones para procesos de conversión del almidón convencionales, incluyendo procesos de licuefacción y/o de sacarificación del almidón, están descritos en, p. ej., US 3,912,590 y en las publicaciones de patentes EP Nos. 252 730 y 63 909.
Producción de edulcorantes a partir del almidón
Un proceso "tradicional" para la conversión del almidón en jarabes de fructosa normalmente consiste en tres procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón es degradado por dextrinas por una \alpha-amilasa (p. ej. Termamyl^{TM}) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a temperaturas de 95-160ºC para un periodo de aprox. 2 horas. Para asegurar una estabilidad enzimática óptima bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones de calcio libre).
Después del proceso de licuefacción las dextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una glucoamilasa (p. ej. AMG^{TM}) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej. Promozyme^{TM}). Antes de esta fase el pH es reducido a un valor debajo de 4.5, manteniendo la temperatura elevada (por encima de 95ºC), y la actividad licuefactora de la \alpha-amilasa es desnaturalizada. La temperatura es bajada a 60ºC, y la glucoamilasa y la enzima desramificante son agregadas. El proceso de sacarificación procede durante 24-72 horas.
Después del proceso de sacarificación el pH es aumentado a un valor en la gama de 6-8, preferiblemente pH 7.5, y el calcio es eliminado por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en jarabe rico en fructosa usando, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme^{TM}).
Al menos 1 mejora enzimática de este proceso podría ser prevista. La reducción de la dependencia de calcio de la \alpha-amilasa licuefactora. La adición de calcio libre es requerida para asegurar una estabilidad adecuadamente alta de la \alpha-amilasa, pero el calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa y necesita ser eliminada, mediante una operación de unidad costosa, hasta una extensión que reduce el nivel de calcio libre por debajo de 3-5 ppm. Se podrían obtener ahorros en el coste si tal operación pudiera ser evitada y el proceso de licuefacción pudiera ser realizado sin adición de iones de calcio libre.
Para conseguir esto, una \alpha-amilasa tipo Termamyl menos dependiente de calcio que es estable y altamente activa a concentraciones bajas de calcio libre (< 40 ppm) es requerida. Tal \alpha-amilasa tipo Termamyl debería tener un pH óptimo a un pH en la gama de 4.5-6.5, preferiblemente en la gama de 4.5-5.5.
Composiciones de detergentes
Como se ha mencionado anteriormente, variantes de la invención pueden de manera adecuada ser incorporadas en composiciones de detergentes. Una termoestabilidad aumentada a concentraciones de calcio bajas serían muy provechosas para el rendimiento de la amilasa en detergentes, es decir, la región alcalina. Se hace referencia, por ejemplo, a WO 96/23874 y WO 97/07202 para detalles adicionales en lo que se refiere a ingredientes pertinentes de composiciones de detergentes (tales como detergentes para lavar la ropa o la vajilla), métodos apropiados de formulación de las variantes en tales composiciones de detergentes, y a ejemplos de tipos pertinentes de composiciones de detergentes.
Composiciones de detergentes que comprenden una variante de la invención pueden adicionalmente comprender una o más enzimas adicionales, tales como una lipasa, cutinasa, proteasa, celulasa, peroxidasa o lacasa, y/u otra \alpha-amilasa.
Las variantes de \alpha-amilasa de la invención pueden ser incorporadas en detergentes a concentraciones empleadas de forma convencional. Está actualmente contemplado que una variante de la invención puede ser incorporada en una cantidad correspondiente a 0,00001-1 mg (calculada como proteína enzimática pura activa) de \alpha-amilasa por litro de solución de detergente para lavar la ropa/la vajilla usando niveles de dosificación convencionales de detergente.
La invención también se refiere a una composición comprendiendo una mezcla de una o más variantes de la invención derivadas de (como la \alpha-amilasa parental tipo Termamyl) la \alpha-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en SEC ID NO: 3 y una alfa-amilasa tipo Termamyl derivada de la \alpha-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en SEC ID NO: 4.
Además, la invención también se refiere a una composición comprendiendo una mezcla de una o más variantes según la invención derivada de (como la \alpha-amilasa de parental tipo Termamyl) la \alpha-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 3 y una alfa-amilasa híbrida que comprende una parte de la \alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5 y una parte de la \alpha-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4. Esta \alpha-amilasa híbrida tipo Termamyl mencionada comprende los 445 residuos de aminoácidos C-terminales de B. licheniformis mostrados en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la \alpha-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5. Esta última \alpha-amilasa híbrida mencionada puede de manera adecuada comprender las mutaciones siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4). En los ejemplos abajo dicha \alpha-amilasa híbrida parental tipo Termamyl, se usa en combinación con variantes de la invención, dichas variantes pueden ser usadas en composiciones de la invención.
En una forma de realización específica de la invención la composición comprende una mezcla de TVB146 y LE174, p. ej., en una proporción de 2:1 a 1:2, tal como 1:1.
Una variante de \alpha-amilasa de la invención o una composición de la invención puede en un aspecto de la invención ser usada para lavar la ropa y/o la vajilla; para desencolado textil o para licuefacción de almidón.
Materiales y métodos Enzimas
BSG alfa-amilasa: alfa-amilasa de B. stearothermophilus representada en la SEC ID NO: 3.
Variante TVB146 de alfa-amilasa: una variante de alfa-amilasa de B. stearothermophilus representada en la SEC ID NO: 3 con las mutaciones siguientes: con la deleción en las posiciones 1181-G182 + N193F. variante LE174 de alfa-amilasa híbrida:
LE174 es una alfa-amilasa híbrida tipo Termamyl que es idéntica a la secuencia de Termamyl, es decir, la \alpha-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, a excepción de que los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la proteína madura) han sido sustituidos por los 33 residuos N-terminales de BAN (proteína madura), es decir, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, que además tiene las siguientes mutaciones:
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración de la SEC ID NO: 4). LE174 fue construida por SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351).
Fermentación y purificación de variantes de \alpha-amilasa
Una cepa de B. subtilis que alberga el plásmido de expresión pertinente es dispuesta en líneas en una placa de LB-agar con 10 \mug/ml de canamicina a partir de materia prima a -80ºC, y crecida durante toda la noche a 37ºC. Las colonias son transferidas a 100 ml de medios de BPX suplementados con 10 \mug/ml de canamicina en un matraz de agitación de 500 ml.
Composición de medio BPX:
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El cultivo es agitado a 37ºC a 270 rpm durante 5 días.
Células y detritos celulares son eliminados del caldo de fermentación por centrifugado a 4500 rpm en 20-25 minutos. Después el sobrenadante es filtrado para obtener una solución completamente clara. El filtrado es concentrado y lavado en un filtro UF (membrana de corte de 10000) y el tampón es cambiado a 20 mM de acetato a pH 5.5. El filtrado UF es aplicado en una S-sepharose F.F. y la elución se realiza por elución de fase con 0,2M de NaCl en el mismo tampón. El eluato es dializado contra 10 mM de Tris, pH 9.0 y aplicado en una Q-sepharose F.F. y eluido con un gradiente lineal de 0-0,3M de NaCl sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad (medida por el ensayo Phadebas) son agrupadas, el pH fue ajustado a pH 7.5 y el color restante fue eliminado por un tratamiento con 0,5% p/vol. carbón activo en 5 minutos.
Determinación de la actividad - (KNU)
Una unidad Kilo Novo de alfa-amilasa (1 KNU) es la cantidad de enzima que degrada 5,26 g de almidón (Merck, Amylum Solubile, Erg. B 6, lote 9947275) por hora en el método estándar de Novo Nordisk para la determinación de alfa-amilasa basada en la condición siguiente:
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Una descripción detallada del método analítico de Novo Nordisk (AF 9) está disponible bajo pedido.
Determinación de la actividad BS-amilasa - KNU(S) 1. Campo de aplicación
Este método se utiliza para determinar la actividad \alpha-amilasa en fermentación y recuperación de muestras y productos formulados y granulados.
2. Principio
La BS-amilasa degrada el sustrato (4,6-etilideno(G_{7})-p-nitrofenil(G_{1})-\alpha,D-maltoheptaósido (escrito como etilideno-G_{7}-PNP) en, entre otras cosas, G_{2}-PNP y G_{3}-PNP, donde G se refiere a glucosa y PNP a p-nitrofenol.
G_{2}-PNP y G_{3}-PNP son degradados por \alpha-glucosidasa, que se añade en exceso, en glucosa y el p-nitrofenol coloreado de amarillo.
La reacción del color es vigilada in situ y el cambio de absorbencia en el tiempo es calculado como una expresión de la velocidad de la reacción y por lo tanto de la actividad de la enzima. Véanse las pautas de Boehringer Mannheim 1442 309 para detalles adicionales.
2.1 Condiciones de reacción
7
3. Definición de unidades
La actividad alfa-amilasa de Bacillus stearotermofius (BS-amilasa) es determinada respecto a un estándar de actividad declarada y establecida en unidades Kilo Novo (Stearothermophilus) o KNU(S)).
4. Especificidad y sensibilidad
Límite de determinación: aprox. 0.4 KNU(s)/g
5. Aparato
Analizador de Cobas Fara
Diluido (p. ej. Hamilton Microlab 1000)
Equilibrio analítico (p. ej. Mettler AE 100)
Placas de agitación
6. Reactivos/sustratos
Un equipo preparado se usa en este análisis para determinar la actividad \alpha-amilasa. Obsérvese que los reactivos específicos para el sustrato y la \alpha-glucosidasa no se usan como se describe en las pautas de Boehringer Mannheim. No obstante, las designaciones "tampón", "cristal 1", cristal 1a" y cristal 2" son aquellas a las que se hace referencia en estas pautas.
6.1. Sustrato
4,6-etilideno(G_{7})-p-nitrofenil(G_{1})-\alpha,D-maltoheptaósido (escrito como etilideno-G_{7}-PNP) p. ej. Boehringer Mannheim 1442 309
6.2 Reactivo auxiliar de \alpha-glucosidasa
\alpha-glucosidasa, p. ej. Boehringer Mannheim 1442 309
6.3 Solución BRIJ 35
8
6.4 Estabilizador
9
7. Muestras y estándares 7.1 Curva estándar Ejemplo: preparación de curva estándar de BS-amilasa
El estándar pertinente es diluido a 0.60 KNU(s)/ml como sigue. Una cantidad calculada de estándar es pesada y añadida a un matraz aforado de 200 ml, que es rellenado hasta alrededor de la marca de 2/3 con agua desmineralizada. Se añade estabilizador correspondiente al 1% del volumen del matraz y el matraz es rellenado hasta la marca con agua desmineralizada. Se utiliza un Hamilton Microlab 1000 para producir las diluciones mostradas abajo. Agua desmineralizada con 10/0 de estabilizador se usa como el diluyente.
10
7.2 Control de nivel
Un control del nivel de BS amilasa de Novo Nordisk A/S está incluido en todas las series usando el Cobas Fara. El control es diluido con 1% estabilizador de modo que la dilución final está en la gama de la curva estándar. Todos los pesos y diluciones están anotados en la lista de trabajo
7.3 Soluciones de muestra Determinación única
Muestras de fermentación (no muestras finales) a partir de la producción, todas las muestras de fermentación de instalaciones experimentales y muestras de estabilidad de almacenamiento son pesadas y analizadas una vez sólo.
Determinación doble en 1 serie
Muestras de proceso, muestras de fermentación final a partir de la producción, muestras de estudios de GLP y muestras de R&D son pesadas y analizadas dos veces.
Determinaciones dobles en 2 series
Muestras de producto acabado son pesadas y analizadas dos veces en dos series separadas.
Concentración máxima de muestras en forma de polvo: 5%
Muestras de prueba son diluidas con agua desmineralizada con el 1% de estabilizador hasta aprox. 0.037 KNU(S)/ml basándose en su actividad prevista. La dilución final es hecha directamente en el vaso de muestra.
8. Procedimiento 8.1 Programa de menú de Cobas
\sqbullet
El Programa de menú de Cobas se utiliza para sugerir el peso/diluciones de muestras y el control de nivel que debe ser usado.
\sqbullet
Las muestras son introducidas en el programa con un único código de identificación y una lista de trabajo es impresa
\sqbullet
Las muestras y control son pesados y diluidos como se establece en la lista de trabajo con los datos de peso escritos a mano se insertan en el cuaderno de trabajo para el análisis de BS-amilasa
\sqbullet
Los resultados son computerizados automáticamente por el Cobas Fara como se describe en artículo 9 y se imprime junto con la curva estándar.
\sqbullet
Las listas de trabajo y resultados impresos son insertados en el cuaderno de trabajo para el análisis de BS-amilasa.
8.2 Instalación de Cobas Fara
\sqbullet
Las muestras son colocadas en el porta muestras
\sqbullet
Los cinco estándares son colocados en el bastidor de calibrado en la posición 1 a 5 (estándar más fuerte en la posición 5), y el control colocado en el mismo bastidor en la posición 10.
\sqbullet
El sustrato es transferido a un contenedor de reactivo de 30 ml y colocado en un bastidor de reactivo en la posición 2 (soporte 1).
\sqbullet
El reactivo auxiliar de \alpha-glucosidasa es transferido a un contenedor de reactivo de 50 ml y colocado en el bastidor de reactivo en la posición 2 (soporte C)
8.3 Análisis de Cobas Fare
Los principios principales del análisis son los siguientes: 20 \muL de muestra y 10 \muL de agua de enjuague son introducidos con pipeta en la cubeta junto con 250 \muL de reactivo auxiliar de \alpha-glucosidasa. La cubeta gira durante 10 segundos y los reactivos son expulsados en las cubetas horizontales. 25 \muL de sustrato y 20 \muL de agua de enjuague son extraídos con pipeta. Después de un 1 segundo de espera para asegurar que la temperatura es de 37ºC, la cubeta gira otra vez y el sustrato es mezclado en las cubetas horizontales. La absorbencia es medida por primera vez después de 120 segundos y luego cada 5 segundos. La absorbencia es medida un total de 37 veces para cada muestra.
9. Cálculos
La actividad de las muestras es calculada respecto a Novo Nordisk A/S estándar.
La curva estándar es trazada por el analizador. La curva debe ser suavemente curvada, enjuagando sin parar hasta una absorbencia de alrededor de 0.25 para el estándar nº. 5.
La actividad de las muestras en KNU(S)/ml es leída de la curva estándar por el analizador.
Los cálculos finales para permitir que los pesos/diluciones usados emplean la fórmula siguiente:
Actividad en KNU (S)/g = S x V x F/W
S = lectura del resultado del análisis (KNU(S)/mL
V = volumen de matraz aforado usado en mL
F = factor de dilución para segunda dilución
W = peso de muestra enzimática en g
9.2 Cálculo de valores medios
Los resultados están establecidos con 3 dígitos significantes. No obstante, para la actividad de la muestra < 10 KNU(S)/g, sólo 2 dígitos significantes están provistos.
Las siguientes reglas se aplican en el cálculo de valores medios:
1. Los datos que se desvían más de 2 desviaciones estándares del valor medio no están incluidos en el cálculo.
2. Determinación única y doble sobre una serie:
El valor medio es calculado en base de resultados que figuran dentro del área de actividad de la curva estándar.
3. Determinaciones dobles sobre dos series: todos los valores están incluidos en el valor medio. Los valores atípicos están omitidos.
10. Exactitud y precisión
El coeficiente de variación es del 2,9% basado en la validación retrospectiva de resultados de análisis para varios productos finales y el control de nivel.
Ensayo para actividad \alpha-amilasa
La actividad \alpha-amilasa está determinada por un método que utiliza comprimidos Phadebas® como sustrato. Comprimidos de Phadebas (prueba de amilasa de Phadebas®, suministrados por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón coloreado de azul insoluble reticulado que ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia de tampón y dispuesto en comprimidos.
Para cada medición única una pastilla es suspendida en un tubo que contiene 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl_{2}, pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba es realizada al baño maría a la temperatura de interés. La \alpha-amilasa que debe evaluarse es diluida en x ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. 1 ml de esta solución de \alpha-amilasa se añade a 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la \alpha-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbencia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad \alpha-amilasa.
Es importante que la absorbencia de 620 nm medida después de 10 o 15 minutos de incubación (duración de la prueba) esté en el rango de 0.2 a 2.0 unidades de absorbencia a 620 nm. En este rango de absorbencia hay linealidad entre actividad y absorbencia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe en consecuencia ser ajustada para cumplir este criterio. Bajo un grupo especifico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones de tampón) 1 mg de una \alpha-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y un color azul será producido. La intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbencia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína \alpha-amilasa pura) de la \alpha-amilasa en cuestión bajo el conjunto de condiciones dadas.
Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de variantes de BSG \alpha-amilasa (SEC ID Nº: 3)
El gen que codifica BSG, amyS, está localizado en el plásmido pPL1117. Este plásmido contiene también el gen que confiere resistencia a la canamicina y un origen de replicación, ambos obtenidos del plásmido pUB110 (Gryczan, T.J. et al (1978) J.Bact 134:318-329).
La secuencia de ADN de la parte madura de amyS está mostrada como la SEC ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la proteína madura está mostrada como la SEC ID NO: 3
La variante TVB145 de BSG, que contiene una deleción de 6 nucleótidos correspondientes a los aminoácidos 1181-G182 en la proteína madura, es construida como sigue:
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es utilizada para amplificar la parte del gen amyS (del plásmido pPL1117), localizada entre los cebadores de ADN BSG1 (SEC ID Nº: 15) y BSGM2 (SEC ID Nº: 18). BSG1 es idéntico a una parte del gen amyS mientras que BSGM2 contiene la deleción de 6 bp de nucleótidos. Una reacción PCR estándar se realiza: 94ºC durante 5 minutos, 25 ciclos de (94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 90 segundos), 72ºC durante 7 minutos usando la polimerasa Pwo bajo condiciones recomendadas por el fabricante, Boehringer Mannheim Gmbh.
La banda amplificada de aproximadamente 550 bp resultante fue usada como un megaprimer (Barik, S and Galinski, MS (1991): Biotechniques 10: 489-490) junto con el cebador BSG3 en una segunda PCR con pPL1117 como molde dando como resultado un fragmento de ADN de aproximadamente 1080 bp.
Este fragmento de ADN es digerido con endonucleasas de restricción Acc65I y SalI y el fragmento resultante de aproximadamente 550 bp es ligado en el plásmido pPL1117 digerido con las mismas enzimas y transformadas en la cepa SHA273 de Bacillus subtilis delecionada de proteasa y de amilasa (descrita en WO92/11357 y WO95/10603).
Los transformantes resistentes a la canamicina y degradantes del almidón fueron analizados para la presencia de las mutaciones deseadas (digestión de restricción para verificar la introducción de un sitio HindIII en el gen). La secuencia de ADN entre los sitios de restricción Acc65I y SalI fue verificada por la secuenciación del ADN para asegurar la presencia de sólo las mutaciones deseadas.
La variante TVB146 de BSG que contiene la misma deleción de 6 nucleótidos como TVB145 y una sustitución adicional de asparagina 193 para una fenilalanina, N193F, fue construida en una vía similar como TVB145 utilizando el cebador BSGM3 (SEC ID Nº: 19) en la primera PCR.
La variante TVB161 de BSG, conteniendo la deleción de 1181-G182. N193F, y L204F, se construye de una manera similar a las dos variantes precedentes con la excepción de que el molde para las reacciones de la PCR sea el plásmido pTVB146 (pPL1117 conteniendo las mutaciones de TVB146 dentro de amyS y el oligonucleótido mutagénico para la primera PCR sea BSGM3.
La variante TVB162 de BSG, conteniendo la deleción de I181-G182. N193F, y E210H, es construida en una vía similar como TVB161 a excepción de que el oligonucleótido mutagénico es BSGM4 (SEC ID Nº: 20).
La variante TVB163 de BSG, conteniendo la deleción de I181-G182. N193F, y E214Q, es construida en una vía similar como TVB161 a excepción de que el oligonucleótido mutagénico es BSGM5 (SEC ID Nº: 21).
Las variantes de BSG arriba construidas fueron luego fermentadas y purificadas como se ha descrito anteriormente en la sección "Materiales y Métodos".
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Ejemplo 2 Medición de la estabilidad dependiente del calcio y del pH
Normalmente, el proceso de licuefacción industrial funciona usando pH 6.0-6.2 como pH de licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre para mejorar la estabilidad a 95ºC-105ºC. Algunas sustituciones aquí propuestas han sido hechas para mejorar la estabilidad a
1. pH inferior a pH 6.2 y/o
2. a niveles de calcio libre inferiores a 40 ppm de calcio libre.
Dos métodos diferentes han sido usados para medir las mejoras en estabilidad obtenidas por las diferentes sustituciones en la \alpha-amilasa de B. stearotermophilus:
Método 1. Un ensayo que mide la estabilidad a pH reducido, pH 5.0, en presencia de 5 ppm de calcio libre. 10 \mug de la variante fueron incubadas bajo las condiciones siguientes: una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a pH 5.0, que contiene 5 ppm de calcio y 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación fue hecha al baño maría a 95ºC durante 30 minutos.
Método 2. Un ensayo que mide la estabilidad en la ausencia de calcio libre y donde el pH es mantenido a pH 6.0. Este ensayo mide la reducción en la sensibilidad de calcio: 10 \mug de la variante fueron incubados bajo las condiciones siguientes: una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a pH 6.0, que contiene 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación fue hecha al baño maría a 95ºC durante 30 minutos.
Determinación de la estabilidad
Todos los procesos de estabilidad 1, 2 han sido hechos usando la misma configuración. El método fue:
La enzima fue incubada bajo las condiciones pertinentes (1-4). Las muestras fueron tomadas a 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y diluidas 25 veces (misma dilución para muestras tomadas) en tampón de ensayo (0.1 M Tampón de Britton 50 mM pH 7.3) y la actividad fue medida usando el ensayo Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones estándares pH 7.3, 37ºC.
La actividad medida antes de la incubación (0 minutos) fue usada como referencia (100%). El descenso en porcentaje fue calculado como función del período de incubación. La tabla muestra la actividad residual después de 30 minutos de incubación.
Método de estabilidad 1. / Mejora de la estabilidad a bajo pH
11
Método de estabilidad 1. / Mejora de estabilidad a pH bajo
La temperatura descrita en método 1 ha sido reducida de 95ºC a 70ºC puesto que las amilasas mencionadas para la SEC ID NO: 1 y 2 tiene una termoestabilidad inferior que aquella para la SEC ID NO: 3.
12
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Método de estabilidad 2. / Sensibilidad a bajo calcio
13
\newpage
Determinación de la actividad específica
La actividad específica fue determinada usando el ensayo Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima. La actividad fue determinada usando el ensayo de \alpha-amilasa descrito en la sección Materiales y Métodos de la
presente.
La actividad específica de la enzima madre y una mutación única y doble fue determinada para:
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Ejemplo 3 Cocción a presión y licuefacción en instalación experimental con variante de alfa-amilasa TVB146
Experimentos de licuefacción en instalación experimental fueron realizados en el sistema mini-jet usando una dosificación de 50 NU (S)/g DS a pH 5.5 con 5 ppm de Ca^{++} añadido, para comparar el rendimiento de la variante de BSG alfa-amilasa TVB146 formulada (SEC ID Nº: 3 con deleción en posiciones 1181-G182 + N193F) con aquella de BSG alfa-amilasa madre (SEC ID Nº: 3). La reacción fue vigilada midiendo el aumento de DE (método de Neocuproina) como función de tiempo.
Mezclas de almidón de maíz fueron preparadas suspendiendo 11,8 kg de Cerestar C*Pharm GL 03406 (89% almidón) en agua desionizada y compensando hasta 30 kg. El pH fue ajustado a 5.5 a temperatura ambiente, después de la adición de 0,55 g de CaCl_{2}.2H_{2}O.
Las enzimas siguientes fueron usadas:
15
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Una cantidad de enzima correspondiente a 50 NU (SM9)/g DS fue añadida, y la conductividad ajustada a 300 mS usando NaCl. Las condiciones estándares fueron las siguientes:
16
Después del sometimiento a presión, el almidón licuado fue recogido y transportado en termo-matraces sellados de la instalación experimental al laboratorio, donde se continuó la licuefacción secundaria a 95ºC.
10 ml de muestras fueron tomadas a intervalos de 15 minutos de 15-90 minutos. 2 gotas de 1 N HCl fueron añadidas para inactivar la enzima. A partir de estas muestras, 0,3-0,1 g (según el DE previsto) fueron pesadas y diluidas a 100 ml. Azúcares de reducción fueron luego determinados según el método Neocuproina (Determinación de azúcar de reducción con precisión mejorada. Dygert, Li, Florida and Thomas (1965). Anal. Biochem 13: 368) y los valores de DE determinados. El desarrollo de DE como función del tiempo está provisto en la siguiente tabla:
17
Como se puede observar la variante de alfa-amilasa TVB146 dio mejor rendimiento significativamente bajo condiciones de aplicación industrialmente relevantes a niveles bajos de calcio que la BSG alfa-amilasa madre.
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Ejemplo 4 Cocción a presión y Licuefacción con una combinación de variantes de alfa-amilasa (TVB146 y LE174)
La cocción a presión y licuefacción usando una combinación de las variantes de alfa-amilasa, TVB146 y LE174 (proporción 1:1) fueron realizadas en las condiciones siguientes:
Almidón de maíz en polvo de grado alimentario Sustrato A.E. Staley (100lbs) D.S. 35% usando agua DI
Ca^{2+} Libre 2.7 ppm a pH 5.3 (ningún añadido, del almidón sólo) pH 5.3 inicial
Unidades en dosis de AF9 (AF9 está disponible bajo pedido) para cada variante enzimática fue 28 NU/g de almidón db para una dosis total de 56 NU/g de temperatura en licuefacción primaria 105ºC
Tiempo de mantenimiento en licuefacción primaria 5 minutos
Temperatura en licuefacción secundaria 95ºC
A 15 minutos en licuefacción secundaria 1.5 gms de hidrolizado fue añadido a un litro volumétrico pesado que contiene 500 cc de agua DI y 1 ml de un HCl normal y el peso exacto añadido fue registrado. Esto fue repetido a intervalos de 15 minutos hasta a 90 minutos con un punto adicional a 127 minutos. Estos fueron diluidos hasta un litro y determinados para equivalencia de dextrosa por medio del método de Neocuproina como se describe por Dygert, Li, Florida and Thomas. Determination of reducing sugar with improved precision (1965). Anal. Biochem 13: 368.
Los resultados fueron los siguientes:
18
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Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
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\bullet R.K. SAIKI et al. Science, 1988, vol. 239, 487-491 [0171]
\bulletMORINAGA et al. Biotechnology, 1984, vol. 2, 646-639 [0171]
\bulletNELSON LONG Analytical Biochemistry, 1989, vol. 180, 147-151 [0171]
\bulletHUNKAPILLER et al. Nature, 1984, vol. 310, 105-111 [0171]
\bullet R. HIGUCHI B. KRUMMEL R.K. SAIKI A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions Nucl. Acids Res, 1988, vol. 16, 7351-7367 [0171]
\bulletDUBNAU et al. J. Mol. Biol., 1971, vol. 56, 209-221 [0171]
\bulletGRYCZAN et al. J. Bacteriol., 1978, vol. 134, 318-329 [0171]
\bullet S.D. ERLICH Proc. Natl. Acad. Sci., 1977, vol. 74, 1680-1682 [0171]
\bulletBOEL et al. Biochemistry, 1990, vol. 29, 6244-6249 [0171]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: NOVO NORDISK A/S
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: +45 44 44 88 88
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: +45 44 49 32 56
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VARIANTES DE AMILASA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
22
23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 514 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 483 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
27
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 480 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
29
30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
31
32
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
34
35
36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
37
38
39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
40
400
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
41
410
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1548 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
42
43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1920 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN:421..1872
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
44
45
46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2084 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN:343..1794
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
47
48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSG1"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSG3"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
101
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM1"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
102
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM2"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
103
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM3"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
104
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM4"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
105
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador BSGM5"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
106

Claims (28)

1. Una variante de una \alpha-amilasa parental tipo Termamyl, donde la \alpha-amilasa parental tipo Termamyl es seleccionada entre:
(i) SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8;
(ii) una \alpha-amilasa parental tipo Termamyl que tiene al menos el 80% de homología para una de las secuencias en (i);
y donde la variante tiene actividad \alpha-amilasa y comprende las mutaciones siguientes 1181* y G182* y N193F en SEC ID NO: 3 o en posiciones correspondientes en otra \alpha-amilasa parental tipo Termamyl.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La variante según la reivindicación 1, donde la \alpha-amilasa tipo Termamyl parental tiene al menos un 90% de homología con una de las secuencias en (i).
3. La variante según la reivindicación 2, donde la \alpha-amilasa tipo Termamyl parental tiene al menos el 95% de homología con una de las secuencias en (i).
4. La variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo además la sustitución E214Q en la posición 214 en la SEC ID NO: 3 o en una posición correspondiente en otra \alpha-amilasa tipo Termamyl parental.
5. Un constructo de ADN comprendiendo una secuencia de ADN que codifica una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 5.
7. Una célula aislada que es transformada con un constructo de ADN según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6.
8. La célula según la reivindicación 7, que es un microorganismo.
9. La célula según la reivindicación 8, que es una bacteria o un hongo.
10. La célula según la reivindicación 9, que es una bacteria Gram positiva.
11. La célula según la reivindicación 10, donde la bacteria Gram positiva es seleccionada entre Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis.
12. Un aditivo de detergente comprendiendo una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. El aditivo de detergente según la reivindicación 12, donde el aditivo detergente está en forma de un granulado no pulverulento, líquido estabilizado o enzima protegida.
14. El aditivo de detergente según la reivindicación 12 o 13, que contiene 0,02-200 mg de proteína enzimática/g de aditivo.
15. El aditivo de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que adicionalmente comprende otra enzima.
16. El aditivo de detergente según la reivindicación 15, donde la otra enzima es seleccionada entre una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
17. Una composición de detergente comprendiendo una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
18. La composición de detergente según la reivindicación 17, que adicionalmente comprende otra enzima.
19. La composición de detergente según la reivindicación 18, donde la otra enzima es seleccionada entre una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
20. Una composición de detergente para lavar la vajilla a mano o a máquina comprendiendo una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
21. La composición de detergente para lavar la vajilla según la reivindicación 20, que adicionalmente comprende otra enzima.
22. La composición de detergente para lavar la vajilla según la reivindicación 21, donde la otra enzima es seleccionada entre una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
23. Una composición de detergente para lavar la ropa a mano o a máquina comprendiendo una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
24. La composición de detergente para lavar la ropa según la reivindicación 23, que adicionalmente comprende otra enzima.
25. La composición de detergente para lava la ropa según la reivindicación 24, donde la otra enzima es seleccionada entre una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una enzima amilolítica y/o una celulasa.
26. Uso de una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para lavar la ropa y/o la vajilla.
27. Uso de una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para desencolado textil.
28. Uso de una variante de \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para licuefacción del almidón.
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