DE69636536T2

DE69636536T2 - Sekretionssignal-Gen und dieses enthaltender Expressionsvektor

Info

Publication number: DE69636536T2
Application number: DE69636536T
Authority: DE
Inventors: Yuko Yokohama-shi HAMA; Hideki Yokohama-shi TOHDA; Hiroko Yokohama-shi TSUKAMOTO; Kiyokazu Yokohama-shi NIKAIDO; Hiromichi Yokohama-shi KUMAGAI
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-01
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2016-02-02
Also published as: DE69636536D1; WO1996023890A1; EP0773296A4; EP0773296A1; EP0773296B1; US5919654A; JP3730256B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Sekretionssignal-Gen, das eine Basensequenz aufweist, die ein von dem Sekretionssignal eines Vorläufers eines passenden (mating) Pheromons (P-Faktor) abgeleitetes Polypeptid kodiert, das das Zusammenpassen (mating) von Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (nachstehend als S. pombe bezeichnet) betrifft. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der das Sekretionssignal-Gen und ein fremdes oder heterologes Protein-Struktur-Gen enthält, und die effiziente sekretorische Produktion des heterologen Protein-Struktur-Gen-Produkts durch S. pombe oder dergleichen.
STAND DER TECHNIK
Bisher wurde die Produktion von heterologen Proteinen unter Verwendung der kinetischen Rekombinationstechnologie umfangreich durchgeführt unter Verwendung von Mikroorganismen, wie z.B. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae oder Bacillus, Tierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen. Als solche heterologe Proteine werden verschiedene biogene Proteine als zugänglich betrachtet, und viele von ihnen wurden bisher unter Verwendung dieser lebenden Organismen für medizinische Verwendung industriell hergestellt.
Methoden, die Prokaryoten verwenden, sind jedoch nicht für alle Polypeptide wirksam, und es ist nicht immer leicht, die komplizierte post-translationale Modifikation eukaryotischer Proteine zu reproduzieren und die natürlichen sterischen Strukturen zu reproduzieren. Zusätzlich weist Escherichia coli ein charakteristisches Endotoxin auf, das die Endprodukte verunreinigen kann. Was Methoden unter Verwendung von Tier-, Pflanzen- oder Insektenzellen betrifft, sind diese Zellen schwieriger zu handhaben als Mikroorganismen, ihre Kultur ist kostspielig und die Produktionseffizienz ist gering. Aus diesem Grund werden Hefen, eukaryotische Mikroorganismen, als am besten für die Herstellung von heterologen Proteinen betrachtet, insbesondere von eukaryotischen Proteinen. Ihre Kulturmethoden sind gut ausgebildet, und sie enthalten keine Endotoxine. Bisher wurden deshalb Expressionsvektoren zur Verwendung in verschiedenen Hefewirten entwickelt (Romanos, M.A. et al., Yeast 8, 423-488, 1992).
Unter verschiedenen Hefen wird S. pombe als in verschiedenen Eigenschaften, wie z.B. Zellzyklus, Chromosomenstruktur und RNA-Spleißen mit höheren Tieren ähnlicher betrachtet als andere Hefen, einschließlich Saccharomyces cerevisiae. Die post-translationale Modifkation, wie z.B. Acetylierung, Phosphorylierung und Glykosylierung von in S. pombe produzierten Proteinen, scheint ziemlich ähnlich zu sein zu der in tierischen Zellen (Russell, P.R. und Nurse, P., Cell 45, 781-782, 1986; Kaufer, N.F. et al., Nature 318, 78-80, 1985; Chappell, T.G. und Warren, G., J. Cell. Biol. 109, 2693-2702, 1989). Es wird deshalb erwartet, dass die Verwendung von S. pombe als Wirt zur Expression eines heterologen Proteins ein Gen-Produkt liefert, das seiner natürlichen Form ähnlicher ist, wie das durch tierische Zellen produzierte. Da Hefen in ihren Kulturmethoden eine Menge Gemeinsamkeiten aufweisen, können die Kenntnisse über andere Hefen leicht für die Hefe angewendet werden. Deshalb ist es offensichtlich vorteilhaft, S. pombe zur Produktion eines heterologen Proteins unter Verwendung mikrobiologischer Methoden und der DNA-Rekombinationstechnik zu verwenden.
S. pombe liegt jedoch in Untersuchungen zur genetischen Rekombination unter ihrer Verwendung weit hinter Escherichia coli und Saccaromyces cerevisiae. Insbesondere im Hinblick auf die Gen-Expression in S. pombe wurde nur über eine geringe Zahl von Untersuchungen berichtet (japanische ungeprüfte Patentpublikationen Nr. 181397/1986, 283288/1990 und 63596/1992). Dies deshalb, weil die Entwicklung von Expressionsvektoren, die starke Promotoren aufweisen, in S. pombe-Zellen stabil sind und zur Einführung eines Gens geeignet und zweckmäßig sind, verzögert wurde. Jüngste Entwicklungen von Vektoren für die Spalthefe mit einer hohen Expressionsfähigkeit, die eine von einem Tiervirus abgeleitete Promotorregion enthält, eröffnete eventuell den Weg zur Massenproduktion von heterologen Proteinen durch S. pombe (japanische ungeprüfte Patentpublikationen Nr. 15380/1993 und 163373/1995, die Erfindungen der Erfinder der vorliegenden Anmeldung beschreiben). Diese Technik ermöglichte es, viele intrazelluläre Proteine leicht zu produzieren, und ist deshalb ziemlich brauchbar.
Die Produktion heterologer eukaryotischer sekretorischer Proteine durch Hefen war bisher kaum erfolgreich, weil Hefen schwer inhärente Signalsequenzen von heterologen sekretorischen Proteinen erkennen können, und deshalb die Produkte aus den Zellen in Kulturmedien nicht sekretieren können. Zum Zeitpunkt der Reinigung war es außerdem notwendig, nach der Zellzerstörung das gewünschte Protein von verschiedenen koexistierenden Zellkomponenten zu isolieren, um eine Inaktivierung zu vermeiden. Die sekretorische Produktion eines heterologen Proteins ist nicht nur im Hinblick auf die Leichtigkeit der Reinigung zu bevorzugen, sondern auch insofern vorteilhaft, weil das Produkt seinem natürlich vorhandenen Gegenstück in der sterischen Struktur identisch oder ziemlich ähnlich ist, weil das zu sekretierende Protein in den sekretorischen Weg in den Wirtszellen eintritt und einem geeigneten Processing unterliegt, wie z.B. Bildung von Disulfid-Bindungen und Glykosylierung.
Es wurde jedoch nur über einige Signalsequenzen, die wirksam in der Spalthefe funktionieren, berichtet (Tokunaga, M. et al., Yeast 9, 379-387, 1993; Bröker, M. et al., B.B.A. 908, 203-213, 1987), und es wurden keine sekretorischen Expressionsvektoren praktisch entwickelt. Andererseits untersuchten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung den P-Faktor, der ein durch S. pombe aus den Zellen sekretiertes Protein ist, und im Zusammenpassen (mating) als zusammenpassendes Pheromon (mating pheromone) beteiligt ist. Als Ergebnis haben sie die Tatsache gefunden, dass nach Überführung aus seinem Vorläufer durch verschiedene Enzyme in S. pombe der P-Faktor in ein Kulturmedium sekretiert wird. Sie bestimmten auch die Aminosäure-Sequenz und das Gen des P-Faktor-Vorläufers (Imai, Y. und Yamamoto, M., Gene & Dev. 8, 328-338; japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 327481/1994). Die Aminosäure-Sequenz des P-Faktor-Vorläufers ist in der nachfolgend angegebenen Sequenzliste SEQ ID NO: 1.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung richteten ihre Aufmerksamkeit auf den vorstehend erwähnten P-Faktor und versuchten, einen sekretorischen Expressionsvektor durch Verwenden seiner sekretorischen Eigenschaft zu entwickeln. Obwohl es unbekannt war, welche Regionen des Vorläufers wirksam als Sekretionssignale fungieren, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung als Ergebnis weiterer Untersuchungen gefunden, dass die N-terminalen ca. 60 Aminosäuren des P-Faktor-Vorläufers wirksam als Sekretionssignale fungieren. Als Ergebnis detaillierterer Untersuchungen haben sie die Existenz einer Präsequenz aufgefunden, die durch Signalpeptidase abgeschnitten wird, und eine Prosequenz, die durch Proteasen im endoplasmatischen Retikulum oder dem Golgi-Apparat während des Processing abgespalten wird. Das Sekretionssignal des P-Faktor-Vorläufers kann deshalb kürzer sein als die N-terminalen ca. 60 Aminosäuren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen bereit, das für ein Polypeptid kodiert, das als Sekretionssignal in S. pombe funktionell ist. Das Polypeptid kann ein Polypeptid sein, das mit dem Sekretionssignal des P-Faktor-Vorläufers oder einem längeren Polypeptid, das das Polypeptid enthält (aber kürzer als der P-Faktor-Vorläufer selbst ist), identisch, äquivalent oder analog sein. Das Polypeptid kann mindestens einen extra Aminosäurerest aufweisen, den das Sekretionssignal des P-Faktor-Vorläufers nicht inhärent aufweist, oder mindestens einen für mindestens einen Aminosäurerest im Sekretionssignal des P-Faktor-Vorläufers substituierten verschiedenen Aminosäurerest. Dem Polypeptid kann ferner mindestens ein Aminosäurerest im Sekretionssignal des P-Faktor-Vorläufers fehlen. Nachstehend wird ein als Sekretionssignal in S. pombe funktionelles Polypeptid einfach als Sekretionssignal bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das das Sekretionssignal (nachstehend als Sekretionssignal-Gen bezeichnet) kodiert, einen Multiklonierungsvektor, der das Sekretionssignal-Gen aufweist, einen Expressionsvektor, der das Sekretionssignal-Gen und ein heterologes Protein-Struktur-Gen aufweist, einen Transformanden aus einem nicht-menschlichen eukaryotischen Wirt, der eine rekombinante DNA trägt, die das Sekretionssignal-Gen oder den Expressionsvektor aufweist, und eine Methode zur Herstellung eines heterologen Proteins unter Verwendung des Transformanden. Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
ein Sekretionssignal-Gen, das eine ein als Sekretionssignal in S. pombe funktionelles Polypeptid kodierende Basensequenz aufweist;
ein Sekretionssignal-Gen, das eine Basensequenz aufweist, die ein Sekretionssignal des durch S. pombe produzierten P-Faktor-Vorläufers kodiert, oder ein Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz des Sekretionssignals enthält und als Sekretionssignal in S. pombe funktionell, ist, in dem eine Addition, Deletion oder Substitution von mindestens einem Aminosäurerest durchgeführt wurde;
ein Sekretionssignal-Gen, das eine Basensequenz aufweist, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäure-Sequenz von der ersten Aminosäure bis zur 16. bis 160. Aminosäure der SEQ ID NO: 1 aufweist, worin Addition, Deletion oder Substitution von mindestens einem Aminosäurerest durchgeführt wurde;
ein Sekretionssignal-Gen, das eine Basensequenz aufweist, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäure-Sequenz von der ersten Aminosäure bis zur 22. ± 6., der 31. ± 6. oder der 57. ± 6. Aminosäure der SEQ ID NO: 1 aufweist, worin Addition, Deletion oder Substitution mindestens eines Aminosäurerests durchgeführt sein kann;
ein Sekretionssignal-Gen, das seine Basensequenz aufweist, die das obige Polypeptid kodiert, worin das Polypeptid mindestens einen zusätzlichen Aminosäurerest am Carboxy-Terminus aufweist, um eine Carboxy-terminale Aminosäure-Sequenz von [-Lys-Lys-Arg] aufzuweisen;
einen Multikloniervektor zur Konstruktion eines Expressionsvektors zur Expression eines heterologen Proteins in einer nicht-menschlichen eukaryotischen Wirtszelle, die das vorstehend genannte Sekretionssignal-Gen stromaufwärts von einer Gen-Einführungsposition aufweist, wodurch das Sekretionssignal-Gen direkt an das einzuführende heterologe Protein-Struktur-Gen geknüpft werden kann;
einen Expressionsvektor zur Expression in einem nicht-menschlichen eukaryotischen Wirt, der ein Struktur-Gen eines Proteins eines Sekretionssignals und ein heterologes Protein, in dieser Reihenfolge vom Amino-Terminus zusammen gebunden, aufweist, worin das Gen des Sekretionssignals das vorstehend genannte Sekretionssignal-Gen ist;
eine isolierte nicht-menschliche eukaryotische Wirtszelle (nachstehend als Transformand bezeichnet), die eine rekombinante DNA trägt, die ein Struktur-Gen eines Proteins des obigen Sekretionssignal-Gens und
ein heterologes Protein, in dieser Reihenfolge vom Amino-Terminus zusammen gebunden, enthält, oder den obigen Expressionsvektor; und
ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins, das das Kultivieren des Transformanden umfasst, damit das heterologe Protein in der Kultur produziert und angehäuft wird, und gewinnen desselben. In einem Transformanden, der das Sekretionssignal-Gen der vorliegenden Erfindung aufweist, wird ein mit einem Sekretionssignal synthetisiertes gebundenes heterologes Protein in den Zellen so geschnitten, dass das Sekretionssignal abgeworfen wird, und wird aus den Zellen sekretiert. Es ist deshalb möglich, ein gewünschtes Protein zu erhalten, indem man es aus dem Kulturmedium isoliert, um ein gewünschtes Protein effektiv und leicht herzustellen.
Nach den Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung ist das längste Sekretionssignal in den Beispielen ein Polypeptid-Segment mit bis zur 57. Aminosäure. In der vorliegenden Erfindung kann das Sekretionssignal jedoch ein längeres Polypeptid-Segment sein, das dieses Polypeptid enthält (in Beispiel 1 wurde ein Polypeptid bis zur 59. Aminosäure verwendet). In diesem Fall wird ein heterologes Protein sekretiert, mit in der Polypeptid-Sequenz stromabwärts von der Spaltungsstelle gebundenen Aminosäureresten (nachstehend als zusätzliches Segment bezeichnet). Die Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung kann erzielt werden, wenn das sekretierte Protein, sogar wenn das beabsichtigte heterologe Protein mit dem daran gebundenen zusätzlichen Segment sekretiert wird, brauchbar oder zumindest nicht nachteilig ist (z.B., wenn das zusätzliche Segment nachher entfernt werden kann). Unter Berücksichtigung der Sequenz von der 55. Aminosäure bis zur 59. Aminosäure des Polypeptid-Segments, wo das Polypeptid-Segment gespalten wird, enthält die Sequenz der ersten ca. 160 Aminosäurereste außerdem drei weitere Sequenzen, die der Sequenz von der 55. bis zur 59. Aminosäure ähnlich sind, und es wird angenommen, dass die Spaltung auch an diesen drei Positionen erfolgen kann.
Im allgemeinen ist jedoch ein langes zusätzliches Segment eher für das gewünschte heterologe Protein nachteilig. Es ist deshalb bevorzugt, dass das sekretierte Protein kein zusätzliches Segment oder ein kur zes zusätzliches Segment enthält. In diesem Sinn wird ein Expressionsvektor vorzugsweise so konstruiert, um die Expression eines an eine Sequenz gebundenen heterologen Proteins, die eine Aminosäure-Sequenz der ersten höchstens 160 Aminosäuren der SEQ ID NO: 1, die das Sekretionssignal enthält, und vorzugsweise an eine Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 2) aufweist, die den ersten höchstens 59 Aminosäuren der SEQ ID NO: 1 entspricht, induziert. Die Ergebnisse der Beispiele zeigen, dass, wenn das Sekretionssignal eine Aminosäure-Sequenz von bis zur 59. Aminosäure aufweist, das sekretierte heterologe Protein, die 58. und 59. Aminosäurereste des Sekretionssignals am Amino-Terminus aufweist. In diesem Fall wird deshalb angenommen, dass ein Polypeptid aus der ersten Aminosäure bis zur 57. Aminosäure der SEQ ID NO: 1 (oder der SEQ ID NO: 2) als Sekretionssignal geeigneter ist.
Spaltung tritt hinter der Sequenz von der 55. Aminosäure bis zur 57. Aminosäure von [-Lys-Lys-Arg-] auf. Deshalb wird angenommen, dass diese Sequenz eine Art Spaltungssignal ist. Dies legt nahe, dass die Spaltung auch hinter den Sequenzen von [-Lys-Lys-Arg-] von der 89. Aminosäure bis zur 91. Aminosäure, von der 123. Aminosäure bis zur 125. Aminosäure und von der 157. Aminosäure zur 159. Aminosäure auftreten kann.
Eine auf die Verwendung einer kürzeren Sequenz gerichtete detaillierte Untersuchung des Sekretionssignals ergab, dass die Aminosäure-Sequenz vom Amino-Terminus bis zur 22. Aminosäure die Präsequenz bildet, und die Aminosäure-Sequenz von der 23. (oder 25.) Aminosäure bis zur 31. Aminosäure die Prosequenz bildet. Beide, die Präsequenz und die Prosequenz, können ein direkt hinter ihnen gebundenes gewünschtes Protein zur Sekretion veranlassen. Sie sind deshalb auch als Sekretionssignale brauchbar, selbst wenn sie kürzer sind als eine Sequenz der ersten ca. 60 Aminosäuren vom Amino-Terminus aus. Andererseits sind nach einer theoretischen Vorhersage (von Heijne, G. "A new method for predicting signal sequence cleavage sites", Nucleic Acids Research, 14, 4683-4690 (1986)) die 16. [-Ala] und die 18. [-Pro] mögliche hintere Enden von Sekretionssignalen, die kürzer sind als die Sequenz von bis zur 22. Aminosäure. Es wird deshalb angenommen, dass ein Polypeptid, das eine Aminosäure-Sequenz von der 1. Aminosäure bis zur 16. Aminosäure aufweist, und ein Polypeptid, das eine Aminosäure-Sequenz von der 1. Aminosäure bis zur 18. Aminosäure aufweist, ebenfalls als Sekretionssignale fungieren können. Eine detailliertere Untersuchung ergab, dass das Polyaminosäure-Segment vom Amino-Terminus bis zur ca. 60. Aminosäure mit einer höheren Wahrscheinlichkeit speziell am Carboxy-Terminus der 57. Arg, gespalten wird, als die Präsequenz von bis zur 22. (oder 24.) Aminosäure, und die Prosequenz bis zur 31. Aminosäure. Im Falle eines Sekretionssignals einer kurzen Sequenz führt deshalb die Anlagerung der Sequenz [-Lys-Lys-Arg-] von der 55. Aminosäure bis zur 57. Aminosäure direkt hinter der Präsequenz oder der Prosequenz zu einer leichteren Spaltung und erwartungsgemäß zu einer effizienteren Sekretion. Tatsächlich wird gezeigt, dass eine Anlagerung von [-Lys-Arg] direkt hinter der 31. [-Lys-] die Effizienz einer Sekretproduktion verbessert.
Aus dem Vorstehenden wird angenommen, dass der P-Faktor-Vorläufer unmittelbar hinter der 22. (oder 24.), der 31. und der 57. Aminosäure gespalten wird, und die Polypeptide, die eine Sequenz von der 1. Aminosäure bis zu diesen Aminosäuren aufweisen, als Sekretionssignale in S. pombe fungieren können. Außerdem wird angenommen, dass längere oder kürzere Sequenzen auch als Sekretionssignale in S. pombe wirken können. Die Sekretionssignale der vorliegenden Erfindung sind deshalb primär identisch zu diesen Sekretionssignalen des P-Faktor-Vorläufers. Die Sekretionssignale der vorliegenden Erfindung sind durch Addition einiger Aminosäurereste an die C-Termini dieser Polypeptide erhaltene Polypeptide (wie die vorstehend genannten Polypeptide von der 1. Aminosäure bis zur 59. Aminosäure und die später in den Beispielen beschriebene Sekretionssignal-P2-Sequenz) und durch Deletion einiger Aminosäurereste an den C-Termini dieser Polypeptide erhaltene Polypeptide (wie die später in Beispielen beschriebene Sekretionssignal-P1-Sequenz). Durch Substitution einiger Aminosäurereste dieser Polypeptide durch andere Aminosäurereste (wie Aminosäurereste, die zu den zu substituierenden Aminosäureresten in den Eigenschaften analog sind) können auch als Sekretionssignale fungieren.
Mehr bevorzugte Sekretionssignale sind (a) ein Polypeptid, das eine Sequenz von der 1. Aminosäure bis zur 22. (oder 25.) Aminosäure aufweist, (b) ein Polypeptid, das eine Sequenz von der 1. Aminosäure bis zur 31. aufweist, (c) ein Polypeptid, das eine Sequenz von der 1. Aminosäure bis zur 57. Aminosäure aufweist, (d) Polypeptide, die C-Termini ± 6 Reste (vorzugsweise ± 3 Reste) der C-Termini der Polypeptide (a) bis (c) aufweisen, und (e) ein Polypeptid, das dem Polypeptid (a), (b) oder (d) entspricht, das mindestens einen zusätzlichen Aminosäurerest aufweist, um die Sequenz [Lys-Lys-Arg] am C-Terminus aufzuweisen. Im Falle von (e) beträgt die Zahl der zusätzlichen Aminosäurereste vorzugsweise höchstens 5.
Das Sekretionssignal-Gen der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das das vorstehend genannte Sekretionssignal kodiert. Dieses Sekretionssignal-Gen bedeutet Gene, die den stromaufwärtigen Regionen des in der japanischen ungeprüften Patentpublikation Nr. 327481/1994 beschriebenem Gen des P-Faktor-Vorläufers und seinen modifizierten Versionen entsprechen. Das Sekretionssignal-Gen ist erhältlich aus einem S. pombe-Chromosom und durch Synthese. Das Sekretionssignal-Gen ist keinesfalls auf die in der vorstehend genannten Publikation beschriebenen Sequenzen beschränkt, und kann ein Gen darstellen, das Sequenzen aufweist, die die vorstehend beschriebenen Aminosäure-Sequenzen kodiert.
Ein gewünschtes heterologes Protein wird durch ein sein Struktur-Gen enthaltendes Expressionssystem exprimiert. Als Expressionssystem ist eine mit einem Expressionsvektor, der ein heterologes Protein-Struktur-Gen enthält, transformierte nicht-menschliche eukaryotische Zelle bevorzugt. Als nicht-menschliche eukaryotische Zelle wird insbesondere S. pombe bevorzugt. In dem Expressionssystem ist das vorstehend genannte Sekretionssignal-Gen an das vordere Ende des heterologen Protein-Struktur-Gens gebunden, und es wird ein Protein des Sekretionssignals und des damit verbundenen heterologen Proteins produziert. Nach intrazellulärem Processing wird das heterologe Protein aus der Zelle sekretiert. Der erfindungsgemäße Multikloniervektor ist ein Multikloniervektor zur Konstruktion des Expressionsvektors, der nachstehend beschrieben wird, und ermöglicht eine Expression eines heterologen Proteins in einer nicht-menschlichen eukaryotischen Wirtszelle. Durch Einführen eines heterologen Protein-Struktur-Gens in den Multikloniervektor kann der nachstehend beschriebene Expressionsvektor konstruiert werden. Der nachstehend beschriebene Expressionsvektor bedeutet einen solchen, der durch Verwendung des nachstehend beschriebenen Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens konstruiert ist, und ist nicht auf einen solchen beschränkt, der zur Verwendung des erfindungsgemäßen Multikloniervektors konstruiert ist.
Der erfindungsgemäße Multikloniervektor weist das vorstehend beschriebene Sekretionssignal-Gen stromaufwärts von einer Gen-Einführungsposition auf, wodurch das Sekretionssignal-Gen direkt mit einem einzuführenden heterologen Protein-Struktur-Gen verknüpft werden kann. Wenn ein heterologes Protein-Struktur-Gen darin eingeführt wird, um einen Expressionsvektor auszubilden, werden das Sekretionssignal-Gen und das heterologe Protein-Struktur-Gen verknüpft, und seine Expression des Ligationsprodukts produziert ein Protein des mit dem heterologen Protein verbundenen Sekretionssignals.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor weist ein Gen auf, das dem vorstehend genannten Sekretionssignal und einem damit verknüpften heterologen Protein-Struktur-Gen (nachstehend als Sekretionssignal-heterologes Protein-Gen bezeichnet) entspricht und ermöglicht die Expression des Gens in einer nicht-menschlichen eukaryotischen Wirtszelle. Dieser Expressionsvektor kann durch verschiedene Methoden unter Verwendung des Sekretionssignal-heterologen Protein-Struktur-Gens konstruiert werden. Es kann z.B. konstruiert werden durch Einführen eines Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens an der Multiklonierposition eines von dem erfindungsgemäßen Multikloniervektor verschiedenen Multikloniervektors. Es kann ohne Verwendung eines Multikloniervektors konstruiert werden.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, der die in der vorstehend genannten japanischen ungeprüften Patentpublikation Nr. 15380/1993 beschriebene Struktur aufweist. Bevorzugt ist es, den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung durch Verwendung des vorstehend genannten Multikloniervektors zu konstruieren, der in der Beschreibung der japanischen Patentanmeldung Nr. 241581/1994 beschrieben wird, die diesen Expressionsvektor oder eine Methode zur Konstruktion eines Expressionsvektors unter Verwendung des Multikloniervektors betrifft. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann trotzdem ein von dem in der vorstehend genannten Publikation beschriebenen Expressionsvektor verschiedener Expressionsvektor sein, und kann ein Chromosomen-Integrations-Typ oder ein Typ sein, der die Kopienzahl erhöhen kann und außerhalb des Kerns stabil vorhanden sein kann. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor, der die in der japanischen ungeprüften Patentpublikation Nr. 15380/1993 beschriebene Struktur aufweist, wird nachstehend beschrieben. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor ist jedoch keinesfalls darauf beschränkt.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor weist eine Promotorregion auf, die die Expression des eingeführten Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens steuert. Der Promotor reguliert die Expression des stromabwärts eingeführten Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens. Der Promotor ist dazu fähig, in einer nicht-menschlichen eukaryotischen Zelle zu fungieren und beschleunigt die Transkription des eingeführten Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens. Spezifisch ist ein Promotor, der in S. pombe-Zellen fungieren kann, bevorzugt.
Als solcher Promotor kann z.B. erwähnt werden Alkoholdihydrogenase-Gen-Promotor, menschlicher Cytomegalovirus-Gen-Promotor und menschlicher chorionischer Gonadotropin-α-Gen-Promotor. Besonders bevorzugt sind Promotoren, die die Transkription stark beschleunigen, wie z.B. Promotoren tierischer Viren (R. Toyama et al., FEBS Lett, 268, 217-221 (1990)). Als solcher bevorzugter Promotor können Promotoren von tierischen Viren, insbesondere menschlicher Cytomegalovirus-Gen-Promotor, genannt werden.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann ein Arzneimittel-Resistenz-Gen aufweisen, wie z.B. ein Antibiotika-Resistenz-Gen und andere verschiedene Gene. Es ist außerdem möglich, den erfindungsgemäßen Vektor als Shuttle-Vektor auszubilden, indem man einen Promotor oder ein Arzneimittel-resistentes Gen, das dazu fähig ist, in einer prokaryotischen Zelle, wie z.B. E. coli, zu fungieren, einbaut. Ein Expressionsvektor muss einen Replikationsursprung aufweisen, um in Zellen exprimiert zu werden. Für den erfindungsgemäßen Expressionsvektor ist es jedoch nicht immer erforderlich, einen Replikationsursprung aufzuweisen. Ein Replikationsursprung kann nach der Konstruktion des Expressionsvektors eingeführt werden. Es ist auch möglich, einen Replikationsursprung autonom in einen Expressionsvektor, der keinen Replikationsursprung aufweist, in einer Zelle einzuführen, nachdem der Expressionsvektor von der Zelle aufgenommen wurde. Diese Methoden zur Einführung eines Replikationsursprungs sind bereits bekannt. Ein Vektor, der einen Replikationsursprung aufweist, der dazu fähig ist, in einer Hefe zu fungieren (nachstehend als Hefe-Vektor bezeichnet) kann z.B. mit dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung integriert werden (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 15380/1993). Es ist auch möglich, den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung und einen Hefe-Vektor in Zellen zusammen autonom fusionieren zu lassen, indem man sie in die gleichen Zellen einführt. Da diese Methode der Einführung eines Replikationsursprungs verfügbar ist, ist es nicht kritisch, ob der erfindungsgemäße Expressionsvektor einen Replikationsursprung aufweist oder nicht. In jedem Fall ist es jedoch für die Expression des Expressionsvektors in Zellen erforderlich, dass der Vektor letztendlich einen Replikationsursprung aufweist.
Es ist gewöhnlich wesentlich, ein Arzneimittel-Resistenz-Gen, wie z.B. ein Antibiotika-Resistenz-Gen, in einen Expressionsvektor als Marker oder zum Klonieren einzuführen. Ein Gen, das eine Leucin-erfordernde Zelle aufgrund der Notwendigkeit für Leucin (wie z.B. LEU2-Gen) oder ein Gen, das eine Uracil-erfordernde Zelle aufgrund der Notwendigkeit für Uracil (wie z.B. URA3-Gen) freisetzt, wird oft eingeführt. Auch für den erfindungsgemäßen Vektor ist es bevorzugt, dass er ein Antibiotika-Resistenz-Gen und einen Promotor, die die Transkription des Antibiotika-Resistenz-Gens beschleunigt (nachstehend als zweiter Promotor bezeichnet), aufweist. Bevorzugt weist der zweite Promotor eine geringere Transkriptions-beschleunigende Aktivität auf als der Promotor, der die Transkription des vorstehend genannten Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens beschleunigt. Als zweiter Promotor werden Promotoren von tierischen Viren bevorzugt. Insbesondere bevorzugt ist der SV40-early-Promotor. Obwohl das durch den zweiten Promotor regulierte Antibiotika-Resistenz-Gen ein konventionelles sein kann, ist insbesondere in der vorliegenden Erfindung Neomycin-Resistenz-Gen bevorzugt.
In der vorliegenden Erfindung ist es durch Verwendung des Expressionsvektors, der ein Antibiotika-Resistenz-Gen aufweist, möglich, die exprimierte Menge des Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens zu erhöhen. Für diesen Zweck muss die Transkriptions-beschleunigende Aktivität des zweiten Promotors geringer sein als die des Promotors, der das Sekretionssignal-heterologe Protein-Gen reguliert. Zum Zweck einer Erklärung wird als Beispiel der Fall der Kultivierung von S. pombe, das einen Expressionsvektor trägt, der SV40-early-Promotor und durch den Promotor reguliertes Neomycin-Resistenz-Gen aufweist, angegeben. Wenn der S. pombe-Transformand in einem Medium, das G418 (Neomycin) enthält, kultiviert wird, erhöht sich die Kopienzahl des Expressionsvektors in einer Zelle mit der G418- Konzentration im Medium. Durch Erhöhen der G418-Konzentration ist es deshalb möglich, die Kopienzahl des Expressionsvektors in einer Zelle zu erhöhen, und damit die Expressionsmenge des Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens zu erhöhen. Wenn die Aktivität des zweiten Promotors höher ist als die des das Sekretionssignal-heterologen Protein-Gens regulierenden Promotors, besteht keine Notwendigkeit, die Kopienzahl des Expressionsvektors zu erhöhen, da eine geringe Kopienzahl des Vektors ausreicht, um eine Produktion des Neomycin-Resistenz-Proteins (Enzym) in ausreichender Menge zu induzieren, und deshalb ist es unmöglich, die Expressionsmenge des gewünschten Sekretionssignal-heterologen Proteins zu erhöhen.
Das heterologe Protein als Produkt eines Protein-Struktur-Gens ist nicht besonders beschränkt, aber vorzugsweise ist es ein physiologisch aktives Protein eines höheren Tiers. Glykoproteine, die grundsätzlich durch die sekretorische Produktion durch eine tierische Zelle erhältlich sind und schwierig unter Verwendung von E. coli zu produzieren sind, und Proteine, die komplizierte sterische Strukturen mit vielen Disulfid-Bindungen aufweisen, wie z.B. menschliches Serum-Albumin und Interleukin 6, sind z.B. besonders bevorzugt.
Die allgemeine Technik der Konstruktion des Multikloniervektors oder des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung ist bereits bekannt und beschrieben, z.B. in einer Arbeit von J. Sambrook et al., "Molecular Cloning 2nd ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Der Multikloniervektor und der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung können durch die vorstehend genannte Methode unter Verwendung dieser üblichen Technik konstruiert werden. Als in der vorliegenden Erfindung als Wirt für den Expressionsvektor zu verwendender Stamm von S. pombe kann z.B. ATCC 38399 (leul-32h^-) und ATCC 38436 (ura4-294h^-) genannt werden. Diese Stämme sind von der American Type Culture Collection erhältlich.
S. pombe kann unter Verwendung eines Expressionsvektors nach bekannten Methoden transformiert werden, und ein S. pombe-Transformand kann z.B. erhalten werden durch die Lithiumacetat-Methode (K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489 (1990)). Der Transformand wird in einem bekanntem Medium kultiviert, und Nährmedium, wie z.B. YPD-Medium, Minimalmedium, wie z.B. MM-Medium (M.D. Rose et al., "Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)) können verwendet werden. Der Transformand wird üblicherweise in einem Bereich von 16 bis 42°C, vorzugsweise von 25 bis 37°C, während 8 bis 168 Stunden, vorzugsweise während 48 bis 96 Stunden, kultiviert. Es kann entweder eine Schüttelkultur oder eine stationäre Kultur verwendet werden, und wenn erforderlich, kann das Kulturmedium gerührt oder belüftet werden.
Als Methoden zur Isolierung und Reinigung des in der Kultur produzierten Proteins können bekannte Methoden, wie z.B. Methoden unter Verwendung der Löslichkeitsdifferenz, wie z.B. Aussalzen und Ausfällen mit einem Lösungsmittel, Methoden unter Verwendung der Molekulargewichtsdifferenz, wie z.B. Ultrafiltration und Gelelektrophorese, Methoden unter Verwendung der Differenz in der elektrischen Ladung, wie z.B. Ionenaustausch-Chromatographie, Methoden unter Verwendung der spezifischen Affinität, wie z.B. Affinitätschromatographie, Methoden unter Verwendung der Differenz in der Hydrophobizität, wie z.B. Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, und Methoden unter Verwendung der Differenz im isoelektrischen Punkt, wie z.B. isoelektrisches Fokussieren, erwähnt werden.
Das isolierte und gereinigte Protein kann durch konventionelle Methoden, wie z.B. Western-Blot oder Aktivitäts-Assay, identifiziert werden. Die Struktur des gereinigten Proteins kann durch Aminosäure-Analyse, Amino-Terminus-Analyse, Primärstruktur-Analyse und dergleichen bestimmt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Nachstehend werden die anliegenden Zeichnungen in Verbindung mit der besten Art zur Durchführung der Erfindung erläutert.
1 veranschaulicht die Struktur des Vektors pSL26m, der in Beispiel 1 konstruiert wurde.
2 und 3 zeigen SDS-PAGE und Western-Blot-Muster, die die Expression von in den Beispielen 2, 5, 8, 11 und 14 erhaltenem menschlichen Interleukin-6 und seiner Varianten demonstrieren.
4 veranschaulicht die Struktur des in Beispiel 4 konstruierten Expressionsvektors pSL2PO6a'cl.
5 veranschaulicht die Struktur des in Beispiel 7 konstruierten Expressionsvektors pSL2P16a'cl.
6 veranschaulicht die Struktur des in Beispiel 10 konstruierten Expressionsvektors pSL2P26a'cl.
7 veranschaulicht die Struktur des in Beispiel 13 konstruierten Expressionsvektors pSL2P36a'cl.
8 veranschaulicht die Struktur des in Beispiel 16 konstruierten Expressionsvektors pSL2P3Ml.
BESTE ART ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun näher unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben. Es ist jedoch zu verstehen, dass der technische Rahmen der vorliegenden Erfindung keinesfalls durch solche spezifischen Beispiele beschränkt wird.
Die Bezugsbeispiele 1 und 2 erläutern die Methoden des Transformierens und Kultivierens einer in den Beispielen verwendeten Hefe.
BEZUGSBEISPIEL 1: Transformation einer Hefe
Ein Leucin-erfordernder Stamm, S. pombe leul-32h^- (ATCC38399) wurde als Wirt verwendet. Wirtszellen wurden in einem tierischen Medium gezüchtet, bis die Zellzahl (0,5-1) × 10⁷ Zellen/ml betrug. Die Zellen wurden gesammelt und in 0,1 M Lithiumacetat (pH 5) bei einer Zellzahl von 1 × 10⁹ Zellen/ml suspendiert. Dann wurde die Zellsuspension bei 30°C 60 Minuten lang inkubiert. 1 μg eines PstI-Fragments eines Hefe-Vektors pAL7 (ars, stb, LEU) (Nucleic Acid Research 18, 6485-6489) und 2 μg eines in den Beispielen erhaltenen Expressionsvektors wurden zu 100 μl der Zellsuspension zugegeben, und 290 μl 50% (Gew./Vol.) PEG4000 (Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4.000) wurden zugegeben, und sie wurden ausreichend gemischt. Dann wurde die Mischung bei 30°C 60 Minuten lang inkubiert, und bei 43°C 15 Minuten lang, und wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen gelassen. Nach Entfernung von PEG4000 durch Zentrifugieren wurden die Zellen in einer geeigneten Menge eines Mediums suspendiert, und die Suspension wurde auf ein Minimalmedium aufgetragen. Das Transformationsverhältnis betrug mindestens 10⁵ μg (pAL7).
Eine geeignete Zahl der vorstehend erhaltenen Transformanden wurde geerntet, und jeder Transformand wurde in 300 μl Wasser suspendiert. Ein 3 μl-Anteil der Suspension wurde auf ein YEA-Medium (Hefe- extrakt 5 g, Glucose 30 g, Agar 20 g/l l), enthaltend G418 (25 μg/ml), aufgetragen und 3 Tage danach wurden die gebildeten Kolonien zur Verwendung entnommen.
BEZUGSBEISPIEL 2: Hefekultur
Der transformierte S. plombe(leul-32h^-)-Stamm wurde in 5 μl MM-Medium, das 1 Gew.-% Casamino-Säure und 2 Gew.-% Glucose enthielt (Alfa et al., "Experiments with Fission Yeast", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993) in Gegenwart von G418 (25 μg/ml) bei 32°C über Nacht kultiviert, und zu 50 ml des MM-Mediums, enthaltend G418 (200 μg/ml), 1 Gew.-% Casamino-Säure und 2 Gew.-% Glucose, wurden aus dem Kulturmedium entnommene 5 × 10⁷ Zellen zugegeben und bei 32°C 48 Stunden lang kultiviert. Dann wurde zentrifugiert, um das Kulturmedium zu gewinnen.
BEISPIEL 1
Herstellung von menschlichem Interleukin-6-Sekretionsvektor
PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines Plamids pAG9-8-1 (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 224097/1995), erhalten durch Einführen der gesamten cDNA von menschlichem Interleukin-6 in einen kommerziell erhältlichen Vektor pUC19 (vertrieben von Boehringer Co., Ltd.) als Templat, und in SEQ ID NOs: 3 und 4 dargestellte Oligo-DNAs als Primer, um den den ORF (offener Leserahmen) von reifes Interleukin-6-enthaltendem Bereich zu vervielfachen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme EcoRI (vertrieben von Takara Shuzo Co.) und HindIII (verrieben von Takara Shuzo Co.) für eine terminale Behandlung unterworfen. Nach Agarosegel-Elektrophorese wurde die ca. 600 Basenpaaren entsprechende Bande ausgeschnitten, und durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP (vertrieben von Asahi Glass Company Ltd.) wurde eine Gen-Fragment-Insertion isoliert.
Unter Verwendung eines Plasmids pADMP2 (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 327481/1994), das das gesamte map2-Gen von S. pombe als Templat und in SEQ ID NOs: 5 und 6 dargestellte Oligo-DNAs als Primer enthielt, wurde PCR durchgeführt, um die P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz enthaltende Region zu vervielfachen. Einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme BspHI (vertrieben von New England Biolab Co.) und EcoRI zur terminalen Behandlung folgte eine Acrylamidgel-Elektrophorese. Die ca. 200 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten und ein Signal-Insertions-Fragment aus dem Gel eluiert.
Ein Expressionsvektor pTL2M für S. pombe (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 163373/1995), unter Verwendung eines in der japanischen ungeprüften Patentpublikation Nr. 15380/1993 beschriebenen Vektors konstruiert, wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme AflIII (vertrieben von New England Biolab Co.) und HindIII und dann einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Die ca. 5.000 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Vektorfragment isoliert.
Diese drei Fragmente wurden mittels eines DNA-Ligations-Kits (Takara Shuzo Co.) verknüpft. E. coli-DHS-Stamm (vertrieben von Toyobo Co.) wurde transformiert und auf den Besitz des beabsichtigten geeignet konstruierten Plasmids gescreent. 1 zeigt die Struktur des so erhaltenen Expressionsvektors pSL26m. pSL26m wurde in einer großen Menge durch die alkalische SDS-Methode hergestellt und durch Restriktionskarte und partielle Basen-Sequenz-Analysen als Plasmid identifiziert, das die beabsichtigte Sequenz aufwies. Die aus der Basen-Sequenz angenommene Aminosäure-Sequenz von menschlichem Interleukin-6 war SEQ ID NO: 7 und bestand aus 185 Resten. Die Aminosäure-Sequenz der Sekretionssignal-Sequenz war SEQ ID NO: 2 und bestand aus 59 Resten.
BEISPIEL 2
Sekretorische Produktion von menschlichem Interleukin-6
Hefe wurde mit dem gemäß Bezugsbeispiel 1 in Beispiel 1 hergestellten Sekretionsvektor transformiert und dann gemäß Bezugsbeispiel 2 kultiviert. 50 ml des Kulturmediums wurden auf das ca. 200-fache mittels eines Membranfilters, hergestellt von Amicon Co., Ltd., aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Coomassie-Brilliant-Blue-Anfärben, analysiert. 2 zeigt das resultierende SDS-PAGE-Muster. In 2 ist Bahn 1 der Überstand von S. pombe/pSL2M-(Kontroll-)Kultur und Bahn 2 der Überstand von S. pombe/pSL26m-Kultur. Wie in 2 gezeigt, wurden mehrere Molekulargewichte von mindestens 50.000 entsprechende Banden beobachtet, während im Niedermolekulargewichtsbereich eine Bande bei ca. 21 K und eine andere Bande bei einem geringfügig kleineren Molekulargewicht festgestellt wurden.
Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse der Überstände sind in 3 dargestellt. In 3 ist Bahn 1 der Überstand von S. pombe/pSL2M-(Kontroll-)Kultur und Bahn 2 der Überstand von S. pombe/pSL26m-Kultur. Die Banden bei 21 K und geringfügig kleinerem Molekulargewicht wurden identifiziert und menschlichem Interleukin-6 zugeordnet. Die Banden mit etwas geringeren Molekulargewichten scheinen Zersetzungsprodukten zugeordnet zu sein.
BEISPIEL 3
Bestimmung der Amino-terminalen Sequenz von sekretiertem Protein
Das aus der durch die SDS-PAGE-Elektrophorese in Beispiel 2 erhaltenen 21 K-Bande-isolierte Protein wurde vom Amino-Terminus durch einen Protein-Sequenzer ("Shimadzu PSQ-1") analysiert, und es wurde gefunden, dass sie eine Amino-terminale Sequenz von Glu-Phe-Met-Pro-Val-Pro-Pro- aufweist. Dies zeigt an, dass sie in das Medium nach genauem Processing zwischen Lys und Glu des Sekretionssignals sekretiert wurde. Eine ähnliche Untersuchung der kleineren Bande mit niedrigerem Molekulargewicht zeigte eine Extraspaltung zwischen dem 9. Lys und dem 10. Asp an.
BEISPIEL 4
Herstellung des Sekretionsvektors für Interleukin-6-Variante unter Verwendung des Sekretionssignals
Unter Verwendung eines Plasmids pTL26a'Cl (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 224097/1995), das die cDNA einer menschlichen Interleukin-6-Variante als Templat und durch SEQ ID NOs: 8 und 9 repräsentierte Oligo-DNAs enthielt, wurde eine PCR durchgeführt, um eine Region, die den ORF der Interleukin-6-Variante enthält, zu vervielfachen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII für eine terminate Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 600 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Insertionsfragment isoliert.
Ein cDNA der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz von S. pombe enthaltendes Plasmid pSL26 m (Beispiel 1) wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII zur terminalen Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die 5.000 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, um durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Vektorfragment isoliert.
Die zwei Fragmente wurden mittels eines DNA-Ligations-Kits verknüpft. Nach Transformation des E. coli-DHS-Stamms wurde der E. coli-Stamm auf das Vorhandensein des Sekretionsvektors pSL2P06a'Cl, wie in 4 dargestellt, konstruiert, durch Restriktionskartenanalyse gescreent. PSL2P06a'Cl wurde in großer Menge durch die Alkali-SDS-Methode hergestellt, und die Basen-Sequenz des ORF der Interleukin-6-Variante und die der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz entsprechende Region wurden bestimmt. Als Ergebnis wurde die Aminosäure-Sequenz der Interleukin-6-Variante aus der durch SEQ ID NO: 10 repräsentierten Basen-Sequenz erwartet und besteht aus 162 Resten, und die Sekretionssignal-Sequenz, die als Sekretionssignal "PO"-Sequenz bezeichnet wurde, bestand aus 59 Resten und wies eine durch SEQ ID NO: 2 repräsentierte Aminosäure-Sequenz auf.
BEISPIEL 5
Sekretorische Produktion von menschlicher Interleukin-6-Variante unter Verwendung der Sekretionssignal-P0-Sequenz
Hefe wurde mit dem in Beispiel 4 gemäß dem Bezugsbeispiel 1 hergestellten Sekretionsvektor transformiert und dann gemäß Bezugsbeispiel 2 kultiviert. 50 ml des Kulturmediums wurden auf das ca. 200-fache mittels eines Membranfilters, hergestellt von Amicon Co., Ltd., aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Coomassie-Brilliant-Blue-Anfärben, analysiert. 2 zeigt das resultierende SDS-PAGE-Muster. In 2 ist Bahn 3 der Überstand von S. pombe/pSL2P06a'Cl-Kultur.
Wie in 3 gezeigt, wurde, während Banden im Molekular-Gewichtsbereich von mindestens 50.000 festgestellt wurden, im Bereich niedrigeren Molekulargewichts nur eine Bande bei ca. 18 K festgestellt. Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse des Überstands der Kultur sind in 3 dargestellt. Bahn 3 in 3 ist der Überstand von S. pombe/pSK2P06a'Cl-Kultur. Die Bande bei 18 K in Bahn 3 in 3 wurde als der menschlichen Interleukin-6-Variante (IL-6a'Cl) zuzuschreibend identifiziert.
BEISPIEL 6
Bestimmung der Amino-terminalen Sequenz von sekretiertem Protein
Das nach einer konventionellen Methode aus der durch SDS-PAGE-Elektrophorese in Beispiel 5 erhaltenen Bande bei 18 K extrahierte Protein wurde vom Amino-Terminus durch Protein-Sequenzer ("Shimadzu PSQ-1") analysiert, und es wurde festgestellt, dass sie eine Amino-terminale Sequenz Glu-Phe-Pro- Val-Pro-Pro-Thr-Ser-Ser-Glu aufweist. Dies zeigt, dass IL-6a'Cl, das eine Variante ist, der das 9. und 10. Lys-Asp vom N-Terminus vom Interleukin-6 fehlt, in das Medium nach genauem Processing zwischen Lys und Glu des Sekretionssignals sekretiert wurde. Die Extraspaltung in Beispiel 3 ist deshalb für die Sekretion nicht erforderlich, und wenn keine spezifische Sequenz im Molekül vorhanden ist, wird nur ein Protein-Typ mit einem konstanten Terminus sekretiert.
BEISPIEL 7
Herstellung des Sekretionsvektors für Interleukin-6-Variante unter Verwendung der Sekretionssignal-P1-Sequenz
Unter Verwendung eines Plasmids pSL2P06a'Cl (Beispiel 4), das die cDNA einer menschlichen Interleukin-6-Variante als Templat und durch SEQ ID NOs: 11 und 12 repräsentierte Oligo-DNAs enthielt, wurde eine PCR durchgeführt, um die den ORF der Interleukin-6-Variante enthaltende Region zu vervielfachen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme HaeII (vertrieben von Takara Shuzo Co.) und HindIII für eine terminate Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und das Gen-Insertions-Fragment wurde mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP isoliert.
Unter Verwendung eines Plasmids pSL2P06a'Cl (Beispiel 4), das die cDNA der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz von S. pombe als Templat und durch SEQ ID NOs: 13 und 14 repräsentierte Oligo-DNAs als Primer enthielt, wurde eine PCR durchgeführt, um eine die P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz enthaltende Region zu vervielfältigen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme SpeI (vertrieben von Takara Shuzo Co.) und HaeII zur terminalen Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 700 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Signal-Insertions-Fragment isoliert.
Ein Expressionsvektor pTL2M für S. pombe (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 163373/1995) wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme SpeI und HindIII für eine terminale Behandlung unterworfen und einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 4.500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Vektorfragment isoliert.
Diese drei Fragmente wurden mittels eines DNA-Ligations-Kits verknüpft. Nach Transformation von E. coli-DHS-Stamm wurden E. coli-Klone auf das Vorhandensein des wie in 5 dargestellten konstruierten Sekretionsvektors pSL2Pl6a'Cl mittels Restriktionskartenanalyse gescreent.
pSL2P16a'Cl wurde in einer großen Menge durch Alkali-SDS-Methode hergestellt, und die Basen-Sequenz des ORF der Interleukin-6-Variante und die der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz entsprechende Region wurden bestimmt. Aus den Basen-Sequenzen wird angenommen, dass die Interleukin-6-Variante eine durch SEQ ID NO: 15 repräsentierte Aminosäure-Sequenz aufweist und aus 163 Resten besteht, und die Sekretionssignal-Sequenz, die als Sekretionssignal "P1"-Sequenz bezeichnet wird, weist eine durch SEQ ID NO: 16 repräsentierte Aminosäure-Sequenz auf und besteht aus 30 Resten.
BEISPIEL 8
Sekretorische Produktion von menschlicher Interleukin-6-Variante unter Verwendung der Sekretionssignal-Pl-Sequenz
Mit dem in Beispiel 7 gemäß Bezugsbeispiel 1 hergestellten Sekretionsvektor wurde Hefe transformiert und dann gemäß Bezugsbeispiel 2 kultiviert. 50 ml des Kulturmediums wurden auf das ca. 200-fache mittels eines Membranfilters, hergestellt von Amicon Co., Ltd., aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Coomassie-Brilliant-Blue-Anfärben, analysiert. 2 zeigt das resultierende SDS-PAGE-Muster. In 2 ist Bahn 4 der Überstand von S. pombe/pSL2P16a'Cl-Kultur.
Wie in 2 gezeigt, wurden, während mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von mindestens 50.000 festgestellt wurden, im Bereich niedrigeren Molekulargewichts zwei Hauptbanden bei ca. 19 K festgestellt.
Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse des Überstands der Kultur sind in 3 dargestellt. In 3 ist Bahn 4 der Überstand von S. pombe/pSL2P16a'Cl-Kultur. Die zwei Banden bei ca. 19 K in Bahn 4 in 3 wurden als der menschlichem Interleukin-6-Variante IL-6a'Cl zuzuschreibend identifiziert.
BEISPIEL 9
Bestimmung der Amino-terminalen Sequenz des sekretierten Proteins
Die Amino-terminalen Sequenzen der mittels einer konventionellen Methode aus den mittels SDS-PAGE-Elektrophorese in Beispiel 5 erhaltenen zwei Banden bei ca. 19 K extrahierten Proteine wurden mittels eines Protein-Sequenzers analysiert, und es wurde gefunden, dass sie Asp-Pro-Gly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Pro für die obere Bande und Gly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro für die untere Bande sind. Die Ergebnisse zeigen, dass zwei Spaltungsstellen vorhanden sind, und dass das Sekretionssignal P1 zwischen dem 22. Ala und dem 23. Asp vom N-Terminus und zwischen Pro und Gly, die zwei Reste sind, die näher zum C-Terminus liegen, geschnitten wurde. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Sekretionssignal-Pl-Sequenz zwei Signal-Peptidase-Spaltungsstellen aufweist.
BEISPIEL 10
Herstellung des Interleukin-6-Variante-Sekretionsvektors unter Verwendung der Sekretionssignal-P2-Sequenz
Unter Verwendung eines Plamids pSL2P06a'Cl (Beispiel 4), das die cDNA einer menschlichen Interleukin-6-Variante als Templat und durch SEQ ID NOs: 17 und 18 repräsentierte Oligo-DNAs als Primer enthält, wurde eine PCR durchgeführt, um die den ORF der Interleukin-6-Variante enthaltene Region zu vervielfältigen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme HaeII und HindIII zur terminalen Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Gen-Insertions-Fragment isoliert.
Unter Verwendung eines Plasmids pSL2P06a'Cl (Beispiel 4), das die cDNA der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz von S. pombe als Templat und durch SEQ ID NOs: 19 oder 20 repräsentierte Oligo-DNAs als Primer enthält, wurde eine PCR durchgeführt, um den die P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz enthaltenden Bereich zu vervielfältigen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme SpeI und HaeII für eine terminate Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese. Die ca. 700 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten und mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP ein Signal-Insertions-Fragment isoliert.
Ein Expressionsvektor pTL2M für S. pombe (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 163373/1995) wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme SpeI und HindIII für eine terminale Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 4.500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP ein Vektor-Fragment isoliert.
Diese drei Fragmente wurden mittels eines DNA-Ligations-Kits verknüpft. Nach Transformation von E. coli-DHS-Stamm wurden E. coli-Klone auf das Vorhandensein des Sekretionsvektors pSL2P26a'Cl, wie in 6 mittels Restriktionskartenanalyse dargestellt, konstruiert, gescreent.
pSL2P26a'Cl wurde in einer großen Menge durch Alkali-SDS-Methode hergestellt, und die Basen-Sequenzen des ORF der Interleukin-6-Variante und die der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz entsprechenden Region wurden bestimmt. Aus den Basen-Sequenzen wird angenommen, dass die Interleukin-6-Variante eine durch SEQ ID NO: 15 repräsentierte Aminosäure-Sequenz aufweist und die Sekretionssignal-Sequenz, die als Sekretionssignal "P2"-Sequenz bezeichnet wird, weist eine durch SEQ ID NO: 21 repräsentierte Aminosäure-Sequenz aus 31 Resten auf.
BEISPIEL 11
Sekretorische Produktion von menschlicher Interleukin-6-Variante unter Verwendung der Sekretionssignal-P2-Sequenz
Mit dem in Beispiel 10 gemäß Bezugsbeispiel 1 hergestellten Sekretionsvektor wurde Hefe transformiert und dann gemäß Bezugsbeispiel 2 kultiviert. 50 ml des Kulturmediums wurden auf das ca. 200-fache mittels eines Membranfilters, hergestellt von Amicon Co., Ltd., aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Coomassie-Brilliant-Blue-Anfärben, analysiert. 2 zeigt das resultierende SDS-PAGE-Muster. In 2 ist Bahn 5 der Überstand von S. pombe/pSL2P26a'Cl-Kultur.
Wie in 2 gezeigt, wurden, während verschiedene Banden im Molekulargewichtsbereich von mindestens 50.000 festgestellt wurden, im Bereich niedrigeren Molekulargewichts zwei größere Banden und eine Hauptbande bei ca. 19 K bzw. bei ca. 18,5 K festgestellt.
Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse des Überstands der Kultur sind in 3 dargestellt. In 3 ist Bahn 5 der Überstand von S. pombe/pSL2P26a'Cl-Kultur. Die zwei Banden bei ca. 19 K und die Bande bei ca. 18,5 K in Bahn 5 in 3 wurden als der menschlichen Interleukin-6-Variante IL-6a'Cl zuzuschreibend identifiziert.
BEISPIEL 12
Bestimmung der Amino-terminalen Sequenz des sekretierten Proteins
Die Amino-terminalen Sequenzen der aus den durch eine konventionelle Methode aus den durch SDS-PAGE-Elektrophorese in Beispiel 11 erhaltenen zwei Banden bei ca. 19 K extrahierten Proteine wurden mittels eines Protein-Sequenzers analysiert, und es wurde gefunden, dass sie Asp-Pro-Gly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Pro für die obere Bande und Gly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro für die untere Bande sind. Die Ergebnisse zeigen, dass zwei Spaltungspositionen vorhanden sind, und dass das Sekretionssignal P1 zwischen der 22. Ala und der 23. Asp vom N-Terminus und zwischen Pro und Gly, die zwei näher am C-Terminus vorhandene Reste sind, geschnitten wurde. Es ist sehr wahrscheinlich, dass das Sekretionssignal zwei Signal-Peptidase-Spaltungsstellen aufweist. Die Amino-terminale Sequenz des aus der Bande bei ca. 18,5 K extrahierten Peptids wurde vom N-Terminus analysiert, und es wurde gefunden, dass sie Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Ser-Ser-Glu ist. Dies zeigt, dass das Sekretionssignal P2 zwischen dem 31. Lys und dem 32. Ser vom N-Terminus während des Processing vor der Sekretion geschnitten wird.
BEISPIEL 13
Herstellung des Interleukin-6-Variante-Sekretionsvektors unter Verwendung der Sekretionssignal-P3-Sequenz
Unter Verwendung eines Plasmids pSL2P06a'Cl (Beispiel 4), das die cDNA einer menschlichen Interleukin-6-Variante als Templat und durch SEQ ID NOs: 22 und 23 repräsentierte Oligo-DNAs als Primer enthielt, wurde eine PCR durchgeführt, um eine den ORF der Interleukin-6-Variante enthaltende Region zu vervielfachen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme AfIII (vertrieben von Nippon Gene Co.) und HindIII für eine terminale Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und ein Gen-Insertions-Fragment wurde mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP isoliert.
Unter Verwendung eines Plamids pSL2P06a'Cl (Beispiel 4), das die P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz von S. pombe als Templat und durch SEQ ID NOs: 24 und 25 repräsentierte Oligo-DNAs als Primer enthielt, wurde eine PCR durchgeführt, um eine die P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz enthaltende Region zu vervielfältigen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme SpeI und AfIII zur terminalen Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 700 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und durch die Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Signal-Insertions-Fragment isoliert.
Ein Expressionsvektor pTL2M für S. pombe (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 163373/1995) wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme SpeI und HindIII für eine terminale Behandlung unterworfen und einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 4.500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Vektorfragment isoliert.
Diese drei Fragmente wurden mittels eines DNA-Ligations-Kits verknüpft. Nach Transformation von E. coli-DHS-Stamm wurden E. coli-Klone auf das Vorhandensein des wie in 6 durch Restriktionskartenanalyse dargestellten richtig konstruierten Sekretionsvektors pSL2P36a'Cl gescreent.
pSL2P36a'Cl wurde in einer großen Menge durch Alkali-SDS-Methode hergestellt, und die Basen-Sequenz des ORF der Interleukin-6-Variante und die der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz entsprechenden Region wurden bestimmt. Aus den Basen-Sequenzen wird angenommen, dass die Interleukin-6-Variante eine durch SEQ ID NO: 15 repräsentierte Aminosäure-Sequenz aufweist und die Sekretionssignal-Sequenz, die als Sekretionssignal "P3"-Sequenz bezeichnet wird, eine durch SEQ ID NO: 26 repräsentierte Aminosäure-Sequenz aus 34 Resten aufweist.
BEISPIEL 14
Sekretorische Produktion von menschlicher Interleukin-6-Variante unter Verwendung von Sekretionssignal-P3-Sequenz
Hefe wurde mittels dem in Beispiel 13 gemäß dem Bezugsbeispiel 1 hergestellten Sekretionsvektor transformiert und dann gemäß Bezugsbeispiel 2 kultiviert. 50 ml des Kulturmediums wurden auf das ca. 200-fache mittels eines Membranfilters, hergestellt von Amicon Co., Ltd., aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Coomassie-Brilliant-Blue-Anfärben, analysiert. 2 zeigt das resultierende SDS-PAGE-Muster. In 2 ist Bahn 6 der Überstand von S. pombe/pSL2P36a'Cl-Kultur.
Wie in 2 gezeigt, wurde, während mehrere Banden im Molekular-Gewichtsbereich von mindestens 50.000 festgestellt wurden, im Bereich niedrigeren Molekulargewichts eine Bande bei ca. 18 K festgestellt.
Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse des Überstands der Kultur sind in 3 dargestellt. Bande bei ca. 18 K in Bahn 6 in 3 wurde als dem IL-6a'Cl zuzuschreibend identifiziert.
BEISPIEL 15
Bestimmung der Amino-terminalen Sequenz des sekretierten Proteins
Die N-terminale Sequenz des mittels einer konventionellen Methode aus der mittels SDS-PAGE-Elektrophorese in Beispiel 14 erhaltenen Bande bei ca. 20 K isolierten Proteins wurde mittels eines Protein-Sequenzers analysiert, und es wurde gefunden, dass sie Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Ser-Ser-Glu ist. Dies zeigt, dass das Protein nach genauem Processing zwischen Lys am Terminus des P3-Signals und Ala am N-Terminus von IL-6a'Cl in das Medium sekretiert wurde.
BEISPIEL 16
Herstellung eines Universal-Sekretionsvektors
Unter Verwendung eines Expressionsvektors pTL2M für S. Pombe (japanische ungeprüfte Patentpublikation Nr. 163373/1995) als Templat und durch SEQ ID NOs: 27 und 28 repräsentiere Oligo-DNAs als Primer wurde eine PCR durchgeführt, um die eine MCS (Multiklonier-Position)-Sequenz enthaltende Region zu vervielfältigen. Das so erhaltene Fragment wurde einer doppelten Digestion durch Restrikti onsenzyme AflIII und BgIII (vertrieben von Takara Shuzo Co.) für eine terminale Behandlung unterworfen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 300 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP ein MCS-Insertions-Fragment isoliert.
Ein menschlicher Interleukin-6-Variante-Sekretionsvektor pSL2P36a'Cl (Beispiel 13) wurde einer doppelten Digestion durch Restriktionsenzyme AfIII und BamHI (vertrieben von Takara Shuzo Co.) für eine terminale Behandlung unterworfen und einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die ca. 4.500 Basenpaaren entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, und mittels der Glasperlen-Methode unter Verwendung von DNA-PREP wurde ein Vektorfragment isoliert.
Diese zwei Fragmente wurden mittels eines DNA-Ligations-Kits verknüpft. Nach Transformation von E. coli-DHS-Stamm wurden E. coli-Klone auf das Vorhandensein des wie in 8 dargestellten geeignet konstruierten Sekretionsvektors pSL2P3M1 gescreent.
pSL2P13M1 wurde in einer großen Menge durch Alkali-SDS-Methode hergestellt, und die Basen-Sequenzen der MCS-Sequenz und der der P-Faktor-Sekretionssignal-Sequenz entsprechende Region wurden bestimmt. Als Ergebnis wies die MCS-Sequenz eine durch SEQ ID NO: 29 repräsentierte Basensequenz von 75 bp auf, und es wird von der Basensequenz angenommen, dass die Aminosäure-Sequenz der Sekretionssignalsequenz durch SEQ ID NO: 26 repräsentiert wird.
Sequenzliste

Claims

Sekretionssignal-Gen, kodierend ein Polypeptid, das als Sekretionssignal in Schizosaccharomyces pombe funktionell ist, worin das Polypeptid aus einer Aminosäure-Sequenz vom ersten Aminosäure-Rest bis zum 31. ± 6. Aminosäure-Rest der SEQ ID NO: 1 und 1 bis 5 zusätzlichen Aminosäure-Resten besteht, um am C-Terminus des Polypeptids die Sequenz [-Lys-Lys-Arg] aufzuweisen.
Sekretionssignal-Gen nach Anspruch 1, worin das Polypeptid die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 26 aufweist.
Multiklonierender Vektor zur Konstruktion eines Expressionsvektors zur Expression eines Proteins in einer eukaryontischen Wirtszelle, der das Sekretionssignal-Gen nach Anspruch 1 oder 2 stromauf von einer Gen-Einführungsposition aufweist, wodurch das Sekretionssignal-Gen direkt an das einzuführende Gen geknüpft werden kann.
Expressionsvektor zur Expression in einer eukaryontischen Wirtszelle, der ein Strukturgen aufweist, das ein Protein kodiert, das aus einem Sekretionssignal und einem heterologen Protein, in dieser Reihenfolge vom Amino-Terminus zusammengebunden, besteht, worin das das Sekretionssignal kodierende Gen das Sekretionssignal-Gen nach Anspruch 1 oder 2 ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, der eine Tiervirus-abgeleitete Promotorregion aufweist, die die Expression des Strukturgens reguliert.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 4 oder 5, der ein Neomycin-Resistenzgen und einen zweiten Tiervirus-abgeleiteten Promotor, der die Expression des Neomycin-Resistenzgens reguliert, aufweist.
Isolierte nicht-menschliche eukaryontische Wirtszelle, umfassend eine rekombinante DNA, die ein ein Protein kodierendes Strukturgen enthält, das aus einem durch das Sekretionssignal-Gen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 kodierten Sekretionssignal und einem heterologen Protein, in dieser Reihenfolge vom Amino-Terminus zusammengebunden, besteht, oder den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 4 oder 5 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 7, die Schizosaccharomyces pombe ist.
Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins, das das Kultivieren des Transformanten nach Anspruch 7 oder 8 aufweist, damit das heterologe Protein in der Kultur produziert und angehäuft wird, und Gewinnen des heterologen Proteins.