KR20140024365A - 조성물 - Google Patents
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Abstract
(a) 지방 분해 효소; (b) 본 명세서에 정의된 하이드로포빈; 및 선택적으로 (c) 세제를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 조성물은 지질-기재의 얼룩을 표면으로부터 제거하기 위한 세정 조성물로서 유용하다.
Description
본 발명은 조성물에 관한 것이지만, 이는 특별히 배타적으로 세제로 사용하기 위한 것은 아니다. 또한 본 발명은 표면 및 물품, 예를 들어 의류 물품 및 식탁용 식기류 물품을 본 조성물을 사용하여 세정하는 방법에 관한 것이다.
문헌[, Annu. Rev. Microbiol. 2001, 55, 625-646]에 기재된 바와 같이, 일반적으로 하이드로포빈은 사상균(filamentous fungi)의 성장 및 발달에 있어서 광범위한 역할을 하는 진균류 기원의 단백질이다. 예를 들어, 하이드로포빈은 기중 구조체(aerial structure)의 형성에 그리고 소수성 표면에의 균사의 부착에 연루되어 있다.
하이드로포빈이 그의 기능을 수행하는 기작은 소수성-친수성 계면 (특히 공기-물 계면)에서 양친매성 필름으로 자기-조립되는 그의 특성을 기반으로 한다.
전형적으로, 하이드로포빈은 클래스 I 및 II로 분류된다. 본 명세서에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 클래스 II 하이드로포빈의 조립된 양친매성 필름은 실온에서 일련의 용매에 재용해될 수 있다 (그러나 상기 용매는 특별히 배타적으로 수성 에탄올인 것은 아니다). 이와는 대조적으로, 클래스 I 하이드로포빈의 조립된 양친매성 필름은 훨씬 덜 용해성이어서, 단지 강산, 예를 들어 트라이플루오로아세트산 또는 포름산에 재용해된다.
하이드로포빈을 함유하는 세제 조성물은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2009/0101167호 (국제특허 공개 WO 2007/014897호에 대응)에는 텍스타일 세척에 있어서의 하이드로포빈, 특히 융합 하이드로포빈의 사용과 이를 함유하는 세척 조성물이 개시되어 있다.
더욱 적은 양으로 사용될 수 있고 이럼으로써 환경에 대한 영향을 최소화시킬 수 있는 계면활성제를 함유하는 세제 조성물에 대한 필요성이 본 기술 분야에 남아 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 하기를 포함하는 조성물이 제공된다:
(a) 지방 분해 효소; 및
(b) 본 명세서에 정의된 하이드로포빈.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 하기를 포함하는 조성물이 제공된다:
(a) 지방 분해 효소;
(b) 본 명세서에 정의된 하이드로포빈; 및
(c) 세제.
본 발명의 일 태양에 따르면, 하기를 포함하는 조성물이 제공된다:
(a) G가 글라이신이고 X가 옥시음이온 구멍(oxyanion hole)-형성 아미노산 잔기인 GX 지방 분해 효소로서, abH23, abH25 및 abH15로 이루어진 군으로부터 선택되는 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 GX 지방 분해 효소; 및(b) 본 명세서에 정의된 하이드로포빈.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 하기를 포함하는 조성물이 제공된다:
(a) G가 글라이신이고 X가 옥시음이온 구멍-형성 아미노산 잔기인 GX 지방 분해 효소;
(b) 본 명세서에 정의된 하이드로포빈; 및
(c) 세제.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 표면을 본 명세서에 정의된 조성물과 접촉시키는 단계에 의해 지질-기재 얼룩(stain)을 표면으로부터 제거하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 지질 얼룩을 표면으로부터 감소시키거나 또는 제거하기 위한 본 명세서에 정의된 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 표면을 본 명세서에 정의된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면을 세정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 물품, 특히 의류 물품 또는 식탁용 식기류 물품을 세정하는 방법이 제공되며, 이는 상기 물품을 본 명세서에 정의된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
이점
놀랍게도, 하이드로포빈, 지방 분해 효소 및 선택적으로 세제의 조합물이 표면, 예를 들어 텍스타일, 의류 또는 식탁용 식기류 표면으로부터 지성 오염물(oily soil)을 제거할 수 있음이 밝혀졌는데; 이러한 오염물을 기존의 상업적 세제를 사용하여 제거하는 것은 일반적으로 문제가 많다. 이러한 효과는 세척 조성물에 본 조합물을 사용할 가능성을 부여한다.
특히, 놀랍게도, 하이드로포빈과, 상기에 언급된 abH 수퍼패밀리로부터 선택되는 GX 지방 분해 효소의 조합물이, 단독으로 사용될 때의 이들 단백질 중 어느 하나의 상가 효과에서 예상되는 것보다 크게 향상된 세정 효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이들 특성은 본 조합물을 세척 조성물에서의 세제의 대체재로 사용하고 이럼으로써 이러한 조성물의 환경 영향을 최소화하는 가능성을 부여한다.
또한, 놀랍게도 하이드로포빈, GX 지방 분해 효소 및 세제의 조합물이, 단독으로 사용될 때의 이들 세 성분 중 임의의 것의 상가 효과에서 예상되는 것보다 크게 향상된 세정 효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이들 특성은 본 조합물을 세척 조성물에서 필요한 세제의 양을 최소화하고 이럼으로써 이러한 조성물의 환경 영향을 최소화하기 위하여 사용하는 가능성을 부여한다.
<도 1a>
도 1a는 열불활성화 액체 세제 아리엘(ARIEL)™ 컬러(Color)의 존재 하에, 그러나 지방 분해 효소의 부재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 얼룩 제거 지수(Stain Removal index; SRI)의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 1b>
도 1b는 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에, 그러나 지방 분해 효소의 부재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 1c>
도 1c는 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에, 그러나 지방 분해 효소의 부재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2a>
도 2a는 지방 분해 효소 리펙스(LIPEX)™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2b>
도 2b는 지방 분해 효소 리펙스™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2c>
도 2c는 지방 분해 효소 리펙스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2d>
도 2d는 지방 분해 효소 리펙스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2e>
도 2e는 지방 분해 효소 리펙스™의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3a>
도 3a는 지방 분해 효소 리포맥스(LIPOMAX)™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3b>
도 3b는 지방 분해 효소 리포맥스™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3c>
도 3c는 지방 분해 효소 리포맥스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3d>
도 3d는 지방 분해 효소 리포맥스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3e>
도 3e는 지방 분해 효소 리포맥스™의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4a>
도 4a는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4b>
도 4b는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4c>
도 4c는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4d>
도 4d는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4e>
도 4e는 지방 분해 효소 SprLip2의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5a>
도 5a는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5b>
도 5b는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5c>
도 5c는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5d>
도 5d는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5e>
도 5e는 지방 분해 효소 TfuLip2의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 6>
도 6은 서열 번호 1의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) HFBII (Y11894.1)를 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 7>
도 7은 서열 번호 2의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이 HFBII (P79073.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 8>
도 8은 서열 번호 3의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이 HFBI (Z68124.1)을 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 9>
도 9는 서열 번호 4의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이 HFBI (P52754.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 10>
도 10은 서열 번호 5의, 하이드로포빈 쉬조필룸 콤뮨(Schizophyllum commune) SC3 (M32329.1)을 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 11>
도 11은 서열 번호 6의, 하이드로포빈 쉬조필룸 콤뮨 SC3 (AAA96324.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 12>
도 12는 서열 번호 7의, 하이드로포빈 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) EAS (X67339.1)를 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 13>
도 13은 서열 번호 8의, 하이드로포빈 뉴로스포라 크라사 EAS (AAB24462.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 14>
도 14는 서열 번호 9의, 탈라로마이세스 서모필루스(Talaromyces thermophilus) TT1 (전구체형 TT1 하이드로포빈을 코딩하는 DNA 서열, 미국 특허 제7241734호의 서열 번호 4)을 나타내며;
<도 15>
도 15는 서열 번호 10의, 탈라로마이세스 서모필루스 TT1 (전구체형 TT1 하이드로포빈의 아미노산 서열, 미국 특허 제7241734호의 서열 번호 3)을 나타내며;
<도 16>
도 16은 서열 번호 11의, 리펙스™의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 17>
도 17은 서열 번호 12의, 볼드체로 나타낸 신호 서열을 포함하는 SprLip2 (스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis) ATCC 25486 Uniprot B5H9Q8, NCBI: ZP_06912654.1)의 전 아미노산 서열을 나타내며;
<도 18>
도 18은 서열 번호 13의, 푸사륨 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum) 포스포리파아제 (국제특허 공개 WO 2005/087918호에 개시되어 있으며 다니스코 에이/에스(Danisco A/S)로부터 그라인드아밀 파워베이크(GRINDAMYL POWERBAKE) 4100™으로 입수가능함)의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 19>
도 19는 서열 번호 29의, 국제특허 공개 WO 98/45453호에 개시된 리파아제 3의 전 아미노산 서열을 나타내고, 잔기 1 내지 270은 본 명세서에서 서열 번호 14의 서열로 칭해지는 성숙 서열을 포함하며;
<도 19a>
도 19a는 서열 번호 14의, 리파아제 3의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 20>
도 20은 서열 번호 15의, 리포맥스™의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 21>
도 21은 서열 번호 16의, TfuLip2의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 22>
도 22는 서열 번호 17의, SprLip2의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 23>
도 23은 서열 번호 18의, 리펙스의 전 아미노산 서열을 나타내고, 이는 신호 서열 (아미노산 잔기 1 내지 17), 프로펩티드 (아미노산 잔기 18 내지 22) 및 성숙 서열 (아미노산 잔기 23 내지 291 - 도 16에 서열 번호 11로 나타냄)을 포함하며;
<도 24>
도 24는 서열 번호 19의, 리포맥스의 전 아미노산 서열을 나타내고, 이는 신호 서열 (아미노산 잔기 1 내지 24) 및 성숙 서열 (아미노산 잔기 25 내지 313 - 도 20에 서열 번호 15로 나타냄)을 포함하며;
<도 25>
도 25는 서열 번호 20의, TfuLip2의 전 아미노산 서열을 나타내고, 이는 신호 서열 (아미노산 잔기 1 내지 40) 및 성숙 서열 (아미노산 잔기 41 내지 301 - 도 21에 서열 번호 16으로 나타냄)을 포함하며;
<도 26>
도 26은 국제특허 공개 WO 2005/087918호에 개시된 푸사륨 헤테로스포룸 CBS 782.83 (야생형) 유래의 지방 분해 효소의 서열 번호 21의 단백질 프리프로서열(preprosequence)을 나타내며, 상기 프리프로서열은 상기 효소의 성숙 형태가 바람직하게는 도 18에 서열 번호 13으로 나타낸 효소를 포함하도록 번역 변형을 겪고; 일부 숙주 유기체에서, 상기 단백질은 다수의 추가의 아미노산이 N 또는 C 말단에 부가되도록 N-말단 프로세싱될 수 있으며;
<도 27>
도 27은 서열 번호 22의, 합성 SprLip2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며;
<도 28>
도 28은 서열 번호 23의, 발현 플라스미드 pZQ205 유래의 SprLip2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며 (celA 신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 29>
도 29는 서열 번호 24의, 플라스미드 pZQ205로부터 생성된 SprLip2의 아미노산 서열을 나타내며 (신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 30>
도 30은 pZQ205 발현 벡터의 플라스미드 지도를 나타내며;
<도 31>
도 31은 SprLip2에 의한 pNB의 가수분해를 나타내며;
<도 32>
도 32는 SprLip2에 의한 pNPP의 가수분해를 나타내며;
<도 33>
도 33은 세제의 부재 하에서의 SprLip2에 의한 트라이옥타노에이트의 가수분해를 나타내며;
<도 34>
도 34는 세제의 존재 하에서의 SprLip2에 의한 트라이옥타노에이트의 가수분해를 나타내며;
<도 35>
도 35는 세제의 존재 및 부재 하에서의 SprLip2의 성능을 나타내며;
<도 36>
도 36은 서열 번호 25의, NCBI 데이터베이스에서 등록 번호 JC8061로 입수가능한 지오바실러스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 주 T1 (GeoT1) 유래의 리파아제의 아미노산 서열을 나타내며 (신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 37>
도 37은 서열 번호 26의, BCE-GeoT1 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 상기 융합 단백질은 서열 번호 25의 서열과, 박테리아 셀룰라아제의 촉매 도메인의 카르복시 말단의 융합물이며;
<도 38>
도 38은 서열 번호 27의, 젠뱅크(GENBANK) 등록 번호 P37957로 입수가능한, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168 (LipA) 유래의 리파아제의 아미노산 서열을 나타내며 (신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 39>
도 39는 서열 번호 28의, BCE-LipA 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 상기 융합 단백질은 서열 번호 27의 서열과, 박테리아 셀룰라아제의 촉매 도메인의 카르복시 말단의 융합물이며;
<도 40>
도 40은 서열 번호 30의, BamHI 부위 앞의 NsiI-MluI-HpaI 효소 제한 부위의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 1a는 열불활성화 액체 세제 아리엘(ARIEL)™ 컬러(Color)의 존재 하에, 그러나 지방 분해 효소의 부재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 얼룩 제거 지수(Stain Removal index; SRI)의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 1b>
도 1b는 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에, 그러나 지방 분해 효소의 부재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 1c>
도 1c는 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에, 그러나 지방 분해 효소의 부재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2a>
도 2a는 지방 분해 효소 리펙스(LIPEX)™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2b>
도 2b는 지방 분해 효소 리펙스™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2c>
도 2c는 지방 분해 효소 리펙스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2d>
도 2d는 지방 분해 효소 리펙스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 2e>
도 2e는 지방 분해 효소 리펙스™의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3a>
도 3a는 지방 분해 효소 리포맥스(LIPOMAX)™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3b>
도 3b는 지방 분해 효소 리포맥스™ 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3c>
도 3c는 지방 분해 효소 리포맥스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3d>
도 3d는 지방 분해 효소 리포맥스™ 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 3e>
도 3e는 지방 분해 효소 리포맥스™의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4a>
도 4a는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4b>
도 4b는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4c>
도 4c는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4d>
도 4d는 지방 분해 효소 SprLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 4e>
도 4e는 지방 분해 효소 SprLip2의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5a>
도 5a는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5b>
도 5b는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 액체 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5c>
도 5c는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 하이드로포빈 농도에서의 세제 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5d>
도 5d는 지방 분해 효소 TfuLip2 및 열불활성화 분말 세제 아리엘™ 컬러의 존재 하에 다양한 특정 세제 농도에서의 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 5e>
도 5e는 지방 분해 효소 TfuLip2의 존재 하에 그러나 세제의 부재 하에 하이드로포빈 농도의 함수로서의 SRI의 변화율 (%)을 나타내며;
<도 6>
도 6은 서열 번호 1의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) HFBII (Y11894.1)를 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 7>
도 7은 서열 번호 2의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이 HFBII (P79073.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 8>
도 8은 서열 번호 3의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이 HFBI (Z68124.1)을 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 9>
도 9는 서열 번호 4의, 하이드로포빈 트리코데르마 레에세이 HFBI (P52754.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 10>
도 10은 서열 번호 5의, 하이드로포빈 쉬조필룸 콤뮨(Schizophyllum commune) SC3 (M32329.1)을 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 11>
도 11은 서열 번호 6의, 하이드로포빈 쉬조필룸 콤뮨 SC3 (AAA96324.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 12>
도 12는 서열 번호 7의, 하이드로포빈 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) EAS (X67339.1)를 코딩하는 DNA 서열을 나타내며;
<도 13>
도 13은 서열 번호 8의, 하이드로포빈 뉴로스포라 크라사 EAS (AAB24462.1)의 아미노산 서열을 나타내며;
<도 14>
도 14는 서열 번호 9의, 탈라로마이세스 서모필루스(Talaromyces thermophilus) TT1 (전구체형 TT1 하이드로포빈을 코딩하는 DNA 서열, 미국 특허 제7241734호의 서열 번호 4)을 나타내며;
<도 15>
도 15는 서열 번호 10의, 탈라로마이세스 서모필루스 TT1 (전구체형 TT1 하이드로포빈의 아미노산 서열, 미국 특허 제7241734호의 서열 번호 3)을 나타내며;
<도 16>
도 16은 서열 번호 11의, 리펙스™의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 17>
도 17은 서열 번호 12의, 볼드체로 나타낸 신호 서열을 포함하는 SprLip2 (스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis) ATCC 25486 Uniprot B5H9Q8, NCBI: ZP_06912654.1)의 전 아미노산 서열을 나타내며;
<도 18>
도 18은 서열 번호 13의, 푸사륨 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum) 포스포리파아제 (국제특허 공개 WO 2005/087918호에 개시되어 있으며 다니스코 에이/에스(Danisco A/S)로부터 그라인드아밀 파워베이크(GRINDAMYL POWERBAKE) 4100™으로 입수가능함)의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 19>
도 19는 서열 번호 29의, 국제특허 공개 WO 98/45453호에 개시된 리파아제 3의 전 아미노산 서열을 나타내고, 잔기 1 내지 270은 본 명세서에서 서열 번호 14의 서열로 칭해지는 성숙 서열을 포함하며;
<도 19a>
도 19a는 서열 번호 14의, 리파아제 3의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 20>
도 20은 서열 번호 15의, 리포맥스™의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 21>
도 21은 서열 번호 16의, TfuLip2의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 22>
도 22는 서열 번호 17의, SprLip2의 성숙 아미노산 서열을 나타내며;
<도 23>
도 23은 서열 번호 18의, 리펙스의 전 아미노산 서열을 나타내고, 이는 신호 서열 (아미노산 잔기 1 내지 17), 프로펩티드 (아미노산 잔기 18 내지 22) 및 성숙 서열 (아미노산 잔기 23 내지 291 - 도 16에 서열 번호 11로 나타냄)을 포함하며;
<도 24>
도 24는 서열 번호 19의, 리포맥스의 전 아미노산 서열을 나타내고, 이는 신호 서열 (아미노산 잔기 1 내지 24) 및 성숙 서열 (아미노산 잔기 25 내지 313 - 도 20에 서열 번호 15로 나타냄)을 포함하며;
<도 25>
도 25는 서열 번호 20의, TfuLip2의 전 아미노산 서열을 나타내고, 이는 신호 서열 (아미노산 잔기 1 내지 40) 및 성숙 서열 (아미노산 잔기 41 내지 301 - 도 21에 서열 번호 16으로 나타냄)을 포함하며;
<도 26>
도 26은 국제특허 공개 WO 2005/087918호에 개시된 푸사륨 헤테로스포룸 CBS 782.83 (야생형) 유래의 지방 분해 효소의 서열 번호 21의 단백질 프리프로서열(preprosequence)을 나타내며, 상기 프리프로서열은 상기 효소의 성숙 형태가 바람직하게는 도 18에 서열 번호 13으로 나타낸 효소를 포함하도록 번역 변형을 겪고; 일부 숙주 유기체에서, 상기 단백질은 다수의 추가의 아미노산이 N 또는 C 말단에 부가되도록 N-말단 프로세싱될 수 있으며;
<도 27>
도 27은 서열 번호 22의, 합성 SprLip2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며;
<도 28>
도 28은 서열 번호 23의, 발현 플라스미드 pZQ205 유래의 SprLip2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며 (celA 신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 29>
도 29는 서열 번호 24의, 플라스미드 pZQ205로부터 생성된 SprLip2의 아미노산 서열을 나타내며 (신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 30>
도 30은 pZQ205 발현 벡터의 플라스미드 지도를 나타내며;
<도 31>
도 31은 SprLip2에 의한 pNB의 가수분해를 나타내며;
<도 32>
도 32는 SprLip2에 의한 pNPP의 가수분해를 나타내며;
<도 33>
도 33은 세제의 부재 하에서의 SprLip2에 의한 트라이옥타노에이트의 가수분해를 나타내며;
<도 34>
도 34는 세제의 존재 하에서의 SprLip2에 의한 트라이옥타노에이트의 가수분해를 나타내며;
<도 35>
도 35는 세제의 존재 및 부재 하에서의 SprLip2의 성능을 나타내며;
<도 36>
도 36은 서열 번호 25의, NCBI 데이터베이스에서 등록 번호 JC8061로 입수가능한 지오바실러스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 주 T1 (GeoT1) 유래의 리파아제의 아미노산 서열을 나타내며 (신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 37>
도 37은 서열 번호 26의, BCE-GeoT1 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 상기 융합 단백질은 서열 번호 25의 서열과, 박테리아 셀룰라아제의 촉매 도메인의 카르복시 말단의 융합물이며;
<도 38>
도 38은 서열 번호 27의, 젠뱅크(GENBANK) 등록 번호 P37957로 입수가능한, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168 (LipA) 유래의 리파아제의 아미노산 서열을 나타내며 (신호 서열은 밑줄이 그어져 있음);
<도 39>
도 39는 서열 번호 28의, BCE-LipA 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 상기 융합 단백질은 서열 번호 27의 서열과, 박테리아 셀룰라아제의 촉매 도메인의 카르복시 말단의 융합물이며;
<도 40>
도 40은 서열 번호 30의, BamHI 부위 앞의 NsiI-MluI-HpaI 효소 제한 부위의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
하이드로포빈
본 명세서에서, 용어 "하이드로포빈"은 친수성/소수성 계면에서 자기-조립이 가능한 그리고 하기 화학식 I을 갖는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 정의된다:
[화학식 I]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 2000이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며;
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Y1 및 Y2는 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고;
a는 1 내지 50이며;
b는 0 내지 5이고;
c는 1 내지 100이며;
d는 1 내지 100이고;
e는 1 내지 50이며;
f는 0 내지 5이고;
g는 1 내지 100이다.
적합하게는, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 40 내지 120개의 아미노산의 서열을 갖는다. 더 바람직하게는, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 45 내지 100개의 아미노산의 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 50 내지 90개, 바람직하게는 50 내지 75개, 그리고 더 바람직하게는 55 내지 65개의 아미노산의 서열을 갖는다. 본 명세서에서, 어구 "하이드로포빈 코어"는 잔기 B1로부터 시작하여 잔기 B8로 종결되는 서열을 의미한다.
화학식 I에서, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상, 바람직하게는 7개 이상, 그리고 가장 바람직하게는 8개 전부가 Cys이다.
화학식 I에서, 일 실시 형태에서 m은 적합하게는 0 내지 500, 바람직하게는 0 내지 200, 더 바람직하게는 0 내지 100, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 20, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 10, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 5, 그리고 가장 바람직하게는 0이다.
화학식 I에서, 일 실시 형태에서 n은 적합하게는 0 내지 500, 바람직하게는 0 내지 200, 더 바람직하게는 0 내지 100, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 20, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 10, 그리고 가장 바람직하게는 0 내지 3이다.
화학식 I에서, a는 바람직하게는 3 내지 25, 더 바람직하게는 5 내지 15이다. 일 실시 형태에서, a는 5 내지 9이다.
화학식 I에서, b는 바람직하게는 0 내지 2, 더 바람직하게는 0이다.
화학식 I에서, c는 바람직하게는 5 내지 50, 더 바람직하게는 5 내지 40이다. 일 실시 형태에서, c는 11 내지 39이다.
화학식 I에서, d는 바람직하게는 2 내지 35, 더 바람직하게는 4 내지 23이다. 일 실시 형태에서, d는 8 내지 23이다.
화학식 I에서, e는 바람직하게는 2 내지 15, 더 바람직하게는 5 내지 12이다. 일 실시 형태에서, e는 5 내지 9이다.
화학식 I에서, f는 바람직하게는 0 내지 2, 더 바람직하게는 0이다.
화학식 I에서, g는 바람직하게는 3 내지 35, 더 바람직하게는 6 내지 21이다. 일 실시 형태에서, g는 6 내지 18이다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 하기 화학식 II를 갖는다:
[화학식 II]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 20이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며;
a는 3 내지 25이고;
b는 0 내지 2이며;
c는 5 내지 50이고;
d는 2 내지 35이며;
e는 2 내지 15이고;
f는 0 내지 2이며;
g는 3 내지 35이다.
화학식 II에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상, 그리고 바람직하게는 8개 전부가 Cys이다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 하기 화학식 III을 갖는다:
[화학식 III]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 20이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며;
a는 5 내지 15이고;
c는 5 내지 40이며;
d는 4 내지 23이고;
e는 5 내지 12이며;
g는 6 내지 21이다.
화학식 III에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상, 그리고 바람직하게는 8개가 Cys이다.
화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III에서, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 또는 7개가 Cys일 때, 잔기 B3 내지 B7은 Cys인 것이 바람직하다.
화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, (a) B1 및 B3 내지 B8은 Cys이고, B2는 Cys 이외의 것이며; (b) B1 내지 B7은 Cys이고, B8은 Cys 이외의 것이며, (c) B1은 Cys 이외의 것이고, B2 내지 B8은 Cys인 것이 바람직하다. 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 다른 잔기는 Ser, Pro 또는 Leu인 것이 바람직하다. 일 실시 형태에서, B1 및 B3 내지 B8은 Cys이며, B2는 Ser이다. 다른 실시 형태에서, B1 내지 B7은 Cys이며, B8은 Leu이다. 추가의 실시 형태에서, B1은 Pro이며, B2 내지 B8은 Cys이다.
본 발명에서 사용되는 하이드로포빈의 시스테인 잔기는 환원된 형태로 존재하거나 또는 임의의 가능한 조합으로 서로와 다이설파이드(-S-S-) 가교체를 형성할 수 있다. 특히 바람직한 일 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부가 Cys일 때, 다이설파이드 가교체가 시스테인 잔기들의 하기 쌍들 중 하나 이상 (바람직하게는 2개 이상, 더 바람직하게는 3개 이상, 가장 바람직하게는 4개 전부) 사이에서 형성될 수 있다: B1과 B6; B2와 B5; B3과 B4; B7과 B8. 하나의 대안적인 바람직한 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부가 Cys일 때, 다이설파이드 가교체가 시스테인 잔기들의 하기 쌍들 중 하나 이상 (바람직하게는 2개 이상, 더 바람직하게는 3개 이상, 가장 바람직하게는 4개 전부) 사이에서 형성될 수 있다: B1과 B2; B3과 B4; B5와 B6; B7과 B8.
본 발명에서 유용한 특정 하이드로포빈의 예에는 하기 간행물에 기재되고 예시된 것이 포함되며, 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다: 문헌[Linder et al., FEMS Microbiology Rev. 2005, 29, 877-896]; 문헌[Kubicek et al., BMC Evolutionary Biology, 2008, 8, 4]; 문헌[Sunde et al., Micron, 2008, 39, 773-784]; 문헌[Wessels, Adv. Micr. Physiol. 1997, 38, 1-45]; 문헌[, Annu. Rev. Microbiol. 2001, 55, 625-646]; 문헌[Hektor and Scholtmeijer, Curr. Opin. Biotech. 2005, 16, 434-439]; 문헌[Szilvay et al., Biochemistry, 2007, 46, 2345-2354]; 문헌[Kisko et al. Langmuir, 2009, 25, 1612-1619]; 문헌[Blijdenstein, Soft Matter, 2010, 6, 1799-1808]; 문헌[ et al., EMBO J. 1994, 13, 5848-5854]; 문헌[ et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 534-539]; 문헌[Wang et al.; Protein Sci., 2004, 13, 810-821]; 문헌[De Vocht et al., Biophys. J. 1998, 74, 2059-2068]; 문헌[Askolin et al., Biomacromolecules 2006, 7, 1295-1301]; 문헌[Cox et al.; Langmuir, 2007, 23, 7995-8002]; 문헌[Linder et al., Biomacromolecules 2001, 2, 511-517]; 문헌[Kallio et al. J. Biol. Chem., 2007, 282, 28733-28739]; 문헌[Scholtmeijer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56, 1-8]; 문헌[Lumsdon et al., Colloids & Surfaces B: Biointerfaces, 2005, 44, 172-178]; 문헌[Palomo et al., Biomacromolecules 2003, 4, 204-210]; 문헌[Kirkland and Keyhani, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., July 17 2010 (전자 출판)]; 문헌[ et al., Int. J. Food Microbiol., 30 June 2010 (전자 출판)]; 문헌[Laaksonen et al. Langmuir, 2009, 25, 5185-5192]; 문헌[Kwan et al. J. Mol. Biol. 2008, 382, 708-720]; 문헌[Yu et al. Microbiology, 2008, 154, 1677-1685]; 문헌[Lahtinen et al. Protein Expr. Purif., 2008, 59, 18-24]; 문헌[Szilvay et al., FEBS Lett., 2007, 5811, 2721-2726]; 문헌[ et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2006, 62, 356-367]; 문헌[Scholtmeijer et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68, 1367-1373]; 문헌[Yang et al, BMC Bioinformatics, 2006, 7 Supp. 4, S16]; 국제특허 공개 WO 01/57066호; 국제특허 공개 WO 01/57528호; 국제특허 공개 WO 2006/082253호; 국제특허 공개 WO 2006/103225호; 국제특허 공개 WO 2006/103230호; 국제특허 공개 WO 2007/014897호; 국제특허 공개 WO 2007/087967호; 국제특허 공개 WO 2007/087968호; 국제특허 공개 WO 2007/030966호; 국제특허 공개 WO 2008/019965호; 국제특허 공개 WO 2008/107439호; 국제특허 공개 WO 2008/110456호; 국제특허 공개 WO 2008/116715호; 국제특허 공개 WO 2008/120310호; 국제특허 공개 WO 2009/050000호; 미국 특허 출원 공개 제2006/0228484호; 및 유럽 특허 제2042156A호.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 서열 번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드, 또는 이의 임의의 것에 대하여 하이드로포빈 코어 내에서 서열 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상이고 하이드로포빈의 상기에 기재된 자기-조립 특성을 유지하는 폴리펩티드이다.
하이드로포빈의 공급원
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 미생물로부터 수득되거나 또는 수득가능하다. 미생물은 바람직하게는 박테리아 또는 진균류, 더 바람직하게는 진균류일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 사상균으로부터 수득되거나 또는 수득가능하다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 담자균문 또는 자낭균문의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능하다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 클라도스포륨(Cladosporium)속 (특히 씨. 풀붐(C. fulvum) 또는 씨. 헤르바룸(C. herbarum)), 오피스토마(Ophistoma)속 (특히 오. 울미(O. ulmi)), 크리포넥트리아(Cryphonectria)속 (특히 씨. 파라시티카(C. parasitica)), 트리코데르마속 (특히 티. 하르지아눔(T. harzianum), 티. 롱기브리치아툼(T. longibrichiatum), 티. 아스페렐룸, 티. 코닝기옵시스(T. Koningiopsis), 티. 아그레시붐(T. aggressivum), 티. 스트로마티쿰(T. stromaticum) 또는 티. 레에세이), 지베렐라(Gibberella)속 (특히 지. 모닐리포르미스(G. moniliformis)), 뉴로스포라(Neurospora)속 (특히 엔. 크라사), 마가나포르테(Maganaporthe)속 (특히 엠. 그리세아(M. grisea)), 하이포크레아(Hypocrea)속 (특히 에이치. 제코리나(H. jecorina), 에이치. 아트로비리디스(H. atroviridis), 에이치. 비렌스(H. virens) 또는 에이치. 릭시이(H. lixii)), 잔토리아(Xanthoria)속 (특히 엑스. 엑타노이데스(X. ectanoides) 및 엑스. 파리에티나(X. parietina)), 에메리셀라(Emericella)속 (특히 이. 니둘란스(E. nidulans)), 아스페르길루스(Aspergillus)속 (특히 에이. 푸미가투스(A. fumigatus), 에이. 오리자에(A. oryzae)), 파라콕시오이데스(Paracoccioides)속 (특히 피. 브라실리엔시스(P. brasiliensis)), 메타리지움(Metarhizium)속 (특히 엠. 아니소플라이에(M. anisoplaie)), 플레우로투스(Pleurotus)속 (특히 피. 오스트레아투스(P. ostreatus)), 코프리누스(Coprinus)속 (특히 씨. 시네레우스(C. cinereus)), 디코타이오네마(Dicotyonema)속 (특히 디. 글라브라툼(D. glabratum)), 플람물리나(Flammulina)속 (특히 에프. 벨루티페스(F. velutipes)), 쉬조필룸속 (특히 에스. 콤뮨), 아가리쿠스(Agaricus)속 (특히 에이. 비스포루스(A. bisporus)), 피솔리투스(Pisolithus)속 (특히 피. 틴크토리우스(P. tinctorius)), 트리콜로마(Tricholoma)속 (특히 티. 테레움(T. terreum)), 폴리오카(Pholioka)속 (특히 피. 나메코(P. nameko)), 탈라로마이세스(Talaromyces)속 (특히 티. 서모필루스) 또는 아그로사이베(Agrocybe)속 (특히 에이. 아에게리타(A. aegerita))의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능하다.
분석
본 발명에서 사용되는 하이드로포빈의 하나의 특성으로는 친수성/소수성 계면에서의 하이드로포빈의 자기-조립 특성이 있다.
본 발명의 정의에 따르면, 자기-조립은 단백질을 폴리테트라플루오로에틸렌 (테플론(TEFLON)(등록상표))에 흡착시킴으로써 그리고 원편광 이색성(Circular Dichroism; CD)을 이용하여 새롭게 형성된 α-나선에 상응하는 CD 스펙트럼에서의 모티프의 출현에 의해 예시되는 이차 구조의 변화를 확립함으로써 검출될 수 있다 (문헌[De Vocht et al., Biophys. J. 1998, 74, 2059-2068]). CD 스펙트럼 분석을 실시하는 전 절차는 문헌[Askolin et al. Biomacromolecules, 2006, 7, 1295-1301]에서 찾아볼 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 계면에서의 표면 특성에 대한 그의 영향에 의해 특성화되지만, 상기 계면은 특별히 배타적으로 공기/물 계면인 것은 아니다. 표면 특성은 표면 장력 (특히 평형 표면 장력) 또는 표면 전단 리올로지(rheology), 특히 표면 전단 탄성 (저장 탄성률)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 물/공기 계면에서의 평형 표면 장력이 45 mN/m 미만, 바람직하게는 40 mN/m 미만, 그리고 더 바람직하게는 35 mN/m 미만으로 감소되게 할 수 있다. 이와는 대조적으로, 순수한 물의 표면 장력은 실온에서 72 mN/m이다. 전형적으로, 물/공기 계면에서의 평형 표면 장력의 이러한 감소는 5 × 10-8 M 내지 2 × 10-6 M, 더 바람직하게는 1 × 10-7 M 내지 1 × 10-6 M의 하이드로포빈 농도를 이용하여 성취될 수 있다. 전형적으로, 물/공기 계면에서의 평형 표면 장력의 이러한 감소는 0℃ 내지 50℃의 범위의 온도, 특히 실온에서 성취될 수 있다. 평형 표면 장력의 변화는 문헌[Cox et al., Langmuir, 2007, 23, 7995-8002]에 기재된 방법에 따라 장력계를 사용하여 측정될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 하이드로포빈은 물/공기 계면에서의 표면 전단 탄성이 300-700 mN/m, 바람직하게는 400-600 mN/m로 증가되게 할 수 있다. 전형적으로, 물/공기 계면에서의 이러한 표면 전단 탄성은 1 × 10-4 M 내지 0.01 M, 바람직하게는 5 × 10-4 M 내지 2 × 10-3 M, 특히 1 × 10-3 M의 하이드로포빈 농도를 이용하여 성취될 수 있다. 전형적으로, 물/공기 계면에서의 이러한 표면 전단 탄성은 0℃ 내지 50℃의 범위의 온도, 특히 실온에서 성취될 수 있다. 평형 표면 장력의 변화는 문헌[Cox et al., Langmuir, 2007, 23, 7995-8002]에 기재된 방법에 따라 유량계를 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 생물계면활성제이다. 생물계면활성제는 살아 있는 세포에 의해 합성되는 표면 활성 물질이다. 생물계면활성제는 표면 장력을 감소시키는 특성, 에멀젼을 안정화시키는 특성, 발포를 촉진하는 특성을 가지며, 일반적으로 비독성이고 생분해성이다.
본 발명의 조성물에서 유용한 특정 하이드로포빈의 예가 하기 표 1에 열거되어 있다.
융합 단백질
본 발명의 맥락에서 하이드로포빈의 정의는 하이드로포빈과 다른 분자, 예를 들어 다당류의 콘쥬게이트(conjugate) 뿐만 아니라 하이드로포빈과 다른 폴리펩티드의 융합 단백질도 포함한다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 융합 단백질이다. 본 명세서에서, 어구 "융합 단백질"은 하이드로포빈에서 천연적으로 나타나는 것이 아닌 추가의 펩티드 서열 (본 명세서에서 "융합 파트너"로 기재됨)에 결합된 하이드로포빈 서열 (상기에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
일 실시 형태에서, 융합 파트너는 하이드로포빈 코어의 아미노 말단에 결합되고 이럼으로써 기 (Y1)m을 형성할 수 있다. 이 실시 형태에서, m은 1 내지 2000, 바람직하게는 2 내지 1000, 더 바람직하게는 5 내지 500, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 200, 더욱 더 바람직하게는 20 내지 100의 범위일 수 있다.
일 실시 형태에서, 융합 파트너는 하이드로포빈 코어의 카르복실 말단에 결합되고 이럼으로써 기 (Y2)n을 형성할 수 있다. 이 실시 형태에서, n은 1 내지 2000, 바람직하게는 2 내지 1000, 더 바람직하게는 5 내지 500, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 200, 더욱 더 바람직하게는 20 내지 100의 범위일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 융합 파트너는 하이드로포빈 코어의 아미노 말단 및 카르복실 말단 둘 모두에 결합될 수 있다. 이 실시 형태에서, 융합 파트너는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 바람직하게는 m 및 n의 바람직한 값으로 상기에 정의된 수의 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 융합 단백질이 아니며, m 및 n은 0이다.
클래스 I 및 II의 하이드로포빈
본 기술 분야에서, 하이드로포빈은 클래스 I 및 II로 분류된다. 클래스 I 및 II의 하이드로포빈은 용해도를 비롯하여 다수의 이유로 구별될 수 있음이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 하이드로포빈은 계면 (특히, 물/공기 계면)에서 양친매성 계면 필름으로 자기-조립된다. 클래스 I 하이드로포빈의 상기 조립된 양친매성 필름은 일반적으로 단지 강산 (전형적으로, pKa가 4 미만인 것, 예를 들어 포름산 또는 트라이플루오로아세트산)에 재가용화되며, 반면에, 클래스 II의 것은 더욱 넓은 범위의 용매에 용해성이다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 클래스 II 하이드로포빈이다. 다른 실시 형태에서, 하이드로포빈은 클래스 I 하이드로포빈이다.
일 실시 형태에서, 어구 "클래스 II 하이드로포빈"은 물/공기 계면에서 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖는 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미하며, 상기 조립된 양친매성 필름은 실온에서 수성 에탄올 용액 (60% (v/v))에서 0.1% (w/w) 이상의 농도로 재용해될 수 있다. 이와는 대조적으로, 이 실시 형태에서, 어구 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 이러한 특정한 재용해 특성은 갖지 않는 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
다른 실시 형태에서, 어구 "클래스 II 하이드로포빈"은 물/공기 계면에서 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖는 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미하며, 상기 조립된 양친매성 필름은 실온에서 수성 소듐 도데실 설페이트 용액 (2% (w/w))에서 0.1% (w/w) 이상의 농도로 재용해될 수 있다. 이와는 대조적으로, 이 실시 형태에서, 어구 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 이러한 특정한 재용해 특성은 갖지 않는 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
클래스 I 및 II의 하이드로포빈은 또한 하이드로포빈 단백질의 다수의 영역의 소수성/친수성에 의해 구별될 수 있다.
일 실시 형태에서, 어구 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B3과 잔기 B4 사이의 영역, 즉 모이어티 (X3)c가 주로 소수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다. 이와는 대조적으로, 이 실시 형태에서, 어구 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B3과 잔기 B4 사이의 영역, 즉 기 (X3)c이 주로 친수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
일 실시 형태에서, 어구 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 소수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다. 이와는 대조적으로, 이 실시 형태에서, 어구 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 친수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
하이드로포빈 단백질의 다양한 영역들의 상대적인 소수성/친수성은 문헌[Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 1982, 157, 105-132]에 기술된 방법을 이용하여 하이드로포빈의 소수도(hydropathy) 패턴을 비교함으로써 확립될 수 있다. 이 참고 문헌의 교시에 따르면, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 따라 단백질의 친수성 및 소수성을 계속해서 평가할 수 있다. 이 목적을 위하여, 상기 방법은 소수도 척도 (문헌으로부터 유래된 다수의 실험적 관찰에 기초함)를 이용하여 20개 아미노산 측쇄들 각각의 친수성 및 소수성 특성을 비교한다. 상기 프로그램은 이동-절편 접근법을 이용하며, 상기 접근법은 소정 길이의 절편 내에서 이것이 서열을 통하여 진행할 때 평균 소수도를 계속적으로 결정한다. 연속 스코어들을 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 도시한다. 이와 동시에, 중심점 선이 인쇄되며, 이는 대부분의 서열결정된 단백질에서 발견되는 아미노산 조성들의 소수도의 대평균(grand average)에 상응한다. 상기 방법이 하이드로포빈에 대하여 문헌[Wessels, Adv . Microbial Physiol . 1997, 38, 1-45]에 추가로 기재되어 있다.
일 실시 형태에서, 어구 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B3과 잔기 B4 사이의 영역, 즉 모이어티 (X3)c가 주로 소수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다. 이와는 대조적으로, 이 실시 형태에서, 어구 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B3과 잔기 B4 사이의 영역, 즉 기 (X3)c이 주로 친수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
일 실시 형태에서, 어구 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 소수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다. 이와는 대조적으로, 이 실시 형태에서, 어구 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 친수성인 하이드로포빈 (본 명세서에 정의되고 예시된 바와 같음)을 의미한다.
하이드로포빈 단백질의 다양한 영역들의 상대적인 소수성/친수성은 문헌[Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 1982, 157, 105-132]에 기술된 그리고 문헌[Wessels, Adv. Microbial Physiol. 1997, 38, 1-45]에 하이드로포빈에 대하여 설명된 방법을 이용하여 하이드로포빈의 소수도 패턴을 비교함으로써 확립될 수 있다.
클래스 II 하이드로포빈은 또한 그의 보존된 서열을 특징으로 할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 클래스 II 하이드로포빈은 하기 화학식 IV를 갖는다:
[화학식 IV]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 200이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며;
a는 6 내지 12이고;
c는 8 내지 16이며;
d는 2 내지 20이고;
e는 4 내지 12이며;
g는 5 내지 15이다.
화학식 IV에서, a는 바람직하게는 7 내지 11이다.
화학식 IV에서, c는 바람직하게는 10 내지 12, 더 바람직하게는 11이다.
화학식 IV에서, d는 바람직하게는 4 내지 18, 더 바람직하게는 4 내지 16이다.
화학식 IV에서, e는 바람직하게는 6 내지 10, 더 바람직하게는 9 또는 10이다.
화학식 IV에서, g는 바람직하게는 6 내지 12, 더 바람직하게는 7 내지 10이다.
일 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 클래스 II 하이드로포빈은 하기 화학식 V를 갖는다:
[화학식 V]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 10이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu 또는 Ser으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며;
a는 7 내지 11이고;
c는 11이며;
d는 4 내지 18이고;
e는 6 내지 10이며;
g는 7 내지 10이다.
화학식 IV 및 화학식 V에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상, 그리고 바람직하게는 8개 전부가 Cys이다.
화학식 IV 및 화학식 V에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 잔기 B3 내지 B7은 Cys인 것이 바람직하다.
화학식 IV 및 화학식 V에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, (a) B1 및 B3 내지 B8은 Cys이고, B2는 Cys 이외의 것이며; (b) B1 내지 B7은 Cys이고, B8은 Cys 이외의 것이거나, 또는 (c) B1은 Cys 이외의 것이고, B2 내지 B8은 Cys인 것이 바람직하다. 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 다른 잔기는 Ser, Pro 또는 Leu인 것이 바람직하다. 일 실시 형태에서, B1 및 B3 내지 B8은 Cys이며, B2는 Ser이다. 또는 다른 실시 형태에서, B1 내지 B7은 Cys이며, B8은 Leu이다. 추가의 실시 형태에서, B1은 Pro이며, B2 내지 B8은 Cys이다.
화학식 IV 및 화학식 V에서, 바람직하게는 기 (X3)c는 서열 모티프 ZZXZ를 포함하며, 여기서, Z는 지방족 아미노산이고; X는 임의의 아미노산이다. 본 명세서에서, 어구 "지방족 아미노산"은 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 발린(V) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 의미한다.
더 바람직하게는, 기 (X3)c는 LLXV, ILXV, ILXL, VLXL 및 VLXV로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 모티프를 포함한다. 가장 바람직하게는, 기 (X3)c는 서열 모티프 VLXV를 포함한다.
화학식 IV 및 화학식 V에서, 바람직하게는 기 (X3)c는 서열 모티프 ZZXZZXZ를 포함하며, 여기서, Z는 지방족 아미노산이고; X는 임의의 아미노산이다. 더 바람직하게는, 기 (X3)c는 서열 모티프 VLZVZXL을 포함하며, 여기서, Z는 지방족 아미노산이고; X는 임의의 아미노산이다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 서열 번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드, 또는 이의 임의의 것에 대하여 하이드로포빈 코어 내에서 서열 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상인 폴리펩티드이다. "하이드로포빈 코어"는 잔기 B1로부터 시작하여 잔기 B8로 종결되는 서열을 의미한다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 자낭균문의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능하다. 일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 클라도스포륨속 (특히 씨. 풀붐), 오피스토마속 (특히 오. 울미), 크리포넥트리아속 (특히 씨. 파라시티카), 트리코데르마속 (특히 티. 하르지아눔, 티. 롱기브리치아툼, 티. 아스페렐룸, 티. 코닝기옵시스, 티. 아그레시붐, 티. 스트로마티쿰 또는 티. 레에세이), 지베렐라속 (특히 지. 모닐리포르미스), 뉴로스포라속 (특히 엔. 크라사), 마가나포르테속 (특히 엠. 그리세아) 또는 하이포크레아속 (특히 에이치. 제코리나, 에이치. 아트로비리디스, 에이치. 비렌스 또는 에이치. 릭시이)의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능하다.
바람직한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 트리코데르마속 (특히 티. 하르지아눔, 티. 롱기브리치아툼, 티. 아스페렐룸, 티. 코닝기옵시스, 티. 아그레시붐, 티. 스트로마티쿰 또는 티. 레에세이)의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능하다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 티. 레에세이 종의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능하다.
더 바람직한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하기:
(a) HFBII (서열 번호 2; 진균류 트리코데르마 레에세이로부터 수득가능함);
(b) HFBI (서열 번호 4; 진균류 트리코데르마 레에세이)로부터 수득가능함;
(c) SC3 (서열 번호 6; 진균류 쉬조필룸 콤뮨)으로부터 수득가능함;
(d) EAS (서열 번호 8; 진균류 뉴로스포라 크라사로부터 수득가능함); 및
(e) TT1 (서열 번호 10; 진균류 탈라로마이세스 서모필루스로부터 수득가능함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 또는 이의 임의의 것에 대하여 하이드로포빈 코어 내에서 서열 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상인 단백질이다.
더 바람직한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하기:
(a) HFBII (서열 번호 1; 진균류 트리코데르마 레에세이로부터 수득가능함);
(b) HFBI (서열 번호 3; 진균류 트리코데르마 레에세이로부터 수득가능함);
(c) SC3 (서열 번호 5; 진균류 쉬조필룸 콤뮨)으로부터 수득가능함;
(d) EAS (서열 번호 7; 진균류 뉴로스포라 크라사로부터 수득가능함);
(e) TT1 (서열 번호 9; 진균류 탈라로마이세스 서모필루스로부터 수득가능함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 단백질,
또는 유전자 암호의 결과로서 상기 (a) 내지 (e)에서 정의된 폴리뉴클레오티드로 축퇴되는 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 단백질이다.
특히 바람직한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 단백질 "HFBII" (서열 번호 2; 트리코데르마 레에세이로부터 수득가능함) 또는 이의 하이드로포빈 코어 내에서 서열 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상인 단백질이다.
일 실시 형태에서, 하이드로포빈은 조성물의 초기 성분으로서 존재할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 하이드로포빈은 (예를 들어, 하이드로포빈 융합 단백질의 원위치 가수분해에 의해) 조성물 내에서 원위치에서 생성될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 하이드로포빈은 차플린(chaplin)으로 전적으로 또는 부분적으로 대체될 수 있다. 차플린류는 하이드로포빈 유사 단백질로서, 이것도 소수성-친수성 계면에서 자기-조립할 수 있고 따라서 하이드로포빈에 대하여 기능적 등가물이다. 차플린이 사상균 및 사상 박테리아(filamentous bacteria), 예를 들어 방선균류(Actinomycetes) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 또한 확인되었다. 하이드로포빈과는 다르게, 차플린은 단지 2개의 시스테인 잔기를 가질 수 있으며, 단지 하나의 다이설파이드 가교체를 형성할 수 있다. 차플린의 예는 국제특허 공개 WO 01/74864호, 미국 특허 출원 공개 제2010/0151525호 및 미국 특허 출원 공개 제2010/0099844호와, 문헌[Talbot, Curr. Biol. 2003, 13, R696-R698]에 기재되어 있다.
지방 분해 효소
본 명세서에서, 어구 '지방 분해 효소'는 지질 기질에 작용하여 자유 지방산 분자를 유리할 수 있는 효소로 정의된다. 바람직하게는, 지방 분해 효소는 지질 기질 (그러나 이는 특별히 배타적으로 트라이글리세라이드, 당지질 및/또는 인지질인 것은 아님) 내의 에스테르 결합을 가수분해시켜 자유 지방산 분자가 유리되게 할 수 있는 효소이다. 가능한 지질 기질의 예가 하기에 기재되어 있다.
본 발명에서 사용되는 지방 분해 효소는 바람직하게는 비극성 지질 및 극성 지질 둘 모두에서 활성을 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "극성 지질"은 인지질 및/또는 당지질을 의미한다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "극성 지질"은 인지질 및 당지질 둘 모두를 의미한다. 극성 및 비극성 지질은 문헌[Eliasson and Larsson, "Cereals in Breadmaking: A Molecular Colloidal Approach", publ. Marcel Dekker, 1993]에 논의되어 있다.
특히, 본 발명에서 사용되는 지방 분해 효소는 바람직하게는 하기 부류의 지질에서 활성을 갖는다: 트라이글리세라이드; 인지질, 특히, 그러나 배타적인 것은 아닌 포스파티딜콜린 (PC) 및/또는 N-아실포스파티딜에탄올아민 (APE); 및 특별히 배타적으로 다이갈락토실 다이글리세라이드 (DGDG)인 것은 아닌 당지질.
본 명세서에서, 어구 "자유 지방산"은 하기 화학식의 화합물:R-C(=O)-OH (여기서, R은 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 하이드로카르빌 기임)을 의미하며, 이 화합물은 총 4 내지 40개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 40개의 탄소 원자, 예를 들어 적어도 10 내지 40개의 탄소 원자, 예를 들어 12 내지 40개, 예를 들어 14 내지 40개, 16 내지 40개, 18 내지 40개, 20 내지 40개 또는 22 내지 40개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 10 내지 24개, 특히 12 내지 22개, 특히 14 내지 18개, 예를 들어 16 또는 18개의 탄소 원자를 갖는다. 특별한 일 실시 형태에서, 이러한 아실 기는 알카노일 기이다. 대안적으로, 이러한 아실 기는 예를 들어 1 내지 5개의 이중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 가질 수 있는 알케노일 기를 포함한다.
적합하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 활성들 중 하나 이상을 가질 수 있다: 포스포리파아제 활성 (예를 들어 포스포리파아제 A1 활성 (E.C. 3.1.1.32) 또는 포스포리파아제 A2 활성 (E.C. 3.1.1.4); 글리코리파아제 활성 (E.C. 3.1.1.26), 트라이아실글리세롤 가수분해 활성 (E.C. 3.1.1.3), 지질 아실트랜스퍼라아제 활성 (문헌[Enzyme Nomenclature Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology]에 따르면 일반적으로 E.C. 2.3.1.x로 분류됨), 및 이의 임의의 조합. 이러한 지방 분해 효소는 본 기술 분야 내에 잘 알려져 있다.
적합하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 포스포리파아제 (예를 들어 포스포리파아제 A1 (E.C. 3.1.1.32) 또는 포스포리파아제 A2 (E.C. 3.1.1.4)); 글리코리파아제 또는 갈락토리파아제 (E.C. 3.1.1.26), 트라이아실글리세라이드 리파아제 (E.C. 3.1.1.3)일 수 있다. 이러한 효소는 추가의 부활성(side activity), 예를 들어 지질 아실트랜스퍼라아제 부활성을 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 트라이아실글리세롤 가수분해 활성 (E.C. 3.1.1.3)을 갖는다.
지방 분해 효소는 효소의 옥시음이온 구멍의 구조 및 서열 분석을 기초로 하여 세 부류 (GX, GGGX 또는 Y) 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다.
"GX 지방 분해 효소"는 효소의 옥시음이온 구멍-형성 잔기 X가 구조적으로 잘 보존되어 있고, 엄격하게 보존된 글리신이 상기 X에 선행하는 것이다.
"GGGX 효소"는 잘 보존된 GGG 패턴, 이어서 보존된 소수성 아미노산 X가 있고, 잔기 X에 선행하는 글리신의 골격 아미드가 옥시음이온 구멍을 형성하는 것이다.
"Y 지방 분해 효소"는 옥시음이온 구멍이 골격 아미드에 의해 형성되는 것이 아니라 타이로신 측쇄의 하이드록실 기에 의해 형성되는 것이다.
일 태양에서, 본 발명은 GX 지방 분해 효소의 용도에 관한 것이다.
적합하게는, 옥시음이온 구멍 형성 잔기 X는 M, Q, F, S, T, A, L 또는 I일 수 있다. 바람직하게는, 옥시음이온 구멍 형성 잔기 X는 M, Q, F, S 또는 T일 수 있다.
일 실시 형태에서, 지방 분해 효소는 하기 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리 abH23 (바람직하게는 abH23.01), abH25 (바람직하게는 25.01), abH16 (바람직하게는 16.01), abH18 (바람직하게는 abH18.01) 및 abH15 (바람직하게는 15.01 또는 15.02) 중 하나에 속할 수 있다.
일 실시 형태에서, 지방 분해 효소는 하기 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리 abH23 (바람직하게는 abH23.01), abH25 (바람직하게는 25.01), abH16 (바람직하게는 16.01) 및 abH15 (바람직하게는 15.02) 중 하나에 속할 수 있다.
일 실시 형태에서, 바람직하게는 지방 분해 효소는 리파아제 엔지니어링 데이터베이스(Lipase Engineering Database)에서 abH23 수퍼패밀리의 구성원, 바람직하게는 abH23.01 상동 패밀리의 구성원으로 분류된다.
이들 수퍼패밀리에 관한 상세 사항은 리파아제 엔지니어링 데이터베이스(http://www.led.uni-stuttgart.de/)에서 찾아볼 수 있다. 본 명세서에서 리파아제 엔지니어링 데이터베이스를 언급할 때, 2009년 12월 10일자로 공개된 데이터베이스의 버전 3.0을 언급하는 것이다.
특히, 일 실시 형태에서 지방 분해 효소는, 이것이 사상균 유래의 GX 지방 분해 효소일 경우 abH23 수퍼패밀리에 속하는 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 지방 분해 효소는, 스위스프로트(swissprot) P19515와 같이, 이 효소의 촉매 트라이어드(catalytic triad)가 리조푸스 미에헤이(Rhizopus miehei) 유래의 리파아제의 것에 맞추어질 경우 GX 지방 분해 효소이다.
abH23 수퍼패밀리에 속하는 지방 분해 효소의 예에는 표 2에 나타낸 것들이 포함된다.
이 실시 형태에서, 바람직하게는 옥시음이온 구멍 형성 잔기는 세린 또는 트레오닌이다.
바람직하게는, 지방 분해 효소는 리조푸스 미에헤이(Rhizopus miehei) 유사 상동 패밀리 abH23.01에 속한다. 적합하게는, 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 효소는 써모마이세스 (바람직하게는, 티. 라누기노수스), 푸사륨 (바람직하게는 에프. 헤테레오스포룸), 아스페르길루스 (바람직하게는 에이. 투비엔기시스 및/또는 에이. 푸미가투스) 및 리조푸스 (바람직하게는, 알. 아리주스) 유래의, 바람직하게는 써모마이세스 (바람직하게는, 티. 라누기노수스), 푸사륨 (바람직하게는 에프. 헤테레오스포룸), 또는 아스페르길루스 (바람직하게는 에이. 투비엔기시스) 유래의 상동 패밀리 abH23.01로 분류되는 임의의 지방 분해 효소를 포함할 수 있다. 이러한 지방 분해 효소의 예에는 리펙스™ (국제특허 공개 WO 94/02617호에 개시되고 본 명세서에 서열 번호 11로 나타낸 써모마이세스 라누기노수스 지방 분해 효소), 국제특허 공개 WO 2005/087918호에 개시되고 본 명세서에 서열 번호 13으로 나타낸 푸사륨 헤테로스포룸 지방 분해 효소 (다니스코 에이/에스로부터 그라인드아밀 파워베이크 4100™으로 입수가능함) 및 리파아제 3 (국제특허 공개 WO 98/45453호에 개시되고 본 명세서에 서열 번호 14로 나타낸 아스페르길루스 투비겐시스(Aspergillus tubigensis) 지방 분해 효소가 포함된다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 지방 분해 효소는, 2005년 7월 26일자의 버전의, 접근 번호 P19833 하에서의 스위스프로트 단백질 지식 베이스(http://www.expasy.org/sprot/ and http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)에 나타낸 바와 같이 촉매 트라이어드가 모락셀라(Moraxella) 리파아제 1 유사 지방 분해 효소의 것에 맞추어질 경우 abH25 수퍼패밀리에 속하는 것으로 간주될 수 있다.
이 패밀리에 속하는 지방 분해 효소의 예에는 표 3에 열거된 것들이 포함된다.
이 실시 형태에서, 바람직하게는 옥시음이온 구멍 형성 잔기는 M, Q, A, F, L 또는 I이다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 지방 분해 효소는, 촉매 트라이어드가 스트렙토마이세스의 것에 맞추어질 경우 abH16 수퍼패밀리에 속하는 것으로 간주될 수 있다.
이 패밀리에 속하는 지방 분해 효소의 예에는 표 4에 나타낸 것들이 포함된다.
이 실시 형태에서, 바람직하게는 옥시음이온 구멍 형성 잔기는 T 또는 Q이다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 지방 분해 효소는, 촉매 트라이어드가 GX 부르크홀데리아(Burkholderia) 리파아제의 것에 맞추어질 경우 abH15 수퍼패밀리에 속하는 것으로 간주될 수 있다.
이 패밀리에 속하는 지방 분해 효소의 예에는 표 5에 나타낸 것들과, 본 명세서에서 서열 번호 15로 나타낸 리포맥스가 포함된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 리파아제 엔지니어링 데이터베이스 버전 3.0에 따라 특정 수퍼패밀리 및/또는 상동 패밀리로 나뉘는 효소의 예가 제공된다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 지방 분해 효소는 이들 예시된 군 내의 지방 분해 효소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 하기 속 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다: 써모마이세스속 (바람직하게는 티. 라누기노수스), 써모비피다속 (바람직하게는, 티. 푸스카), 슈도모나스속 (바람직하게는 피. 알칼리게네스(P. alcaligenes)) 및 스트렙토마이세스속 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스).
적합하게는, 지방 분해 효소는 하기 아미노산 서열들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a) 서열 번호 11의 서열;
b) 서열 번호 15의 서열;
c) 서열 번호 16의 서열;
d) 서열 번호 17의 서열;
e) a) 내지 d)에 정의된 아미노산 서열들 중 임의의 하나에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 아미노산 서열; 또는
f) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 a) 내지 d) 중 임의의 하나에 기술된 바와 같은 그리고 지방 분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열.
적합하게는, 지방 분해 효소는 abH 15 수퍼패밀리, 바람직하게는 abH 15.01 수퍼패밀리에 속할 수 있다.
적합하게는, 지방 분해 효소는 하기 아미노산 서열들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a) 서열 번호 25의 서열;
b) 서열 번호 26의 서열;
c) 도 36에 나타낸 바와 같이 신호 펩티드가 결여된 서열 번호 25의 서열;
d) a) 내지 c)에 정의된 아미노산 서열들 중 임의의 하나에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 아미노산 서열; 또는
e) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 a) 내지 c) 중 임의의 하나에 기술된 바와 같은 그리고 지방 분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열.
적합하게는, 지방 분해 효소는 지오바실러스 종, 바람직하게는 지. 스테아로써모필루스 주 T1로부터 클로닝된 리파아제(GeoT1), 예를 들어 서열 번호 25에 나타낸 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소, 예를 들어 GeoT1은 서열 번호 26에 나타낸 것과 같이 박테리아 셀룰로오스의 촉매 도메인의 카르복시-말단에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 박테리아 셀룰라아제는 네덜란드 바른 소재의 센트럴 뷰로 부어 쉼멜컬쳐스(Central Bureau voor Schimmelcultures; CBS)에 CBS 670.93 (BCE103으로 칭해짐)으로 기탁된 바실러스 주로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소, 예를 들어 GeoT1은 절단가능한 링커에 의해 BCE103 셀룰라아제에 연결된다. 따라서, 일부 실시 형태에서 지방 분해 효소, 예를 들어 GeoT1은 융합 단백질이 아니다.
적합하게는, 지방 분해 효소는 abH 18 수퍼패밀리, 바람직하게는 abH 18.01 수퍼패밀리에 속할 수 있다.
적합하게는, 지방 분해 효소는 하기 아미노산 서열들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
f) 서열 번호 27의 서열;
g) 서열 번호 28의 서열;
h) 도 36에 나타낸 바와 같이 신호 펩티드가 결여된 서열 번호 27의 서열;
i) a) 내지 c)에 정의된 아미노산 서열들 중 임의의 하나에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 아미노산 서열; 또는
j) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 a) 내지 c) 중 임의의 하나에 기술된 바와 같은 그리고 지방 분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열.
적합하게는, 지방 분해 효소는 바실러스 서브틸리스로부터 클로닝된 리파아제, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 유래의 리파아제A (LipA), 예를 들어 서열 번호 27에 나타낸 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소, 예를 들어 LipA는 서열 번호 28에 나타낸 것과 같이 박테리아 셀룰로오스의 촉매 도메인의 카르복시-말단에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 박테리아 셀룰라아제는 네덜란드 바른 소재의 센트럴 뷰로 부어 쉼멜컬쳐스에 CBS 670.93 (BCE103으로 칭해짐)으로 기탁된 바실러스 주로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소, 예를 들어 LipA는 절단가능한 링커에 의해 BCE103 셀룰라아제에 연결된다. 따라서, 일부 실시 형태에서 지방 분해 효소, 예를 들어 LipA는 융합 단백질이 아니다.
일 태양에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리파아제", "리파아제 효소", "지방 분해 효소", "지방 분해 폴리펩티드", 또는 "지방 분해 단백질"은 지질 분해 능력, 예를 들어 트라이글리세라이드 또는 인지질을 분해하는 능력을 나타내는 효소, 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 지방 분해 효소는 예를 들어 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제 또는 큐티나아제일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 지방 분해 활성은 본 기술 분야에 공지된 임의의 절차에 따라 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Gupta et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 2003, 37:63-71]; 미국 특허 제5,990,069호; 및 국제특허 공개 WO 96/18729호 참조).
일 태양에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세제 또는 세정 조성물을 제공한다:
a) 서열 번호 17에 나타낸 폴리펩티드 또는 리파아제 활성을 갖는 이의 단편;
b) 서열 번호 17로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상이며 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
c) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 서열 번호 17에 기술된 바와 같은 그리고 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
e) 서열 번호 23으로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
f) 엄격한 조건 하에 서열 번호 23의 핵산 서열의 상보체에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
g) 스트렙토마이세스 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스)로부터 수득가능한 (바람직하게는 수득되는), 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
적합하게는, 상기 폴리펩티드는 조성물의 총 중량의 0.01 내지 2 중량ppm의 농도로 존재할 수 있다. 본 조성물은 프로테아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 말토스 생성(maltogenic) 아밀라아제, 말토스 비생성(non-maltogenic) 아밀라아제, 리파아제, 큐티나아제, 카보하이드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난아제, 아라비나아제, 갈락타나아제, 자일라나아제, 옥시다아제, 락카아제, 퍼옥시다아제, 및 아실 트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 조성물은 하나 이상의 계면활성제, 예를 들어 비이온성 (반극성을 포함함), 음이온성, 양이온성 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 조성물은 분말 형태로 존재할 수 있거나 또는 액체 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은 표면을 하기를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계에 의해 지질-기재 얼룩을 표면으로부터 제거하는 방법을 추가로 제공한다:
a) 서열 번호 17에 나타낸 폴리펩티드 또는 리파아제 활성을 갖는 이의 단편;
b) 서열 번호 17로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상이며 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
c) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 서열 번호 17에 기술된 바와 같은 그리고 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
e) 서열 번호 23으로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
f) 엄격한 조건 하에 서열 번호 23의 핵산 서열의 상보체에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
g) 스트렙토마이세스 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스)로부터 수득가능한 (바람직하게는 수득되는), 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
다른 태양에서, 본 발명은 세정에 있어서 및/또는 세제에 있어서 하기를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다:
a) 서열 번호 17에 나타낸 폴리펩티드 또는 리파아제 활성을 갖는 이의 단편;
b) 서열 번호 17로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상이며 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
c) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 서열 번호 17에 기술된 바와 같은 그리고 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
e) 서열 번호 23으로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
f) 엄격한 조건 하에 서열 번호 23의 핵산 서열의 상보체에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
g) 스트렙토마이세스 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스)로부터 수득가능한 (바람직하게는 수득되는), 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
예를 들어, 이러한 용도는 지질 얼룩을 표면으로부터 감소시키거나 또는 제거하기 위한 것일 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 표면을 하기를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면을 세정하는 방법을 제공한다:
a) 서열 번호 17에 나타낸 폴리펩티드 또는 리파아제 활성을 갖는 이의 단편;
b) 서열 번호 17로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상이며 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
c) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 서열 번호 17에 기술된 바와 같은 그리고 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
e) 서열 번호 23으로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
f) 엄격한 조건 하에 서열 번호 23의 핵산 서열의 상보체에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
g) 스트렙토마이세스 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스)로부터 수득가능한 (바람직하게는 수득되는), 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
추가의 태양에서, 본 발명은 물품을 하기를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 물품을 세정하는 방법을 제공한다:
a) 서열 번호 17에 나타낸 폴리펩티드 또는 리파아제 활성을 갖는 이의 단편;
b) 서열 번호 17로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상이며 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
c) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 서열 번호 17에 기술된 바와 같은 그리고 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
e) 서열 번호 23으로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
f) 엄격한 조건 하에 서열 번호 23의 핵산 서열의 상보체에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
g) 스트렙토마이세스 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스)로부터 수득가능한 (바람직하게는 수득되는), 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
적합하게는, 물품은 의류 물품 또는 식탁용 식기류 물품일 수 있다.
본 발명은 지방 분해 효소 및 하이드로포빈을 포함하는 조성물의 많은 응용, 방법 및 용도를 제공한다. 의심을 피하기 위하여, 이들 응용, 방법 및 용도 각각은 하기를 포함하는 조성물에 적용될 수 있다:
a) 서열 번호 17에 나타낸 폴리펩티드 또는 리파아제 활성을 갖는 이의 단편;
b) 서열 번호 17로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상이며 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
c) 하나 또는 수 개의 변형(즉, 결실, 치환 및/또는 삽입), 예를 들어2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개의 아미노산 변형, 또는 그보다 더 많은 아미노산 변형, 예를 들어 10개의 아미노산 변형을 제외하고는 서열 번호 17에 기술된 바와 같은 그리고 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
d) 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
e) 서열 번호 23으로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 또는 유전자 암호의 축퇴에 의해 서열 번호 23의 뉴클레오티드 서열에 관련되는 핵산에 대하여 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 또는 바람직하게는 99% 이상인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
f) 엄격한 조건 하에 서열 번호 23의 핵산 서열의 상보체에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드; 또는
g) 스트렙토마이세스 (바람직하게는 에스. 프리스티나에스피랄리스)로부터 수득가능한 (바람직하게는 수득되는), 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
숙주 세포
본 발명과 관련하여 어구 "숙주 세포"는 상기에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터 중 어느 하나를 포함하며, 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 효소의 재조합적 생성에서 사용되는 임의의 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 실시 형태는 본 발명의 효소를 발현시키는 뉴클레오티드 서열로 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 이 세포는 상기 벡터와 양립가능하도록 선택될 것이며, 예를 들어 원핵 세포 (예를 들어 박테리아 세포), 진균류 세포, 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 인간 세포가 아니다.
적합한 박테리아 숙주 유기체의 예로는 그람(gram) 양성 또는 그람 음성 박테리아 종이 있다.
본 발명의 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 성질 및/또는 발현 단백질의 추가의 프로세싱에 대한 바람직함에 따라, 진핵 숙주, 예를 들어 효모 또는 다른 진균류가 바람직할 수 있다. 그러나, 일부 단백질은 효모 세포로부터 저조하게 분비되거나 또는 일부의 경우에 적당하게 프로세싱되지 않는다 (예를 들어, 효모에서 과글리코실화). 이들 경우에서, 상이한 진균류 숙주 유기체가 선택되어야 한다.
적합한 숙주 세포 - 예컨대 효모, 진균류 및 식물 숙주 세포 - 의 사용은 최적의 생물학적 활성을 본 발명의 재조합 발현 생성물에 부여하는 데 필요할 수 있는 번역 후 변형 (예를 들어, 미리스토일화, 글리코실화, 절단, 지질화 및 타이로신, 세린 또는 트레오닌 포스포릴화, 또는 N-말단 아세틸화)을 제공할 수 있다.
숙주 세포는 프로테아제 결핍 주 또는 프로테아제가 없는 주일 수 있다.
숙주 세포의 유전자형은 발현이 개선되도록 변형될 수 있다.
숙주 세포 변형의 예에는 프로테아제 결핍, 희귀 tRNA의 보충, 및 다이설파이드 결합 형성을 향상시키기 위한 세포질에서의 환원 전위의 변형이 포함된다.
예를 들어, 숙주 세포 이. 콜라이(E. coli)는 문헌[Kane, Curr Opin Biotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E. coli"]에 예시된/기재된 바와 같이 이종성 단백질의 발현을 개선시키기 위하여 희귀 tRNA를 과다발현시킬 수 있다. 숙주 세포는 다수의 환원 효소가 결핍될 수 있으며, 따라서 안정한 다이설파이드 결합의 형성이 유리해지는데, 이는 문헌[Bessette, Proc Natl Acad Sci USA (1999), 96, 13703-13708 "Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm"]에 예시된/기재된 바와 같다.
단리
일 태양에서, 본 발명에서 사용하기 위한 효소는 단리된 형태로 존재할 수 있다.
용어 "단리된"은 서열 또는 단백질이, 자연에서 이 서열 또는 단백질에 천연적으로 회합된 그리고 자연에서 발견되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 사실상 없음을 의미한다.
정제
일 태양에서, 본 발명에서 사용하기 위한 효소는 정제된 형태로 사용될 수 있다.
용어 "정제된"은 서열이 상대적으로 순수한 상태로, 예를 들어 적어도 약 51% 순수한 상태, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 순수한 상태로, 또는 적어도 약 95% 순수한 상태 또는 적어도 약 98% 순수한 상태로 존재함을 의미한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 클로닝
본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드 또는 변형에 적합한 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 폴리펩티드를 생성하는 임의의 세포 또는 유기체로부터 단리될 수 있다. 다양한 방법이 뉴클레오티드 서열의 단리 분야 내에서 잘 알려져 있다.
예를 들어, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 폴리펩티드를 생성하는 유기체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저(messenger) RNA를 사용하여 제작될 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열이 공지되어 있을 경우, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하고 이를 사용하여 유기체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 폴리펩티드 코딩 클론을 확인할 수 있다. 대안적으로, 다른 공지된 폴리펩티드 유전자에 대하여 상동성인 서열을 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 폴리펩티드 코딩 클론을 확인할 수 있다. 후자의 경우에, 낮은 엄격도의 혼성화 및 세척 조건이 사용된다.
대안적으로, 폴리펩티드 코딩 클론은 게놈 DNA의 단편을 발현 벡터, 예를 들어 플라스미드 내로 삽입하고, 생성된 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 효소-음성 박테리아를 형질전환시키고, 그 후 형질전환된 박테리아를 폴리펩티드에 의해 저해되는 효소를 함유하는 한천 상에 도말하고 이럼으로써 폴리펩티드를 발현하는 클론을 확인함에 의해 확인될 수 있다.
다른 추가의 대안에서, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 확립된 표준 방법, 예를 들어 문헌[Beucage S.L. et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869]에 기재된 포스포로아미다이트법, 또는 문헌[Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, 801-805]에 기재된 방법에 의해 합성 제조될 수 있다. 포스포로아미다이트법에서, 예를 들어 자동 DNA 합성기에서 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 정제하고, 어닐링하고, 라이게이션시키고, 적절한 벡터 내에 클로닝한다.
뉴클레오티드 서열은 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원, 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원의 것일 수 있으며, 이는 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원 (적절할 경우)의 단편들의 라이게이션에 의해 제조된다. 각각의 라이게이션된 단편은 전체 뉴클레오티드 서열의 다양한 부분에 상응한다. 또한 DNA 서열은 예를 들어 미국 특허 제4,683,202호 또는 문헌[Saiki R K et al., Science (1988) 239, 487-491]에 기재된 바와 같이 특정 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 제조될 수 있다.
뉴클레오티드 서열
또한 본 발명은 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "뉴클레오티드 서열"은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체 (예를 들어 이의 부분)를 말한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 것일 수 있으며, 이는 센스 가닥을 나타내든지 안티센스 가닥을 나타내든지 간에 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다.
본 발명과 관련하여 어구 "뉴클레오티드 서열"은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 이것은 코딩 서열의 DNA, 더 바람직하게는 cDNA를 의미한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 그 자체는, 이것이 그의/그들의 자연 환경에 또한 존재하는 그의 자연적으로 결부된 서열(들)에 연결될 때 그의 자연 환경에서의 천연 뉴클레오티드 서열을 커버하지 않는다. 언급의 용이함을 위하여, 본 발명자는 이 바람직한 실시 형태를 "비천연 뉴클레오티드 서열"로 부를 것이다. 이와 관련하여, 어구 "천연 뉴클레오티드 서열"은 그의 자연 환경 내에 있는 그리고 그가 자연적으로 결부된 전체 프로모터에 작동가능하게 연결되는 경우의 전체 뉴클레오티드 서열을 의미하는데, 상기 프로모터도 그의 자연 환경 내에 있다.
그러나, 본 발명의 범주에 포함되는 아미노산 서열은 그의 천연 유기체에서의 뉴클레오티드 서열의 발현 후 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 범주에 포함되는 아미노산 서열은, 그의 천연 유기체 내에서 뉴클레오티드 서열에 의해 발현될 수 있지만, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 유기체 내에서 그가 천연적으로 결부되는 프로모터의 제어 하에 있는 것은 아니다.
바람직하게는 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니다. 이와 관련하여, 어구 "천연 폴리펩티드"는 그의 자연 환경 내에 있으며, 이것이 그의 천연 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되었을 경우의 전체 폴리펩티드를 의미한다.
전형적으로, 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다 (즉, 재조합 DNA). 그러나, 본 발명의 대안적인 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 본 기술 분야에 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다 (문헌[Caruthers MH et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232] 참조).
분자 진화
일단 효소-코딩 뉴클레오티드 서열이 단리되었거나, 또는 추정 효소-코딩 뉴클레오티드 서열이 확인되었으면, 선택된 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명에 따른 효소를 제조하기 위하여 상기 서열을 돌연변이시키는 것이 바람직할 수 있다.
돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이 부위의 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
적합한 방법은 문헌[Morinaga et al., Biotechnology (1984) 2, 646-649]에 개시되어 있다. 효소-코딩 뉴클레오티드 서열 내로 돌연변이를 도입하는 다른 방법은 문헌[Nelson and Long, Analytical Biochemistry (1989), 180, 147-151]에 기재되어 있다.
상기에 기재된 바와 같은 부위 지정 돌연변이 유발 대신, 예를 들어 상업적 키트, 예컨대 스트라타진(Stratagene)으로부터의 진모르프(GeneMorph) PCR 돌연변이 유발 키트, 또는 클론테크(Clontech)로부터의 다이버시파이(Diversify) PCR 랜덤 돌연변이 유발 키트를 사용하여 돌연변이를 랜덤하게 도입할 수 있다. 유럽 특허 제0 583 265호에는 PCR 기반의 돌연변이 유발의 최적화 방법이 언급되어 있으며, 이는 유럽 특허 제0 866 796호에 기재된 것과 같은 돌연변이 유발 DNA 유사체의 사용과 또한 조합될 수 있다. 오류 발생이 쉬운(error prone) PCR 기술은 바람직한 특징을 갖는 지질 아실 트랜스퍼라아제의 변이체의 생성에 적합하다. 국제특허 공개 WO 02/06457호에는 리파아제의 분자 진화가 언급되어 있다.
신규한 서열을 수득하는 세 번째 방법은 임의의 수의 제한 효소 또는 Dnase I과 같은 효소를 사용함으로써 동일하지 않은 뉴클레오티드 서열을 단편화하고, 기능성 단백질을 코딩하는 전 뉴클레오티드 서열들을 재조립함에 의한 것이다. 대안적으로, 하나의 또는 다수의 동일하지 않은 뉴클레오티드를 사용하여 전 뉴클레오티드 서열의 재조립 동안 돌연변이를 도입할 수 있다. DNA 셔플링(shuffling) 및 패밀리 셔플링 기술은 바람직한 특징을 갖는 지질 아실 트랜스퍼라아제의 변이체의 생성에 적합하다. '셔플링'을 수행하기에 적합한 방법은 유럽 특허 제0 752 008호, 유럽 특허 제1 138 763호, 유럽 특허 제1 103 606호에서 찾아볼 수 있다. 또한 셔플링은 미국 특허 제6,180,406호 및 국제특허 공개 WO 01/34835호에 기재된 바와 같이 DNA 돌연변이 유발의 다른 형태와 조합될 수 있다.
따라서, 다수의 부위 지정 돌연변이 또는 랜덤 돌연변이를 생체 내에서 또는 시험관 내에서 뉴클레오티드 서열 내에 생성하고, 후속적으로, 코딩된 폴리펩티드의 개선된 기능성에 대하여 다양한 수단에 의해 스크리닝하는 것이 가능하다. 인실리코(in silico) 및 엑소(exo)-매개 재조합 방법 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 00/58517호, 미국 특허 제6,344,328호, 미국 특허 제6,361,974호 참조)을 이용하여, 예를 들어 분자 진화를 수행할 수 있으며, 여기서, 생성된 변이체는 공지된 효소 또는 단백질에 대하여 매우 낮은 상동성을 보유한다. 이럼으로써 수득된 이러한 변이체는 공지된 트랜스퍼라아제 효소에 대하여 상당한 구조적 유사성을 갖지만, 매우 낮은 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다.
게다가, 비제한적 예로서, 폴리뉴클레오티드 서열의 돌연변이 또는 천연 변이체를 야생형 또는 다른 돌연변이 또는 천연 변이체와 재조합시켜 새로운 변이체를 생성할 수 있다. 이러한 새로운 변이체는 또한 코딩된 폴리펩티드의 개선된 기능성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
상기에 언급된 응용 및 유사한 분자 진화 방법은 단백질 구조 또는 기능에 대한 어떠한 종래의 지식 없이도 바람직한 특징을 갖는 본 발명의 효소의 변이체의 확인 및 선발을 허용하며, 예측불가능한 그러나 유익한 돌연변이 또는 변이체의 생성을 허용한다. 효소 활성의 최적화 또는 변경에 있어서 본 기술 분야에서 분자 진화의 응용의 다수의 예가 있으며, 이러한 예는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 숙주 세포에서의 또는 시험관 내에서의 최적화된 발현 및/또는 활성, 증가된 효소 활성, 변경된 기질 및/또는 생성물 특이성, 증가된 또는 감소된 효소 또는 구조 안정성, 바람직한 환경 조건, 예를 들어 온도, pH, 기질에서 변경된 효소 활성/특이성.
당업자에게 자명해지는 바와 같이, 분자 진화 툴(tool)을 이용하여 효소를 효소의 기능성이 개선되도록 변경시킬 수 있다.
적합하게는, 본 발명에서 사용되는 지방 분해 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변이체를 코딩할 수 있으며, 즉, 지방 분해 효소는 모 효소(parental enzyme)와 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 함유할 수 있다. 변이체형 효소는 모 효소와의, 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99%의 상동성을 보유한다.
변이체형 지방 분해 효소는 모 효소와 비교하여 트라이글리세라이드 및/또는 모노글리세라이드 및/또는 다이글리세라이드에 대하여 감소된 활성을 가질 수 있다.
적합하게는, 변이체형 효소는 트라이글리세라이드 및/또는 모노글리세라이드 및/또는 다이글리세라이드에 대하여 활성을 전혀 갖지 않을 수 있다.
대안적으로, 변이체형 효소는 증가된 열안정성을 가질 수 있다.
변이체형 효소는 하기, 즉, 극성 지질, 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린, 당지질, 다이갈락토실 모노글리세라이드, 모노갈락토실 모노글리세라이드 중 하나 이상에 대하여 증가된 활성을 가질 수 있다.
지질 아실트랜스퍼라아제의 변이체가 공지되어 있으며, 이러한 변이체들 중 하나 이상은 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 및/또는 본 발명에 따른 효소 조성물에서 사용하기에 적합할 수 있다. 단지 예로서, 지질 아실트랜스퍼라아제의 변이체는 하기 참고 문헌에 기재되어 있으며, 본 발명에 따라 사용될 수 있다: 문헌[Hilton & Buckley J. Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 : 997-1000]; 문헌[Robertson et al. J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269: 2146-50]; 문헌[Brumlik et al. J. Bacteriol. 1996 Apr; 178 : 2060-4]; 문헌[Peelman et al. Protein Sci. 1998 Mar; 7:587-99].
아미노산 서열
또한 본 발명은 본 발명의 방법 및/또는 용도 중 임의의 하나에서 사용하기 위한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 용도를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 예에서, 어구 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이다. 일부 예에서, 어구 "아미노산 서열"은 "효소"와 동의어이다.
아미노산 서열은 적합한 공급원으로부터 제조/단리될 수 있거나, 또는 이것은 합성에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 이것은 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 제조될 수 있다.
적합하게는, 아미노산 서열은 표준 기술에 의해 본 명세서에 교시된 단리된 폴리펩티드로부터 수득될 수 있다.
단리된 폴리펩티드로부터 아미노산 서열을 결정하는 하나의 적합한 방법은 하기와 같다:
정제된 폴리펩티드는 동결 건조될 수 있으며, 100 μg의 동결 건조된 물질은 8 M 우레아와 0.4 M 탄산수소암모늄 (pH 8.4)의 혼합물 50 μl에 용해시킬 수 있다. 용해된 단백질은 질소를 이용한 오버레이(overlay) 및 5 μl의 45 mM 다이티오트레이톨의 첨가 후 50℃에서 15분 동안 변성시키고 환원시킬 수 있다. 실온으로 냉각시킨 후, 5 μl의 100 mM 요오도아세트아미드를 첨가하여 시스테인 잔기가 질소 하에서 암소에서 실온에서 15분 동안 유도체화되게 할 수 있다.
135 μl의 물과, 물 5 μl 중 엔도프로테이나아제 Lys-C 5 μg을 상기 반응 혼합물에 첨가할 수 있으며, 절단은 질소 하에서 37℃에서 24시간 동안 실시될 수 있다.
생성된 펩티드는 역상 HPLC에 의해 VYDAC C18 컬럼 (0.46×15 cm;10 ㎛; 미국 캘리포니아주 소재의 더 세퍼레이션 그룹(The Separation Group))에서, 물 중 0.1% TFA의 용매 A 및 아세토니트릴 중 0.1% TFA의 용매 B를 이용하여 분리될 수 있다. 선택된 펩티드는 N-말단 서열결정 이전에 동일 용매 시스템을 사용하여 데벨로실(Develosil) C18 컬럼에서 재크로마토그래피될 수 있다. 서열결정은 제조업자의 지시에 따라 펄스 액체 고속 사이클(pulsed liquid fast cycle)을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 476A 서열결정기를 사용하여 행해질 수 있다 (미국 캘리포니아주 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)).
서열 동일성 또는 서열 상동성
여기서, 용어 "상동체"는 본 아미노산 서열 및 본 뉴클레오티드 서열과 특정한 상동성을 갖는 엔티티(entity)를 의미한다. 여기서, 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.
상동 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열은 기능적 활성을 유지하는 및/또는 효소의 활성을 향상시키는 폴리펩티드를 제공하고/하거나 코딩해야 한다.
본 발명의 맥락에서, 상동 서열은 본 서열에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하도록 취해진다. 전형적으로, 상동체는 본 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 면에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서, 서열 동일성 면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 상동 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (본 서열)에 대하여 적어도 75, 85 또는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 취해진다. 전형적으로, 상동체는 본 서열과 동일한, 활성 부위 등을 코딩하는 서열을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기) 면에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서, 서열 동일성 면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 눈으로 또는 더욱 일반적으로는 쉽게 입수가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 행해질 수 있다. 이들 구매가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열들 사이의 상동성 (%)을 계산할 수 있다.
상동성 (%)은 연접 서열들에서 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열을 다른 하나의 서열과 맞추고, 하나의 서열 내의 각각의 아미노산을, 한 번에 하나의 잔기씩, 다른 하나의 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접적으로 비교한다. 이는 "갭이 없는(ungapped)" 정렬로 칭해진다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 단지 상대적으로 짧은 수의 잔기에서 수행된다.
이것이 매우 간단하고 일관적인 방법이지만, 이것은 예를 들어 달리 동일한 서열 쌍에서, 하나의 삽입 또는 결실에 의해 이후의 아미노산 잔기가 정렬 밖에 있게 되고 따라서 잠재적으로는 글로벌 정렬(global alignment)이 수행될 때 상동성 (%)이 크게 감소되게 할 것임을 고려하지 못한다. 그 결과, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어에 과도하게 벌칙을 주지 않고서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 설계된다. 이는 국소적 상동성을 최대화하려고 하기 위하여 서열 정렬에서 "갭"을 삽입함으로써 성취된다.
그러나, 이들 더욱 복잡한 방법은 "갭 페널티"(gap penalty)를 정렬에서 나타나는 각각의 갭에 할당하여서, 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우 가능한 한 적은 갭에 의한 서열 정렬 - 두 비교 서열들 사이의 더욱 높은 관련성을 반영함 - 은 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 스코어를 성취할 것이다. "의사 갭 코스트"(affine gap cost)가 전형적으로 사용되며, 이는 갭의 존재에 대하여 상대적으로 높은 코스트를 청구하고 갭 내의 각각의 후속 잔기에 대하여 더 작은 페널티를 청구한다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더욱 적은 갭에 의해 최적화 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변경되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위하여 이러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트(default) 값을 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 최대 상동성 (%)의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적 정렬을 생성하는 것을 필요로 한다. 이러한 정렬을 실시하기에 적합한 컴퓨터 프로그램으로는 벡터(Vector) NTI (인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.))가 있다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예에는 BLAST 패키지 (문헌[Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18]), 및 FASTA (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410])가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다 (문헌[Ausubel et al. 1999, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 응용에 있어서, 벡터 NTI 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 시퀀시즈(Sequences)로 칭해지는 새로운 툴이 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열 비교에 이용가능하다 (문헌[FEMS Microbiol Lett 1999 174: 247-50]; 문헌[FEMS Microbiol Lett 1999 177: 187-8] 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
최종 상동성 (%)이 동일성 면에서 측정될 수 있지만, 정렬 과정 그 자체는 전형적으로 극단의 쌍 비교(all-or-nothing pair comparison)를 기반으로 하는 것이 아니다. 대신, 일반적으로 계량화된 유사성 스코어 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 사용되며, 이는 스코어를 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 한 각각의 쌍별 비교에 할당한다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예로는 BLOSUM62 매트릭스가 있으며, 이는 BLAST 프로그램 스위트(suite)의 디폴트 매트릭스이다. 일반적으로 벡터 NTI 프로그램은 공용 디폴트 값, 또는 공급될 경우 관습 기호 비교 표 (추가의 상세 사항에 대해서는 사용자 매뉴얼을 참조) 중 어느 하나를 이용한다. 일부 응용에 있어서, 벡터 NTI 어드밴스(ADVANCE)™ 10 패키지의 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 상동성 백분율은 클러스탈(CLUSTAL)과 유사한 알고리즘을 기반으로 하여 벡터 NTI 어드밴스TM 10 (인비트로겐 코포레이션) 내의 다중 정렬 특징을 이용하여 계산될 수 있다 (문헌[Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73, 237-244]).
일단 상기 소프트웨어가 최적 정렬을 생성하였으면, 상동성 (%), 바람직하게는 서열 동일성 (%)을 계산하는 것이 가능하다. 전형적으로 상기 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이를 행하여 수치 값을 생성한다.
적합하게는, 뉴클레오티스 서열과 관련된 동일성 정도는 20개 이상의 연접 뉴클레오티드, 바람직하게는 30개 이상의 연접 뉴클레오티드, 바람직하게는 40개 이상의 연접 뉴클레오티드, 바람직하게는 50개 이상의 연접 뉴클레오티드, 바람직하게는 60개 이상의 연접 뉴클레오티드, 바람직하게는 100개 이상의 연접 뉴클레오티드에서 결정된다.
적합하게는, 뉴클레오티드 서열과 관련된 동일성의 정도는 전 서열에서 결정될 수 있다.
서열 동일성을 결정할 때 갭 페널티가 사용된다면, 바람직하게는 프로그램의 디폴트 파라미터를 쌍별 정렬에 사용한다. 예를 들어, 하기 파라미터가 BLAST 2의 쌍별 정렬에 있어서의 현재 디폴트 파라미터이다:
일 실시 형태에서, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열의 서열 동일성은 상기에 정의된 스코어링 파라미터를 이용하여 BLAST2 (blastn)를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 목적상, 동일성 정도는 동일한 서열 요소들의 수를 기반으로 한다. 아미노산 서열에 있어서 본 발명에 따른 동일성 정도는 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 벡터 NTI 어드밴스™ 11 (인비트로겐 코포레이션)에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 쌍별 정렬에 있어서, 사용되는 스코어링 파라미터는 바람직하게는 BLOSUM62이며, 이때 갭 존재 페널티는 11이고 갭 연장 페널티는 1이다.
적합하게는, 아미노산 서열과 관련된 동일성 정도는 20개 이상의 연접 아미노산, 바람직하게는 30개 이상의 연접 아미노산, 바람직하게는 40개 이상의 연접 아미노산, 바람직하게는 50개 이상의 연접 아미노산, 바람직하게는 60개 이상의 연접 아미노산, 바람직하게는 100개 이상의 연접 아미노산에서 결정된다.
적합하게는, 아미노산 서열과 관련된 동일성의 정도는 전 서열에서 결정될 수 있다.
또한 서열은 사일런트(silent) 변화를 생성하고 기능적으로 등가인 물질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 당해 물질의 이차 결합 활성을 유지하기만 한다면, 잔기들의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성을 바탕으로 하여 고의적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하며; 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며; 친수성 값이 유사한 하전되지 않은 극성 헤드(head) 기를 갖는 아미노산은 류신, 아이소류신, 발린, 글라이신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 타이로신을 포함한다.
보존적 치환이 예를 들어 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두 번째 컬럼 내의 동일 블록 내의, 그리고 바람직하게는 세 번째 컬럼 내의 동일 줄 내의 아미노산은 서로에 대하여 치환될 수 있다:
또한, 본 발명은 일어날 수 있는 상동적 치환 (치환 및 대체는 본 명세서에서 둘 모두 기존의 아미노산 잔기를 대안적인 잔기와 상호교환하는 것을 의미하도록 사용됨)을 포함하며, 즉, 유사한 것으로 치환하는 것(like-for-like substitution), 예를 들어, 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 치환하는 것 등을 포함한다. 비상동적 치환이 또한 일어날 수 있으며, 즉, 하나의 부류의 잔기를 다른 것으로 치환하거나 또는 대안적으로 비천연 아미노산, 예를 들어 오르니틴 (이하, Z로 칭함), 다이아미노부티르산 오르니틴 (이하, B로 칭함), 노르류신 오르니틴 (이하, O로 칭함), 피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신의 포함을 수반한다.
비천연 아미노산에 의한 대체가 또한 이루어질 수 있다.
변이체형 아미노산 서열은 글라이신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 뿐만 아니라 메틸, 에틸 또는 프로필 기와 같은 알킬 기를 비롯하여 서열의 임의의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기도 포함할 수 있다. 추가의 형태의 변이는 펩토이드 형태의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하며, 이는 당업자에 의해 잘 이해될 것이다. 의심을 피하기 위하여, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소라기보다는 오히려 그 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이체형 아미노산 잔기를 말하기 위하여 사용된다. 펩토이드 형태의 펩티드를 제조하는 방법은 본 기술 분야, 예를 들어 문헌[Simon RJ et al., PNAS (1992) 89, 9367-9371] 및 문헌[Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13, 132-134]에 공지되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 또는 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 합성 또는 변형 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 서열 내에 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 골격 및/또는 당해 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서의 아크리딘 또는 폴리라이신 사슬의 부가를 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 본 기술 분야에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 변형은 뉴클레오티드 서열의 생체 내 활성 또는 수명을 향상시키기 위하여 실시될 수 있다.
또한 본 발명은 본 명세서에 논의된 서열 또는 임의의 유도체에 대하여 상보성인 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 유도체의 사용을 포함한다. 상기 서열이 이의 단편에 대하여 상보성이라면, 그 서열은 다른 유기체 등에서 유사한 코딩 서열을 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.
본 발명의 서열에 대하여 100% 상동성인 것은 아닌 그러나 본 발명의 범주 내에 있는 폴리뉴클레오티드가 다수의 방법으로 수득될 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열의 다른 변이체가 예를 들어 일련의 개체, 예를 들어 상이한 집단으로부터의 개체로부터 만들어진 DNA 라이브러리의 프로빙에 의해 수득될 수 있다. 게다가, 다른 바이러스/박테리아 또는 세포 상동체, 특히 포유류 세포 (예를 들어, 쥐, 생쥐, 소 및 영장류 세포)에서 발견되는 세포 상동체가 수득될 수 있으며, 이러한 상동체 및 이의 단편은 일반적으로 본 명세서에서 서열 목록에 나타낸 서열과 선택적으로 혼성화할 수 있을 것이다. 이러한 서열은 다른 동물 종으로부터 만들어진 cDNA 라이브러리 또는 다른 동물 종으로부터의 게놈 DNA 라이브러리를 프로빙하고, 중간 내지 높은 엄격도의 조건 하에서, 첨부된 서열 목록 내의 서열들 중 임의의 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 프로브를 이용하여 이러한 라이브러리들을 프로빙함으로써 수득될 수 있다. 유사한 고려 사항이 본 발명의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 종 상동체 및 대립 형질 변이체 수득에 적용된다.
변이체 및 주/종 상동체는 또한 축퇴 PCR을 이용하여 수득될 수 있으며, 상기 PCR에서는 본 발명의 서열 내의 보존된 아미노산 서열을 코딩하는 상동체 및 변이체 내의 서열을 표적화하도록 설계된 프라이머가 사용될 것이다. 보존된 서열은 예를 들어 몇몇 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열들의 정렬에 의해 예측될 수 있다. 서열 정렬은 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, GCG 위스콘신 파일업(Wisconsin PileUp) 프로그램이 널리 사용된다.
축퇴 PCR에서 사용되는 프라이머는 하나 이상의 축퇴 위치를 함유할 것이며, 공지된 서열에 대한 단일 서열 프라이머를 이용한 서열 클로닝에 사용되는 것보다 더 낮은 엄격도 조건에서 사용될 것이다.
대안적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 특성화된 서열의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 수득될 수 있다. 이는 예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되고 있는 특정 숙주 세포에 있어서 코돈 선호성을 최적화하기 위하여 사일런트 코돈 서열 변화가 필요할 경우 유용할 수 있다. 제한 폴리펩티드 인식 부위를 도입하기 위하여, 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 특성 또는 기능을 변경하기 위하여 다른 서열 변화가 요구될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 (뉴클레오티드 서열)를 이용하여 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머, 대안적인 증폭 반응을 위한 프라이머, 예를 들어 방사성 또는 비방사성 표지체를 이용하여 통상적인 수단에 의해 현시적 표지체로 표지된 프로브를 생성할 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 길이가 15개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 예를 들어 25, 30 또는 40개 이상의 뉴클레오티드일 것이며, 본 명세서에 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드라는 용어에 또한 포함된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 폴리뉴클레오티드 및 프로브는 재조합적으로, 합성에 의해, 또는 당업자가 이용가능한 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
일반적으로, 프라이머는 원하는 핵산 서열을 한 번에 하나의 뉴클레오티드씩 단계적으로 제조하는 것을 포함하는 합성 수단에 의해 생성될 것이다. 자동화 기술을 이용하여 이를 달성하는 기술은 본 기술 분야에서 쉽게 이용가능하다.
더욱 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합적 수단을 이용하여, 예를 들어 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응) 클로닝 기술을 사용하여 생성될 것이다. 이는 클로닝하기를 원하는 지질 표적화 서열의 영역의 측면의 프라이머의 쌍 (예를 들어, 약 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 것)을 만들고, 상기 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 영역의 증폭을 야기하는 조건 하에 폴리머라아제 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 (예를 들어 아가로스 겔 상에서의 반응 혼합물의 정제에 의해) 단리하고, 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함할 것이다. 프라이머는, 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있도록, 적합한 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 설계될 수 있다.
혼성화
또한 본 발명은 본 발명의 서열에 대하여 상보성인 서열 또는 본 발명의 서열 또는 이에 상보성인 서열에 혼성화될 수 있는 서열의 용도를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "혼성화"는 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 기술에서 실시되는 증폭 과정 뿐만 아니라 "핵산 가닥이 염기쌍 형성을 통하여 상보성 가닥과 연결되는 과정"도 포함한다.
또한 본 발명은 본 명세서에 논의된 본 서열 또는 임의의 유도체에 대하여 상보성인 서열, 또는 이의 단편 또는 유도체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함한다.
또한 본 발명은 본 명세서에 논의된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열에 대하여 상보성인 서열을 포함한다.
혼성화 조건은 문헌[Berger and Kimmel, 1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA]에 교시된 바와 같이 뉴클레오티드 결합 복합체의 용융 온도 (Tm)를 기초로 하며, 하기에 설명된 바와 같이 규정된 "엄격도"를 부여한다.
최대 엄격도는 전형적으로 약 Tm-5℃ (프로브의 Tm보다 5℃ 낮음)에서 일어나며; 높은 엄격도는 Tm보다 약 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서 일어나며; 중간 엄격도는 Tm보다 약 10℃ 내지 20℃ 낮은 온도에서 일어나며; 낮은 엄격도는 Tm보다 약 20℃ 내지 25℃ 낮은 온도에서 일어난다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 최대 엄격도의 혼성화를 이용하여 동일한 뉴클레오티드 서열을 확인하거나 또는 검출할 수 있는 반면, 중간 (또는 낮은) 엄격도의 혼성화를 이용하여 유사한 또는 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하거나 또는 검출할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 높은 엄격도 조건 또는 중간 엄격도 조건 하에서 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열에 대하여 상보성인 서열의 용도를 포함한다.
더 바람직하게는, 본 발명은 높은 엄격도 조건 (예를 들어, 65℃ 및 0.1×SSC {1×SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0}) 하에서 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열에 대하여 상보성인 서열의 용도를 포함한다.
또한 본 발명은 (본 명세서에 논의된 것의 상보성 서열을 비롯하여) 본 명세서에 논의된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 (본 명세서에 논의된 것의 상보성 서열을 비롯하여) 본 명세서에 논의된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열에 대하여 상보성인 뉴클레오티드 서열의 용도에 관한 것이다.
중간 내지 최대 엄격도의 조건 하에서 본 명세서에 논의된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 용도가 본 발명의 범주 내에 또한 포함된다.
바람직한 태양에서, 본 발명은 엄격한 조건 (예를 들어, 50℃ 및 0.2 × SSC) 하에서, 본 명세서에 논의된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 용도를 커버한다.
더 바람직한 태양에서, 본 발명은 높은 엄격도 조건 (예를 들어, 65℃ 및 0.1 × SSC) 하에서, 본 명세서에 논의된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 용도를 커버한다.
생물학적 활성
바람직하게는, 변이체 서열 등은 적어도 본 명세서에 제시된 서열만큼 생물학적 활성을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물학적으로 활성인"은 자연 발생 서열의 유사한 구조적 기능 (그러나 반드시 동일한 정도로 그러한 것은 아님) 및/또는 유사한 조절 기능 (그러나 반드시 동일한 정도로 그러한 것은 아님) 및/또는 유사한 생화학적 기능 (그러나 반드시 동일한 정도로 그러한 것은 아님)을 갖는 서열을 말한다.
재조합체
일 태양에서, 본 발명에서 사용하기 위한 서열은 재조합 서열, 즉 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 서열이다.
이들 재조합 DNA 기술은 당업자의 능력 이내이다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어 문헌[J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 설명되어 있다.
합성
일 태양에서, 본 발명에서 사용하기 위한 서열은 합성 서열, 즉 시험관 내에서의 화학적 합성 또는 효소적 합성에 의해 제조된 서열이다. 이것은 숙주 유기체, 예를 들어 메탄올 자화(methylotrophic) 효모 피키아(Pichia) 및 한세눌라(Hansenula)에 있어서의 최적 코돈 사용을 이용하여 만들어진 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
폴리펩티드의 발현
본 발명에서 사용하기 위한 또는 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 재조합 복제가능 벡터 내에 혼입시킬 수 있다. 벡터는 양립가능한 숙주 세포에서 및/또는 양립가능한 숙주 세포로부터 폴리펩티드 형태로 뉴클레오티드 서열을 복제 및 발현하는 데 사용될 수 있다. 발현은 프로모터/인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함하는 제어 서열을 이용하여 제어될 수 있다. 원핵 프로모터 및 진핵 세포에서 기능성인 프로모터가 사용될 수 있다. 조직 특이적 또는 자극 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 상기에 기재된 둘 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 요소를 포함하는 키메라 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 숙주 재조합 세포에 의해 생성된 폴리펩티드는 사용되는 벡터 및/또는 서열에 따라 분비될 수 있거나 또는 세포내에 함유될 수 있다. 코딩 서열은 특정한 원핵 또는 진핵 세포 막을 통하여 물질 코딩 서열의 분비를 유도하는 신호 서열을 이용하여 설계될 수 있다.
발현 벡터
어구 "발현 벡터"는 생체 내 또는 시험관 내 발현이 가능한 제작물을 의미한다.
바람직하게는, 발현 벡터는 적합한 숙주 유기체의 게놈 내에 혼입된다. 용어 "혼입되는"은 바람직하게는 게놈 내로의 안정한 혼입을 커버한다.
본 발명에서 사용하기 위한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이 뉴클레오티드 서열이 적합한 숙주 유기체에 의해 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 벡터 내에 존재할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 벡터로 하기에 기재된 적합한 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있다.
벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터의 선택은 흔히 이것이 도입될 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
본 발명에서 사용하기 위한 벡터는 하나 이상의 선발가능한 마커 유전자, 예를 들어 항생제 내성, 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 선발은 (국제특허 공개 WO 91/17243호에 기재된 바와 같이) 동시 형질전환(co-transformation )에 의해 달성될 수 있다.
벡터는 시험관 내에서, 예를 들어 RNA의 생성에 사용될 수 있거나 또는 숙주 세포의 트랜스펙션, 형질전환, 형질도입 또는 감염에 사용될 수 있다.
벡터는 벡터가 당해 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예로는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제 기점이 있다.
조절 서열
일부 응용에서, 본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 선택된 숙주 세포에 의한 것과 같은 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 예로서, 본 발명은 이러한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 커버하며, 즉, 이 벡터는 발현 벡터이다.
어구 "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성 요소들이 이들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계로 있는 병치(juxtaposition)를 말한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 그러한 방식으로 라이게이션된다.
어구 "조절 서열"은 프로모터 및 인핸서와, 다른 발현 조절 신호를 포함한다.
용어 "프로모터"는 본 기술 분야의 보통의 의미로 사용되며, 예를 들어, RNA 폴리머라아제 결합 부위의 의미로 사용된다.
본 발명의 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 향상된 발현은 또한 이종성 조절 영역, 예를 들어 프로모터, 분비 리더 및 종결 영역의 선택에 의해 또한 성취될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 적어도 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
박테리아, 진균류 또는 효모 숙주에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 유도하기에 적합한 프로모터의 예는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
제작물
용어 "제작물" - 이는 "콘쥬게이트", "카세트" 및 "하이브리드"와 같은 용어와 동의어임 - 은 프로모터에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 간접적 부착의 예로는 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 프로모터의 중간에, 적합한 스페이서 그룹, 예를 들어 인트론 서열, 예를 들어 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론을 제공하는 것이 있다. 이것은 본 발명과 관련하여 용어 "융합된"에 대하여도 그러하며, 이는 직접적 또는 간접적 부착을 포함한다. 일부의 경우에, 상기 용어들은 야생형 유전자 프로모터와 일상적으로 결부된 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열의 천연 조합과, 상기 프로모터와 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열 둘 모두가 그의 자연 환경에 존재할 경우의 이들의 천연 조합은 커버하지 않는다.
제작물은 심지어 유전자 제작물의 선발을 허용하는 마커를 함유하거나 또는 발현할 수 있다.
일부 응용에 있어서, 바람직하게는 제작물은 적어도 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 포함한다.
유기체
본 발명과 관련하여 용어 "유기체"는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 이로부터 수득된 생성물을 포함할 수 있는 임의의 유기체를 포함한다.
본 발명과 관련하여 어구 "트랜스제닉(transgenic) 유기체"는 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 이로부터 수득된 생성물을 포함하는, 및/또는 프로모터가 유기체 내에서 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용할 수 있는 임의의 유기체를 포함한다. 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에 혼입된다.
적합한 유기체는 원핵 생물, 진균류, 효모 또는 식물을 포함한다.
어구 "트랜스제닉 유기체"는 그의 자연 환경에서의 천연 뉴클레오티드 코딩 서열을 커버하지 않으며, 이는 상기 서열이 또한 그의 자연 환경에 있는 그의 천연 프로모터의 제어 하에 있을 경우에 그러하다.
따라서, 본 발명의 트랜스제닉 유기체는 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 본 명세서에 정의된 제작물, 본 명세서에 정의된 벡터, 본 명세서에 정의된 플라스미드, 본 명세서에 정의된 세포 또는 이들의 생성물 중 임의의 하나 또는 그 조합을 포함하는 유기체를 포함한다. 예를 들어, 트랜스제닉 유기체는 자연에서 지질 아실트랜스퍼라아제를 코딩하는 서열과 결부되지 않는 프로모터의 제어 하에 본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함할 수 있다.
숙주 세포/유기체의 형질전환
숙주 유기체는 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다.
적합한 원핵 숙주의 예에는 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이 및 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바람직하게는 비. 리케니포르미스가 포함된다.
원핵 숙주의 형질전환에 대한 교시는 본 기술 분야에 잘 기록되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 원핵 숙주가 사용되면, 뉴클레오티드 서열은 인트론의 제거에 의한 것과 같이, 형질전환 전에 적합하게 변형될 필요가 있을 수 있다.
다른 실시 형태에서, 트랜스제닉 유기체는 효모일 수 있다.
사상균 세포는 공지된 방식으로 원형질체를 형성하고 원형질체를 형질전환시키는 것, 이어서 세포벽을 재생시키는 것을 포함하는 방법과 같은, 본 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 형질전환될 수 있다. 숙주 미생물로서의 아스페르길루스의 사용은 유럽 특허 제0 238 023호에 기재되어 있다. 일 실시 형태에서, 바람직하게는 티. 레에세이가 숙주 유기체이다.
다른 숙주 유기체는 식물일 수 있다. 식물의 형질전환에 사용되는 일반적인 기술에 대한 개관은 문헌[Potrykus, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1991) 42:205-225] 및 문헌[Christou, Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27]에서 찾아볼 수 있다. 식물 형질전환에 관한 추가의 교시는 유럽 특허 출원 제0449375호에서 찾아볼 수 있다.
진균류, 효모 및 식물의 형질전환에 관한 일반적인 교시가 하기 섹션에 제시되어 있다.
형질전환 진균류
숙주 유기체는 진균류, 예를 들어 사상균일 수 있다. 적합한 이러한 숙주의 예에는 푸사륨속, 써모마이세스속, 아크레모늄(Acremonium)속, 아스페르길루스속, 페니실륨속, 무코르(Mucor)속, 뉴로스포라속, 트리코데르마속 등에 속하는 임의의 구성원이 포함된다. 일 실시 형태에서, 트리코데르마, 바람직하게는 티. 레에세이가 숙주 유기체이다.
사상균의 형질전환에 대한 교시는 미국 특허 제5741665호에 개관되어 있으며, 이는 사상균의 형질전환 및 이 진균류의 배양을 위한 표준 기술이 본 기술 분야에 잘 알려져 있음을 언급하고 있다. 엔. 크라사에 적용되는 기술에 대한 광범위한 개관은 예를 들어 문헌[Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143]에서 찾아진다. 79-143.
사상균의 형질전환에 대한 추가의 교시는 미국 특허 제5674707호에 개관되어 있다.
일 태양에서, 숙주 유기체는 아스페르길루스속의 것, 예를 들어 아스페르길루스 니게르일 수 있다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 아스페르길루스는 또한 예를 들어 문헌[Turner G. 1994, Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.( Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666]의 교시에 따라 제조될 수 있다.
사상균에서의 유전자 발현은 문헌[Punt et al. Trends Biotechnol. (2002); 20(5):200-6], 문헌[Archer & Peberdy Crit. Rev. Biotechnol. (1997) 17:273-306]에 개관되었다.
형질전환 효모
다른 실시 형태에서, 트랜스제닉 유기체는 효모일 수 있다.
효모에서의 이종성 유전자 발현의 원리에 대한 개관은 예를 들어 문헌[Methods Mol Biol (1995), 49:341-54], 및 문헌[Curr Opin Biotechnol (1997); 8:554-60]에 제공되어 있다.
이와 관련하여, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지(Saccharomyces cerevisi) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 종 (문헌[FEMS Microbiol Rev (2000 24:45-66)] 참조)이 이종성 유전자 발현을 위한 비히클로서 사용될 수 있다.
사카로마이세스 세레비지애에서의 이종성 유전자 발현 및 유전자 생성물의 분비의 원리에 대한 개관은 문헌[E Hinchcliffe E Kenny, 1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J. Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.]에 주어져 있다.
효모의 형질전환에 있어서, 몇몇 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 예를 들어, 본 발명에 따른 트랜스제닉 사카로마이세스는 문헌[Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929]; 문헌[Beggs, J D, 1978, Nature, London, 275, 104]; 및 문헌[Ito, H et al., 1983, J Bacteriology 153, 163-168]의 교시에 따라 제조될 수 있다.
형질전환된 숙주 세포는 다양한 선발 마커, 예를 들어 영양요구성 마커 우성 항생제 내성 마커를 사용하여 선발될 수 있다.
적합한 효모 숙주 유기체는 피키아 종, 한세눌라 종, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위니아(Yarrowinia) 종, 에스. 세레비지애를 포함하는 사카로마이세스 종, 또는 쉬조사카로마이세 폼베(Schizosaccharomyce pombe)를 포함하는 쉬조사카로마이세 종으로부터 선택되는 효모 종과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 생물공학적 관련 효모로부터 선택될 수 있다.
메탄올 자화 효모 종 피키아 파스토리스의 주가 숙주 유기체로서 사용될 수 있다.
일 실시 형태에서, 숙주 유기체는 (국제특허 공개 WO 01/39544호에 기재된 바와 같이) 한세눌라 종, 예를 들어 에이치. 폴리모르파일 수 있다.
형질전환 식물/식물 세포
본 발명에 적합한 숙주 유기체는 식물일 수 있다. 일반적인 기술에 대한 개관은 문헌[Potrykus, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1991) 42:205-225] 및 문헌[Christou, Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27]에서, 또는 국제특허 공개 WO 01/16308호에서 찾아볼 수 있다. 트랜스제닉 식물은 예를 들어 향상된 수준의 피토스테롤 에스테르 및 피토스타놀 에스테르를 생성할 수 있다.
배양 및 생성
본 발명의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 코딩된 효소의 생성을 유도하는 그리고 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터의 상기 효소의 회수를 용이하게 하는 조건 하에서 배양될 수 있다.
세포의 배양에 사용되는 배지는 당해 숙주 세포의 성장 및 효소 발현의 수득에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.
재조합 세포에 의해 생성되는 단백질은 세포의 표면 상에서 디스플레이될 수 있다.
효소는 숙주 세포로부터 분비될 수 있으며, 잘 알려진 절차를 이용하여 배양 배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.
분비
흔히, 폴리펩티드는 발현 숙주로부터 배양 배지 내로 분비되는 것이 바람직하며, 효소는 상기 배양 배지로부터 더욱 용이하게 회수될 수 있다. 본 발명에 따르면, 분비 리더 서열은 원하는 발현 숙주를 기초로 하여 선택될 수 있다. 하이브리드 신호 서열이 본 발명의 맥락에서 또한 사용될 수 있다.
자연에서 지질 아실트랜스퍼라아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 결부되지 않은 분비 리더 서열의 전형적인 예로는 진균류 아밀로글루코시다아제 (AG) 유전자 (glaA - 예를 들어 아스페르길루스 유래의 18개 아미노산 버전 및 24개 아미노산 버전 둘 모두), a-인자 유전자 (효모, 예를 들어 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 및 한세눌라) 또는 α-아밀라아제 유전자 (바실러스)에서 기원하는 것이 있다.
검출
아미노산 서열의 발현의 검출 및 측정을 위한 다양한 프로토콜이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예에는 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사면역 분석법(radioimmunoassay; RIA) 및 형광 활성화 세포 분류법(fluorescent activated cell sorting; FACS)이 포함된다.
매우 다양한 표지체 및 콘쥬게이션 기술이 당업자에 의해 공지되어 있으며, 이는 다양한 핵산 및 아미노산 분석에서 사용될 수 있다.
다수의 회사, 예를 들어 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가(Promega; 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 및 유에스 바이오케미칼 코포레이션(US Biochemical Corp; 미국 오하이오주 클레블랜드 소재)이 이들 절차를 위한 상업적 키트 및 프로토콜을 공급한다.
적합한 리포터 분자 또는 표지체는 방사성 핵종, 효소, 형광, 화학발광 또는 발색 제제와, 기질, 보조 인자, 저해제, 자기 입자 등을 포함한다. 이러한 표지체의 사용을 교시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 미국 특허 제3,850,752호; 미국 특허 제3,939,350호; 미국 특허 제3,996,345호; 미국 특허 제4,277,437호; 미국 특허 제4,275,149호 및 미국 특허 제4,366,241호를 포함한다.
또한, 재조합 면역글로불린이 미국 특허 제4,816,567호에 나타낸 바와 같이 생성될 수 있다.
융합 단백질
본 발명에서 사용하기 위한 효소는 예를 들어 이의 추출 및 정제를 돕기 위하여 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 융합 단백질 파트너의 예에는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST), 6xHis, GAL4 (DNA 결합 및/또는 전사 활성화 도메인) 및 β-갈락토시다아제가 포함된다. 융합 단백질 파트너와 관심대상의 단백질 서열 사이에 단백질 분해 절단 부위를 포함하여 융합 단백질 서열의 제거를 허용하는 것이 또한 편리할 수 있다. 바람직하게는 융합 단백질은 단백질 서열의 활성을 방해하지 않을 것이다.
이. 콜라이에서의 유전자 융합물 발현 시스템이 문헌[Gene fusion expression systems in E. coli have been reviewed in Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6:501-6]에 개관되었다.
본 명세서에 정의된 특정한 특성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 융합 단백질을 코딩하기 위하여 비천연 서열에 라이게이션될 수 있다. 예를 들어, 물질 활성에 영향을 줄 수 있는 제제에 대한 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 있어서, 구매가능한 항체에 의해 인식되는 비천연 에피토프를 발현하는 키메라 물질을 코딩하는 것이 유용할 수 있다.
추가의 관심대상의 단백질(protein of interest; POI)
본 발명에 따라 사용하기 위한 서열은 또한 하나 이상의 추가의 관심대상의 단백질(POI) 또는 관심대상의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence of interest; NOI)과 함께 사용될 수 있다.
POI의 비제한적 예에는 하기가 포함된다: 전분 대사에 연루된 단백질 또는 효소, 글라이코겐 대사에 연루된 단백질 또는 효소, 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피커라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이자아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루큐로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 아이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락튜로나아제, 프로테아제, 람노-갈락튜로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제 (D-헥스소: O2-옥시도리덕타아제, EC 1.1.3.5) 또는 이의 조합. NOI는 심지어 상기 서열들 중 임의의 것에 대한 안티센스 서열일 수 있다.
POI는 심지어 예를 들어 추출 및 정제를 돕기 위한 융합 단백질일 수 있다.
POI는 심지어 분비 서열에 융합될 수 있다.
세제
본 발명의 조성물은 세정 및/또는 세제 조성물의 성분을 형성할 수 있다. 특히, 본 발명의 소정의 실시 형태는 세제를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 세정 및 세제 조성물은 본 기술 분야에 잘 기재되어 있으며, 적합한 세정 및 세제 조성물의 추가의 설명에 대해서는 국제특허 공개 WO 96/34946호; 국제특허 공개 WO 97/07202호; 및 국제특허 공개 WO 95/30011호를 참조한다.
본 발명의 화합물은 예를 들어 얼룩진 천의 전처리에 적합한 세탁 첨가제 조성물 및 린스 첨가된 천 유연제 조성물을 비롯한 손세탁 또는 기계 세탁용 세제 조성물로서 조제되거나, 또는 일반 가정의 경질 표면 세정 작업에 사용하기 위한 세제 조성물 (자동차 세척 또는 세정 조성물을 포함함)로서 조제되거나, 또는 수작업 또는 기계식 식기 세척 작업용으로 조제될 수 있다. 이것은 또한 손비누, 샴푸 및 샤워 겔을 포함하지만 이에 한정되지 않는 개인 위생 제품으로서의 사용용으로 조제될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 세탁 조성물은 지방 분해 효소, 하이드로포빈 및 선택적으로 세제가 하나 이상의 효소, 예를 들어 프로테아제, 카르복시펩티다아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 말토스 생성 아밀라아제, 말토스 비생성 아밀라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 포스포리파아제, 글리코실트랜스퍼라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 카보하이드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난아제, 만노시다아제, 아라비나아제, 갈락타나아제, 자일라나아제, 옥시다아제, 폴리에스테라아제, 락카아제, 사이클로덱스트린 에스테라아제, 피타아제, 카탈라아제, 할로퍼옥시다아제, 및/또는 퍼옥시다아제, 펙틴 분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 폴리페놀옥시다아제, 트랜스글루타미나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 및/또는 이의 조합과 조합된 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 양립가능하여야 하며 (예를 들어, pH 최적, 다른 효소 및 비효소 성분들과의 양립가능성 등), 효소(들)는 유효량으로 존재하여야 한다.
프로테아제: 적합한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형된 또는 단백질 엔지니어링된(engineered) 돌연변이체가 또한 적합하다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 예를 들어 알칼리 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리 프로테아제의 예로는 서브틸리신, 특히 바실러스 종으로부터 유래된 것, 예를 들어 서브틸리신 노보(Novo), 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg), 서브틸리신 309 (예를 들어 미국 특허 제6,287,841호 참조), 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 168 (예를 들어 국제특허 공개 WO 89/06279호 참조)이 있다. 트립신-유사 프로테아제의 예로는 (예를 들어 돼지 또는 소 기원의) 트립신 및 푸사륨 프로테아제 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 89/06270호 및 국제특허 공개 WO 94/25583호 참조)가 있다. 유용한 프로테아제의 예에는 또한 국제특허 공개 제WO 92/19729호 및 국제특허 공개 WO 98/20115호에 기재된 변이체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 구매가능한 프로테아제 효소는 알칼라아제(ALCALASE)(등록상표), 사비나아제(SAVINASE)(등록상표), 리쿼나아제(LIQUANASE)(등록상표), 오보자임(OVOZYME0(등록상표), 폴라자임(POLARZYME)(등록상표), 에스페라아제(ESPERASE)(등록상표), 에버라아제(EVERLASE)(등록상표), 및 칸나아제(KANNASE)(등록상표) (노보자임즈(Novozymes), 이전에는 노보 노르디스크 에이/에스(Novo Nordisk A/S)); 엑셀라아제(EXCELLASE)™, 막사타아제(MAXATASE)(등록상표), 막사칼(MAXACAL)™, 막사펨(MAXAPEM)™, 프로퍼라아제(PROPERASE)(등록상표), 프로퍼라아제 L(등록상표), 퓨라펙트(PURAFECT)(등록상표), 퓨라펙트 L(등록상표), 퓨라패스트(PURAFAST)™ , OXP™, FN2™, 및 FN3™ (제넨코르(Genencor) - 다니스코 에이/에스(Danisco A/S) 부문)을 포함한다.
폴리에스테라아제: 적합한 폴리에스테라아제는 국제특허 공개 WO 01/34899호 (제넨코르) 및 국제특허 공개 WO 01/14629호 (제넨코르)에 기재된 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 본 명세서에 개시된 다른 효소와 임의로 조합되어 포함될 수 있다.
아밀라아제: 본 조성물은 아밀라아제, 예를 들어 α-아밀라아제 (EC 3.2.1.1), G4-형성 아밀라아제 (EC 3.2.1.60), β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2) 및 γ-아밀라아제 (EC 3.2.1.3)를 포함할 수 있다. 이들은 박테리아 또는 진균류 기원의 아밀라아제를 포함할 수 있으며, 화학적으로 변형된 또는 단백질 엔지니어링된 돌연변이체가 포함된다. 듀라밀(DURAMYL)(등록상표), 터마밀(TERMAMYL)™, 펑가밀(FUNGAMYL)(등록상표) 및 반(BAN)™ (노보자임즈, 이전에는 노보 노르디스크 에이/에스), 라피다아제(RAPIDASE)(등록상표), 및 퓨라스타(PURASTAR)(등록상표) (다니스코 유에스에이, 인크.(Danisco USA, Inc.)), 리쿼자임(LIQUEZYME)™, 나탈라아제(NATALASE)™, 수프라밀(SUPRAMYL)™, 스테인자임(STAINZYME)™, 펑가밀 및 반™ (노보자임즈 에이/에스), 라피다아제(RAPIDASE)™, 퓨라스타(PURASTAR)™, 퓨라스타록삼(PURASTAROXAM)™ 및 파워라아제(POWERASE)™ (다니스코 유에스에이 인크.로부터의 것), 그라인드아밀(GRINDAMYL)™ 파워프레시(PowerFresh), 파워플렉스(POWERFlex)™ 및 그라인드아밀 파워소프트(PowerSoft) (다니스코 에이/에스로부터의 것)와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 구매가능한 아밀라아제.
퍼옥시다아제/옥시다아제: 본 조성물에서의 사용용으로 고려되는 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제는 식물, 박테리아 또는 진균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형된 또는 단백질 엔지니어링된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다아제의 예에는 국제특허 공개 WO 93/24618호, 국제특허 공개 WO 95/10602호 및 국제특허 공개 WO 98/15257호에 기재된 것과 같은, 코프리누스, 예를 들어 씨. 시네레우스 유래의 퍼옥시다아제, 및 이의 변이체가 포함된다. 구매가능한 퍼옥시다아제는 가드자임(GUARDZYME)(등록상표) (노보자임즈 에이/에스)을 포함한다.
셀룰라아제: 적합한 셀룰라아제는 박테리아 또는 진균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형된 또는 단백질 엔지니어링된 돌연변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라아제는 바실러스속, 슈도모나스속, 후미콜라(Humicola)속, 푸사륨속, 티엘라비아(Thielavia)속, 아크레모늄(Acremonium)속 유래의 셀룰라아제, 예를 들어 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 및 푸사륨 옥시스포룸으로부터 생성된 진균류 셀룰라아제를 포함하며, 이는 예를 들어 미국 특허 제4,435,307호; 미국 특허 제5,648,263호; 미국 특허 제5,691,178호; 미국 특허 제5,776,757호; 및 국제특허 공개 WO 89/09259호에 개시되어 있다. 사용에 고려되는 예시적인 셀룰라아제로는 텍스타일을 위한 색상 케어 효과를 갖는 것들이 있다. 이러한 셀룰라아제의 예로는 예를 들어 유럽 특허 제0495257호; 유럽 특허 제531372호; 국제특허 공개 WO 99/25846호 (제넨코르 인터내셔널, 인크.(Genencor International, Inc.)), 국제특허 공개 WO 96/34108호 (제넨코르 인터내셔널, 인크.), 국제특허 공개 WO 96/11262호; 국제특허 공개 WO 96/29397호; 및 국제특허 공개 WO 98/08940호에 기재되어 있는 셀룰라아제가 있다. 다른 예로는 셀룰라아제 변이체, 예를 들어 국제특허 공개 WO 94/07998호; 국제특허 공개 WO 98/12307호; 국제특허 공개 WO 95/24471호; 국제특허 공개 WO 99/01544호; 유럽 특허 제531 315호; 미국 특허 제5,457,046호; 미국 특허 제5,686,593호; 및 미국 특허 제5,763,254홍 기재된 것이 있다. 구매가능한 셀룰라아제는 셀루자임(CELLUZYME)(등록상표), 케어자임(등록상표) 및 엔돌라아제(ENDOLASE)(등록상표) (노보자임즈, 이전에는 노보 노르디스크 에이/에스); 클라지나아제(CLAZINASE)™ 및 퓨라닥스(PURADAX)(등록상표) HA (제넨코르); 및 KAC-500(B)™ (카오 코포레이션(Kao Corporation))를 포함한다.
구매가능한 만난아제의 예에는 만나웨이(MANNAWAY)™ (덴마크 소재의 노보자임즈) 및 만나스타(MANNASTAR)™ (제넨코르)가 포함된다.
본 발명의 조성물은 고체 또는 액체 중 어느 하나로 조제될 수 있다. 제형의 예에는 과립, 펠렛, 슬러리, 바아(bar), 페이스트, 폼, 겔, 스트립 등이 포함된다. 바람직한 세제 첨가제 제형은 특히 분진 비발생(non-dusting) 과립, 액체, 특히 안정화 액체 또는 슬러리이다. 액체 세제는 전형적으로 70% 이하의 물 및 0-30%의 유기 용매를 함유하는 수성 액체 세제 또는 비수성 액체 세제일 수 있다.
분진 비발생 과립은 예를 들어 미국 특허 제4,106,991호 및 미국 특허 제4,661,452호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있으며, 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 선택적으로 코팅될 수 있다. 왁스질 코팅 재료의 예로는 평균 몰중량이 1000 내지 20000인 폴리 (에틸렌 옥사이드) 생성물 (폴리에틸렌 글리콜, PEG); 16 내지 50개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 알코올이 12 내지 20개의 탄소 원자를 함유하며 15 내지 80개의 에틸렌 옥사이드 단위가 있는 에톡실화 지방 알코올; 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 다이- 및 트라이글리세라이드가 있다. 유체층 기술에 의한 적용에 적합한 필름-형성 코팅 재료의 예는 영국 특허 제1483591호에 주어져 있다. 액체 효소 제제는 예를 들어 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 확립된 방법에 따라 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 유럽 특허 출원 제238216호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
세제 조성물은 또한 하나 이상의 추가의 계면활성제를 포함할 수 있으며, 상기 계면활성제는 반극성 및/또는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 쯔비터이온성을 비롯하여 비이온성일 수 있다. 계면활성제는 전형적으로 0.1 중량% 내지 60 중량% 의 수준으로 존재한다.
포함시킬 때, 세제는 일반적으로 약 1% 내지 약 40%의 음이온성 계면활성제, 예를 들어 선형 알킬벤젠설포네이트, 알파-올레핀설포네이트, 알킬 설페이트 (지방 알코올 설페이트), 알코올 에톡시설페이트, 2차 알칸설포네이트, 알파-설포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐석신산 또는 비누를 함유할 것이다.
포함시킬 때, 세제는 일반적으로 약 0.2% 내지 약 40%의 비이온성 계면활성제, 예를 들어 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코사이드, 알킬다이메틸아민옥사이드, 에톡실레이트화 지방산모노에탄올아미드, 지방산모노에탄올아미드, 폴리하이드록시 알킬 지방산아미드, 또는 글루코사민의 다른 N-아실 또는 N-알킬 유도체를 함유할 것이다.
세제는 0-65%의 세제 빌더 또는 복합체 형성제, 예를 들어 제올라이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트라이아세트산, 에틸렌다이아민테트라아세트산, 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산, 알킬- 또는 알케닐석신산, 용해성 실리케이트 또는 층상 실리케이트 (예를 들어, 획스트(Hoechst)로부터의 SKS-6)를 함유할 수 있다.
세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예로는 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리 (비닐피롤리돈), 폴리 (에틸렌 글리콜), 폴리 (비닐 알코올), 폴리 (비닐피리딘-N-옥사이드), 폴리 (비닐이미다졸), 폴리카르복실레이트, 예를 들어 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 있다.
세제는 과산-형성 표백 활성제, 예를 들어 테트라아세틸에틸렌다이아민 또는 노나노일옥시벤젠설포네이트와 조합될 수 있는 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트와 같은 과산화수소 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 대안적으로, 표백 시스템은 예를 들어 아미드계, 이미드계 또는 설폰계의 퍼옥시산을 포함할 수 있다.
본 발명의 세제 조성물의 효소(들)는 통상적인 안정화제, 예를 들어 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산 또는 붕산 유도체, 예를 들어 방향족 보레이트 에스테르, 또는 페닐 보론산 유도체, 예를 들어 4-포르밀페닐 보론산을 사용하여 안정화될 수 있으며, 본 조성물은 예를 들어 국제특허 공개 WO 92/19709호 및 국제특허 공개 WO 92/19708호에 기재된 바와 같이 조제될 수 있다.
또한 세제는 다른 통상적인 세제 성분, 예를 들어 점토를 포함하는 천 컨디셔너, 폼 부스터(booster), 거품 억제제, 부식 방지제, 오염물 현탁제, 오염물 재침착 방지제, 염료, 살균제, 광 증백제, 하이드로트로프(hydrotrope), 변색 저해제 또는 방향제를 함유할 수 있다.
투입량
본 발명의 조성물에서, 하이드로포빈은 이것이 본 명세서에 기재된 효과를 나타낼 수 있게 하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다. 적합하게는, 하이드로포빈은 조성물의 총 중량의 0.001 중량% 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.002 중량% 내지 2.5 중량%, 더 바람직하게는 0.005 중량% 내지 1 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.5 중량%의 농도로 존재한다. 특히 바람직한 예에서, 하이드로포빈은 조성물의 총 중량의 0.01, 0.05, 0.1, 0.25 또는 0.4 중량%의 농도로 존재한다.
본 발명의 조성물에서, 지방 분해 효소는 이것이 본 명세서에 기재된 효과를 나타낼 수 있게 하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다.
적합하게는, 지방 분해 효소는 조성물의 총 중량의 0.001 내지 400 중량ppm, 바람직하게는 0.002 내지 200 중량ppm, 더 바람직하게는 0.005 내지 100 중량ppm, 더욱 더 바람직하게는 0.01 내지 50 중량ppm, 더욱 더 바람직하게는 0.02 내지 25 중량ppm의 순수 효소 단백질의 농도로 존재한다.
적합하게는, 지방 분해 효소는 조성물 1 g당 0.025 내지 25, 바람직하게는 0.05 내지 10, 더 바람직하게는 0.1 내지 5단위의 효소 활성의 농도로 존재한다. 상기 활성은 하기에 기재된 트라이옥타노에이트 분석법에 따라 측정되며, 여기서 1단위의 활성은 1 μmol의 자유 지방산이 효소액 1 g에 의해 1분 내에 생성됨을 나타낸다.
본 발명의 조성물이 세제를 포함할 경우, 세제는 이것이 본 명세서에 기재된 효과를 나타낼 수 있게 하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다. 적합하게는, 세제는 도(Do)에 의하면 0.001 내지 20 g/L, 바람직하게는 0.01 내지 10 g/L, 더 바람직하게는 0.05 내지 5 g/L, 더욱 더 바람직하게는 0.1 내지 2 5 g/L의 농도로 존재하며, 상기 리터는 세척액의 부피를 말한다. 특히 바람직한 예에서, 세제는 세척액 1 L당 0.01, 0.05, 0.1, 0.25 또는 0.4 g의 농도로 존재한다.
트라이옥타노에이트 분석
조성물 중 트라이옥타노에이트의 반응 에멀젼은 하기 2가지 완충제 중 하나에서, 에탄올 (5%)에 사전 현탁시킨 0.4% 트라이옥타노에이트로부터 제조되었다: pH 8.2로 조정된 0.05M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES), 또는 pH 10으로 조정된 0.05M N-사이클로헥실-3-아미노프로판설폰산 (CAPS). 이들 둘 모두의 완충제에 있어서, 물의 경도를 240 ppm으로 조정하였다. 최종 분석 혼합물은 트라이글리세라이드의 유화를 돕기 위하여 다양한 양의 세제를 함유하였다.
반응 에멀젼은 고전단 혼합을 2분 동안 적용하고 (24000 m-1, 울트라 투락스(Ultra Turrax) T25, 얀케 운트 쿤켈(Janke & Kunkel)), 그 후 150 μl를 이미 30 μl의 효소 샘플을 함유하고 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트 웰로 옮김으로써 제조하였다. 자유 지방산 생성량은 비-에스테르화 지방산(non-esterified fatty acids; NEFA)의 정량적 측정을 위한 시험관 내 효소적 비색 분석법을 사용하여 측정하였다. 이 방법은 자유 지방산에 특이적이며, 첨가된 아실-CoA 신테타아제의 존재 하에서의 지방산에 의한 코엔자임 A(CoA)의 아실화에 의존한다. 이와 같이 생성된 아실-CoA는 퍼옥시다아제의 존재 하에 과산화수소의 생성에 의해, 첨가된 아실-CoA 옥시다아제에 의해 산화된다. 이는 자주색 부가물이 형성되도록 3-메틸-N-에틸-N(β-하이드록시에틸)-아닐린과 4-아미노안티피린의 산화적 축합을 가능하게 하는데, 상기 부가물은 비색 측정될 수 있다. 30℃에서의 6분간의 인큐베이션 후 생성된 자유 지방산의 양은 30 μl의 가수분해 용액을 이미 120 μl의 NEFA A 용액을 함유하고 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트 웰로 옮김으로써 NEFA HR(2) 키트 (독일 소재의 와코 케미칼스 게엠베하(Wako Chemicals GmbH)) 내의 재료들을 사용하여 측정하였다. 30℃에서의 3분 동안의 인큐베이션에 이어서 60 μl의 NEFA B 용액을 첨가하였다. 30℃에서의 4.5분 동안의 인큐베이션 후, 520 nm에서의 OD를 측정하였다.
세탁 조성물
본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 예를 들어 세탁 조성물 중 하이드로포빈 전구체 (예를 들어 하이드로포빈 융합 단백질)의 가수분해에 의해 세탁 조성물 내에서 원위치에서 생성될 수 있다.
하이드로포빈 전구체 (예를 들어 하이드로포빈 융합 단백질)는 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈을 원위치에서 생성하기 위하여 필요하다. 이것은 세탁 조성물의 초기 성분으로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 하이드로포빈 전구체가 처음에 전혀 존재하지 않거나 또는 불충분하게 존재할 경우, 이 성분은 상기 조성물에 첨가될 수 있다.
필요할 경우, 촉매 (특히 효소, 특히 프로테아제 효소)가 존재할 수 있다. 이것은 세탁 조성물의 초기 성분으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 촉매가 처음에 전혀 존재하지 않거나 또는 불충분하게 존재할 경우, 이 성분은 상기 조성물에 첨가될 수 있다.
세탁 조성물은 지질 (특히, 트라이글리세라이드 및/또는 다이글리세라이드 및/또는 모노글리세라이드)일 수 있는 얼룩을 추가로 포함할 수 있다. 이 얼룩은 표면, 예를 들어 천 상에 존재할 수 있다. 따라서 본 발명의 세탁 조성물은 표면, 예를 들어 천을 포함할 수 있다.
하이드로포빈 전구체의, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈으로의 전환은 천으로부터의 지질을 포함하는 얼룩의 제거를 도울 수 있다.
세정 방법
본 발명은 표면을 본 발명에 따른 조성물과 접촉시킴으로써 지질-기재의 얼룩을 표면으로부터 제거하는 방법을 추가로 포함한다. 게다가, 본 발명은 표면을 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 표면의 세정 방법을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 물품을 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 물품 (그러나 특별히 배타적으로 의류 물품 또는 식탁용 식기류 물품인 것은 아님)의 세정 방법을 포함한다.
다른 태양에서, 천으로부터 유성 얼룩을 제거하는 방법이 제공된다. 본 방법은 일반적으로 유성 얼룩을 갖는 천을 확인하는 단계, 천을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계, 및 천을 헹구어 유성 얼룩을 천으로부터 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소, 하이드로포빈, 및 선택적으로 세제는 단일 조성물 중에 함께 존재한다. 일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소, 하이드로포빈 및 선택적으로 세제는 상이한 조성물들 중에 별도로 있으며, 이들은 천과의 접촉 이전에 조합되거나 또는 천 상에서 함께 혼합된다. 따라서, 리파아제 및 아쥬반트(adjuvant)의 적용은 동시적이거나 또는 순차적일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 세척 전처리 단계, 즉 천을 손세탁하거나 또는 기계 세탁하기 전에 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 천을 손세탁하거나 또는 기계 세탁할 때에 일어난다. 상기 접촉은 본 발명의 조성물을 세척수와 혼합하거나, 본 조성물을 천 상에 스프레이하거나, 붓거나 또는 적하하거나, 또는 본 조성물을 어플리케이터를 사용하여 적용한 결과로서 일어날 수 있다.
본 방법은 다양한 오일 얼룩, 또는 유성 얼룩 부분을 제거하는 데 효과적인데, 상기 얼룩은 전형적으로 지방산의 에스테르, 예를 들어 트라이글리세라이드를 포함한다.
헹굼은 세척 후 어떤 시점에 일어날 수 있으며, 일부 태양에서 본 발명의 세정 방법은 천을 조성물과 접촉시킨 후 본질적으로 완료됨을 알 것이다.
식료품
본 발명의 조성물은 식료품의 성분으로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식료품"은 인간 및/또는 동물 소비용으로 적합한 물질을 의미한다.
적합하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식료품"은 바로 소비될 수 있는 형태의 식료품을 의미할 수 있다. 그러나, 대안적으로 또는 이에 더하여, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 식료품이라는 용어는 식료품의 제조에서 사용되는 하나 이상의 식품 재료를 의미할 수 있다. 단지 예로서, 식료품이라는 용어는 도우(dough)로부터 생성된 베이킹된(baked) 상품과, 상기 베이킹된 상품의 제조에서 사용되는 도우 둘 모두를 포함한다.
식료품은 용도 및/또는 적용 양식 및/또는 투입 양식에 따라 용액의 형태로 또는 고체로서 존재할 수 있다.
식품 - 예를 들어 기능성 식품 - 으로서 사용될 - 또는 이의 제조에서 사용될 - 때, 본 발명의 조성물은 하기 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다: 영양적으로 허용가능한 담체, 영양적으로 허용가능한 희석제, 영양적으로 허용가능한 부형제, 영양적으로 허용가능한 아쥬반트, 영양적으로 활성인 성분.
바람직한 태양에서, 본 발명은 하기 중 하나 이상으로부터 선택되는, 상기에 정의된 식료품을 제공한다: 난류(eggs), 마요네즈, 샐러드 드레싱, 소스, 아이스크림, 알가루(egg powder), 변성 난황 및 이로부터 제조된 제품을 포함하지만 이에 한정되지 않는 난류-기재의 제품; 빵, 케이크, 스위트(sweet) 도우 제품, 라미네이션된 도우, 액체 반죽, 머핀, 도넛, 비스킷, 크래커 및 쿠키를 포함하는 베이킹된 상품; 초컬릿, 캔디, 캐러멜, 할라와(halawa), 무가당 및 가당 껌, 풍선껌, 부드러운 풍선껌, 츄잉껌을 포함하는 껌, 및 푸딩을 포함하는 과자류; 셔벗을 포함하는 냉동 제품, 바람직하게는 아이스크림 및 아이스밀크를 포함하는 냉동 유제품; 치즈, 버터, 밀크, 커피 크림, 휘핑 크림, 커스터드 크림, 밀크 드링크 및 요구르트를 포함하는 유제품; 무스, 야채용 휘핑 크림, 가공된 식육 제품을 포함하는 식육 제품; 식용 유지류, 가스가 들어있는(aerated) 그리고 가스가 들어 있지 않은(non-aerated) 휘핑 제품, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 마가린, 쇼트닝 및 저지방 및 초저지방 스프레드를 포함하는 스프레드; 드레싱, 마요네즈, 딥(dip), 크림 기재의 소스, 크림 기재의 수프, 음료, 향신료 에멀젼 및 소스.
적합하게는, 본 발명에 따른 식료품은 "고부가가치 식품(fine food)"일 수 있으며, 이는 케이크, 페이스트리, 과자류, 초컬릿, 퍼지(fudge) 등을 포함한다.
일 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 도우 제품 또는 베이킹된 제품, 예를 들어 빵, 튀긴 제품, 스낵, 케이크, 파이, 브라우니, 쿠키, 누들, 스낵 물품, 예를 들어 크래커, 그라함 크래커, 프레첼, 및 포테이토칩과, 파스타일 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 간편식, 예를 들어 부분 베이킹 또는 부분 조리 제품일 수 있다. 이러한 부분 베이킹 또는 부분 조리 제품의 예에는 상기에 기재된 베이킹 제품 및 도우의 부분 베이킹 버전이 포함된다.
추가의 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 식물 유래된 식품 제품, 예를 들어 가루, 프리믹스, 오일, 지방, 코코아 버터, 커피 화이트너(coffee whitener), 샐러드 드레싱, 마가린, 스프레드, 땅콩 버터, 쇼트닝, 아이스크림, 조리용 기름일 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 버터, 밀크, 크림, 치즈, 예를 들어 다양한 형태 (치즈, 예를 들어 다양한 형태(조각난 형태, 블록 형태, 슬라이스 형태 또는 입자상(grated)을 포함함)의 천연 치즈, 가공 치즈 및 모조 치즈, 크림 치즈, 아이스크림, 냉동 디저트, 요구르트, 요구르트 드링크, 버터 지방, 무수 유지방, 다른 유제품일 수 있다. 본 발명에 따른 효소는 유제품에서 지방 안정성을 향상시킬 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 동물 유래 성분을 함유하는 식품 제품, 예를 들어 가공육 제품, 조리용 기름, 쇼트닝일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 음료, 과일, 혼합 과일, 야채류, 마리네이드 또는 와인일 수 있다.
일 태양에서, 본 발명에 따른 식료품은 식물 유래 오일(즉, 식물유), 예를 들어 올리브유, 해바라기유, 땅콩유 또는 평지씨유이다. 오일은 탈검(degummed) 오일일 수 있다.
실시예
실시예 1
구매가능한 열불활성화 세제의 존재 또는 부재 하에 하이드로포빈의 첨가에 의해 리파아제의 세정 능력이 향상되는지를 시험하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.
사용한 리파아제는 하기와 같았다 (각각을 단회 용량으로 투입함):
리펙스™ (abH23.1, 진균류) (서열 번호 11) (노보자임즈 에이/에스로부터 구매가능함), 1 mL 중 1.25 mg
리포맥스™ (abH15.2, 패밀리 l-1) (서열 번호 15) (다니스코 에이/에스로부터 구매가능함), 1 mL 중 6 mg
SprLip2 (abH16, 패밀리 l-7) (서열 번호 17), 1 mL 중 258 μl
TfuLip2 (abH25.1, 패밀리 lll) (서열 번호 16), 1 mL 중 30.8 μl
사용한 하이드로포빈은 하이드로포빈 HFBII (서열 번호 2; 진균류 트리코데르마 레에세이로부터 수득가능함)였다. 26.6 g의 HFBII (150 mg/g의 하이드로포빈 단백질을 함유함)를 100 mL의 물에 용해시켜 40 g/L의 하이드로포빈 단백질을 함유하는 용액을 제공하였다. 상기 용액을 적절하게 희석시켜 조성물의 총 중량의 0.01, 0.05, 0.1, 0.25 및 0.40 중량%의 하이드로포빈 용량을 제공하였다.
사용한 세제는 열불활성화 액체 세제 (아리엘™ 컬러 리퀴드) 및 열불활성화 분말 세제 (아리엘™ 컬러 파우더)였다. 이들은 프록터 앤드 갬블(Procter & Gamble)로부터 구매가능하다. 세제를 적절하게 희석시켜 0, 0.1, 0.25 및 0.4 g/L의 용량을 제공하였다.
세제를 하기와 같이 열불활성화시켰다: 액체 세제를 95℃의 수조 내에 2시간 동안 두는 한편, 분말 세제의 물 중 0.1 g/mL 제제를 핫플레이트(hot plate) 상에서 1시간 동안 비등시켰다. 열처리는, 비효소 세제 성분의 특성을 유지하면서 상업적 세제 제형 중 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 불활성화시킨다. 가열 후, 세제를 희석시키고, 리파아제 효소 활성에 대하여 분석한다.
얼룩진 천 상에서의 리파아제 및 하이드로포빈의 세정 능력을 미세견본(microswatch) 분석 포맷으로 시험하였다. 얼룩 제거 실험은, 24웰 플레이트 포맷 (덴마크 소재의 넝크(Nunc))으로 세팅한, 지질을 함유하는 기술적 얼룩 (CS-61 견본: 네덜란드 소재의 센터 포 테스트머티리얼즈(Center for Testmaterials)로부터 구매한, 착색제를 포함하는 소고기 지방, 면직물)을 사용하여 실시하였다. 각각의 분석 웰은 CS-61 견본의 사전 절단 13 ㎜ 조각을 포함하도록 세팅하였다. 견본들을 스캐너 (마이크로텍 스캔 메이커(MiCrotek Scan Maker) 900)를 사용하여 사전 판독하고, 24웰 플레이트 내에 넣었다.
사용한 완충제는 액체 세제 시험의 경우 20 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES) (0.2 M, pH 8.2)이었으며, 분말 세제 시험의 경우 20 mM N-사이클로헥실-3-아미노프로판설폰산 (CAPS) (0.2 M, pH 10.0)이었다. 물의 경도는, 둘 모두의 완충제에 있어서 15000 ppm의 2/1 Ca2+/Mg2+를 2400 ppm (희석률: 6.25)으로 희석시킨 것을 사용하여 24도 (프랑스 경도) (FH - 1도 (프랑스 경도)는 물 1 리터당 탄산칼슘 10 밀리그램으로 정의됨)로 조정하였다.
24웰 플레이트를 사용하였으며, 각각의 웰은 1 ml의 용액을 함유하였다. 각각의 줄의 하이드로포빈 농도는 하기와 같았다: 조성물의 총 중량의 0 중량%; 0.01 중량%; 0.05 중량%; 0.1 중량%; 0.25 중량%; 및 0.4 중량%. 각각의 컬럼에서의 세제 농도는 하기와 같았다: 0; 0.1 g/L; 0.25 g/L; 및 0.4 g/L.
상기에 기재된 900 μl의 적절한 완충제를 24웰 플레이트의 각각의 견본-함유 웰에 첨가하였다. 100 μl의 하이드로포빈 용액을 각각의 웰 내에 첨가하였다. 반응의 개시를 위하여, 효소 샘플을 100 μl의 부피로 각각의 웰 내에 첨가하였다. 상기 플레이트를 200 rpm에서 37℃에서 30분 동안 진탕시켰다. 인큐베이션 후, 반응 완충제를 제거하고, 각각의 웰 내의 천을 1 mL의 증류수로 3회 헹구었다. 헹굼액을 제거한 후, 견본을 50℃에서 4시간 동안 건조시키고, 반사율을 측정하였다. 세정 능력을 단일 세척 사이클 후 정량화하였다. 얼룩 제거율은 각각의 견본에 있어서 세정 후 및 세정 전 RGB 컬러 측정의 차이로서 계산하였다. RGB 측정치를 스캐너 (마이크로텍 스캔 메이커 900)를 이용하여 취하였다.
세척된 천의 얼룩 제거 지수(Stain Removal Index; ΔSRI) 값의 차이를 하기 식을 이용하여 세척하지 않은 천과 관련하여 계산하였다:
오염물 제거율 (%)(RGB) = (오염물 제거 ΔE(RGB)/ 초기 오염물 ΔE(RGB)) × 100%
여기서,
이며,
이고, RGB ref 값은 오염되지 않은 면직물 (백색)의 값이다.
그 결과를 하기와 같이 도 1a 내지 5e에 나타낸다:
도 1a 내지 1c: 지방 분해 효소 없음(대조군)
도 2a 내지 2e: 지방 분해 효소 리펙스™ (abH23.1)
도 3a 내지 3e: 지방 분해 효소 리포맥스™ (abH15.2)
도 4a 내지 4e: 지방 분해 효소 SprLip2 (abH16)
도 5a 내지 5e: 지방 분해 효소 TfuLip2 (abH25.1)
특히, 도 2e, 4e 및 5e는 세제의 부재 하에서 시스템 중 리파아제의 존재에 대한 하이드로포빈의 영향을 예시한다. 이들 도면은 적어도 이들 리파아제에 있어서 개별적으로 사용될 때의 각각의 성분의 상가 효과보다 탁월한 상승 효과가 관찰될 수 있음을 나타낸다.
게다가, 도 2b는 하이드로포빈, 리파아제 리펙스(등록상표) 및 세제 아리엘(등록상표) 컬러 리퀴드의 조합물을 사용할 때, 세제의 농도가 증가함에 따라 이 시스템은 세제를 사용하지 않을 때와 비교하여 더욱 낮은 농도의 하이드로포빈 (0.4% 대신 0.05%)에서 능력 평탄역에 도달한다. 더욱이, 도 5b는 하이드로포빈, 리파아제 TfuLip2 및 세제 아리엘(등록상표) 컬러 리퀴드의 조합물을 사용하여, 세제의 농도 및 하이드로포빈의 농도를 증가시킴으로써, 개선된 세척 효과를 성취할 수 있음을 (특히 0.4 g/L의 세제 및 0.4%의 하이드로포빈을 이용함) 나타낸다.
게다가, 도 2d는 하이드로포빈, 리파아제 리펙스(등록상표) 및 세제 아리엘(등록상표) 컬러 파우더의 조합물을 이용할 때, 능력 패턴이 세제의 더욱 낮은 수준에 의해 영향을 받지 않음을 예시한다 (이 시스템은 0.05%의 하이드로포빈에서 평탄역에 도달함). 그러나, 더욱 높은 농도의 세제에서, 더욱 높은 SRI 값이 도달될 수 있다 (0.4 g/L의 세제에서 30%). 더욱이, 도 5d는 하이드로포빈, 리파아제 TfuLip2 및 세제 아리엘(등록상표) 컬러 파우더의 조합물을 사용할 때, 이 시스템의 전체 능력은 시스템 중 세제의 농도가 증가함에 따라 향상됨을 예시한다.
마지막으로, 도 1b는 하이드로포빈 및 세제 아리엘(등록상표) 컬러 리퀴드의 조합물을 리파아제의 부재 하에 사용할 때, 낮은 농도의 하이드로포빈 (0.01-0.1%) 및 세제 (0.25 g/L 미만)에서 적은 상승 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 2 - 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스 ATCC 2548 리파아제 (SprLip2)의 클로닝 및 발현
SprLip2 유전자를 진레이(GeneRay; 중국 상하이 소재)가 합성하였다. SprLip2 합성 유전자를 NheI/BamHI 이중 절단 및 라이게이션에 의해 발현 플라스미드 pKB128 내로 클로닝하였다. 플라스미드 pKB128은 플라스미드 pKB105의 유도체이며 (미국 특허 공개 제2006/0154843호에 기재됨) A4 프로모터-CelA 신호 서열의 공급원이다. 플라스미드 pKB128은 BamHI 부위 앞에 NsiI-MluI-HpaI 제한효소 부위 (atgcatacgcgtgttaac; 서열 번호 30)를 함유한다. 에이. 니게르 A4 프로모터 및 CelA 절단 신호 서열은 SprLip2 유전자 서열 (예측 성숙 단백질에 상응함)의 5' 말단에 있으며, 11AG3 종결 서열은 SprLip2 유전자 서열의 3' 말단에 융합시켰다. pZQ205 발현 벡터 (도 30)는 pKB128을 제한 효소 NheI 및 BamHI로 절단한 후 유사하게 절단된 SprLip2 합성 유전자에 라이게이션시키고, 이어서 이. 콜라이 세포를 형질전환시킴으로써 제작하였다. SprLip2 유전자의 올바른 서열을 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.
pZQ205의 플라스미드 DNA로 숙주 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyes lividans) TK23 원형질 세포 (미국 특허 공개 제2006/0154843호에 기재됨)를 형질전환시켰다. 3개의 형질전환체를 골라내고, 시드(seed) 진탕 플라스크 내로 옮기고 (다이메틸 설폭사이드 중 50 ug/ml의 티오스트렙톤을 함유하는 15 ml의 TSG 배지), 30℃에서 2일 동안 성장시켰으며, 이때 200 rpm에서 진탕하였다. 시드 진탕 플라스크로부터의 2일 배양물 3 ml을 단백질 생성을 위하여 30 ml의 스트렙토마이세스 변형 생성 배지 II로 옮겼다. 생성 배양물을 200 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 2일 동안 성장시켰다. 단백질을 세포외 배지 내로 분비시키고, 여과한 배양 배지를 세정 분석의 수행에 그리고 생화학적 특성화 실험에 사용하였다. 투입량은 바이오라드(Biorad) 단백질 분석법 (500-0006EDU)을 이용하여 브래드포드식(Bradford type) 분석에 의해 결정한 총 단백질을 기준으로 하고, 바이오-라드로부터의 크라이테리온(Criterion) 얼룩 무함유 시스템을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 결정된 순도에 대하여 보정하였다.
실시예 3 - SprLip2의 생화학적 특성화
SprLip2의 리파아제/에스테라아제 활성을 파라-니트로페닐 부티레이트 에스테르 (pNB) 및 파라-니트로페닐 팔미테이트 (pNPP)를 기질로 사용하여 시험하였다. 각각의 기질 (p-니트로페닐 부티레이트, pNB, 시그마(Sigma), CAS 2635-84-9, 카탈로그 번호 N9876, 다이메틸 설폭사이드 (피어스(Pierce), 20688, 수분 함량 <0.2%)에 용해시킴; 및 p-니트로페닐 팔미테이트 (pNPP; 시그마, CAS 1492-30-4, 카탈로그 번호 N2752, 다이메틸 설폭사이드에 용해시킴)의 20 mM 스톡 용액을 제조하고, 장시간 보관을 위하여 -80℃에서 보관하였다. SprLip2 발현 세포로부터의 여과 배양 상청액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 분석 완충제 [2% 폴리비닐 알코올 (PVA)을 함유하는 50 mM HEPES pH 8.2, (0.75 mM CaCl2 및 0.25 mM MgCl2를 함유함) (시그마)]에서 연속적으로 희석시키고, 25℃에서 평형시켰다. 100 μl의 1:20으로 희석시킨 기질 (분석 완충제 중)을 다른 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 300 rpm에서 진탕시키면서 25℃에서 10분 동안 평형시켰다. 희석 플레이트로부터의 10 μl의 효소 용액을 기질 함유 플레이트에 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 플레이트를 25℃로 평형시킨, 동적 측정이 가능한 분광 광도계로 즉시 옮겼다. 동적 모드에서의 흡광도 변화를 410 nm에서 5분 동안 판독하였다. 배경 속도 (효소를 전혀 포함하지 않음)를 시험 샘플의 속도로부터 차감하였다. 샘플 농도를 하기와 같이 결정하였다:
샘플 농도 = (공지되지 않은 속도 × 표준 농도) / 표준 속도
결과를 도 32 (pNB 가수분해) 및 도 33 (pNPP 가수분해)에 나타낸다. (상대적인 가수분해 속도).]
실시예 4 - SprLip2에 의한 트라이글리세라이드의 가수분해
이 분석은 리파아제에 의한 트라이글리세라이드 기질로부터의 지방산의 방출을 측정하도록 설계하였다. 이 분석은 가수분해 반응물로 이루어졌으며, 여기서, 리파아제를 트라이글리세라이드 에멀젼과 함께 인큐베이션하면 지방산이 유리되며 따라서 유화된 기질의 탁도가 감소한다. 이 분석에 사용한 트라이글리세라이드 기질은 글리세릴 트라이옥타노에이트 (시그마, CAS 538-23-8, 카탈로그 번호 T9126-100ML)였다. 유화된 트라이옥타노에이트 (0.75% (v/v 또는 w/v))는 50 ml의 검 아라빅 (시그마, CAS 9000-01-5, 카탈로그 번호 G9752; pH 8.2의 50 mM HEPES 중에 제조한 10 mg/ml의 검 아라빅) 또는 세제 용액 (pH 8.2의 50 mM HEPES 중 0.1% 열불활성화 타이드(Tide)(등록상표) 냉수용 세제, 미국 오하이오주 신시내티 소재의 프록터 앤드 갬블 (0.75 mM CaCl2 및 0.25 mM MgCl2를 함유함))을 375 μl의 트라이글리세라이드와 혼합함으로써 제조하였다. 상기 용액들을 혼합하고, 2분 이상 동안 초음파 처리하여 안정한 에멀젼을 제조하였다. 200 μl의 유화 기질을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 20 μl의 연속 희석 효소 샘플 (SprLip2를 발현하는 세포로부터의 여과 배양 상청액)을 기질 함유 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 실러(sealer)로 덮고, 20℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액 중의 지방산의 존재는 제조업자가 나타낸 바와 같이 HR 시리즈 NEFA-HR (2) NEFA 키트 (독일 소재의 와코 케미칼스 게엠베하)를 사용하여 550 nm에서의 흡광도의 증가로서 검출하였다. 결과를 도 34 (세제 없음) 및 도 35 (세제를 이용함)에 나타낸다.
실시예 5 - SprLip2의 세정 능력
SprLip2의 세정 능력을 구매가능한 열불활성화 세제의 존재 및 부재 하에서 시험하였다. 리파아제의 스톡 용액은 258 μl의 효소를 증류수에 의해 1 ml로 희석시킴으로써 제조하였다. 사용한 세제는 미국 오하이오주 신시내티 소재의 프록터 앤드 갬블로부터의 열불활성화 액체 세제 (아리엘™ 컬러 리퀴드) 및 열불활성화 분말 세제 (아리엘™ 컬러 파우더)였다.
얼룩 제거 실험은, 24웰 플레이트 포맷 (덴마크 소재의 넝크)으로, 지질을 함유하는 기술적 얼룩 (CS-61 견본: 네덜란드 소재의 센터 포 테스트머티리얼즈로부터 구매한, 착색제를 포함하는 소고기 지방, 면직물)을 사용하여 실시하였다. 각각의 분석 웰은 CS-61 견본의 사전 절단 13 ㎜ 조각을 포함하도록 세팅하였다. 견본들을 스캐너 (마이크로텍 스캔 메이커 900)를 사용하여 사전 판독하고, 24웰 플레이트 내에 넣었다. 사용한 완충제는 액체 세제의 경우 pH 8.2의 20 mM HEPES였으며, 분말 세제의 경우 pH 10.0의 20 mM CAPS였다. 물의 경도는, 둘 모두의 완충제에 있어서 15000 ppm의 2/1 Ca2+/Mg2+를 2400 ppm으로 희석시킨 것을 사용하여 24도 (프랑스 경도)로 조정하였다. 세제들을 0; 0.1 g/L; 0.25 g/L; 및 0.4 g/L의 농도로 시험하였다. 상기에 기재된 1 ml의 적절한 완충제를 24웰 플레이트의 각각의 견본-함유 웰에 첨가하였다. 반응의 개시를 위하여, 효소 샘플을 100 μl의 부피로 각각의 웰 내에 첨가하였다. 상기 플레이트를 200 rpm에서 37℃에서 30분 동안 진탕시켰다. 인큐베이션 후, 반응 완충제를 제거하고, 각각의 웰 내의 천을 1 mL의 증류수로 3회 헹구었다. 헹군 견본을 50℃에서 4시간 동안 건조시키고, 그의 반사율을 측정하였다. 세정 능력을 단일 세척 사이클 후 정량화하였다. 얼룩 제거율은 각각의 견본에 있어서 세정 후 및 세정 전 RGB 측정의 차이로서 계산하였다. RGB 측정치를 스캐너 (마이크로텍 스캔 메이커 900)를 이용하여 취하였다. 세척된 천의 얼룩 제거 지수 값(SRI)의 차이를 하기 식을 이용하여 세척하지 않은 천과 관련하여 계산하였다:
오염물 제거율 (%)(RGB) = (오염물 제거 ΔE(RGB)/ 초기 오염물 ΔE(RGB)) × 100%
여기서,
이며,
이고, RGB ref 값은 오염되지 않은 면직물 (백색)의 값이다.
결과는 도 36에 나타내어져 있다.
상기 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않고서 본 발명의 개시된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화가 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명을 특정한 바람직한 실시 형태와 관련하여 설명하였지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시 형태에 부당하게 한정되지 않아야 함을 이해하여야 한다. 실제, 화학 분야, 생화학 분야 및 생물 공학 분야 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한, 본 발명을 실시하기 위한 설명된 양식의 다양한 변경이 하기 특허청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
<110> DANISCO US, Inc
<120> Compositions
<130> P040179WO
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 667
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 1
cacattcact caactcctct ttctcaactc tccaaacaca aacattcttt gttgaatacc 60
aaccatcacc acctttcaag atgcagttct tcgccgtcgc cctcttcgcc accagcgccc 120
tggctgctgt ctgccctacc ggcctcttct ccaaccctct gtgctgtgcc accaacgtcc 180
tcgacctcat tggcgttgac tgcaagaccc gtatgttgaa ttccaatctc tgggcatcct 240
gacattggac gatacagttg acttacacga tgctttacag ctaccatcgc cgtcgacact 300
ggcgccatct tccaggctca ctgtgccagc aagggctcca agcctctttg ctgcgttgct 360
cccgtggtaa gtagtgctcg caatggcaaa gaagtaaaaa gacatttggg cctgggatcg 420
ctaactcttg atatcaaggc cgaccaggct ctcctgtgcc agaaggccat cggcaccttc 480
taaagcaatg gcttgcttta ctgccggcag tctttgagaa ctctgggctc acaaaagacg 540
acttgcatgt atcatggggg ctcgcaaatg ggaggatttg gaggggattg aggctgggtt 600
tggcctatta gaggattgca taatggaaga tttgcgagca ggacatagac gtatctagag 660
ttctagt 667
<210> 2
<211> 86
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 2
Met Gln Phe Phe Ala Val Ala Leu Phe Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Val Cys Pro Thr Gly Leu Phe Ser Asn Pro Leu Cys Cys Ala Thr Asn
20 25 30
Val Leu Asp Leu Ile Gly Val Asp Cys Lys Thr Pro Thr Ile Ala Val
35 40 45
Asp Thr Gly Ala Ile Phe Gln Ala His Cys Ala Ser Lys Gly Ser Lys
50 55 60
Pro Leu Cys Cys Val Ala Pro Val Ala Asp Gln Ala Leu Leu Cys Gln
65 70 75 80
Lys Ala Ile Gly Thr Phe
85
<210> 3
<211> 2868
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 3
tttgtatggc tggatctcga aaggcccttg tcatcgccaa gcgtggctaa tatcgaatga 60
gggacaccga gttgcatatc tcctgatcat tcaaacgaca agtgtgaggt aggcaatcct 120
cgtatcccat tgctgggctg aaagcttcac acgtatcgca taagcgtctc caaccagtgc 180
ttaggtgacc cttaaggata cttacagtaa gactgtatta agtcagtcac tctttcactc 240
gggctttgaa tacgatcctc aatactcccg ataacagtaa gaggatgata cagcctgcag 300
ttggcaaatg taagcgtaat taaactcagc tgaacggccc ttgttgaaag tctctctcga 360
tcaaagcaaa gctatccaca gacaagggtt aagcaggctc actcttccta cgccttggat 420
atgcagcttg gccagcatcg cgcatggcca atgatgcacc cttcacggcc caacggatct 480
cccgttaaac tcccctgtaa cttggcatca ctcatctgtg atcccaacag actgagttgg 540
gggctgcggc tggcggatgt cggagcaaag gatcacttca agagcccaga tccggttggt 600
ccattgccaa tggatctaga ttcggcacct tgatctcgat cactgagaca tggtgagttg 660
cccggacgca ccacaactcc ccctgtgtca ttgagtcccc atatgcgtct tctcagcgtg 720
caactctgag acggattagt cctcacgatg aaattaactt ccagcttaag ttcgtagcct 780
tgaatgagtg aagaaatttc aaaaacaaac tgagtagagg tcttgagcag ctggggtggt 840
acgcccctcc tcgactcttg ggacatcgta cggcagagaa tcaacggatt cacacctttg 900
ggtcgagatg agctgatctc gacagatacg tgcttcacca cagctgcagc tacctttgcc 960
caaccattgc gttccaggat cttgatctac atcaccgcag cacccgagcc aggacggaga 1020
gaacaatccg gccacagagc agcaccgcct tccaactctg ctcctggcaa cgtcacacaa 1080
cctgatatta gatatccacc tgggtgattg ccattgcaga gaggtggcag ttggtgatac 1140
cgactggcca tgcaagacgc ggccgggcta gctgaaatgt ccccgagagg acaattggga 1200
gcgtctatga cggcgtggag acgacgggaa aggactcagc cgtcatgttg tgttgccaat 1260
ttgagattgt tgaccgggaa aggggggacg aagaggatgg ctgggtgagg tggtattggg 1320
aggatgcatc attcgactca gtgagcgatg tagagctcca agaatataaa tatcccttct 1380
ctgtcttctc aaaatctcct tccatcttgt ccttcatcag caccagagcc agcctgaaca 1440
cctccagtca acttccctta ccagtacatc tgaatcaaca tccattcttt gaaatctcac 1500
cacaaccacc atcttcttca aaatgaagtt cttcgccatc gccgctctct ttgccgccgc 1560
tgccgttgcc cagcctctcg aggaccgcag caacggcaac ggcaatgttt gccctcccgg 1620
cctcttcagc aacccccagt gctgtgccac ccaagtcctt ggcctcatcg gccttgactg 1680
caaagtccgt aagttgagcc ataacataag aatcctcttg acggaaatat gccttctcac 1740
tcctttaccc ctgaacagcc tcccagaacg tttacgacgg caccgacttc cgcaacgtct 1800
gcgccaaaac cggcgcccag cctctctgct gcgtggcccc cgttgtaagt tgatgcccca 1860
gctcaagctc cagtctttgg caaacccatt ctgacaccca gactgcaggc cggccaggct 1920
cttctgtgcc agaccgccgt cggtgcttga gatgcccgcc cggggtcaag gtgtgcccgt 1980
gagaaagccc acaaagtgtt gatgaggacc atttccggta ctgggaaagt tggctccacg 2040
tgtttgggca ggtttgggca agttgtgtag atattccatt cgtacgccat tcttattctc 2100
caatatttca gtacactttt cttcataaat caaaaagact gctattctct ttgtgacatg 2160
ccggaaggga acaattgctc ttggtctctg ttatttgcaa gtaggagtgg gagattcgcc 2220
ttagagaaag tagagaagct gtgcttgacc gtggtgtgac tcgacgagga tggactgaga 2280
gtgttaggat taggtcgaac gttgaagtgt atacaggatc gtctggcaac ccacggatcc 2340
tatgacttga tgcaatggtg aagatgaatg acagtgtaag aggaaaagga aatgtccgcc 2400
ttcagctgat atccacgcca atgatacagc gatatacctc caatatctgt gggaacgaga 2460
catgacatat ttgtgggaac aacttcaaac agcgagccaa gacctcaata tgcacatcca 2520
aagccaaaca ttggcaagac gagagacagt cacattgtcg tcgaaagatg gcatcgtacc 2580
caaatcatca gctctcatta tcgcctaaac cacagattgt ttgccgtccc ccaactccaa 2640
aacgttacta caaaagacat gggcgaatgc aaagacctga aagcaaaccc tttttgcgac 2700
tcaattccct cctttgtcct cggaatgatg atccttcacc aagtaaaaga aaaagaagat 2760
tgagataata catgaaaagc acaacggaaa cgaaagaacc aggaaaagaa taaatctatc 2820
acgcaccttg tccccacact aaaagcaaca gggggggtaa aatgaaat 2868
<210> 4
<211> 97
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei
<400> 4
Met Lys Phe Phe Ala Ile Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Gln Pro Leu Glu Asp Arg Ser Asn Gly Asn Gly Asn Val Cys Pro Pro
20 25 30
Gly Leu Phe Ser Asn Pro Gln Cys Cys Ala Thr Gln Val Leu Gly Leu
35 40 45
Ile Gly Leu Asp Cys Lys Val Pro Ser Gln Asn Val Tyr Asp Gly Thr
50 55 60
Asp Phe Arg Asn Val Cys Ala Lys Thr Gly Ala Gln Pro Leu Cys Cys
65 70 75 80
Val Ala Pro Val Ala Gly Gln Ala Leu Leu Cys Gln Thr Ala Val Gly
85 90 95
Ala
<210> 5
<211> 945
<212> DNA
<213> Schizophyllum commune
<400> 5
agtcgaacac cccagttcaa ctaccccagc ccttccttcc ttcgctatcc ttccttacaa 60
cctgctcgcc atgttcgccc gtctccccgt cgtgttcctc tacgccttcg tcgcgttcgg 120
cgccctcgtc gctgccctcc caggtggcca cccgggcacg acgtacgtcg acctctcacc 180
gtcctctaat gtcttgctga tgaagccccg tatagcacgc cgccggttac gacgacggtg 240
acggtgacca cggtgagtag ctttctcgcc gtcgacgact cgaacgcatt ggctaatttt 300
tgctcatagc cgccctcgac gacgaccatc gccgccggtg gcacgtgtac tacggggtcg 360
ctctcttgct gcaaccaggt tcaatcggta cgtacatcaa agcggcacga ccaggcatct 420
cagctgacgg ccacatcgta caggcgagca gcagccctgt taccgccctc ctcggcctgc 480
tcggcattgt cctcagcgac ctcaacgttc tcgttggcat cagctgctct cccctcactg 540
tgagatcttt ttgttcactg tcccaattac tgcgcactga cagactttgc caggtcatcg 600
gtgtcggagg cagcggctgt tcggcgcaga ccgtctgctg cgaaaacacc caattcgtat 660
gtatactttc catgcgtgtc cctttctccg ctaatcatct gtagaacggg ctgatcaaca 720
tcggttgcac ccccatcaac atcctctgag caggtgaacg cgcctgtcgg tgggatattc 780
gggcgacggg agcctcgggc aatctgagcc tcgttactgc ctagcaaatt cggaatccct 840
tcgatgtcat agggtcgcgg acaagtgatc gtcttgctac atactccaag gtgttgactc 900
attccctcag ataatgaaca ttgttgttgt tgttgtttgt tctct 945
<210> 6
<211> 136
<212> PRT
<213> Schizophyllum commune
<400> 6
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1 5 10 15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210> 7
<211> 776
<212> DNA
<213> Neurospora crassa
<400> 7
atcatcagca tcaacatctt cacttcacaa catcttctca accttccaac tcaccttcca 60
aaccaccttc aaaaccaact cccagcttct ttcagcaaac ccccaaccgc caaaatgcag 120
ttcaccagcg tcttcaccat cctcgccatt gccatgaccg ccgctgcggc cccggctgag 180
gttgttcccc gcgccaccac catcggcccc aacacctgct ccatcgacga ctacaagcct 240
tactgctgcc agtctatgtc cggccccgcc ggctcccctg gtctcctcaa cctcatcccc 300
gtcgacctca gcgcctcgct cggctgcgtt gtcggtgtca tcggctccca atgtggtgcc 360
agcgtcaagt gctgcaagga cgatgttacc aacaccggca actccttcct catcatcaac 420
gctgccaact gcgttgccta agtgtttacg cggcaacagc gcaaagtcta ggcaatgcct 480
tgttctcaac gctgctgcca gtccagcacc ccccttctgc agcaaggagc ccccttctgc 540
tggactggca gcacaacgag ctgctactac aacacaagca tcatgcctgg acgcaacaga 600
agccgataat cttggggttt ggttttgggg gatgaaggtg atgagttgat ggattggatc 660
gatatcttac aatgcgtgtc tcttcctgtt aagatctgct ttactatttt cctattttct 720
tttacacata gctatgtatc actaaggcct ggtgattaat acactctctt aaccct 776
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 8
Met Gln Phe Thr Ser Val Phe Thr Ile Leu Ala Ile Ala Met Thr Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro Ala Glu Val Val Pro Arg Ala Thr Thr Ile Gly Pro
20 25 30
Asn Thr Cys Ser Ile Asp Asp Tyr Lys Pro Tyr Cys Cys Gln Ser Met
35 40 45
Ser Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Leu Leu Asn Leu Ile Pro Val Asp
50 55 60
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Cys Val Val Gly Val Ile Gly Ser Gln Cys
65 70 75 80
Gly Ala Ser Val Lys Cys Cys Lys Asp Asp Val Thr Asn Thr Gly Asn
85 90 95
Ser Phe Leu Ile Ile Asn Ala Ala Asn Cys Val Ala
100 105
<210> 9
<211> 453
<212> DNA
<213> Talaromyces thermophilus
<400> 9
atgaagttcg ccggtgtctt gcttgctgtc gccgctgcgg cgactgccct gccaaacgtc 60
ggtcccagtg ggaagacggc tcacaagccg caccaggagc ctttctggcc tgtgcagcag 120
gacgtgaccg tggaacaggc caaggctatc tgtggtgaag gcaaccaggt cgcttgctgc 180
aacgaggtca gctacgcggg cgacaccacc gaaatcgcga ccggccccct ggctggcacc 240
ctcaaggacc tgctcggcgg caagaacggc gccaagggcc tgggtctctt cgacaagtgc 300
tcgcgtctca atgtcgatct cctgcttggc ctgtcgagcc tcatcaacca agaatgcaag 360
cagcacattg cctgctgcca gggcaacgag gccgattcct ccaacgacct catcggtctc 420
aacattcctt gcattgccct tggctcgctg ctg 453
<210> 10
<211> 151
<212> PRT
<213> Talaromyces thermophilus
<400> 10
Met Lys Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Pro Asn Val Gly Pro Ser Gly Lys Thr Ala His Lys Pro His Gln
20 25 30
Glu Pro Phe Trp Pro Val Gln Gln Asp Val Thr Val Glu Gln Ala Lys
35 40 45
Ala Ile Cys Gly Glu Gly Asn Gln Val Ala Cys Cys Asn Glu Val Ser
50 55 60
Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Glu Ile Ala Thr Gly Pro Leu Ala Gly Thr
65 70 75 80
Leu Lys Asp Leu Leu Gly Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Leu Gly Leu
85 90 95
Phe Asp Lys Cys Ser Arg Leu Asn Val Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ser
100 105 110
Ser Leu Ile Asn Gln Glu Cys Lys Gln His Ile Ala Cys Cys Gln Gly
115 120 125
Asn Glu Ala Asp Ser Ser Asn Asp Leu Ile Gly Leu Asn Ile Pro Cys
130 135 140
Ile Ala Leu Gly Ser Leu Leu
145 150
<210> 11
<211> 269
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mature amino acid sequence of Lipex
<400> 11
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly
100 105 110
Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val
115 120 125
Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr
180 185 190
Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro
195 200 205
Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser
210 215 220
Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265
<210> 12
<211> 289
<212> PRT
<213> Streptomyces pristinaespiralis
<400> 12
Met Leu Pro Trp Lys Arg Ala Leu Arg Pro Leu Ser Ala Leu Met Leu
1 5 10 15
Ala Val Ala Val Ala Leu Thr Pro Ala Ala Thr Ala Thr Ala Asp Thr
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gly Trp Asn Asp Tyr Asp Cys Lys Pro
35 40 45
Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val Val Leu Val His Gly Thr Leu Gly
50 55 60
Asn Ser Val Asp Asn Trp Leu Val Leu Ala Pro Tyr Leu Val Lys Arg
65 70 75 80
Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro
85 90 95
Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Val Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp
100 105 110
Ala Tyr Val Asp Lys Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Pro Glu Ala Asp
115 120 125
Ile Val Gly His Ser Gln Gly Gly Met Met Pro Arg Tyr Tyr Leu Lys
130 135 140
Phe Leu Gly Gly Ala Ala Lys Val Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro
145 150 155 160
Ser Asn His Gly Thr Asp Leu Asn Gly Phe Thr Ala Leu Leu Pro Tyr
165 170 175
Phe Pro Gly Ala Ala Asp Leu Leu Gly Arg His Thr Pro Ala Leu Ala
180 185 190
Asp Gln Val Thr Gly Ser Ala Phe Leu Thr Arg Leu Asn Ala Asp Gly
195 200 205
Asp Thr Val Ala Gly Val Arg Tyr Thr Val Ile Ala Thr Arg Tyr Asp
210 215 220
Glu Val Val Thr Pro Trp Arg Ser Gln Tyr Leu Ser Gly Pro Asn Val
225 230 235 240
Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu Cys Pro Leu Asp Leu Ser Glu His
245 250 255
Val Ala Ile Gly Val Phe Asp Leu Ile Ala Tyr His Glu Val Ala Asn
260 265 270
Ala Leu Asp Pro Ala His Ala Thr Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Phe
275 280 285
Gly
<210> 13
<211> 275
<212> PRT
<213> Fusarium heterosporum
<400> 13
Ala Val Gly Val Thr Ser Thr Asp Phe Thr Asn Phe Lys Phe Tyr Ile
1 5 10 15
Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Gly Thr Ala Ala Gly Ala
20 25 30
Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Ile Glu Ser Asn Gly
35 40 45
Val Thr Val Val Ala Ser Phe Thr Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly
50 55 60
Tyr Val Ser Thr Asp Ser Ser Arg Lys Glu Ile Val Val Ala Ile Arg
65 70 75 80
Gly Ser Ser Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Asp Gln
85 90 95
Ser Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln
100 105 110
Asn Ala Trp Ala Glu Ile Ser Ala Gln Ala Ser Ala Ala Val Ala Lys
115 120 125
Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Lys Val Val Ala Thr Gly His Ser
130 135 140
Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Ser Ala Ala Asn Leu Arg Ala Ala
145 150 155 160
Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn
165 170 175
Ala Ala Leu Ser Ala Phe Ile Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Phe Arg
180 185 190
Val Thr His Asp Lys Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe
195 200 205
Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Asp Lys Val Asp Tyr Ala Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala
225 230 235 240
Ala Asn Leu Met Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Asp Ala
245 250 255
His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe
260 265 270
Ser Trp Arg
275
<210> 14
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mature amino acid sequence of Lipase 3
<400> 14
Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asp Ser Asn
20 25 30
Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr
35 40 45
Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile
85 90 95
Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly
100 105 110
Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile
115 120 125
Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg
145 150 155 160
Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile
165 170 175
Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala
180 185 190
Asn Phe Arg Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro
195 200 205
Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser
210 215 220
Gly Asn Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Val
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu
260 265 270
<210> 15
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mature amino acid sequence of Lipomax
<400> 15
Val Tyr Ile Thr Glu Val Ser Gln Leu Asn Thr Ser Glu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Glu Gln Val Glu Glu Ile Ala Ala Ile Ser Gly Lys
20 25 30
Gly Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser His Gly Gly Pro Thr Val Arg
35 40 45
Tyr Val Ala Ala Val Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Val
50 55 60
Gly Ala Pro His Lys Gly Ser Asp Thr Ala Asp Phe Ile Arg Gln Ile
65 70 75 80
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Glu Ala Ile Val Ala Gly Ile Val Asn Gly
85 90 95
Leu Gly Ala Leu Ile Asn Phe Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ser Pro
100 105 110
Gln Asn Ala Leu Gly Ala Leu Glu Ser Leu Asn Ser Glu Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Phe Asn Ala Lys Tyr Pro Gln Gly Ile Pro Thr Ser Ala Cys Gly
130 135 140
Glu Gly Ala Tyr Lys Val Asn Gly Val Ser Tyr Tyr Ser Trp Ser Gly
145 150 155 160
Thr Ser Pro Leu Thr Asn Val Leu Asp Val Ser Asp Leu Leu Leu Gly
165 170 175
Ala Ser Ser Leu Thr Phe Asp Glu Pro Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg
180 185 190
Cys Ser Ser His Leu Gly Lys Val Ile Arg Asp Asp Tyr Arg Met Asn
195 200 205
His Leu Asp Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu Thr Ser Leu Phe Glu
210 215 220
Thr Asp Pro Val Thr Val Tyr Arg Gln Gln Ala Asn Arg Leu Lys Leu
225 230 235 240
Ala Gly Leu
<210> 16
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mature amino acid sequence of TfuLip2
<400> 16
Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Pro Thr Asp Ala Leu Leu Glu
1 5 10 15
Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser Arg Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro Arg Glu Asn
35 40 45
Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Glu
50 55 60
Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ile Ala Ser His Gly Phe Val
65 70 75 80
Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser Arg
85 90 95
Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn His Met Ile Asn Arg Ala Ser
100 105 110
Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly
115 120 125
His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro
130 135 140
Asp Leu Lys Ala Ala Ile Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn
145 150 155 160
Trp Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp
165 170 175
Thr Ile Ala Pro Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu
180 185 190
Pro Ser Ser Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His
195 200 205
Phe Ala Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala
210 215 220
Trp Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu
225 230 235 240
Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr Arg
245 250 255
Ser Thr Cys Pro Phe
260
<210> 17
<211> 259
<212> PRT
<213> Streptomyces pristinaespiralis
<400> 17
Asp Thr Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gly Trp Asn Asp Tyr Asp Cys
1 5 10 15
Lys Pro Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val Val Leu Val His Gly Thr
20 25 30
Leu Gly Asn Ser Val Asp Asn Trp Leu Val Leu Ala Pro Tyr Leu Val
35 40 45
Lys Arg Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp Tyr Gly Gln Leu Pro Gly
50 55 60
Val Pro Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Val Asp Lys Ser Ala Glu Gln
65 70 75 80
Leu Asp Ala Tyr Val Asp Lys Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Pro Glu
85 90 95
Ala Asp Ile Val Gly His Ser Gln Gly Gly Met Met Pro Arg Tyr Tyr
100 105 110
Leu Lys Phe Leu Gly Gly Ala Ala Lys Val Asn Ala Leu Val Gly Ile
115 120 125
Ala Pro Ser Asn His Gly Thr Asp Leu Asn Gly Phe Thr Ala Leu Leu
130 135 140
Pro Tyr Phe Pro Gly Ala Ala Asp Leu Leu Gly Arg His Thr Pro Ala
145 150 155 160
Leu Ala Asp Gln Val Thr Gly Ser Ala Phe Leu Thr Arg Leu Asn Ala
165 170 175
Asp Gly Asp Thr Val Ala Gly Val Arg Tyr Thr Val Ile Ala Thr Arg
180 185 190
Tyr Asp Glu Val Val Thr Pro Trp Arg Ser Gln Tyr Leu Ser Gly Pro
195 200 205
Asn Val Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu Cys Pro Leu Asp Leu Ser
210 215 220
Glu His Val Ala Ile Gly Val Phe Asp Leu Ile Ala Tyr His Glu Val
225 230 235 240
Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ala His Ala Thr Pro Thr Thr Cys Ala Ser
245 250 255
Val Phe Gly
<210> 18
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full amino acid sequence of Lipex
<400> 18
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
20 25 30
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
35 40 45
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
50 55 60
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
85 90 95
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
100 105 110
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
115 120 125
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
130 135 140
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
145 150 155 160
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
165 170 175
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
180 185 190
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
195 200 205
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
210 215 220
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp
245 250 255
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
260 265 270
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
275 280 285
Thr Cys Leu
290
<210> 19
<211> 313
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full amino acid sequence of Lipomax
<400> 19
Met Asn Asn Lys Lys Thr Leu Leu Ala Leu Cys Ile Gly Ser Ser Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Gly Pro Ala Glu Ala Gly Leu Phe Gly Ser Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Thr His Gly Leu Leu Gly Phe
35 40 45
Asp Ser Ile Leu Gly Val Asp Tyr Trp Tyr Gly Ile Pro Ser Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Asp Gly Ala Ser Val Tyr Ile Thr Glu Val Ser Gln Leu Asn
65 70 75 80
Thr Ser Glu Leu Arg Gly Glu Glu Leu Leu Glu Gln Val Glu Glu Ile
85 90 95
Ala Ala Ile Ser Gly Lys Gly Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser His
100 105 110
Gly Gly Pro Thr Val Arg Tyr Val Ala Ala Val Arg Pro Asp Leu Val
115 120 125
Ala Ser Val Thr Ser Val Gly Ala Pro His Lys Gly Ser Asp Thr Ala
130 135 140
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Pro Pro Gly Ser Ala Gly Glu Ala Ile Val
145 150 155 160
Ala Gly Ile Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu Ile Asn Phe Leu Ser Gly
165 170 175
Ser Ser Ser Thr Ser Pro Gln Asn Ala Leu Gly Ala Leu Glu Ser Leu
180 185 190
Asn Ser Glu Gly Ala Ala Ala Phe Asn Ala Lys Tyr Pro Gln Gly Ile
195 200 205
Pro Thr Ser Ala Cys Gly Glu Gly Ala Tyr Lys Val Asn Gly Val Ser
210 215 220
Tyr Tyr Ser Trp Ser Gly Thr Ser Pro Leu Thr Asn Val Leu Asp Val
225 230 235 240
Ser Asp Leu Leu Leu Gly Ala Ser Ser Leu Thr Phe Asp Glu Pro Asn
245 250 255
Asp Gly Leu Val Gly Arg Cys Ser Ser His Leu Gly Lys Val Ile Arg
260 265 270
Asp Asp Tyr Arg Met Asn His Leu Asp Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly
275 280 285
Leu Thr Ser Leu Phe Glu Thr Asp Pro Val Thr Val Tyr Arg Gln Gln
290 295 300
Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Leu
305 310
<210> 20
<211> 301
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full amino acid sequence of TfuLip2
<400> 20
Met Ala Val Met Thr Pro Arg Arg Glu Arg Ser Ser Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Ala Leu Gln Val Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Val Thr Ala Val
20 25 30
Ser Leu Ala Ala Pro Ala His Ala Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro
35 40 45
Asn Pro Thr Asp Ala Leu Leu Glu Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val
50 55 60
Ser Glu Glu Asn Val Ser Arg Leu Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Tyr Pro Arg Glu Asn Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile
85 90 95
Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Glu Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu
100 105 110
Arg Ile Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr
115 120 125
Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser Arg Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu
130 135 140
Asn His Met Ile Asn Arg Ala Ser Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp
145 150 155 160
Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr
165 170 175
Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro Asp Leu Lys Ala Ala Ile Pro Leu
180 185 190
Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn Trp Ser Ser Val Thr Val Pro Thr
195 200 205
Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp Thr Ile Ala Pro Val Ala Thr His
210 215 220
Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu Pro Ser Ser Ile Ser Lys Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His Phe Ala Pro Asn Ile Pro Asn Lys
245 250 255
Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala Trp Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn
260 265 270
Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu
275 280 285
Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr Arg Ser Thr Cys Pro Phe
290 295 300
<210> 21
<211> 279
<212> PRT
<213> Fusarium heterosporum
<400> 21
Glu Ala Glu Ala Ala Val Gly Val Thr Ser Thr Asp Phe Thr Asn Phe
1 5 10 15
Lys Phe Tyr Ile Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Gly Thr
20 25 30
Ala Ala Gly Ala Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Ile
35 40 45
Glu Ser Asn Gly Val Thr Val Val Ala Ser Phe Thr Gly Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Ile Gly Gly Tyr Val Ser Thr Asp Ser Ser Arg Lys Glu Ile Val
65 70 75 80
Val Ala Ile Arg Gly Ser Ser Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu
85 90 95
Asp Phe Asp Gln Ser Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His
100 105 110
Ser Gly Phe Gln Asn Ala Trp Ala Glu Ile Ser Ala Gln Ala Ser Ala
115 120 125
Ala Val Ala Lys Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Lys Val Val Ala
130 135 140
Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Ser Ala Ala Asn
145 150 155 160
Leu Arg Ala Ala Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ala Pro
165 170 175
Arg Val Gly Asn Ala Ala Leu Ser Ala Phe Ile Ser Asn Gln Ala Gly
180 185 190
Gly Glu Phe Arg Val Thr His Asp Lys Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro
195 200 205
Pro Leu Ile Phe Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Asp Lys Val Asp Tyr Ala Ile Ser Asp Val Lys Val
225 230 235 240
Cys Glu Gly Ala Ala Asn Leu Met Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu
245 250 255
Asp Ile Asp Ala His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn
260 265 270
Ala Gly Gly Phe Ser Trp Arg
275
<210> 22
<211> 777
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic SprLip2 gene
<400> 22
gacaccacga ccgcggcacc ctcctcgggc tggaacgact acgactgcaa gccgtccgcc 60
gcgcaccccc gccccgtggt cctcgtccac ggcacgctcg gcaacagcgt ggacaactgg 120
ctggtcctgg ccccgtacct cgtcaagcgc ggctactgcg tgttctccct ggactacggc 180
cagctgccgg gcgtgccctt cttccacggc ctgggcccgg tggacaagag cgccgagcag 240
ctggacgcct acgtggacaa ggtgctcgcc gccaccggcg ccccggaggc ggacatcgtc 300
gggcactcgc aggggggcat gatgccccgg tactacctga agttcctcgg cggggcggcc 360
aaggtcaacg ccctggtggg catcgccccc tcgaaccacg ggacggacct caacggcttc 420
accgccctcc tgccgtactt cccgggcgcc gccgacctcc tcggccggca caccccggcg 480
ctggccgacc aggtcaccgg gagcgcgttc ctgacccgcc tgaacgcgga cggcgacacg 540
gtcgcggggg tccgctacac cgtcatcgcc acgcgctacg acgaggtcgt caccccctgg 600
cggtcccagt acctgagcgg cccgaacgtc cggaacgtgc tgctccagga cctgtgcccc 660
ctcgacttga gcgaacacgt ggccatcggc gtgttcgacc tcatcgcata ccacgaggtc 720
gccaacgccc tggacccggc gcacgccacc cccacgacct gcgcgtccgt cttcggc 777
<210> 23
<211> 915
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SprLip2 gene from expression plasmid pZQ205
<400> 23
atgggctttg ggagcgctcc catcgcgttg tgtccgcttc gcacgaggag gaacgctttg 60
aaacgccttt tggccctgct cgcgaccggc gtgtcgatcg tcggcctgac tgcgctagcc 120
ggccccccgg cacaggccga caccacgacc gcggcaccct cctcgggctg gaacgactac 180
gactgcaagc cgtccgccgc gcacccccgc cccgtggtcc tcgtccacgg cacgctcggc 240
aacagcgtgg acaactggct ggtcctggcc ccgtacctcg tcaagcgcgg ctactgcgtg 300
ttctccctgg actacggcca gctgccgggc gtgcccttct tccacggcct gggcccggtg 360
gacaagagcg ccgagcagct ggacgcctac gtggacaagg tgctcgccgc caccggcgcc 420
ccggaggcgg acatcgtcgg gcactcgcag gggggcatga tgccccggta ctacctgaag 480
ttcctcggcg gggcggccaa ggtcaacgcc ctggtgggca tcgccccctc gaaccacggg 540
acggacctca acggcttcac cgccctcctg ccgtacttcc cgggcgccgc cgacctcctc 600
ggccggcaca ccccggcgct ggccgaccag gtcaccggga gcgcgttcct gacccgcctg 660
aacgcggacg gcgacacggt cgcgggggtc cgctacaccg tcatcgccac gcgctacgac 720
gaggtcgtca ccccctggcg gtcccagtac ctgagcggcc cgaacgtccg gaacgtgctg 780
ctccaggacc tgtgccccct cgacttgagc gaacacgtgg ccatcggcgt gttcgacctc 840
atcgcatacc acgaggtcgc caacgccctg gacccggcgc acgccacccc cacgacctgc 900
gcgtccgtct tcggc 915
<210> 24
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SprLip2 produced from plasmid pZQ205
<400> 24
Met Gly Phe Gly Ser Ala Pro Ile Ala Leu Cys Pro Leu Arg Thr Arg
1 5 10 15
Arg Asn Ala Leu Lys Arg Leu Leu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Val Ser
20 25 30
Ile Val Gly Leu Thr Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala Gln Ala Asp Thr
35 40 45
Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gly Trp Asn Asp Tyr Asp Cys Lys Pro
50 55 60
Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val Val Leu Val His Gly Thr Leu Gly
65 70 75 80
Asn Ser Val Asp Asn Trp Leu Val Leu Ala Pro Tyr Leu Val Lys Arg
85 90 95
Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro
100 105 110
Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Val Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp
115 120 125
Ala Tyr Val Asp Lys Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Pro Glu Ala Asp
130 135 140
Ile Val Gly His Ser Gln Gly Gly Met Met Pro Arg Tyr Tyr Leu Lys
145 150 155 160
Phe Leu Gly Gly Ala Ala Lys Val Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro
165 170 175
Ser Asn His Gly Thr Asp Leu Asn Gly Phe Thr Ala Leu Leu Pro Tyr
180 185 190
Phe Pro Gly Ala Ala Asp Leu Leu Gly Arg His Thr Pro Ala Leu Ala
195 200 205
Asp Gln Val Thr Gly Ser Ala Phe Leu Thr Arg Leu Asn Ala Asp Gly
210 215 220
Asp Thr Val Ala Gly Val Arg Tyr Thr Val Ile Ala Thr Arg Tyr Asp
225 230 235 240
Glu Val Val Thr Pro Trp Arg Ser Gln Tyr Leu Ser Gly Pro Asn Val
245 250 255
Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu Cys Pro Leu Asp Leu Ser Glu His
260 265 270
Val Ala Ile Gly Val Phe Asp Leu Ile Ala Tyr His Glu Val Ala Asn
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Ala His Ala Thr Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Phe
290 295 300
Gly
305
<210> 25
<211> 416
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 25
Met Lys Cys Cys Arg Ile Met Phe Val Leu Leu Gly Leu Trp Phe Val
1 5 10 15
Phe Gly Leu Ser Val Pro Gly Gly Arg Thr Glu Ala Ala Ser Leu Arg
20 25 30
Ala Asn Asp Ala Pro Ile Val Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Trp Gly
35 40 45
Arg Glu Glu Met Phe Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gly Val Arg Gly Asp
50 55 60
Ile Glu Gln Trp Leu Asn Asp Asn Gly Tyr Arg Thr Phe Thr Leu Ala
65 70 75 80
Val Gly Pro Leu Ser Ser Asn Trp Asp Arg Ala Cys Glu Ala Tyr Ala
85 90 95
Gln Leu Val Gly Gly Thr Val Asp Tyr Gly Ala Ala His Ala Ala Lys
100 105 110
His Gly His Ala Arg Phe Gly Arg Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Pro Glu
115 120 125
Leu Lys Arg Gly Gly Arg Ile His Ile Ile Ala His Ser Gln Gly Gly
130 135 140
Gln Thr Ala Arg Met Leu Val Ser Leu Leu Glu Asn Gly Ser Gln Glu
145 150 155 160
Glu Arg Glu Tyr Ala Lys Ala His Asn Val Ser Leu Ser Pro Leu Phe
165 170 175
Glu Gly Gly His His Phe Val Leu Ser Val Thr Thr Ile Ala Thr Pro
180 185 190
His Asp Gly Thr Thr Leu Val Asn Met Val Asp Phe Thr Asp Arg Phe
195 200 205
Phe Asp Leu Gln Lys Ala Val Leu Glu Ala Ala Ala Val Ala Ser Asn
210 215 220
Val Pro Tyr Thr Ser Gln Val Tyr Asp Phe Lys Leu Asp Gln Trp Gly
225 230 235 240
Leu Arg Arg Gln Pro Gly Glu Ser Phe Asp His Tyr Phe Glu Arg Leu
245 250 255
Lys Arg Ser Pro Val Trp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Arg Tyr Asp Leu
260 265 270
Ser Val Ser Gly Ala Glu Lys Leu Asn Gln Trp Val Gln Ala Ser Pro
275 280 285
Asn Thr Tyr Tyr Leu Ser Phe Ser Thr Glu Arg Thr Tyr Arg Gly Ala
290 295 300
Leu Thr Gly Asn His Tyr Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Phe Ser Ala
305 310 315 320
Val Val Cys Ala Pro Phe Leu Gly Ser Tyr Arg Asn Pro Thr Leu Gly
325 330 335
Ile Asp Asp Arg Trp Leu Glu Asn Asp Gly Ile Val Asn Thr Val Ser
340 345 350
Met Asn Gly Pro Lys Arg Gly Ser Ser Asp Arg Ile Val Pro Tyr Asp
355 360 365
Gly Thr Leu Lys Lys Gly Val Trp Asn Asp Met Gly Thr Tyr Asn Val
370 375 380
Asp His Leu Glu Ile Ile Gly Val Asp Pro Asn Pro Ser Phe Asp Ile
385 390 395 400
Arg Ala Phe Tyr Leu Arg Leu Ala Glu Gln Leu Ala Ser Leu Gln Pro
405 410 415
<210> 26
<211> 705
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCE-GeoT1 fusion protein
<400> 26
Asp Asp Tyr Ser Val Val Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn
1 5 10 15
Gly Glu Leu Val Asn Glu Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met
20 25 30
Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser
35 40 45
Met Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala
50 55 60
Met Tyr Thr Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu
65 70 75 80
Lys Val Lys Glu Thr Val Glu Ala Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val
85 90 95
Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys
100 105 110
Glu Glu Ala Lys Asp Phe Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp
115 120 125
Tyr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp
130 135 140
Val Thr Trp Asp Asn Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro
145 150 155 160
Val Ile Arg Asp Asn Asp Pro Asn Asn Ile Val Ile Val Gly Thr Gly
165 170 175
Thr Trp Ser Gln Asp Val His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp
180 185 190
Pro Asn Val Met Tyr Ala Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln
195 200 205
Asn Leu Arg Asp Gln Val Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile
210 215 220
Phe Val Ser Glu Trp Gly Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val
225 230 235 240
Phe Leu Asp Glu Ala Gln Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn
245 250 255
Leu Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Leu Met Pro Gly Ala Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu
275 280 285
Leu Ser Pro Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala
290 295 300
Ser Asp Asn Asn Asp Pro Ile Pro Asp Pro Asp Asp Glu Ala Ser Leu
305 310 315 320
Arg Ala Asn Asp Ala Pro Ile Val Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Trp
325 330 335
Gly Arg Glu Glu Met Phe Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gly Val Arg Gly
340 345 350
Asp Ile Glu Gln Trp Leu Asn Asp Asn Gly Tyr Arg Thr Phe Thr Leu
355 360 365
Ala Val Gly Pro Leu Ser Ser Asn Trp Asp Arg Ala Cys Glu Ala Tyr
370 375 380
Ala Gln Leu Val Gly Gly Thr Val Asp Tyr Gly Ala Ala His Ala Ala
385 390 395 400
Lys His Gly His Ala Arg Phe Gly Arg Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Pro
405 410 415
Glu Leu Lys Arg Gly Gly Arg Ile His Ile Ile Ala His Ser Gln Gly
420 425 430
Gly Gln Thr Ala Arg Met Leu Val Ser Leu Leu Glu Asn Gly Ser Gln
435 440 445
Glu Glu Arg Glu Tyr Ala Lys Ala His Asn Val Ser Leu Ser Pro Leu
450 455 460
Phe Glu Gly Gly His His Phe Val Leu Ser Val Thr Thr Ile Ala Thr
465 470 475 480
Pro His Asp Gly Thr Thr Leu Val Asn Met Val Asp Phe Thr Asp Arg
485 490 495
Phe Phe Asp Leu Gln Lys Ala Val Leu Glu Ala Ala Ala Val Ala Ser
500 505 510
Asn Val Pro Tyr Thr Ser Gln Val Tyr Asp Phe Lys Leu Asp Gln Trp
515 520 525
Gly Leu Arg Arg Gln Pro Gly Glu Ser Phe Asp His Tyr Phe Glu Arg
530 535 540
Leu Lys Arg Ser Pro Val Trp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Arg Tyr Asp
545 550 555 560
Leu Ser Val Ser Gly Ala Glu Lys Leu Asn Gln Trp Val Gln Ala Ser
565 570 575
Pro Asn Thr Tyr Tyr Leu Ser Phe Ser Thr Glu Arg Thr Tyr Arg Gly
580 585 590
Ala Leu Thr Gly Asn His Tyr Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Phe Ser
595 600 605
Ala Val Val Cys Ala Pro Phe Leu Gly Ser Tyr Arg Asn Pro Thr Leu
610 615 620
Gly Ile Asp Asp Arg Trp Leu Glu Asn Asp Gly Ile Val Asn Thr Val
625 630 635 640
Ser Met Asn Gly Pro Lys Arg Gly Ser Ser Asp Arg Ile Val Pro Tyr
645 650 655
Asp Gly Thr Leu Lys Lys Gly Val Trp Asn Asp Met Gly Thr Tyr Asn
660 665 670
Val Asp His Leu Glu Ile Ile Gly Val Asp Pro Asn Pro Ser Phe Asp
675 680 685
Ile Arg Ala Phe Tyr Leu Arg Leu Ala Glu Gln Leu Ala Ser Leu Gln
690 695 700
Pro
705
<210> 27
<211> 212
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 27
Met Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Ile Ala Leu Val Thr Ile Leu Met
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys Ala Ala
20 25 30
Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Ser Phe
35 40 45
Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser Arg
50 55 60
Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp Glu
85 90 95
Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly Ala
100 105 110
Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val Ala
115 120 125
Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Ala
130 135 140
Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp Gly
165 170 175
Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu Tyr
180 185 190
Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly Gly
195 200 205
Gln Asn Thr Asn
210
<210> 28
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCE-LipA fusion protein
<400> 28
Asp Asp Tyr Ser Val Val Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn
1 5 10 15
Gly Glu Leu Val Asn Glu Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met
20 25 30
Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser
35 40 45
Met Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala
50 55 60
Met Tyr Thr Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu
65 70 75 80
Lys Val Lys Glu Thr Val Glu Ala Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val
85 90 95
Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys
100 105 110
Glu Glu Ala Lys Asp Phe Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp
115 120 125
Tyr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp
130 135 140
Val Thr Trp Asp Asn Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro
145 150 155 160
Val Ile Arg Asp Asn Asp Pro Asn Asn Ile Val Ile Val Gly Thr Gly
165 170 175
Thr Trp Ser Gln Asp Val His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp
180 185 190
Pro Asn Val Met Tyr Ala Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln
195 200 205
Asn Leu Arg Asp Gln Val Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile
210 215 220
Phe Val Ser Glu Trp Gly Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val
225 230 235 240
Phe Leu Asp Glu Ala Gln Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn
245 250 255
Leu Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Leu Met Pro Gly Ala Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu
275 280 285
Leu Ser Pro Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala
290 295 300
Ser Asp Asn Asn Asp Pro Ile Pro Asp Pro Asp Asp Glu Ala Glu His
305 310 315 320
Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Ser Phe Asn Phe
325 330 335
Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser Arg Asp Lys
340 345 350
Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn Tyr Asn Asn
355 360 365
Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp Glu Thr Gly
370 375 380
Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly Ala Asn Thr
385 390 395 400
Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val Ala Asn Val
405 410 415
Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Ala Leu Pro
420 425 430
Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile Tyr Ser Ser
435 440 445
Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp Gly Ala Arg
450 455 460
Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu Tyr Ser Ser
465 470 475 480
Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly Gly Gln Asn
485 490 495
Thr Asn
<210> 29
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full amino acid sequence of Lipase 3
<400> 29
Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Leu Ala Val Arg Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp Ser Ala Ala Ala Tyr
35 40 45
Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asp Ser Asn Leu Thr Cys Thr Ala
50 55 60
Asn Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Thr Met Leu Leu Glu
65 70 75 80
Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala
85 90 95
Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile Leu Glu Asp Asn Asp
115 120 125
Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp
130 135 140
Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala Met Ser
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
165 170 175
Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser
180 185 190
Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile Gly Asn Tyr Ala Leu
195 200 205
Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala Asn Phe Arg Val Thr
210 215 220
His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe
225 230 235 240
Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Gly Ala Ser
245 250 255
Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala
260 265 270
Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Val Ala His Leu Trp Tyr
275 280 285
Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu
290 295
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NsiI-MluI-HpaI enzyme restriction sites
<400> 30
atgcatacgc gtgttaac 18
Claims (45)
- (a) 지방 분해 효소; 및
(b) 하기 화학식 I을 갖는 하이드로포빈을 포함하는 조성물:
[화학식 I]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
(여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 2000이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며;
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Y1 및 Y2는 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고;
a는 1 내지 50이며;
b는 0 내지 5이고;
c는 1 내지 100이며;
d는 1 내지 100이고;
e는 1 내지 50이며;
f는 0 내지 5이고;
g는 1 내지 100임). - 제1항에 있어서, 지방 분해 효소는 트라이아실글리세롤 가수분해 활성 (E.C. 3.1.1.3)을 갖는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 지방 분해 효소는 G가 글라이신이고 X가 옥시음이온 구멍(oxyanion hole)-형성 아미노산 잔기인 GX 지방 분해 효소이며, GX 지방 분해 효소는 abH23, abH25 및 abH15로 이루어진 군으로부터 선택되는 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 세제를 추가로 포함하는 조성물.
- (a) G가 글라이신이고 X가 옥시음이온 구멍-형성 아미노산 잔기인 GX 지방 분해 효소;
(b) 하기 화학식 I을 갖는 하이드로포빈:
[화학식 I]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
(여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 2000이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며;
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Y1 및 Y2는 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고;
a는 1 내지 50이며;
b는 0 내지 5이고;
c는 1 내지 100이며;
d는 1 내지 100이고;
e는 1 내지 50이며;
f는 0 내지 5이고;
g는 1 내지 100임); 및
(c) 세제를 포함하는 조성물. - 제5항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 abH23, abH25, abH16 및 abH15로 이루어진 군으로부터 선택되는 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리에 속하는 조성물.
- 제6항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 abH23.01, abH 25.01, abH16.01 및 abH15.02로 이루어진 군으로부터 선택되는 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리에 속하는 조성물.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 옥시음이온 구멍 형성 잔기 X는 M, Q, F, S, T, A, L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 abH23.01, abH 25.01 및 abH15.02로 이루어진 군으로부터 선택되는 알파/베타 하이드롤라아제 수퍼패밀리에 속하는 조성물.
- 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 사상균(filamentous fungus)으로부터 수득되거나 또는 수득가능한 조성물.
- 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 리조푸스 메이헤이(Rhizopus meihei) 유사 상동 패밀리 abH23.01에 속하는 조성물.
- 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 상동 패밀리 abH23.01로 분류되며, 써모마이세스(Thermomyces), 푸사륨(Fusarium), 아스페르길루스(Aspergillus) 및 리조푸스(Rhizopus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능한 조성물.
- 제12항에 있어서, GX 지방 분해 효소는 상동 패밀리 abH23.01로 분류되며, 써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus), 푸사륨 헤테레오스포룸(Fusarium hetereosporum), 아스페르길루스 투비엔기시스(Aspergillus tubiengisis), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 및 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrihzus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 진균류 종으로부터 수득되거나 또는 수득가능한 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 분해 효소는 조성물의 총 중량의 0.001 내지 20 중량ppm의 농도로 존재하는 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 분해 효소는 조성물의 총 중량의 0.01 내지 2 중량ppm의 농도로 존재하는 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 40 내지 120개 아미노산의 서열을 갖는 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 하기 화학식 II를 갖는 조성물:
[화학식 II]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
(여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 20이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며;
a는 3 내지 25이고;
b는 0 내지 2이며;
c는 5 내지 50이고;
d는 2 내지 35이며;
e는 2 내지 15이고;
f는 0 내지 2이며;
g는 3 내지 35임). - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 하기 화학식 III을 갖는 조성물:
[화학식 III]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
(여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 20이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며;
a는 5 내지 15이고;
c는 5 내지 40이며;
d는 4 내지 23이고;
e는 5 내지 12이며;
g는 6 내지 21임). - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부는 Cys인 조성물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 융합 단백질인 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 사상균으로부터 수득되거나 또는 수득가능한 조성물.
- 제21항에 있어서, 하이드로포빈은 클라도스포륨(Cladosporium), 오피스토마(Ophistoma), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 트리코데르마(Trichoderma), 지베렐라(Gibberella), 뉴로스포라(Neurospora), 마가나포르테(Maganaporthe), 하이포크레아(Hypocrea), 잔토리아(Xanthoria), 에메리셀라(Emericella), 아스페르길루스, 파라콕시오이데스(Paracoccioides), 메타리지움(Metarhizium), 플레우로투스(Pleurotus), 코프리누스(Coprinus), 디코타이오네마(Dicotyonema), 플람물리나(Flammulina), 쉬조필룸(Schizophyllum), 아가리쿠스(Agaricus), 피솔리투스(Pisolithus), 트리콜로마(Tricholoma), 폴리오카(Pholioka), 탈라로마이세스(Talaromyces) 및 아그로사이베(Agrocybe)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 진균류로부터 수득되거나 또는 수득가능한 조성물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 조성물 내에서 원위치(in situ)에서 생성되는 조성물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 중, 하이드로포빈은 물/공기 계면에서의 평형 표면 장력이 45 mN/m 미만으로 감소되게 하는 조성물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 중, 하이드로포빈은 물/공기 계면에서의 표면 전단 탄성이 300-700 mN/m로 증가되게 하는 조성물.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 클래스(class) II 하이드로포빈인 조성물.
- 제26항에 있어서, 하이드로포빈은 하기 화학식 IV를 갖는 클래스 II 하이드로포빈인 조성물:
[화학식 IV]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
(여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 200이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며;
a는 6 내지 12이고;
c는 8 내지 16이며;
d는 2 내지 20이고;
e는 4 내지 12이며;
g는 5 내지 15임). - 제26항 또는 제27항에 있어서, 하이드로포빈은 하기 화학식 V를 갖는 클래스 II 하이드로포빈인 조성물:
[화학식 V]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
(여기서,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 10이며;
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu 또는 Ser으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며;
a는 7 내지 11이고;
c는 11이며;
d는 4 내지 18이고;
e는 6 내지 10이며;
g는 7 내지 10임). - 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부는 Cys인 조성물.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 기 (X3)c는 Z가 지방족 아미노산이고; X가 임의의 아미노산인 서열 모티프 ZZXZ를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈은 조성물의 총 중량의 0.001 중량% 내지 5 중량%의 농도로 존재하는 조성물.
- 제31항에 있어서, 하이드로포빈은 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 0.5 중량%의 농도로 존재하는 조성물.
- 제4항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세제는 0.001 내지 5 g/L의 농도로 존재하는 조성물.
- 제33항에 있어서, 세제는 0.01 내지 0.5 g/L의 농도로 존재하는 조성물.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 말토스 생성(maltogenic) 아밀라아제, 말토스 비생성(non-maltogenic) 아밀라아제, 리파아제, 큐티나아제, 카보하이드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난아제, 아라비나아제, 갈락타나아제, 자일라나아제, 옥시다아제, 락카아제 및 퍼옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 함유하는 조성물.
- 제4항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세제는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 조성물.
- 제36항에 있어서, 계면활성제는 비이온성 (반극성을 포함함), 음이온성, 양이온성 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 분말 형태의 조성물.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 형태의 조성물.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 표면을 접촉시키는 단계에 의해 지질-기재 얼룩(stain)을 표면으로부터 제거하는 방법.
- 지질 얼룩을 표면으로부터 감소시키거나 또는 제거하기 위한 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 표면을 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면을 세정하는 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 물품을 접촉시키는 단계를 포함하는, 물품을 세정하는 방법.
- 제43항에 있어서, 물품은 의류 물품인 방법.
- 제43항에 있어서, 물품은 식탁용 식기류 물품인 방법.
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