BRPI0607594A2

BRPI0607594A2 - compósito multi-camadas ou substrato revestido, processo para a preparação dos mesmos, e, uso de hidrofobinas

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Publication number: BRPI0607594A2
Application number: BRPI0607594-0A
Authority: BR
Inventors: Hermann Seyffer; Hans-Georg Lemaire; Ulf Baus; Thomas Subkowski; Claus Bollschweiler; Thomas Heidenfelder; Karl-Heinz Schumacher; Marvin Karos
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2010-04-06
Also published as: WO2006103225A1; JP2008537701A; US8859106B2; JP4772110B2; EP1866150B1; MX2007012021A; EP1866150A1; KR20080004555A; US20090233110A1

Abstract

COMPóSITO MULTI-CAMADAS OU SUBSTRATO REVESTIDO, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DOS MESMOS, E, USO DE HIDROFOBTNAS. A invenção refere-se a um compósito multi-camadas ou um substrato revestido, compreendendo compostos de que pelo menos 40 % em peso se constituem de aminoácidos alfa ligados por meio de ligações peptídicas (referidos abreviadamente como polipeptídeo, abaixo) como promotores de adesão entre pelo menos duas camadas adjacentes do composto ou entre o revestimento e o substrato. Mais especificamente, a invenção refere-se ao uso de hidrofobinas como promotores de adesão.

Description

"COMPÓSITO MULTI-CAMADAS OU SUBSTRATO REVESTIDO,PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DOS MESMOS, E, USO DE COMPOSTOS"

A invenção refere-se a um compósito multi-camadas ou umsubstrato revestido, compreendendo compostos de que pelo menos 40 % empeso se constituem de aminoácidos alfa ligados por meio de ligaçõespeptídicas (referidos abreviadamente como polipeptídeo, abaixo) comopromotores de adesão entre pelo menos duas camadas adjacentes do compostoou entre o revestimento e o substrato. Mais especificamente, a invençãorefere-se ao uso de hidrofobinas como promotores de adesão.

Hidrofobinas são pequenas proteínas com cerca de 100 a 150aminoácidos, que são característicos de fungos filamentosos, por exemplo,Schizophyllum commune. Eles apresentam usualmente 8 unidades cisteína.

Hidrofobinas apresentam uma afinidade marcante parainterfaces e, portanto, são vantajosas para revestimento de superfícies. Assim,é possível revestir, por exemplo, Teflon com hidrofobinas para se obter umasuperfície hidrofílica.

Hidrofobinas podem ser isoladas de substâncias naturais.Nosso pedido precedente, DE 10 2005 007 480.4, revela um processo para apreparação de hidrofobinas.

O uso de hidrofobinas para vários aplicações foi proposto noestado da técnica.

WO 96/41882 propõe o uso de hidrofobinas como agentesemulsificantes, espessantes, tensoativos, para hidrofilização de superfícieshidrofóbicas, para aperfeiçoar a resistência à água de substrato hidrofílicos,para preparar emulsões óleo-em-água ou emulsões água-em-óleo. Aplicaçõesfarmacêuticas, como a preparação de ungüentos ou cremes e tambémaplicações cosméticas, como proteção da pele ou a preparação de xampuscapilares ou enxágües capilares também são propostas.A EP 1 252 516 revela o revestimento de janelas, lentes de contato, biossensores, aparelhos médicos, recipientes para realização de experimentos ou para armazenamento, cascos de embarcações, partículas sólidas ou o chassi ou carroceria de veículos de passageiros com uma solução contendo hidrofobina a uma temperatura de 30 a 80°C.

WO 03/53383 revela o uso de hidrofobina para tratar materiais de queratina em aplicações cosméticas.

WO 03/10331 revela um sensor revestido com hidrofobina, por exemplo, um eletrodo de medição, em que se ligou substâncias não covalentes adicionais, por exemplo, substâncias eletroativas, anticorpos ou enzimas.

Previamente usou-se promotores de adesão muito diferentes para aperfeiçoar a adesão de, por exemplo, revestimentos em uma grande variedade de substratos. De acordo com o Rõmpp Chemie Lexikon (edição de 1990) são vantajosos, por exemplo, titanatos, silanos, complexos de cromo de ácidos carboxílicos insaturados. Promotores de adesão particularmente indicados para adesivos são copolímeros de etileno/acilamida, isocianatos poliméricos ou compostos de organo-silício reativos.

Poliuretanos e polietilenoiminas também são promotores de adesão conhecidos.

O objeto da presente invenção consistiu em proporcionar promotores de adesão alternativos que apresentam propriedades de aplicação muito boas e que proporcionam, em particular, boa adesão das camadas individuais de um compósito multi-camadas ou de um revestimento sobre um substrato.

Assim, verificou-se o compósito multi-camadas ou o substrato revestido, como definido previamente.

O promotor de adesão

O compósito multi-camadas ou o substrato revestidocompreende o polipeptídeo definido previamente como um promotor de adesão.

O polipeptídeo consiste de pelo menos 40 % em peso, de preferência, pelo menos 70 % em peso, de forma particularmente preferível, pelo menos 90 % em peso, e de forma mui particularmente preferível pelo menos 95 ou 99 % em peso, de aminoácidos alfa ligados via ligações peptí dicas.

Em uma concretização particular, o polipeptídeo consiste exclusivamente de aminoácidos alfa ligados via ligações peptídicas.

Aminoácidos alfa particularmente vantajosos são glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cisteína, cistina, metionina, triptofano, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, lisina e histidina.

O polipeptídeo compreende, de preferência, o alfa-aminoácido cisteína em uma mistura com outros aminoácidos alfa.

O polipeptídeo consiste, de forma particularmente preferível de pelo menos 0,1 % em peso, de forma particularmente preferível, pelo menos 0,5, de forma mui particularmente preferível pelo menos 1 % em peso, de cisteína. O teor de cisteína no polipeptídeo não excede geralmente 15 % em peso, em particular 10 % em peso, e de forma mui particularmente preferível não excede 7 % em peso.

Em uma concretização particular, os polipeptídeos são hidrofobinas.

O termo "hidrofobinas" de acordo com a presente invenção significa abaixo proteínas da fórmula geral estrutural (I)

Xn-C1-Xi.5o-C2-Xo-5-C3-Xi.ioo-C4-Xi.ioo-C5-Xi.5o-C6-Xo-5-C7-Xi.5o-C8-Xm (I), sendo que X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente ocorrentes (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). X também pode ser, em cada caso,idêntico ou diferente. Os índices próximos de X indicam, em cada caso, o número de aminoácidos, C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina, sendo que pelo menos quatro dos radicais indicados com C são cisteína, e o índices nem são independentemente um do outro números naturais de 0 e 500, de preferência, de 15 a 300.

Os polipeptídeos de acordo com fórmula (I) são caracterizados adicionalmente pela propriedade do incremento, à temperatura ambiente, após revestimento de uma superfície de vidro, do ângulo de contato de uma gota de água em pelo menos 20°, de preferência, pelo menos 25° e, de forma particularmente preferível, 30°, comparado em cada caso com o ângulo de contato de uma gota de água de tamanho semelhante com a superfície de vidro não-revestida.

Os aminoácidos indicados de C1 a C8 são, de preferência, cisteínas; no entanto, eles também podem ser substituídos por outros aminoácidos com dimensões espaciais similares, de preferência, alanina, serina, treonina, metionina ou glicina. No entanto, pelo menos quatro, de preferência, pelo menos 5, de forma particularmente preferível, pelo menos 6 e, em particular, pelo menos 7, das posições de C1 a C8 deveriam consistir de cisteínas. Cisteínas podem encontrar-se em um estado reduzido, ou podem formar pontes dissulfeto entre si. Prefere-se particularmente a formação intramolecular de pontes C-C, em particular aquela com pelo menos uma ponte dissulfeto intramolecular, de preferência, 2, de forma particularmente preferível, 3 e de forma mui particularmente preferível 4, pontes dissulfeto intramoleculares. A substituição descrita acima de cisteínas por aminoácidos com dimensões espaciais similares, envolve vantajosamente a substituição em pares daquelas posições C que podem formar pontes dissulfeto intramoleculares entre si.

Caso também se use cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas ou treoninas nas posições indicadas com X, a numeração dasposições de C individuais nas fórmulas gerais podem variar correspondentemente.

Prefere-se o emprego de hidrofobinas da fórmula geral (II)

Xn-C1-X3.25-C2-Xo-2-C3-X5.50-C4-X2-35"C5-X2-i5-C6-Xo-2-C7-X3.35-C8-Xm (II)

para realizar a presente invenção, em que X, C e os índices próximos a X e C são como definido acima, porém os índices nem são números entre 0 e 300 e as proteínas distinguem-se adicionalmente pela variação de ângulo contato mencionada acima.

Prefere-se particularmente o emprego de hidrofobinas da

fórmula (III)

Xn-C1-X5.9-C2-C3-Xii.39-C4-X2-23-C5-X5.9-C6-C7-X6.ig-C8-Xm (iii)> sendo que X, C e os índices próximos a X e C são como definido acima, os índices nem são números entre 0 e 200 e as proteínas distinguem-se adicionalmente pela variação de ângulo de contato mencionada acima, e pelo menos 6 dos radicais indicados com C são cisternas. Prefere-se particularmente que todos os radicais C sejam cisteínas.

Os radicais Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos quesão ligadas naturalmente a uma hidrofobina. No entanto, qualquer um ou ambos os radicais também podem ser seqüências de peptídeos que não são ligados naturalmente a uma hidrofobina. Isto também inclui aqueles radicais Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeos naturalmente ocorrente em uma hidrofobina foi estendida por uma seqüência de peptídeos que não ocorre naturalmente em uma hidrofobina.

Se Xn e/ou Xm forem seqüências de peptídeos que não são ligados naturalmente a hidrofobinas, referidas seqüências têm comprimentos de usualmente de pelo menos 20, de preferência, pelo menos 35, de forma particularmente preferível, pelo menos 50 e de forma mui particularmente preferível pelo menos 100 aminoácidos. Um radical deste tipo não é ligado naturalmente a uma hidrofobina também será referido abaixo como umparceiro de fusão. Isto deve expressar o fato de que as proteínas podem consistir de pelo menos uma parte de hidrofobina e um parceiro de fusão que, na natureza, não ocorre conjuntamente nesta forma.

O parceiro de fusão pode ser selecionado dentre uma multiplicidade de proteínas. Também é possível que uma pluralidade de parceiros de fusão seja ligada a uma parte de hidrofobina, por exemplo, à ponta amino (Xn) e à ponta carbóxi (Xm) de referida parte de hidrofobina. No entanto, também é possível ligar, por exemplo, duas partes de parceiros de fusão a uma posição (Xn ou Xm) da proteína da invenção.

Partes de parceiros de fusão particularmente vantajosas são proteínas que ocorrem naturalmente em microorganismos, em particular em E. coli ou Bacillus subtilis. Exemplos de referidas partes de parceiros de fusão são as seqüências yaad (SEQ ID NO: 15 e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18), e tiorredoxina. Fragmentos ou derivados de referidas seqüências, que compreendem apenas uma parte, de preferência, 70-99 %, de forma particularmente preferível, 80-98 %, de referidas seqüências ou em que aminoácidos ou nucleotídeos individuais foram alterados em comparação com a seqüência mencionada, também são bem adequados, sendo que os percentuais dados referem-se, em cada caso, ao número de aminoácidos.

Adicionalmente também é possível que a seqüência de polipeptídeos das proteínas usadas de acordo com a invenção tenha sido modificada, por exemplo, por meio de glicosilação, acetilação ou, então, por meio de reticulação química, por exemplo, com glutaraldeído.

Uma característica das proteínas usadas de acordo com a invenção é a alteração das propriedades de superfície quando as superfícies são revestidas com referidas proteínas. A variação das propriedades de superfície pode ser determinada experimentalmente medindo-se o ângulo de contato de uma gota de água antes e após o revestimento da superfície com a proteína e determinando-se a diferença das duas medições.A medição dos ângulos de contato é conhecida, em princípio, pela pessoa versada na arte. As medições baseiam-se na temperatura ambiente e gotas de água de 5 1. As condições experimentais precisas para um método, como exemplo vantajoso, de medição do ângulo de contato são ilustradas na seção experimental. Nas condições indicadas ali, as proteínas usadas de acordo com a invenção apresentam a propriedade de incrementar o ângulo de contato em pelo menos 20°, de preferência, pelo menos 25°, de forma particularmente preferível, pelo menos 30°, em cada caso comparado com o ângulo de contato de uma gota de água de tamanho similar com a superfície de vidro não-revestida.

As posições dos aminoácidos polares e não polares na parte hidrofobina das hidrofobinas conhecidas até aqui são preservadas, resultando em um diagrama característico de hidrofobicidade. Diferenças de propriedades físicas e de hidrofobicidade resultaram na classificação das hidrofobinas conhecidas até aqui em duas classes, I e II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

As membranas combinadas de hidrofobinas de classe I são, em grande parte, insolúveis (mesmo a 1 % de dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma temperatura elevada) e podem ser dissociadas novamente por meio de ácido fórmico ou ácido trifluoroacético (TFA) concentrado. Em contraste, as formas combinadas de hidrofobinas de classe II são menos estáveis. Elas podem ser novamente dissolvidas com etanol a 60 % ou SDS a 1 % (à temperatura ambiente).

Comparação das seqüências de aminoácidos revela que o comprimento da região entre cisteína C3 e C4 é distintamente mais curta em hidrofobinas de classe II do que em hidrofobinas de classe I. Adicionalmente, hidrofobinas de classe II apresentam aminoácidos mais carregados do que classe I.

Hidrofobinas que são particularmente preferidas pararealização da presente invenção são aquelas dos tipos dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, bas£2 que são caracterizadas estruturalmente na listagem de seqüências abaixo. Elas também podem ser apenas partes ou derivados de referidos tipos. Também é possível ligar uma pluralidade de partes de hidrofobina, de preferência, 2 ou 3, com a mesma estrutura ou uma estrutura diferente uma da outra e uma seqüência de polipeptídeos vantajosa correspondente que não é conectada naturalmente a uma hidrofobina.

Considera-se particularmente vantajosas para a realização da presente invenção as proteínas de fusão apresentando as seqüências de polipeptídeos indicadas nas SEQ ID NO: 20, 22, 24 e também as seqüências de ácido nucleico que codificam para tal, em particular as seqüências de acordo com SEQ ID NO: 19, 21, 23. Concretizações particularmente preferidas também são proteínas que, partindo das seqüências de polipeptídeos indicadas na SEQ ID NO. 20, 22 ou 24, resultam da substituição, inserção ou deleção de pelo menos um, até 10, de preferência, 5, de forma particularmente preferível, 5 % de todos os aminoácidos e que ainda apresentam pelo menos 50 % da atividade biológica das proteínas de partida. Propriedade biológica das proteínas significa aqui o incremento descrito acima do ângulo de contato em pelo menos 20°.

As proteínas usadas de acordo com a invenção podem serpreparadas quimicamente por meio de processos da síntese peptídica, por exemplo, por meio de síntese de fase sólida de acordo com Merrifield.

Hidrofobinas naturalmente ocorrentes podem ser isoladas de fontes naturais por meio de métodos vantajosos. Como exemplo, faz-se referência a Wõsten et ai, Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO 96/41882.

Proteínas de fusão podem ser preparadas, de preferência, por meio de processos de manipulação genética em que uma seqüência de ácido nucleico, em particular seqüência de DNA, que codifica para o parceiro defusão e uma que codifica para a parte de hidrofobina são combinadas de tal forma que a proteína desejada é gerada por meio de expressão gênica da seqüência de ácido nucleico combinada em um organismo hospedeiro. Um processo de preparação deste tipo é divulgado em nosso pedido precedente DE 102005007480.4.

Organismos hospedeiros (organismos produtores) que podem ser vantajosos aqui para o processo de preparação mencionado são procariontes (incluindo Archaea) ou eucariontes, particularmente bactérias incluindo halobactérias e metanococos, fungos, células de insetos, células de plantas e células mamíferas, de forma particularmente preferível, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas), e outros.

A invenção refere-se adicionalmente ao uso de construções de expressão compreendendo, sob o controle genético de seqüências de ácido nucleico reguladoras, uma seqüência de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo usado de acordo com a invenção e também a vetores compreendendo pelo menos uma destas construções de expressão.

Construções usadas compreendem, de preferência, um promotor a 5' a montante da seqüência codificante particular, e uma seqüência terminadora a 3' a jusante e, se desejado, elementos reguladores usuais adicionais, em cada caso ligadas operacionalmente com a seqüência codificante.

Uma "ligação operacional" significa a disposição seqüencial de promotor, seqüência codificante, terminador e, se desejado, elementos reguladores adicionais de tal forma que cada um dos elementos reguladores seja capaz de realizar esta função conforme requerido na expressão da seqüência codificante.Exemplos de seqüências ligáveis operacionalmente são seqüências de objetivação e também acentuadores, sinais de poliadenilação e análogos. Outros elementos reguladores compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e análogos.

Seqüências reguladoras vantajosas encontram-se descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Adicionalmente a estas seqüências reguladoras, a regulação natural destas seqüências ainda pode estar presente a montante dos genes estruturais efetivos e, se desejado, pode ter sido alterada geneticamente de tal forma que a regulação natural seja desativada e a expressão dos genes seja incrementada.

Uma construção de ácido nucleico preferida também compreende vantajosamente uma ou mais das seqüências acentuadoras previamente indicadas que são ligadas funcionalmente ao promotor e que permitem a expressão da seqüência de ácido nucleico a ser incrementada. Seqüências vantajosas adicionais, como elementos reguladores ou terminadores adicionais também podem ser inseridas na ponta 3' das seqüências de DNA.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes na construção emuma ou mais cópias. A construção também pode compreender marcadores adicionais, como genes da resistência a antibióticos ou genes complementadores de auxotrofia, se apropriado para o objetivo de selecionar referida construção.

Seqüências reguladoras que são vantajosas para o processoestão presentes, por exemplo, em promotores, como o promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, Iaclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD)SPó, lambda-PR ou no promotor lambda-P, sendo que referidos promotores são usados vantajosamente em bactérias Gram-negativas.Seqüências reguladoras vantajosas adicionais estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivos amy e SP02, nos promotores ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH de levedura ou fungos.

Também é possível usar promotores artificiais para regulação.

Com o objetivo de expressão em um organismo hospedeiro, a construção de ácido nucleico é inserida vantajosamente em um vetor, como um plasmídeo ou um fago, por exemplo, que permite que os genes sejam expressos otimamente no hospedeiro. Vetores significam, adicionalmente a plasmídeos e fagos, também outros vetores conhecidos pela pessoa versada na arte, i.e., por exemplo, vírus, como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transpósons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular, e também o sistema de Agrobacterium.

Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou replicados cromossomicamente. Estes vetores constituem uma concretização adicional da invenção. Exemplos de plasmídeos vantajosos são, em E. coli, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19,2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-Bl, tgtll ou pBdCI, em Streptomyces, pIJlOl, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, em Bacillus, pUBUO, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos, pALSl, pIL2 ou pBBlló, em leveduras, 2alpha, pAG-1, YEp6, YEpl3 ou pEMBLYe23, ou, em plantas, pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Referidos plasmídeos são uma pequena seleção dos possíveis plasmídeos. Outros plasmídeos são bem conhecidos pela pessoa versada na arte e podem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et ai, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

Com o objetivo de expressar os outros genes que estãopresentes, a construção de ácido nucleico também compreende vantajosamente seqüências reguladoras na ponta 3' e/ou na ponta para incrementar a expressão, que são selecionadas para expressão ótima dependendo do organismo hospedeiro e do gene ou dos genes selecionados. 5 Estas seqüências reguladoras devem permitir a expressãoespecífica da expressão de proteínas e genes. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expresso ou superexpresso apenas após indução ou que é expresso e/ou superexpresso imediatamente.

Em conexão com isto, os fatores ou seqüências reguladoras podem influenciar positivamente, de preferência, e com isso incrementar a expressão dos genes que foram introduzidos. Assim, os elementos reguladores podem ser acentuados vantajosamente no nível de transcrição por meio do uso de sinais de transcrição fortes, como promotores e/ou acentuadores. No entanto, adicionalmente a isto, também é possível acentuar a tradução por meio do aperfeiçoamento da estabilidade do mRNA, por exemplo.

Em um concretização adicional do vetor, o vetor que compreende a construção de ácido nucleico da invenção ou o ácido nucleico da invenção também pode ser introduzido vantajosamente nos microorganismos em forma de um DNA linear e ser integrado no genoma do organismo hospedeiro por meio de recombinação heteróloga ou homóloga. Este DNA linear pode consistir de um vetor linearizado, como um plasmídeo ou apenas da construção de ácido nucleico ou do ácido nucleico.

Para expressar genes heterólogos otimamente em organismos, é vantajoso alterar as seqüências de ácido nucleico de acordo com o uso de códon específico empregado no organismo. O uso de códon pode ser facilmente determinado com o auxílio de análises de computador de outros genes do organismo em questão.

Uma cassete de expressão é preparado fundindo-se umpromotor apropriado com uma seqüência de nucleotídeos codificante vantajosa e com um sinal de terminação ou um sinal de poliadenilação. Técnicas comuns de recombinação e clonagem são como descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e também em TJ. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987), são usadas para este fim.

Para se obter a expressão em um organismo hospedeiro vantajoso, a construção de ácido nucleico recombinante ou construção gênica é inserida vantajosamente em um vetor específico para hospedeiro que permite que os genes sejam expressos otimamente no hospedeiro. Vetores são bem conhecidos pela pessoa versada na arte e podem ser encontrados, por exemplo, em "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

É possível preparar, com o auxílio dos vetores, microorganismos recombinantes que são transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor e que podem ser usados para produzir as proteínas usadas de acordo com a invenção. Vantajosamente, as construções recombinantes da invenção descritas acima são introduzidas em um sistema de hospedeiro vantajoso e expressas. Em conexão com isto, é possível usar métodos de transfecção e clonagem familiares conhecidos pela pessoa versadana arte, como, por exemplo, coprecipitação, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção retroviral e análogos, com o objetivo de ocasionar a expressão de referidos ácidos nucleicos no sistema de expressão particular. Sistemas vantajosos encontram-se descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience,New York 1997, ou Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Também é possível preparar microorganismos recombinados homologamente. Para tal fim, prepara-se um vetor que compreende pelo menos uma seção de um gene a ser usado de acordo com a invenção ou uma seqüência codificante em que, se apropriado, se introduziu pelo menos uma deleção de aminoácido, adição de aminoácido ou substituição de aminoácido para modificar, por exemplo, disromper funcionalmente, a seqüência (vetor "knock-out" [de inibição]). A seqüência introduzida também pode ser, por exemplo, um homólogo de um microorganismo relacionado, ou pode derivar-se de uma fonte mamífera, de levedura ou inseto. Alternativamente, o vetor usado para recombinação homóloga pode ser projetado de tal forma que o gene endógeno, no caso de recombinação homóloga, se encontre mutado ou, de outra forma, alterado, mas ainda codificando a proteína funcional (p. ex. a região reguladora a montante pode ter sido alterada de tal forma que a expressão da proteína endógena seja alterada com isso). A seção alterada do gene usado de acordo com a invenção encontra-se no vetor de recombinante homólogo. A construção de vetores que são vantajosos para recombinação homóloga encontra-se descrita, por exemplo, em Thomas, K.R. e Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.

Organismos hospedeiros recombinantes vantajosos para o ácido nucleico usado de acordo com a invenção ou a construção de ácido nucleico são, em princípio, qualquer organismo procariótico ou eucariótico.

Usa-se de maneira vantajosa microorganismos, como bactérias, fungos ou leveduras como organismos hospedeiros. Usa-se de maneira vantajosa bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, de preferência, bactérias das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, de forma particularmente preferível,bactérias dos gêneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus.

Dependendo do organismo hospedeiro, os organismos usados no processo de preparação de proteínas de fusão são desenvolvidos ou cultivados de uma maneira conhecida pela pessoa versada na arte. Microorganismos são desenvolvidos usualmente em um meio líquido que compreende uma fonte de carbono, usualmente em forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, usualmente em forma de fontes de nitrogênio orgânico, como extrato de levedura ou sais, como sulfato de amônio, traços de elementos, como sais de ferro, sais de manganês e sais de magnésio e, se desejado, vitaminas, a temperaturas entre 0°C e 100°C, de preferência, entre 10°C e 60°C, enquanto eram supridas com oxigênio. Em conexão com isto, o pH do líquido nutriente pode ou não ser mantido em um valor fixo, i.e. pode ou não ser regulado durante o cultivo. O cultivo pode ser realizado em modo de bateladas, em modo de semi-bateladas ou continuamente. Nutrientes podem ser introduzidos inicialmente no início da fermentação ou podem ser introduzidos subseqüentemente de uma maneira semicontínua ou contínua. As enzimas podem ser isoladas dos organismos por meio do processo descrito nos exemplos ou podem ser usados para a reação como um extrato bruto.

Proteínas usadas de acordo com a invenção ou fragmentosfuncionais, biologicamente ativos das mesmas, podem ser preparados por meio de um processo recombinante, com um microorganismo produtor de proteína que está sendo cultivado, expressão das proteínas que estão sendo induzidas, se apropriado, e referidas proteínas sendo isoladas da cultura. As proteínas também podem ser produzidas desta maneira numa escala industrial se isto for desejado. O microorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado por meio de métodos conhecidos. Bactérias podem ser propagadas, por exemplo, no meio TB ou meio LB e a uma temperatura de 20 a 40°C e um pH de 6 a 9. Condições de cultivo vantajosas são descritasdetalhadamente, por exemplo, em T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Se as proteínas usadas de acordo com a invenção não forem secretadas no meio de cultura, as células são então disrompidas e o produto é obtido do lisado por meio de processos conhecidos de isolamento de proteína. As células podem se disrompidas, conforme desejado, por meio de ultrassom de alta freqüência, por meio de alta pressão, como, por exemplo, em uma célula de pressão Francesa, por meio de osmólise, por ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, por meio de homogeneizadores ou por meio de uma combinação de dois ou mais dos processos listados.

As proteínas usadas de acordo com a invenção podem ser purificadas usando-se métodos cromatográficos conhecidos, como cromatografia de peneira molecular (filtração por gel), por exemplo, cromatografia em Q Sepharose, cromatografia de troca de íon e cromatografia hidrofóbica, e também usando-se outros métodos usuais, como ultrafiltração, cristalização, dessalinização, diálise e eletroforese em gel nativo. Processos vantajosos encontram-se descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.

Pode ser vantajoso isolar a proteína recombinante por meio do uso de sistemas de vetor ou oligonucleotídeos que estendem o cDNA por meio de seqüências de nucleotídeos em particular e, com isto, codificam para proteínas alteradas ou proteínas de fusão que são usadas, por exemplo, para simplificar a purificação. Exemplos de modificações vantajosas deste tipo são "marcadores" que atuam como âncoras, como a modificação conhecida como a âncora de hexa-histidina, ou epítopos que podem ser reconhecidos como antígenos por anticorpos (descritos, por exemplo, em Harlow, E. e Lane, D.,1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Outros marcadores vantajosos são, por exemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, etapatavidina-BD-avi-tag, Flag-tag, T7 etc. Estas âncoras podem ser usadas para ligar as proteínas a um suporte sólido, como uma matriz de polímero, por exemplo, que pode ser empacotada, por exemplo, em uma coluna de cromatografia, ou pode ser usada em uma placa de microtitulação ou outro suporte. Os protocolos de purificação correspondentes podem ser obtidos de fornecedores de marcadores de afinidade comerciais.

As proteínas preparadas como descrito podem ser usadas, seja diretamente como proteínas de fusão ou, após clivagem e remoção do parceiro de fusão, como hidrofobinas "puras".

Pretendendo-se remover o parceiro de fusão, recomenda-se incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio de reconhecimento específico para as proteases) na proteína de fusão entre a parte de hidrofobina e a parte do parceiro de fusão. Sítios de clivagem vantajosos são, em particular, aquelas seqüências de peptídeos que, de outra forma, não ocorrem na parte de hidrofobina, nem na parte do parceiro de fusão, que podem ser facilmente determinadas por meio de ferramentas de bio-informática. São particularmente vantajosas, por exemplo, clivagem de BrCN em clivagem mediada com metionina ou protease com Fator Xa, clivagem de enteroquinase, trombina, clivagem de TEV (protease do vírus da cicatriz do tabaco).

Atribuição dos nomes de seqüências a DNA e seqüências de polipeptídeos na listagem de seqüências

dewA DNA e seqüências de polipeptídeos SEQ ID NO: 1

dewA seqüência de polipeptídeo SEQ ID NO: 2

rodA DNA e seqüências de polipeptídeos SEQ ID NO: 3

rodA seqüência de polipeptídeo SEQ ID NO: 4

hypA DNA e seqüências de polipeptídeos SEQ ID NO: 5<table>table see original document page 19</column></row><table>

O compósito multi-camadas

Compósitos multi-camadas são empregados para fins muito diferentes, por exemplo, como meios de embalagem (em particular películas de composto) ou artigos auto-adesivos (compósito multi-camadas constituído pelo menos de suporte e uma camada adesiva).

Os compósitos multi-camadas compreendem pelo menos duas, de preferência, de duas a cinco, camadas, sendo possível que as camadas individuais apresentem espessuras de 0,01 a 5 mm, por exemplo. As camadas individuais podem consistir de polímeros naturais ou sintéticos ou, então, de metal. As camadas são, em particular, películas de polímero, papel, folhas demetal, películas de polímero metalizadas etc.

Os polipeptídeos acima são usados como promotores de adesão entre pelo menos duas camadas adjacentes do compósito multi-camadas. De preferência, pelo menos uma das camadas adjacentes é uma camada de um polímero natural ou sintético. Polímeros vantajosos são, em particular, policondensados, como poliésteres, poliadutos, como poliuretanos, poliamidas, policarbonatos ou éteres de polifenileno ou sulfetos de polifenileno ou polímeros obteníveis por meio de polimerização de radical livre ou iônica de compostos etilenicamente insaturados (referidos aqui abreviadamente como polímeros de radical livre). Referidos polímeros de radical livre consistem, de preferência, de pelo menos 60 % em peso, de forma particularmente preferível, pelo menos 80 % em peso, de "monômeros principais" selecionado de (met)acrilatos de alquila com de Cl a C20, ésteres de vinila de ácidos carboxílicos compreendendo até 20 átomos de carbono, aromáticos de vinila com até 20 átomos de carbono, nitrilas etilenicamente insaturados, halogenetos de vinila, vinil éteres de alcoóis compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, hidrocarbonetos alifáticos com de 2 a 8 átomos de carbono e uma ou duas duplas ligações, em particular etileno e propileno.

Os polipeptídeos da invenção são vantajosos, em particular, também como promotores de adesão para polímeros não polares; portanto, de preferência, pelo menos uma das camadas adjacentes consiste de um polímero não polar.

Uma medida da polaridade de polímeros é a tensão superficial no ar (21°C). Quanto menor a tensão superficial, tanto mais não polar é o polímero.

Portanto, pelo menos uma das camadas adjacentes consiste, de preferência de um polímero não polar apresentando uma tensão superficial inferior a 50 mN/m (milinewton/metro), em particular inferior a 40 mN/m. Exemplos de polímeros não polares deste tipo são poliamida 66 (42,5 mN/m),poliestireno (43,5 mN/m), PVC (38,4 mN/m), polietileno (36,1 mN/m), polipropileno (29 mN/m) ou politetrafluoroetano (22,5 mN/m).

Prefere-se particularmente que ambas as camadas adjacentes consistam de um polímero não polar do tipo referido.

A quantidade de polipeptídeo requerida para promoção de adesão usualmente de 0,01 a 1000 mg (miligrama/m2 (metro quadrado)), em particular de 0,01 a 100 mg/m2 e, de forma particularmente preferível, de 0,1 a 10 mg/m2.

O polipeptídeo pode ser aplicado em uma das duas camadas adjacentes e, alternativamente, também pode ser aplicado em ambas as camadas se ambas as camadas já tiverem sido formadas.

O polipeptídeo encontra-se, de preferência, em forma de uma solução aquosa; o teor de polipeptídeo da solução é, de preferência, de 0,01 a 5 partes em peso de polipeptídeo a 100 partes em peso de água. Para o uso de acordo com a invenção, a solução é, de preferência, diluída adicionalmente a uma concentração de 1 a 10 000 ug/ml de água, em particular de 10 a 1000 ug/ml de água.

Portanto, a aplicação pode ser seguida primeiramente por um processo de secagem para remover a água.

Subseqüentemente, as duas camadas adjacentes podem ser ligadas por meio de métodos usuais, por exemplo, por meio de laminação.

O polipeptídeo também pode ser aplicado, em particular, em uma das camadas adjacentes (primeira camada), e, então, na outra camada adjacente (segunda camada) pode ser aplicado aplicando-se uma dispersão de polímero, solução de polímero ou um polímero isento de solvente na primeira camada dotada com o promotor de adesão e, subseqüentemente, formando uma película e/ou cura térmica ou fotoquímica. Para este fim, o polímero em particular encontra-se em forma de uma solução ou dispersão aquosa, de forma particularmente preferível, uma dispersão aquosa de um polímero ememulsão, de preferência, de qualquer um dos polímeros de radical livre listados acima. Após o polímero ter sido aplicado, realiza-se então, se apropriado, um processo de secagem.

O substrato revestido

Substratos são revestidos para vários fins diferentes. Deveria-se mencionar, em particular, revestimentos decorativos ou revestimentos protetores (termo genérico: revestimentos) ou alhures revestimentos adesivos, sendo que é possível que o adesivo seja aplicado tal qual no substrato ou ser ligado ao mesmo, por exemplo, em forma de um artigo autoadesivo (etiqueta ou fita adesiva).

O substrato, ou a superfície do substrato, pode consistir de qualquer material. Da mesma forma, o revestimento da superfície do revestimento que está voltada para o substrato pode consistir de qualquer material.

De preferência, a superfície do substrato superfície ou o revestimento, ou a superfície do revestimento voltada para o substrato, consiste de polímeros naturais ou sintéticos.

Polímeros vantajosos são, em particular, policondensados, como poliésteres, poliadutos, como poliuretanos, poliamidas, policarbonatos ou éteres de polifenileno ou sulfetos de polifenileno ou polímeros obteníveis por meio de polimerização iônica ou de radical livre de compostos etilenicamente insaturados (referidos abreviadamente como polímeros de radical livre).

Com relação à estrutura dos polímeros de radical livre e seu teor de monômero principal, os comentários acima podem aplicar-se.

Os polipeptídeos da invenção são vantajosos, em particular, também como promotores de adesão para polímeros não polares; portanto, pelo menos a superfície do substrato ou a superfície do revestimento voltada para o substrato consiste, de preferência, de um polímero não polar.Com relação ao ângulo de contato como uma medida de polaridade, os comentários acima aplicam-se igualmente.

Prefere-se particularmente que ambos, a superfície do substrato e a superfície do revestimento voltada para o substrato, consistam de um referido polímero não polar.

A quantidade de polipeptídeo requerida para promoção de adesão corresponde à quantidade indicada acima.

O polipeptídeo pode ser aplicado na superfície do substrato, numa superfície do revestimento voltada para o substrato ou em ambas. A aplicação sobre a superfície do revestimento voltada para o substrato é possível se referido revestimento tiver sido pré-formado, i.e. caso se pretenda aplicar uma película simples ou um compósito multi-camadas (ver acima) sobre o substrato.

O polipeptídeo encontra-se, de preferência, em forma de uma solução aquosa; o teor de referida solução é como indicado acima.

Portanto, é possível realizar, após a aplicação, primeiramente um processo de secagem para remover a água.

O revestimento pode ser aplicado no substrato por meio de métodos usuais; por exemplo, películas ou compósitos multi-camadas podem ser aplicados por meio de laminação.

Em particular, o revestimento pode ser preparado por meio de aplicação de uma dispersão de polímero, solução de polímero ou um polímero isento de solvente, sobre a superfície voltada para o substrato dotada com o promotor de adesão e, subseqüentemente, por meio de formação de uma película e/ou cura térmica ou fotoquímica. Para tal fim, o polímero em particular encontra-se em forma de uma solução ou dispersão aquosa, de forma particularmente preferível, uma dispersão aquosa de um polímero em emulsão, de preferência, de qualquer um dos polímeros de radical livre listados acima. Após o polímero ter sido aplicado, realiza-se um processo desecagem, se desejado.

Os compósitos multi-camadas e substratos revestidos da invenção apresentam uma intensidade marcantemente incrementada. Com o uso dos polipeptídeos como promotores de adesão, a adesão do revestimento no substrato é mais forte e a adesão das camadas individuais do compósito multi-camadas entre si é superior.

Em uma concretização preferida adicional da invenção, o substrato é um metal. Em princípio, este pode ser qualquer metal. Exemplos incluem ferro, aço, zinco, estanho, alumínio, cobre e ligas de referidos metais entre si e com outros metais. Eles podem ser, em particular, aço, aço revestido com zinco, ligas de zinco, alumínio ou ligas de alumínio. Prefere-se particularmente zinco ou ligas de zinco ou substratos com os mesmos, como, por exemplo, aço galvanizado.

Ligas de Zn ou Al são conhecidas pela pessoa versada na arte. A pessoa versada na arte seleciona o tipo e a quantidade de componentes de liga dependendo da finalidade de aplicação desejada. Componentes típicos de ligas de zinco incluem, em particular, Al, Pb, Si, Mg, Sn, Cu ou Cd. Componentes típicos de ligas de alumínio incluem, em particular, Mg, Mn, Si, Zn, Cr, Zr, Cu ou Ti. As ligas também pode ser ligas de Al/Zn que compreendem aproximadamente a mesma quantidade de Al e Zn. Aço revestido com ligas deste tipo é comercialmente obtenível.

Os metais podem ter qualquer forma, preferindo-se, contudo, folhas de metal, tiras de metal ou folhas de metal. O metal também pode ser um material composto com uma superfície metálica. Ele pode ser, por exemplo, um composto de uma película de polímero e um metal.

As superfícies metálicas serão revestidas com os polipeptídeos a serem usados de acordo com a invenção, de preferência, com hidrofobinas, como promotores de adesão. Isto pode ser realizado usando-se soluções aquosas de referidos polipeptídeos. Detalhes do processo de revestimento jáforam mencionados acima.

O revestimento pode compreender, em particular, tintas típicas ou sistemas de tintas para revestimento de superfícies metálicas. Elas podem ser tintas curadas termicamente, fotoquimicamente ou por meio de outros mecanismos.

Tintas típicas para revestimento de superfícies de metal compreendem pelo menos um ligante e também componentes reticuláveis. Os componentes reticuláveis podem ser reticuladores que são empregados adicionalmente a um ligante, ou eles podem ser grupos reticuláveis ligados ao ligante. O ligante pode apresentar, evidentemente, grupos reticuláveis e é possível empregar adicionalmente um reticulante. Neste caso, pode-se conceber várias combinações possíveis. Por exemplo, ligantes e reticuladores podem ser empregados separadamente um do outro. Neste caso, o ligante compreende grupos funcionais reativos que podem reagir com grupos funcionais reativos complementares nos reticuladores. Uma alternativa compreende ligantes auto-reticulantes que compreendem grupos funcionais reativos capazes de sofrer reações de reticulação com grupos de seu tipo ("entre si") ou com grupos funcionais reativos complementares no mesmo polímero. É possível que os reticuladores reajam exclusivamente entre si.

Exemplos de ligantes vantajosos compreendem (co)polímeros de (met)acrilato, ésteres de polivinila parcialmente hidrolisados, poliésteres, resinas alquídicas, polilactonas, policarbonatos, poliéteres, produtos de adição química de amina - resina de epóxido, poliuréias, poliamidas, poliimidas ou poliuretanos. Evidentemente também é possível usar misturas de vários polímeros, desde que referida mistura não produza quaisquer efeitos indesejados.

Os componentes reticuladores podem apresentar grupos de reticulação térmica, ou grupos de reticulação fotoquímica. Exemplos de reticuladores térmicos vantajosos compreendem reticuladores baseados emepóxidos, em melarnina ou em isocianatos de blocos. Reticuladores vantajosos para reticulação fotoquímica compreendem, em particular, compostos apresentando múltiplos grupos etilenicamente insaturados, em particular acrilatos di- ou polifuncionais.

O uso de acordo com a invenção de polipeptídeos, de preferência, de hidrofobinas, melhora de maneira vatnajosa a adesão da tinta sobre o substrato. Também é possível obter uma resistência aperfeiçoada da camada de tinta ao enrugamento em testes de anticorrosão.

Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar a invenção de maneira mais detalhada:

Parte A) Preparação de hidrofobinas

Exemplo 1

Trabalho preliminar para a clonagem de yaad-His6 / yaaE-HiSô Realizou-se uma reação em cadeia de polimerase com o auxílio dos oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal 573). O DNA modelo usado foi DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis. O fragmento de PCR obtido compreendeu a seqüência codificante do gene de Bacillus subtilis yaaD / yaaE e, em suas pontas, em cada caso, um sítio de clivagem de restrição Ncol e, respectivamente, BglII. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com as endonucleases de restrição Ncol e BglII. Este fragmento de DNA foi usado como inserto e clonado no vetor pQE60 da Qiagen, que havia sido previamente linearizado com as endonucleases de restrição Ncol e BglII. Os vetores assim obtidos, pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5, podem ser usados para expressar proteínas que consistem de YAAD::HIS6 e YAAE::HTS6, respectivamente.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattccExemplo 2

Clonagem de hidrofobina yaad DewA-His6

Realizou-se uma reação em cadeia de polimerase com o oligonucleotídeo KaM 416 e KaM 417. O DNA modelo usado foi DNA genômico do mofo Aspergillus nidulans. O fragmento de PCR obtido compreendeu a seqüência codificante do gene de hidrofobina dewA e um sítio de clivagem de proteinase de fator Xa N-terminal. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com a endonuclease de restrição BamHL Este fragmento de DNA foi usado como inserto e clonada no vetor pQE60YAAD#2 previamente linearizado com a endonuclease de restrição BglIL

O vetor assim obtido, #508, pode ser usado para expressar uma proteína de fusão que consiste de YAAD::Xa::dewA::HIS6. KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTC TCCGTCTCCGC

Exemplo 3

Clonagem de hidrofobina de yaad RodA-His6

O plasmídeo #513 foi clonado analogamente ao plasmídeo

#508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATT

GCTGC

KaM43 5: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Exemplo 4

Clonagem de hidrofobina de yaad BASF1-His6 O plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418. O DNA modelo empregado foi uma seqüência de DNA sintetizada artificialmente -hidrofobina BASF1 - (ver Apêndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Exemplo 5

Clonagem da hidrofobina de yaad BASF2-HÍS6O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418. O DNA modeloempregado foi uma seqüência de DNA sintetizada artificialmente -hidrofobina BASF2 (ver apêndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Exemplo 6

Clonagem da hidrofobina de yaad SC3-HÍS6O plasmídeo #526 foi clonada analogamente ao plasmídeo#508, usando-se os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465. O DNA modeloempregado foi cDNA de Schyzophyllum commune (ver apêndice).KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Exemplo 7

Fermentação da hidrofobina de yaad DewA-His6 de cepa de E.coli recombinante

Inoculação de 3 ml de meio LB líquido com uma cepa de E.coli expressando hidrofobina de yaad DewA-His6 em tubos Greiner de 15 ml.Incubação a 37°C em um agitador a 200 rpm a 37°C durante 8 h. Em cadacaso, 2 frascos de Erlenmeyer com volume de 1 1 com defletores e 250 ml demeio LB (+ 100 ug/ml de ampicilina) são inoculados com 1 ml de pré-culturae incubados em um agitador a 180 rpm a 37°C durante 9 h. Inocular 13,5 1 demeio LM (+100 ug/ml de ampicilina) com 0,5 1 de pré-cultura (OD60onm LIOmedida contra H2Q) em um fermentador de 20 1. A adição de 140 ml de 100mM de IPTG a uma OD6onm de ~3,5. Após 3 h, resfiiar o fermentador a 10°Ce remover o caldo de fermentação por meio de centrifugação. Usar pelota decélulas para purificação adicional.

Exemplo 8

Purificação da proteína de fusão de hidrofobina recombinante(purificação de proteínas de fusão de hidrofobina apresentando um marcadorHisó C-terminal)

100 g de pelota de células (100 - 500 mg de hidrofobina) sãoconstituídos com 50 mM de tamponador de fosfato de sódio, pH 7,5, a umvolume total de 200 ml e ressuspensos. A suspensão é tratada com umUltraturrax tipo T25 (Janke e Kunkel; DCA-Labortechnik) durante 10 minutose subseqüentemente, para os fins de degradar os ácidos nucleicos, incubadacom 500 unidades de benzonase (Merck, Darmstadt; número de ordem1,01697,0001) à temperatura ambiente durante 1 hora. Antes da disrupção decélulas, realiza-se uma filtração usando-se um cartucho de vidro (PI). Paradisromper as células e compartilhar o DNA genômico remanescente, realiza-se duas operações no homogeneizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH;Microfluidics Corp.). O homogeneizado é centrifugado (Sorvall RC-5B, GSARotor, béquer de centrifugação de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm,23.000 g), o sobrenadante é colocado sore gelo e o pelota é resuspenso em100 ml de tamponador de fosfato de sódio, pH 7,5. Centrifugação eressuspensão são repetidas três vezes, o tamponador de fosfato de sódiocompreendendo 1 % de SDS na terceira repetição. Após ressuspensão, asolução é agitada durante uma hora, seguida de uma centrifugação final(Sorvall RC-5B, GSA Rotor, béquer de centrifugação de 250 ml, 60 minutos,4°C, 12.000 rpm, 23.000 g). De acordo com análise SDS-PAGE, ahidrofobina está presente no sobrenadante após a centrifugação final (Figura1).

Os experimentos mostram que a hidrofobina está presente nascélulas de E. coli correspondentes, provavelmente em forma de corpos deinclusão. Aplicou-se 50 ml do sobrenadante compreendendo hidrofobina emuma coluna de 50 ml de níquel-Sepharose High Performance 17-5268-02(Amersham) equilibrada com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0. Acoluna é lavada com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0, e ahidrofobina é eluída subseqüentemente com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0, compreendendo 200 mM de imidazol. Com o objetivo de removero imidazol, a solução é dialisada contra 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH8,0.

A Figura 1 ilustra a purificação da hidrofobina preparada:Faixa 1: solução aplicada em coluna de níquel-Sepharose(diluição de 1:10)

Faixa 2: perfluxo = eluado da etapa de lavagem

Faixas de 3-5: picos de OD 280 de frações de eluição

A hidrofobina da Figura 1 apresenta um peso molecular deaprox. 53 kD. Algumas das faixas menores representam produtos dedegradação de hidrofobina.

Exemplo 9

Teste de desempenho; caracterização da hidrofobina por meiode alteração do ângulo de contato de uma gotícula de água sobre vidro.

Substrato:

Vidro (vidro de janela, Süddeutsche Glas, Mannheim,Alemanha):

Concentração de hidrofobina: 100 ug/ml

Incubação de lâminas de vidro de um dia para o outrotemperatura 80°C) em 50 mM de acetato de sódio pH 4 + 0,1 % Tween 20,seguida de revestimento, lavagem em água destilada seguida de incubação: 10min / 80°C / 1 % de solução de SDS em água destiladalavagem em água destiladaAs amostras são secadas ao ar e determina-se o ângulo decontato (em graus) de um gotícula de 5 ul de água.

O ângulo de contato foi medido em um instrumento do sistemaDataphysics de ângulo de contato OCA 15+, programa SCA 20.2.0.(novembro de 2002). A medição foi realizada de acordo com as instruções dofabricante.

Vidro não-tratado resultou em um ângulo de contato de 30 ±5o; um revestimento com a hidrofobina funcional de acordo com Exemplo 8(yaad-dewA-his6) resultou em ângulos de contato de 75 ± 5o.

Parte B) O uso de polipeptídeos como promotores de adesão

Exemplo 10

Substrato de polietileno

Materiais usados:

Solução usada:

Empregou-se uma solução da proteína de fusão preparada deacordo com Exemplo 8, yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19), em água, nosexperimentos de desempenho. Concentração de hidrofobina em solução: 100ug/ml (0,01 % em peso).

Substrato: Corpos modelados (placas pequenas) de polietileno

Revestimento:

Uma película de poliéster foi revestida com Acronal A 240,uma dispersão aquosa de poliacrilato comercial da BASF para adesivossensíveis a pressão, e secada e cortada em tiras com largura de 2,5 cm. Astiras adesivas obtidas foram usadas para revestimento das plaquetas de PE.

Procedimento:

A solução de polipeptídeo foi aplicada sobre placas depolietileno e secada (placas de polietileno pré-tratadas).

Em seguida, tiras adesivas foram ligadas a placas depolietileno pré-tratadas e, para comparação, a placas de polietileno não-tratadas, e determinou-se a força necessária para remover as tiras adesivas(resistência ao descascamento em N)

Resistência ao descascamento com polipeptídeo comopromotor de adesão: 4,7 N

Resistência ao descascamento sem polipeptídeo comopromotor de adesão: 2,6 N

Exemplo 11

Substratos metálicos

Empregou-se uma solução da proteína de fusão preparada deacordo com Exemplo 8, yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19), em água nosexperimentos de desempenho. Concentração de hidrofobina em solução: 100|i.g/ml (0,01 % em peso). Qualquer informação relativa ao pH? Se este últimofor de 8 a 8,5, se não se houver adicionado tamponador adicional?

As folhas de teste a seguir foram usadas como substratosmetálicos:

<table>table see original document page 32</column></row><table>

A tinta usada foi um revestimento de topo cozido à base de demelamina alquídica. (Isto caracteriza suficientemente a tinta ?)Descrição experimental

As folhas de alumínio foram limpadas em um banho deimersão de limpeza alcalina (60 g/l de NaOH, 60°C, 1 min) e enxaguadas comágua destilada. As folhas foram então descarnadas em um banho dedescamamento ácido com HN03/H20 (1:1) à temperatura ambiente durante15 segundos, enxaguadas com água destilada e secadas a seco com arpressurizado.

As folhas de aço galvanizado e as folhas de aço foramenxaguadas com água de rio quente, subseqüentemente enxaguadas com águadestilada e secadas a seco com ar pressurizado.

As folhas foram revestidas com as hidrofobinas por meio deimersão destas últimas na solução previamente indicada, em cada caso àtemperatura ambiente. As folhas de alumínio foram imersas durante 16 h, asfolhas de aço galvanizado e as folhas de aço foram imersas durante 4 h. Asfolhas foram enxaguadas em seguida com água destilada e secadas com arpressurizado.

Após revestimento com a hidrofobina como promotor deadesão, as lâminas foram imersas em um revestimento de topo cozido à basede melamina alquídica em uma bacia plástica durante 15 s e pré-secadas ao ardurante aprox. 1 h. Isto foi seguido de secagem em uma estufa de secagem a190°C durante 30 min, e cura.

Para comparação, preparou-se em cada caso uma amostraadicional da mesma maneira com a tinta, mas sem o promotor de adesão dehidrofobina.

Teste de desempenho

O desempenho das folhas foi avaliado com EN ISO 2409(corte transversal), EN ISO 4628-8 (enrugamento) e DIN 53156 {cupping de Erichsen).

O teste de corte transversal avalia o aspecto da superfície datinta com base em padrões predeterminados, após se ter introduzido um cortetransversal em referida superfície. Isto envolve a avaliação da extensão emque a tinta descarna da superfície devido à realização do corte transversal. Aavaliação é realizada de maneira conhecida com o auxílio de classes de 0 a 5, sendo que 0 é a melhor e 5 é a pior classificação.

O enrugamento da camada de tinta é determinada por meio deum teste de corrosão padrão (exposição na câmara de pulverização de sal (SSDIN 50021)) realizado nas folhas. O enrugamento das folhas de alumínio foiavaliada após 298 h, o das folhas de aço foi avaliada após 50 h e a das folhasde aço galvanizado foi avaliada após 190 h, em cada caso com base empadrões predeflnidos e usando-se graus de 0 a 5, sendo que 0 é a melhor e 5 éa pior classificação.

O cupping de Erichsen compreende prensar uma esfera contraa parte posterior da amostra e realizar uma depressão. O aspecto da tinta namarca é avaliado com base em padrões predeflnidos, sendo que, neste caso, 5é a melhor, e 0 é a pior classificação.

Os resultados dos testes de desempenho encontram-seresumidos abaixo.

Exemplo 11-1: Substrato de aço

■ Corte transversal

■ Enrugamento

hidrofobinas

sem comhidrofobinas hidrofobinas

O uso de uma hidrofobina como promotor de adesão não alterao enrugamento (grau 5) em comparação com uma amostra sem hidrofobina. Oteste de corte transversal (valor mais baixo) e o teste de cupping de Erichsen(valor mais elevado) dão, em cada caso, um resultado superior.

Exemplo 11-2: Substrato de aço galvanizado<image>image see original document page 35</image>

O uso de hidrofobinas como promotores de adesão sobre açogalvanizado produz valores que são, em todos os três casos, superioresàqueles sem promotor de adesão (valores inferiores para corte transversal eenrugamento, e valor mais elevado para cupping de Erichsen). Oaperfeiçoamento mais claro é obtido na integridade à proteção contra corrosão(enrugamento) (grau 1 com promotor de adesão, em contraste a grau 4 sempromotor de adesão).

Exemplo 11-3: Substrato de alumínio

<image>image see original document page 35</image>No caso de um substrato de alumínio, corte e transversal eenrugamento são bons até mesmo sem promotor de adesão. O cupping deErichsen resulta em um aperfeiçoamento ainda mais ligeiro.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Aktiengesellschaft

<120> PREPARAÇÃO RECOMBINANTE DE HIDROFOBINAS<130> AE 20040837

<160> 24

<170> Patentln versão 3.1<210> 1<211> 405

<212> DNA<213> basf-dewA<220>

<221> CDS

<222> (1)..(405)

<223>

<400> 1

atg cgc ttc ate gtc tet etc etc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48Met Arg Phe Ile Vai Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala15 10 15

acc gcc etc ceg gcc tet gcc gea aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30

gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 14 4

Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Vai Gly Ser35 40 45

ate gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60

age ggt ctg etc ggt gct ggc ctt etc aac ggg etc tcg ggc aac act 240Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80

ggc age gcc tgc gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg etc 288

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95

gct etc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc 336

Ala Leu Vai Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Vai Cys Lys Asn Ile Vai

100 105 110

gct tgc tgc cet gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Vai Ala Vai Asp Asn Ala115 120 125ggc gct ggt acc aag gct gag 4 05

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> basf-dewA

<400> 2

Met Arg Phe lie Vai Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala15 10 15

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30

Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Vai Gly Ser35 40 45

lie Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60

Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu lie Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95

Ala Leu Vai Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Vai Cys Lys Asn lie Vai100 105 110

Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Vai Ala Vai Asp Asn Ala115 120 125

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135

<210> 3

<211> 471

<212> DNA

<213> basf-rodA

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(471)

<223>

<400> 3

atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48Met Lys Phe Ser lie Ala Ala Ala Vai Vai Ala Phe Ala Ala Ser Vai15 10 15

gcg gcc etc cet cet gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Vai20 25 30

ggc aac aag ggc aac age aac gtc aag ttc cet gtc cec gaa aac gtg 14 4

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Vai Lys Phe Pro Vai Pro Glu Asn Vai35 40 45

acc gtc aag cag gcc tec gac aag tgc ggt gac cag gcc cag etc tet 192Thr Vai Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser50 55 60

tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Vai Asp Glu65 70 75 80

ggt ctt ctg tet ggt gcc etc age ggc etc ate ggc gcc ggg tet ggt 288Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu lie Gly Ala Gly Ser Gly85 90 95

gcc gaa ggt ctt ggt etc ttc gat cag tgc tec aag ctt gat gtt gct 336Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Vai Ala100 105 110

gtc etc att ggc ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384Vai Leu lie Gly lie Gln Asp Leu Vai Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125

att gcc tgc tgc cag aac tec cec tec age gcg gat ggc aac ctt att 432lie Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu lie130 135 140

ggt gtc ggt etc cet tgc gtt gcc ctt ggc tec ate etc 471Gly Vai Gly Leu Pro Cys Vai Ala Leu Gly Ser lie Leu145 150 155

<210> 4

<211> 157

<212> PRT

<213> basf-rodA

<400> 4

Met Lys Phe Ser lie Ala Ala Ala Vai Vai Ala Phe Ala Ala Ser Vai15 10 15

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Vai20 25 30

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Vai Lys Phe Pro Vai Pro Glu Asn Vai35 40 45

Thr Vai Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser50 55 60

Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Vai Asp Glu65 70 75 80

Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu lie Gly Ala Gly Ser Gly85 90 95Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Vai Ala100 105 110

Vai Leu lie Gly lie Gln Asp Leu Vai Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125

lie Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu lie130 135 140

Gly Vai Gly Leu Pro Cys Vai Ala Leu Gly Ser lie Leu145 150 155

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> basf-HypA

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<223>

<400> 5

atg ate tet cgc gtc ctt gtc gct gct etc gtc gct etc cec gct ctt 48Met lie Ser Arg Vai Leu Vai Ala Ala Leu Vai Ala Leu Pro Ala Leu15 10 15

gtt act gea act cet gct cec gga aag cet aaa gcc age agt cag tgc 96Vai Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys20 25 30

gac gtc ggt gaa ate cat tgc tgt gac act cag cag act cec gac cac 144Asp Vai Gly Glu lie His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His35 40 45

acc age gcc gcc gcg tet ggt ttg ctt ggt gtt cec ate aac ctt ggt 192Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Vai Pro lie Asn Leu Gly50 55 60

gct ttc etc ggt ttc gac tgt acc cec att tec gtc ctt ggc gtc ggt 240Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro lie Ser Vai Leu Gly Vai Gly65 70 75 80

ggc aac aac tgt gct gct cag cet gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Vai Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe85 90 95

acc gea ttg att aac gct ctt gac tgc tet cet gtc aat gtc aac etc 336Thr Ala Leu lie Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Vai Asn Vai Asn Leu100 105 110

<210> 6<211> 112

<212> PRT<213> basf-HypA<400> 6

Met lie Ser Arg Vai Leu Vai Ala Ala Leu Vai Ala Leu Pro Ala Leu15 10 15

Vai Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys20 25 30

Asp Vai Gly Glu lie His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His35 40 45

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Vai Pro lie Asn Leu Gly50 55 60

Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro lie Ser Vai Leu Gly Vai Gly65 70 75 80

Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Vai Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe85 90 95

Thr Ala Leu lie Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Vai Asn Vai Asn Leu100 105 110

<210> 7<211> 357<212> DNA<213> basf-HypB<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (357)

<223>

<400> 7

atg gtc age acg ttc ate act gtc gea aag acc ctt etc gtc gcg etc 48Met Vai Ser Thr Phe lie Thr Vai Ala Lys Thr Leu Leu Vai Ala Leu15 10 15

etc ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gea act acc ggc aag 96Leu Phe Vai Asn lie Asn lie Vai Vai Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys20 25 30

cat tgt age acc ggt cet ate gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tet 144His Cys Ser Thr Gly Pro lie Glu Cys Cys Lys Gln Vai Met Asp Ser35 40 45

aag age cet cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60

ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc age cet 240Gly Vai Leu Ala Gly Vai Lys Gly Leu Vai Gly Ala Asn Cys Ser Pro65 70 75 80

ate acg gea att ggt att ggc tec ggc age caa tgc tet ggc cag acc 288lie Thr Ala lie Gly lie Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr85 90 95

gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336Vai Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Vai Vai Ala lie Gly Cys100 105 110

act ccc att aat gcc aat gtg 357Thr Pro lie Asn Ala Asn Vai115

<210> 8<211> 119<212> PRT<213> basf-HypB<400> 8

Met Vai Ser Thr Phe lie Thr Vai Ala Lys Thr Leu Leu Vai Ala Leu15 10 15

Leu Phe Vai Asn lie Asn lie Vai Vai Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys20 25 30

His Cys Ser Thr Gly Pro lie Glu Cys Cys Lys Gln Vai Met Asp Ser35 40 45

Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60

Gly Vai Leu Ala Gly Vai Lys Gly Leu Vai Gly Ala Asn Cys Ser Pro65 70 75 80

lie Thr Ala lie Gly lie Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr85 90 95

Vai Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Vai Vai Ala lie Gly Cys100 ' 105 110

Thr Pro lie Asn Ala Asn Vai115

<210> 9<211> 408<212> DNA<213> basf-sc3<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (408)

<223>

<400> 9atg ttc gcc

cgt etc ccc gtc gtg ttc etc tac gcc ttc gtc gcg ttc 48Met Phe Ala Arg Leu Pro Vai Vai Phe Leu Tyr Ala Phe Vai Ala Phe15 10 15

ggc gcc etc gtc gct gcc etc cca ggt ggc cac ceg ggc acg acc acg 96Gly Ala Leu Vai Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr20 25 30

ceg ceg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ceg cec tcg acg acg 144Pro Pro Vai Thr Thr Thr Vai Thr Vai Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr35 40 45

acc ate gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg etc tet tgc tgc 192Thr lie Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys50 55 60

aac cag gtt caa tcg gcg age age age cet gtt acc gcc etc etc ggc 240Asn Gln Vai Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Vai Thr Ala Leu Leu Gly65 70 75 80

ctg etc ggc att gtc etc age gac etc aac gtt etc gtt ggc ate age 288Leu Leu Gly lie Vai Leu Ser Asp Leu Asn Vai Leu Vai Gly lie Ser85 90 95

tgc tet cec etc act gtc ate ggt gtc gga ggc age ggc tgt tcg gcg 336Cys Ser Pro Leu Thr Vai lie Gly Vai Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala100 105 110

cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg ate aac ate 384Gln Thr Vai Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu lie Asn lie115 120 125

ggt tgc acc cec ate aac ate etc 408Gly Cys Thr Pro lie Asn lie Leu130 135

<210> 10

<211> 136

<212> PRT

<213> basf-sc3

<400> 10

Met Phe Ala Arg Leu Pro Vai Vai Phe Leu Tyr Ala Phe Vai Ala Phe15 10 15

Gly Ala Leu Vai Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr20 25 30

Pro Pro Vai Thr Thr Thr Vai Thr Vai Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr35 40 45

Thr lie Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys50 55 60

Asn Gln Vai Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Vai Thr Ala Leu Leu Gly65 70 75 80

Leu Leu Gly lie Vai Leu Ser Asp Leu Asn Vai Leu Vai Gly lie Ser85 90 95Cys Ser Pro Leu Thr Vai Ile Gly Vai Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala100 105 110

Gln Thr Vai Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile115 120 125

Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu130 135

<210> 11

<211> 483

<212> DNA

<213> basf-BASFl

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(483)

<223>

<400> 11

atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc etc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48Met Lys Phe Ser Vai Ser Ala Ala Vai Leu Ala Phe Ala Ala Ser Vai15 10 15

gcc gcc etc cet cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Vai20 25 30

ggc aac aag ttc cet gtc cet gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144Gly Asn Lys Phe Pro Vai Pro Asp Asp Vai Thr Vai Lys Gln Ala Thr35 40 45

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tac gcc ggc gac gtc etc acc gac ate gac gag ggc ate etc gcc ggc 240Tyr Ala Gly Asp Vai Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly65 70 75 80

etc etc aag aac etc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc etc ggc 288Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly85 90 95

etc ttc gac cag tgc gtc aag etc gac etc cag ate tcc gtc ate ggc 336Leu Phe Asp Gln Cys Vai Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Vai Ile Gly100 105 110

ate cet ate cag gac etc etc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Vai Asn Lys Gln Cys Lys Gln115 120 125

aac ate gcc tgc tgc cag aac tcc cet tcc gac gcc acc ggc tcc etc 432Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu130 135 140

gtc aac etc ggc etc ggc aac cet tgc ate cet gtc tcc etc etc cat 480Vai Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys lie Pro Vai Ser Leu Leu His145 150 155 160

atg 483Met

<210> 12

<211> 161

<212> PRT

<213> basf-BASFl

<400> 12

Met Lys Phe1

Ser Vai Ser Ala Ala Vai Leu Ala Phe Ala Ala Ser Vai5 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Vai20 25 30

Gly Asn Lys35

Asp Lys Cys50

Tyr Ala Gly65

Leu Leu LysLeu Phe Asp

lie Pro lie115

Asn lie Ala130

Vai Asn Leu145

Phe Pro Vai Pro Asp Asp Vai Thr Vai Lys Gln Ala Thr40 45

Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr55 60

Asp Vai Leu Thr Asp lie Asp Glu Gly lie Leu Ala Gly70 75 80

Asn Leu lie Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly85 90 95

Gln Cys Vai Lys Leu Asp Leu Gln lie Ser Vai lie Gly100 105 110

Gln Asp Leu Leu Asn Gln Vai Asn Lys Gln Cys Lys Gln120 125

Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu135 140

Gly Leu Gly Asn Pro Cys lie Pro Vai Ser Leu Leu His150 155 160

Met

<210> 13

<211> 465

<212> DNA

<213> basf-BASF2

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(465)<223><400> 13

tac gcc ggc gac gtc acc gac ate gac gag ggc ate etc gcc ggc etc 240Tyr Ala Gly Asp Vai Thr Asp lie Asp Glu Gly lie Leu Ala Gly Leu65 70 75 80

etc aag aac etc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc etc ggc etc 288Leu Lys Asn Leu lie Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu85 . 90 95

ttc gac cag tgc gtc aag etc gac etc cag ate tcc gtc ate ggc ate 336Phe Asp Gln Cys Vai Lys Leu Asp Leu Gln lie Ser Vai lie Gly lie100 105 110

cet ate cag gac etc etc aac cag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 384Pro lie Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn lie Ala Cys115 120 125

tgc cag aac tcc cet tcc gac gcc acc ggc tcc etc gtc aac etc ggc 432Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Vai Asn Leu Gly130 135 140

aac cet tgc ate cet gtc tcc etc etc cat atg 4 65

Asn Pro Cys lie Pro Vai Ser Leu Leu His Met145 150 155

<210> 14

<211> 155

<212> PRT

<213> basf-BASF2

<400> 14

Met Lys Phe Ser Vai Ser Ala Ala Vai Leu Ala Phe Ala Ala Ser Vai15 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Vai20 25 30

Gly Asn Lys Phe Pro Vai Pro Asp Asp Vai Thr Vai Lys Gln Ala Thr35 40 45Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr50 55 60

Tyr Ala Gly Asp Vai Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu65 70 75 80

Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu85 90 95

Phe Asp Gln Cys Vai Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Vai Ile Gly Ile100 105 110

Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys115 120 125

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Vai Asn Leu Gly130 135 140

Asn Pro Cys Ile Pro Vai Ser Leu Leu His Met145 150 155

<210> 15

<211> 882

<212> DNA

<213> basf-yaad

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (882)

<223>

<400> 15

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Vai Lys Arg Gly Met Ala Glu Met15 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96Gln Lys Gly Gly Vai Ile Met Asp Vai Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Vai Ala Vai Met Ala Leu Glu Arg Vai35 40 45

cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Vai Ala Arg Met Ala Asp Pro50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ceg gta atg gca 240Thr Ile Vai Glu Glu Vai Met Asn Ala Vai Ser Ile Pro Vai Met Ala65 70 75 80

aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Vai Glu Ala Arg Vai Leu Glu Ala Met85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ceg gct gac gaa 336Gly Vai Asp Tyr lie Asp Glu Ser Glu Vai Leu Thr Pro Ala Asp Glu100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Vai Pro Phe Vai Cys Gly115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg lie Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 4 80

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn lie Vai Glu Ala145 150 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528Vai Arg His Met Arg Lys Vai Asn Ala Gln Vai Arg Lys Vai Vai Ala165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624Tyr Glu Leu Leu Leu Gln lie Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Vai Vai195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct etc atg 672Asn Phe Ala Ala Gly Gly Vai Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Vai Phe Vai Gly Ser Gly lie Phe Lys225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala lie Vai Glu Ala Thr Thr245 250 255

cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu lie Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly260 265 270

act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864Thr Ala Met Lys Gly lie Glu lie Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285

atg caa gaa cgc ggc tgg 882Met Gln Glu Arg Gly Trp290

<210> 16

<211> 294

<212> PRT

<213> basf-yaad

<400> 16

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Vai Lys Arg Gly Met Ala Glu Met15 10 15Gln Lys Gly Gly Vai lie Met Asp Vai lie Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

lie Ala Glu Glu Ala Gly Ala Vai Ala Vai Met Ala Leu Glu Arg Vai35 40 45

Pro Ala Asp lie Arg Ala Ala Gly Gly Vai Ala Arg Met Ala Asp Pro50 55 60

Thr lie Vai Glu Glu Vai Met Asn Ala Vai Ser lie Pro Vai Met Ala65 70 75 80

Lys Ala Arg lie Gly His lie Vai Glu Ala Arg Vai Leu Glu Ala Met85 90 95

Gly Vai Asp Tyr lie Asp Glu Ser Glu Vai Leu Thr Pro Ala Asp Glu100 105 110

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Vai Pro Phe Vai Cys Gly115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg lie Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn lie Vai Glu Ala145 150 155 160

Vai Arg His Met Arg Lys Vai Asn Ala Gln Vai Arg Lys Vai Vai Ala165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190 -

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln lie Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Vai Vai195 200 205

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Vai Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

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<210> 17

<211> 591

<212> DNA

<213> basf-yaae<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (591)

<223>

<400> 17

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576

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<210> 19

<211> 1329

<212> DNA

<213> basf-yaad-Xa-dewA-his<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1329)

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<221> CDS

<222> (1) .. (1407)

<223>

<400> 23

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Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg lie Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn lie Vai Glu Ala145 150 155 160

Vai Arg His Met Arg Lys Vai Asn Ala Gln Vai Arg Lys Vai Vai Ala165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln lie Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Vai Vai195 200 205Asn Phe Ala Ala Gly Gly Vai Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Vai Phe Vai Gly Ser Gly lie Phe Lys225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala lie Vai Glu Ala Thr Thr245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu lie Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly lie Glu lie Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser lie Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser290 295 300

Vai Ser Ala Ala Vai Leu Ala Phe Ala Ala Ser Vai Ala Ala Leu Pro305 310 315 320

Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Vai Gly Asn Lys Phe325 330 335

Pro Vai Pro Asp Asp Vai Thr Vai Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly340 345 350

Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp355 360 365

Vai Leu Thr Asp lie Asp Glu Gly lie Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn370 375 380

Leu lie Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln385 390 395 400

Cys Vai Lys Leu Asp Leu Gln lie Ser Vai lie Gly lie Pro lie Gln405 410 415

Asp Leu Leu Asn Gln Vai Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn lie Ala Cys420 425 430

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Vai Asn Leu Gly435 440 445

Leu Gly Asn Pro Cys lie Pro Vai Ser Leu Leu His Met Gly Ser His450 455 460

His His His His His465

Claims

1. Compósito multi-camadas ou substrato revestido,caracterizado pelo fato de que compreende compostos de que pelo menos 40% em peso se constituem de aminoácidos alfa ligados via ligações peptídicas(referidos abaixo abreviadamente como polipeptídeo) como promotores deadesão entre pelo menos duas camadas adjacentes do composto ou entre orevestimento e o substrato.

2. Compósito multi-camadas ou substrato revestido de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 80 % empeso dos polipeptídeos consistem de aminoácidos alfa.

3. Compósito multi-camadas ou substrato revestido de acordocom a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeoscompreendem cisteína como um componente.

4. Compósito multi-camadas ou substrato revestido de acordocom qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de queos polipeptídeos consistem de pelo menos 0,5 % em peso de cisteína.

5. Compósito multi-camadas ou substrato revestido de acordocom a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeossão hidrofobinas da fórmula <formula>formula see original document page 63</formula>sendo que X pode, em cada caso, ser idêntico ou diferente epode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente ocorrentes (Phe, Leu,Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp,Glu, Gly), os índices próximos a X indicam em cada caso o número deaminoácidos, e C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina,sendo que pelo menos quatro dos radicais indicados como C são cisteína, e,adicionalmente, os índices nem são, independentemente um do outro, outrosnúmeros naturais de 0 e 500, de preferência, de 15 a 300.

6. Compósito multi-camadas de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dascamadas adjacentes consiste de um polímero natural ou sintético.

7. Compósito multi-camadas de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dascamadas adjacentes consiste de um polímero sintético (não polar)apresentando um tensão superficial inferior a 50 mN/m.

8. Compósito multi-camadas de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que ambas as camadasadjacentes consistem de um polímero natural ou sintético.

9. Compósito multi-camadas ou substrato revestido de acordocom qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de queuma das camadas consiste de um metal ou de uma liga.

10. Compósito multi-camadas de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a camada adjacente é uma camada de tinta.

11. Compósito multi-camadas de acordo com a reivindicação 9ou 10, caracterizado pelo fato de que o metal é selecionado do grupo queconsiste de aço, aço revestido com zinco, ligas de zinco, alumínio ou ligas dealumínio, ou é alumínio ou ligas de alumínio.

12. Processo para a preparação do compósito multi-camadas,caracterizado pelo fato de que- o polipeptídeo é aplicado em uma das camadas adjacentes,realiza-se um procedimento de secagem, se desejado,quando o polipeptídeo foi aplicado na forma de uma solução aquosa, ea outra camada adjacente é laminada subseqüentementesobre, ou é preparada por meio de formação de uma película de um polímeronatural ou sintético.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o polímero natural ou sintético da outra camada encontra-sena forma de uma dispersão ou solução aquosa e realiza-se um procedimentode secagem após a formação da película.

14. Substrato revestido de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a superfície dosubstrato ou a superfície do revestimento voltada para o substrato consiste de um polímero natural ou sintético.

15. Substrato revestido de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5 ou 14, caracterizado pelo fato de que a superfície dosubstrato ou a superfície do revestimento voltada para o substrato consiste deum polímero sintético (não-polar) apresentando uma tensão superficial inferior a 50 mN/m.

16. Substrato revestido de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a superfíciedo substrato ou a superfície do revestimento voltada para o substrato consistede um polímero natural ou sintético.

17. Processo para preparação do substrato revestido comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 14 a 16,caracterizado pelo fato de que- o polipeptídeo é aplicado na superfície do substrato ou nasuperfície do agente de revestimento voltada para o substrato,- realiza-se um procedimento de secagem, se desejado,quando o polipeptídeo foi aplicado em forma de uma solução aquosa, e- o agente de revestimento é aplicado subseqüentementeno substrato.

18. Processo para preparação do substrato revestido de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de queo polipeptídeo é aplicado na superfície do substrato,- realiza-se um procedimento de secagem, se desejado,quando o polipeptídeo foi aplicado em forma de uma solução aquosa, eo revestimento é preparado subseqüentemente por meio deformação de uma película de um polímero natural ou sintético sobre asuperfície do substrato.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o polímero natural ou sintético encontra-se em forma de umadispersão ou solução aquosa e realiza-se um procedimento de secagem após aformação da película.

20. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 19,caracterizado pelo fato de que a dispersão ou solução aquosa é uma dispersãoaquosa de um polímero em emulsão.

21. Uso de compostos de que pelo menos 40 % em pesoconstituem-se de aminoácidos alfa ligados via ligações peptídicas (referidoabreviadamente como polipeptídeo), caracterizado pelo fato de que é comopromotores de adesão entre pelo menos duas camadas adjacentes de umcompósito multi-camadas ou entre revestimento e substrato de um substratorevestido.