DE68912777T2 - Insulin-analoge. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Insulin-Analoge, die gegen chemische Modifikationen stabilisiert sind, und neuartige Insulin-Zubereitungen, die solche Insulin-Analoge enthalten.
- Wenn Insulin bei Körper-(oder selbst Raum-)Temperatur gehandhabt wird, neigt die biologische Potenz dazu, als eine Funktion der Zeit abzunehmen. Solcher Verlust an biologischer Potenz kann bestimmten chemischen Modifikationen von Insulin zugeschrieben werden, die während der Lagerung auftreten.
- Wie andere Proteine ist Insulin kein stabiles Gebilde, sondern unterliegt einem Abbau durch chemische Reaktionen mit Molekülen oder Ionen in seiner Umgebung oder intra- und intermolekularen Umwandlungen innerhalb der Insulin-Moleküle.
- Hydrolytische Umwandlung von Insulin in saurer Lösung mit der Freisetzung von Ammonium-Ionen und Bildung von Desamidierungsprodukten ist von Sundby (J. Biol. Chem. 237 (1962), 3406- 4311) berichtet worden, der nachwies, daß Monodesamido-(A21)- Insulin das vorherrschende Derivat ist, das gebildet wird.
- Jackson et al. (Diabetes 21 (1972), 235-245) verglichen saure und neutrale Lösungen und zeigten, daß ähnliche, aber weniger ausgeprägte Desamidierung in neutralem regulären Insulin beobachtet werden kann. Langsame Desamidierung von Insulin in neutraler Lösung sowie in zwei unterschiedlichen neutralen Suspensionen wurde von Schiichtkrull et al. (Handbook of Experimental Pharmacology, New Series, Vol. XXXII/2, Springer Verlag, S. 729-777) berichtet.
- Bei höheren Lagerungstemperaturen kann signifikante Desamidierung auch in neutraler Lösung beobachtet werden, in der gezeigt worden ist, daß die hydrolytische Transformation in der B-Kette von Insulin hauptsächlich an Asn(B3) stattfindet (Brange et al., Diabetologia 25 (1983), 193 (Zusammenfassung)). Die Desamidierungsgeschwindigkeit in neutralen Insulin-Zubereitungen variiert mit der Formulierung.
- Während Desamido-Insulin, das in saurem Medium erzeugt ist, in Position A21 hydrolysiert wird, werden die bei neutralem pH gebildeten Produkte in der B-Kette zum Teil durch Hydrolyse von Asn(B3), zum Teil durch eine α-β-Aspartyl-Umlagerung von Asn(B3) mit gleichzeitiger Desamidierung desamidiert.
- Bildung kleiner Mengen kovalenter Dimerisations- und Polymerisationsprodukte von Insulin während der Lagerung von neutralen Zubereitungen wurde von Schlichtkrull et al. (aaO.) und Brange et al., Diabetologia 27 (1984), 259, berichtet. In neutralen Lösungen variiert diese Umwandlung mit dem Formulierung und der Insulin-Marke.
- Kovalente Dimerisation von Insulin beruht hauptsächlich auf einer Reaktion einer N-terminalen Aminogruppe mit einer Carboxamidgruppe von Asparagin oder Glutamin.
- Ein anderer Teil an Dimerisation beruht hauptsächlich auf einer Reaktion von Aldehyd mit Insulin-Aminogruppen, was eine Brücke zwischen zwei Insulin-Molekülen bildet.
- Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige Insulin-Analoge zur Verfügung zu stellen, die beträchtlich weniger empfindlich gegenüber den oben beschriebenen chemischen Umwandlungen und Abbau sind.
- Die Ziele der Erfindung werden mit den neuartigen Humaninsulin-Analogen, die hier im weiteren beschrieben sind, erreicht.
- Eine große Anzahl von Insulin-Analogen ist in der Vergangenheit beschrieben worden. Märki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619-1632) beschreiben die Synthese von Analogen von Humaninsulin, die sich von Humaninsulin im Ersatz einer einzelnen Aminosäure in den Positionen 2, 5, 6, 7, 8 und 11 der A-Kette und 5, 7, 13 und 16 der B-Kette unterscheiden, was neue Einsichten in die verblüffende Struktur-Aktivitäts-Beziehung von Insulin erlaubte. Weitere Studien modifizierten den Hauptrezeptorbindungsbereich in Insulin (B(22)- B(26)), um den Einfluß einer solchen Mutation auf die Rezeptorbindungsaktivität zu untersuchen. Stabilität gegen chemischen Abbau und Umwandlung wurde jedoch nicht diskutiert.
- Mit "Insulin-Analoge", wie hierin verwendet, ist eine Verbindung gemeint, die eine Molekularstruktur besitzt, die derjenigen von Insulin ähnlich ist, einschließlich der Disulfid- Brücken zwischen Cys(A7) und Cys(B7) und Cys(A20) und Cys(B19) und einer inneren Disulfid-Brücke zwischer Cys(A6) und Cys(A11), und mit Insulinaktivität.
- In ihrem breitesten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Insulin-Analoge zur Verfügung, in denen ein oder mehrere Asparagin-Reste (Asn) oder Glutamin-Reste (Gln) durch einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt worden sind. Die Insulin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung können dadurch gekennzeichnet werden, daß Asn in Position B3 durch einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist und daß außerdein wenigstens Gln in Position A5 oder A15 oder Asn in Position A18 oder A21 durch einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist und fakultativ auch Gln in Position B4 durch einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist.
- Die Substituenten für Gln können im Prinzip jeder natürlich auftretende Aminosäurerest ohne freie Amidgruppe in der Seitenkette sein. Bevorzugte Substituenten sind Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr und Gly, wobei Glu und Asp am bevorzugtesten sind.
- Die Substituenten für Asn können im Prinzip jeder natürlich auftretende Aminosäurerest sein, einschließlich Gln. Bevorzugte Substituenten sind Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Gly, Met, Trp und Gln, wobei Glu und Asp am bevorzugtesten sind. Bevorzugte Substituenten für Asn(B3) sind Asp, Gln, Ser, Thr oder Gly.
- Obgleich Asn vorzugsweise durch einen Aminosäurerest ersetzt ist, der keine freie Amidgruppe in der Seitenkette enthält, könnte eine Stabilisierung gegen chemischen Abbau in einigen Fällen durch Ersetzen von Asn durch Gln erhalten werden. Der Grund hierfür ist, daß Asn empfindlicher als Gln angesehen wird, desamidiert zu werden, um Umlagerungsprodukte zu bilden oder an Dimerisationsreaktionen teilzunehmen.
- Ersatz von Asn in B3 kann mit Ersatz von Asn(A21) oder Asn(A18) kombiniert werden. Auch kann Ersatz von Asn in B3 mit Ersatz von Asn in A18 und A21 oder Gln in A15 und Asn in A18 kombiniert werden.
- Die vorliegende Erfindung wird nicht als nur mit der Stabilisierung von nativen Insulinen, wie etwa Human-, Schweine- oder Rinderinsulin zusammenhängend angesehen. In den letzten Jahren sind eine Anzahi von Insulin-Analogen entwickelt worden, in denen bestimmte Aminosäurereste von Humaninsulin durch andere Aminosäurereste ersetzt worden sind.
- In der europäischen Patentanmeldung Nr.214826 sind schnellwirkende Insulin-Analoge beschrieben, in denen ein oder mehrere der Aminosäurereste in den Positionen A8, A9, A10, A13, A21, B1, B2, B5, B9, B10, B12, B14, B16, B17, B18, B20, B26, B27 und B28 von Humaninsulin durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt sind. Bevorzugte Substituenten sind Glu und Asp. Da diese Insulin-Analoge Asn und Gln in den Positionen A18 und B3 bzw. A5, A15 und B4 beibehalten haben, können sie ebenso gegen chemischen Abbau gemäß der vorliegenden Erfindung stabilisiert werden.
- Beispiele für solche schnellwirkenden Insulin-Analoge, die gegen chemischen Abbau stabilisiert sind, sind solche, die ein Asp oder Glu in Position B9, B10, B27 und/oder B28 enthalten.
- Eine andere Gruppe bekannter Insulin-Analoge ist beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 254,516. In diesen Insulin-Analogen ist ein basischer Aminosäurerest in der B27- Position ersetzt worden und/oder ein neutraler Aminosäurerest ist in die A4-, A17-, B13- und/oder B21-Position eingefügt worden. Außerdem kann Asn(A21) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt werden, um die Stabilität von Insulin-Lösung, die die Insulin-Analoge mit Langzeitwirkung enthält, bei saurem pH zu erhöhen. Die vorliegende Erfindung geht jedoch über das hinaus, was in EP Nr. 254,516 beschrieben ist, indem sie Substitutionen von Gln und/oder Asn auch in Position A5, A15, A18, B3 und B4 vorschlägt.
- Die vorliegende Erfindung wird auch als bestimmte Derivationen und weitere Substitutionen der Insulin-Analoge umfassend angesehen, vorausgesetzt daß solche Derivatiönen oder Substitutionen keinen wesentlichen Einfluß auf das angestrebte Ziel der Erfindung haben. Es ist demgemäß möglich, eine oder mehrere der funktionellen Gruppen in den Aminosäureresten zu derivatisieren. Zum Beispiel würde die per se bekannte Umwandlung von sauren Gruppen im Insulin-Molekül in Ester- oder Amidgruppen und Umwandlung von Alkoholgruppen in Alkoxygruppen oder umgekehrt als innnerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung liegend angesehen.
- Ebenfalls als innerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung liegend angesehen wird die Addition oder Entfernung einiger Aminosäurereste an den N- oder C-terminalen Enden der A- und B-Ketten, vorausgesetzt, daß dies keinen signifikanten Einfluß auf die Gesamteigenschaften der Insulin-Analoge hat.
- Solche Modifikationen an den Enden der A- und B-Polypeptidketten können in vitro auf den Insulin-Analogen gemäß der vorliegenden Erfindung oder mittels rekombinater DNA-Technologie ausgeführt werden, wie für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird.
- Die neuartigen Insulin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem das Proinsulin-Gen durch Ersetzen von (einem) Codon(s) an der geeigneten Stelle im nativen Human-Proinsulin-Gen durch (ein)Codon(s), das (die) den gewünschten Aminosäurerest-Ersatz kodiert (kodieren) geändert, oder die gesamte DNA-Sequenz, die das gewünschte Insulin-Analog kodiert synthetisiert wird. Das Gen, das das gewünschte Insulin-Analog kodiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der, wenn er in einen geeigneten Wirtsorganismus, z.B. E. coli, Bacillus oder Hefe, transferiert wird, das gewünschte Produkt erzeugt. Das exprimierte Produkt wird dann aus den Zellen oder der Kulturbrühe isoliert, abhängig davon, ob das exprimierte Produkt aus den Zellen sekretiert wird oder nicht.
- Die neuartigen Insulin-Analoge können auch durch chemische Synthese min Verfahren hergestellt werden, die zu dem von Märki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619- 1632) beschriebenen Verfahren analog sind. Sie können auch aus separat in vitro hergestellten A- und B-Ketten gebildet werden, die die geeigneten Aminosäurerestsubstitutionen enthalten, woraufhin die modifizierten A- und B-Ketten durch Aufbau von Disulfid-Brücken gemäß bekannten Verfahren (z.B. Change et al., in: Rick DH, Gross E (Hrg.) Peptides: Synthesis - Structure - Function. Proceedings of the seventh American peptide Symposium, Illinois, S. 721-728) verknüpft werden.
- Die Insulin-Analoge können außerdem durch ein Verfahren hergestellt werden, das zu dem der EP-Patentanmeldung Nr. 0163529A beschriebenen Verfahren analog ist, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme miteinbezogen ist. Mit einem solchen Verfahren wird ein Insulin-Vorläufer von Humaninsulin, in dem LysB29 mit GlyA21 mittels entweder einer Peptidbindung oder einer Peptidkette variierender Länge verbunden ist, mit richtig angeordneten Disulfid-Brücken von Hefe exprimiert und sekretiert und dann durch die sogenannte Transpeptidierungsreaktion in Humaninsulin überführt.
- Demgemäß können die vorliegenden Insulin-Analoge hergestellt werden, indem eine DNA-Sequenz, die einen Vorläufer des fraglichen Insulin-Analogs kodiert, in ein geeignetes Hefe-Expressionsvehikel inseriert wird, das, wenn es in Hefe transferiert wird, den Vorläufer des Insulin-Analogs expremieren und sekretieren kann, in dem LYSB29 mit GlyA21 durch eine Peptidbindung oder eine Peptidkette mit der Formel I verknüpft ist
- -Rn-R¹-, (I)
- in der R eine Peptidkette mit n Aininosäureresten ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist und R¹ Lys oder Arg ist, wenn der transformierte Hefestamm in einem geeigneten Nährmedium kultiviert wird. Der Vorläufer wird dann aus der Kulturbrühe gewonnen und mit einer Aminoverbindung mit der Formel II
- Q-OR'', (II)
- in der Q der Aminosäurerest ist, der in der B30-Position inseriert werden soll, vorzugsweise Thr, und R'' eine Carboxy- Schutzgruppe (z.B. Methyl oder tert.-Butyl) ist, unter Verwendung von Trypsin oder Trypsin-ähnlichem Enzym als einem Katalysator in einer Mischung aus Wasser und organischen Lösungsmitteln in analoger Weise zur Reaktion gebracht, wie beschrieben in US-Patent Nr. 4,343,898 (wobei dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme miteinbezogen ist), woraufhin die Carboxy- Schutzgruppe entfernt wird und das Insulin-Analog aus der Reaktionsmischung isoliert wird.
- Die Insulin-Analoge können auch mit einem Verfahren hergestellt werden, das zu dem in der EP-Patentanmeldung Nr. 86302133.3, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme miteinbezogen wird, beschriebenen Verfahren analog ist. Mit diesem Verfahren werden Insulin-Vorläufer des Typs, der eine Brücke zwischen der A- und B-Kette besitzt die aus einem einzelnen Paar basischer Aminosäuren (Lys, Arg) besteht, in Hefe hergestellt und dann durch eine enzymatische Umwandlung zu Insulin umgewandelt.
- Die vorliegenden Insulin-Analoge können für die Herstellung von neuartigen Insulin-Zubereitungen mit Insulinaktivität verwendet werden, die Human- oder Schweineinsulin in den bisher aus dem Stand der Technik bekannten Insulin-Zubereitungen ersetzen können. Solche neuartigen Insulin-Zubereitungen enthalten die Insulin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben in wäßriger Lösung oder Suspension, vorzugsweise bei neutralem pH. Das wäßrige Medium wird isotonisch gemacht, z.B. mit Natriumchlorid, Natriumacetat oder Glycerin. Außerdem kann das wäßrige Medium Zink-Ionen, Puffer, wie etwa Acetat und Citrat, und Konservierungsstoffe , wie etwa m-Kresol, Methylparaben oder Phenol, enthalten. Der pH-Wert der Zubereitung wird auf den gewünschten Wert eingestellt. Die Insulin-Zubereitung wird durch Sterilfiltration steril gemacht.
- Die Insulin-Zubereitungen dieser Erfindung können in zur Verwendung der bekannten Insulin-Zubereitungen ähnlicher Art und Weise verwendet werden.
- Die für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind diejenigen, die in J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558 angegeben sind. Die Aminosäuren liegen in der L-Konfiguration vor. Sofern nicht anders angegeben, ist die Art von Insulinen, die hierin angegeben sind, menschlich.
- Wie im folgenden Text verwendet, bedeutet B(1-29) eine verkürzte B-Kette von Humaninsulin von B(1)Phe bis B(29)Lys und A(1-21) bedeutet die A-Kette von Humaninsulin.
- Die Substitution(en) , die gemäß der Praxis der Erfindung im Humaninsulin-Molekül vorgenommen wird (werden), ist (sind) mit einem Präfix angegeben, das sich auf Humaninsulin bezieht. Als ein Beispiel bedeutet Glu(B3)-Humaninsulin ein Humaninsulin- Analog, in dem Asn in Position 3 in der B Kette durch Glu ersetzt worden ist. Glu(B3),B(1-29)-Ala-Ala Lys-A(1-21)-Humaninsulin bedeutet einen Vorläufer für das Insulin-Analog, in dem Asn in Position 3 in der verkürzten B-Kette (siehe oben) durch Glu ersetzt worden ist und in dem die B(1-29)-Kette und die A-Kette (A(1-21)) durch die Peptidsequenz Ala-Ala-Lys verknüpft sind. Sofern nicht anders angegeben, soll es selbstverständlich sein, daß die B(1-29)-Kette und die A(1-21)-Kette durch Disulfid-Brücken zwischen A(7)Cys urd B(7)Cys bzw. zwischen A(20)Cys und B(19)Cys wie in Humaninsulin verknüpft sind und daß die A-Kette die innere Disulfid-Brücke zwischen A(6)Cys und A(11)Cys enthält.
- Gene, die die Vorläufer des Insulin-Analogs kodieren, können durch Modifikation von Genen, die die entsprechenden Humaninsulin-Vorläufer kodieren, durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden, um Codons, die die gewünschte Mutation kodieren, zu inserieren oder mit diesen zu ersetzen. Eine DNA- Sequenz, die den Vorläufer des Insulin-Analogs kodiert, kann auch durch enzymatische Synthese aus öligonukleotiden hergestellt werden, die insgesamt oder zum Teil dem Insulin-Analog- Vorläufer-Gen entsprechen.
- DNA-Sequenzen, die ein Gen mit der gewünschten Mutation enthalten, werden dann mit einer geeigneten Promotorsequenz, z.B. Fragmenten, die für den TPI-Promoter (TPIp) kodieren (T. Alber und G. Kawasaki, Nucleotide Sequence of the triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Applied Genet. 1 (1982), 419-434) , einer geeigneten Leader-Sequenz und möglichen Transkriptionsterminationssequenz, z.B. von TPI aus S. cerevisiae (TPIT) kombiniert. Diese Fragmente stellen Sequenzen zur Verfügung, die eine hohe Transkriptionsrate für das den Vorläufer kodierende Gen sicherstellen, und stellen auch eine Vorsequenz zu Verfügung, die die Lokalisierung von Vorläufern in den sekretorischen Weg hinein und seine schließliche Exkretion in das Nährmedium hinein lewirkt. Die Expressionseinheiten sind außerdem versehen mit einem Hefe-Replikationsursprung, zum Beispiel dem 2u-Ursprung, und einem selektierbaren Marker, z.B. LEU 2.
- Für den Zweck dieser Erfindung stellten war die Gene, die den fraglichen Insulin-Analog-Vorläufer kodieren, durch Ligation von 10 Oligonukleotiden her, gefolgt von Insertion des Gens in ein Hefe-Expressionsplasmid, wie beschrieben von L. Thim et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83 (1986) 6766-6770, und J. Markussen et al., Protein Engineering 1 (1987), 215-223.
- Ein synthetisches Gen für den Vorläufer Asp(B3)B(1-29)-Ala- Ala-Lys-Glu(A15) ,Asp(A18) ,A(1-21) wurde aus 10 Oligonukleotiden durch Ligation aufgebaut. Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesizer unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie auf einem Glasträger mit kontrollierter Porengröße snythetisiert (Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H. Tetrahydron Letters 22 (1981) , 1859-1869). Das synthetische Gen war wie folgt:
- Buchstaben und Zahlen über der DNA-Sequenz geben den entsprechenden Aminosäurerest (mittels der Ein-Buchstaben-Abkürzung) bzw. seine Position in der B- und in der A-Kette an. Die Sequenz AlaAlaLys ist die Brücke zwischen der A- und der B-Kette. Ebenfalls dargestellt sind die Endonukleaserestriktionsstellen im synthetischen Gen.
- Das synthetische Gen wurde an ein 330 bp EcoRI-HgaI-Fragment aus Plasmid pKFN9, das für die MFα1-Signal- und -Leader- Sequenz(1-85) kodiert, und an das große EcoRI-XbaI-Fragment aus pUC19 ligiert. Die Konstruktion von pKFN9, das eine HgaI- Stelle unmittelbar nach der MFα1-Leadersequenz enthält, ist beschrieben in der EP-Patentanmeldung Nr. 0214826.
- Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;) zu transformieren, selektierend auf Ampicillinresistenz. Sequenzierung eines ³²p-XbaI-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980), 499- 560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die richtige DNA-Sequenz enthielten.
- Ein richtiges Plasmid wurde zur weiteren Verwendung ausgewählt und mit EcoRI und XbaI geschnitten. Das ECoRI-XbaI-Fragment wurde an ein 9,5 kb NcoI-XbaI-Fragment auf pMT636 und ein 1,4 kb NcoI-EcoRI-Fragment aus pMT636 ligiert Die Konstruktion von Plasmid pMT636 ist beschrieben in der WO-Patentanmeldung Nr. 89/01968. Es enthält das Schizo. pombe-TPI-Gen (POT), den S. cerevisiae-Triosephosphatisomerase-Promoter und -Terminator, TPIp und TPIT (Alber, T. und Kawasaki G., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982) , 419-434).
- Das resultierende Plasmid kodiert die folgende Sequenz
- TPIp-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Vorläufer-Gen-TPIT,
- in der MFα1 die S. cerevisiae-MFα1-Kodierungssequenz ist (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 (1982), 933-943) und Signal-Leader(1-85) bedeutet, daß die Sequenz die ersten 85 Aminosäurereste der MFαI-Signal-Leadersequenz enthält.
- Ein S. cerevisiae (E2-7B XE11-36 a/α, Δtpi Δtpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hefeextrakt, 2 % Bacto-Pepton, 2 % Galctose, 1 % Lactat) auf eine O.D. bei 600 nm von 0,6 gezüchtet.
- 100 ml Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbis, 25 mM Na&sub2;EDTA pH 8,0 und 6,7 mg/ml Dithiotreit enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbit, 10 mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat, pH = 5,8, und 2 mg Novozym 234 enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen durch Zentrkfugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH = 7,5) gewaschen und erneut in 2 ml CAS suspendiert. Für Transformation wurden 0,1 ml in CAS erneut suspendierte Zellen mit ungefähr 1 ug des oben beschriebenen Plasmids vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. 1 ml von (20 % Polyethylenglykol 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) wurde zugegeben und die Mischung weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33 % v/v YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) erneui suspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und der Pellet in 0,5 ml 1,2 M Sorbit erneut suspendiert. Dann wurden 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al., ( Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), das 1,2 M Sorbit plus 2,5 % Agar enthält) bei 52ºC zugegeben und die Suspension oben auf Platten gegossen, die dasselbe mit Agar verfestigte, Sorbit enthaltende Medium enthielten. Transformante Kolonien wurden nach drei Tagen bei 30ºC ausgewählt, erneut isoliert und verwendet, um Flüssigkulturen zu starten.
- Transformante Stämme wurden auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton (von Difco Laboratories) und 2 % Glucose) in einem 1500 Liter-Tank bei 30ºC gezüchtet. Das exprimierte Produkt wurde aus der Kulturbrühe isoliert. Die Ausbeute betrug 40,3 mg/Liter.
- 0,2 Mol (47,1 g) Thr-Met, HOAC wurden in DMF gelöst, um 100 ml Lösung zu ergeben, 50 ml 76,5 % v/v DMF in Wasser wurden zugegeben und 10 g rohes Asp(B3),B(1-29)-Ala-Ala-Lys- Glu(A15) ,Asp(A18)A(1-21)-Humaninsulin wurden in der Mischung gelöst, die bei 12ºc thermostatisiert wurde. Dann wurde 1 g Trypsin in 25 ml 0,05 M Calciumacetat zugegeben und nach 24 Stunden bei 12ºC wurde die Mischung zu 2 Litern Aceton zugegeben und die ausgefällten Peptide wurden durch Zentrifugation isoliert und im Vakuum getrocknet. Das Glu(A15) ,Asp(A18), Asp(B3) , B30Thr-OMe-Humaninsulin wurde auf einer präparativen HPLC-Säule mit Silica-C18 als Säulenmaterial gereinigt.
- Das Glu(A15) ,Asp(A18) ,Asp(B3),B30Thr-OMe-Humaninsulin wurde in Wasser auf 1 % (w/v) dispergiert und wurde durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxid bis zu einem pH-Wert von 10,0 gelöst. Der pH-Wert wurde konstant bei 10,0 für 24 Stnden bei 25 ºC gehalten. Das gebildete Glu(A15),Asp(A18),Asp(B3)-Humaninsulin wurde durch Zugabe von Natriumchlorid bis zu etwa 8 % (w/v), Natriumacetat-Trihydrat bis zu etwa 1,4 % (w/v) und Zinkacetat-Dihydrat bis zu etwa 0,01 % (w/v), getolgt von Zugabe von 1 N Salzsäure bis zu pH 5,5, ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert und durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt.
- 2,40 g Glu(A15),Asp(A18),Asp(B3)-Humaninsulin.
- Ein synthetisches Gen, das einen Vorläufern Glu(B3),Asp(B10)- Ala-Ala-Lys-Glu(A18)A(1-21) kodiert, wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Gen hatte die folgende Sequenz: Buchstaben und Zahlen über der DNA-Sequen geben den entsprechenden Aminosäurerest (mittels der Ein-Buchstaben-Abkürzung) bzw. seine Position in der B- und in der A-Kette an. Die Sequenz AlaAlaLys ist die Brücke zwischen der A- und der B-Kette. Ebenfalls dargestellt sind die Endonukleaserestriktionsstellen im synthetischen Gen.
- Das synthetische Gen wurde in ein Hefe-transformierendes Plasmid inseriert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Transformation von Hefe und Kultivierung des transformierten Hefestamms wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute des Vorläufers betrug 87,3 mg/Liter. Der Vorläufer wurde transpeptidiert und in das obige Endprodukt mit derselben Verfahrensweise wie in Beispiel 1 überführt. Ausbeute an Glu(A18),Glu(B3) Asp(B10)-Humaninsulin betrug 17,73 g.
- Ein synthetisches Gen für den Vorläufer Gln(B3)B(1-29)-Ala- Ala-Lys-Gly(A21)A(1-21) wurde aufgebaut, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das synthetische Gen hatte die folgende Sequenz:
- Buchstaben und Zahlen über der DNA-Sequenz geben den entsprechenden Aminosäurerest (mittels der Ein-Buchstaben-Abkürzung) bzw. seine Position in der B- und in der A-Kette an. Die Sequenz AlaAlaLys ist die Brücke zwischen der A- und der B-Kette. Ebenfalls dargestellt sind die Endonukleaserestriktionsstellen im synthetischen Gen.
- Das synthetische Gen wurde in ein Hefe-transformierendes Plasmid inseriert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Transformation von Hefe und Kultivierung des transformierten Hefestamms wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute des Vorläufers betrug 19,6 mg/Liter. Der Vorläufer wurde transpeptidiert und in das obige Endprodukt mit derselben Vorgehensweise wie in Beispiel 1 überführt. Ausbeute an Gly(A21),Gln(B3)-Humaninsulin betrug 0,31 g.
- Ein synthetisches Gen für den Vorläufer Thr(B3)B(1-29)-Ala- Ala-Lys-His(A18),Ser(A21)A(1-21) wurde aufgebaut, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das synthetische Gen hatte die folgenden Sequenz:
- Buchstaben und Zahlen über der DNA-Sequenz geben den entsprechenden Aminosäurerest (mittels der Ein-Buchstaben-Abkürzung) bzw. seine Position in der B- und der A-Kette an. Die Sequenz AlaAlaLys ist die Brücke zwischen der A- und der B-Kette. Ebenfalls dargestellt sind die Endonukleaserestriktionsstellen im synthetischen Gen.
- Das synthetische Gen wurde in ein Hefe-transformierendes Plasmid inseriert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Transformation von Hefe und Kultivierung des transformierten Hefestamms wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute des Vorläufers betrug 7,3 mg/Liter. Der Vorläufer wurde transpeptidiert und in das obige Produkt mit derselben Vorgehensweise wie in Beispiel 1 überführt. Ausbeute an His(A18),Ser(A21), Thr(B3)-Humaninsulin betrug 0,79 g.
- Neutrale Lösungen der obigen Insulin-Analoge, die Phenol und Glycerin enthielten, wurden nach Lagerung für 4 Wochen bei 37ºC auf Stabilität getestet. Als Referenz wurde eine zinkfreie neutrale Lösung von Humaninsulin und ein schnellwirkendes Insulin Asp(B10)-Humaninsulin verwendet. Prozente an Desamido-Produkten wurden bestimmt mit HPLC. Die Ergebnisse erscheinen aus der folgenden Tabelle. Tabelle 1 Getestete Verbindung % Desamido-Insulin Glu(A15),Asp(A18),Asp(B3)-Humaninsulin Gly(A21),Gln(B3)-Humaninsulin His(A18),Ser(A21),Thr(B3)-Humaninsulin Humaninsulin, zinkfrei (Referenz) Glu(A18),Gln(B3),Asp(B10)-Humaninsulin Asp(B10)-Humaninsulin (Referenz)
- Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 wird deutlich, daß die Insulin-Analoge der vorliegenden Erfindung merkbar weniger desamidiert werden als die Referenzverbindungen und daher bei Lagerung stabiler sind.
- Das neuartige Insulin wurde auf in-vitro-Insulinaktivität mit Humaninsulin als Standard mit einem Free Fat Cell Assay (FFC) getestet, wie beschrieben von A. J. Moody et al., Hormone Metab. Res. 6 (1974) 12-16, unter Verwendung von Mäuse-Adipozyten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 2 Getestete Verbindung FFC % von Humaninsulin Glu(A15),Asp(A18),Asp(B3)-Humaninsulin Glu(A18),Glu(B3),Asp(B10)-Humaninsulin Gly(A21),Gln(B3)-Humaninsulin His(A18),Ser(A21),Thr(B3)-Humaninsulin
- Biologische in-vitro-Aktivität in der obigen Größenordnung wird einer biologischen in-vivo-Aktivität derselben Größenordnung wie derjenigen von Humaninsulin entsprechen (U. Ribel et al., Diabetes Research and Clinical Practice, Supp. 1 zu Vol.5, Pos. 003-3, 1988)
Claims (8)
1. Humaninsulin-Analoge, in denen Asn in Position B3 durch
einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest
ersetzt ist und in denen außerdem wenigstens Gln in
Position A5 oder A15 oder Asn in Position A18 oder A21 durch
einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest
ersetzt ist und fakultativ auch Gln in Position B4 durch
einen anderen natürlichen auftretenden Aminosäurerest
ersetzt ist.
2. Humaninsulin-Analoge nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Asn in Position B3 und A18 durch einen
anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist.
3. Humaninsulin-Analoge nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Asn in B3 und A21 durch einen anderen
natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist.
4. Humaninsulin-Analoge nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Asn in Position B3 und A21 und Gln in
Position A15 durch einen anderen natürlich auftretenden
Aminosäurerest ersetzt ist.
5. Humaninsulin-Analoge nach den vorangehenden Ansprüchen,
dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest-Ersatz in
den Positionen A18, A21 und B3 ausgewählt ist aus der
Gruppe, die aus Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile,
Ala, Met, Trp, Tyr, Gly und Gln besteht, und der
Aminosäurerest-Ersatz in Position A5, A15 und B4 ausgewählt
ist aus der Gruppe, die aus Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val,
Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr und Gly besteht.
6. Humaninsulin-Analoge nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B3 Asp, Gln,
Ser, Thr oder Gly ist.
7. Insulin-Zubereitungen mit Insulinaktivität, dadurch
gekennzeichnet, daß sie ein Insulin-Analog nach einem der
vorangehenden Ansprüche oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz desselben enthalten.
8. Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hefestamm, der mit
einem replizierbaren Expressionsvehikel transformiert
ist, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die einen Vorläufer des
Insulin-Analogs kodiert, in dem LysB29 mit GlyA1 verknüpft
ist durch eine Peptidbindung oder eine Peptidkette mit
der Formel I
-Rn-R¹-, (I)
in der R eine Peptidkette mit n Aminosäureresten ist, n
eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist und R¹ Lys oder Arg ist,
in einem geeigneten Nährstoffmedium kultiviert wird, der
Vorläufer aus der Kulturbrühe gewonnen und mit einer
Aminoverbindung mit der Formel II
Thr-OR", (II)
in der R ein Carboxy-Schutzgruppe ist, unter Verwendung
von Trypsin oder einem trypsinähnlichen Enzym als einem
Katalysator in einer Mischung aus Wasser und organischen
Lösungsmitteln zur Reaktion gebracht wird, woraufhin die
Carboxy-Schutzgruppe durch Hydrolyse entfernt wird.
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