CN105829531A

CN105829531A - α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

Info

Publication number: CN105829531A
Application number: CN201480068977.5A
Authority: CN
Inventors: C.安德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2016-08-03
Also published as: EP3083952A2; US20160312200A1; WO2015091959A2; WO2015091959A3

Abstract

本发明涉及具有α?淀粉酶活性的变体和编码这些变体的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用这些变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及α-淀粉酶变体(具有α-淀粉酶活性的多肽)、编码α-淀粉酶的核酸、生产α-淀粉酶的方法、包括α-淀粉酶的组合物以及使用α-淀粉酶的方法。

相关领域说明

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。

α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些用途如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。

属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作特妙淀粉酶(Termamyl)，所述特妙淀粉酶已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。

特妙淀粉酶和许多高效α-淀粉酶的活性需要钙。对于特妙淀粉酶，已经发现四个钙原子通过带负电荷的氨基酸残基配位而结合于α-淀粉酶结构中。在其他α-淀粉酶中，结合在该结构中的钙离子的量可能是不同的。对钙的这一需要在存在强螯合剂化合物的应用例如洗涤剂中是缺点，然而通常在其他应用中，例如淀粉的液化和生物燃料的生产中不添加螯合剂。

因此，开发在包含螯合剂的组合物例如洗涤剂组合物中既稳定又显示出良好性能的酶是一个挑战。

举例而言，在洗涤剂组合物中添加或掺入螯合剂以在洗涤过程中降低水硬度，保护可能还存在的漂白剂，且螯合剂还可以进一步对某些污迹的去除具有直接作用。钙依赖性酶在洗涤剂组合物中的稳定性有时可以通过将钙添加至洗涤剂中而改进，但常常这会产生配制上的问题，即洗涤剂的物理稳定性。

芽孢杆菌淀粉酶如特妙淀粉酶、AA560(WO2000/060060)和SP707(通过冢本(Tsukamoto)等人，1988，生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)151:25-31)形成一个特定的已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶的组。这些淀粉酶已经经修饰以改进洗涤剂中的稳定性。WO96/23873例如披露了缺失α-淀粉酶SP690、SP722和SP707(WO96/23873的SEQIDNO:1、2和7)的氨基酸181+182或氨基酸183+184以改进此淀粉酶的稳定性。WO96/23873另外披露了通过用例如亮氨酸取代M202来修饰这些淀粉酶以使该分子对氧化保持稳定。因而，修饰淀粉酶来改进某些特性是已知的。然而，洗涤剂行业正朝向在洗涤剂组合物中使用更强螯合剂(chelator)(即螯合剂(chelatingagent))发展。因此，对于在洗涤剂组合物、特别是在包括强螯合剂的洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶仍然存在需要。同时，在餐具洗涤和衣物洗涤两者中，存在着朝向在较低温度下洗涤的趋势。因此，对于在低温下具有高性能并且在包括强螯合剂的洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶存在需要。

因此，本发明的一个目的是提供具有α-淀粉酶活性(α-淀粉酶)的变体，所述变体(α-淀粉酶)在洗涤剂组合物、特别是在液体衣物洗涤和/或液体餐具洗涤洗涤剂组合物、特别是包括强螯合剂和因此非常低浓度的游离钙离子的洗涤剂中具有高稳定性。因此，一个目标是提供在包含小于0.05mM游离钙离子的组合物中具有改进的稳定性的变体。一个另外的目的是提供在粉末状洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶和/或在洗涤剂中存储后具有高淀粉酶活性的α-淀粉酶。具体地，本发明的目标是提供在洗涤剂组合物中具有高稳定性连同具有在低温(例如在15℃或在30℃)具有高洗涤性能的α-淀粉酶。具体地，本发明的目标是提供与亲本α-淀粉酶相比，或与现有技术的稳定性改进的亲本α-淀粉酶，例如披露于WO96/23873中的在位置181+182或183+184处具有两个氨基酸的缺失的SP690、SP722或SP707相比，具有在15℃下的改进的洗涤性能和/或在洗涤剂(例如像标准洗涤剂A(参见实验部分)中改进的稳定性的α-淀粉酶。

发明概述

本发明涉及α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或三个或四个位置处的缺失和/或取代，以及b)在一个或多个位置处的取代，使用SEQIDNO:1进行编号，所述取代对应于位置L63、M105、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、Q280、N311、F343、D418、S419和S420，并且该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

本发明另外涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及生产这些变体的方法。

本发明另外涉及包含所述变体的组合物如洗涤剂组合物，以及这些变体的用途。

定义

α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶”与术语“具有α-淀粉酶活性的多肽”是同义的。“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，其构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖-和多糖的水解的酶。出于本发明的目的，根据方法中所述的程序确定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的α-淀粉酶具有SEQIDNO:1的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意思指一种酶的包含该酶的催化机器的区域。

洗涤剂组合物：除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；机洗餐具洗涤剂洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴凝胶(showergel)、沐浴露(foambath)；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。

除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、皂棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴凝胶、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了具有蛋白酶活性的多肽(即根据本发明的蛋白酶)以外，该术语涵盖了可以包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

酶的有效量：术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒状、棒状)组合物等。术语蛋白酶的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中达到希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶量。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

织物：术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，数个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与本发明的α-淀粉酶变体相关的相比于亲本α-淀粉酶有所改进的特征。例如，SEQIDNO:1+缺失(183+184)+M105F+I206Y+M208Y+L217V+T246V的变体应与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶相比。可替代地，如以下描述，变体与具有a)的相同改变的亲本相比。这意指具有SEQIDNO:1+(183+184)缺失的氨基酸序列的α-淀粉酶。

包括缺失(182+183)和以下取代M105F+I206Y+M208Y+L217V+T246V的根据SEQIDNO:2的变体应与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶相比。可替代地，亲本α-淀粉酶可以是具有SEQIDNO:2+缺失(182+183)的氨基酸序列的α-淀粉酶，并且因此该变体应与具有SEQIDNO:2+(182+183)的缺失的氨基酸序列的α-淀粉酶相比。

此类改进的特性包括但不限于催化效率、催化速率、化学稳定性、螯合剂稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、洗涤剂稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、以及热稳定性、和改进的洗涤性能，特别是在低温下，例如5℃与35℃之间的温度下的改进的洗涤性能。可以改进的另一种特性是该分子在洗涤剂组合物中、特别是在液体洗涤剂组合物中存储期间的稳定性。变体稳定性中的改进是相对于如以上描述的亲本淀粉酶的稳定性而言的。改进的存储稳定性可以确定为在如在实例1、2和3中描述的存储期后的残余活性。

洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。如以下描述，该洗涤性能可以通过计算所谓的强度值来量化。

改进的洗涤性能：术语“改进的洗涤性能”在此定义为例如通过增加的污渍去除而相对于亲本α-淀粉酶的洗涤性能展现出本发明的淀粉酶变体的洗涤性能的改变。改进的洗涤性能可以通过比较所谓的强度值来测量。

低温：“低温”是5℃-40℃，例如5℃-35℃，优选5℃-30℃，更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃，并且特别是5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃，更优选10℃-25℃，最优选10℃-20℃，并且特别是10℃-15℃的温度。最优选的，低温意指15℃。

强度值：洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能，其中更高的强度值与更高的洗涤性能相关。

使用专业平板扫描仪(KodakiQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

I n t = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}}

纺织品：纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQIDNO:1的氨基酸1至485。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码一种变体α-淀粉酶的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链-或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

非织物洗涤剂组合物：术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，例如餐具洗涤洗涤剂组合物、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行变化以产生酶变体的α-淀粉酶。具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的淀粉酶可以例如是所要求α-淀粉酶变体的亲本。

相关洗涤条件：在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，可以使用本领域熟知的程序Vector确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。另一个熟知的程序是ClustalW程序。因此，可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSSEMMA。

还可以使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

纺织品：术语“纺织品”是指织造织物，连同适于转化为或用作纱线、织造、针织以及非织造织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有SEQIDNO:1的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。本发明的变体优选地是SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6的亲本α-淀粉酶的变体或与这些中的任一个具有至少90％序列一致性的α-淀粉酶的变体。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

水硬度：如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degreeofhardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degreeofhardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。

野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母或丝状真菌)表达的一种α-淀粉酶。

变体命名规则

出于本发明的目的，使用在SEQIDNO:1中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQIDNO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法 (MethodsinMolecularBiology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSSEMMA。

当其他酶与SEQIDNO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSIBLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(NucleicAcidsRes.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSIBLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。在给定位置处的氨基酸可以被任何其他氨基酸取代的情况下，将其表示为T226A；C；D；E；F；G；H；I；K；L；M；N；P；Q；R；S；W；V；Y。因此，这意味着位置226处的苏氨酸可以被选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、W、V或Y的组的一个氨基酸取代。同样地，在给定位置处的氨基酸可以用选自特定的氨基酸组的一个氨基酸取代的情况下，例如在位置226处的苏氨酸可以被酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸中的任一个取代的情况下，将其表示为T226Y；F；H。给定位置处的不同改变还可以由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。可替代地，可以用“/”、“，”或“”(即空格)分开多个取代，并且构成相同含义和目的。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195^*”或者“G195^*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195^*+Ser411^*”或“G195^*+S411^*”。缺失还可以写作“del(G195)”或为“del(G195+S411)”的若干缺失。可替代地，可以用“/”、“，”或“”(即空格)分开多个缺失，并且构成相同含义和目的。

插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸#1、插入氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。可替代地，可以用“/”、“，”或“”(即空格)分开多个改变，并且构成相同含义和目的。

发明详述

α-淀粉酶变体

在一方面，本发明涉及α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括

a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或三个或四个位置处的缺失和/或取代，以及

b)在一个或多个位置处的取代，当使用SEQIDNO:1进行编号时，所述取代对应于位置L63、M105、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、Q280、N311、F343、D418、S419和S420，并且该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

在一个实施例中，该α-淀粉酶变体是亲本α-淀粉酶的变体，该变体包含：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183、和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代，以及b)在一个或多个位置处的取代，这些取代选自下组，该组由以下各项组成：L63Q；L63P；L63R；L63V；L63F；L63C；L63G；L63A；L63D；L63E；L63H；L63K；L63I；L63M；L63N；L63S；L63T；L63Y；特别是L63V，

A113M；A113R；A113W；A113I；A113L，

M116F；M116Y；M116L，

R118P；P118Q；P118V；P118F；P118C；P118G；P118A；P118D；P118E；P118H；P118I；P118K；P118M；P118S；P118Y，特别是R118P；P118Q；P118V；P118F；P118C；P118G，

N128C，

Q129P；Q129R；Q129V；Q129F；Q129C；Q129G；Q129A；Q129D；Q129E；Q129H；Q129I；Q129K；Q129L；Q129M；Q129N；Q129S；Q129T；Q129Y，特别是Q129E，

G133N，

A139Q；A139P；A139R；A139V；A139F；A139C；A139G；A139D；A139E；A139H；A139I；A139K；A139L；A139M；A139N；A139S；A139T；A139Y，特别是A139T，

R142H；R142V；R142L；R142Q；R142I，

R172M，

L173Y，

N174S；N174E，

A186E；A186N；A186Q；A186S，

E190P；E190R；E190V；E190F；E190C；E190G；E190A；E190D；E190Q；E190H；E190I；E190K；E190L；E190M；E190N；E190S；E190T；E190Y，特别是E190P，

N195Y；N195H；N195K；N195L；N195F，

A204Q；A204P；A204R；A204V；A204F；A204C；A204G；A204D；A204E；A204H；A204I；A204K；A204L；A204M；A204N；A204S；A204T；A204Y，特别是A204T，

I206Q；I206P；I206R；I206V；I206F；I206C；I206G；I206A；I206D；I206E；I206H；I206K；I206L；I206M；I206N；I206S；I206T；I206Y，特别是I206Y；I206F；I206C；I206L；I206H；I206S，

H210M；H210D；H210C；H210A；H210Q；H210S；H210F；H210N；H210E；H210T，

P211Q；P211R；P211V；P211F；P211C；P211G；P211A；P211D；P211E；P211H；P211I；P211K；P211L；P211M；P211N；P211S；P211T；P211Y，特别是P211L；P211M；P211S；P211Q；P211G；P211V；P211W；P211A；P211H；P211T；P211R，

E212T；E212R；E212S；E212V；E212L；E212Y；E212R；E212T；E212G，

V213Q；V213P；V213R；V213F；V213C；V213G；V213A；V213D；V213E；V213H；V213I；V213K；V213L；V213M；V213N；V213S；V213T；V213Y，特别是V213T；V213A；V213G，V213S；V213C；V213L；V213P，

V214Q；V214P；V214R；V214F；V214C；V214G；V214A；V214D；V214E；V214H；V214K；V214L；V214M；V214N；V214S；V214T；V214Y，特别是V214T

L217M；L217Q；L217V；L217I；L217H，特别是L217V，

Y243Q；Y243P；Y243R；Y243F；Y243C；Y243G；Y243A；Y243D；Y243E；Y243H；Y243I；Y243K；Y243L；Y243M；Y243N；Y243S；Y243T；Y243V，特别是Y243F，

S244Q；S244P；S244R；S244F；S244C；S244G；S244A；S244D；S244E；S244H；S244I；S244K；S244L；S244M；S244N；S244Y；S244T；S244V，特别是S244Q，

T246Q；T246P；T246R；T246F；T246C；T246G；T246A；T246D；T246E；T246H；T246I；T246K；T246L；T246M；T246N；T246Y；T246S；T246V，特别是T246Q；M，

N260E，N311R，F343W和N418C，

其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

在一个优选实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b)的以下取代中的一个或多个：

L63Q；P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；K；I；M；N；S；T；Y，特别是L63V，

A113M；R，W；I；L，

M116F；Y；L，

R118P；Q；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；fM；S；Y，特别是R118P；Q；V；F；C；G，

N128C，

Q129P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是Q129E，

G133N，

A139Q；P；R；V；F；C；G；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是A139T，

R142H；V；L；Q；I，

R172K；M，

L173Y，

N174Q；S；E，

A186E；N；Q；S，

E190P；R；V；F；C；G；A；D；Q；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是E190P，

N195Y；H；K；L；F，

A204Q；P；R；V；F；C；G；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是A204T，

I206Q；P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；K；L；M；N；S；T；Y，特别是I206Y；F；C；L；H；S，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

P211Q；R；V；F；C；G；A；D，E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是P211L；M；S；Q；G；V；W；A；H；T；R，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

V213Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是V213T；A；G，S；C；L；P，

V214Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是V214T；I，

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

Y243Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；V，特别是Y243F，

S244Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；Y；T；V，特别是S244Q，

T246Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；Y；S；V，特别是T246Q；M，

N260E，Q280S，N311R，F343W和N418C，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且该变体与SEQIDNO:1的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b)的以下取代中的一个或多个：

A113M；R，W；I；L，

W116F；Y；L，

N128C，

G133N，

K142H；V；L；Q；I，

Q172K；M，

L173Y，

Q174S；E，

G186E；N；Q；S，

N195Y；H；K；L；F，

A204Q；P；R；V；F；C；G；DE；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是A204T，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

P211Q；R；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是P211L；M；S；Q；G；V；W；A；H；T；R，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

N260E，Q311R，F343W和N418C，其中这些位置对应于SEQIDNO:2的位置，并且该变体与SEQIDNO:2的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性。

L63Q；L63P；L63R；L63V；L63F；L63C；L63G；L63A；L63D；L63E；L63H；L63K；L63I；L63M；L63N；L63S；L63T；L63Y特别是L63V，

A113M；A113R，A113W；A113I；A113L，

W116F；W116Y；W116L，

R118P；R118Q；R118V；R118F；R118C；R118G；R118A；R118D；R118E；R118H；R118I；R118K；R118M；R118S；R118Y，特别是R118P；R118Q；R118V；R118F；R118C；R118G，

N128C，

G133N，

K142H；K142V；K142L；K142Q；K142I，

Q172K；M，

L173Y，

Q174S；E，

G186E；G186N；G186Q；G186S，

N195Y；N195H；N195K；N195L；N195F，

P211Q；P211R；P211V；P211F；P211C；P211G；P211A；P211D；P211E；P211H；P211I；P211K；P211L；P211M；P211N；P211S；P211T；P211Y，特别是P211L；P211M；P211S；P211Q；P211G；P211V；P211WAP211；HP211；TP211；P211R，

E212T；P212R；P212S；P212V；P212L；P212Y；P212R；P212T；P212G，

V213Q；V213P；V213R；V213F；V213C；V213G；V213A；V213D；V213E；V213H；V213I；V213K；V213L；V213M；V213N；V213S；V213T；V213Y，特别是V213T；V213A；V213G；V213S；V213C；V213L；V213P，

V214Q；V214P；V214R；V214F；V214C；V214G；V214A；V214D；V214E；V214H；V214I；V214K；V214L；V214M；V214N；V214S；V214T；V214Y，特别是V214T；V214I，

L217M；L217Q；L217V；L217I；L217H，特别是L217V，

在另一个实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b)的以下取代中的一个或多个：

A113M；R，W；I；L，

M116F；Y；L，

N128C，

G133N，

K142H；V；L；Q；I，

K172M，

L173Y，

N174Q；S；E，

G186E；N；Q；S，

N195Y；H；K；L；F，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

N260E，N280S，Q311R，F343W和N418C，其中这些位置对应于SEQIDNO:3的位置，并且该变体与SEQIDNO:3的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性。

A113M；A113R；A113W；A113I；A113L，

M116F；M116Y；M116L，

N128C，

G133N，

K142H；K142V；K142L；K142Q；K142I，

K172M，

L173Y，

N174Q；N174S；N174E，

G186E；G186N；G186Q；G186S，

N195Y；N195H；N195K；N195L；N195F，

P211Q；P211R；P211V；P211F；P211C；P211G；P211A；P211D；P211E；P211H；P211I；P211K；P211L；P211M；P211N；P211S；P211T；P211Y，特别是P211L；P211M；P211S；P211Q；P211G；P211V；P211A；P211H；P211T；P211R，

E212T；E212R；E212S；E212V；E212L；E212Y；E212R；E212T；E212G，

L217M；L217Q；L217V；L217I；L217H，特别是L217V，

在另一个实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b的以下取代中的一个或多个：

G113M；R，W；I；L，

I116F；Y；L，

N118P；Q；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；fM；S；Y，特别是R118P；Q；V；F；C；G，

N128C，

G133N，

K142H；V；L；Q；I，

Q172K；M，

L173Y，

Q174S；E，

A186E；N；Q；S，

N195Y；H；K；L；F，

V206Q；P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；K；L；M；N；S；T；Y，特别是I206Y；F；C；L；H；S，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

I214Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；K；L；M；N；S；T；Y，特别是V214T

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

P260E，N280S，N311R，F343W和N418C，其中这些位置对应于SEQIDNO:4的位置，并且该变体与SEQIDNO:4的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性。

G113M；G113R；G113W；G113I；G113L，

I116F；I116Y；I116L，

N118P；N118Q；N118V；N118F；N118C；N118G；N118A；N118D；N118E；N118H；N118I；N118K；N118M；N118S；N118Y，特别是R118P；N118Q；N118V；N118F；N118C；N118G，

N128C，

G133N，

K142H；K142V；K142L；K142Q；K142I，

Q172K；M，

L173Y，

Q174S；Q174E，

A186E；A186N；A186Q；A186S，

N195Y；N195H；N195K；N195L；N195F，

V206Q；V206P；V206R；V206V；V206F；V206C；V206G；V206A；V206D；V206E；V206H；V206K；V206L；V206M；V206N；V206S；V206T；V206Y，特别是I206Y；V206F；V206C；V206L；V206H；V206S，

P211Q；P211R；P211V；P211F；P211C；P211G；P211A；P211D；P211E；P211H；P211I；P211K；P211L；P211M；P211N；P211S；P211T；P211Y，特别是P211L；P211M；P211S；P211Q；P211G；P211V；P211WA；P211H；P211T；P211R，

E212T；E212R；E212S；E212V；E212L；E212Y；E212R；E212T；E212G，

I214Q；I214P；I214R；I214F；I214C；I214G；I214A；I214D；I214E；I214H；I214K；I214L；I214M；I214N；I214S；I214T；I214Y，特别是V214T

L217M；L217Q；L217V；L217I；L217H，特别是L217V，

T246Q；T246P；T246R；T246F；T246C；T246G；T246A；T246D；T246E；T246H；T246I；T246K；T246L；T246M；T246N；T246Y；T246S；T246V，特别是T246Q；T246M，

在另一个实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b)的以下取代中的一个或多个：

G113M；R，W；I；L，

M116F；Y；L，

N128C，

G133N，

K142H；V；L；Q；I，

Q172K；M，

L173Y，

Q174S；E，

A186E；N；Q；S，

N195Y；H；K；L；F，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

P260E，N280S，N311R，F343W和D418C，其中这些位置对应于SEQIDNO:5的位置，并且该变体与SEQIDNO:5的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性。

G113M；G113R；G113W；G113I；G113L，

M116F；M116Y；M116L，

N128C，

G133N，

K142H；K142V；K142L；K142Q；K142I，

Q172K；Q172M，

L173Y，

Q174S；E，

A186E；A186N；A186Q；A186S，

N195Y；N195H；N195K；N195L；N195F，

E212T；E212R；E212S；E212V；E212L；E212Y；E212R；E212T；E212G，

L217M；L217Q；L217V；L217I；L217H，特别是L217V，

在又优选的实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b)的以下取代中的一个或多个：

A113M；R；W；I；L，

N116F；Y；L，

L118P；Q；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；M；S；Y，特别是R118P；Q；V；F；C；G，

N128C，

G133N，

K142H；V；L；Q；I，

Q172K；M，

F173Y，

Q174S；E，

A186E；N；Q；S，

N195Y；H；K；L；F，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

N280S，K311R，F343W和N418C，其中这些位置对应于SEQIDNO:6的位置，并且该变体与SEQIDNO:6的α-淀粉酶具有至少90％序列一致性。

在一个优选实施例中，该变体源自具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，所述变体包含b)的以下取代中的一个或多个：

A113M；A113R；A113W；A113I；A113L，

N116F；N116Y；N116L，

L118P；L118Q；L118V；L118F；L118C；L118G；L118A；L118D；L118E；L118H；L118I；L118K；L118M；L118S；L118Y，特别是R118P；L118Q；L118V；L118F；L118C；L118G，

N128C，

G133N，

K142H；K142V；K142L；K142Q；K142I，

Q172K；Q172M，

F173Y，

Q174S；Q174E，

A186E；A186N；A186Q；A186S，

N195Y；N195H；N195K；N195L；N195F，

V206Q；V206P；V206R；V206V；V206F；V206C；V206G；V206A；V206C；V206D；V206E；V206H；V206K；V206L；V206M；V206N；V206S；V206T；V206Y，特别是I206Y；V206F；V206C；V206L；V206H；V206S，

E212T；E212R；E212S；E212V；E212L；E212Y；E212R；E212T；E212G，

L217M；L217Q；L217V；L217I；L217H，特别是L217V，

在一个实施例中，本发明的α-淀粉酶变体是分离的变体。

在一个优选实施例中，该变体进一步包括对应于H183+G184的氨基酸的成对缺失。在另一个实施例中，该变体包括对应于R181+G182的氨基酸的成对缺失。在另一个实施例中，该变体包括对应于R181+H183的氨基酸的成对缺失。在另一个实施例中，该变体包括对应于R181+G184的氨基酸的成对缺失。在另一个实施例中，该变体包括对应于G182+H183的氨基酸的成对缺失。在另一个实施例中，该变体包括对应于G182+G184的氨基酸的成对缺失。在另一个实施例中，该变体进一步包括在181、182、183和184的非缺失位置的一个或两个处的取代。

因此，在此考虑了包括对应于如以上在a)下描述的H183+G184、R181+G182、R181+H183、R181+G184、或G182+H183的氨基酸的成对缺失的根据本发明的变体，包括以上描述的即对应于b)的在一个或多个位置处的取代。

在一个实施例中，该变体包括b)的所述取代中的两个或更多个。

在一个优选实施例中，它包括在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。在一个最优选实施例中，a)包括位置H183+G184的缺失并且b)包括取代N195F+I206Y。

在另一个优选实施例中，该变体包括a)对应于H183+G184的氨基酸的成对缺失，并且包括b)在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。

在另一个实施例中，该变体包括a)对应于R181+G182的氨基酸的成对缺失，并且包括b)在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。

在另一个实施例中，a)包括对应于R181+H183的氨基酸的成对缺失，并且b)包括在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。

在另一个实施例中，a)包括对应于R181+G184的氨基酸的成对缺失，并且b)包括在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。

在另一个实施例中，a)包括对应于G182+H183的氨基酸的成对缺失，并且b)包括在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。

在另一个实施例中，a)包括对应于G182+G184的氨基酸的成对缺失，并且b)包括在位置195+206处的取代，例如N195F+I206Y或N195Y+I206F或N195Y+I206Y或N195F+I206F或N195F+I206L或N195F+I206H。

在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少91％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少92％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少93％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少94％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性。在一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少96％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少97％序列一致性但是小于100％序列一致性。在又另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少98％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽具有至少99％序列一致性但是小于100％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少91％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少92％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少93％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少94％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性。在一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少96％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少97％序列一致性但是小于100％序列一致性。在又另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少98％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽具有至少99％序列一致性但是小于100％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少91％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少92％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少93％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少94％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性。在一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少96％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少97％序列一致性但是小于100％序列一致性。在又另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少98％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽具有至少99％序列一致性但是小于100％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少91％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少92％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少93％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少94％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性。在一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少96％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少97％序列一致性但是小于100％序列一致性。在又另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少98％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽具有至少99％序列一致性但是小于100％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少91％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少92％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少93％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少94％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少96％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少97％序列一致性但是小于100％序列一致性。在又另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少98％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽具有至少99％序列一致性但是小于100％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少91％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少92％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少93％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少94％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性。在一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少96％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少97％序列一致性但是小于100％序列一致性。在又另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少98％序列一致性但是小于100％序列一致性。在另一个实施例中，该变体与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽具有至少99％序列一致性但是小于100％序列一致性。

相应地，本发明的优选α-淀粉酶变体是其中改变包括突变H183*+G184*+N195F+I206Y或由其组成的变体，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置并且该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

在一个另外优选的实施例中，α-淀粉酶变体的改变包括突变H183*+G184*+N195F+I206Y或由其组成，其中这些位置对应于SEQIDNO1的位置并且该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽具有至少95％序列一致性但是小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

在另一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206Y和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206Y和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的取代I206Y和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206Y和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206Y和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206F和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206F和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206F和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206F和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代I206F和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195F和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195F和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195F和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195F和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195F和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195Y和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195Y和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195Y和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195Y和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代N195Y和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213S和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213S和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213S和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213S和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213S和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213T和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213T和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213T和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213T和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V213T和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V214T和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V214T和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V214T和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V214T和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V214T和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V217M和缺失H183*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V217M和缺失R181*+G182*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V217M和缺失G182*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V217M和缺失R181*+G184*，或由其组成。在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽中的任一个的取代V217M和缺失G182*+H183*，或由其组成。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：I206Y+H183*+G184*、I206Y+R181*+G182*、I206Y+G182*+G184*、I206Y+R181*+G184*、I206Y+G182*+H183*、I206Y+N195F+H183*+G184*、I206Y+N195F+G182*+G184*、I206Y+N195F+R181*+G184*、I206Y+N195F+G182+H183*、I206Y+N195F+R181*+G182*、I206Y+N195Y+H183*+G184*、I206Y+N195Y+G182*+G184*、I206Y+N195Y+R181*+G184*、I206Y+N195Y+G182+H183*和I206Y+N195Y+R181*+G182*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：I206F+H183*+G184*、I206F+R181*+G182*、I206F+G182*+G184*、I206F+R181*+G184*、I206F+G182*+H183*、I206F+N195F+H183*+G184*、I206F+N195F+G182*+G184*、I206F+N195F+R181*+G184*、I206F+N195F+G182+H183*、I206F+N195F+R181*+G182*、I206F+N195Y+H183*+G184*、I206F+N195Y+G182*+G184*、I206F+N195Y+R181*+G184*、I206F+N195Y+G182+H183*和I206F+N195Y+R181*+G182*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：M105L+H183*+G184*、M105L+R181*+G182*、M105L+G182*+G184*、M105L+R181*+G184*、M105L+G182*+H183*、M105L+N195F+H183*+G184*、M105L+N195F+G182*+G184*、M105L+N195F+R181*+G184*、M105L+N195F+G182+H183*、M105L+N195F+R181*+G182*、M105L+N195Y+H183*+G184*、M105L+N195Y+G182*+G184*、M105L+N195Y+R181*+G184*、M105L+N195Y+G182+H183*、M105L+N195Y+R181*+G182*和M105L+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：R171S+H183*+G184*、R171S+R181*+G182*、R171S+G182*+G184*、R171S+R181*+G184*、R171S+G182*+H183*、R171S+N195F+H183*+G184*、R171S+N195F+G182*+G184*、R171S+N195F+R181*+G184*、R171S+N195F+G182+H183*、R171S+N195F+R181*+G182*、R171S+N195Y+H183*+G184*、R171S+N195Y+G182*+G184*、R171S+N195Y+R181*+G184*、R171S+N195Y+G182+H183*、R171S+N195Y+R181*+G182*和R171S+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：N174Q+H183*+G184*、N174Q+R181*+G182*、N174Q+G182*+G184*、N174Q+R181*+G184*、N174Q+G182*+H183*、N174Q+N195F+H183*+G184*、N174Q+N195F+G182*+G184*、N174Q+N195F+R181*+G184*、N174Q+N195F+G182+H183*、N174Q+N195F+R181*+G182*、N174Q+N195Y+H183*+G184*、N174Q+N195Y+G182*+G184*、N174Q+N195Y+R181*+G184*、N174Q+N195Y+G182+H183*、N174Q+N195Y+R181*+G182*和N174Q+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：M208F+H183*+G184*、M208F+R181*+G182*、M208F+G182*+G184*、M208F+R181*+G184*、M208F+G182*+H183*、M208F+N195F+H183*+G184*、M208F+N195F+G182*+G184*、M208F+N195F+R181*+G184*、M208F+N195F+G182+H183*、M208F+N195F+R181*+G182*、M208F+N195Y+H183*+G184*、M208F+N195Y+G182*+G184*、M208F+N195Y+R181*+G184*、M208F+N195Y+G182+H183*、M208F+N195Y+R181*+G182*和M208F+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：M208Y+H183*+G184*、M208Y+R181*+G182*、M208Y+G182*+G184*、M208Y+R181*+G184*、M208Y+G182*+H183*、M208Y+N195F+H183*+G184*、M208Y+N195F+G182*+G184*、M208Y+N195F+R181*+G184*、M208Y+N195F+G182+H183*、M208Y+N195F+R181*+G182*、M208Y+N195Y+H183*+G184*、M208Y+N195Y+G182*+G184*、M208Y+N195Y+R181*+G184*、M208Y+N195Y+G182+H183*、M208Y+N195Y+R181*+G182*和M208Y+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213T+H183*+G184*、V213T+R181*+G182*、V213T+G182*+G184*、V213T+R181*+G184*、V213T+G182*+H183*、V213T+N195F+H183*+G184*、V213T+N195F+G182*+G184*、V213T+N195F+R181*+G184*、V213T+N195F+G182+H183*、V213T+N195F+R181*+G182*、V213T+N195Y+H183*+G184*、V213T+N195Y+G182*+G184*、V213T+N195Y+R181*+G184*、V213T+N195Y+G182+H183*、V213T+N195Y+R181*+G182*和V213T+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213S+H183*+G184*、V213S+R181*+G182*、V213S+G182*+G184*、V213S+R181*+G184*、V213S+G182*+H183*、V213S+N195F+H183*+G184*、V213S+N195F+G182*+G184*、V213S+N195F+R181*+G184*、V213S+N195F+G182+H183*、V213S+N195F+R181*+G182*、V213S+N195Y+H183*+G184*、V213S+N195Y+G182*+G184*、V213S+N195Y+R181*+G184*、V213S+N195Y+G182+H183*、V213S+N195Y+R181*+G182*和V213S+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213C+H183*+G184*、V213C+R181*+G182*、V213C+G182*+G184*、V213C+R181*+G184*、V213C+G182*+H183*、V213C+N195F+H183*+G184*、V213C+N195F+G182*+G184*、V213C+N195F+R181*+G184*、V213C+N195F+G182+H183*、V213C+N195F+R181*+G182*、V213C+N195Y+H183*+G184*、V213C+N195Y+G182*+G184*、V213C+N195Y+R181*+G184*、V213C+N195Y+G182+H183*、V213C+N195Y+R181*+G182*和V213C+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213G+H183*+G184*、V213G+R181*+G182*、V213G+G182*+G184*、V213G+R181*+G184*、V213G+G182*+H183*、V213G+N195F+H183*+G184*、V213G+N195F+G182*+G184*、V213G+N195F+R181*+G184*、V213G+N195F+G182+H183*、V213G+N195F+R181*+G182*、V213G+N195Y+H183*+G184*、V213G+N195Y+G182*+G184*、V213G+N195Y+R181*+G184*、V213G+N195Y+G182+H183*、V213G+N195Y+R181*+G182*和V213G+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V214T+H183*+G184*、V214T+R181*+G182*、V214T+G182*+G184*、V214T+R181*+G184*、V214T+G182*+H183*、V214T+N195F+H183*+G184*、V214T+N195F+G182*+G184*、V214T+N195F+R181*+G184*、V214T+N195F+G182+H183*、V214T+N195F+R181*+G182*、V214T+N195Y+H183*+G184*、V214T+N195Y+G182*+G184*、V214T+N195Y+R181*+G184*、V214T+N195Y+G182+H183*、V214T+N195Y+R181*+G182*和V214T+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：L217M+H183*+G184*、L217M+R181*+G182*、L217M+G182*+G184*、L217M+R181*+G184*、L217M+G182*+H183*、L217M+N195F+H183*+G184*、L217M+N195F+G182*+G184*、L217M+N195F+R181*+G184*、L217M+N195F+G182+H183*、L217M+N195F+R181*+G182*、L217M+N195Y+H183*+G184*、L217M+N195Y+G182*+G184*、L217M+N195Y+R181*+G184*、L217M+N195Y+G182+H183*、L217M+N195Y+R181*+G182*和L217M+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：L217I+H183*+G184*、L217I+R181*+G182*、L217I+G182*+G184*、L217I+R181*+G184*、L217I+G182*+H183*、L217I+N195F+H183*+G184*、L217I+N195F+G182*+G184*、L217I+N195F+R181*+G184*、L217I+N195F+G182+H183*、L217I+N195F+R181*+G182*、L217I+N195Y+H183*+G184*、L217I+N195Y+G182*+G184*、L217I+N195Y+R181*+G184*、L217I+N195Y+G182+H183*、L217I+N195Y+R181*+G182*和L217I+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：L217V+H183*+G184*、L217V+R181*+G182*、L217V+G182*+G184*、L217V+R181*+G184*、L217V+G182*+H183*、L217V+N195F+H183*+G184*、L217V+N195F+G182*+G184*、L217V+N195F+R181*+G184*、L217V+N195F+G182+H183*、L217V+N195F+R181*+G182*、L217V+N195Y+H183*+G184*、L217V+N195Y+G182*+G184*、L217V+N195Y+R181*+G184*、L217V+N195Y+G182+H183*、L217V+N195Y+R181*+G182*和L217V+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：L217Q+H183*+G184*、L217Q+R181*+G182*、L217Q+G182*+G184*、L217Q+R181*+G184*、L217Q+G182*+H183*、L217Q+N195F+H183*+G184*、L217Q+N195F+G182*+G184*、L217Q+N195F+R181*+G184*、L217Q+N195F+G182+H183*、L217Q+N195F+R181*+G182*、L217Q+N195Y+H183*+G184*、L217Q+N195Y+G182*+G184*、L217Q+N195Y+R181*+G184*、L217Q+N195Y+G182+H183*、L217Q+N195Y+R181*+G182*和L217Q+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：K179L+H183*+G184*、K179L+R181*+G182*、K179L+G182*+G184*、K179L+R181*+G184*、K179L+G182*+H183*、K179L+N195F+H183*+G184*、K179L+N195F+G182*+G184*、K179L+N195F+R181*+G184*、K179L+N195F+G182+H183*、K179L+N195F+R181*+G182*、K179L+N195Y+H183*+G184*、K179L+N195Y+G182*+G184*、K179L+N195Y+R181*+G184*、K179L+N195Y+G182+H183*、K179L+N195Y+R181*+G182*和K179L+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：N195Y+H183*+G184*、N195Y+R181*+G182*、N195Y+G182*+G184*、N195Y+R181*+G184*、N195Y+G182*+H183*、和N195Y+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：E190P+H183*+G184*、E190P+R181*+G182*、E190P+G182*+G184*、E190P+R181*+G184*、E190P+G182*+H183*、E190P+N195F+H183*+G184*、E190P+N195F+G182*+G184*、E190P+N195F+R181*+G184*、E190P+N195F+G182+H183*、E190P+N195F+R181*+G182*、E190P+N195Y+H183*+G184*、E190P+N195Y+G182*+G184*、E190P+N195Y+R181*+G184*、E190P+N195Y+G182+H183*、E190P+N195Y+R181*+G182*和E190P+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：G305S+H183*+G184*、G305S+R181*+G182*、G305S+G182*+G184*、G305S+R181*+G184*、G305S+G182*+H183*、G305S+N195F+H183*+G184*、G305S+N195F+G182*+G184*、G305S+N195F+R181*+G184*、G305S+N195F+G182+H183*、G305S+N195F+R181*+G182*、G305S+N195Y+H183*+G184*、G305S+N195Y+G182*+G184*、G305S+N195Y+R181*+G184*、G305S+N195Y+G182+H183*、G305S+N195Y+R181*+G182*、G305S+N195F+I206Y+G182+H183*、G305S+N195F+I206Y+R181*+G182*、和G305S+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：N195H+H183*+G184*、N195H+R181*+G182*、N195H+G182*+G184*、N195H+R181*+G184*、N195H+G182*+H183*、和N195H+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：N195L+H183*+G184*、N195L+R181*+G182*、N195L+G182*+G184*、N195L+R181*+G184*、N195L+G182*+H183*、和N195L+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：N195I+H183*+G184*、N195I+R181*+G182*、N195I+G182*+G184*、N195I+R181*+G184*、N195I+G182*+H183*、和N195I+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213T+V214T+H183*+G184*、V213T+V214T+R181*+G182*、V213T+V214T+G182*+G184*、V213T+V214T+R181*+G184*、V213T+V214T+G182*+H183*、V213T+V214T+N195F+H183*+G184*、V213T+V214T+N195F+G182*+G184*、V213T+V214T+N195F+R181*+G184*、V213T+V214T+N195F+G182+H183*、V213T+V214T+N195F+R181*+G182*、V213T+V214T+N195Y+H183*+G184*、V213T+V214T+N195Y+G182*+G184*、V213T+V214T+N195Y+R181*+G184*、V213T+V214T+N195Y+G182+H183*、V213T+V214T+N195Y+R181*+G182*和V213T+V214T+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213T+V214T+L217V+H183*+G184*、V213T+V214T+L217V+R181*+G182*、V213T+V214T+L217V+G182*+G184*、V213T+V214T+L217V+R181*+G184*、V213T+V214T+L217V+G182*+H183*、V213T+V214T+L217V+N195F+H183*+G184*、V213T+V214T+L217V+N195F+G182*+G184*、V213T+V214T+L217V+N195F+R181*+G184*、V213T+V214T+L217V+N195F+G182+H183*、V213T+V214T+L217V+N195F+R181*+G182*、V213T+V214T+L217V+N195Y+H183*+G184*、V213T+V214T+L217V+N195Y+G182*+G184*、V213T+V214T+L217V+N195Y+R181*+G184*、V213T+V214T+L217V+N195Y+G182+H183*、V213T+V214T+L217V+N195Y+R181*+G182*和V213T+V214T+L217V+N195F+I206Y+H183*+G184*和M208Y+V213T+V214T+L217V+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213T+V214T+L217M+H183*+G184*、V213T+V214T+L217M+R181*+G182*、V213T+V214T+L217M+G182*+G184*、V213T+V214T+L217M+R181*+G184*、V213T+V214T+L217M+G182*+H183*、V213T+V214T+L217M+N195F+H183*+G184*、V213T+V214T+L217M+N195F+G182*+G184*、V213T+V214T+L217M+N195F+R181*+G184*、V213T+V214T+L217M+N195F+G182+H183*、V213T+V214T+L217M+N195F+R181*+G182*、V213T+V214T+L217M+N195Y+H183*+G184*、V213T+V214T+L217M+N195Y+G182*+G184*、V213T+V214T+L217M+N195Y+R181*+G184*、V213T+V214T+L217M+N195Y+G182+H183*、V213T+V214T+L217M+N195Y+R181*+G182*和V213T+V214T+L217M+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213T+V214T+L217Q+H183*+G184*、V213T+V214T+L217Q+R181*+G182*、V213T+V214T+L217Q+G182*+G184*、V213T+V214T+L217Q+R181*+G184*、V213T+V214T+L217Q+G182*+H183*、V213T+V214T+L217Q+N195F+H183*+G184*、V213T+V214T+L217Q+N195F+G182*+G184*、V213T+V214T+L217Q+N195F+R181*+G184*、V213T+V214T+L217Q+N195F+G182+H183*、V213T+V214T+L217Q+N195F+R181*+G182*、V213T+V214T+L217Q+N195Y+H183*+G184*、V213T+V214T+L217Q+N195Y+G182*+G184*、V213T+V214T+L217Q+N195Y+R181*+G184*、V213T+V214T+L217Q+N195Y+G182+H183*、V213T+V214T+L217Q+N195Y+R181*+G182*和V213T+V214T+L217Q+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213S+V214T+L217M+H183*+G184*、V213S+V214T+L217M+R181*+G182*、V213S+V214T+L217M+G182*+G184*、V213S+V214T+L217M+R181*+G184*、V213S+V214T+L217M+G182*+H183*、V213S+V214T+L217M+N195F+H183*+G184*、V213S+V214T+L217M+N195F+G182*+G184*、V213S+V214T+L217M+N195F+R181*+G184*、V213S+V214T+L217M+N195F+G182+H183*、V213S+V214T+L217M+N195F+R181*+G182*、V213S+V214T+L217M+N195Y+H183*+G184*、V213S+V214T+L217M+N195Y+G182*+G184*、V213S+V214T+L217M+N195Y+R181*+G184*、V213S+V214T+L217M+N195Y+G182+H183*、V213S+V214T+L217M+N195Y+R181*+G182*和V213S+V214T+L217M+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在一个实施例中，该变体包括SEQIDNO:1的成熟多肽的选自以下列表的多个改变，该列表由以下各项组成：V213S+V214T+H183*+G184*、V213S+V214T+R181*+G182*、V213S+V214T+G182*+G184*、V213S+V214T+R181*+G184*、V213S+V214T+G182*+H183*、V213S+V214T+N195F+H183*+G184*、V213S+V214T+N195F+G182*+G184*、V213S+V214T+N195F+R181*+G184*、V213S+V214T+N195F+G182+H183*、V213S+V214T+N195F+R181*+G182*、V213S+V214T+N195Y+H183*+G184*、V213S+V214T+N195Y+G182*+G184*、V213S+V214T+N195Y+R181*+G184*、V213S+V214T+N195Y+G182+H183*、V213S+V214T+N195Y+R181*+G182*和V213S+V214T+N195F+I206Y+H183*+G184*。

在本发明的另一个实施例中，该变体包括三个或更多个取代，优选是如以上描述的b)的三个或更多个取代。在本发明的另一个实施例中，该变体包括四个或更多个取代，优选是b)的四个或更多个取代。在本发明的另一个实施例中，该变体包括五个或更多个取代，优选是b)的五个或更多个取代。

在又另一个实施例中，本发明涉及多个变体，其中取代b)包括选自下组的取代或由其组成，该组由以下各项组成：

M105L+I206Y，M105L+I206Y+L217I，M105I+I206Y，M105F+I206Y+M208Y+L217V+T246V，M105F+I206Y，M105L+I206F，M105I+I206Y+M208Y+L217I+T246V，M105I+I206Y+T246I，T246I，N195F+V213S+V214T，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+V213S+V214T，N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T+L217M，N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217M，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217Q，N195F+I206Y+V213G+V214T，N195F+I206Y+V213S，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，N195F+V213S，N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217M，N195F+V213G+V214T，I206Y+M208Y+L217Q，I206F+M208Y+L217Q，I206Y+M208Y+L217I，I206F+M208Y+L217M，I206Y+M208Y，I206Y+L217M，I206Y+M208Y+V213A+L217M，I206Y+M208Y+L217V+T246V，I206Y+V213G，I206Y+M208F+L217V，I206N+M208Y+L217M，I206F+M208Y+L217V，I206Y+T246V，I206Y+L217I，I206Y+L217V，I206F+M208F+L217I，I206Y+M208L+V213S，I206F+L217I，I206Y+L217I+T246I，I206L+L217V，I206Y+M208F+L217H，I206L+M208F+L217I，I206L+L217V+T246L，I206F+T246V，M208Y+V213S+L217M，M208Y+V213A+L217Q，L63I+I206Y，L63I+I206Y+I241V，L63V+I206Y，L63V+M105L+I206Y，L63V+I206Y+L217I，L63V+M105F+I206Y+M208F+L217I，L63V+I206Y+T246V，L63V+I206F，L63V+I206L+L217V，L63V+M105F+I206Y，L63V+I206Y+I241V+T246L，N195F+I206Y+M208Y+V214T+L217V，A186E+N195F+I206Y，N195F+I206Y+M208Y+V213T+L217V，A186E+N195F+A204T+I206Y+P211S，L63I++N195F+I206Y+H210S，L63V+N195F+I206Y+H210S，N195F+I206Y+V213P+V214T，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217I，A186E+N195F+I206Y+H210S，N195F+V213P，A186E+N195F+A204T+I206Y+H210S，N195F+I206H，N195F+M208Y+V213T+V214T+L217V，I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+L217V，N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T，N195F+I206Y+M208Y，N195F+V213I+V214P，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T，N195F+I206Y，I206Y+V213S，G182P+A186E，G182S+A186E，G182V+A186K，K179L+A186H+E190P，K179L+A186K+E190P，K179L+A186R+E190P，K179L+A186S+E190P，K179L+E190P，K179L+G182C+A186K+E190P，K179L+G182P+A186S+E190P，K179L+G182P+A186V+E190P，K179L+G182S+A186Q+E190P，L173F+N174Q，L173Y+N174S，R172K+L173Y+N174E，T193A+N195F，T193D+N195F，T193N+N195F，T193S+N195F，V213A+V214Q，V213G+V214T，V213I+V214P，V213N+V214Q，V213P+V214L，V213S+V214R，W48V+A60V，V213G+V214T，V213N+V214I，V213P+V214T和V213S+V214T。

与该变体的亲本α-淀粉酶相比或与具有相对于如本发明的变体的a)而言的相应改变的亲本相比，由此获得的变体具有改进的洗涤剂稳定性。即，当SEQIDNO:1的变体包括a)181*+182*的缺失和b)V213G+V214T时，该洗涤剂稳定性优选地可以与具有氨基酸181*+182*的缺失的SEQIDNO:1相比并且得以改进。

具体地，本发明的变体在液体洗涤剂中、特别是在包括强螯合剂的液体洗涤剂中具有改进的稳定性，如根据实例1所确定的。与亲本α-淀粉酶相比或与具有相对于如本发明的变体的a)而言的相应改变的亲本相比，在包含小于0.125mM游离钙离子例如小于0.1或甚至小于0.05mM游离钙离子(例如小于0.04mM或0.03mM或0.02mM或0.01或甚至小于0.01mM)的组合物中，本发明的变体进一步具有以下优点：具有改进的稳定性。因此，在一个实施例中，当与亲本α-淀粉酶相比时，在液体洗涤剂中本发明的变体具有改进的稳定性，其中通过以下方式来确定该稳定性：在包含小于0.125mM游离钙离子例如小于0.1或甚至小于0.05mM游离钙离子(例如小于0.04mM或0.03mM或0.02mM或0.01或甚至小于0.01mM)的液体洗涤剂中，在40℃孵育该变体持续113小时，并且比较针对该变体和该亲本α-淀粉酶所获得的稳定性确定。

在一个优选实施例中，a)是位置183+184的缺失并且b)包括选自下组的改变或由其组成，该组由以下各项组成：

N195F+I206Y+R171S，N195F+I206Y+G305S，M105L+I206Y，M105L+I206Y+L217I，M105I+I206Y，M105F+I206Y+M208Y+L217V+T246V，M105F+I206Y，M105L+I206F，M105I+I206Y+M208Y+L217I+T246V，M105I+I206Y+T246I，N195F+V213S+V214T，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+V213S+V214T，N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T+L217M，N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217M，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217Q，N195F+I206Y+V213G+V214T，N195F+I206Y+V213S，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，N195F+V213S，N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217M，N195F+V213G+V214T，I206Y+M208Y+L217Q，

I206F+M208Y+L217Q，I206Y+M208Y+L217I，I206F+M208Y+L217M，I206Y+M208Y，I206Y+L217M，I206Y+M208Y+V213A+L217M，I206Y+M208Y+L217V+T246V，I206Y+V213G，I206Y+M208F+L217V，I206N+M208Y+L217M，I206F+M208Y+L217V，I206Y+T246V，I206Y+L217I，I206Y+L217V，I206F+M208F+L217I，I206Y+M208L+V213S，I206F+L217I，I206Y+L217I+T246I，I206L+L217V，I206Y+M208F+L217H，I206L+M208F+L217I，I206L+L217V+T246L，I206F+T246V，M208Y+V213S+L217M，M208Y+V213A+L217Q，L63I+I206Y，L63I+I206Y+I241V，L63V+I206Y，L63V+M105L+I206Y，L63V+I206Y+L217I，L63V+M105F+I206Y+M208F+L217I，L63V+I206Y+T246V，L63V+I206F，L63V+I206L+L217V，L63V+M105F+I206Y，L63V+I206Y+I241V+T246L，N195F+I206Y+M208Y+V214T+L217V，A186E+N195F+I206Y，N195F+I206Y+M208Y+V213T+L217V，A186E+N195F+A204+I206Y+P211S，L63I++N195F+I206Y+H210S，L63V+N195F+I206Y+H210S，N195F+I206Y+V213P+V214T，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217I，A186E+N195F+I206Y+H210S，N195F+V213P，A186E+N195F+A204T+I206Y+H210S，N195F+I206H，N195F+M208Y+V213T+V214T+L217V，I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，N195F+I206Y+L217V，N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T，N195F+I206Y+M208Y，N195F+V213I+V214P，N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T，N195F+I206Y，I206Y+V213SG182P+A186E，G182S+A186E，G182V+A186K，K179L+A186H+E190P，K179L+A186K+E190P，K179L+A186R+E190P，K179L+A186S+E190P，K179L+E190P，K179L+G182C+A186K+E190P，K179L+G182P+A186S+E190P，K179L+G182P+A186V+E190P，K179L+G182S+A186Q+E190P，L173F+N174Q，L173Y+N174S，R172K+L173Y+N174E，T193A+N195F，T193D+N195F，T193N+N195F，T193S+N195F，V213A+V214Q，V213P+V214L，V213S+V214R，W48V+A60V，V213G+V214T，V213I+V214P，V213N+V214I，V213N+V214Q，V213P+V214T和V213S+V214T。

与亲本α-淀粉酶相比或与具有与所要求保护的变体除了b)的改变的相同序列的α-淀粉酶相比，由此提供的变体具有改进的洗涤剂稳定性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。

在一个实施例中，该变体与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。

SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6中任一个的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA对从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。

本发明提供了一种改进具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中任一个的氨基酸序列的或与其具有至少90％序列一致性的亲本α-淀粉酶的稳定性、特别是洗涤剂稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽位置R181、G182、H183和G184的亲本α-淀粉酶中的位置，取代和/或缺失两个或更多个氨基酸，以及

b)向该亲本α-淀粉酶引入以下取代中的一个或多个：

L63Q；P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；K；I；M；N；S；T；Y，特别是L63V，A113M；R，W；I；L，

M116F；Y；I；W；L，R118P；Q；V；F；G；A；C；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是R118P；Q；V；F；C；G，N128C，Q129P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是Q129E，A139Q；P；R；V；F；C；G；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是A139T，R142H；V；L；Q；I，R171S，

E190P；R；V；F；C；G；A；D；Q；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是E190P，N195Y；H；K；L，A204Q；P；R；V；F；C；G；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是A204T，I206Q；P；R；V；F；C；G；A；D；E；H；K；L；M；N；S；T；Y，特别是I206Y；F；C；L；H；S，H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，P211Q；R；V；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是P211L；M；S；Q；G；V；W；A；H；T；R，E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，V213Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是V213T；S；C；L，V214Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；I；K；L；M；N；S；T；Y，特别是V214T，L217V，Y243F，S244Q，T246Q，G305S，N311R，D418C，S419M和S420Q；R，以上是使用SEQIDNO:1进行编号，其中所得变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中任一个的成熟多肽具有至少90％例如至少95％但小于100％的序列一致性，并且其中所得变体具有α-淀粉酶活性，并且与该亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤剂稳定性。

在一个实施例中，改进具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中任一个的氨基酸序列的或与其具有至少90％序列一致性的亲本α-淀粉酶的稳定性、特别是洗涤剂稳定性的方法，包括以下步骤：

b)向该亲本α-淀粉酶引入以下取代中的一个或多个

L63Q；L63P；L63R；L63V；L63F；L63C；L63G；L63A；L63D；L63E；L63H；L63K；L63I；L63M；L63N；L63S；L63T；L63Y，特别是L63V，A113M；A113R；A113W；A113I；A113L，

M116F；M116Y；M116I；M116W；M116L，R118P；R118Q；R118V；R118F；R118C；R118G；R118A；R118D；R118E；R118H；R118I；R118K；R118L；R118M；R118N；R118S；R118T；R118Y，特别是R118P；R118Q；R118V；R118F；R118C；R118G，N128C，Q129P；Q129R；Q129V；Q129F；Q129C；Q129G；Q129A；Q129D；Q129E；Q129H；Q129I；Q129K；Q129L；Q129M；Q129N；Q129S；Q129T；Q129Y，特别是Q129E，A139Q；A139P；A139R；A139V；A139F；A139C；A139G；A139D；A139E；A139H；A139I；A139K；A139L；A139M；A139N；A139S；A139T；A139Y，特别是A139T，R142H；R142V；R142L；R142Q；R142I，R171S，E190P；E190R；E190V；E190F；E190C；E190G；E190A；E190D；E190Q；E190H；E190I；E190K；E190L；E190M；E190N；E190S；E190T；E190Y，特别是E190P，N195Y；N195H；N195K；N195L，A204Q；A204P；A204R；A204V；A204F；A204C；A204G；A204D；A204E；A204H；A204I；A204K；A204L；A204M；A204N；A204S；A204T；A204Y，特别是A204T，I206Q；I206P；I206R；I206V；I206F；I206G；I206A；I206C；I206D；I206E；I206H；I206K；I206L；I206M；I206N；I206S；I206T；I206Y，特别是I206Y；I206F；I206C；I206L；I206H；I206S，H210M；H210D；H210C；H210A；H210Q；H210S；H210F；H210N；H210E；H210T，P211Q；P211R；P211V；P211F；P211C；P211G；P211A；P211D；P211E；P211H；P211I；P211K；P211L；P211M；P211N；P211S；P211T；P211Y，特别是P211L；P211M；P211S；P211Q；P211G；P211V；P211WA；P211H；P211T；P211R，E212T；E212R；E212S；E212V；E212L；E212Y；E212R；E212T；E212G，V213Q；V213P；V213R；V213F；V213C；V213G；V213A；V213D；V213E；V213H；V213I；V213K；V213L；V213M；V213N；V213S；V213T；V213Y，特别是V213T；V213S；V213C；V213L，V214Q；V214P；V214R；V214F；V214C；V214G；V214A；V214D；V214E；V214H；V214I；V214K；V214L；V214M；V214N；V214S；V214T；V214Y，特别是V214T，L217V，Y243F，S244Q，T246Q，G305S，N311R，D418C，S419M和S420Q；R，以上是使用SEQIDNO:1进行编号，其中所得变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽具有至少90％例如至少95％但小于100％的序列一致性，其中该所得变体具有α-淀粉酶活性并且与该亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤剂稳定性。

在一个实施例中，使用SEQIDNO:1进行编号，步骤a)包括缺失在位置R181、G182、H183和G184处的所述氨基酸中的两个，例如这些氨基酸对应于R181+G182、R181+H183、R181+G184、G182+H183、G182+G184或H183+G184。在一个优选实施例中，使用SEQIDNO:1进行编号，缺失在位置183+184处的氨基酸。

在一个优选的实施例中，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、热稳定性，优选地低温下的改进的洗涤性能、洗涤剂稳定性和螯合剂稳定性。

在一个特别优选的实施例中，与亲本α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤剂稳定性。在一个实施例中，与亲本α-淀粉酶相比，在液体洗涤剂组合物中，该变体具有改进的稳定性。可以如实例1所描述，确定液体洗涤剂组合物中的稳定性。

在一个实施例中，引入SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的多肽中的氨基酸取代和/或缺失的数目高达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。因此，根据本发明的变体可以包括高达10个取代和/或缺失。在一个具体实施例中，与在此确切描述的相比，根据本发明的变体包括高达10个另外的取代和/或缺失。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德沃斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。SEQIDNO:1的氨基酸序列中的必需氨基酸位于为催化残基的位置D236、E266和D333处。此外，该Y58、H107、R234、H240、H332对于形成该活性位点而言是关键的。因此，氨基酸D236、E266、D333、Y58、H107、R234、H240、H332优选不应被突变。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

亲本α-淀粉酶

在一个优选实施例中，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：

a.与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；

b.与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；

c.与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；

d.与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；

e.与SEQIDNO:5的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；

f.与SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；

g.SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；

h.与针对SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。

在其他实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:1具有至少91％，或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％，例如至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

在其他实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:2具有至少91％，或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％，例如至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

在其他实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:3具有至少91％，或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％，例如至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

在其他实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:4具有至少91％，或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％，例如至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

在其他实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:5具有至少91％，或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％，例如至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

在其他实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:6具有至少91％，或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％，例如至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:3的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:5的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:6的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:6的氨基酸序列或由其组成。

在又另一个实施例中，该亲本是SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6的成熟多肽的等位基因变体。

亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。

该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属α-淀粉酶。

还可以通过本领域已知的方法人工制造SEQIDNO1、2、3、4、5和6的α-淀粉酶连同其变体。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括将以下项引入与SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6具有至少90％序列一致性的亲本α-淀粉酶中：a)在该亲本α-淀粉酶中的两个或更多个位置的取代和/或缺失，所述位置对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184，和b)在一个或多个位置处的取代，所述取代对应于SEQIDNO:1的位置L63、M105、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、Q280、N311、F343、D418、S419和S420，其中所得变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽具有至少90％例如至少95％但小于100％的序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收该变体。a)和b)的缺失和/或取代可以如以上所描述。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。同样地，SEQIDNO:1、2、3、4、5和6的多肽可以通过本领域技术人员已知的方式通过合成基因构建来产生。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcidsRes.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(FungalGenet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。在一个实施例中，这些多核苷酸是分离的多核苷酸。在一个实施例中，这些多核苷酸编码包括以下项的变体：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。因此，在一个实施例中，该核酸构建体包括编码包括以下项的变体的多核苷酸：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，在一个实施例中，该重组表达载体包括编码包括以下项的变体的多核苷酸：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但是小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性；启动子，以及转录和翻译终止信号。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如在WO2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO00/24883中的方法来完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。因此，在一个实施例中，该重组宿主细胞包括编码包括以下项的变体的多核苷酸：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但是小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列。

将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CABInternational)，大学出版社(UniversityPress)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、土生梭孢壳、长绒毛栓菌、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉的细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化：贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente)，在艾本尔森，J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙，M.I.(Simon,M.I.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology)，酶学方法(MethodsinEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)，纽约；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

生产方法

本发明还涉及产生本发明的变体α-淀粉酶的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该变体的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该变体。

所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

可以使用特异性针对具有α-淀粉酶活性的变体的本领域已知的方法来检测该变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。在一方面，回收包含该变体的发酵液。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体多肽，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的变体的一种发酵液配制品或一种细胞组合物。因此，在一个实施例中，发酵液配制品或细胞组合物包括变体，该变体包括：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的变体的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的变体)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，所述组合物是含有机酸、已被杀灭的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的已杀灭细胞的(cell-killed)全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO90/15861或WO2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

酶组合物

本发明还涉及包括本发明的α-淀粉酶变体的组合物。优选地，所述组合物富含此种变体。术语“富含”指示该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因子。

因此，在一个实施例中，该组合物包括变体，该变体包括：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

这些组合物可以包括本发明的一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

洗涤剂组合物

在一个实施例中，本发明针对以下洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的α-淀粉酶变体。因此，在一个实施例中，该洗涤剂组合物包括变体，该变体包括：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。在一个实施例中，该洗涤剂是一种液体洗涤剂组合物。在另一个实施例中，该洗涤剂组合物是一种粉末状洗涤剂组合物。

该洗涤剂组合物可以是衣物洗涤剂组合物或餐具洗涤洗涤剂组合物。

另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升洗涤液体0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质，优选是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质，最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。

用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣造粒(laundrygranulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

可以使用常规稳定剂稳定本发明的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制该组合物。

在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP1025240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。

低的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。

高的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为在洗涤水中它们具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。

拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范围从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。

本发明的变体还可以掺入WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，将该专利通过引用结合在此。

下面给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约0％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。

本发明的洗涤剂组合物还包括如在US20130072416或US20130072415中所披露的类异戊二烯表面活性剂中的一个或多个。

助水溶剂

助水溶剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(CurrentOpinioninColloid&InterfaceScience)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约10％至约40％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂(chelatingagent)(即螯合剂(chelator))。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约10％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US5977053中。

螯合剂(Chelatingagent)或螯合剂(chelator)是可与特定的金属离子形成分子的化学物，从而使这些离子失活使其不能与其他元素进行反应，由此是通过形成螯合物而抑制化学活性的一种结合剂。螯合是在配体与单一中心原子之间形成或存在的两种或更多种单独的结合。配体可以是任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。在本文上下文中，术语“螯合剂(chelatingagent)”包括螯合剂(chelant)、螯合剂(chelatingagent)、螯合剂(chelatingagent)、络合剂(complexingagent)、或可与如钙和镁等金属离子形成水溶性复合物的螯合剂(sequesteringagent)。螯合作用描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于类似的一组非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。螯合剂具有与金属离子特别是钙(Ca2+)离子的结合能力，并广泛应用于洗涤剂，和一般用于洗涤如洗衣或洗碟的组合物。然而，螯合剂自身呈现出抑制酶活性。在本申请中，术语螯合剂(chelatingagent)与“络合剂(complexingagent)”或“螯合剂(chelatingagent)”或“螯合剂(chelant)”互换使用。

由于大多数α-淀粉酶具有钙敏感性，螯合剂的存在可影响酶活性。α-淀粉酶的钙敏感性可通过将给定α-淀粉酶在强螯合剂的存在下温育，并分析该温育对所述α-淀粉酶的活性的影响来确定。钙敏感性α-淀粉酶会在温育过程中丧失其活性的主要部分或全部。该螯合剂可以按一个量值存在于该组合物中，该量值为从0.0001wt％至20wt％、优选地从0.01至10wt％、更优选地从0.1至5wt％。

强螯合剂可以是但不限于以下各项：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTMPA、DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙烯二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)和次氨基三乙酸(NTA)或其混合物。螯合剂可以按它们的酸形式或盐存在，优选地，螯合剂可以作为钠盐、铵盐或钾盐存在。

表征螯合剂：如所提及的，螯合效应(chelateeffect或chelatingeffect)描述了与相似的非螯合配体对于金属离子的亲和力相比，螯合配体对于相同的金属离子具有增强的亲和力。然而，该螯合作用的强度可通过多种类型的测定或测量方法决定，由此根据其螯合作用(或强度)对螯合剂进行区分和排位。

在一个测定中，螯合剂可以通过它们在pH8.0下将游离钙离子(Ca2+)的浓度从2.0mM降低至0.10mM或更少的能力来表征，例如通过使用基于由M.K.纳卡拉占(Nagarajan)等人，JAOCS，第61卷，第9期(1984年9月)，第1475-1478页描述的方法的测试。

供参考，一种螯合剂与以该螯合剂相等浓度的EDTA在pH下具有将游离钙离子(Ca2+)浓度从2.0mM降低至0.10mM相同能力，则该螯合剂被称为强螯合剂。

漂白系统

洗涤剂可以含有按重量计0-20％，如大约0％至大约10％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物+餐具洗涤+I&I洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidicacid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，这些系统可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(邻苯二甲酰亚胺基)过氧己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO2007/087243中。

另外的酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

在一个实施例中，该洗涤剂组合物包括变体，该变体包括：a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性，以及一种或多种另外的酶，其中该一种或多种另外的酶选自下组，该组由以下各项组成：

i.与SEQIDNO:8中的蛋白酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的蛋白酶：32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216；

ii.与SEQIDNO:9中的脂肪酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的脂肪酶：1-5、27、33、38、57、91、94、96、97、111、163、210、225、231、233、249和254-256；

iii.与SEQIDNO:3中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：9、118、149、182、186、195、202、257、295、299、320、323、339、345和458；

iv.与SEQIDNO:6中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：140、195、和206、243、260和476；

v.与SEQIDNO:7中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：180、181、243和475；

vi.与SEQIDNO:10中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：178、179、187、203、458、459、460和476；

vii.与SEQIDNO:1中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括修饰的α-淀粉酶：202；

viii.与SEQIDNO:11中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：405、421、422和428；和/或

ix.根据SEQIDNO:2的α-淀粉酶。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及WO99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO2002/099091的SEQIDNO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO2001/062903的SEQIDNO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(NovozymesA/S))、CarezymePremium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和PuradaxHA^TM(杰能科国际公司(GenencorInternationalInc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US7262042和WO09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO92/175177、WO01/016285、WO02/026024以及WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO89/06270、WO94/25583和WO05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO92/21760、WO95/23221、EP1921147以及EP1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO07/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO92/19729、WO96/034946、WO98/20115、WO98/20116、WO99/011768、WO01/44452、WO03/006602、WO04/03186、WO04/041979、WO07/006305、WO11/036263、WO11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,RS103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenz^Tm、PurafectPurafectPurafectEffectenz^Tm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-BrocasesN.V.))、BLAP(序列示于US5352604的图29中)及其变体(汉高股份(HenkelAG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO95/06720&WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO12/137147)。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508以及WO09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE7家族的过水解酶(WO09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(HuntsmanTextileEffectsPteLtd)的商业产品GentlePowerBleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。

淀粉酶：可以与本发明的变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO95/10603中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO94/18314、WO97/43424以及WO99/019467的SEQIDNO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO02/010355中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO2006/066594的SEQIDNO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQIDNO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO99/019467中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO96/023873的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的那些或其与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO96/023873的SEQID2用于编号，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO08/153815中的SEQIDNO:2、WO01/66712中的SEQIDNO:10的淀粉酶或其与WO08/153815的SEQIDNO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQIDNO:10具有90％序列一致性的变体。WO01/66712中的SEQIDNO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO09/061380中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:2具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQIDNO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQIDNO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO01/66712中的SEQIDNO:12的α-淀粉酶或与SEQIDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQIDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO2011/098531、WO2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、特妙淀粉酶^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、LiquozymeX及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、ExcellaseS、PreferenzS100及PreferenzS110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternationalInc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶：根据本发明的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC1.11.1.7包括的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。

适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP179,486)，及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602以及WO98/15257中描述的那些。

根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。

在一个实施例中，本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的一个优选方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。

已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceoushyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，比如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。

还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。

在一个优选实施例中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvulariaverruculosa)和不等弯孢，例如如描述于WO95/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO97/04102中的疣枝弯孢CBS147.63或疣枝弯孢CBS444.70；或可源自如描述于WO01/79459中的Drechslerahartlebii，如描述于WO01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiellasalina)、如描述于WO01/79461中的Phaeotrichoconiscrotalarie或如描述于WO01/79460中的Geniculosporiumsp.。

根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC1.3.3.5)。

优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。

来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP2238885)。

来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。

优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO95/33836中。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆体等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆体。

非尘颗粒可以例如如在US4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker)。

染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0,01％至约0,5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-GeigyAG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的ParawhiteKX，由派拉蒙矿物与化学(ParamountMineralsandChemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污垢释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些污垢释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污垢释放聚合物是包括一个核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO2006/108856以及WO2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP1867808或WO2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装置的形式。

袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(ChrisCraftIn.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US2009/0011970A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

洗衣皂条

本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combobar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将固体物体(例如洗衣皂条)放置于容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。

洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4+并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO09/092699、EP1705241、EP1382668、WO07/001262、US6472364、WO04/074419或WO09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO09/124162、WO09/124163、WO09/117340、WO09/117341、WO09/117342、WO09/072069、WO09/063355、WO09/132870、WO09/121757、WO09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO09/087033、WO09/050026、WO09/047125、WO09/047126、WO09/047127、WO09/047128、WO09/021784、WO09/010375、WO09/000605、WO09/122125、WO09/095645、WO09/040544、WO09/040545、WO09/024780、WO09/004295、WO09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO09/074403、WO09/068501、WO09/065770、WO09/021813、WO09/030632以及WO09/015951。

WO2011025615、WO2011016958、WO2011005803、WO2011005623、WO2011005730、WO2011005844、WO2011005904、WO2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO2011005905、WO2011005910、WO2011005813、WO2010135238、WO2010120863、WO2010108002、WO2010111365、WO2010108000、WO2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO2010033746、WO2010033747、WO2010033897、WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO2010024470、WO2010025161、WO2010014395、WO2010044905、WO2010145887、WO2010142503、WO2010122051、WO2010102861、WO2010099997、WO2010084039、WO2010076292、WO2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO2010057784、WO2010054986、WO2010018043、WO2010003783、WO2010003792、WO2011023716、WO2010142539、WO2010118959、WO2010115813、WO2010105942、WO2010105961、WO2010105962、WO2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO2010072456、WO2010069905、WO2010076165、WO2010072603、WO2010066486、WO2010066631、WO2010066632、WO2010063689、WO2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO2010000636。

产生组合物的方法

本发明还涉及产生组合物的方法。该方法可以与洗涤剂组合物的(存储)稳定性相关：例如，肥皂条预混方法WO2009155557。

用途

本发明针对用于使用α-淀粉酶变体或其组合物在清洁过程例如衣物洗涤或包括自动化餐具洗涤的硬表面清洁中的方法。因此，在一个实施例中，用于使用α-淀粉酶变体或其组合物的方法包括使用变体或包括变体的组合物，其中该变体包括a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代；以及b)在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：L63、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、N311、F343、和N418，其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置，并且其中该α-淀粉酶变体与具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的多肽中的任一个具有至少90％，例如至少92％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中在清洁过程例如衣物洗涤或包括自动化餐具洗涤的硬表面清洁中该变体具有α-淀粉酶活性。对于清洁而言重要的污物和污渍由许多不同物质构成，并且已经开发全都具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用的清洁过程中特异性地改善污渍去除。本领域已知的去污酶包括以下酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶。

在一个方面中，本发明涉及本发明的α-淀粉酶变体在洗涤剂组合物中用于在清洁硬表面中使用(例如餐具洗涤)，或在洗衣中或用于去污的用途。

本发明的另一个方面是在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中使用包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及任选地一种或多种选自以下清单的洗涤剂组分的洗涤剂组合物，该清单包括助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。

一个另外的方面是在洗涤剂组合物或洗涤剂应用中使用包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及一种或多种选自下组的另外的酶的洗涤剂组合物，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶或其任何混合物。

在另一方面，本发明涉及一种洗衣方法，该方法可用于家用洗衣以及工业洗衣。此外，本发明涉及一种用于洗涤纺织品(例如织物、服装(garment)、衣服(cloth)等)的方法，其中该方法包括用一种洗涤溶液处理该纺织品，该洗涤溶液包含一种洗涤剂组合物以及一种本发明的α-淀粉酶。可以使用家用或工业洗衣机进行洗衣或可以使用一种洗涤剂组合物手动地进行洗衣，该洗涤剂组合物包含本发明的葡糖淀粉酶。

在另一方面，本发明涉及一种餐具洗涤方法，该方法可用于家用餐具洗涤以及工业餐具洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤硬表面(例如，用餐工具，如刀、叉、匙；陶器，如盘子、玻璃杯、碗；以及平底锅)的方法，其中该方法包括用一种洗涤溶液处理该硬表面，该洗涤溶液包含一种洗涤剂组合物以及一种本发明的α-淀粉酶。可以例如使用家用或工业洗碗机洗涤硬表面或使用一种洗涤剂组合物手动地洗涤硬表面，该洗涤剂组合物包含本发明的α-淀粉酶、任选地连同一种或多种选自下组的另外的酶，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或其任何混合物。

在一个另外的方面，本发明涉及一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中的包括本发明的α-淀粉酶变体连同一种或多种表面活性剂以及任选地一种或多种选自以下清单的洗涤剂组分的组合物接触，该清单包括助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。一个另外的方面是一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中包括本发明的α-淀粉酶变体连同一种或多种表面活性剂、一种或多种选自下组的另外的酶的组合物接触，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶或其任何混合物。

方法

α-淀粉酶活性的测定

PNP-G7测定

可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(G₇)-对硝基苯基(G₁)-α,D-麦芽庚糖苷的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放自由PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。

试剂：

来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH7.0)。

α-葡糖苷酶试剂含有52.4mMHEPES、87mMNaCl、12.6mMMgCl₂、0.075mMCaCl₂、>4kU/L的α-葡糖苷酶。

通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mLG7-pNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。

稀释缓冲液：50mMMOPS，0.05％(w/v)TritonX100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n(n＝9-10)))，1mMCaCl2，pH8.0。

程序：

将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD405nm下在5分钟内每20秒测量吸收。

在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。

Phadebas活性测定

α-淀粉酶活性还可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(MagleLifeSciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。

将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。37℃下孵育15分钟。通过添加30μl1MNaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。

淀粉酶样品应稀释成使得620nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。

还原糖活性测定

α-淀粉酶活性还可通过使用例如玉米淀粉底物的还原糖测定来确定。通过与p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的多个还原端。与PHBAH反应之后，可通过405nm下的吸光度来测量还原端的数量并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。

使玉米淀粉底物(3mg/mL)在milliQ水中蒸煮5分钟来溶解并且在测定之前冷却。关于终止液，制备一种Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液(K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)8087)50g/l，NaOH20g/l)并且通过将p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，西格玛(Sigma)H9882)添加至Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液至15mg/mL来新鲜制备终止液。

在PCR-MTP中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释酶并且混合。在PCR机器中在所需温度孵育5分钟。通过添加75μl终止液(Ka-Na-酒石酸盐/NaOH/PHBAH)来停止反应。在PCR机器中在95℃孵育10分钟。将150μl转移至新MTP并且测量405nm下的吸光度。

淀粉酶样品应稀释成使得405nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。

测定

为了确定残余淀粉酶活性，可以使用Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651，英杰公司(Invitrogen)，拉霍亚(LaJolla)，加州(CA)，美国(USA))。

底物是一种玉米淀粉衍生物，DQ^TM淀粉，它是用FL染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升50mM乙酸钠(pH4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下、黑暗中保持，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mMCaCl₂，pH5.5，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mMCaCl₂，pH5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mM乙酸盐、0.01％(W/v)X100、0.125mMCaCl₂，pH5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。

为了测定，在一个黑色384孔微量滴定板中，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶混合10秒。在每个孔中在25℃于15分钟内每分钟测量荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并且将V_max计算作为荧光强度相对于时间的曲线的斜率。曲线应是线性的，并且调整了残余活性测定以使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。

参照α-淀粉酶

参照α-淀粉酶应是具体变体的亲本α-淀粉酶。

实例

实例1：在40℃下与包含螯合剂的洗涤剂一起孵育后的残余活性

在具有螯合剂的洗涤剂中的淀粉酶变体的稳定性的测试

通过如以下所描述的G7-pNP测定确定本发明变体的(残余的)淀粉酶活性。通常，在标准洗涤剂A中的残余淀粉酶活性是在40℃下孵育113小时后确定的；然后将该活性与在4℃下孵育113小时后的参照(亲本)的活性如以下所描述的并且用G7pNP(从罗氏公司(Roche-AMYL)试剂盒)测定试剂盒进行比较。

G7-pNP测定的详细说明

用于这一测定的底物是5亚乙基G₇-pNP(4,6-亚乙基(G7)-1,4-硝基苯基-(G1)-α,D-麦芽七糖苷)，它是可由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。借助于包括在试剂盒中的α-葡糖苷酶，将降解产物进一步降解，以释放对硝基苯酚(100％生色团释放)。对硝基苯酚具有黄色并且因此可以在405nm下以光度测定来测量。形成的对硝基苯酚的颜色强度与α-淀粉酶活性成正比。含有α-葡糖苷酶和G7-pNP的试剂盒由罗氏/日立(Roche/Hitachi)(AMYL，产品目录号：11876473)制造。该测定可以容易地在384孔板中进行。向20μl的经稀释样品中添加80μl的G7-pNP底物工作溶液。在405nm处在室温(25℃)下以1分钟为间隔持续15分钟测量反应动力学，并且将V_max计算为吸光度相对于时间的曲线的斜率。在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。将蛋白质浓度确保为使得该曲线图是线性的。

试剂：

试剂盒具有两种组分，R1和R2。R1包含52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸，pH7.0)缓冲液，87mMNaCl，12.6mMMgCl，0.075mMCaCl₂和≥4kU/Lα-葡糖苷酶。R2包含52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸，pH7.0)缓冲液，22mM4,6-亚乙基-G7-pNP。该G7-pNP底物工作溶液是通过将R1和R2组分以6.6ml和1.6ml的比率混合并且使用底物稀释缓冲液稀释整个溶液1:1而制备的。此溶液就在使用之前制成。底物稀释缓冲液是52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸，pH7.0)缓冲液。样品稀释缓冲液包含100mMMOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，pH7.8。洗涤剂组合物是标准洗涤剂A(参见下表D)。将它作为100％。螯合剂储备液是6％EDTA，pH8.0。

程序：

一式三份将5μl的纯化的蛋白(按在50mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)pH8+1mM氯化钙中的1.6mg/ml浓度)添加至两个96孔未经灭菌的测定板(Nunc，目录号：12565226)中，随后添加90μl的标准洗涤剂A和5μl的6％EDTA。将一个平板在40℃下孵育113小时(被称为应激板)并且将另一个平板(被称为非应激板)在4℃下保持相同时间。孵育后，将来自对应孔的10μl样品转移至新鲜MTP中，并且向其中添加110μl的样品稀释缓冲液，以1000RPM充分混合5min。然后将20μl的经稀释的样品转移至测定板(384孔，Nunc板，目录号1256853)并且如以上所描述的进行G7-pNP测定。在相同的384孔板上确定应激和非应激样品两者的活性。确保参照亲本淀粉酶包括在所有测试微量滴定板上。残余活性被计算为100*Vmax(应激样品)/Vmax(非应激样品)。RA(样品)/RA(参照)的比率被表示为在40℃的改进因子(IF)。

实例2：在45℃下与包含螯合剂的洗涤剂一起孵育后的残余活性

在具有螯合剂的洗涤剂中的淀粉酶变体的稳定性的测试

可以通过如以上在实例1中所述的G7-pNP测定，进一步确定本发明的变体的(残余)淀粉酶活性，除了孵育温度是在45℃持续113小时。同样地，将参照亲本α-淀粉酶在45℃孵育，持续相同时段。RA(样品)/RA(参照)的比率被表示为在45℃的改进因子(IF)。

实例3：在48℃下与包含螯合剂的洗涤剂一起孵育后的残余活性

在具有螯合剂的洗涤剂中的淀粉酶变体的稳定性的测试

可以通过如以上在实例1中所述的G7-pNP测定，进一步确定本发明的变体的(残余)淀粉酶活性，除了孵育温度是在48℃持续113小时。同样地，将参照亲本α-淀粉酶在48℃孵育，持续相同时段。RA(样品)/RA(参照)的比率被表示为在48℃的改进因子(IF)。

使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能

为了评定α-淀粉酶在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。

洗涤性能总体描述

制备一种测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH)、0.79g/l洗涤剂(例如，如下文描述的标准洗涤剂J)和处于浓度0或0.2mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加带有淀粉污渍的织物(来自测试材料中心BV的CS-28，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将它们在15℃和30℃洗涤20分钟，或可替代地在15℃和40℃洗涤20分钟，如在实例中详细说明的那样。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA洗涤性能实验可以在以下详细说明的实验条件下实施：

表A：实验条件

洗涤剂	液体标准洗涤剂J(参见表B)
		洗涤剂剂量	0.79g/L
测试溶液体积	160μL
		pH	按原来的情况
洗涤时间	20分钟
		温度	15℃或30℃
水硬度	6°dH
		测试中的酶浓度	0.2mg酶蛋白/L
测试材料	CS-28(大米淀粉棉)

表B：标准洗涤剂J

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS	5.15	5.00
AS	5.00	4.50
			AEOS	14.18	10.00
可可脂肪酸	1.00	1.00
			AEO	5.00	5.00
MEA	0.30	0.30
			MPG	3.00	3.00
乙醇	1.50	1.35
			DTPA(作为Na5盐)	0.25	0.10
柠檬酸钠	4.00	4.00
			甲酸钠	1.00	1.00
氢氧化钠	0.66	0.66
			H₂O，离子交换	58.95	58.95

通过将CaCl₂、MgCl₂、以及NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝2:1:4.5)添加至测试系统中，要将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表C：实验条件

洗涤剂	液体标准洗涤剂A(参见表D)
		洗涤剂剂量	3.33g/L
测试溶液体积	160μL
		pH	按原来的情况
洗涤时间	20分钟
		温度	15℃或40℃
水硬度	15°dH
		测试中的酶浓度	0.2mg酶蛋白/L
测试材料	CS-28(大米淀粉棉)

表D：标准洗涤剂A

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS	12.00	11.60
AEOS，SLES	17.63	4.90
			大豆脂肪酸	2.75	2.48
可可脂肪酸	2.75	2.80
			AEO	11.00	11.00
氢氧化钠	1.75	1.80
			乙醇/丙-2-醇	3.00	2.70/0.30
MPG	6.00	6.00
			甘油	1.71	1.70
TEA	3.33	3.30
			甲酸钠	1.00	1.00
柠檬酸钠	2.00	2.00
			DTMPA	0.48	0.20
PCA	0.46	0.18
			苯氧基乙醇	0.50	0.50
H₂O，离子交换	33.64	33.64

通过将CaCl₂、MgCl₂、和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，要将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表E：实验条件

表F：标准洗涤剂X

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS	16.50	15.00
AEO*	2.00	2.00
			碳酸钠	20.00	20.00
硅酸二钠	12.00	9.90
			沸石A	15.00	12.00
硫酸钠	33.50	33.50
			PCA	1.00	1.00

*将标准洗涤剂X混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO单独地添加。

通过将CaCl₂、MgCl₂、以及NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝2:1:4.5)添加至测试系统中，要将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

I n t = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}}

纺织品：

纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自试验材料

BV中心，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。

Claims

1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，包含

a)在对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184的两个或更多个位置处的缺失和/或取代，以及

b)在一个或多个位置处的取代，所述取代选自下组，该组由以下各项组成：

A113M；R，W；I；L，

M116F；Y；L，

N128C，

G133N，

R142H；V；L；Q；I，

R172M，

L173Y，

N174S；E，

A186E；N；Q；S，

N195Y；H；K；L；F，

H210M；D；C；A；Q；S；F；N；E；T，

E212T；R；S；V；L；Y；R；T；G，

V214Q；P；R；F；C；G；A；D；E；H；K；L；M；N；S；T；Y，特别是V214T

L217M；Q；V；I；H，特别是L217V，

N260E，N311R，F343W和N418C，

2.根据权利要求1所述的变体，其中a)包括对应于R181+G182、R181+H183、R181+G184、G182+H183、G182+G184或H183+G184的氨基酸的成对缺失。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的两个或更多个。

4.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的三个或更多个。

5.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的四个或更多个。

6.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括所述取代中的五个或更多个。

7.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中b)包括选自下组的取代或由其组成，该组由以下各项组成：

M105L+I206Y，

M105L+I206Y+L217I，

M105I+I206Y，

M105F+I206Y+M208Y+L217V+T246V，

M105F+I206Y，

M105L+I206F，

M105I+I206Y+M208Y+L217I+T246V，

M105I+I206Y+T246I，

N195F+V213S+V214T，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+V213S+V214T，

N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T+L217M，

N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217M，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217Q，

N195F+I206Y+V213G+V214T，

N195F+I206Y+V213S，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，

N195F+V213S，

N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217M，

N195F+V213G+V214T，

I206Y+M208Y+L217Q，

I206F+M208Y+L217Q，

I206Y+M208Y+L217I，

I206F+M208Y+L217M，

I206Y+M208Y，

I206Y+L217M，

I206Y+M208Y+V213A+L217M，

I206Y+M208Y+L217V+T246V，

I206Y+V213G，

I206Y+M208F+L217V，

I206N+M208Y+L217M，

I206F+M208Y+L217V，

I206Y+T246V，

I206Y+L217I，

I206Y+L217V，

I206F+M208F+L217I，

I206Y+M208L+V213S，

I206F+L217I，

I206Y+L217I+T246I，

I206L+L217V，

I206Y+M208F+L217H，

I206L+M208F+L217I，

I206L+L217V+T246L，

I206F+T246V，

M208Y+V213S+L217M，

M208Y+V213A+L217Q，

L63I+I206Y，

L63I+I206Y+I241V，

L63V+I206Y，

L63V+M105L+I206Y，

L63V+I206Y+L217I，

L63V+M105F+I206Y+M208F+L217I，

L63V+I206Y+T246V，

L63V+I206F，

L63V+I206L+L217V，

L63V+M105F+I206Y，

L63V+I206Y+I241V+T246L，

N195F+I206Y+M208Y+V214T+L217V，

A186E+N195F+I206Y，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+L217V，

A186E+N195F+A202T+I206Y+P209S，

L63I+N195F+I206Y+H210S，

N195F+I206Y+V213P+V214T，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217I，

A186E+N195F+I206Y+H210S，

N195F+V213P，

A186E+N195F+A202T+I206Y+H210S，

N195F+I206H，

N195F+M208Y+V213T+V214T+L217V，

I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+L217V，

N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T，

N195F+I206Y+M208Y，

N195F+V213I+V214P，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T，

N195F+I206Y，

I206Y+V213S，

G182P+A186E，

G182S+A186E，

G182V+A186K，

K179L+A186H+E190P，

K179L+A186K+E190P，

K179L+A186R+E190P，

K179L+A186S+E190P，

K179L+E190P，

K179L+G182C+A186K+E190P，

K179L+G182P+A186S+E190P，

K179L+G182P+A186V+E190P，

K179L+G182S+A186Q+E190P，

L173F+N174Q，

L173Y+N174S，

R172K+L173Y+N174E，

T193A+N195F，

T193D+N195F，

T193N+N195F，

T193S+N195F，

V213A+V214Q，

V213P+V214L，，

V213S+V214R，

W48V+A60V，

V213G+V214T，

V213I+V214P，

V213N+V214I，

V213N+V214Q，

V213P+V214T和

V213S+V214T。

8.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶与SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6中任一项的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列一致性。

9.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶具有SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6中任一个的氨基酸序列。

10.根据以上权利要求中任一项所述的变体，在洗涤剂组合物中该变体相对于具有与该变体相同的a)的改变但不具有b)的改变的亲本α-淀粉酶具有改进的稳定性。

11.根据以上权利要求中任一项所述的变体，在洗涤剂组合物中该变体相对于SEQIDNO:1的亲本α-淀粉酶具有改进的稳定性。

12.根据权利要求10或11中任一项所述的变体，其中该洗涤剂是液体洗涤剂组合物或粉状洗涤剂组合物。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的变体，其中该组合物包括螯合剂，优选强螯合剂。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的变体，其中根据实例1确定该改进的稳定性。

15.根据权利要求13所述的变体，其中当在21℃和pH8.0下测量时，处于低于10mM浓度的该螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.10mM。

16.根据以上权利要求中任一项所述的变体，在包含小于0.05mM游离钙离子的组合物中该变体具有改进的稳定性，其中该改进是相对于SEQIDNO:1的多肽或相对于具有与该变体相同的a)的改变但不具有b)的改变的SEQIDNO:1的多肽而言的。

17.一种编码根据权利要求1至16中任一项所述的变体的多核苷酸。

18.一种包含根据权利要求17所述的多核苷酸的核酸构建体。

19.一种包含根据权利要求17所述的多核苷酸的表达载体。

20.一种包含根据权利要求17所述的多核苷酸的宿主细胞。

21.一种生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：

a)在适合于表达该变体的条件下培养根据权利要求20所述的宿主细胞；并且

b)回收该变体。

22.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括向与SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的亲本α-淀粉酶引入以下各项

a)在该亲本α-淀粉酶中的两个或更多个位置的取代和/或缺失，所述位置对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184，以及

b)在一个或多个位置处的取代，所述取代对应于SEQIDNO:1的位置L63、M105、A113、M116、R118、N128、Q129、G133、A139、R142、R172、L173、N174、A186、E190、N195、A204、I206、H210、P211、E212、V213、V214、L217、Y243、S244、T246、N260、Q280、N311、F343、D418、S419和S420，其中所得变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6中任一个的氨基酸序列具有至少90％，例如至少95％、例如至少97％但小于100％的序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收该变体。

23.一种改进具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％序列一致性的亲本α-淀粉酶的稳定性、特别是洗涤剂稳定性、优选液体洗涤剂稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：

a)取代和/或缺失在该亲本α-淀粉酶中的两个或更多个位置，所述位置对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置R181、G182、H183和G184，并且

b)向该亲本α-淀粉酶引入以下取代中的一种或多种

M105L+I206Y，

M105L+I206Y+L217I，

M105I+I206Y，

M105F+I206Y+M208Y+L217V+T246V，

M105F+I206Y，

M105L+I206F，

M105I+I206Y+M208Y+L217I+T246V，

M105I+I206Y+T246I，

N195F+V213S+V214T，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+V213S+V214T，

N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T+L217M，

N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+M208F+V213T+V214T+L217M，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217Q，

N195F+I206Y+V213G+V214T，

N195F+I206Y+V213S，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217M，

N195F+V213S，

N195F+I206Y+M208L+V213T+V214T+L217M，

N195F+V213G+V214T，

I206Y+M208Y+L217Q，

I206F+M208Y+L217Q，

I206Y+M208Y+L217I，

I206F+M208Y+L217M，

I206Y+M208Y，

I206Y+L217M，

I206Y+M208Y+V213A+L217M，

I206Y+M208Y+L217V+T246V，

I206Y+V213G，

I206Y+M208F+L217V，

I206N+M208Y+L217M，

I206F+M208Y+L217V，

I206Y+T246V，

I206Y+L217I，

I206Y+L217V，

I206F+M208F+L217I，

I206Y+M208L+V213S，

I206F+L217I，

I206Y+L217I+T246I，

I206L+L217V，

I206Y+M208F+L217H，

I206L+M208F+L217I，

I206L+L217V+T246L，

I206F+T246V，

M208Y+V213S+L217M，

M208Y+V213A+L217Q，

L63I+I206Y，

L63I+I206Y+I241V，

L63V+I206Y，

L63V+M105L+I206Y，

L63V+I206Y+L217I，

L63V+M105F+I206Y+M208F+L217I，

L63V+I206Y+T246V，

L63V+I206F，

L63V+I206L+L217V，

L63V+M105F+I206Y，

L63V+I206Y+I241V+T246L，

N195F+I206Y+M208Y+V214T+L217V，

A186E+N195F+I206Y，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+L217V，

A186E+N195F+A202T+I206Y+P209S，

L63I+N195F+I206Y+H210S，

N195F+I206Y+V213P+V214T，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217I，

A186E+N195F+I206Y+H210S，

N195F+V213P，

A186E+N195F+A202T+I206Y+H210S，

N195F+I206H，

N195F+M208Y+V213T+V214T+L217V，

I206Y+M208Y+V213T+V214T+L217V，

N195F+I206Y+L217V，

N195F+I206Y+M208Y+V213S+V214T，

N195F+I206Y+M208Y，

N195F+V213I+V214P，

N195F+I206Y+M208Y+V213T+V214T，

N195F+I206Y，

I206Y+V213S，

G182P+A186E，

G182S+A186E，

G182V+A186K，

K179L+A186H+E190P，

K179L+A186K+E190P，

K179L+A186R+E190P，

K179L+A186S+E190P，

K179L+E190P，

K179L+G182C+A186K+E190P，

K179L+G182P+A186S+E190P，

K179L+G182P+A186V+E190P，

K179L+G182S+A186Q+E190P，

L173F+N174Q，

L173Y+N174S，

R172K+L173Y+N174E，

T193A+N195F，

T193D+N195F，

T193N+N195F，

T193S+N195F，

V213A+V214Q，

V213P+V214L，，

V213S+V214R，

W48V+A60V，

V213G+V214T，

V213I+V214P，

V213N+V214I，

V213N+V214Q，

V213P+V214T和

V213S+V214T

当使用SEQIDNO:1的成熟多肽进行编号时，其中所得变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6的成熟多肽具有至少90％，例如至少95％、例如至少97％但小于100％的序列一致性，并且其中该所得变体具有α-淀粉酶活性并且与该亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤剂稳定性。

24.根据权利要求22或23中任一项所述的方法，其中该变体具有以下亲本α-淀粉酶的至少50％例如至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的活性，该亲本α-淀粉酶具有SEQIDNO:1、2、3、4、5、或6的氨基酸序列。

25.根据权利要求22或23中任一项所述的方法，其中根据在方法部分中描述的G7-pNP测定来确定该活性。

26.一种组合物，包括根据权利要求1至16中任一项所述的变体。

27.根据权利要求26所述的组合物，该组合物是洗涤剂组合物，例如液体洗涤剂组合物或粉状洗涤剂组合物。

28.根据权利要求26或27中任一项所述的组合物，该组合物是液体洗衣组合物或液体餐具洗涤组合物，例如ADW液体洗涤剂组合物。

29.根据权利要求1至16中任一项所述的变体在清洁过程，例如衣物洗涤或包括自动化餐具洗涤的硬表面清洁中的用途。