MX2007012021A - El uso de polipeptidos como promotores de adhesion. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un compuesto multiestratificado o un sustrato recubierto que contiene los compuestos consistentes en por lo menos 40% en peso de alfa aminoacidos unidos por formaciones peptidicas (en adelante polipeptidos) y utilizada en forma de agentes adhesivos entre por lo menos dos capas adyacentes del compuesto o entre un recubrimiento y un sustrato.

Description

EL USO DE POLIPEPTIDOS COMO PROMOTORES DE ADHESIÓN La invención se refiere a un compuesto multiestratificado o un sustrato recubierto, que comprende los compuestos de los cuales por lo menos 40% en peso están compuestos de alfa aminoácidos ligados por enlaces peptídicos (conocidos como polipéptido por brevedad en adelante) como promotores de adhesión entre por lo menos dos capas adyacentes del compuesto o entre el recubrimiento y el sustrato. Más específicamente, la invención se refiere al uso de hidrofobinas como promotores de la adhesión.

Las hidrofobinas son proteínas pequeñas que tienen desde cerca de 100 a 150 aminoácidos, las cuales son características de hongos filamentosos, por ejemplo Schizophyllum commune . Estas normalmente tienen 8 unidades de cisteína.

Las hidrofobinas tienen notable afinidad por las interfaces y por tanto son apropiadas para recubrir superficies. Así pues, es posible recubrir, por ejemplo, teflón por medio de hidrofobinas para obtener una superficie hidrófila.

Las hidrofobinas pueden ser separadas de sustancias naturales. Nuestra solicitud anterior, DE-10 2005 007 480.4 describe un proceso para preparar hidrofobinas.

El uso de hidrofobinas para diversas aplicaciones ha sido propuesto en la técnica anterior.

WO 96/41882 propone el uso de hidrofobinas como emulsificadores, espesantes, agentes tensoactivos, para hidrofilizar superficies hidrofóbicas, para mejorar la resistencia al agua de los sustratos hidrofílicos, para preparar emulsiones aceite en agua o emulsiones agua en aceite. También se proponen aplicaciones farmacéuticas como la preparación de ungüentos o cremas y también aplicaciones cosméticas como protección para la piel o la preparación de champús para el cabello o enjuague para el cabello.

EP 1 252 516 describe el recubrimiento de ventanas, lentes de contacto, vidrio censores, aparatos médicos, envases para llevar a cabo experimentos o para almacenamiento, cascos de buques, partículas sólidas o el chasis o carrocería de vehículos de pasajeros con una solución que contenga hidrofobina a una temperatura desde 30 hasta 80°C.

WO 03/53383 describe el uso de hidrofobina para tratar materiales de queratina en aplicaciones cosméticas .

WO 03/10331 describe un censor recubierto con hidrofobina, por ejemplo, un electrodo de medición, al cual se han unido otras sustancias no covalentes, por ejemplo, sustancias electroactivas, anticuerpos o enzimas.

Anteriormente, promotores de adhesión muy diferentes han sido utilizados para mejorar la adhesión de, por ejemplo, recubrimientos para una gran variedad de sustratos. Los apropiados son, de acuerdo con Rómpp Chemie Lexikon (edición 1990), por ejemplo, titanatos, silanos, complejos de cromo de ácidos carboxílicos insaturados. Los promotores de adhesión especialmente mencionados para adhesivos son copolímeros de etileno/acrilamida, isocianatos poliméricos o compuestos de organosilicios reactivos.

Los poliuretanos y polietilen iminas también son promotores de adhesión conocidos.

El objetivo de la presente invención fue proporcionar promotores de adhesión alternativos que tengan muy buenas propiedades de aplicación y que efectúen, en particular, buena adhesión de las capas individuales de un compuesto multiestratificado o de un recubrimiento sobre un sustrato.

Por consiguiente, se encontró el compuesto multiestratificado o el sustrato recubierto, como se define al principio.

El promotor de la adhesión El compuesto multiestratificado o el sustrato recubierto consiste en el polipéptido definido al principio como promotor de adhesión.

El polipéptido consiste en por lo menos 40% en peso, preferentemente al menos 70% en peso, con particular preferencia al menos 90% en peso y con muy particular preferencia al menos 95 o 99% en peso de alfa aminoácidos ligados por enlaces peptídicos.

En una modalidad particular, el polipéptido consiste exclusivamente en alfa aminoácidos ligados por enlaces peptídicos .

Los alfa aminoácidos particularmente apropiados son glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cisteína, cistina, metionina, triptofano, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, glicina e histidina .

El polipéptido preferentemente contiene el aminoácido cisteína en una mezcla con otros alfa aminoácidos.

El polipéptido con particular preferencia consiste en por lo menos 0.1% en peso, con particular preferencia el menos 0.5, con muy particular preferencia al menos 1% en peso de cisteína. El contenido de cisteína en el polipéptido generalmente no supera 15% en peso, en particular 10% en peso y con muy particular preferencia no supera 7% en peso.

En una modalidad particular, los polipéptidos son hidrofobinas .

El término "hidrofobinas" de acuerdo con la presente invención significa en adelante proteínas de la fórmula estructural, general (I).

Xn-C -X?-5o~C -Xo-5-C -X?-?oo_C —X?-?oo-C -X?-5o-C -Xo-5_C -X?_5o~C -Xm (I) , donde X puede ser alguno de los 20 aminoácidos que se encuentran en la naturaleza (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, ILe, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) . X puede también en cada caso ser idéntico o diferente. Los índices cerca de X indican en cada caso el número de aminoácidos, C es cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, con por lo menos 4 de los residuos indicados con C siendo cisteína, y los índices n y m son, independientes entre sí, números naturales de 0 y 500, preferentemente desde 15 hasta 300.

Los polipéptidos de conformidad con la fórmula (I) además se caracterizan por la propiedad de su creciente, a temperatura ambiente, después de recubrir una superficie de vidrio, ángulo de contacto de una gota de agua en por lo menos 20°C, preferentemente al menos 25°C y particularmente de preferencia 30°C, en cada caso en comparación con el ángulo de contacto de una gota de agua de tamaño similar con la superficie de vidrio no recubierta.

Los aminoácidos indicados C1 a C8 son preferentemente cisteínas, no obstante, estas también pueden ser sustituidas con otros aminoácidos de dimensiones espaciales semejantes, preferentemente alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, por lo menos 4, preferentemente al menos 5, con particular preferencia al menos 6 y en particular al menos 7 de las posiciones C1 a C8 deben consistir en cisteínas. Las cisteínas pueden estar en un estado reducido o pueden formar puentes disulfuro entre sí. Se da preferencia particular a la formación intramolecular de puentes C-C, en particular, con al menos 1, de preferencia 2, particularmente de preferencia 3 y muy particularmente de preferencia 4 puentes disulfuro intramolecular. La sustitución antes descrita a de las cisteínas por aminoácidos de dimensiones espaciales semejantes incluye ventajosamente sustituir en pares aquellas posiciones C que puedan formar puentes disulfuro intramolecular entre sí.

Si las cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas o treoninas también se utilizan en las posiciones indicadas por X, la numeración de las posiciones C individuales en las fórmulas generales puede cambiar en consecuencia.

Se da preferencia al empleo de hidrofobinas de la fórmula general (II), Xp-C -X3-25_C -X?-2_C -X5-50-C -X2-35-C -X2-1S-C -Xo-2~ ~X3-35~C (II) , para llevar a cabo la presente invención, en donde X, C y los índices cercanos a X y C son como ya se definió, pero los índices n y m son números entre 0 y 300 y las proteínas además se distinguen por el cambio de ángulo de contacto antes mencionado.

Se da preferencia particular al empleo de hidrofobinas de la fórmula (III) Xn-C -X5-9-CJ-C -Xn-39-C ~X2-23~C -X5-9-C -C -X6-18~C -Xm (III) , donde X, C y los índices cercanos a X y C son como ya se definió, los índices n y m son números entre 0 y 200 y las proteínas además se distinguen por el cambio en el ángulo de contacto antes mencionado, y por lo menos 6 de los residuos indicados C son cisteínas. Se da preferencia particular a que todos los residuos C sean cisteínas.

Los residuos Xn y X pueden ser secuencias peptídicas que estén naturalmente ligadas a una hidrofobina. No obstante, cualquier o ambos residuos también pueden ser secuencias peptídicas que no estén ligadas naturalmente a una hidrofobina. También esto incluye aquellos residuos Xn y/o Xm en los que una secuencia peptítidica que se encuentre en la naturaleza en una hidrofobina haya sido extendida por una secuencia peptídica que no se encuentre en forma natural en una hidrofobina.

Si Xn y/o Xm son secuencias peptídicas que no están ligadas naturalmente a las hidrofobinas, tales secuencias son normalmente por lo menos 20, de preferencia al menos 35, con particular preferencia al menos 50 y muy particularmente de preferencia al menos 100 aminoácidos de longitud. Un residuo de esta clase que no esta ligado naturalmente a una hidrofobina también se menciona en adelante como pareja de fusión. Esta está destinada a expresar el hecho de que las proteínas pueden consistir en por lo menos una parte de hidrofobina y una pareja de fusión que en la naturaleza no se encuentra junta en esta forma.

La pareja de fusión puede ser seleccionada de una multiplicidad de proteínas. También es posible que una pluralidad de parejas de fusión estén ligadas a una parte hidrofobina, por ejemplo, al amino terminal (Xn) y al carboxilo terminal (Xm) de la parte hidrofobina. Sin embargo, también es posible ligar, por ejemplo, dos partes parejas de fusión a una posición (xn o xm) de la proteína de la invención.

Las partes pareja de fusión particularmente apropiadas son proteínas que se encuentran en forma natural en microorganismos, en particular en E. coli o bacillus subtilis. Los ejemplos de estas partes parejas de fusión son las secuencias yaad (SEC ID NO: 15 y 16) , yaae (SEC ID NO: 17 y 18) y tioredoxina. Los fragmentos i derivados de tales secuencias, que comprenden solo una parte, preferentemente 60-99%, con particular preferencia 80-98% de las secuencias o en las que los aminoácidos individuales o nucleótidos han sido alterados en comparación con la secuencia mencionada, también son muy adecuados, con los porcentajes dados refiriéndose en cada caso al número de aminoácidos.

Además también es posible que la secuencia polipeptídica de las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención haya sido modificada, por ejemplo por glucosilación, acetilación o incluso por reticulación química, por ejemplo, con glutaraldehído.

Una característica de las proteínas que se utilizan de acuerdo con la invención es el cambio en las propiedades de superficie cuando las superficies se recubren con las proteínas. El cambio en las propiedades de superficie puede determinarse experimentalmente midiendo el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después de recubrir la superficie con la proteína y determinando la diferencia de las dos mediciones.

La medición de los ángulos de contacto es conocida en principio para el trabajador experto. Las mediciones se basan en la temperatura ambiente y gotas de agua de 5 L. Las condiciones experimentales precisas para un método, apropiado por ejemplo, de medición del ángulo de contacto se ilustran en la sección de experimentos. Bajo las condiciones mencionadas ahí, las proteínas que se utilizan de acuerdo con la invención tienen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto en por lo menos 20°C, de preferencia al menos 25°C con particular preferencia al menos 30°C, en cada caso en comparación con el ángulo de contacto de una gota de agua de tamaño similar con la superficie de vidrio no recubierta.

Las posiciones de los aminoácidos polares y no polares en la parte hidrofobina de las hidrofobinas conocidas a la fecha se preservan, dando como resultado una gráfica de hidrofobicidad característica. Las diferencias en las propiedades biofísicas y la hidrofobicidad resulto en la clasificación de las hidrofobinas conocidas a la fecha en dos clases, I y II (Wessels y col., 1994, Ann. Rev. Phytophatol . , 32, 413-437) .

Las membranas ensambladas de las hidrofobinas clase I son en gran medida insolubles (incluso a 1% de dodeciisulfato de sodio (SDS) a una temperatura elevada) y solo pueden ser disociadas de nuevo por medio de ácido trifluoroacético (TFA) concentrado o ácido fórmico. Por el contrario, las formas ensambladas de la hidrofobinas clase II son menos estables. Estas pueden ser sueltas otra vez incluso mediante etanol al 60% de concentración o SDS al 1% (a temperatura ambiente) .

La comparación de las secuencias de aminoácidos revela que la longitud de la región entre la cisteína CJ y C4 es distintamente más corta en las hidrofobinas clase II que en las hidrofobinas clase I. Las hidrofobinas clase II además tienen más aminoácidos con carga que la clase I.

Las hidrofobinas que son particularmente preferidas para llevar a cabo la presente invención son las de los tipos dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, que se caracterizan estructuralmente en la secuencia que se enlista más adelante. Estas también pueden ser solo partes o derivados de estos tipos. También es posible ligar una pluralidad de partes de hidrofobina, preferentemente 2 ó 3, de la misma estructura o una diferente entre sí y a una secuencia polipeptídica apropiada correspondiente que no este conectada naturalmente a una hidrofobina.

Particularmente apropiadas para llevar a cabo la presente invención son además las proteínas de fusión que tienen las secuencias polipeptídicas indicadas en la SEC ID NO: 20, 22, 24 y también las secuencias de ácido nucleico que codifican para estas, en particular la secuencias de acuerdo con SEC ID NO: 19, 21, 23. Las modalidades particularmente preferidas también son proteínas que, comenzando a partir de las secuencias polipeptídicas indicadas en la SEC ID NO: 20, 22 ó 24, resultan de la sustitución, inserción o deleción de por lo menos 1, hasta 10, preferentemente 5, con particular preferencia 5% de todos los aminoácidos y los cuales todavía tienen por lo menos 50% de la propiedad biológica de las proteínas iniciales. La propiedad biológica de las proteínas en este caso significa el aumento antes descrito en el ángulo de contacto por al menos 20°C.

Las proteínas que se utilizan de acuerdo con la invención pueden prepararse químicamente por procesos conocidos de la síntesis de péptidos, por ejemplo por síntesis en fase sólida de acuerdo con Merrifield.

Las hidrofobinas que se encuentran en estado natural pueden ser aisladas de fuentes naturales por medio de métodos apropiados. Como un ejemplo se hace referencia a Wósten y col., Eur. J. Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882.

Las proteínas de fusión pueden prepararse preferentemente por procesos de ingeniería genética en las cuales una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de DNA, que codifica para la pareja de fusión y una codificante para la parte hidrofobina se combinan en tal forma que la proteína deseada se genera por expresión génica de la secuencia de ácido nucleico combinada en un organismo huésped. Un proceso de preparación de esta clase esta descrito en nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4.

Los organismos hospederos (organismos productores) que pueden ser apropiados en este caso para el proceso de preparación mencionado son procariotas (incluidas las Archaea) o eucariotas, particularmente bacterias que incluyen halobacterias y metanococci, hongos, células de insecto, células vegetales y células de mamífero, particularmente de preferencia Esc eria Coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus, nidulans, Arpergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (o células relacionadas) y otras.

La invención además se refiere al uso de constructos de expresión que comprende, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido utilizando de acuerdo con la invención y también a los vectores que contienen por lo menos uno de estos constructos de expresión.

Los constructos utilizados preferentemente contienen un promotor 5' corriente arriba de la secuencia codificadora particular y una secuencia terminadora 3' corriente abajo y, si es apropiado, otros elementos reguladores acostumbrados, en cada caso ligados operativamente a la secuencia codificadora.

Un "enlace operativo" significa el arreglo secuencial del promotor, la secuencia codificadora, el terminador y, si es apropiado, otros elementos reguladores en tal forma que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir su función como sea necesario para expresar la secuencia codificadora.

Los ejemplos de las secuencias que se pueden ligar de manera operativa son secuencias de acceso y también potenciadores, señales de poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Las secuencias reguladoras apropiadas están descritas, por ejemplo, en Goedel, Gene expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego CA (1990) .

Además de estas secuencias reguladoras, la regulación natural de estas secuencias puede todavía estar presente corriente arriba de los genes estructurales reales y, si es apropiado, pueden haber sido alterados genéticamente en tal forma que la regulación natural haya sido desactivada (switched off) y se haya aumentado la expresión de los genes.

Un constructo de ácido nucleico preferido también comprende ventajosamente una o más de las secuencias potenciadoras antes mencionadas que se ligan funcionalmente al promotor y que permiten que la expresión de la secuencia de ácido nucleico sea aumentada. Secuencias ventajosas adicionales como pueden ser otros elementos reguladores o terminadores también pueden ser insertadas en el extremo 3' de las secuencias de DNA.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en el constructo en una o más copias. El constructo también puede comprende marcadores adicionales como resistencias a antibióticos o genes complementadotes de la auxotrofia, si es apropiado para el propósito de seleccionar el constructo .

Las secuencias reguladoras que son ventajosas para el proceso estén presentes, por ejemplo, en los promotores como pueden ser el cos, tac, trp, tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, GAL, trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6m, lambda-PR o en el promotor lambda-P, cuyos promotores se utilizan ventajosamente en bacterias gram negativas. Otras secuencias reguladoras ventajosas están presentes, por ejemplo, en los promotores gram positivos amy y SP02, en los promotores de levadura u hongos ADC1 MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

También es posible utilizar promotores artificiales para la regulación.

Para el propósito de la expresión en un organismo huésped, el constructo de ácido nucleico se inserta ventajosamente en un vector como puede ser un plásmido o un fago, por ejemplo, el cual permite que los genes sean expresados óptimamente en el hospedero. Los vectores significan, además de los plásmidos y fagos, también cualquier otro vector conocido para el trabajador experto, es decir, por ejemplo, virus como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmicos y DNA lineal o circular y también el sistema agrobacterium.

Estos vectores pueden ser replicados en forma autónoma en el organismo huésped o replicados en forma cromosómica. Estos vectores constituyen otra modalidad de la invención. Los ejemplos de los plásmidos convenientes son, en E. coli, plG338, pACYC184, pBR322, pUCld, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-Bl, tgt11, ó pBdCl, estreptomices, , pIJIOl, pIJ364, pIJ702, ó pIJ361, en bacillus, pUBUO, pC194, ó pBD214, en corinebacterium pSA77 ó pAJ667, en hongo, pALSl, pIL2 ó pBB116, en levaduras, 2alfa, pAG-1, YEp6, YEpl3, ó pEMBYe23, o en plantas, pLGV23, pGHlacJ pBIN19, pAK2004, o pDH51. Estos plásmidos son una selección pequeña de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son bien conocidos para los trabajadores expertos y pueden encontrarse, por ejemplo, en el libro Clining Vectors (Eds. Pouwels P. H. y col., Elsevier, Amsterdarm-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) .

Para el propósito de expresar los demás genes que están presentes, el constructo de ácido nucleico también ventajosamente comprende secuencias reguladoras 3' terminales y/o 5' terminales para aumentar la expresión, lo cual se selecciona para expresión óptima dependiendo del organismo hospedero y el gen o genes seleccionados.

Estas secuencias reguladoras están propuestas para permitir a los genes y la expresión de proteínas expresarse específicamente. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gen se exprese o sobre exprese solo después de la inducción o que se exprese y/o sobre exprese inmediatamente.

En este sentido, las secuencias reguladoras o factores pueden preferentemente influir positivamente y con ello aumentar la expresión de los genes que han sido introducidos. Así pues, los elementos reguladores pueden ser mejorados ventajosamente al nivel de la transcripción utilizando señales de transcripción fuertes como pueden ser los promotores y/o potenciadotes . Sin embargo, además de esto, también es posible potenciar la traducción mejorando la estabilidad del mRNA, por ejemplo.

En otra modalidad del vector, el vector el cual comprende el constructo de ácido nucleico de la invención o el ácido nucleico de la invención puede ventajosamente ser introducido en los microorganismos en la forma de un DNA lineal y ser integrado en el genoma del organismo hospedero por medio de recombinación heteróloga u homologa. Este DNA lineal puede consistir en un vector linealizado como puede ser un plásmido o solamente el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico.

Para expresar genes heterólogos de manera óptima en organismos, es ventajoso alterar las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con el uso de codones específico empleado en el organismo. El uso de codones puede fácilmente determinarse con la ayuda de análisis de computadora u otros genes conocidos del organismo en cuestión.

Se prepara un cásete de expresión fundiendo un promotor apropiado a una secuencia nucleotídica codificadora apropiada y a una señal terminadora o señal de poli adenilación. Las técnicas comunes de recombinación y clonación, como están descritas, por ejemplo, en Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en T.J. Shillhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. Y Wiley interscience (1987, se utilizan para este propósito.

Para lograr la expresión en un organismo hospedero apropiado, el constructo de ácido nucleico recombinante o constructo génico se inserta ventajosamente en un vector específico del huésped que permite que los genes sean expresados óptimamente en el hospedero. Los vectores son bien conocidos para el trabajador experto y pueden encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels, P. H. y col., Eds., Elsevier, Ámsterdam-New York-Oxford, 1985) .

Es posible preparar, con la ayuda de los vectores, microorganismo recombinantes los cuales, por ejemplo, se transformen con por lo menos un vector y los cuales puedan ser utilizados para producir las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención. Ventajosamente, los constructos recombinantes antes descritos de la invención se introducen en un sistema hospedero apropiado y se expresan. En este sentido, los métodos comunes de clonación y transfección conocidos para el trabajador experto, como puede ser, por ejemplo, coprecipitación, fusión de protoplastos, electroporación, transfección retroviral y similares, preferentemente se utilizan para hacer que los ácidos nucleicos se expresen en el sistema de expresión específico. Los sistemas apropiados están descritos, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel y col., Wiley interscience, New York 1997, o Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

También es posible preparar microorganismos homólogamente recombmados . Para este propósito se prepara un vector que contenga por lo menos una sección de un gen para ser utilizado de acuerdo con la invención o de una secuencia codificadora en la cual, si es apropiado, por lo menos una deleción de aminoácido, una adición de aminoácido o sustitución de aminoácido haya sido introducida para modificar, por ejemplo, romper funcionalmente, la secuencia (vector knockout) . La secuencia introducida puede, por ejemplo, también ser un homólogo de un microorganismo relacionado o ser derivado de una fuente de mamífero, levadura o insecto. De otro modo, el vector utilizado para recombinación homologa puede ser designado en tal forma que el gen endógeno sea, en el caso de recombinación homologa, mutado o de otro modo alterado pero todavía codifique la proteína funcional (por ejemplo, la región reguladora corriente arriba puede haber sido alterada en tal forma que la expresión de la proteína endógena se altere por este medio) . La sección alterada del gen utilizado de acuerdo con la invención esta en el vector de recombinación homólogo. La construcción de vectores que son apropiados para recombinación homologa esta descrita, por ejemplo, en Thomas, K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Los organismo huéspedes recombinates apropiados para el ácido nucleico utilizado de acuerdo con la invención o el constructo de ácido nucleico son, en principio, cualquier organismo procariótico o eucariótico. Ventajosamente, microorganismos como bacterias, hongos o levaduras se utilizan como organismos hospederos. Las bacterias Gram positivas o Gram negativas, preferentemente bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetacease o Nocardiaceae, particularmente de preferencia la bacteria genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus, se utilizan ventajosamente.

Los organismos que se utilizan en el proceso de preparación de las proteínas de fusión son, dependiendo del organismo huésped, crecidas o cultivadas en una forma conocida para el trabajador experto. Los microorganismos normalmente se crecen en un medio líquido que contiene una fuente de carbono, normalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, normalmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánico como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, sales de manganeso y sales de magnesio y, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas entre 0°C y 100°C, preferentemente entre 10°C y 60°C, suministrando al mismo tiempo oxígeno. En este sentido, el pH del líquido nutriente puede o no mantenerse en un valor fijo, es decir, puede o no ser regulado durante el cultivo. El cultivo puede llevarse a cabo en lotes, semilotes o en forma continua. Los nutrientes pueden ser inicialmente introducidos al principio de la fermentación o ser alimentados subsecuentemente en una forma semicontinua o continua. Las enzimas pueden ser aisladas de los organismos por el proceso descrito en los ejemplos o utilizarse para la reacción como un extracto crudo.

Las proteínas que se utilizan de acuerdo con la invención o los fragmentos funcionales, biológicamente activos de estas pueden ser preparados por medio de un proceso de recombinante, con un microorganismo productor de proteína siendo cultivado, la expresión de las proteínas se introducen si es apropiado y las proteínas se aislan del cultivo. Las proteínas también pueden ser producidas en esta forma a escala industrial si se desea. El microorganismo recombinante puede ser cultivado y fermentado por los métodos conocidos. Por ejemplo, las bacterias pueden ser propagadas en medio TV o medio LD y a una temperatura desde 20 hasta 40°C y un pH desde 6 hasta 9. Las condiciones de cultivo apropiadas están descritas con detalle, por ejemplo, en T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) .

Si las proteínas que se utilizan de acuerdo con la invención no se secretan hacia el medio de cultivo, las células entonces se rompen y el producto se obtiene del lisado por los procesos de aislamiento de proteínas conocidos. Las células pueden romperse, según se desee, por medio de ultrasonido de alta frecuencia, por medio de alta presión, como puede ser por ejemplo en una celda de presión french, por medio de osmólisis, por la acción de detergentes, enzimas lípicas o disolventes orgánicos, por medio de homogeneizadores o por una combinación de dos o más de los procesos enlistados.

Las proteínas que se utilizan de acuerdo con la invención pueden ser purificadas utilizando métodos cromatográficos conocidos como puede ser la cromatografía de tamices moleculares (filtración en gel), por ejemplo cromatografía de Q Sepharose, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, y también utilizando otros métodos acostumbrados como la ultrafíltración, cristalización, salado, diálisis y electroforesis en gel. Los procesos apropiados están descritos, por ejemplo, en Cooper, F. G. Biochemiche Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlín, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.

Puede ser ventajoso aislar la proteína recombinante utilizando sistemas vectores u oligonucleótidos que extiendan el cDNA por secuencias nucleotídicas particulares y con ello codifiquen para proteínas alteradas o proteínas de fusión las cuales se utilizan, por ejemplo, para simplificar la purificación. Los ejemplos de las modificaciones apropiadas de esta clase son "etiquetas" que actúan como anclas, como puede ser la modificación conocida como el ancla hexa-histidina, o epítopes que pueden ser reconocidos como antígenos por los anticuerpos (descrito, por ejemplo, en Harlow, E. and Lañe, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y J Press). Otras etiquetas apropiadas son, por ejemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, estreptavidina-BD-avi-tag, Flag-tag, T7, etcétera. Estas anclas pueden utilizarse para unir las proteínas a un soporte sólido como puede ser una matriz polimérica, por ejemplo la cual puede, por ejemplo, ser empacada en una columna cromatográfica, o puede ser utilizada en una placa de microtitulación o sobre otro soporte. Los protocolos de purificación correspondientes pueden obtenerse de los proveedores de etiquetas de afinidad comerciales .

Las proteínas preparadas como esta descrito pueden utilizarse directamente como proteínas de fusión o, después de cortar y remover la pareja de fusión, como hidrofobinas "puras".

Si la pareja de fusión esta destinada a ser removida, se recomienda incorporar un sitio de corte potencial (sitio de reconocimiento específico para proteasas) en la proteína de fusión entre la parte hidrofobina y la parte pareja de fusión. Los sitios de corte apropiados son en particular aquellas secuencias peptídicas que de otro modo no se encontrarían en la parte hidrofobina ni en la parte pareja de fusión, la cual puede ser fácilmente determinada por medio de herramientas bioinformáticas . Particularmente apropiadas son, por ejemplo, el clivaje BrCN sobre metionina o clivaje mediado por proteasa con factor Xa, clivage de enterocinasa, trombina, clivaje TEV (proteasa del virus tobáceo etch) .

Asignación de los nombres de secuencias para el DNA y secuencias polipeptídicas en el listado de secuencias Compuesto multiestratificado Los compuestos multiestratificados se emplean para propósitos muy diferentes, por ejemplo como medio de empaque (en particular películas compuestas) o artículo autoadhesivos (compuesto multiestratificado de por lo menos soporte y una capa adhesiva) .

Los compuestos multiestratificados comprenden al menos dos, preferentemente dos a cinco capas, siendo posible que las capas individuales tengan un espesor desde 0.01 a 5 mm, por ejemplo. Las capas individuales pueden consistir en polímeros naturales o sintéticos o incluso de metal. Las capas son, en particular, películas poliméricas, papel, foils metálicos, películas poliméricas metalizadas, etcétera.

Los polipéptidos anteriores se utilizan como promotores de la adhesión entre por lo menos dos capas adyacentes del compuesto multiestratificado .

Preferentemente, por lo menos una de las capas adyacentes es una capa de un polímero natural o sintético. Los polímeros apropiados son, en particular, policondensados como poliésteres, poli aductos como poliuretanos, poliamidas, policarbonatos o polifenileno éteres o polifenileno sulfuros o polímeros que pueden obtenerse por polimerización por radicales libres o iónica de compuestos etilénicamente insaturados (conocidos como polímeros de radicales libres) . Estos polímeros de radicales libres consisten preferentemente en al menos 60% en peso, con particular preferencia al menos 80% en peso, de "monómeros principales" seleccionados de (met) acrilatos de alquilo de Ci a C2o, esteres vinílicos de ácidos carboxílicos que contengan hasta 20 átomos de carbono, vinil aromáticos con hasta 20 átomos de carbono, nitrilos etilénicamente insaturados, haluros de vinilo, vinil éteres de alcoholes que contengan desde 1 hasta 10 átomos de carbono, hidrocarburos alifáticos con desde 2 hasta 8 átomos de carbono y uno o dos enlaces dobles, en particular etileno y propileno.

Los polipéptidos de la invención son apropiados en particular también como promotores de adhesión para polímeros no polares; por tanto, preferentemente al menos uno de las capas adyacentes consiste en un polímero no polar.

Una medida de la polaridad de los polímeros es la tensión superficial en aire (21°C) . A menor tensión superficial más no polar es el polímero.

Por tanto, por lo menos una de las capas adyacentes preferentemente consiste en un polímero no polar que tenga una tensión superficial de menos de 50 mN/m (milinewton/metro) , en particular menos de 40 mN/m. Los ejemplos de los polímeros no polares de esta clase son poliamida 66 (42.5 mN/m), poliestireno (43.5 mN/m), PVC (38.4 mN/m), polietileno (36.1 mN/m), polipropileno (29 mN/m) o politetrafluroetano (22.5 mN/m).

Se da preferencia particular a ambas capas adyacentes que consisten en un polímero no polar como éste.

La cantidad de polipéptido requerida para la promoción de la adhesión normalmente es desde 0.01 hasta 100 mg (miligramo/m2 (metro cuadrado) ) , en particular 0.01 a 100 mg/m2 y particularmente de preferencia 0.1 a 10 mg/m".

El polipéptido puede ser aplicado a cualquiera de las dos capas adyacentes y, de otro modo, también puede ser aplicado a ambas capas si ambas capas ya han sido preformadas.

El polipéptido preferentemente esta en la forma de una solución acuosa; el contenido del polipéptido de la solución es preferentemente desde 0.01 hasta 5 partes en peso de polipéptido para 100 partes en peso de agua. Para el uso de acuerdo con la invención, la solución preferentemente se diluye más a una concentración desde 1 hasta 10,000 µg/mL de agua, en particular 10 a 1000 µg/mL de agua.

La aplicación puede, por tanto, ser seguida primero por un proceso de secado para remover el agua.

Posteriormente, las dos capas adyacentes pueden ser unidas por los métodos acostumbrados, por ejemplo por laminación.

El polipéptido puede, en particular, también ser aplicado a una de las capas adyacentes (primera capa) , y la otra capa adyacente (segunda capa) puede entonces ser preparada aplicando una dispersión polimérica, solución polimérica o un polímero libre de disolvente a la primera capa provista con el promotor de la adhesión y posteriormente formando una película y/o el curado térmico o fotoquímico. Para este propósito, el polímero en particular esta en la forma de una dispersión o solución acuosa, particularmente de preferencia una dispersión acuosa de un polímero de emulsión, preferentemente de cualquiera de los polímeros de radicales libres antes enlistados. Después de que el polímero haya sido aplicado, un proceso de secado entonces se lleva a cabo, si es apropiado.

El substrato recubierto Los substratos se recubren para propósitos muy diferentes. Debe hacerse mención en particular de recubrimientos decorativos o recubrimientos protectores (término genérico: recubrimientos) o incluso recubrimientos adhesivos, siendo posible que el adhesivo sea aplicado como tal al sustrato o sea unido a este, por ejemplo en forma de un artículo autoadhesivo (etiqueta o cinta adhesiva) .

El sustrato, o la superficie del sustrato, pueden consistir en cualquier material. Del mismo modo, el recubrimiento o la superficie frente al sustrato del recubrimiento pueden consistir en cualquier material.

Preferentemente, la superficie del sustrato o el recubrimiento, o la superficie del recubrimiento frente al sustrato, consiste en polímeros naturales o sintéticos.

Los polímeros apropiados son, en particular, policondensados como poliésteres, poliaductos como poliuretanos, poliamidas, policarbonatos o polifenileno éteres o polifenileno sulfuros o polímeros que pueden obtenerse por polimerización por radicales libres o iónica de compuestos etilénicamente insaturados (conocidos como polímeros de radicales libres en breve) .

Con respecto a la estructura de los polímeros de radicales libres y su contenido de monómero principal, son pertinentes los comentarios anteriores.

Los polipéptidos de la invención son apropiados en particular también como promotores de la adhesión para polímeros no polares; por tanto; al menos la superficie del sustrato o la superficie del recubrimiento frente al sustrato preferentemente consisten en un polímero no polar .

Con respecto al ángulo de contacto como una medida de la polaridad, los comentarios hechos en lo anterior del mismo modo aplican.

Se da preferencia particular a la superficie del sustrato y la superficie del recubrimiento frente al sustrato, consistentes en un polímero no polar como éstos.

La cantidad de polipéptido necesario para la promoción de la adhesión corresponde a la cantidad antes indicada .

El polipéptido puede ser aplicado a la superficie del sustrato, a la superficie del recubrimiento frente al sustrato o a ambos. La aplicación a la superficie del recubrimiento frente al sustrato es posible si el recubrimiento ha sido preformado, es decir, si una película sencilla o un compuesto multiestratificado (ver en lo anterior) va a ser aplicado al sustrato.

El polipéptido preferentemente esta en la forma de una solución acuosa; el contenido de la solución es como ya se indicó.

Por tanto, es posible, después de la aplicación, llevar a cabo primero un proceso de secado para eliminar el agua.

El recubrimiento puede ser aplicado al sustrato por los métodos acostumbrados; las películas o compuestos multiestratificados pueden ser, por ejemplo, laminados .

En particular, el recubrimiento puede ser preparado por la aplicación de una dispersión polimérica, una solución polimérica o un polímero libre de disolvente a la superficie frente al sustrato provista con el promotor de la adhesión y posteriormente formando una película y/o el curado térmico o fotoquímico. Para este propósito, el polímero en particular esta en la forma de una dispersión o solución acuosa, particularmente de preferencia una dispersión acuosa de un polímero en emulsión, preferentemente de cualquiera de los polímeros de radicales libres antes enlistados. Después de que el polímero haya sido aplicado se lleva a cabo entonces un proceso de secado, si es apropiado.

Los compuestos multiestratificados y sustratos recubiertos de la invención tienen una resistencia notablemente aumentada. Mediante el uso de los polipéptidos como promotores de la adhesión, la adhesión del recubrimiento al sustrato es más fuerte y es superior la adhesión de las capas individuales del compuesto multicapa entre sí.

En otra modalidad preferida de la invención, el sustrato es un metal, en principio, este puede ser cualquiera de los metales. Los ejemplos pueden ser hierro, acero, zinc, estaño, aluminio, cobre y aleaciones de estos metales con ellos mismos y con otros metales. Estos pueden ser, en particular, acero, acero recubierto con zinc, aleaciones de zinc, aluminio o aleaciones de aluminio. Se da preferencia particular al zinc o aleaciones de zinc o sustratos con estos como puede ser, por ejemplo, acero galvanizado.

Las aleaciones de Zn o Al son conocidas para el trabajador experto. El trabajador experto selecciona el tipo y cantidad de componentes de la aleación dependiendo del propósito de aplicación deseado. Los componentes comunes de las aleaciones de zinc incluyen, en particular, Al, Pb, Si, Mg, Sn, Cu ó Cd. Los componentes comunes de las aleaciones de aluminio incluyen, en particular, Mg, Mn, Si, Zn, Cr, Zr, Cu ó Ti. Las aleaciones también pueden ser aleaciones de Al/Zn que contienen aproximadamente la misma cantidad de Al y Zn .

El acero recubierto con elaciones de esta clase esta a la disposición en el comercio.

Los metales pueden tener cualquier configuración, con preferencia dada, no obstante, a las hojas metálicas, tiras metálicas o láminas metálicas. El metal también puede ser un material compuesto con una superficie metálica. Este puede ser, por ejemplo, un compuesto de una película polimérica y un metal.

Las superficies metálicas serán recubiertas con los polipéptidos para ser utilizados de acuerdo con la invención, preferentemente con hidrofobinas, como promotores de la adhesión. Esto puede llevarse a cabo utilizando soluciones acuosas de los polipéptidos . Los detalles del proceso de recubrimiento ya han sido mencionados antes.

El recubrimiento puede ser, en particular, pinturas comunes y sistemas de pintura para recubrir superficies metálicas. Estas pueden ser pinturas curadas térmicamente, fotoquímicamente o por otros mecanismos.

Las pinturas comunes para recubrir superficies metálicas contienen por lo menos un aglomerante y también componentes reticulables . Los componentes reticulables pueden ser reticuladores que se emplean además de un aglomerante o pueden ser grupos reticulables ligados al aglomerante. El aglomerante puede también, desde luego, tener grupos reticulables y un reticulador puede ser empleado adicionalmente. En este caso, son posibles diversas combinaciones. Por ejemplo, los aglomerantes y reticuladores pueden emplearse separados entre sí. El aglomerante en este caso comprende grupos funcionales reactivos que pueden reaccionar con grupos funcionales complementarios, reactivos en los reticuladores . Una alternativa son aglomerantes autoreticuladores que comprenden grupos funcionales reactivos con capacidad de sufrir reacciones de reticulación con grupos de su clase ("con ellos mismos") o con grupos funcionales reactivos, complementarios sobre el mismo polímero. También es posible que los reticuladores reaccionen exclusivamente con ellos mismos.

Los ejemplos de los aglomerantes apropiados comprenden (co) polímeros, (met) acrilato, esteres polivmílicos parcialmente hidrolizados, poliésteres, resinas alquídicas, polilactonas, policarbonatos, poliéteres, aductos de resinas epóxidica-amina, poliureas, poliamidas, poliimidas o poliuretanos. Desde luego también es posible utilizar mezclas de diferentes polímeros, a condición de que la mezcla no produzca efectos no deseados.

Los componentes reticuladores pueden tener grupos de reticulación térmica o grupos de reticulación fotoquímica. Los ejemplos de los reticuladores térmicos apropiados son reticuladores basados en epóxidos, en melamina o en isocianatos bloqueados. Los reticuladores apropiados para reticulación fotoquímica son, en particular, compuestos que tienen múltiple grupos etilénicamente insaturados, en particular acrilatos di- o polifuncionales .

El uso de acuerdo con la invención de los polipéptidos, preferentemente de hidrofobinas, mejora en una forma ventajosa la adhesión de la pintura sobre el sustrato. También se logra una resistencia mejorada de la capa de pintura al alargamiento plástico en pruebas anticorrosión .

Los siguientes ejemplos están destinados para demostrar la invención con mayor detalle: Parte A) Preparación de hidrofobinas Ejemplo 1 Trabajo preliminar para la clonación de yaad/His6/yaaE- His6 Una reacción en cadena de polimerasas se llevó a cabo con la ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal572/Hal573) . El DNA modelo utilizado fue DNA genómico de la bacteria Bacillus subtillis. El fragmento de PCR obtenido contenía la secuencia codificadora del gen yaaD/yuaaE de Bacillus subtillis y, en sus extremos o terminales, en cada caso un Ncol y, respectivamente, el sitio de clivaje de restricción Bglll. El fragmento de PCR fue purificado y cortado con endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Este fragmento de DNA fue utilizado como inserto y clonado en el vector pQE60 de Quiagen, el cual había sido previamente linealizado con las endonucleadas de restricción Ncol y Bglll. Los vectores así obtenidos, pQE60TAAD#2/pQE60YaaE#5 pueden utilizarse para expresar proteínas que consistan en YASD::HIS6 y YAAE::HIS6, respectivamente.

Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Ejemplo 2 Clonación de yaad hidrofobina DewA-Hise Una reacción en cadena de polimerasa se llevó a cabo con el oligonucleótido KaM 416 y KaM 417. El DNA modelo utilizado fue DNA genómico del hongo Aspergillus nidulans. El fragmento de PCR obtenido contenía la secuencia codificante del gen de hidrofobina dewA y un sitio de clivaje factor Xa proteinasa N terminal. El fragmento de PCR fue purificado y cortado con la endonucleasa de restricción BamHl . Este fragmento de DNA fue utilizado como inserto y clonado en el vector pQE60YAAD#2 previamente linearizado con la endonucleasa de restricción Bglll.

El vector así obtenido, #508, puede ser utilizado para expresar una proteína de fusión consistente en YAAD: :Xa: :dewA: :HIS6.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM 17: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC Ejemplo 3 Clonación de yaad hidrofobina rodA-His 6 • El plásmido #513 fue clonado del mismo modo que el plásmido #508, utilizando los oligonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

KaM43 : GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435 : CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Ejemplo 4 Clonación de yaad hidrofobina BASFl-Hisß El plásmido #507 fue clonado del mismo modo que el plásmido #508, utilizando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. El DNA modelo empleado fue una secuencia de DNA sintetizada artificialmente-hidrofobina BASFl- (ver apéndice) .

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 5 Clonación de yaad hidrofobina BASF2-Hisc El plásmido #506 fue clonado del mismo modo que el plásmido #508, utilizando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. El DNA modelo empleado fue una secuencia de DNA artificialmente sintetizada -hidrofobina BASF2- (ver apéndice) .

KaM417 : CCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418 : CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 6 Clonación de yaad hidrofobina SC3-His6 El plásmido #526 fue clonado del mismo modo que el plásmido #508, utilizando los oligonucleótidos KaM 464 y KaM 465. El DNA modelo empleado fue una cDNA de Schyzophyllum commune (ver apéndice) .

KaM464 : CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465 : GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Ejemplo 7 Fermentación de la yaad hidrofobina DewA-His6 de la cepa de E. coli recombinante Inoculación de 3 mL de medio líquido LB con una cepa de E. Coli que expresaba yaad hidrofobina DewA-Hisß en tubos Greiner de 15 mL. Incubación de 37°C sobre un agitador a 200 rpm a 37°C durante 8 h. En cada caso dos matraces Erlenmeyer de 1 L con mamparas y 250 mL de medio LB (+ 100 µg/mL de ampicilina) se inoculan con 1 L del precultivo y se incuban en un agitador a 180 rpm a 37°C durante 9 h. Inocular 13.5 L de medio LM (+ 100 µg/mL de ampicilina) con 0.5 L de precultivo (D06oonm 1:10 medido contra H20) en un fermentador de 20 L. Adición de 140 mL de IPTG 100 M a una DOdonm ~ 3.5. Después de 3 h, enfriar el fermentador a 10°C y retirar el caldo de fermentación por centrifugación. Utilizar el paquete de células para otra purificación.

Ejemplo 8 Purificación de la proteína de fusión hidrofobina recombinante (purificación de las proteínas de fusión hidrofobina que poseen una etiqueta His6 C terminal) 100 g del paquete de células (100-500 mg de hidrofobina) se constituyen con buffer de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, para un volumen total de 200 mL y se resuspenden. La suspensión es tratada con un Ultraturrax tipo T25 (Janke y Kunkel; IKA-labortechnik) durante 10 minutos y posteriormente, con el propósito de degradar los ácidos nucleicos, se incuba con 500 unidades de benzonase (Merck, Damstadt; número de orden 1.01 697.0001) a temperatura ambiente durante 1 hora. Antes del rompimiento de las células, una filtración se lleva a cabo utilizando un cartucho de vidrio (Pl) . Con el propósito de romper las células y de cortar el DNA genómico restante, dos corridas del homogeneizador se llevan a cabo a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; microfluidics Corp.). El homogeneado se centrifuga (Sorvall RC-5B, rotor GSA, vaso de centrifuga de 250 mL, 60 minutos, 4°C, 12 rpm, 23 g) , el sobrenadante se pone en hielo y el sedimento se resuspende en 100 mL de buffer de fosfato de sodio, pH 7.5. La centrifugación y resuspensión se repiten 3 veces, el buffer de fosfato de sodio conteniendo el 1% SDS en la tercera repetición. Después de la resuspensión, la solución se agita durante 1 hora, seguido por centrifugación final (Sorvall RC-5B rotor GSA, vaso de centrifuga de 250 mL, 60 minutos, 4°Cc, 12,000 rpm, 23,000 g) . De acuerdo con el análisis SDS-page, la hidrofobina esta presente en el sobrenadante después de la centrifugación final (figura 1) los experimentos muestran que la hidrofobina esta presente en las células de E. coli correspondiente probablemente en forma de cuerpos de inclusión. 50 mL del sobrenadante que contiene la hidrofobina se aplican a una columna Nickel-sepharese High Performance 17-5268-02 (Amersham) de 50 mM equilibrada con buffer Tris-Cl 50 mM, pH 8.0. La columna se lava con buffer Tris-Cl 50 mM, pH 8.0 y la hidrofobina posteriormente se eluye con buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.0,m conteniendo imidazol 200 mM. Para el propósito de separar el imidazol, la solución se dializa contra buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.

La Figura 1 representa la purificación de la hidrofobina preparada: Banda 1: solución aplicada a la columna nickel-sepharose (dilución 1:10) Banda 2: flujo pasante = eluido del vaso de lavado Bandas 3-5: picos a DO 280 de las fracciones de la elución.

La hidrofobina de la Figura 1 tiene un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Algunas de las bandas más pequeñas representan los productos de degradación de hidrofobina.

Ejemplo 9 Prueba de desempeño; caracterización de la hidrofobina cambiando el ángulo de contacto de una gota de agua en vidrio.

Sustrato: Vidrio (vidrio de ventana, Süddeustsche Glas, Mannheim, Alemania) : Concentración de la hidrofobina: 100 µg/mL. Incubación de los porta objetos de vidrio de la noche (temperatura 80°C) en acetato de sodio 50 mM, pH 4 más 0.1% Tween 20. Seguido por recubrimiento, lavado en agua destilada.

Seguido por incubación: 10 min/80°C/l% solución SDS en agua destilada. Lavado en agua destilada.

Las muestras se secan en aire y se determina el ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 µl de agua.

El ángulo de contacto fue medido en un instrumento Dataphysics Contact Angle Systems OCA 15+, software SCA 20.2.0 (noviembre de 2002). La medición se llevo a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El vidrio no tratado dio como resultado un ángulo de contacto de 30 ± 5°; un recubrimiento con una hidrofobina funcional de acuerdo con el ejemplo 8 (yaad-dewA-hisß) dio como resultado ángulos de contacto de 75 ± 5°.

Parte B) El uso de los polipéptidos como promotores de la adhesión Ejemplo 10 Sustrato de polietileno Materiales utilizados: Solución utilizada: En los experimentos de desempeño se empleo una solución de la proteína de fusión preparada de acuerdo con el ejemplo 8, yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 19) en agua. Concentración de hidrofobina en solución: 100 µg/mL (0.01% en peso) .

Sustrato: cuerpos moldeados (placas pequeñas) de polietileno .

Recubrimiento: Una película de poliéster fue recubierta con Acronal A 240, una dispersión acuosa de de poliacrilato, comercial de B ASF para adhesivos sensibles a la presión, y se seco y corto en tiras de 2.5 cm de ancho. Las tiras adhesivas obtenidas fueron utilizadas para recubrir las plaquetas de PE.

Procedimiento : La solución del polipéptido fue aplicada a las placas de polietileno y se cada (placas de polietileno pretratadas) .

Posteriormente, las tiras adhesivas fueron unidas a placas de polietileno pretratadas y, para comparación, a placas de polietileno no tratadas y se determino la fuerza necesaria para retirar las tiras adhesivas (fuerza de adherencia en N) .

Fuerza de adherencia con polipéptido como promotor de la adhesión: 4.7 N Fuerza de adherencia sin polipéptido como promotor de la adhesión: 2.6 N Ejemplo 11 Substratos metálicos Una solución de la proteína de fusión preparada de acuerdo con el ejemplo 8, yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 19) en agua, se empleo en los experimentos de desempeño .

Concentración de hidrofobina en solución: 100 µg/mL (0.01% en peso). ¿Alguna información sobre el pH? ¿este último debe ser desde 8 hasta 8.5 si no se ha adicionado más buffer?.

Como sustratos metálicos se utilizaron las siguientes láminas de prueba: La pintura utilizada fue una capa final horneada basada en melamina alquídica. (¿Esto caracteriza suficientemente la pintura?) .

Descripción experimental Las láminas de aluminio fueron desoxidadas en un baño de inmersión para limpieza alcalina (60 g/L de NaOH, 60°C, 1 min) y se enjuagaron con agua destilada. Las láminas fueron entonces decapadas en un baño ácido con HN03/H20 (1:1) a temperatura ambiente durante 15 segundos, se enjuagaron con agua destilada y se secaron por soplado con aire a presión.

Las láminas de acero galvanizado y las láminas de acero fueron enjuagadas con agua de río, caliente, posteriormente enjuagadas con agua destilada y secadas por soplado con aire a presión.

Las láminas fueron recubiertas con las hidrofobinas por inmersión de las anteriores en la solución antes mencionada, en cada caso a temperatura ambiente. Las láminas de aluminio fueron sumergidas durante 16 h, las láminas de acero galvanizado y las láminas de acero fueron sumergidas durante 4 h. Las láminas fueron posteriormente enjuagadas con agua destilada y secadas por soplado con aire a presión.

Después del recubrimiento con la hidrofobina como promotor de la adhesión, las laminas fueron sumergidas en una capa superficial horneada a base de melamina alquídica en un recipiente de plástico durante 15 S y presecadas en aire durante aproximadamente 1 h. Esto fue seguido por secado en un horno desecado a 190°C durante 30 min y el curado.

Para comparación, en cada caso se preparo otra muestra en la misma forma con la pintura pero sin el promotor de adhesión hidrofobina.

Prueba de desempeño El desempeño de las laminas fue evaluado mediante EN ISO 2409 (corte al través o tronzado), EN ISO 4628-8 (alargamiento plástico) y DIN 53156 (Erichsen cupping) .

La prueba del corte al través evalúa la apariencia de la superficie de la pintura con base en las normas predefinidas, después de que un corte al través ha sido cortado en la superficie. Esto incluye evaluar el grado al cual la pintura se exfolia de la superficie debido al corte. La evaluación se hace en la forma conocida con la ayuda de grados desde 0 hasta 5, siendo 0 el mejor y 5 el peor puntaje.

El alargamiento plástico de la capa de pintura se determina por una prueba de corrosión estándar (la exposición en la cámara de rocío salino (SS DIN 50021) ) de las láminas. El alargamiento plástico o termofluencia de las láminas de aluminio fue evaluada después de 298 h, el de las láminas de acero fue evaluado después de 50 h y el de las láminas de acero galvanizado fue evaluado después de 190 h, en cada caso con base en los estándares predefinidos y utilizando grados de 0 a 5, siendo 0 el mejor y 5 el peor puntaje.

El acopamiento de Erichsen consiste en comprimir una esfera contra la parte posterior de la muestra y hacer una depresión. La apariencia de la pintura en la marca se evalúa con base en estándares predefinidos, siendo 5 la mejor y 0 la peor puntuación.

Los resultados de las pruebas de desempeño se resumen a continuación.

Ejemplo 11-1: substrato de acero * Corte al través a Alargamiento plástico a Acopamjento Erichsen Hidrofobinas Acero sin con hidrofobinas hidrofobinas Utilizando una hidrofobina como promotor de la adhesión no cambia la termofluencia (grado 5) en comparación con una muestra sin hidrofobma. La prueba de corte al través (valor inferior) y la prueba de acopamiento de Erichsen (valor superior) en cada caso dan un resultado superior.

Ejemplo 11-2: substrato de acero galvanizado tf Corte al través B Alargamiento plástico o Acopanuento Epc sen Hidrofobinas sin con hidrofobinas hidiofobinas El uso de hidrofobmas como promotores de la adhesión sobre acero galvanizado produce valores que son en los tres casos superiores a los que se obtienen sin promotor de la adhesión (valores menores para corte al través y termofluencia y valor superior para el acopamiento de Epchsen) . El mejoramiento más claro se logra en la integridad de protección a la corrosión (termofluencia) (grado 1 con promotor de adhesión, en contraste con grado 4 sin promotor de adhesión) .

Ejemplo 11-3: substrato de aluminio sin con hidrofobinas hidrofobinas En el caso de un substrato de aluminio, el corte al través y la termofluencia son buenos incluso sin promotor de adhesión. El acopamiento de Erichsen dan como resultado un leve mejoramiento todavía.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto multiestratificado o sustrato recubierto que comprende los compuestos de los cuales por lo menos 40% en peso son compuestos de alfa aminoácidos ligados por enlaces peptídicos (mencionados como polipéptido en breve en adelante) como promotores de la adhesión entre por lo menos dos capas adyacentes del compuesto o entre el recubrimiento y el sustrato, en donde los polipéptidos son hidrofobinas de la fórmula: Xn-C -X?-5o~C -Xo-b_C -X?-?oo_C -X?-?oo_C -X?-5o-C -Xo-s_C -X?_5o_C -Xm (I) , donde X puede ser en cada caso idéntico o diferente y puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que se encuentran en la naturaleza (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, ILe, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) , los índices cerca de X indican en cada caso el número de aminoácidos, C es cisteína, alanina, serina, glicina, metionina o treonina, con por lo menos 4 de los residuos indicados con C siendo cisteína, y los índices n y m son, independientes entre sí, números naturales de 0 y 500, preferentemente desde 15 hasta 300. El compuesto multiestratificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos una de las capas adyacentes consiste en un polímero natural o sintético. El compuesto multiestratificado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque por lo menos una de las capas adyacentes consiste en un polímero (no polar) sintético que tiene una tensión superficial de menos que 50 mN/m . El compuesto multiestratificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque ambas capas adyacentes consisten en un polímero natural o sintético. El compuesto multiestratificado o sustrato recubierto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque una de las dos capas consiste en un metal o una aleación. El compuesto multiestratificado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la capa adyacente es una capa de pintura. El compuesto multiestratificado de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el metal se selecciona del grupo que consiste en acero, acero recubierto con zinc, aleaciones de zinc, aluminio o aleaciones de aluminio o es aluminio o aleaciones de aluminio. Un proceso para preparar el compuesto multiestratificado de conformidad con cualquiera dee las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque: — el polipéptido se aplica a una de las capas adyacentes, — un procedimiento de secado se lleva a cabo, si es apropiado, cuando el polipéptido ha sido aplicado en forma de una solución acuosa, y — la otra capa adyacente se lamina posteriormente sobre o se prepara formando una película de un polímero natural o sintético. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polímero natural o sintético de la otra capa esta en forma de una solución o dispersión acuosa y un procedimiento de secado se lleva a cabo después de que la película se ha formado . 10. El sustrato recubierto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie del sustrato o la superficie del recubrimeinto frente al sustrato consiste en un polímero natural o sintético. 11. El sustrato recubierto de conformidad con la reivindicación 1 ó 10, caracterizado porque la superficie del sustrato o la superficie del recubrimiento frente al sustrato consiste en un polímero (no polar) sintético que tiene una tensión superficial de menos que 50 mN/m. 12. El sustrato recubierto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 10 u 11, caracterizado porque la superficie del sustrato o la superficie del recubrimiento frente al sustrato consisten en un polímero natural o sintético. 13. Un proceso para preparar un sustrato recubierto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 10 a 12, caracterizado porque: el polipéptido se aplica a la superficie del sustrato o a la superficie del agente de recubrimiento frente al sustrato un procedimiento de secado se lleva a cabo, si es apropiado, cuando el polipéptido ha sido aplicado en forma de una solución acuosa, y el agente de recubrimiento se aplica posteriormente al sustrato. 14. El proceso para preparar el sustrato recubierto de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque : - el polipéptido se aplica a la superficie del sustrato un procedimiento de secado se lleva a cabo, si es apropiado, cuando el polipéptido ha sido aplicado en la forma de una solución acuosa, y el recubrimiento se prepara posteriormente formando una película de un polímero natural o sintético sobre la superficie del sustrato. 15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polímero natural o sintético está en forma de una solución o dispersión acuosa y un procedimiento de secado se lleva a cabo después de que la película se ha formado. El proceso de conformidad con la reivindicación 9 ó 15, caracterizado porque la solución o dispersión acuosa es una dispersión acuosa de un polímero en emulsión. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un compuesto multiestratificado o un sustrato recubierto que contiene los compuestos consistentes en por lo menos 40% en peso de alfa aminoácidos unidos por formaciones peptídicas (en adelante polipéptidos) y utilizada en forma de agentes adhesivos entre por lo menos dos capas adyacentes del compuesto o entre un recubrimiento y un sustrato.