CN109563498A

CN109563498A - 包含黄原胶裂解酶变体i的洗涤剂组合物

Info

Publication number: CN109563498A
Application number: CN201780049451.6A
Authority: CN
Inventors: N·穆斯曼; S·威兰; D·赫布斯特; L·安德森; J·E·尼尔森; A·斯文森; R·N·蒙拉兹; R·K·塞纳森; G·H·门德斯; S·达拉尔; S·阿加瓦尔; K·D·兰德; P·F·延森
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2019-04-02
Also published as: KR20190045095A; US20190185790A1; AU2017317563A8; AU2017317563B8; AU2017317563B2; US11001827B2; KR102483218B1; WO2018037064A1; EP3504331A1; AU2017317563A1

Abstract

本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物和所述组合物的使用方法。

Description

包含黄原胶裂解酶变体I的洗涤剂组合物

序列表的提及

本申请包含以计算机可读形式的序列表，其引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及洗涤剂组合物，例如洗衣组合物和餐具洗涤组合物，包括洗手和自动餐具洗涤组合物，其包含新型黄原胶裂解酶变体，其在一种或多种特性中显示出相对于亲本黄原胶裂解酶的改变，所述特性包括：洗涤剂稳定性(例如在螯合剂如EDTA或柠檬酸盐的存在下，例如洗涤剂组合物中改善的稳定性)、和/或贮存稳定性(例如在螯合剂如EDTA或柠檬酸盐的存在下，例如洗涤剂组合物中改善的贮存稳定性)。本发明进一步涉及包含对黄原胶具有活性的新型黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物。本发明还涉及用于生产所述洗涤剂组合物的方法和所述洗涤剂组合物在清洁应用中的用途。

背景技术

黄原胶是源自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestri)的细菌外壳的多糖。它通过野油菜黄单胞菌细菌的葡萄糖、蔗糖或乳糖发酵而产生。在发酵期后，用异丙醇将多糖从生长培养基中沉淀出来，干燥且研磨成细粉。然后，将其加入液体培养基中以形成胶。黄原胶是由不同的糖组成的天然多糖，所述不同的糖通过几种不同的键连接，如β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡糖醛酸基键和β-D-葡萄糖基-β-D-1,4-葡糖基键。黄原胶至少部分溶解于水中，并且形成高粘性溶液或凝胶。黄原胶的完全酶促降解需要几种酶促活性，包括黄原胶裂解酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡糖醛酸基键的酶，并且已在文献中得到描述。黄原胶裂解酶是本领域已知的，例如，已从解藻酸类芽孢杆菌(Paenibacillus alginolyticus)XL-1中分离出两种黄原胶裂解酶(例如Ruijssenaars等人(1999)‘A pyruvated mannose-specific xanthan lyaseinvolved in xanthan degradation by Paenibacillus alginolyticus XL-1’，Appl.Environ.Microbiol.65(6)：2446-2452，以及Ruijssenaars等人(2000)，‘A novelgene encoding xanthan lyase of Paenibacillus alginolyticus strain XL-1’，Appl.Environ.Microbiol.66(9)：3945-3950)。糖苷水解酶是催化糖基键水解以释放较小糖的酶。存在已进行分类的超过100类糖苷水解酶，参见Henrissat等人(1991)‘Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities’，J.Biochem.280：309-316和在www.cazy.org处的Uniprot网站。糖苷水解酶家族9(GH9)由超过70种不同的酶组成，所述酶主要是内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)和外切-β-氨基葡糖苷酶(EC3.2.1.165)。近年来，黄原胶已被用作许多消费品中的成分，所述消费品包括食品(例如作为色拉调料和乳制品中的增稠剂)、以及化妆品(例如作为牙膏和化妆产品、乳膏和洗剂中的稳定剂和增稠剂，用于防止成分分离且提供产品的正确质地)。进一步的黄原胶已在石油工业中用作添加剂，以调节钻井液的粘度等。黄原胶的广泛使用已导致降解含有黄原胶的溶液、凝胶或混合物的需要，从而允许更容易地去除副产物。用于降解黄原胶的黄原胶裂解酶和内切葡聚糖酶，以及这些酶用于清洁目的例如去除含黄原胶的污渍、以及在钻井和石油工业中的用途是已知的，例如WO2013167581A1。

发现具有SEQ ID NO：2的已知黄原胶裂解酶对具有螯合剂的洗涤剂的存在是敏感的。为了改善此类酶的适用性和/或成本和/或性能，一直在寻找具有改变的特性的变体，所述特性例如在螯合剂例如EDTA或柠檬酸盐的存在下例如增加的稳定性，例如在洗涤剂组合物中改善的稳定性等。然而，随后为突变体文库的纯化和功能分析所需的大型酶的诱变可能是非常昂贵和费力的。

发明内容

因为具有SEQ ID NO：2的已知黄原胶裂解酶是大型酶(>1000个残基)，所以随机靶向其特性用于改善例如在螯合剂的存在下，例如在洗涤剂组合物中的稳定性是困难和昂贵的。

在一些方面，本发明鉴定了具有SEQ ID NO：2的已知黄原胶裂解酶的蛋白质序列/结构中的螯合剂诱导的不稳定区域，当该分子在具有EDTA的缓冲液中温育时，所述不稳定区域受到影响，并且因此提供了在何处使黄原胶裂解酶突变，以便使分子在洗涤剂例如包含螯合剂的洗涤剂组合物中稳定的重要指导。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，所述不稳定区域选自：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，所述不稳定区域选自：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性。

在一些方面，本发明限定了具有下述特点中的一个或多个的亲本黄原胶裂解酶(例如，SEQ ID NO：2)的螯合剂诱导的不稳定区域：在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域在构象上相对更不稳定；和/或在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域相对更暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域相对更容易接近所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域相对更构象动态；和/或在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域相对更容易接受氘掺入。在本发明中，当提及“相对”时，它意指如上所述的给定区域的特点基于在螯合剂的存在下的其特点和/或特性以及在不存在螯合剂的情况下的其特点和/或特性之间观察到的差异(即为了确定螯合剂的影响，每个区域在不存在螯合剂的情况下与其自身进行比较，并且相对于在不存在螯合剂的情况下的其天然特点/特性确定任何变化)(参见实施例1)。

在一些方面，本发明涉及包含与SEQ ID NO：2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述内切葡聚糖酶变体包含在选自以下的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，例如，在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的所述改变：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO：2的编号)，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，例如，在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的所述改变：614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO：2的编号)，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，例如，在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的所述改变：731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO：2的编号)，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，例如，在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的所述改变：807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO：2的编号)，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，例如，在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的所述改变：872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO：2的编号)，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，例如，在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的所述改变：903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO：2的编号)。在一些方面，前述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自以下的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或所有六个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

在一些方面，本发明涉及洗涤剂组合物黄原胶裂解酶变体，其具有在选自由以下位置组成的组的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：SEQ ID NO：2的155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有选自以下的一个或多个置换：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自以下的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：624、635、649、656、738、753、754、757、769、775、777、801、843和875。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有选自以下的一个或多个取代：A624E、S635E、T649K、I656V、G738L、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、D801G、A843P和K875T。

在本发明的洗涤剂组合物的一些方面，黄原胶裂解酶变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，以及在至少一个相邻区域中的一个或多个位置处的改变。因此，在一些方面，除在如上文和本文其他地方所述的选自区域1、2、3、4、5和6的至少一个区域中的一个或多个位置中的改变之外，黄原胶裂解酶变体进一步包含在选自以下的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

viii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

ix)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

x)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

xi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

xii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

xiii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13。

黄原胶裂解酶变体可以例如包含在选自区域7、8、9、10、11、12和13的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或所有七个区域各自中的一个或多个位置处的改变。

在一些方面，在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变是在选自以下的一个或多个位置处的改变：SEQ ID NO：2的9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016。黄原胶裂解酶变体可以例如包含在这些位置中的两个或更多个，例如，在这些位置中的三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个处的改变。

在一些方面，在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变包括选自以下的一个或多个取代：SEQ ID NO：2的K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T。黄原胶裂解酶变体可以例如包含这些取代中的两个或更多个，例如，所述取代中的三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个。

在本发明的洗涤剂组合物的一些方面，黄原胶裂解酶变体包含在选自区域1、2、3、4、5和6的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变，以及在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变。在一个方面，该变体包含在选自SEQ IDNO：2的位置624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915的一个或多个位置处的改变，以及在选自位置89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016的一个或多个位置处的改变。

变体可以例如包含在选自SEQ ID NO：2的位置624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915的两个或更多个位置，例如三个、四个、五个或更多个位置处的改变，以及在选自位置89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016的两个或更多个位置，例如三个、四个、五个或更多个位置处的改变。

在这方面用于改变的优选位置包括选自SEQ ID NO：2的位置624、635、649、656、738、753、754、757、769、775、777、801、843和875的一个或多个位置，以及选自位置100、190、229、234、360、399、440、458、492、567、582、672、892和1008的一个或多个位置。

在这方面的一个实施方案中，黄原胶裂解酶变体包含选自Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y N1008D和K1016T的一个或多个取代，以及选自A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A的一个或多个取代。该变体可以例如包含选自Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y N1008D和K1016T的两个或更多个取代，例如三个、四个、五个或更多个取代，以及选自A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A的两个或更多个取代，例如三个、四个、五个或更多个取代。该实施方案中的优选取代包括选自S100D、A190Q、E229S、I234V、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、K567R、S582K、N672D、N892Y和N1008D的一个或多个取代，以及选自A624E、S635E、T649K、I656V、G738L、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、D801G、A843P和K875T的一个或多个取代。

这些变体的非限制性实例包括：

·A190Q、E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、I703L、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、I703L、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、V352I、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、V800P、D801G、K875T、N892Y

·E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、T664K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、A911V、N1008D、K1016T

·E229S、I234V、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、V800P、D801G、K875T、N892Y

·Q89Y、E229S、N440K、S582K、A624E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、P752K、G753E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y

·E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·E229S、N440K、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、N440K、S582K、A624E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、V800P、D801G、K875T、N892Y

·A190Q、E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、P752K、G753E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y

·A190Q、E229S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·E229S、N440K、S582K、N672D、P752R、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、S582K、S635E、N672D、P752R、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·A190Q、E229S、N440K、S582K、A624E、S635E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·E229S、I234V、A492L、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、T664K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、T915A、N1008D

·E229S、N440K、S582K、A624E、S635E、N672D、G738L、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·A190Q、E229S、D458S、T631N、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y

·A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S754R、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y

·E229S、D458S、S582K、T631N、S635E、N672D、M728V、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、A492L、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·S100D、A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D

·A190Q、E229S、I234V、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·E229S、N399K、D458S、A492H、K567R、S582K、S635E、T649K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D777R、D801G、K875T、N892Y

·E229S、D458S、A492L、T631N、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y

·E229S、D458S、A492H、K567R、S582K、S635E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D777R、D801G、K875T、N892Y

·S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、N1008D

·E229S、N399K、D458S、K567R、S582K、S635E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D777R、D801G、K875T、N892Y。

在一些方面，本发明涉及包含对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物；优选地，所述活性包含黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，与亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO：2)相比，所述黄原胶裂解酶变体在所述洗涤剂组合物中具有改善的稳定性。

在一些方面，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，相对于亲本黄原胶裂解酶，所述黄原胶裂解酶变体具有>1.0的半衰期改善系数(HIF)。

在一些方面，本发明涉及洗涤剂组合物，其包含根据本发明对黄原胶具有活性的分离的黄原胶裂解酶变体。在一个进一步方面，洗涤剂组合物进一步包含具有GH9内切葡聚糖酶活性的分离的多肽。

在一些方面，本发明的洗涤剂组合物包含用于降解黄原胶的一种或多种洗涤剂组分。

在一些方面，本发明涉及本发明的洗涤剂组合物的用途，其中所述用途选自：用于降解黄原胶的用途、以及在清洁过程例如衣物或硬表面清洁例如餐具洗涤中的用途。

在一些方面，本发明进一步涉及本发明的洗涤剂组合物用于降解黄原胶、或者用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面例如餐具洗涤的用途，其中所述组合物具有酶去垢益处。

在一些方面，本发明还涉及使用本发明的洗涤剂组合物降解黄原胶的方法，其中黄原胶在硬表面或纺织品的表面上。

序列表概述

SEQ ID NO：1是来自类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp)菌株的亲本成熟黄原胶裂解酶的DNA序列。

SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1编码的成熟多肽的氨基酸序列。

定义

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过逆转录从得自真核细胞或原核细胞的成熟、剪接的、mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其通过包括剪接的一系列步骤进行加工，然后作为成熟的剪接mRNA出现。

清洁或洗涤剂应用：术语“清洁或洗涤剂应用”意指将本申请的黄原胶裂解酶施加于任何组合物中，用于通过手工、机器或自动化清洁或洗涤硬表面或纺织品的目的。

清洁组合物：术语“清洁组合物”指用于从待清洁物品中去除不需要的化合物的组合物，所述待清洁物品例如纺织品、餐具和硬表面。该术语涵盖对于所需的特定类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊剂或喷雾组合物)选择的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；以及纺织品和衣物预洁剂(pre-spotter)，以及餐具洗涤清洁剂)。除黄原胶裂解酶之外，洗涤剂制剂还可以含有一种或多种另外的酶(如黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶、或其任何混合物)，和/或组分如表面活性剂、增效剂(builder)、螯合剂或螯合试剂、漂白剂系统或漂白剂组分、聚合物、织物柔顺剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、褐变抑制剂、荧光增白剂、杀菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、抗腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放读码框决定，所述开放读码框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

颜色澄清：在洗涤和穿着过程中，松散或断裂的纤维可以在织物的表面上积聚。一个后果可以是由于表面污染，织物的颜色看起来较不明亮或较不强烈。从纺织品中去除松散或断裂的纤维将部分地恢复纺织品的原始颜色和外观。如本文使用的，术语“颜色澄清”意指纺织品的初始颜色的部分恢复。

控制序列：术语“控制序列”意指对于编码本发明成熟多肽的多核苷酸表达所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自相同的基因)或外源的(即，来自不同的基因)，或者对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子和转录和翻译终止信号。为了引入特定的限制性位点，控制序列可以具有接头，以促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。

对应于：如本文使用的，术语“对应于”指确定序列的特定氨基酸的方式，其中提及特定的氨基酸序列。例如，为了本发明的目的，当提及特定氨基酸位置时，技术人员将能够将另一种氨基酸序列与已提及的所述氨基酸序列比对，以便确定哪种特定氨基酸在所述另一种氨基酸序列中可能是有利的。另一种氨基酸序列与例如如SEQ ID NO：2中所示的序列、或本文列出的任何其他氨基酸序列的比对已在本文其他地方描述。可以使用可替代的比对方法，并且这些方法对于技术人员是众所周知的。

降解黄原胶和黄原胶降解活性：术语“降解黄原胶”和“黄原胶降解活性”可互换使用，并且定义为黄原胶解聚、降解或分解成较小组分。黄原胶的降解可以是一种或多种侧链糖类的去除，黄原胶的主链切割成较小的组分，或一种或多种侧链糖类的去除以及黄原胶的主链切割成较小的组分。用于测量黄原胶降解的优选测定在本文实施例4中描述。黄原胶降解活性的非限制性实例包括黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性。

洗涤剂组分：术语“洗涤剂组分”在本文中定义为意指可以用于洗涤剂组合物中的化学品类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、水溶助剂、增效剂、共增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物着色剂、织物柔顺剂、泡沫促进剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白试剂、香料、荧光增白剂、杀菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、去污聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。洗涤剂组合物可以包含任何类型的洗涤剂组分中的一种或多种。

洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”指用于从待清洁物品中去除不需要的化合物的组合物，所述待清洁物品例如纺织品、餐具和硬表面。洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品、餐具和硬表面，用于家用清洁和工业清洁两者。该术语涵盖对于所需的特定类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊剂或喷雾组合物)选择的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；以及纺织品和衣物预洁剂，以及餐具洗涤清洁剂)。除含有本发明的黄原胶裂解酶和/或GH9内切葡聚糖酶外，洗涤剂制剂还可以含有一种或多种另外的酶(如内切葡聚糖酶、黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣多糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶、或其任何混合物)，和/或组分如表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物柔顺剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、褐变抑制剂、荧光增白剂、杀菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、抗腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。

餐具洗涤：术语“餐具洗涤”指所有形式的餐具洗涤，例如手洗或自动餐具洗涤。餐具洗涤包括但不限于清洁所有形式的餐具，如盘子、杯子、玻璃杯、碗、各种形状的刀叉餐具(如勺子、刀子、叉子和一次性餐具(serving utensil))，以及陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸类塑料(acrylics)。

餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明并不限于任何特定类型的餐具洗涤组合物或任何特定的洗涤剂。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”或“EG”意指内切-1,4-或内切-1,3；1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(例如，EC 3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键合，混合的β-1,3/β-1,4葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖、木葡聚糖、黄原胶和含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。内切葡聚糖酶活性可以通过测量底物粘度中的减少或通过还原糖测定确定的还原末端中的增加来确定(Zhang等人，2006，Biotechnology Advances 24：452-481)。

酶去垢益处：术语“酶去垢益处”在本文中定义为与不含酶的相同洗涤剂相比，酶可添加至洗涤剂的有利效应。可以由酶提供的重要去垢益处是在洗涤和/或清洗之后没有或非常少的可见污垢的污渍去除，防止或减少在洗涤过程中释放的污垢的再沉积，该效应也被称为抗再沉积，完全或部分恢复纺织品的白度，所述纺织品最初是白色，但在反复使用和洗涤后，已获得了灰白或淡黄色的外观，该效应也被称为美白。与催化污渍去除或防止污垢再沉积并不直接相关的纺织品护理益处对于酶去垢益处也是重要的。这样的纺织品护理益处的实例是防止或减少染料从一种织物转移到另一种织物或同一织物的另一部分，该效应也被称为染料转移抑制或防回染，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或者去除已存在的小球或起毛，该效应也被称为抗起球，改善织物柔软性，织物的颜色澄清和去除织物或衣服纤维中捕集的颗粒状污垢。酶促漂白是进一步的酶去垢益处，其中催化活性一般用于催化漂白组分例如过氧化氢或其他过氧化物的形成。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且与提供用于其表达的控制序列可操作地连接。

片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个氨基酸的多肽；其中片段具有黄原胶裂解酶活性。在一个方面，片段含有成熟多肽的氨基酸数目的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。

对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体：术语“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体”、或“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性且属于GH9类糖基水解酶的内切葡聚糖酶”，定义为包含属于GH9类糖基水解酶的结构域，并且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性(例如酶促活性、黄原胶降解活性、内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性)的多肽。

对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体：术语“对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体”定义为切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡糖醛酸基键的多肽(例如，黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性)。用于测量黄原胶活性的优选测定公开于本文实施例4中。对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体的实例是像这样的黄原胶裂解酶多肽。因此，切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡糖醛酸基键的多肽。

半衰期：术语“半衰期”指酶在给定的一组条件下丧失其酶促活性的一半花费的时间。它指示为T_1/2并且以小时(hour)(小时(hr))测量。对于亲本(例如野生型)和/或变体，半衰期可以在给定的洗涤剂浓度和贮存温度下进行计算，因为降解遵循指数衰减并且温育时间(小时)是已知的，即，根据下式：

T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间

T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间

其中‘RA’是以百分比计的残留活性，并且‘时间’是以小时计的温育时间。

半衰期改善系数：术语“半衰期改善系数”或“HIF”是与亲本多肽(例如亲本黄原胶裂解酶)相比，变体的半衰期的改善。在给定的一组贮存条件(洗涤剂浓度和温度)下，半衰期改善系数(HIF)可以如下计算：

其中野生型(wt)在与变体相同的贮存条件(洗涤剂浓度和温育温度)下温育。在其中野生型和变体之间的稳定性差异太大而无法使用相同的温育时间准确地评价关于野生型和变体两者的半衰期的情况下，关于野生型和变体的温育时间是不同的，例如对于野生型1小时和对于最稳定的变体840小时。

硬表面清洁：术语“硬表面清洁”在本文中定义为硬表面的清洁，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，以及硬物体的表面，例如汽车(洗车)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于清洗盘子、杯子、玻璃杯、碗和刀叉餐具例如勺子、刀子、叉子、一次性餐具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸类塑料。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改善的特性：术语“改善的特性”意指与变体相关的特征，所述特征与亲本相比是改善的。此类改善的特性包括但不限于催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、在贮存条件下的稳定性、螯合剂稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性和热稳定性。

改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在本文中定义为相对于亲本蛋白酶变体的洗涤性能，展示蛋白酶变体的洗涤性能的改变的(变体)酶(也是酶的共混物，不一定只是变体，以及主链，并且与某些清洁组合物等组合)，例如通过增加的污渍去除。术语“洗涤性能”包括洗衣以及包括例如在餐具洗涤中的洗涤性能。

分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分去除它与之在自然界中结合的天然存在的组成成分中的一种或多种或全部；(3)相对于在自然界中发现的那种物质，通过人工修饰的任何物质；或(4)相对于它与之天然结合的其他组分，通过增加物质的量来修饰的任何物质(例如编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然结合的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

衣物洗涤：术语“衣物洗涤”涉及家用衣物洗涤和工业衣物洗涤两者，并且意指用含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的方法。衣物洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行，或者可以通过手动进行。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等之后，以其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸1至1037。

本领域已知宿主细胞可以产生由相同的多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽的混合物(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。本领域还已知不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此，与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比，表达多核苷酸的一种宿主细胞可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶促活性的成熟多肽的多核苷酸，所述酶促活性例如对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性或黄原胶裂解酶活性。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸1至3111。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离，或被修饰以包含核酸的区段，其方式为在自然界中否则不存在或是合成的，其包含一个或多个控制序列。

可操作地连接的：术语“可操作地连接的”意指这样的配置，其中控制序列被置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置处，使得控制序列指导编码序列的表达。

亲本：术语“亲本”或“亲本黄原胶裂解酶”意指具有黄原胶裂解酶活性的任何多肽，对其做出改变以产生本发明的酶变体。在一个方面，亲本是这样的黄原胶裂解酶，其具有变体的相同氨基酸序列，但不具有在一个或多个指定位置处的改变。应理解，表述“具有相同的氨基酸序列”涉及100％的序列同一性。亲本黄原胶裂解酶的非限制性实例包括具有SEQ ID NO：2的成熟亲本黄原胶裂解酶。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)进行测定，所述Needleman-Wunsch算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)的Needle程序中实现的，优选版本5.0.0或更高版本。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长的同一性”(使用–nobrief选项获得)的Needle输出用作同一性百分比，并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对的长度–比对中的空位总数目)

为了本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)进行测定，所述Needleman-Wunsch算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，同上)的Needle程序中实现的，优选版本5.0.0或更高版本。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长的同一性”(使用–nobrief选项获得)的Needle输出用作同一性百分比，并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度–比对中的空位总数目)

严格条件：不同的严格条件如下定义。

术语“极低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中的预杂交和杂交，遵循标准的DNA印迹程序共12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，各15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中的预杂交和杂交，遵循标准的DNA印迹程序共12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，各15分钟。

术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中的预杂交和杂交，遵循标准的DNA印迹程序共12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，各15分钟。

术语“中高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中的预杂交和杂交，遵循标准的DNA印迹程序共12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，各15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中的预杂交和杂交，遵循标准的DNA印迹程序共12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，各15分钟。

术语“极高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中的预杂交和杂交，遵循标准的DNA印迹程序共12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，各15分钟。

子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'和/或3'末端缺失的一个或多个核苷酸的多核苷酸；其中所述子序列编码具有酶促活性，例如对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性或黄原胶裂解酶活性的片段。

纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织材料，包括纱线、纱线中间产物、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织材料，由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如服装和其他物品)。纺织品或织物可以以编织物、织造物、牛仔布、非织造物、毛毡、纱线和毛巾料的形式。纺织品可以是基于纤维素的，例如天然纤维素，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维，或人造纤维素(例如源于木浆)，包括粘胶/人造丝、苎麻、乙酸纤维素纤维(tricell)、lyocell或其共混物。该纺织品或织物还可以是非基于纤维素的，例如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼、羊绒、马海毛、兔和丝，或合成聚合物例如尼龙、芳纶、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维、或其共混物，以及基于纤维素的纤维和非基于纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴侣材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳纶纤维)和含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、乙酸纤维素纤维、lyocell)的共混物。织物可以是常规的可洗衣物，例如弄脏的家用衣物。当使用术语织物或服装时，它预期还包括更广义的纺织品。

纺织品护理益处：与催化污渍去除或防止污垢再沉积并非直接相关的“纺织品护理益处”对于酶去垢益处也是重要的。这样的纺织品护理益处的实例是防止或减少染料从一种纺织品转移到另一种纺织品或同一纺织品的另一部分，该效应也被称为染料转移抑制或防回染，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或者去除已存在的小球或起毛，该效应也被称为抗起球，改善纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清和去除纺织品纤维中捕集的颗粒状污垢。酶促漂白是进一步的酶去垢益处，其中催化活性一般用于催化漂白组分例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类的形成。

变体：术语“变体”意指包含在一个或多个位置处的改变，即取代、插入和/或缺失的多肽(例如，黄原胶裂解酶多肽)。取代意指用不同的氨基酸替换占据位置的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；并且插入意指在占据位置的氨基酸附近和紧随其后加入一个或多个氨基酸，例如1-5个氨基酸。本发明的黄原胶裂解酶变体的非限制性实例包括对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体。本发明的变体的非限制性实例进一步包括具有SEQ IDNO：2的成熟亲本黄原胶裂解酶的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％黄原胶裂解酶活性的变体。用于测量对黄原胶的活性的优选测定公开于本文实施例4中。

稳定性：术语“稳定性”意指对变化、解折叠、崩解、变性或活性丧失的抗性或抗性程度。稳定性的非限制性实例包括构象稳定性、贮存稳定性和在使用期间的稳定性，例如在洗涤过程中的稳定性，并且根据时间反映多肽(例如根据本发明的黄原胶裂解酶变体)的稳定性，例如当所述多肽(例如所述黄原胶裂解酶变体)保持在溶液特别是洗涤剂溶液中时，保留多少活性。稳定性受许多因素的影响，例如螯合剂的存在、pH、温度、洗涤剂组合物，例如增效剂、表面活性剂、螯合剂等的量。黄原胶裂解酶稳定性可以如本文实施例4中所述使用半衰期改善系数(HIF)来测量。

改善的稳定性：术语“改善的稳定性”或“增加的稳定性”在本文中定义为相对于亲本黄原胶裂解酶，相对于具有变体的相同氨基酸序列，但在一个或多个特定位置处没有改变的黄原胶裂解酶，或相对于SEQ ID NO：2的稳定性，在洗涤剂组合物中(例如在溶液中，例如在螯合剂例如EDTA或柠檬酸盐的存在下)增加的稳定性。术语“改善的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改善的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”和“改善的洗涤剂稳定性”。

改善的化学稳定性：术语“改善的化学稳定性”在本文中定义为在天然存在或合成的一种或多种化学品的存在下温育一段时间后，展示酶促活性的保留的变体酶，所述温育减少亲本酶的酶促活性。改善的化学稳定性还可以导致变体在此类化学品的存在下更能够(例如，比亲本更好)催化反应。在本发明的一个特定方面，改善的化学稳定性是在洗涤剂特别是液体洗涤剂中改善的稳定性。当将本发明的黄原胶裂解酶变体混合到液体洗涤剂制剂内，尤其是混合到包含螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的液体洗涤剂制剂内时，术语“洗涤剂稳定性”或“改善的洗涤剂稳定性”特别是与亲本黄原胶裂解酶相比改善的黄原胶裂解酶稳定性。

构象稳定性：术语“构象稳定性”意指对构象变化、解折叠或崩解的抗性或抗性程度。相应地，术语“构象上较不稳定的”意指对构象变化、解折叠或崩解的较小抗性或具有较小程度的抗性。

不稳定性：术语“不稳定性”意指稳定性的缺乏。不稳定性的非限制性实例包括构象不稳定性、解折叠、变性、解体、活性丧失。

螯合剂诱导的不稳定区域：术语“螯合剂诱导的不稳定区域”意指在螯合剂的存在下，多肽中促成所述多肽的不稳定性的任何区域。螯合剂的非限制性实例包括EDTA(乙二胺四乙酸)和柠檬酸盐。螯合剂诱导的不稳定区域的非限制性实例包括多肽中具有下述特点中的一个或多个的任何区域：在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域在构象上更不稳定；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更容易接近所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更构象动态；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更容易接受氘掺入。螯合剂诱导的不稳定区域的非限制性实例进一步包括多肽中负责螯合剂诱导的不稳定性的任何区域。成熟黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO：2)的螯合剂诱导的不稳定区域的非限制性实例包括：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。与成熟黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO：2)的螯合剂诱导的不稳定区域相邻的区域的非限制性实例包括：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13。

相邻区域：术语“相邻区域”意指多肽中并非螯合剂诱导的不稳定区域的任何区域。成熟黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO：2)的相邻区域的非限制性实例包括：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13。

螯合剂暴露：术语“螯合剂暴露”意指到达多肽的螯合剂的浓度或量。相应地，在本发明的上下文中，术语“更暴露于螯合剂”意指特定区域(例如螯合剂诱导的不稳定区域)的螯合剂暴露大于不同区域(例如相邻区域)的螯合剂暴露。在一个方面，螯合剂暴露可以用浓度、持续时间和频率(例如对于化学试剂，例如螯合剂)或强度的数字项来表示。

螯合剂可及性：术语“螯合剂可及性”涵盖对通过螯合剂的影响的开放性和通过螯合剂接近的容易性。相应地，在本发明的上下文中，术语“对螯合剂更易接近”意指特定区域(例如螯合剂诱导的不稳定区域)的螯合剂可及性大于不同区域(例如相邻区域)的螯合剂可及性。

构象动态：术语“构象动态”涵盖多肽(例如在溶液中)的振动、结构重排和转变。相应地，在本发明的上下文中，术语“更构象动态”意指特定区域(例如螯合剂诱导的不稳定性区域)的构象动态大于不同区域(例如相邻区域)的构象动态。

对氘掺入的接受性：术语“对氘掺入的接受性”意指在氢-氘交换期间被氘原子替换的氢原子的量。所述量可以以相对(例如与另一个量相比)或绝对(例如，用数字表示)项来测量。相应地，在本发明的上下文中，术语“更容易接受氘掺入”意指对特定区域(例如螯合剂诱导的不稳定区域)的氘掺入的接受性大于对不同区域(例如相邻区域)的氘掺入的接受性。

洗涤性能：术语“洗涤性能”用作酶去除在例如洗涤或硬表面清洁过程中待清洁物体上存在的污渍的能力。可以通过计算‘用于洗衣的自动机械应力测定(AMSA)’中的所谓强度值(Int)或缓解值(Rem)来定量洗涤性能中的改善。

用于变体命名的惯例

为了本发明的目的，SEQ ID NO：2中公开的成熟多肽用于确定另一种黄原胶裂解酶中的相应氨基酸残基。另一种黄原胶裂解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：2中公开的成熟多肽比对，并且基于比对，对应于SEQ ID NO：2中公开的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)进行确定，如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology OpenSoftware Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)的Needle程序中实施的，优选5.0.0或更高版本。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

另一种黄原胶裂解酶中的相应氨基酸残基的鉴定可以通过使用几种计算机程序比对多重多肽序列来确定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望的多重序列比较；3.5或更高版本；Edgar，2004，Nucleic Acids Research 32：1792-1797)、MAFFT(6.857或更高版本；Katoh和Kuma，2002，Nucleic Acids Research 30：3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic Acids Research 33：511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics 23：372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics 26:1899-1900)、以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更高；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)，使用它们各自的缺省参数。

当其他酶已与SEQ ID NO：2的成熟多肽分歧，使得传统的基于序列的比较无法检测它们的关系(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.295：613-615)时，可以使用其他配对序列比较算法。使用搜索程序可以获得基于序列的搜索中的更高灵敏度，所述搜索程序利用多肽家族的概率表示(概况)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程生成概况，并且能够检测遥远同系物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更高的灵敏度。程序例如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.287：797-815；McGuffin和Jones，2003，Bioinformatics 19：874-881)利用来自各种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对概况和溶剂化电位)的信息，作为预测关于查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.313：903-919的方法，可以用于将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对可以依次又用于生成用于多肽的同源性模型，并且可以使用为此目的开发的各种工具评价此类模型的准确性。

对于已知结构的蛋白质，几种工具和资源可用于检索且生成结构比对。例如，SCOP蛋白质超家族已在结构上比对，并且那些比对是可访问和可下载的。可以使用各种算法比对两种或更多种蛋白质结构，所述算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins33：88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering 11：739-747)，并且这些算法的实现可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同系物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformatics 16：566-567)。

在描述本发明的变体时，修改下文描述的命名法以便于提及。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置，取代的氨基酸。相应地，用丙氨酸取代在位置226处的苏氨酸指定为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表在位置205和411处的甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代和丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法：原始氨基酸，位置，*。相应地，在位置195处的甘氨酸的缺失指定为“Gly195*”或“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用下述命名法：原始氨基酸，位置，原始氨基酸，插入的氨基酸。相应地，在位置195处的甘氨酸后插入赖氨酸指定为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多重氨基酸的插入指定为[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸后插入赖氨酸和丙氨酸指示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。在特定位置处的插入的指示应理解为在原始氨基酸残基之后的插入。例如，“在位置195处的插入”应理解为在位置195中的原始残基之后的插入。

在这种情况下，插入的氨基酸残基通过对插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号添加小写字母进行编号。在上文实例中，序列因此将是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多重改变。包含多重改变的变体通过加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”，分别代表在位置170和195处的精氨酸和甘氨酸被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同的改变。当不同的改变可以在一个位置处引入时，不同的改变通过逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指定下述变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

可替代地，可以使用括号指示不同的改变，例如Arg170[Tyr，Gly]或单字母代码R170[Y,G]。

具体实施方式

具有SEQ ID NO：2的已知黄原胶裂解酶是大型酶(>1000个残基)，因此靶向其特性用于改善例如在螯合剂的存在下，例如在洗涤剂组合物中的稳定性是非常费力和昂贵的。在一些方面，当尝试使用针对选自以下的区域的蛋白质改造稳定黄原胶裂解酶分子时，本发明缩小了靶向的残基数目：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

在一个实施方案中，当尝试使用蛋白质改造稳定黄原胶裂解酶分子时，本发明显著缩小了靶向的残基数目。

变体

在一个实施方案中，具有SEQ ID NO：2的已知黄原胶内切葡聚糖酶的蛋白质序列中的螯合剂诱导的不稳定区域(当分子在具有EDTA的缓冲液中温育时会受到影响)：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。这涉及在何处使黄原胶裂解酶突变，以便使分子在洗涤剂例如包含螯合剂如EDTA或柠檬酸盐的洗涤剂组合物中稳定的重要指导。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自以下的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性；优选地，所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自以下的两个或更多个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性；优选地，所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含如本文所述的亲本黄原胶裂解酶(例如，SEQID NO：2)的洗涤剂组合物，所述亲本黄原胶裂解酶具有在选自区域1-6的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中所述区域是螯合剂诱导的不稳定区域，优选地，所述螯合剂诱导的不稳定区域具有下述特点中的一个或多个：在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域在构象上更不稳定；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更容易接近所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更构象动态；和/或在螯合剂的存在下，它比其一个或多个或全部相邻区域更容易接受氘掺入；进一步优选地，所述相邻区域选自：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，以及对应于SEQID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，进一步最优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

在一个实施方案中，相邻区域可以是下述中的一个或多个或全部：对应于SEQ IDNO：2的氨基酸1至153的区域7，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，对应于SEQID NO：2的氨基酸659至730的区域9，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区域1-6的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，所述区域(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶)对于所述洗涤剂组分比其一个或多个或全部相邻区域相对更容易接近。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区域1-6的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，所述区域(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶)比其一个或多个或全部相邻区域相对更暴露于所述洗涤剂组分。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区域1-6的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，所述区域(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶)比其一个或多个或全部相邻区域相对更构象动态。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区域1-6的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，所述区域(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶)比其一个或多个或全部相邻区域相对更容易接受氘掺入。

在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自以下的两个或更多个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自以下的(例如SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)一个区域中的多重改变(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自以下的(例如SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)多重区域(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)中的多重改变(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地，所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在成熟亲本多肽(例如，SEQ ID NO：2)的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)，其中每个改变独立地是取代、插入或缺失，其中所述变体具有黄原胶裂解酶活性。

在一个实施方案中，变体与亲本黄原胶裂解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含如本文所述的黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体与SEQ ID NO：2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性

在另一个方面，变体包含在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998的一个或多个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998中任一个的两个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998中任一个的三个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998的四个或更多个位置，例如五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位置处的改变。

在另一个方面，变体包含在对应于位置155的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置155的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代Y155E或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置159的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置159的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含取代A159P或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置620的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置620的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代K620R或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置624的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置624的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A624E或由其组成

在另一个方面，变体包含在对应于位置626的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置626的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A626Q或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置631的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置631的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T631N或T631E，或者由其组成。在对应于位置631的位置处的优选取代是T631N。

在另一个方面，变体包含在对应于位置635的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置635的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含取代S635E、S635T或S635Q，或者由其组成。在对应于位置635的位置处的优选取代是S635E。

在另一个方面，变体包含在对应于位置649的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置649的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T649V、T649K或T649R，或者由其组成。在对应于位置649的位置处的优选取代是T649K。

在另一个方面，变体包含在对应于位置650的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置650的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代Q650G或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置656的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置656的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代I656V或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置738的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置738的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代G738L或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置745的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置745的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代K745R或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置746的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置746的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代F746L或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置748的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置748的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代L748T或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置752的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置752的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代P752R或P752K，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置753的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置753的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代G753E、G753Q或G753S，或者由其组成。在对应于位置753的位置处的优选取代是G753E。

在另一个方面，变体包含在对应于位置754的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置754的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代S754E、S754L、S754Q或S754R，或者由其组成。在对应于位置754的位置处的优选取代是S754E或S754R。

在另一个方面，变体包含在对应于位置757的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置757的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代S757D、S757P或S757E，或者由其组成。在对应于位置757的位置处的优选取代是S757D。

在另一个方面，变体包含在对应于位置764的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置764的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代P764V或P764K，或者由其组成。在对应于位置764的位置处的优选取代是P764V。

在另一个方面，变体包含在对应于位置769的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置769的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的改变A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q或A769*，或者由其组成。在对应于位置769的位置处的优选取代是A769D。

在另一个方面，变体包含在对应于位置774的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置774的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A774V或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置775的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置775的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代L775A或L775F或L775I或L775M或L775Q或L775S或L775Y，或者由其组成。在对应于位置775的位置处的优选取代是L775M、L775Y或L775A。

在另一个方面，变体包含在对应于位置779的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置779的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代P779V或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置782的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置782的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含取代Y782I或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置786的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置786的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含取代N786K或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置789的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置789的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含取代G789R或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置792的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置792的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代K792W、K792Y、K792V或K792A，或者由其组成。在对应于位置792的位置处的优选取代是K792W或K792Y。

在另一个方面，变体包含在对应于位置796的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置796的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代N796Q或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置799的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置799的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A799H或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置800的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置800的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代V800P或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置801的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置801的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代D801G或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置819的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置819的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代K819R或K819T，或者由其组成。在对应于位置819的位置处的优选取代是K819R或K819T。

在另一个方面，变体包含在对应于位置824的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置824的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代K824R或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置843的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置843的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含取代A843P或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置845的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置845的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在对应于位置845的位置处的优选取代是D845E。

在另一个方面，变体包含在对应于位置875的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置875的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代K875T或K875E，或者由其组成。在对应于位置875的位置处的优选取代是K875T。

在另一个方面，变体包含在对应于位置903的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置903的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T903A或T903Q，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置911的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置911的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A911M、A911V或A911S，或者由其组成。在对应于位置911的位置处的优选取代是A911V。

在另一个方面，变体包含在对应于位置912的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置912的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A912I或A912T或A912Y，或者由其组成。在对应于位置912的位置处的优选取代是A912T。

在另一个方面，变体包含在对应于位置915的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置915的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T915S、T915Q、T915A或T915V，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置919的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置919的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T919D、T919F或T919G，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置921的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置921的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T921R或T921S，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置923的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置923的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T923D或T923H，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置925的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置925的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T925D或T925Q或T925R，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置927的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置927的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代T927K或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置928的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置928的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代D928W或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置930的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置930的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代Y930F或Y930H或Y930L，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置933的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置933的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代D933M或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置941的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置941的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代G941D或G941E，或者由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置966的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置966的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代A966P或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置991的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置991的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代N991D或由其组成。

在另一个方面，变体包含在对应于位置998的位置处的改变或由其组成。在另一个方面，在对应于位置998的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代V998K或由其组成。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自以下的一个或多个位置处的改变：SEQ ID NO：2的155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998，其中每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体具有在选自以下的一个或多个位置处的改变：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K，其中编号根据SEQ ID NO：2。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表1中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表2中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表3中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表4中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表5中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表6中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表7中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表8中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表9中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表10中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表11中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表12中列出的黄原胶裂解酶变体。

在一个特定实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体选自本文表13中列出的黄原胶裂解酶变体。

变体可以进一步包含在一个或多个其他位置处的一个或多个另外的改变。

氨基酸改变可以具有次要性质，其为不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小的缺失，通常为1-30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能(例如聚组氨酸束、抗原性表位或结合结构域)来促进纯化的小延伸。

保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的此类性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等等。

多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的程序进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每一个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变体分子的黄原胶裂解酶活性，以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性位点或其他生物相互作用也可以通过结构的物理分析来确定，如通过与推定的接触位点氨基酸的突变结合的此类技术如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记所确定的。参见例如，de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份也可以由与相关多肽的比对进行推断。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，其具有与SEQ ID NO：2相比在1和20之间，例如在1和10之间或在1和5之间的改变总数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，优选地，所述对黄原胶的活性是黄原胶降解活性，进一步优选地，所述黄原胶降解活性是EC4.2.2.12活性。

在一个实施方案中，与亲本酶(例如，SEQ ID NO：2)相比，变体在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，与亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO：2)相比，所述黄原胶裂解酶变体在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性；优选地，所述洗涤剂组合物(在其中它具有改善的稳定性并且任选还具有本发明的洗涤剂组合物)包含螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，相对于亲本黄原胶裂解酶，所述黄原胶裂解酶变体具有≥1.0的半衰期改善系数(HIF)；优选地，具有>1.0的半衰期改善系数(HIF)。更优选地，本发明的变体的半衰期改善系数(HIF)为至少1.2，例如至少1.5，例如至少2.0、至少3.0、至少4.0或至少5.0。计算半衰期改善系数(HIF)的优选方式在本文的实施例4中描述。

在一个实施方案中，本发明涉及包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，其中在将所述黄原胶裂解酶变体在洗涤剂组合物中在25℃或30℃下温育约30分钟到约20小时的时间段后测定半衰期改善系数(HIF)。

亲本

亲本黄原胶裂解酶可以是(a)与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交：(i)SEQID NO：1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；或(c)由与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

在一个方面，亲本与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其具有黄原胶裂解酶活性。在一个方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差至多10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，亲本是SEQ ID NO：2的成熟多肽的片段，其含有SEQ ID NO：2的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的氨基酸数目。在另一个实施方案中，亲本是SEQ ID NO：2的成熟多肽的等位基因变体。

在另一个方面，亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸在极低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中高严格条件、高严格条件或极高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体(Sambrook等人，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

SEQ ID NO：1的多核苷酸或其子序列，以及SEQ ID NO：2的多肽或其片段，可以用于设计核酸探针，以根据本领域众所周知的方法鉴定且克隆编码来自不同属或物种的菌株的亲本的DNA。特别地，遵循标准的DNA印迹程序，此类探针可以用于与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定且分离其中的相应基因。此类探针可以比整个序列短得多，但长度应为至少15，例如至少25、至少35或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针为长度至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。可以使用DNA和RNA探针两者。探针通常进行标记用于检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。此类探针由本发明涵盖。

可以在由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交且编码亲本的DNA。来自此类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其他分离技术分开。来自文库的DNA或分离的DNA可以转移且固定到硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

为了本发明的目的，杂交指示多核苷酸在极低到极高严格条件下与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO：1；(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。核酸探针在这些条件下与之杂交的分子可以使用例如X射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。

在另一个实施方案中，亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N末端或C末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N末端或C末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内并且融合多肽的表达在相同的启动子和终止子的控制下。融合多肽也可以使用内含肽技术构建，其中融合多肽在翻译后产生(Cooper等人，1993，EMBO J.12：2575-2583；Dawson等人，1994，Science 266：776-779)。

融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌后，切割位点，释放两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下中公开的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology 13：498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology 9：378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry 25：505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology13：982-987；Carter等人，1989，Proteins：Structure，Function，andGenetics 6：240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48。

亲本可以得自任何属的微生物。为了本发明的目的，如本文与给定来源结合使用的术语“得自”应该意指由多核苷酸编码的亲本由来源或来自来源的多核苷酸已插入其中的菌株产生。在一个方面，亲本是细胞外分泌的。

亲本可以是细菌酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性菌多肽，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)酶，或者革兰氏阴性菌多肽，例如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、Ilyobacter、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或解脲支原体(Ureaplasma)酶。

在一个方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)酶。

在另一个方面，亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)酶。

在另一个方面，亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)酶。

亲本可以是真菌酶。例如，亲本可以是酵母酶，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)酶；或丝状真菌酶，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、闭毛壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、家白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、巨座壳属(Magnaporthe)、Melanocarpus、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜熱子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)酶。

在另一个方面，亲本是卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)酶。

在另一个方面，亲本是解纤维素枝顶孢(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰刀菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰刀菌(Fusarium cerealis)、库威镰刀菌(Fusarium crookwellense)、大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰刀菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰刀菌(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、网状镰刀菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusariumroseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰刀菌(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰刀菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)酶。

在另一个方面，亲本是类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)黄原胶裂解酶，例如SEQ ID NO：2的黄原胶裂解酶。

应理解，对于上述物种，本发明涵盖完全和不完全状态两者，以及其他分类学等价物，例如无性型，而不管它们通过其已知的物种名称。本领域技术人员将容易地认识到适当等价物的身份。

这些物种的菌株在许多保藏中心中对公众容易接近，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)、以及农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。

可以从其他来源鉴定且获得亲本，包括从自然界中分离的微生物(例如，土壤、堆肥、水等)或使用上述探针直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品。用于直接从自然栖息地中分离微生物和DNA的技术是本领域众所周知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。

变体的制备

用于获得具有黄原胶裂解酶活性的变体的方法可以包括：(a)在对应于SEQ IDNO：2的成熟多肽的位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998的一个或多个位置处，将改变引入亲本黄原胶裂解酶内，其中所述变体具有黄原胶裂解酶活性；并且(b)回收变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序制备变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个确定位点处引入一个或多个突变的技术。

定点诱变可以通过PCR在体外完成，所述PCR涉及使用含有所需突变的寡核苷酸引物。定点诱变也可以通过盒式诱变在体外进行，所述盒式诱变涉及在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处通过限制性酶的切割，以及在多核苷酸中含有突变的寡核苷酸的后续连接。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，允许质粒和插入片段的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4949-4955；以及Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.18：7349-4966。

定点诱变也可以通过本领域已知的方法在体内完成。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.19：773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.4：285-290；以及Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.43：15-16。

任何定点诱变程序都可以用于本发明中。存在可以用于制备变体的许多商业试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码目的多肽。可以利用许多技术进行基因合成，例如由Tian等人(2004，Nature 432：1050-1054)描述的基于多路微芯片的技术，以及其中寡核苷酸在光可编程的微流体芯片上合成且组装的类似技术。

可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法制备且测试单个或多重氨基酸取代、缺失和/或插入，随后为有关的筛选程序，例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625所公开的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry 30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene 46：145；Ner等人，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法可以与高流通量、自动化筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。可以从宿主细胞中回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中的各个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面来完成半合成基因构建。半合成构建的典型代表是利用与PCR技术组合的合成的多核苷酸片段的方法。因此可以从头合成基因的确定区域，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物扩增，而另外其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以改组多核苷酸子序列。

实施方案

在一个实施方案中，本发明涉及洗涤剂组合物，其包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)如本文公开的黄原胶裂解酶变体。

在一个实施方案中，本发明涉及洗涤剂组合物，其包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)如本文公开的黄原胶裂解酶变体，进一步包含一种或多种洗涤剂组分；优选地，所述洗涤剂组分包含螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

在一个实施方案中，本发明涉及洗涤剂组合物，其包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)黄原胶裂解酶变体，进一步包含选自以下的一种或多种另外的酶：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶、或其任何混合物。

在一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种洗涤剂组分以及选自以下的一种或多种另外的酶：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶、或其任何混合物，优选地，所述洗涤剂组分包含螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

在一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种洗涤剂组分，其中所述洗涤剂组合物的形式为条，均质片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个区室的小袋，常规或致密粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或者常规、致密或浓缩液体。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的洗涤剂组合物的用途，其中所述用途选自：用于降解黄原胶的用途，以及在清洁过程例如衣物或硬表面清洁例如餐具洗涤中的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的洗涤剂组合物的用途，其中所述洗涤剂组合物具有酶去垢益处。

在一个实施方案中，本发明涉及用于降解黄原胶的方法，其包括：将本发明的洗涤剂组合物施加于黄原胶。

在一个实施方案中，本发明涉及用于降解黄原胶的方法，其包括：将本发明的洗涤剂组合物施加于黄原胶，其中所述黄原胶在纺织品或硬表面的表面上，例如餐具洗涤。

多核苷酸

本文公开的是编码本发明的变体的分离的多核苷酸。编码变体的所述分离的多核苷酸可以包含：(a)编码变体的多核苷酸，所述变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，所述不稳定区域选自：i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，iii)对应于SEQ IDNO：2的氨基酸731至803的区域3，iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA或cDNA中分离、或其组合。从基因组DNA中克隆多核苷酸可以例如通过以下来实现：使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选，以检测具有共享结构特点的克隆DNA片段。参见例如，Innis等人，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York。可以使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。多核苷酸可以克隆到枯草杆菌或大肠杆菌的菌株或相关生物中，并且因此例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因或物种变体。

编码如本文所述的多肽的多核苷酸的修饰可能是合成与多肽基本上相似的多肽所必需的。术语与多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在形式。这些多肽可以在某些改造方式方面与从其天然来源中分离的多肽不同，例如，在比活性、热稳定性、最适pH等等方面不同的变体。变体可以通过下述构建：基于作为SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列呈现的多核苷酸，例如其子序列，和/或引入核苷酸取代，所述核苷酸取代不导致多肽的氨基酸序列中的改变，但对应于预期用于产生酶的宿主生物的密码子使用，或者引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代。关于核苷酸取代的一般描述，参见Ford等人，(1991)，‘ProteinExpression and Purification’，2：95-107。

核酸构建体

本文还公开的是包含与一种或多种控制序列可操作地连接的、编码如本文所述的变体的多核苷酸的核酸构建体，在与控制序列相容的条件下，所述控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。相应地，公开的是包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，其包含与一个或多个控制序列可操作地连接的：(a)编码变体的多核苷酸，所述变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，所述不稳定区域选自：i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，在与控制序列相容的条件下，所述控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可以各种方式操作多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸插入载体内之前对其进行操作可能是期望的或必需的。利用重组DNA方法用于修饰多核苷酸的技术是本领域众所周知的。

控制序列可以是启动子，用于表达编码本发明多肽的多核苷酸由宿主细胞识别的多核苷酸。启动子含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短的和杂合的启动子，并且可以得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology 13：97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene 69：301-315)、天蓝色链霉菌基因(dagA)和原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)。进一步的启动子在Gilbert等人，1980，Scientific American 242：74-94中的"Usefulproteins from recombinant bacteria"中；以及在Sambrook等人，1989，同上中描述。串联启动子的实例公开于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从关于以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰刀菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰刀菌Daria(WO 00/56900)、镶片镰刀菌Quinn(WO 00/56900)、米赫根毛霉脂肪酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉黄原胶裂解酶I、里氏木霉黄原胶裂解酶II、里氏木霉黄原胶裂解酶III、里氏木霉黄原胶裂解酶IV、里氏木霉黄原胶裂解酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已替换为来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的非翻译前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中非翻译前导序列已替换为来自构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的非翻译前导序列)；以及突变型、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子得自关于以下的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人，1992，Yeast 8：423-488描述。

控制序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。终止子与编码多肽的多核苷酸的3'末端可操作地连接。在宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子得自关于克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子得自关于构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子得自关于酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人，1992，同上描述。

控制序列还可以是在启动子下游和基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加基因的表达。

合适的mRNA稳定子区域的实例得自苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology 177：3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，对于通过宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的多核苷酸的5'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列得自关于米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。

用于酵母宿主细胞的合适前导序列得自关于酿酒酵母烯醇酶(ENO 1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，可操作地连接到多核苷酸的3'末端的序列，并且当转录时，由宿主细胞识别为将多聚腺苷残基加入转录的mRNA中的信号。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列得自关于构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

用于酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.15：5983-5990描述。

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N末端连接的信号肽，并且指导多肽进入细胞的分泌途径内。多核苷酸的编码序列的5'末端可以固有地含有信号肽编码序列，其在翻译读码框中与编码多肽的编码序列的区段天然连接。可替代地，编码序列的5'末端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码序列。当编码序列不天然含有信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替换天然信号肽编码序列，以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径内的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自关于以下的基因的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草杆菌prsA。进一步的信号肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews 57：109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自关于以下的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、绵毛状腐质霉脂肪酶和米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用信号肽得自关于酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，同上描述。

控制序列也可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的N末端处的前肽。所得多肽称为前酶或前多肽(或在某些情况下为酶原)。前多肽一般是无活性的，并且可以通过前肽从前多肽的催化或自催化切割而转换为活性多肽。前肽编码序列可以得自关于以下的基因：枯草杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

当存在信号肽和前肽序列两者时，前肽序列紧靠多肽的N末端定位，并且信号肽序列紧靠前肽序列的N末端定位。

还可能期望添加相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达的调节序列。调节系统的实例是促使基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸与调节序列可操作地连接。

表达载体

本文还公开的是重组表达载体，其包含编码如本文所述的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号。相应地，还公开的是用于获得包含编码变体的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体的方法，所述变体包含：(a)编码变体的多核苷酸，所述变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，所述不稳定区域选自：i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，ii)对应于SEQ IDNO：2的氨基酸614至658的区域2，iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点，以允许在此类位点处插入或取代编码多肽的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体内来表达多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适当的控制序列可操作地连接用于表达。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地经受重组DNA程序，并且可以造成多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与载体待引入其内的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当引入宿主细胞内时，所述载体整合到基因组内，并且连同它已整合到其内的染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或者两种或更多种载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞的基因组内的总DNA，或转座子。

载体优选含有一种或多种可选择标记物，其允许容易地选择转化的、转染的、转导的或类似细胞。可选择标记物是一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等等。

细菌可选择标记物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性的标记物。用于酵母宿主细胞的合适标记物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的可选择标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其等价物。优选用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因、以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组内或载体在细胞中不依赖于基因组的自主复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组内，载体可以依赖编码多肽的多核苷酸序列或载体的任何其他元件，用于通过同源或非同源重组整合到基因组内。可替代地，载体可以含有另外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞的基因组内。为了增加在精确位置处的整合的可能性，整合元件应该含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性，以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组内。

对于自主复制，载体可以进一步包含复制起点，致使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是介导在细胞中起作用的自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指致使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

可用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene98：61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.15：9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞内，以增加多肽的产生。通过将至少一个另外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组内，或通过将可扩增的可选择标记物基因与多核苷酸一起包括(其中细胞含有可选择标记物基因的扩增拷贝)，可以获得多核苷酸的拷贝数中的增加，并且从而可以通过在适当的可选择试剂的存在下培养细胞来选择多核苷酸的另外拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。

宿主细胞

本文还公开的是重组宿主细胞，其包含编码如本文所述的变体的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到指导本发明的变体产生的一种或多种控制序列。相应地，本文公开的是重组宿主细胞，其包含与指导变体产生的一种或多种控制序列可操作地连接的、编码如本文所述的变体的多核苷酸，所述变体包含：(a)编码变体的多核苷酸，所述变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，所述不稳定区域选自：i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞内，使得构建体或载体维持为染色体整合体或如较早所述的自我复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核生物或真核生物。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、Ilyobacter、奈瑟菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和解脲支原体。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞也可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、化脓性链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽疫亚种细胞。

细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞内可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168：111-115)、感受态细胞转化(参见例如Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56：209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或缀合(参见例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169：5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞内可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)、或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic AcidsRes.16：6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞内可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)、缀合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞内可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)、或缀合(参见例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。将DNA引入链球菌属细胞内可以通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick，1991，Microbios68：189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)、或缀合(参见例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞内的任何方法。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂真菌(如通过Hawksworth等人，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK定义的)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文使用的，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母和属于不完全真菌的酵母(芽生菌(Blastomycetes))。因为酵母的分类在将来可能变化，所以为了本发明的目的，酵母应该如Biology andActivities of Yeast(Skinner、Passmore和Davenport，编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括亚门真菌门(Eumycota)和卵菌门的所有丝状体(如由Hawksworth等人，1995，同上定义的)。丝状真菌的特征一般在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，通过酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，并且碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、云芝属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、巨座壳属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、毛平革菌属、射脈菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜熱子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、苍烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、莫达瑞姆金孢子菌、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、粗毛云芝(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰刀菌、谷类镰刀菌、库威镰刀菌、大刀镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰刀菌、异孢镰刀菌、合欢木镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌Fusariumtorulosum、拟丝孢镰刀菌、镶片镰刀菌、特异腐质霉、绵毛状腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉侧菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢壳、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，以及Christensen等人，1988，Bio/Technology 6：1419-1422中描述。用于转化镰刀属物种的合适方法由Malardier等人，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用通过Becker和Guarente，InAbelson，J.N.和Simon，M.I.，编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，J.Bacteriol.153：163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1920中描述的程序来转化酵母。

生产方法

本文还公开的是产生如本文所述的变体的方法(例如，体外或离体方法)，其包括：(a)在适合于表达变体的条件下，培养本发明的宿主细胞；(b)回收变体。相应地，本文公开的是产生变体的方法(例如，体外或离体方法)，其包括：(a)在适合于表达变体的条件下，培养包含编码变体的多核苷酸的宿主细胞，所述变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，所述不稳定区域选自：i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，iii)对应于SEQ IDNO：2的氨基酸731至803的区域3，iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，并且(b)任选地，回收变体。

进一步公开的是产生本发明的变体的方法(例如，体外或离体方法)，其包括(a)在有助于多肽产生的条件下，培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生多肽；并且(b)回收多肽。在一个优选的方面，细胞是类芽孢杆菌属细胞或微杆菌属(Microbacterium)细胞。

还公开的是产生本发明的变体的方法(例如，体外或离体方法)，其包括(a)在有助于多肽产生的条件下，培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收多肽。

使用本领域已知的方法，在适合于多肽产生的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养、或者在合适的培养基和允许多肽表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基内，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，则可以从细胞裂解产物中回收多肽。

可以使用本领域已知的对于多肽特异性的方法，例如用于测定纤维素或黄原胶裂解酶活性的方法来检测变体多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定可以用于测定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法回收变体多肽。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收多肽，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

变体多肽可以通过本领域已知的各种程序进行纯化，所述程序包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS PAGE或提取(参见例如，Protein Purification，Janson和Ryden，编辑，VCH Publishers，New York，1989)，以获得基本上纯的多肽。

在一个可替代方面，不回收变体多肽，而是将表达多肽的宿主细胞用作变体多肽的来源。

组合物

在一个特定方面，与亲本酶相比，或与具有变体相同的氨基酸序列，但在一个或多个指定位置处没有改变(例如，取代、缺失或插入)的黄原胶裂解酶相比，或与具有SEQ IDNO：2的黄原胶裂解酶相比，根据本发明的变体在洗涤剂中具有改善的稳定性，其中如本文实施例4中所公开的测量在洗涤剂中的活性和/或稳定性。

除酶外，洗涤剂组合物还可以包含另外的组分。另外组分的选择在技术人员的技能范围内，并且包括常规成分，包括下文阐述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括考虑待清洁的织物类型、污渍的类型和/或程度、在其下进行清洁的温度、以及洗涤剂产品的制剂。尽管下文提到的组分根据特定功能性通过一般标题分类，但这不应解释为限制，因为组分可以包含如本领域技术人员将了解的另外功能性。

洗涤剂组合物可以适合于纺织品例如织物、布或亚麻布的洗涤，或者清洁硬表面例如地板、桌子或餐具洗涤。

洗涤剂组合物

在一个实施方案中，如本文所述的变体可以以对应于每升洗涤液0.0001-200mg酶蛋白，例如0.0005-100mg酶蛋白，优选0.001-30mg酶蛋白，更优选0.005-8mg酶蛋白，甚至更优选0.01-2mg酶蛋白的量加入洗涤剂组合物中。

例如，用于自动餐具洗涤机(ADW)中的组合物可以包括按组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05-5％的酶蛋白。

例如，用于洗衣颗粒或固体/颗粒洗衣组合物的组合物一般可以包括按组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

例如，用于洗衣液中的组合物可以包括按组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂进行稳定，所述稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且组合物可以如例如WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制。

在某些市场中，使用不同的洗涤条件，并且像这样使用不同类型的洗涤剂。这公开于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)，使用低洗涤剂浓缩系统，而美国使用中等洗涤剂浓缩系统，并且欧洲使用高洗涤剂浓缩系统。

低洗涤剂浓缩系统包括其中洗涤水中存在小于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂通常视为低洗涤剂浓缩系统，因为它们具有在洗涤水中存在的大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度包括其中洗涤水中存在约800ppm至约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。北美洗涤剂一般视为中等洗涤剂浓缩系统，因为它们具有在洗涤水中存在的大约975ppm的洗涤剂组分。

高洗涤剂浓缩系统包括其中洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲洗涤剂一般视为高洗涤剂浓缩系统，因为它们具有在洗涤水中的大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。

拉丁美洲洗涤剂一般是高泡磷酸盐增效剂洗涤剂，并且拉丁美洲中使用的洗涤剂范围可以落入中等和高洗涤剂浓度两者中，因为它们范围为在洗涤水中1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施方案。

本发明的多肽也可以掺入WO97/07202中公开的洗涤剂制剂中，所述专利在此引入作为参考。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，其可以是阴离子和/或阳离子和/或非离子和/或半极性和/或两性离子的、或其混合物。在一个特定实施方案中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。表面活性剂通常以按重量计约0.1％至60％，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％的水平存在。表面活性剂基于所需的清洁应用加以选择，并且包括本领域已知的任何常规表面活性剂。可以利用本领域已知的用于洗涤剂中的任何表面活性剂。

当包括在其中时，洗涤剂通常包含按重量计约1％至约40％，例如约5％至约30％，包括约5％至约15％、或约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是线性烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、分支烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基烷基磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、烷烃-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)例如十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)包括甲酯磺酸盐(MES)、烷基或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸或皂的二酯和单酯及其组合。

当包括在其中时，洗涤剂通常包含按重量计约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇胺季铵化合物(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂基氯化铵(DSDMAC)和烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。

当包括在其中时，洗涤剂通常包含按重量计约0.2％至约40％，例如约0.5％至约30％，特别是约1％至约20％，约3％约10％，例如约3％至约5％、或约8％至约12％的非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(PFA)、烷氧基化脂肪酸烷基酯如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基聚葡糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、聚羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺(葡糖酰胺，GA或脂肪酸葡糖酰胺，FAGA)的N-酰基N-烷基衍生物、以及以商品名SPAN和TWEEN下可获得的产品及其组合。

当包括在其中时，洗涤剂通常包含按重量计约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛脂烷基)-N,N-双(2-羟基乙基)氧化胺、脂肪酸烷醇酰胺和乙氧基化脂肪酸烷醇酰胺及其组合。

当包括在其中时，洗涤剂通常包含按重量计约0％至约10％的两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱例如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。

水溶助剂

水溶助剂是使水溶液中的疏水性化合物(或者相反地，在非极性环境中的极性物质)增溶的化合物。通常，水溶助剂具有亲水性和疏水性特征两者(如从表面活性剂已知的所谓的两性性质)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发的自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science 12：121-128的综述。水溶助剂不展示超过其自聚集发生的临界浓度，如对于表面活性剂和脂质形成胶束、层状或其他良好限定的中间相发现的。相反，许多水溶助剂显示连续型聚集过程，其中聚集物的尺寸随着浓度的增加而增长。然而，许多水溶助剂改变含有极性和非极性特征的物质的系统的相行为、稳定性和胶体性质，所述系统包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物。水溶助剂经常跨越从制药、个人护理、食品到技术应用的工业使用。在洗涤剂组合物中使用水溶助剂允许例如表面活性剂的更浓缩制剂(如在通过去除水而压实液体洗涤剂的过程中)，而不诱导不希望有的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5至约5％、或约3至约5％的水溶助剂。可以利用用于洗涤剂中的本领域已知的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯苯磺酸钠(SCS)、伞花素磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠及其组合。

增效剂和共增效剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，如约5％至约45％的洗涤剂增效剂或共增效剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，增效剂的水平通常为40-65％，特别是50-65％。增效剂和/或共增效剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用用于衣物洗涤剂中的本领域已知的任何增效剂和/或共增效剂。增效剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、可溶性硅酸盐如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-硝基三乙醇)和羧甲基菊粉(CMI)及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共增效剂或其混合物。该洗涤剂组合物可以包括单独的共增效剂，或与增效剂如沸石增效剂的组合。共增效剂的非限制性实例包括聚丙烯酸类塑料的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。进一步的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐、以及烷基或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N’-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N’,N”-三乙酸酯(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。进一步的示例性增效剂和/或共增效剂在例如WO09/102854、US5977053中描述。

漂白系统

洗涤剂可以包含按重量计0-50％，例如约0.1％至约25％的漂白系统。可以利用用于衣物洗涤剂中的本领域已知的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂，光漂白剂，漂白活化剂，过氧化氢来源如过碳酸钠和过硼酸钠，预形成的过酸及其混合物。合适的预形成的过酸包括但不限于过氧羧酸和盐、过氧羧酸和盐、过亚胺酸和盐、过一硫酸和盐例如Oxone(R)及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，其可以包含例如与形成过酸的漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐如过硼酸盐的钠盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。术语漂白活化剂在本文中意欲为与过氧漂白剂如过氧化氢反应以形成过酸的化合物。因此形成的过酸构成活化的漂白剂。在本文中待使用的合适的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。合适的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧十二烷酸、4-(十二烷酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)和/或WO98/17767中公开的那些。在EP624154中公开了目的漂白活化剂的特定家族，并且在该家族中特别优选的是乙酰基柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酯如三乙酸甘油酯具有环境友好的优点，因为它最终降解成柠檬酸和醇。此外，乙酰基柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在贮存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供了良好的增洁能力。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸如6-(邻苯二甲酰亚胺基)过氧己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施方案中，漂白剂组分可以是选自具有下式的有机催化剂的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地为含有9至24个碳的分支烷基或含有11至24个碳的线性烷基，优选每个R¹独立地为含有9至18个碳的分支烷基或含有11至18个碳的线性烷基，更优选每个R¹独立地选自2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基。其他示例性漂白系统例如在WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259和WO2007/087242中描述。合适的光漂白剂可以例如是磺化锌或酞菁。

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5-5％、2-5％、0.5-2％或0.2-1％的聚合物。可以利用用于洗涤剂中的本领域已知的任何聚合物。该聚合物可以充当如上所述的共增效剂，或者可以提供抗再沉积、纤维保护、去污、染料转移抑制、油脂清洁和/或消泡性质。一些聚合物可以具有超过一种的上述性质和/或超过一种的下述基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)和聚羧酸酯如PAA、PAA/PMA、聚天冬氨酸和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)和聚(对苯二甲酸氧乙烯酯)(PET-POET)的共聚物、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)和聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。进一步的示例性聚合物包括磺化聚羧酸盐、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)和乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物公开于例如WO 2006/130575中。还考虑了上述聚合物的盐。

织物着色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物着色剂，例如染料或颜料，其在洗涤剂组合物中配制时可以在所述织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液接触时沉积在织物上，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色调。荧光增白剂发出至少一些可见光。相比之下，当织物着色剂吸收至少一部分可见光谱时，它们改变表面的色调。合适的织物着色剂包括染料和染料-粘土缀合物，并且还可以包括颜料。合适的染料包括小分子染料和聚合染料。合适的小分子染料包括选自落入下述颜色索引(CI)分类的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226(引入本文作为参考)中所述。洗涤剂组合物优选包含约0.00003重量％至约0.2重量％、约0.00008重量％至约0.05重量％、或甚至约0.0001重量％至约0.04重量％的织物着色剂。该组合物可以包含0.0001重量％至0.2重量％的织物着色剂，当组合物为单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂也公开于例如WO 2007/087257和WO2007/087243。

另外的酶

洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种[另外的]酶，例如黄原胶裂解酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、地衣多糖酶、碳水化合物酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般而言，所选择的酶的性质应当与所选择的洗涤剂(即，最佳pH、与其他酶促和非酶促成分的相容性等)相容，并且酶应当以有效量存在。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白质改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些。

显示出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的纤维素酶的实例是WO02/099091中已描述的那些。

纤维素酶的其他实例包括WO96/29397中描述的45家族纤维素酶，并且尤其是其在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO：8中的下述位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。

商购可得的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novozymes A/S)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)、以及KAC-500(B)^TM(KaoCorporation)。

蛋白酶：另外的酶可以是另一种蛋白酶或蛋白酶变体。蛋白酶可以具有动物、植物或微生物起源，包括化学或遗传修饰的突变体。微生物起源是优选的。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族例如胰蛋白酶，或S8家族例如枯草杆菌蛋白酶。金属蛋白酶蛋白酶可以是例如来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。

术语“枯草杆菌酶”指根据Siezen等人，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等人Protein Science 6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征在于在活性位点具有丝氨酸的蛋白酶亚组，所述丝氨酸与底物形成共价加合物。枯草杆菌酶可以分成6个亚部分，即枯草杆菌蛋白酶家族、热酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素(Lantibiotic)肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面，蛋白酶可以是枯草杆菌酶，例如枯草杆菌蛋白酶或其变体。此外，枯草杆菌酶(和丝氨酸蛋白酶)的特征在于具有除丝氨酸外的两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。

枯草杆菌蛋白酶的实例是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶lentus、迟缓芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶309、WO 89/06279中描述的枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例在WO98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602和WO 04/099401中描述。枯草杆菌酶变体的实例可以是在以下位置中任一中具有突变的那些：使用BPN'编号的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252和274。更优选的枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。进一步优选的蛋白酶是如例如WO 95/23221中所述的来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶，以及其在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147和EP1921148中描述的变体。

胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如具有猪或牛起源)、以及WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰刀菌属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO98/20111、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，尤其是在下述位置中的一个或多个中具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。

优选的商购可得的蛋白酶包括Alcalase^TM、Coronase^TM、Duralase^TM、Durazym^TM、Esperase^TM、Everlase^TM、Kannase^TM、Liquanase^TM、Liquanase Ultra^TM、Ovozyme^TM、Polarzyme^TM、Primase^TM、Relase^TM、Savinase^TM和Savinase Ultra^TM、(Novozymes A/S)、Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)、BLAP和BLAP X(Henkel AG&Co.KGaA)、Excellase^TM、FN2^TM、FN3^TM、FN4^TM、Maxaca^TM、Maxapem^TM、Maxatase^TM、Properase^TM、Purafast^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、Purafect Prime^TM和Puramax^TM(Genencor int.)。

脂肪酶和角质酶：合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白质改造的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)，例如如EP258068和EP305216中描述的来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为绵毛状腐质霉)的脂肪酶，来自腐质霉属例如特异腐质霉的角质酶(WO96/13580)，来自假单胞菌属菌株的脂肪酶(其中一些现在重新命名为伯克氏菌属(Burkholderia))，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、假单胞菌属物种(P.sp.)菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶(WO10/107560)、来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(US5,389,536)、来自嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO11/084412)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)脂肪酶(WO11/084417)、来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)、以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO12/137147)的脂肪酶。

进一步的实例是脂肪酶，有时被称为酰基转移酶或过水解酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A(WO10/111143)具有同源性的酰基转移酶、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO09/67279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是来自Huntsman TextileEffects Pte Ltd的商业产品Gentle Power Bleach中使用的S54V变体(WO10/100028)。

其他实例是脂肪酶变体，例如EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508和WO09/109500中所述的那些。

优选的商业脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(Novozymes A/S)、Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(最初来自Gist-Brocades)。

淀粉酶

淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶，并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰或蛋白质改造的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特殊菌株。

淀粉酶的实例是具有WO 95/10603中的SEQ ID NO：3的淀粉酶或其与SEQ ID NO：3具有90％序列同一性的变体。WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424和WO99/019467的SEQ ID NO：4中描述了优选的变体，例如在下述位置的一个或多个中具有取代的变体：WO95/10603中的SEQ ID NO：3的15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。

其他淀粉酶是WO 2016/203064的SEQ ID NO：1的变体，其与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列同一性。优选的变体是包含在对应于SEQ ID NO：1的位置1、54、56、72、109、113、116、134、140、159、167、169、172、173、174、181、182、183、184、189、194、195、206、255、260、262、265、284、289、304、305、347、391、395、439、469、444、473、476或477的一个或多个位置中的修饰的变体，其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO：1具有至少75％但小于100％的序列同一性。

可以使用的进一步的淀粉酶是WO 02/010355中的SEQ ID NO：6的淀粉酶或其与SEQ ID NO：6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO：6的优选变体是具有在位置181和182处的缺失和在位置193处的取代的那些。

其他淀粉酶实例是杂合α-淀粉酶，其包含WO 2006/066594的SEQ ID NO：6中所示的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33，以及WO 2006/066594的SEQ ID NO：4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483，或其具有其90％序列同一性的变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在下述位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含WO 2006/066594的SEQ ID NO：6中所示的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33以及SEQ ID NO：4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有下述取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264。

进一步的淀粉酶实例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO：6的淀粉酶或其与SEQID NO：6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO：6的优选变体是在下述位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置G182和H183或位置H183和G184处具有缺失的淀粉酶。

另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的那些，或者其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的优选变体是在下述位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476。更优选的变体是在位置182和183或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：7的最优选的淀粉酶变体是具有在位置183和184中的缺失以及在位置140、195、206、243、260、304和476中的取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO：2、WO 01/66712中的SEQ ID NO：10的淀粉酶，或者其与WO 08/153815的SEQ ID NO：2具有90％序列同一性或WO01/66712中的SEQ ID NO：10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO：10的优选变体是在下述位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。

可以使用的进一步的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO：2的淀粉酶或其与SEQ ID NO：2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO：2的优选变体是具有在下述位置的一个或多个中的取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO：2的更优选变体是具有在下述位置的一个或多个中的取代、缺失或插入的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E和G475K和/或在位置R180和/或S181中的缺失。SEQ ID NO：2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中所述变体任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。

淀粉酶的其他实例是具有WO01/66712中的SEQ ID NO：12的α-淀粉酶，或与SEQ IDNO：12具有至少90％，例如至少95％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQ ID NO：12的下述位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外具有选自以下的一个或多个位置中的取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选在所有这些位置另外具有取代的变体。

商购可得的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白质改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的那些。

商购可得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

通过加入含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过加入包含所有这些酶的组合添加剂，洗涤剂酶可以包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂可以例如配制为颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，特别是无粉尘颗粒、液体特别是稳定液体或浆料。

无粉尘颗粒可以如US 4,106,991和4,661,452中公开的生产，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂布。蜡质涂布材料的实例是平均摩尔重量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于通过流化床技术应用的成膜涂布材料的实例在GB 1483591中给出。例如，液体酶制剂可以根据已确定的方法通过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得到稳定。受保护的酶可以根据EP238,216中公开的方法进行制备。

辅助材料

也可以利用用于衣物洗涤剂中的本领域已知的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括单独或组合的抗腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂/崩解试剂、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇如丙二醇)、织物柔顺剂包括粘土、填料/加工助剂、荧光增白剂/光学增白剂、泡沫促进剂、泡沫(泡泡(suds))调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、鞣质抑制剂和芯吸剂。可以利用用于衣物洗涤剂中的本领域已知的任何成分。这些成分的选择完全在技术人员的技能范围内。

分散剂：本发明的洗涤剂组合物也可以含有分散剂。特别地，粉状洗涤剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚或共聚酸或其盐，其中多元羧酸包含通过不超过两个碳原子彼此分开的至少两个羧基原子团。合适的分散剂例如在Powdered Detergents，Surfactant science series volume 71，Marcel Dekker，Inc中描述。

染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以以按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或甚至约0.1％至约3％的量存在。

荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物优选还含有可以给待清洁的物品着色的另外组分，例如荧光增白剂或光学增白剂。当存在时，增白剂优选为约0.01％至约0.5％的水平。适用于洗衣洗涤剂组合物的任何荧光增白剂都可用于本发明的组合物中。最常用的荧光增白剂是属于二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-二苯乙烯基衍生物类别的那些。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括下述的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸酯；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸酯；4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸酯，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸酯；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸酯和2-(芪基-4"-萘并-1.,2'：4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸酯。优选的荧光增白剂是可从Ciba-Geigy AG，Basel，瑞士获得的Tinopal DMS和Tinopal CBS。Tinopal DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸酯的二钠盐。Tinopal CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸酯的二钠盐。还优选的荧光增白剂是由ParamountMinerals and Chemicals，Mumbai，印度供应的商购可得的Parawhite KX。适用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷基氨基香豆素。合适的荧光增白剂水平包括约0.01、0.05、0.1或者甚至约0.2重量％的较低水平至0.5或甚至0.75重量％的更高水平。

去污聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种去污聚合物，其帮助从织物如基于棉和聚酯的织物去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。去污聚合物可以是例如基于非离子或阴离子对苯二甲酸酯的聚合物、聚乙烯己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺参见例如Powdered Detergents，Surfactantscience series volume 71，Marcel Dekker，Inc中的第7章。另一类型的去污聚合物是两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物，其包含核心结构和附着至核心结构的多个烷氧基化物基团。核心结构可以包含如WO 2009/087523(在此引入作为参考)中详细描述的聚乙烯亚胺结构或聚烷醇胺结构。此外，无规接枝共聚物是合适的去污聚合物。合适的接枝共聚物在WO2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314(引入本文作为参考)中更详细地描述。其他去污聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如在EP 1867808或WO 2003/040279(两者均在此引入作为参考)中所述的那些。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子改性纤维素、非离子改性纤维素、阳离子改性纤维素、两性离子改性纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素酯及其混合物。

抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、以及乙氧基化聚乙烯亚胺。在上文去污聚合物下描述的基于纤维素的聚合物也可以充当抗再沉积剂。

其他合适的辅助材料包括但不限于抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔顺剂、填料、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂、以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产物制剂

洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个区室的小袋、常规或致密粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规的致密或浓缩液体。存在许多洗涤剂制剂形式，例如层(相同或不同的相)、小袋以及用于机器给料单元的形式。

小袋可以配置为单个或多个区室。它可以具有任何形式、形状和材料，其适合于容纳组合物，例如而不允许组合物在水接触之前从小袋中释放。小袋由封装内部容积的水溶性膜制成。所述内部容积可以被分成小袋的区室。优选的膜是聚合物材料，优选形成为膜或片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或衍生物是所选择的聚丙烯酸类塑料和水溶性丙烯酸类塑料共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚甲基丙烯酸类塑料，最优选聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，膜例如PVA中的聚合物水平为至少约60％。优选的平均分子量通常为约20,000至约150,000。膜也可以是包含可水解降解和水溶性聚合物共混物的共混组合物，例如聚丙交酯和聚乙烯醇(如由Chris Craft In.Prod.Of Gary，Ind.，US出售的，在贸易参考M8630下已知)加上增塑剂如甘油、乙二醇、丙二醇、山梨糖醇及其混合物。小袋可以包含由水溶性膜分离的固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或部分组分。用于液体组分的区室可以在组成中不同于含有固体的区室。参考：(US2009/0011970A1)。

洗涤剂成分可以通过水溶性袋中的小室或在片剂的不同层中彼此物理分离。由此可以避免组分之间的负面贮存相互作用。每个区室的不同溶出曲线也可以导致所选组分在洗涤溶液中的延迟溶解。

并非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，通常含有按重量计至少20％和至多95％的水，例如至多约70％的水、至多约65％的水、至多约55％的水、至多约45％的水、至多约35％的水。其他类型的液体，包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚和多元醇可以包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以含有0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水的。

洗衣皂条

本发明的酶可以加入洗衣皂条中并且用于手洗衣物、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条、合成皂(syndet)条和洗涤剂条。条的类型通常在其所含的表面活性剂的类型方面不同，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂。洗衣皂条具有其在室温下是固体，而不是液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为在一段时间内不显著改变的物理形式，即如果将固体物体(例如洗衣皂条)放置在容器内，则固体物体不改变以填充其置于其中的容器。条是通常为条形式的固体，但也可以是其他固体形状如圆形或椭圆形。

洗衣皂条可以含有一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛(或亚硫酸氢盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸、一种或多种皂或合成表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或单价阳离子和有机阴离子的盐，其中单价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺，并且有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以含有络合剂如EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填料、表面活性剂例如阴离子合成表面活性剂、增效剂、聚合物洗涤剂、洗涤剂螯合剂、稳定剂、填料、染料、色素、染料转移抑制剂、烷氧基化聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、粘合剂、溶浸剂、漂白活化剂、粘土污垢去除剂、抗再沉淀剂、聚合物分散剂、增白剂、织物柔顺剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，所述设备例如但不限于：混合器、压条机例如两级真空压条机、挤出机、切割机、标志压模机、冷却通道和包装机。本发明并不限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。本发明的预混物可以在该过程的不同阶段加入皂中。例如，可以制备含有皂、酶、任选的一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混物，然后将该混合物压条。酶和任选的另外的酶可以与例如以液体形式的蛋白酶抑制剂同时加入。除混合步骤和压条步骤以外，该方法可以进一步包括研磨、挤出、切割、冲压、冷却和/或包装的步骤。

生产组合物的方法

本发明还涉及生产组合物的方法。该方法可能与洗涤剂组合物的(贮存)稳定性有关：例如，皂条预混方法WO2009155557。

用途

本发明还涉及关于使用其洗涤剂组合物的方法。本发明可以用于例如需要降解黄原胶的任何洗涤剂应用中。

降解黄原胶的用途

黄原胶已被用作许多消费品包括食品和化妆品中的成分，并且已在石油工业中使用。因此，黄原胶的降解可以导致改善的清洁过程，例如更容易去除含有胶例如黄原胶的污渍。因此，本发明涉及包含如本文所述的黄原胶裂解酶(例如变体)的洗涤剂组合物降解黄原胶的用途。一个实施方案是包含如本文所述的黄原胶裂解酶(例如变体)的洗涤剂组合物连同内切葡聚糖酶一起降解黄原胶的用途。黄原胶的降解可以优选使用粘度降低测定(例如，ViPr测定)或可替代地如本文实施例4中所描述的来测量。

可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.47：273-279，1972开发的比色测定，通过评价用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶上的还原末端来测量GH9内切葡聚糖酶活性。优选的实施方案是使用由黄原胶裂解酶预处理的0.1％黄原胶。用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解可以通过计算空白和样品之间的差异来确定，其中大于0.5mAU，优选大于0.6mAU，更优选大于0.7mAU，或甚至更优选大于0.8mAU的差异显示用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解。

可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.47：273-279，1972开发的比色测定，通过评价在黄原胶上的还原末端来测量黄原胶裂解酶活性。优选的实施方案是使用0.1％黄原胶。黄原胶的降解可以通过计算空白和样品之间的差异来确定，其中大于0.1mAU，优选大于0.15mAU，更优选大于0.2mAU，或甚至更优选大于0.25mAU的差异显示黄原胶的降解。

可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.47：273-279，1972开发的比色测定，通过评价在黄原胶上的还原末端来测量黄原胶裂解酶(例如，如本文所述的变体)和内切葡聚糖酶活性。优选的实施方案是使用0.1％黄原胶。黄原胶的降解可以通过计算空白和样品之间的差异来确定，其中大于0.4mAU，优选大于0.5mAU，更优选大于0.6mAU，或甚至更优选大于0.8mAU的差异显示黄原胶的降解。

本发明还涉及用于降解黄原胶的方法，其包括将包含本文所述的一种或多种黄原胶裂解酶(例如变体)的洗涤剂组合物施加于黄原胶。本发明进一步涉及用于降解黄原胶的方法，其包括将包含一种或多种黄原胶裂解酶的洗涤剂组合物施加于黄原胶。一个实施方案是用于降解黄原胶的方法，其包括将包含如本文所述的一种或多种黄原胶裂解酶(例如变体)连同一种或多种内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物施加于黄原胶。

在洗涤剂中的用途

本发明尤其涉及包含如本文所述的黄原胶裂解酶(例如变体)的洗涤剂组合物在清洁过程中的用途，所述清洁过程例如纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)，以及家用和工业硬表面清洁例如餐具洗涤。为此，可以将黄原胶裂解酶(例如变体)加入包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。

在一些方面，如本文所述的黄原胶裂解酶(例如变体)可以连同内切葡聚糖酶一起用于洗涤剂组合物中，用于清洁过程例如纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)，以及家用和工业硬表面清洁例如餐具洗涤。为此，可将本文所述的黄原胶裂解酶(例如变体)连同内切葡聚糖酶一起加入包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。

可将本文所述的多肽(例如变体)加入洗涤剂组合物中，并且因此成为其的组分。洗涤剂组合物可以配制为例如用于家用和工业衣物清洁两者的手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适合于有污渍织物的预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或配制为用于一般家用或工业硬表面清洁操作中的洗涤剂组合物，或配制用于手工或机器(家用和工业两者)餐具洗涤操作。在一个具体方面，本发明涉及包含如本文所述的多肽的洗涤剂添加剂。

本发明还涉及用于降解在纺织品或硬表面(例如餐具洗涤)的表面上的黄原胶的方法，其包括将包含如本文所述的一种或多种黄原胶裂解酶(例如变体)的洗涤剂组合物施加于黄原胶。在一些方面，本发明还涉及用于降解在纺织品或硬表面(例如餐具洗涤)的表面上的黄原胶的方法，其包括将包含本文所述的一种或多种黄原胶裂解酶(例如变体)的洗涤剂组合物连同一种或多种内切葡聚糖酶一起施加于黄原胶。在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物。还涵盖的是具有酶去垢益处的黄原胶裂解酶(例如变体)在所述洗涤剂组合物中的用途。

已考虑单独使用如本文所述的黄原胶裂解酶(例如，变体)给予酶去垢益处，优选对黄原胶的酶去垢益处。

在一些方面，本发明涉及包含一种或多种洗涤剂组分和如本文所述的分离的黄原胶裂解酶(例如变体)连同GH9内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物的用途。在一些方面，本发明涉及包含一种或多种洗涤剂组分和分离的黄原胶裂解酶(例如本文所述的变体)连同GH9内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物的用途。

本发明在下述段落中进一步限定：

1.一种包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自以下的区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，

其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、或至少99％且小于100％的序列同一性；优选地，所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

2.段落1的洗涤剂组合物，其中所述黄原胶裂解酶变体是选自以下的亲本黄原胶裂解酶的变体：

a)与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽；

b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；

c)由与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的多核苷酸编码的多肽；和

d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的片段，其具有黄原胶裂解酶活性。

3.段落2的洗涤剂组合物，其中所述亲本黄原胶裂解酶与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

4.段落2-3中任一项的洗涤剂组合物，其中所述亲本黄原胶裂解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在极低严格条件、中等严格条件、中高严格条件、高严格条件或极高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体。

5.段落2-4任一项的洗涤剂组合物，其中所述亲本黄原胶裂解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

6.段落2-5中任一项的洗涤剂组合物，其中所述亲本黄原胶裂解酶包含SEQ IDNO：2的成熟多肽或由其组成。

7.段落2-6中任一项的洗涤剂组合物，其中所述亲本黄原胶裂解酶是SEQ ID NO：2的成熟多肽的片段，其中所述片段具有黄原胶裂解酶活性。

8.段落2-7中任一项的洗涤剂组合物，其中所述黄原胶裂解酶变体与亲本黄原胶裂解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。

9.段落1-8中任一项的洗涤剂组合物，其中选自区域1-6的所述区域是螯合剂诱导的不稳定区域；

优选地，(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述螯合剂诱导的不稳定区域具有下述特点中的一个或多个：

i)在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域在构象上更不稳定；和/或

ii)在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域更暴露于所述螯合剂；和/或

iii)在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域更容易接近所述螯合剂；和/或

iv)在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域更构象动态；和/或

v)在螯合剂的存在下，比其一个或多个或全部相邻区域更容易接受氘掺入；

进一步优选地，所述相邻区域选自：

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

viii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

ix)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

x)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

xi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

xii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，

进一步最优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

10.段落1-9中任一项的洗涤剂组合物，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自区域1-6的(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区域比其一个或多个或全部相邻区域在构象上更不稳定；

优选地，所述相邻区域选自：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，

进一步优选地，所述洗涤剂组分包含螯合剂；进一步最优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

11.段落1-10中任一项的洗涤剂组合物，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自区域1-6的(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区域比其一个或多个或全部相邻区域更暴露于所述洗涤剂组分；

优选地，所述相邻区域选自：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，

12.段落1-11中任一项的洗涤剂组合物，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自区域1-6的(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区域比其一个或多个或全部相邻区域更容易接近所述洗涤剂组分；

优选地，所述相邻区域选自：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，

13.段落1-12中任一项的洗涤剂组合物，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自区域1-6的(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区域比其一个或多个或全部相邻区域更构象动态；

优选地，所述相邻区域选自：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，

14.段落1-13中任一项的洗涤剂组合物，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自区域1-6的(例如，SEQ ID NO：2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区域比其一个或多个或全部相邻区域更容易接受氘掺入；

优选地，所述相邻区域选自：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13，

15.段落1-14中任一项的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自以下的两个或更多个区域中的一个或多个位置处的改变(例如，取代、缺失或插入)：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，

其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、或至少99％且小于100％的序列同一性，优选地，所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地，所述活性是黄原胶降解活性。

16.段落1-15中任一项的洗涤剂组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

17.段落1-16中任一项的洗涤剂组合物，其中在一个或多个位置处的所述改变(例如，取代、缺失或插入)选自以下位置中的改变：SEQ ID NO：2的155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998，其中编号根据SEQ ID NO：2，优选以下位置中的改变：775、779或923，其中编号根据SEQ ID NO：2。

18.段落1-17中任一项的洗涤剂组合物，其中在一个或多个位置处的所述改变选自：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K，其中编号根据SEQID NO：2。

19.段落1-18中任一项的洗涤剂组合物，其进一步包含在选自以下的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变：

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

viii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

ix)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

x)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

xi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

xii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

xiii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13。

20.段落19的洗涤剂组合物，其中在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的所述改变是在选自以下的一个或多个位置处的改变：SEQ IDNO：2的9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016。

21.段落20的洗涤剂组合物，其中在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的所述改变包含选自以下的一个或多个取代：SEQ ID NO：2的K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T。

22.段落1-21的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在选自SEQ ID NO：2的位置624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915的一个或多个位置处的改变，以及在选自位置89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016的一个或多个位置处的改变。

23.段落22的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含选自Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y N1008D和K1016T的一个或多个取代，以及选自A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A的一个或多个取代。

24.段落1-23中任一项的洗涤剂组合物，其中与亲本黄原胶裂解酶(例如，SEQ IDNO：2)相比，改变总数目在1和20之间，例如在1和10之间或在1和5之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

25.段落1-24中任一项的洗涤剂组合物，其中所述对黄原胶的活性是黄原胶降解活性，优选地，所述黄原胶裂解酶变体具有EC4.2.2.12活性。

26.段落1-25中任一项的洗涤剂组合物，其中与亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQID NO：2)相比，所述变体在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性；优选地，所述洗涤剂组合物包含螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

27.段落1-26任一项的洗涤剂组合物，其中相对于亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO：2的黄原胶裂解酶，所述变体具有≥1.0的半衰期改善系数(HIF)；优选地，所述变体具有>1.0，更优选至少1.2，例如至少1.5，例如至少2.0的半衰期改善系数(HIF)。

28.段落27的洗涤剂组合物，其中在将所述黄原胶裂解酶变体在洗涤剂组合物中在25℃下温育约30分钟到约20小时的时间段后测定所述半衰期改善系数(HIF)。

29.段落1-28中任一项的洗涤剂组合物，其中所述变体选自：i)本文表1中列出的黄原胶裂解酶变体，ii)本文表2中列出的黄原胶裂解酶变体，iii)本文表3中列出的黄原胶裂解酶变体，iv)本文表4中列出的黄原胶裂解酶变体，v)本文表5中列出的黄原胶裂解酶变体，ⅵ)本文表6中列出的黄原胶裂解酶变体，和vii)本文表7、8、9、10、11、12或13中任一个中列出的黄原胶裂解酶变体。

30.段落1-29中任一项的洗涤剂组合物，其中所述组合物包含一种或多种洗涤剂组分；优选地，所述组分包含螯合剂；进一步优选地，所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。

31.段落1-30任一项的组合物，其进一步包含选自以下的一种或多种另外的酶：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣多糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶、或其任何混合物。

32.段落1-31中任一项的组合物，其中所述组合物的形式为条，均质片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个区室的小袋，常规或致密粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或者常规、致密或浓缩液体。

34.段落1-32中任一项的洗涤剂组合物的用途，其中所述用途是用于降解黄原胶。

35.段落34的用途，其中所述黄原胶裂解酶变体具有酶去垢益处。

通过下述实施例进一步描述本发明，所述实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：氢交换-HDX

通过在5mM EDTA的不存在或存在下，将99.9％氘代的20mM Tris，1mM CaCl2，pH 8加入至85％的最终氘浓度，起始SEQ ID NO：2的亲本黄原胶裂解酶的连续酰胺氢/氘(H/D)交换。H/D交换在22℃下以1μM的浓度一式三份进行。在范围为15秒至1小时的五个时间点，通过加入1：1(v/v)冰冷的6M盐酸胍，300mM磷酸盐，pH 2.05至2.6的最终pH，来猝灭样品。将猝灭的样品立即冷冻且贮存在-80℃下直至LC-MS分析。遵循相同的程序制备非氘化样品，但使用蛋白质缓冲液。通过在99.9％氘代的6M盐酸胍中的过夜温育制备完全氘化的样品(对于SEQ ID NO：2的亲本黄原胶裂解酶，85％D₂O)，并且在300mM磷酸盐，pH 2.3中猝灭至2.6的最终pH。为了研究EDTA对黄原胶裂解酶的作用的可逆性，对三种状态的黄原胶裂解酶(XL)完成H/D交换10分钟：(1)XL；(2)XL+5mM EDTA；(3)XL XL与第一个5mM EDTA预温育30分钟，并且第二个与10mM CaCl2预温育30分钟。如上所述猝灭样品。

将猝灭的样品加载到冷却的HDX-UPLC系统内，用于使用固定的胃蛋白酶柱(Pierce，Rockford，USA)的在线胃蛋白酶消化。使用捕获柱(Waters VanGuard C18，1.7μM，2.1x 5mm)，以200μl/分钟0.23％甲酸的流速，将肽脱盐3分钟，并且通过反相层析(WatersAcquity BEH C18，1.7μm，1x 100mm)分离肽，使用2分钟内8-18％和10分钟内18-40％的两步梯度，以40μl/分钟流速的0.23％甲酸的乙腈溶液。使用Synapt G2质谱仪(Waters，Milford，USA)对肽进行具有离子迁移率的正电喷雾电离质谱法。

使用数据独立(MSe)和数据依赖性采集方案(DDA)的组合、以及在Protein LynxGlobal Server v.2.5中的数据分析，通过非氘代样品的串联质谱法鉴定SEQ ID NO：2的成熟亲本黄原胶裂解酶的胃酶解肽。在DynamX v.3.0或HXexpress中测定各个肽的氘掺入(M.Guttman，D.Weis，J.Engen，K.Lee，J.Am.Soc.Mass.Spectrom.2013，24，1906-1912)。统计分析(F检验和斯氏T检验)用于确定分析的蛋白质状态之间的H/D交换(ΔDX)中的统计学显著变化。

选择具有H/D交换中的显著变化(ΔDX>0.5)的肽，作为鉴定SEQ ID NO：2内的螯合剂诱导的不稳定区域。在SEQ ID NO：2的黄原胶裂解酶内鉴定了下述螯合剂诱导的不稳定区域：对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，以及对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6。

实施例2：黄原胶裂解酶变体的构建和表达

将黄原胶裂解酶亲本基因(即SEQ ID NO：1)PCR组装成线性盒，其含有在上游的启动子系统和在下游的cat选择标记物。为了允许盒通过同源重组在枯草芽孢杆菌宿主的Pel基因座处的染色体整合，在盒的两侧上均包括与整合位点相同的>2kb DNA序列。从含有黄原胶裂解酶亲本基因(SEQ ID NO：1)的菌株制备的基因组DNA用作模板，用于生成定点突变体。诱变正向和反向引物用于生成大约6kb的PCR片段。该片段连同另一个正向引物一起用作大引物，以扩增>8kb的DNA片段。含有完整的盒(启动子系统、黄原胶裂解酶和cat基因，连同在Pel基因座处的重组所需的同源DNA序列)的该片段用于转化。

盒中使用的三重启动子系统已在WO 99/43835中描述，并且它由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子(包括稳定序列)组成。包括来自克劳氏芽孢杆菌的蛋白酶信号序列，以将蛋白质输出细胞。

SEQ ID NO：2的成熟亲本黄原胶裂解酶的生成变体显示于下表1和2中。通过测序确认改变的存在。

将含有变体的芽孢杆菌属生物在含有氯霉素(6μg/ml)的LB肉汤中接种，并且在37℃下生长过夜。为了表达黄原胶裂解酶变体，将2％的过夜培养物加入1000ml带挡板的烧瓶中的300ml 10-R培养基中，并且在30℃下在180rpm下生长96小时。

10-R培养基含有33g/L可溶性淀粉、6g/L(NH4)2HPO4、5g/L马铃薯蛋白胨、1.2g/L(MgSO4x 7H2O)、12g/L KH2PO4、5g/L(Na2HPO4x 2H2O)、18mL/L痕量金属溶液、1.8g/LK2SO4和0.1g/L(CaCl2x 2H2O)和0.5mL/L SB2121(消泡剂)。通过混合0.49g/L(MnSO4xH2O)、1.97g/L(FeSO4x 7H2O)、0.1g/L(CuSO4x 5H2O)、0.3g/L ZnCl2和19.6g/L柠檬酸，来制备痕量金属溶液。

实施例3：黄原胶裂解酶变体的纯化

在纯化之前，通过在10℃下以8000x g离心30分钟，随后为在Buchner漏斗中使用Seitz过滤器(K250)和WHATMAN玻璃过滤器GF/F级的组合的真空过滤，来澄清枯草芽孢杆菌肉汤。最后，将上清液通过0.22μ切向流过滤装置过滤。

使用三步自动串联柱层析纯化黄原胶裂解酶变体。Macro-Prep Methyl HIC柱用含有1M(NH4)2SO4和1mM CaCl2缓冲液的50mM Tris，pH 8.0预平衡。在样品加载到柱上的过程中，澄清的培养上清液(250mL)用含有2M(NH4)2SO4和1mM CaCl2缓冲液的50mM Tris，pH8.0在线1：1稀释，以使最终浓度达到1M。用平衡缓冲液洗涤未结合或弱结合的蛋白质，直至在280nm处的吸光度低于0.1AU。使用含有0.5M(NH4)2SO4和1mM CaCl2的50mM Tris pH 8进行洗脱。将洗脱的蛋白质峰自动加载到MEP-Hypercel柱上，所述柱用含有0.5M(NH4)2SO4和1mM CaCl2的50mM Tris，pH 8预平衡。用平衡缓冲液洗涤未结合或弱结合的蛋白质，直至在280nm处的吸光度低于0.1AU。再次用含有1mM CaCl2的50mM Tris，pH 8洗涤柱，以去除杂质。用含有1mM CaCl2的50mM乙酸钠，pH 5洗脱纯化的蛋白质。将洗脱的纯化蛋白质自动转移至Sephadex G-25柱用于脱盐，所述柱用含有1mM CaCl2的50mM MOPS，pH 8预平衡。

实施例4：洗涤剂稳定性测定

用于洗涤剂稳定性测定的试剂如下制备：

通过将209.26g 3-吗啉代丙磺酸溶解于Milli Q水中，制备1.0M MOPS缓冲液原液。使用NaOH将pH调节至7.5，并且将最终体积的缓冲液补足至1000ml。将该缓冲液原液贮存于4℃下直至使用时。通过将50ml的1.0M原液加入950ml Milli Q水中，制备MOPS缓冲液的50mM工作溶液。

通过将400mg黄原胶溶解于100ml Milli Q水中，新鲜制备0.4％w/v黄原胶的底物溶液。

通过将106.99g Na2CO3、47.98g酒石酸钾钠和2.42mg(Bi(NO3)3x 5H2O)溶解于Milli Q水中，制备含有1.0M Na2CO3、0.17M酒石酸钾钠和5mM(Bi(NO3)3x 5H2O)的储备溶液混合物，最终体积为1000ml。将该储备溶液混合物过滤且贮存于室温下。

通过将1.5g对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)溶解于储备溶液混合物中，来新鲜制备PAHBAH试剂(1.5％PAHBAH)。

洗涤剂稳定性测定：

A.筛选变体的培养上清液

通过在30℃下与洗涤剂(70％，最终浓度)温育后，测量变体或野生型对照的培养物上清液中存在的酶促活性，来确定洗涤剂内稳定性。

通过将30μl培养上清液和70μl Persil Universal Gel洗涤剂(100％)加入96孔微量滴定板的孔内进行洗涤剂应激，所述微量滴定板在1000rpm下振荡15分钟。产生两块相同的板，其中一块板在4℃下温育(无应激板)，而另一块板在30℃下温育1小时(应激板)。在温育后，将来自无应激板和应激板的样品用稀释缓冲液(50mM MOPS，5mM CaCl2，pH 7.5)稀释50X。

为了测量稀释的酶-洗涤剂样品的酶活性，在96孔PCR板中制备反应混合物。将50μl稀释的样品与50μl新鲜制备的底物溶液混合，并且在40℃下温育1小时。

在温育后，将75μl PAHBAH试剂加入相同PCR板中的反应混合物中，并且在可编程的热循环仪(T-ROBOT)中在90℃下温育10分钟，随后为在10℃下的后续冷却。将样品(25μl)转移到384孔微量滴定板中，并且使用Infinite M1000读数器(TECAN，瑞士)在405nm处测量吸光度。

关于变体和野生型对照的残留活性(RA)计算为相对于在4℃下温育后剩余的酶促活性，在30℃下温育后剩余的酶促活性的百分比，即，在扣除有关背景吸光度贡献之后根据下式：

残留活性(RA)＝100％*Abs405(在30℃下温育的样品)/Abs405(在4℃下温育的样品)。

挑选就在板中生长的野生型而言具有较高洗涤剂稳定性的变体。

B.筛选纯化的变体

通过在30℃下与洗涤剂(90％，最终浓度)温育后，测量纯化蛋白质的酶活性，来确定纯化的变体的洗涤剂稳定性。

使用50mM MOPS缓冲液，将纯化的变体稀释至200ppm的浓度。对于洗涤剂处理，将10μl稀释的纯化样品与90μl Persil Universal Gel洗涤剂(100％)混合到96孔微量滴定板的孔内，所述微量滴定板在1000rpm下振荡20分钟。产生两块相同的板，其中一块板在4℃下温育(无应激板)，而另一块板在30℃下温育1小时(应激板)。在温育后，将来自无应激板和应激板的样品用稀释缓冲液(50mM MOPS，1mM CaCl2，pH7.5)稀释50X。

如节段A中所述完成无应激样品和应激样品的酶促活性分析。

C.计算半衰期和半衰期改善系数(HIF)

对于野生型对照和/或变体，在给定的洗涤剂浓度和贮存温度下计算半衰期(T1/2(以小时计))，因为降解遵循指数衰减并且温育时间(小时)是已知的，即，根据下式：

T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间

T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间

其中“RA”是如上计算的以百分比计的残留活性，并且“时间”是以小时计的温育时间。

在给定的一组贮存条件(洗涤剂浓度和温度)下，半衰期改善系数(HIF)计算为HIF＝T1/2(变体)/T1/2(野生型)，其中野生型在与变体相同的贮存条件下温育。

对于纯化的变体所获得的HIF值显示于下表3中。

表3.纯化的变体的半衰期改善系数：

对于变体的培养上清液所获得的HIF值显示于下表4中。

实施例5：黄原胶裂解酶变体的半衰期

如上文实施例2和3中所述制备且纯化SEQ ID NO：2的成熟亲本黄原胶裂解酶的变体。通过在与洗涤剂一起温育后，测量变体的任一培养物上清液或纯化样品中存在的酶促活性，如实施例4中所述测定变体的洗涤剂内稳定性。对于培养上清液在30℃下使用70％浓度的Persil Universal Gel洗涤剂(PUG)，并且对于纯化的变体在30℃下使用70％或90％浓度的PUG洗涤剂进行温育，其中对于培养上清液变体温育时间为一小时，并且对于纯化变体为一小时或三小时。

关于培养上清液的半衰期和计算的半衰期改善系数(HIF)值在下表5中提供。表6显示了关于纯化变体的半衰期和半衰期改善系数(HIF)，其中基于0.22小时的野生型半衰期计算与70％洗涤剂浓度一起温育的变体的HIF，并且基于0.20小时的野生型半衰期计算与90％洗涤剂浓度一起温育的变体的HIF。

表5.变体的培养上清液的半衰期和半衰期改善系数(HIF)

表6.纯化变体的半衰期和半衰期改善系数(HIF)

实施例6：在螯合剂诱导的不稳定区域和相邻区域中具有突变的黄原胶裂解酶变体的半衰期

如上文实施例2和3中所述制备且纯化SEQ ID NO：2的成熟亲本黄原胶裂解酶的变体。为了该实施例的目的，产生在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域(区域1、2、3、4、5、6)和至少一个相邻区域(区域7、8、9、10、11、12、13)中具有突变的变体。如实施例4中所述，通过测量与洗涤剂温育后变体的纯化样品中存在的酶促活性，来测定变体的洗涤剂内稳定性。使用70％、90％或95％浓度的Persil Universal Gel洗涤剂(PUG)进行温育，其中温育在30、32、35或37℃的温度下，并且变体温育时间范围为一小时至最多840小时

如上文实施例4中所述计算半衰期。在其中野生型和变体之间的稳定性差异太大而无法使用相同的温育时间准确地评价关于野生型和变体两者的半衰期的情况下，关于野生型和变体的温育时间是不同的，例如对于野生型1小时和对于最稳定的变体最多840小时。

此外，为了确定对于更稳定的变体在较短的温育持续时间内的稳定性(半衰期)，例如，<168小时，关于一些变体的温育温度增加2-7℃。对于在较高温度(即>30℃)下测试的变体，无法计算基于野生型的HIF值，因为在这些温度下无法准确地确定野生型的半衰期(分钟数量级)。因此，下表中变体的稳定性根据半衰期(以小时计)报告。

下表7-13显示了关于纯化变体的半衰期连同关于每种变体的测试条件(温度、洗涤剂浓度、温育时间)的信息。

表7.纯化变体的半衰期：温度(T)30℃，洗涤剂浓度70％

突变	T(℃)	洗涤剂(％)	温育时间(小时)	半衰期(小时)
					无突变(野生型)	30	70	1	0.22
K620R、K855R	30	70	1	1.0
					K329R、K745R	30	70	1	0.8
K360R、K745R	30	70	1	0.7
					A293G、K567R、S579R、K620R	30	70	1	1.5
S100D、N991D	30	70	1	0.5

表8.纯化变体的半衰期：温度(T)30℃，洗涤剂浓度90％

表9.纯化变体的半衰期：温度(T)30℃，洗涤剂浓度95％

表10.纯化变体的半衰期：温度(T)32℃，洗涤剂浓度90％

表11.纯化变体的半衰期：温度(T)35℃，洗涤剂浓度90％

表12.纯化变体的半衰期：温度(T)35℃，洗涤剂浓度95％

表13.纯化变体的半衰期：温度(T)37℃，洗涤剂浓度90％

序列表

<110> 汉高股份有限及两合公司

<120> 包含黄原胶裂解酶变体I的洗涤剂组合物

<130> PT034077PCT

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3111

<212> DNA

<213> Paenibacillus sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3111)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (1)..(3111)

<400> 1

gac gag ttt gac acg cta agg gaa aag tat aag gcc atg ctg aac gga 48

Asp Glu Phe Asp Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly

1 5 10 15

ggg aca acc tat aat ctc tcc gac ccg gat ata gcg gcg cgt gtt aat 96

Gly Thr Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn

20 25 30

gcc att acg gtg act gcc cag gga tac tgg gac tcc atg ctt aaa gat 144

Ala Ile Thr Val Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp

35 40 45

ccg aac cgt aac cgt ctt tgg aac gat gca ccc ttt ggc tcg gat tcg 192

Pro Asn Arg Asn Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser

50 55 60

act tcc atc acc acg acc tac aga cac ctt tat gat atg gcg cta gct 240

Thr Ser Ile Thr Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala

65 70 75 80

tat acg act tat ggc tcc agt ctg cag ggc aat gcc gca ctt aaa gcg 288

Tyr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala

85 90 95

gat att atc agc ggt ttg gac tgg atg aat gcc aat caa ttt tat aat 336

Asp Ile Ile Ser Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn

100 105 110

ggc tgc agc caa tat caa aac tgg tgg cac tgg caa att ggc ggt ccc 384

Gly Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro

115 120 125

atg gcc ttg aat gat atc gtg gca tta atg tac acg gag cta acc gca 432

Met Ala Leu Asn Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala

130 135 140

aca caa att tcc aat tac atg gcg gcc att tat tac acc caa gcg agt 480

Thr Gln Ile Ser Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser

145 150 155 160

gtt acg atg acg ggg gca aac cgg cta tgg gaa agt cag gtt att gcc 528

Val Thr Met Thr Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala

165 170 175

atc tcc gga atc ttg aat aag gat tcc gcc aga gtt gcc gct ggt cgg 576

Ile Ser Gly Ile Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg

180 185 190

gat ggc atc agc gct ttg ctg ccg tat gtc gcc aag ggt gac gga ttt 624

Asp Gly Ile Ser Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe

195 200 205

tac aac gat gga tca ttc gtt cag cat act tat tat gct tac aac ggt 672

Tyr Asn Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly

210 215 220

ggt tat ggt tca gag ctg tta tct ggc att gca gac ttg ata ttt att 720

Gly Tyr Gly Ser Glu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile

225 230 235 240

ttg aat ggc tct tca tgg cag gta acg gat cct aat aaa aac aat gta 768

Leu Asn Gly Ser Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val

245 250 255

tac cgt tgg att tat gat tcc tac gag cct ttc atc tat aaa ggg aat 816

Tyr Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn

260 265 270

ctg atg gac atg gtc cgc ggt aga gag atc tca agg cat gga ttg cag 864

Leu Met Asp Met Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln

275 280 285

gac gat aag gca gcc gtg act gtg atg gca tcg atc att cgt ctg tca 912

Asp Asp Lys Ala Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser

290 295 300

caa acc gct gct tcc gcc gat gct acc gca ttt aag aga atg gtg aaa 960

Gln Thr Ala Ala Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys

305 310 315 320

tat tgg ctg ctg ctg gat acg gat aag act ttc ctt aaa gca gta tcg 1008

Tyr Trp Leu Leu Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser

325 330 335

att gat ctg att att gcc gcg aac caa ctg gtg aac gat tcc acc gtt 1056

Ile Asp Leu Ile Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val

340 345 350

acc tct cga ggg gag cta gtg aaa tat aaa caa ttc tcc gga atg gac 1104

Thr Ser Arg Gly Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp

355 360 365

cgc gct gta cag ctt aga cct ggc ttc ggt ttt ggg ctt agc atg ttt 1152

Arg Ala Val Gln Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe

370 375 380

tcc agc cgg atc ggt aat tat gag tcg att aat gca gag aac aac aaa 1200

Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys

385 390 395 400

ggc tgg cat acc ggc gac ggc atg acc tac ctt tac aat act gac ctg 1248

Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu

405 410 415

agt cag ttc aat gac cat ttc tgg gca act gtg gat aat tac cga ttg 1296

Ser Gln Phe Asn Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu

420 425 430

ccg ggt acc aca gtg ctc cag aac acg acg caa acc gcg aac agc cgc 1344

Pro Gly Thr Thr Val Leu Gln Asn Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg

435 440 445

agc gac aaa agc tgg gcc gga gga acg gat att ctt ggg caa tat ggt 1392

Ser Asp Lys Ser Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly

450 455 460

gtt tcc ggc atg gaa ctg cat acc gta ggt aag agc ctg aca gcc aag 1440

Val Ser Gly Met Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys

465 470 475 480

aaa tcc tgg ttc atg ttt gac gat gag atc gtc gcg ctg ggt tca ggt 1488

Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly

485 490 495

att gcc agc acc gat ggc atc gca acc gaa acg att gta gag aat cga 1536

Ile Ala Ser Thr Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg

500 505 510

aag ctc aat agc agc ggc aat aat gca ttg att gtt aac ggg acg gcg 1584

Lys Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala

515 520 525

aag ccg ggc tcc ctt gga tgg tcg gaa aca atg acc gga acc aat tat 1632

Lys Pro Gly Ser Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr

530 535 540

att cat cta gcc ggc agc gta ccc ggc tcc gat atc ggt tat tat ttt 1680

Ile His Leu Ala Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe

545 550 555 560

cct ggt gga gca gca gtc aaa ggc ttg cgt gaa gcc cgg tcg gga agc 1728

Pro Gly Gly Ala Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser

565 570 575

tgg agc tcg ctg aat tcc tcc gca tcc tgg aag gac tcg aca ttg cat 1776

Trp Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His

580 585 590

aca cgc aac ttt atg acg ctt tgg ttc gat cat ggc atg aac ccg aca 1824

Thr Arg Asn Phe Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr

595 600 605

aac ggt agt tat tct tat gtg ctg ctt ccg aat aag acc agc agt gcg 1872

Asn Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Ala

610 615 620

gtg gcc agc tat gct gca acg cct cag atc agc att ctg gag aat tct 1920

Val Ala Ser Tyr Ala Ala Thr Pro Gln Ile Ser Ile Leu Glu Asn Ser

625 630 635 640

agc tcg gcg caa gcg gtg aag gag acg caa ttg aat gtc acc gga att 1968

Ser Ser Ala Gln Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile

645 650 655

aac ttt tgg aac gat gag cca acc acg gtg ggc ctg gtt act tcc aat 2016

Asn Phe Trp Asn Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asn

660 665 670

cgg aaa gca tcc gtt atg aca aaa gaa acg gct agt gat ttc gag ata 2064

Arg Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile

675 680 685

tcc gtt tcc gac ccg acc caa agt aat gtg ggg acc atc tat att gat 2112

Ser Val Ser Asp Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp

690 695 700

gtc aac aaa agt gca acc gga ttg att tcg aag gat aat gaa ata acg 2160

Val Asn Lys Ser Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr

705 710 715 720

gtc att cag tac tac cca acc atg aag ttt aaa gtc aat gta aac aat 2208

Val Ile Gln Tyr Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn

725 730 735

tct ggc ggg aag tcc tat aaa gta aag ttt agc ctg aca gga aca ccc 2256

Ser Gly Gly Lys Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro

740 745 750

ggc agc aac ccg tct cca atc ccg ata ccg aat cct tac gaa gcg gaa 2304

Gly Ser Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu

755 760 765

gct ttg cca att aac gct ctg aca gat act ccc gtg gtt tac aat gat 2352

Ala Leu Pro Ile Asn Ala Leu Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp

770 775 780

gcc aat gcc agt ggt ggc aag aag ctt ggc ttc aat aac aat gca gtg 2400

Ala Asn Ala Ser Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val

785 790 795 800

gat gat tat gtg gag ttc agt ctg gac gtc aca cag ccc ggc acc tac 2448

Asp Asp Tyr Val Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr

805 810 815

gat gtc aaa tcc cgg att atg aaa tca acg aac agc ggg att tat cag 2496

Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln

820 825 830

ctg tct att aat ggg acc aac gta ggg agc gcg cag gat atg ttc tgg 2544

Leu Ser Ile Asn Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp

835 840 845

acg acc tcc gag ctg tct aag gag ttt act atg ggc tca tac agc ttc 2592

Thr Thr Ser Glu Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe

850 855 860

agc aca ccc ggg agc tat ttg ttc cga tta aaa aca acc ggc aag aat 2640

Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Lys Thr Thr Gly Lys Asn

865 870 875 880

gtc agt tct tca gga tat aag ctg atg ctg gac aat ttt agt ctg gta 2688

Val Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Asn Phe Ser Leu Val

885 890 895

tca aca ggt att gat aca acg gtg att gtg gac aat gcc gat gca gct 2736

Ser Thr Gly Ile Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala

900 905 910

ggt gtt acg aag gtg ggt act tgg acc gga acc aat acg cag acc gat 2784

Gly Val Thr Lys Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp

915 920 925

cgg tac ggc gcc gac tac att cac gat ggg aac acg ggg aaa ggt acg 2832

Arg Tyr Gly Ala Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr

930 935 940

aag agc gtt acc ttt act cca aat gta cct atc agt gga act tat cag 2880

Lys Ser Val Thr Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln

945 950 955 960

gtt tac atg atg tgg gct gcc cat acg aat agg gca acg aat gtt ccc 2928

Val Tyr Met Met Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro

965 970 975

gta gac gta acg cat tca ggc ggt aca gca acg cta aat gtt aac caa 2976

Val Asp Val Thr His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln

980 985 990

caa ggt aat ggt ggt gtg tgg aat tta ctg ggt acg tat agc ttt aat 3024

Gln Gly Asn Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn

995 1000 1005

gct ggg tcc acg ggg gct atc aag atc cgt acg gac gcg acg aat 3069

Ala Gly Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn

1010 1015 1020

gga tat gtt gta gcc gat gcc gtg aag ctg gta aag gtc cca 3111

Gly Tyr Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro

1025 1030 1035

<210> 2

<211> 1037

<212> PRT

<213> Paenibacillus sp.

<400> 2

Asp Glu Phe Asp Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Val Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp

35 40 45

Pro Asn Arg Asn Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser

50 55 60

Thr Ser Ile Thr Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala

85 90 95

Asp Ile Ile Ser Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn

100 105 110

Gly Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro

115 120 125

Met Ala Leu Asn Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala

130 135 140

Thr Gln Ile Ser Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser

145 150 155 160

Val Thr Met Thr Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala

165 170 175

Ile Ser Gly Ile Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg

180 185 190

Asp Gly Ile Ser Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe

195 200 205

Tyr Asn Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly

210 215 220

Gly Tyr Gly Ser Glu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile

225 230 235 240

Leu Asn Gly Ser Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val

245 250 255

Tyr Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn

260 265 270

Leu Met Asp Met Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln

275 280 285

Asp Asp Lys Ala Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser

290 295 300

Gln Thr Ala Ala Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys

305 310 315 320

Tyr Trp Leu Leu Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser

325 330 335

Ile Asp Leu Ile Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val

340 345 350

Thr Ser Arg Gly Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp

355 360 365

Arg Ala Val Gln Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe

370 375 380

Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys

385 390 395 400

Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu

405 410 415

Ser Gln Phe Asn Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu

420 425 430

Pro Gly Thr Thr Val Leu Gln Asn Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg

435 440 445

Ser Asp Lys Ser Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly

450 455 460

Val Ser Gly Met Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys

465 470 475 480

Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly

485 490 495

Ile Ala Ser Thr Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg

500 505 510

Lys Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala

515 520 525

Lys Pro Gly Ser Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr

530 535 540

Ile His Leu Ala Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe

545 550 555 560

Pro Gly Gly Ala Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser

565 570 575

Trp Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His

580 585 590

Thr Arg Asn Phe Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr

595 600 605

Asn Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Ala

610 615 620

Val Ala Ser Tyr Ala Ala Thr Pro Gln Ile Ser Ile Leu Glu Asn Ser

625 630 635 640

Ser Ser Ala Gln Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile

645 650 655

Asn Phe Trp Asn Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asn

660 665 670

Arg Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile

675 680 685

Ser Val Ser Asp Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp

690 695 700

Val Asn Lys Ser Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr

705 710 715 720

Val Ile Gln Tyr Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn

725 730 735

Ser Gly Gly Lys Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro

740 745 750

Gly Ser Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu

755 760 765

Ala Leu Pro Ile Asn Ala Leu Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp

770 775 780

Ala Asn Ala Ser Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val

785 790 795 800

Asp Asp Tyr Val Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr

805 810 815

Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln

820 825 830

Leu Ser Ile Asn Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp

835 840 845

Thr Thr Ser Glu Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe

850 855 860

Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Lys Thr Thr Gly Lys Asn

865 870 875 880

Val Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Asn Phe Ser Leu Val

885 890 895

Ser Thr Gly Ile Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala

900 905 910

Gly Val Thr Lys Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp

915 920 925

Arg Tyr Gly Ala Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr

930 935 940

Lys Ser Val Thr Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln

945 950 955 960

Val Tyr Met Met Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro

965 970 975

Val Asp Val Thr His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln

980 985 990

Gln Gly Asn Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn

995 1000 1005

Ala Gly Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn

1010 1015 1020

Gly Tyr Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro

1025 1030 1035

Claims

1.一种包含黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体包含在至少一个螯合剂诱导的不稳定区域中的一个或多个位置处的改变，所述不稳定区域选自：

i)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸731至803的区域3，

ii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸903至1004的区域6，

iii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸154至176的区域1，

iv)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸614至658的区域2，

v)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸807至846的区域4，和

vi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸872至885的区域5，

其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少60％且小于100％的序列同一性。

2.权利要求1的洗涤剂组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

3.权利要求1或2的洗涤剂组合物，其中所述的在一个或多个位置处的改变选自以下位置中的改变：155、159、620、624、626、631、635、649、650、656、738、745、752、753、754、757、769、775、777、779、782、786、789、792、796、799、801、819、824、843、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、933、941、966、991和998，其中编号根据SEQ ID NO：2。

4.权利要求1-3中任一项的洗涤剂组合物，其中所述的在一个或多个位置处的改变选自：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626Q、T631N、S635E、S635T、T649V、T649K、Q650G、I656V、G738L、K745R、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、A769D、A769T、A769R、L775A、L775F、L775I、L775M、L775Q、L775S、L775Y、D777R、P779V、Y782I、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、D801G、K819R、K824R、A843P、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911M、A911V、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915S、T915V、T915Q、T919D、T919F、T919G、T921R、T921S、T923D、T923H、T925D、T925Q、T925R、T927K、D928W、Y930F、Y930H、Y930L、D933M、G941D、G941E、A966P、N991D和V998K，其中编号根据SEQ ID NO：2。

5.权利要求1-4中任一项的洗涤剂组合物，所述黄原胶裂解酶变体进一步包含在选自以下的至少一个区域中的一个或多个位置处的改变：

vii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1至153的区域7，

viii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸177至613的区域8，

ix)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸659至730的区域9，

x)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸804至806的区域10，

xi)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸847至871的区域11，

xii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸886至902的区域12，和

xiii)对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1005至1037的区域13。

6.权利要求5的洗涤剂组合物，其中在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的所述改变是在选自以下的一个或多个位置处的改变：9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016，其中编号根据SEQ ID NO：2。

7.权利要求6的洗涤剂组合物，其中在选自区域7、8、9、10、11、12和13的至少一个区域中的一个或多个位置处的所述改变包含选自以下的一个或多个取代：K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T，其中编号根据SEQ ID NO：2。

8.权利要求6的洗涤剂组合物，其中所述黄原胶裂解酶变体包含在选自SEQ ID NO：2的位置624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915的一个或多个位置处的改变，以及在选自位置89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016的一个或多个位置处的改变。

9.权利要求8的洗涤剂组合物，其中所述黄原胶裂解酶变体包含选自Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y N1008D和K1016T的一个或多个取代，以及选自A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A的一个或多个取代。

10.权利要求1-9中任一项的洗涤剂组合物，其中与亲本黄原胶裂解酶例如具有SEQ IDNO：2的黄原胶裂解酶相比，所述黄原胶裂解酶变体在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性。

11.权利要求1-10中任一项的洗涤剂组合物，其中相对于亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO：2的黄原胶裂解酶，所述黄原胶裂解酶变体具有>1.0，优选至少1.2，例如至少1.5，例如至少2.0的半衰期改善系数(HIF)。

12.权利要求1-11中任一项的包含至少一种黄原胶裂解酶变体的洗涤剂组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种洗涤剂组分。

13.权利要求1-12中任一项的洗涤剂组合物的用途，其中所述用途是用于降解黄原胶，例如在清洁过程例如衣物洗涤或硬质表面清洁例如餐具洗涤中降解黄原胶。