KR20100111683A

KR20100111683A - 극히 지연된 시간-작용 프로필을 갖는 신규 인슐린 유도체

Info

Publication number: KR20100111683A
Application number: KR1020107014964A
Authority: KR
Inventors: 파울 하버만; 게르하르트 자이프케; 롤란트 쿠를레; 귄터 뮐러; 마르크 좀머펠트; 노르베르트 텐나겔스; 게오르크 창크; 울리히 베르너
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2008-01-09
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2010-10-15
Also published as: TW200942257A; CN101970476B; IL206843A0; AU2009203810B2; AR070119A1; CA2711752A1; HK1148542A1; JP5695909B2; WO2009087082A3; NZ586589A; PE20091305A1; MA31997B1; CO6290770A2; UY31597A1; CN101970476A; US8633156B2; TWI433681B; EP2229406B1; AU2009203810A1; ZA201003927B

Abstract

본 발명은 음하전 및 양하전 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환, B 쇄의 C-말단 카르복시 그룹의 아미드화 및 인슐린 A 쇄의 위치 8에 히스티딘을 특징으로 하는, 기본 시간-작용 프로필을 갖는 신규 인슐린 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이의 생산 및 용도에 관한 것이다.

Description

극히 지연된 시간-작용 프로필을 갖는 신규 인슐린 유도체{Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile}

본 발명은 기본 시간/작용 프로필을 갖는 신규 인슐린 유사체, 이의 제법 및 용도에 관한 것이다.

당뇨병의 빈도는 최근에 거의 유행병 수준으로 증가했다. 이 장애는 평균수명의 심각한 단축을 초래할 수 있다. 당뇨병이 있는 사람들은 자신의 신체에 외부로부터 인슐린을 빈번하게 공급해야만 한다. 인슐린 치료는 최적화하는 것이 민감할 수 있다. 특정 약리 성질이 있는 다른 인슐린은 지금도 이용할 수 있다. 실제로, 다른 인슐린은 자신의 작용 기간에 따라 단기 작용성 인슐린, 속효성 인슐린, 장기 작용성 인슐린 및 혼합 인슐린으로 세분된다. 장기 작용성 인슐린과 동의어로 사용되는 명칭은 서방형 인슐린, 데포(depot) 인슐린 또는 그 외 기저(basal) 인슐린이다. 이러한 많은 인슐린 산물에서 활성 성분은 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 사람 인슐린으로부터 유래된 소위 인슐린 유사체이다. "인슐린 유사체" 및 "인슐린"이란 용어는 본 발명에서 동의어로 사용되고 있다.

집중 인슐린 요법의 정책은 기저 인슐린을 조기 투여하여 혈당 수준을 안정하게 조절하는 것을 목표로 하여 건강 위험을 감소시키고자 한다. 현행 기저 인슐린의 한 예는 약제 Lantus®(활성 성분: 인슐린 글라진 = Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) 사람 인슐린)이다. 새로운 개량된 기저 인슐린을 개발하는데 있어서 일반적인 목표는 혈당 저하 사건 횟수를 최소화하는 것이다. 이와 관련하여 이상적인 기저 인슐린은 각 환자 중에서 적어도 24시간 동안 확실하게 작용하는 것이다. 인슐린 효과는 지연형 개시 및 가능한 한 얕은 시간/작용 프로필을 나타내어, 순간적인 혈당저하의 위험이 분명하게 최소화되고 식품의 사전 섭취 없이도 투여가 가능한 것이 이상적이다. 인슐린 효과가 가능한 오랫동안 동일한 수준으로 지속적일 때, 즉 일정량의 인슐린이 체내에 공급될 때에는 기저 인슐린의 공급이 양호한 것이다. 이에 따르면 혈당저하 사건의 위험이 낮고 환자-특이적 및 일간(day)-특이적 변동성이 최소화된다. 따라서, 이상적인 기저 인슐린의 약동학적 프로필은 지연형 작용 개시 및 지연형, 즉 장기 지속성 및 균일한 작용을 특징으로 해야 한다.

하지만, 이미 달성된 치료요법적 장점에도 불구하고, 지금까지 기술된 서방형 인슐린 중에는 이상적인 기저 인슐린의 약동학적 성질을 나타내는 것이 없다. 바람직한 인슐린은 혈당저하 사건의 위험과 일간 의존적인 변동의 위험이 환자 중에서 더욱 최소화되고 작용 기간이 더욱 지연성이어서 어떠한 경우에도 인슐린을 매일 투여할 필요가 전혀 없을 정도로 얕고 장기 지속성 시간/작용 프로필을 나타내는 것이다. 이것은 당뇨환자, 특히 인슐린을 스스로 투여할 수 없는 간호를 필요로 하는 자 및 노인성 당뇨병 환자들의 간단해진 치료를 가능하게 할 것이며, 이에 따라 엄청난 경제적 이익을 줄 것이다. 이러한 기저 인슐린은 또한 2형 당뇨병의 초기 단계에 유익할 것이다. 임상가들은 많은 사람들에 존재하는 주사 공포증이 양호한 시기에 인슐린 요법을 시작하지 못하게 한다고 보고한다. 결과적으로, 혈당 조절이 좋지 않아 당뇨병의 말기 후유증을 야기한다. 주사 투여되는 인슐린 용량의 횟수를 줄이는 기저 인슐린은 환자가 더욱 허용할 수 있는 인슐린 요법의 효과를 제공할 것이다.

콘 등(Kohn et al., Peptides 28(2007) 935-948)은 사람 인슐린의 등전점(pI = 5.6)과 비교하여 알칼리 범위의 방향으로 등전점(pI)이 이동하는 인슐린 유사체를 B 쇄 말단에 또는 A 쇄와 B 쇄의 N 말단에 리신 또는 아르기닌을 부가하여 제조함으로써 생리학적 조건 하에서 용해도가 감소되어 장기적인 시간/작용 프로필을 초래하여 인슐린의 약동학을 최적화할 수 있는 방법을 기술한다. 이와 관련하여 콘 등은 아이디어의 상황에서 최상의 화합물로 화합물 18(Arg(A0), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) 사람 인슐린(pI 측정값 = 7.3; pI 계산값 = 7.58))을 기술하고 있다. 콘 등은 신규 인슐린 유사체를 디자인하는데 있어서 주요 목표를 pI = 5.6의 등전점을 중성 범위로 증가시키기 위해 사람 인슐린의 아미노산 서열에 양하전 아미노산을 부가하는 것이라 생각한다.

하지만, 이제 다음과 같은 특징을 나타내는 인슐린 유사체에 의해 전술한 바람직한 기본 시간/작용 프로필이 수득된다는 것이 놀랍게 발견되었다:

· B 쇄 말단은 리신 또는 아르기닌아미드와 같은 아미드화된 염기성 아미노산 잔기로 이루어지고, 즉 B 쇄 말단의 아미드화된 염기성 아미노산 잔기에서 말단 아미노산의 카르복실 그룹은 이의 아미드화된 형태로 존재하며,

· A8 아미노산 위치는 히스티딘 잔기가 차지하고 있고,

· A21 아미노산 위치는 글리신 잔기, 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기가 차지하고 있고,

· A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 및 B4를 포함하는 그룹 중 하나 이하의 아미노산 잔기가 Asp 또는 Glu에 해당한다.

놀랍게도, 정확하게 전술한 인슐린 유사체는 이상에 가까운, 즉 지연된 얕은 작용 개시 및 더 긴 작용 기간과 같은 원하는 유익한 시간/작용 프로필을 나타낸다. 이에 따라 혈당저하 사건의 위험이 분명하게 최소화된다. 이러한 지연은 놀랍게도, 래트를 이용한 모델 실험에서도 그 효과를 검출할 수 있을 정도로 현저했다. 이에 반해, 인슐린 글라진의 지연 작용은 도 2에 제시된 바와 같이 래트에서 분명하게 관찰할 수 없었다. 도 1은 본 발명의 화합물 YKL202 및 YKL203의 혈당저하 효과를 나타낸 것이다. 래트 실험에서 수득된 결과는 개 실험에서도 확인된다. 다시 한번, 작용 기간은 인슐린 글라진보다 분명하게 긴 것으로 관찰된다. 따라서, 뚜렷이 덜 빈번하게 투여되어야 하는 신규 기저 인슐린이 제공된다. 전술한 약동학적 이점 외에도, 본 발명의 유사체는 인슐린 글라진과 비교 시에, 약리학적 관점에서 우수한 성질을 나타낸다. 또한, 본 발명의 인슐린은 생리화학적 관점에서도 이점을 나타낸다.

이에, 본 발명은 놀랍게도 하기 화학식 I의 인슐린 유사체가 바람직한 약리학적 프로필, 즉 지연된 작용 개시 및 장기 지속적이고 균일한 효과를 나타낸다는 것을 발견했다:

화학식 I

상기 화학식 I에서,

A-1은 Lys, Arg 또는 아미노 그룹에 해당하고;

A0은 Lys, Arg 또는 화학적 결합에 해당하며;

A1은 Arg 또는 Gly에 해당하고;

A5는 Asp, Glu 또는 Gln에 해당하며;

A15는 Asp, Glu 또는 Gln에 해당하고;

A18은 Asp, Glu 또는 Asn에 해당하고;

A21은 Ala, Ser, Thr 또는 Gly에 해당하고;

B-1은 Asp, Glu 또는 아미노 그룹에 해당하고;

B0은 Asp, Glu 또는 화학 결합에 해당하며;

B1은 Asp, Glu, Phe 또는 화학 결합에 해당하고;

B3은 Asp, Glu 또는 Asn에 해당하고;

B4는 Asp, Glu 또는 Gln에 해당하고;

B29는 Arg, Lys, 또는 아미노산 Phe, Ala, Thr, Ser, Val, Leu, Glu 또는 Asp를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산, 또는 화학 결합에 해당하고;

B30은 Thr 또는 화학 결합에 해당하고;

B31은 Arg, Lys 또는 화학 결합에 해당하고;

B32는 Arg-아미드 또는 Lys-아미드에 해당하며,

A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 및 B4를 포함하는 그룹 중의 1개 이하의 아미노산 잔기는 Asp 또는 Glu에 해당한다. 따라서 본 발명은 이러한 인슐린 유사체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 및 B4를 포함하는 그룹의 하나의 아미노산 잔기가 Asp 또는 Glu에 해당하는, 전술한 인슐린 유사체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 바람직하게는 A-1이 Arg에 해당하거나, A0이 Arg에 해당하거나, A5가 Glu에 해당하거나, A15가 Glu에 해당하거나, A18이 Asp에 해당하거나, A8이 His에 해당하거나, A21이 Gly에 해당하거나, B0이 Glu에 해당하거나, B3이 Asp에 해당하거나, B4가 Glu에 해당하거나, B30이 Arg에 해당하거나, 또는 B30이 Lys에 해당하는, 전술한 인슐린 유사체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다음을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 전술한 인슐린 유사체에 관한 것이다:

언급된 인슐린 유사체의 명칭에서 "사람 인슐린"이란 용어의 상세 사항은 사람 인슐린의 A 쇄와 B 쇄의 아미노산 서열을 언급하는 것으로, 이로부터의 모든 변수(부가, 치환, 결실)는 제시된 인슐린 유사체의 명칭에 표시되어 있다.

또한, 본 발명은 전술한 인슐린 유사체의 제조방법으로, 인슐린 유사체의 전구체를 재조합으로 제조하고, 이 전구체를 2-쇄 인슐린으로 효소적으로 가공하고, 아르기닌아미드와의 커플링을 트립신 활성이 있는 효소의 존재 하에 수행한 다음, 인슐린 유사체를 분리하는 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 진성 당뇨병, 특히 I형 또는 II형 진성 당뇨병을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용되는 전술한 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 인슐린 유사체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 연골 재생에 치료요법적으로 이용되는 전술한 인슐린 유사체를 포함하는 약제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 베타 세포 재생을 보조하는데 치료요법적으로 이용되는 전술한 인슐린 유사체를 포함하는 약제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 용해된 인슐린 유사체를 포함하는 수성 형태인, 전술한 인슐린 유사체의 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 분말 형태, 특히 결정형 및/또는 무정형인, 전술한 인슐린 유사체의 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 현탁액 형태인 전술한 인슐린 유사체의 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학적 샤페론을 추가로 포함하는 전술한 인슐린 유사체의 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 인슐린 유사체의 전구체를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 인슐린 유사체의 A 쇄를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 인슐린 유사체의 B 쇄를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 DNA를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 DNA 또는 전술한 벡터를 포함하는 숙주 유기체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 C 펩타이드가 이의 N 말단에 아미노산 잔기 아르기닌을 보유하고 C 말단이 Arg Arg, Arg Lys 또는 Lys Arg Arg 형태인 것을 특징으로 하는 프리프로인슐린(preproinsulin) 유사체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP1) 또는 이의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘(exendin)-3 또는 -4 또는 이의 유사체 또는 유도체, 바람직하게는 엑센딘-4를 추가로 포함하는 전술한 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 엑센딘-4의 유사체가

를 포함하는 그룹 중에서 선택되거나, 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염인 전술한 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 엑센딘-4의 유사체가

를 포함하는 그룹 중에서 선택되거나 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염인 전술한 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 문단에 기술된 제형으로, 펩타이드 -Lys₆-NH₂가 엑센딘-4의 유사체의 C 말단에 부착되어 있는 제형에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 엑센딘-4의 유사체가

또한, 본 발명은 추가로 Arg³⁴, Lys²⁶ (N^ε(γ-글루타밀(N^α-헥사데카노일))) GLP-1 (7-37) [리라글루타이드(liraglutide)] 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 전술한 제형에 관한 것이다.

이와 관련하여 당업자에게 명백한 것은, 본 발명의 인슐린이 투여 후에 유익한 효과를 나타내는 약제학적 제형 품목일 수 있다는 것이다. 이와 관련하여 출발점은 수용액이다. 따라서, 추가 성분은 혼화성이어야 한다. 이 제제는 동물 기원 유래의 임의의 성분을 포함하지 않아야 한다는 점에서 바이러스의 동물 오염의 위험성은 최소화된다. 또한, 보존제를 첨가하여 미생물 오염을 방지하는 것도 유익하다. 등장제를 첨가해서 투여 부위에 있는 조직 세포의 생리기능에 미치는 제형의 부정적인 효과의 가능성을 상쇄시키는 것도 가능하다. 프로타민의 첨가는 안정화 효과가 있을 수 있어, 제형에 프로타민을 첨가하여 실질적으로 염이 없는 인슐린 제제를 수득할 수 있다. 페놀계 성분의 첨가는 사용된 인슐린 유사체의 구조의 안정성을 야기할 수 있고, 이로써 추가로 특히 작용 개시에 대한 지연 효과를 유발할 수 있다. 또한, 본 발명의 서방형 인슐린의 공간 구조를 안정시키고 더 우수한 열안정성을 야기하는 물질을 제형에 첨가하는 것도 가능하다. 이러한 화학적 샤페론은 예컨대 짧은 합성 펩타이드일 수 있으며, 이것은 또한 아미노산 유사체를 포함할 수도 있고, 또는 인슐린의 C 펩타이드 유래의 펩타이드 서열 등을 포함할 수도 있다.

본 발명의 인슐린은 데포(depot) 형태의 개발을 위해 나노입자에 혼입될 수 있다. 또한, 본 발명의 서방형 인슐린이 중합체 담체에 가역적으로 결합하여 존재하는 소위 서방형 제형도 생각할 수 있다.

본 발명의 인슐린은 고속 작용성 인슐린, 예컨대 Apidra^®, NovoRapid^®, Humalog^®, 또는 개발 중인 인슐린 유도체와 함께, 또는 적당한 시간/작용 프로필을 가진 제형 또는 흡입성 인슐린 또는 개발 중인 비측 또는 경구 투여성 인슐린과 함께 병행 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 서방형 인슐린과 고속 작용성 인슐린의 적당히 배합된 혼합물도 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 본 발명의 인슐린 유사체는 또한 GLP-1(글리카곤 유사 펩타이드-1) 또는 엑센딘-4 또는 엑센딘-3과 비슷한 활성으로 설명되는 펩타이드를 포함하는 약제학적 제제에도 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드의 예로는 제법이 특허출원 WO 2006/058620, WO 2001/04156, WO 2004/005342 및 WO 98/08871에 설명되어 있는 펩타이드, 엑세나티드(Byetta^®) 또는 GLP-1(7-37)이 있다. 이와 관련하여 특히 유익한 제형은 상기 펩타이드의 데포 제형을 함유하는 것이다. II형 당뇨병의 초기에 특히 유익한 치료법의 종류는 메트포민과 같이 인슐린의 효과를 증가시키는, 본 발명의 약제의 투여와 함께 병행 제공하는 것이다. 인크레틴의 수준을 증가시키는 디펩타이딜 펩티다제-4 저해제와의 병용 요법은 췌장에서 인슐린 분비를 증가시키는 설포닐우레아와의 병용과 같이 마찬가지로 가능하다. 본 발명의 서방형 인슐린은 적당한 줄기 세포 유래의 베타 세포의 재생이 분화 인자의 투여에 의해 개시될 때 특히 유익하게 이용될 수 있다. 이러한 적용예들은 모두 당뇨병의 치료법에 대해 예시적으로 언급된 것으로, 본 발명도 마찬가지로 이에 관한 것이다. 이에 따라, 본 발명은 당뇨병, 특히 I형 또는 II형 당뇨병을 치료하기 위해 다른 활성 성분과 함께 사용되는 본 발명의 인슐린의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 골격에 관한 재생 과정, 예컨대 연골 재생에 사용되는 본 발명의 인슐린의 용도에 관한 것이다. 이 용도에서 중요한 것은, 강한 대사 반응을 동시에 유발함이 없이, 인슐린의 분열촉진능을 조절 이용하게 하는 것이다.

또한, 본 발명은 특히 수성 제형 또는 분말을 나타내는 본 발명의 유사체를 포함하는 약제에 관한 것이다.

상기 약제는 바람직하게는 주사용 용액 또는 현탁액인 약제학적 제제이고, 용해된 형태, 무정형 형태 및/또는 결정질 형태, 바람직하게는 용해된 형태인, 본 발명의 적어도 하나의 인슐린 유사체, 및/또는 이의 적어도 하나의 생리학적으로 허용되는 염의 함유량을 특징으로 한다.

상기 제제는 pH가 바람직하게는 약 2.5 내지 8.5, 특히 4.0 내지 8.5이고, 적당한 등장화제, 적당한 보존제 및 적당한 경우 적당한 완충제 및 바람직하게는 추가로 특정 아연 이온 농도를 멸균 수용액에 포함하는 것이 좋다. 활성 성분 외에 제제 성분의 총량은 제제 담체를 형성한다. 적당한 등장화제는 예컨대 글리세롤, 글루코스, 만니톨, NaCl, 칼슘 또는 마그네슘 화합물, 예컨대 CaCl₂ 등이다. 약산성 pH 값에서 본 발명의 인슐린 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 용해도는 등장화제 및/또는 보존제의 선택에 의해 영향을 받는다.

적당한 보존제의 예는 페놀, m-크레졸, 벤질 알콜 및/또는 p-하이드록시벤조산 에스테르이다.

pH를 특히 약 4.0 내지 8.5로 조정하는데 사용할 수 있는 완충제 물질은 예컨대 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 등이다. 그렇지 않다면, 생리학적으로 허용되는 묽은 산(일반적으로 HCl) 또는 알칼리(일반적으로 NaOH)도 pH를 조정하는데 적당하다.

제제가 아연 함유물을 보유한다면, 그 함량은 1㎍/ml 내지 2mg/ml 중 하나, 특히 1㎍/ml 내지 200㎍ 아연/ml인 것이 바람직하다. 놀랍게도 본 발명의 인슐린 유사체의 작용 프로필은 Zn을 첨가함으로써 만족스럽게 영향을 미칠 수 있다. 이것은 총 작용 기간, 작용 개시 속도 및 작용 효과 곡선의 프로필에 대해 상이하고, 이에 따라 환자 개개인의 안정화를 허용하는 제제의 생산을 가능하게 한다.

본 발명의 제제의 활성 성분 프로필을 변동시키기 위해서, 미변형 인슐린, 바람직하게는 소, 돼지 또는 사람 인슐린, 특히 사람 인슐린, 또는 인슐린 유사체 및 이의 유도체를 혼합하는 것도 가능하다. 이와 마찬가지로, GLP-1(글루카곤 유사 펩타이드-1)과 비슷한 활성을 특징으로 하는 하나 이상의 엑센딘-4 유도체 또는 펩타이드를 혼합하는 것도 가능하다. 역시, 본 발명은 이러한 약제(제제)에 관한 것이다.

바람직한 활성 성분 농도는 약 1 내지 1500 IU(국제 단위)/ml, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 1000 IU/ml, 특히 약 40 내지 400 IU/ml에 해당하는 농도이다.

본 발명의 인슐린 유사체는 먼저 아직 아미드를 포함하지 않는 전구체로 생물공학적으로 제조한다. 당업자는 인슐린 제조의 다양한 가능 방법을 잘 알고 있다. 이와 관련하여 사용되는 숙주 세포계는 세균, 효모 및 고등 식물 또는 발효 배양용 식물 세포이다. 비용면에서 가능하다면, 숙주계로 동물 세포를 이용하는 발현계도 생각할 수 있다. 하지만, 이의 전제조건은 동물 바이러스의 확실한 부재이다. 따라서, 예시적으로 기술된 발현계는 단백질의 재조합 제조를 위해 개발된 숙주/벡터계의 작은 일부만을 나타내는 것임을 분명하게 알 수 있다. 예를 들어, 효모 또는 식물계, 예컨대 이끼, 조류 또는 고등 식물, 예컨대 담배, 완두콩, 홍화, 보리, 옥수수 또는 오일씨드 평지 식물을 기반으로 한 생물공학적 공정은 본 출원에 기술되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 역시 적당한 생물공학적 발현계에서 표적 펩타이드가 제조될 수 있게 하는 암호화 DNA 서열 및 숙주/벡터계를 포함한다. 이에 따라, 숙주 유기체는 식물계 중에서 시조마이세테스(Schizomycetes), 세균 또는 남조류(blue algae)를 포함하는 제1 시조피타(Schizophyta) 문(division)의 유기체, 제2 문 피코피타(Phycophyta) V강 클로로피시에(Chlorophyceae)의 유기체, 제2 문 피코피타 VII강 로도피시에(Rhodophyceae)의 유기체, 제3 문 미코피타(Mycophyta)의 유기체, 제5 문 브리오피타(Bryophyta)의 유기체 및 제7 문 스퍼마토피타(Spermatophyta)의 유기체 중에서 선택할 수 있다.

유럽 특허 출원 EP-A 1 222 207은 변형된 C 펩타이드를 포함하는 프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT358d를 기술한다. 지금은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 도움을 받아 프로인슐린-암호화 서열을 특별하게 변형시켜 본 발명의 인슐린 전구체로 작용할 수 있는 프리프로인슐린을 발현하는 것이 가능하게 할 수 있다. 해당 융합 단백질은 반드시 세포내 제조될 필요는 없다. 당업자에게는 이러한 단백질이 세균 발현에 의해 제조된 다음 세포질 및/또는 배양 상청액으로 분비될 수도 있다는 것은 명백한 것이다. 유럽 특허 출원 EP-A 1 364 029는 이것을 예시적으로 설명한다. 본 발명은 마찬가지로 본 발명의 유사체를 야기하는 프로인슐린 전구체에 관한 것이다.

이러한 방식으로 제조된 프로인슐린은 본래 위치 A0에 리신 또는 아르기닌을 포함하고 B 쇄의 C-말단 말단에 리신 또는 아르기닌을 보유하는 인슐린 유사체 전구체로 변환될 수 있다. 대안적으로, 리신 또는 아르기닌이 아직 존재하지 않는다면 A 쇄의 N 말단에 양하전 아미노산을 반합성적으로 부가하는 것도 가능하다.

본 발명의 프로인슐린이 세균에서 세포내 발현 후에 봉입체 형태 또는 용해성 형태이면, 이 전구체는 시험관내 폴딩에 의해 정확한 입체형태로 폴딩된 다음, 가공 및 생화학적 변형이 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 기술된 융합 단백질은 우레아 또는 구아니디늄 염산염에 의한 변성 후에 직접 폴딩할 수 있고, 본 발명은 또한 폴딩 중간체에 관한 것이다.

각 중간체를 농축하는 데에는 생화학적 방법이 사용되며, 특히 기본 원리는 공개되어 있고 사실상 교과서의 주제인 분리 방법이 사용된다. 당업자에게 이러한 원리들이 결과적으로 조합될 수 있고, 이에 따라 그 순서가 종래 공개된 적이 없는 방법을 야기할 수 있다는 것은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 유사체의 정제를 야기하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유사체의 제조방법으로, 인슐린 유사체의 전구체가 재조합으로 제조되고, A 쇄의 아미노산 1에 대해 N-말단에 아르기닌 또는 리신을 보유하고 B 쇄의 C-말단 말단에 리신 또는 아르기닌 잔기를 보유하되, 트립신 활성이 있는 효소의 존재 하에 아르기닌아미드 또는 리신아미드가 아미드와 이에 따른 본 발명의 서방형 인슐린으로 변환되는 2-쇄 인슐린 전구체로 효소적으로 변환된 다음, 생화학적 정제 방법에 의해 고순도로 제조되는 제조방법에 관한 것이다.

적어도 하나의 자연 발생의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 대응하는, 그렇지 않으면 동일한 자연 발생의 단백질 유래의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가 및/또는 결실을 통해 다른 단백질은 단백질 "유사체"라 부른다. 또한, 이와 관련하여 부가 및/또는 교체된 아미노산 잔기가 자연 발생이 아닌 잔기인 것도 가능하다.

초기 단백질의 특정 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의해 수득되는 단백질은 단백질의 "유도체"라 부른다. 화학적 변형은 하나 이상의 아미노산에 하나 이상의 특정 화학적 그룹의 첨가 등으로 이루어질 수 있다.

도 1: 본 발명의 인슐린 유사체의 래트에서의 혈당 저하 효과.
도 2: 인슐린 글라진의 래트에서의 혈당 저하 효과.

이하 실시예는 본 발명의 개념을 예증하기 위한 것이지만 이와 관련하여 제한 효과는 없다.

실시예 1: Gly(A21)-인슐린 및 C/A 쇄 경계에 Arg Arg을 보유하는 변형 C 펩타이드를 암호화하는 벡터 유도체 pINT3580의 제조

유럽 특허 출원 EP-A 1 222 207은 플라스미드 pINT358d, pINT91d 및 프라이머 서열 Tir을 기술하고 있다. 이 산물의 DNA는 플라스미드 pINT3580을 작제하는데 사용된다. 플라스미드 pINT358d는 더욱이 특정 성질의 변형된 C 펩타이드를 암호화하는 유전자 서열을 특징으로 한다. 3개의 프라이머 서열을 합성한다:

이 프라이머는 pINT358d에 의해 암호화된 프로인슐린 서열의 A 쇄의 위치 21에 있는 아스파라긴 대신에 글리신(굵은 인쇄체, 밑줄)을 도입시키는 가공 후에 작용한다.

이 프라이머는 인슐린 A/B 쇄 경계에 있는 리신 대신에 아르기닌을 도입시키기 위해 프라이머 arg_cjunc_rev처럼 작용한다.

도입되는 아르기닌의 코돈은 두 프라이머 모두에서 굵은 인쇄체 활자이다. PCR은 유럽 특허출원 EP-A 1 222 207에 따라 각 프라이머 쌍 Tir/arg_cjunc_rev 및 arg_cjuncf/pint3580_glya21rev와 주형으로서 플라스미드 pINT358d의 DNA를 이용하여 수행한다. 두 반응 산물은 일정량을 배합해서 제3 PCR에 프라이머 쌍 Tir/pint3580_glya21rev와 함께 이용한다. 이 반응의 산물은 겔 전기영동으로 반응 혼합물을 분별한 후 정제하고 하나의 동일한 반응에서 제한효소 Sal1/Nco1을 제조자의 지시에 따라 사용하여 분해하고, 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분별하고, 프로인슐린 서열을 암호화하는 DNA 단편을 분리한다. 그 다음, 이 단편을 DNA 리가제 반응을 통해 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다.

이 연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 세균 세포를 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물을 25 mg/l 앰피실린을 함유하는 선택 평판에서 선별한다. 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 서열 분석으로 특성을 분석한다. 정확한 플라스미드는 pINT3580이라 한다.

실시예 2: His(A8), Gly(A21)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3581의 작제

이 작제는 3가지 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 3번째 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다. 프라이머 Tir 및 pint3580_glya21rev를 사용한다. 2가지 추가 프라이머를 합성한다:

A 쇄의 위치 8에서 히스티딘을 암호화하는 코돈은 각 경우마다 굵게 표시하여 강조한다. 작제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. PCR1 및 2의 주형은 플라스미드 pINT3580의 DNA이다. PCR1은 프라이머 쌍 Tir/pint3580_Ha8rev를 사용하여 수행하고 PCR2는 프라이머 쌍 pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev를 이용하여 수행한다. 프라이머 쌍 Tir/pint3580_glya21rev는 PCR3에 이용한다. 이 경우에 주형은 PCR1 및 PCR2의 반응 산물의 혼합물이다. 정확한 플라스미드는 pINT3581이라 한다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 아르기닌아미드로의 아미드화 후에 나타나고

으로 표현되는 화합물 YKL202의 전구체이다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 리신아미드로의 아미드화 후에 나타나고

으로 표현되는 화합물 YKL202의 전구체이다.

실시예 3: His(A8), Glu(A5), Gly(A21)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3582의 작제

이 작제는 3가지 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 수행한다. 3번째 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다. 프라이머 Tir 및 pint3580_glya21rev를 사용한다. 2가지 추가 프라이머를 합성한다.

A 쇄의 위치 5에 있는 글루탐산을 암호화하는 코돈은 각 경우마다 굵게 표시하여 강조한다. 작제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다. 정확한 플라스미드는 pINT3582라 한다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-1의 전구체이다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-1b의 전구체이다.

실시예 4: His (A8), Asp (A18), Gly(A21)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3583의 작제

이 작제는 하나의 폴리머라제 연쇄 반응만을 수행하여 실시예 1과 다르다. 이 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다. 프라이머 Tir을 사용한다. 1가지 프라이머를 추가로 합성한다:

A 쇄의 위치 18에서 아스파르트산을 암호화하는 코돈은 굵게 표시하여 강조한다. 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다. 정확한 플라스미드는 pINT3583이라 한다.

으로 표현되는 화합물 YKL202의 전구체이다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-2b의 전구체이다.

실시예 5: His (A8), Glu (A15), Gly (A21)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3585의 작제

이 작제는 하나의 폴리머라제 연쇄 반응만을 실행하여 실시예 1과 다르다. 이 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다. 프라이머 Tir을 사용한다. 1가지 프라이머를 추가로 합성한다:

A 쇄의 위치 15에서 글루탐산을 암호화하는 코돈은 굵게 강조한 것이다. 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다. 정확한 플라스미드는 pINT3585라 한다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-3의 전구체이다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-3b의 전구체이다.

실시예 6: His (A8), Gly (A21), Asp (B3)- 프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3588의 작제

이 작제는 3가지 폴리머라제 연쇄 반응으로 실시예 1과 2에 기술된 바와 같이 수행한다. 3번째 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA 내로 삽입한다. 프라이머 Tir 및 pint3580_glya21rev를 사용한다. 2가지 추가 프라이머를 합성한다:

인슐린 B 쇄의 위치 3에서 아스파르트산을 암호화하는 코돈은 각 경우마다 굵게 강조한 것이다. 작제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다. 정확한 플라스미드는 pINT3588이라 한다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-4의 전구체이다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-4b의 전구체이다.

실시예 7: His (A8), Gly (A21), Glu (B4) 프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3593의 작제

인슐린 B 쇄의 위치 4에서 글루탐산을 암호화하는 코돈은 굵게 강조한 것이다. 작제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다. 정확한 플라스미드는 pINT3593이라 한다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-5의 전구체이다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-5b의 전구체이다.

실시예 18: His (A8), Gly (A21), Glu (B0) - 프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3597의 작제

작제는 2회의 폴리머라제 연쇄 반응으로 수행한다. 프라이머 pint3580_glya21rev가 사용된다. 다른 2가지 프라이머가 합성된다:

이 경우에 두 프라이머는 부분적인 중첩이 있다. pint3581_Eb0f2는 NcoI 인식 서열을 함유한다. 이것은 밑줄친 부분이다. B 쇄의 출발점인 위치 0에서 글루탐산을 암호화하는 코돈은 각 경우마다 굵게 강조한 부분이다. PCR1의 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다.

PCR1은 프라이머쌍 pint3581_Eb-1f2 / pint3580_glya21rev을 이용하여 수행한다. PCR2의 주형은 PCR1의 산물이다. PCR2는 프라이머쌍 pint3581_Eb-1f2 / pint3580_glya21rev을 이용하여 수행한다. PCR2의 산물은 전체 프리프로인슐린 서열을 커버한다. 제2 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다. 정확한 플라스미드는 pINT3597이라 한다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-6의 전구체이다.

으로 표현되는 화합물 YKL202-6b의 전구체이다.

위치 B0에 글루탐산의 코돈 대신 아스파르트산 코돈으로의 교체 및 이하 실시예는 위치 B0에 글루탐산 대신에 아스파르트산을 보유하는 플라스미드를 생산한다.

실시예 9: His (A8), Gly (A21), Lys (B0) - 프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3700의 작제

작제는 프리서열과 B 쇄의 개시부 사이의 경계에서 아르기닌의 코돈 대신에 리신의 코돈을 도입시키는 작용을 한다. 작제는 2가지 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 일어난다. 프라이머 pint3580_glya21rev가 사용된다. 2가지 추가 프라이머가 합성된다:

각 경우마다 두 프라이머는 부분 중첩되어 있고 pint3581_Eb0f2는 NcoI 인식 서열을 함유한다. 이것은 밑줄친 부분이다. B 쇄의 개시부인 위치 1에서 글루탐산을 암호화하는 코돈은 각 경우마다 굵게 강조한 부분이다. PCR1의 주형은 플라스미드 pINT3581의 DNA이다. PCR1은 프라이머쌍 pint3581_Eb-1f2 / pint3580_glya21rev을 이용하여 수행한다. PCR2의 주형은 PCR1의 산물이다. PCR2는 프라이머쌍 pint3581_Eb-1f2 / pint3580_glya21rev을 이용하여 수행한다. PCR2의 산물은 전체 프리프로인슐린 서열을 커버한다. 제2 반응의 산물은 Nco1/Sal1 절단 후에 Nco1/Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다. 정확한 플라스미드는 pINT3700이라 한다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 화합물

의 전구체이다. 이 화합물은 먼저 Thr(B30)-사람 인슐린의 중간체 Arg(A0), His(A8), Gly(A21)을 트립신 및 리실 엔도펩티다제 C와 반응시켜 제조하고, 이 중간체를 이어서 아르기닌아미드로의 아미드화에 의해,

으로 표현되는 목적 화합물 TKL202-7로 변환시킴으로써 수득한다.

상기 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은

으로 표현되고 리신아미드로의 아미드화 후에 산출되는 화합물 YKL202-7b의 전구체이다.

실시예 10: Gly(A21), Lys(B0)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3701의 작제

이 작제는 프리서열과 B 쇄의 개시부 사이인 경계에서 아르기닌의 코돈 대신에 리신 코돈을 도입시키는 작용을 한다. PCR1의 주형으로 플라스미드 pINT358d의 DNA를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9의 작제 전략에 따라, 기초 플라스미드 pINT358d와 같이 C 펩타이드와 A 쇄 사이의 경계가 아미노산 서열 Lys-Arg으로 형성되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pINT3701을 수득한다.

실시예 11: 실시예 10에 따른 C 펩타이드를 이용한 His(A8), Gly(A21), Lys(B0)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT3702의 작제

주형으로 플라스미드 pINT3701의 DNA를 이용하는 것을 제외하고는 실시예 2에 기술된 작제 계획에 따라 플라스미드 pINT3702를 수득한다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 화합물

의 전구체이다. 이 화합물은 먼저 리실 엔도펩티다제 C와만 반응시켜 Thr(B30)-사람 인슐린의 중간체 Arg(A0), His(A8), Gly(A21)을 제조하고, 이어서 아르기닌아미드로의 아미드화에 의해,

으로 표현되는 목적 화합물 YKL-202-8로 변환시켜 수득한다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 리신아미드로의 아미드화후 산출되는,

으로 표현되는 화합물 YKL202-8b의 전구체이다.

실시예 12: His(A8), Gly(A21), Lys(B0)-프리프로인슐린 및 C/A 쇄 경계에서 트리펩타이드 Lys-Arg-Arg을 보유하는 변형 C 펩타이드을 암호화하는 벡터 유도체 pINT3703의 제조

플라스미드 pINT3702의 DNA는 주형으로 사용하고 프라이머 pint3580_glya21rev 및 Tir이 사용된다. 2개의 프라이머 서열을 합성한다.

이 프라이머는 인슐린 A/B 쇄 경계에 아르기닌을 도입시키기 위해 프라이머 arg_cjunc_rev처럼 작용한다.

도입되는 아르기닌의 코돈은 두 프라이머에서 굵은 인쇄체로 표시했다. PCR은 각각 프라이머쌍 Tir/3702_cjunc_rev 및 3702_arg_cjuncf/pint3580_glya21rev와 주형으로서 플라스미드 pINT3702의 DNA를 이용하여 유럽 특허 EP-A 1 222 207에 따라 수행했다. 두 반응 산물은 일정량을 배합하여 제3 PCR에서 프라이머쌍 Tir/pint3580_glya21rev과 함께 이용한다. 이 반응의 산물은 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분별한 후 정제하고 제한효소 Sal1/Nco1로 하나의 동일 반응물 내에서 제조사의 지시에 따라 분해하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분별한 뒤, 프로인슐린 서열을 암호화하는 DNA 단편을 분리한다. 그 다음, 이 단편을 DNA 리가제 반응에 의해 Nco1-Sal1-개열된 pINT91d 벡터 DNA에 삽입한다.

이 연결 혼합물을 이용하여 컴피턴트 이.콜라이 세균 세포를 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물은 25mg/l 앰피실린을 함유하는 선발 평판에서 평판배양한다. 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 DNA 서열분석으로 특성을 규명한다. 정확한 플라스미드는 pINT3702라 한다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 화합물

의 전구체이다. 이 화합물은 먼저 리실 엔도펩티다제 C와 반응시켜 Thr(B30)_사람 인슐린의 중간체 Arg(A-1), Arg(A0), His(A8), Gly(A21)을 제조한 뒤, 이 중간체를 이어서 아르기닌아미드로의 아미드화에 의해 목적 화합물로 변환시킴으로써 수득한다.

상기 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 리신아미드로의 아미드화 후에 수득되는 화합물

의 전구체이다.

아스파르트산 또는 글루탐산이 실시예 3 내지 8에 따라 A 또는 B 쇄의 적당한 위치에 도입될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 이러한 프로인슐린은 다음과 같은 화합물들의 전구체이다.

실시예 13: His(A8), Gly(A21), Lys(B0)-프리프로인슐린을 암호화하는 벡터 유도체 pINT3704의 제조

본 실시예는 His(A8), Gly(A21), Lys(B0)-프리프로인슐린, 및 사람 인슐린의 위치 A21에서 나타나는 아미노산 글리신이 결실되어 있고 C/A 쇄 경계에 트리펩타이드 Lys-Arg-Arg을 보유하는 변형 C 펩타이드를 암호화하는 벡터 유도체 pINT3704의 제조에 대해 설명한다.

실시예 12에 기술된 합성식에 따르고 프라이머 3702_arg_cjuncf 및 3702_arg_cjuncfrev를 프라이머 3703_△Ga1f 및 3703_△Ga1rev로 교체하고 주형으로 플라스미드 pINT3703의 DNA를 이용하여, A 쇄의 위치 1에 있는 아미노산 글리신은 암호화된 프리프로인슐린에서 결실되고 서열의 나머지는 pINT3703에 의해 암호화된 서열에 대응하는 플라스미드 pINT3704를 수득한다.

이 플라스미드에 의해 암호화된 프리프로인슐린은 화합물

의 전구체이다. 이 화합물은 먼저 리실 엔도펩티다제 C와의 반응에 의해 중간체

을 제조한 뒤, 이 중간체를 아르기닌아미드로의 아미드화에 의해 목적 화합물로 변환시킴으로써 수득한다.

의 전구체이다.

이에, 음하전 아미노산이 실시예 12에 따라 프리프로인슐린 서열에 도입될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 실시예 13과 유사하게, 플라스미드 pINT3702로부터 A 쇄의 위치 1에 N-말단 아미노산으로 아르기닌을 보유하는 인슐린 유도체의 제조를 허용하는 프로인슐린 서열을 암호화하는 플라스미드를 제조하는 것도 가능하다.

실시예 14: 프로인슐린 유도체의 발현

발현은 유럽 특허 출원 EP-A 1 222 207의 실시예 1에 따라 수행한다.

실시예 15: 프로인슐린 유도체의 폴딩

폴딩은 사실상 EP-A 0 668 282에 기술된 방법으로 수행한다.

실시예 16: 트립신을 이용한 실시예 2 내지 8의 프로인슐린의 가공

폴딩된 프리프로인슐린은 효소적으로 가공하여 C-말단 B 쇄 말단이 리신 또는 아르기닌인 것을 특징으로 하는 2-쇄 Arg(A0)-인슐린 전구체를 제공한다. 폴딩된 프리프로인슐린 전구체의 효소적 가공은 WO91/03550의 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행한다. 이 경우에 특히 WO 2007/031187 A1에 기술된 트립신 변형체를 이용하는 것이 유리한 것으로 확인된다.

실시예 17: 엔도프로테이나제 Lys-C를 이용한 실시예 9 내지 13의 프로인슐린의 가공

아크로모박터 라이티커스(Achromobacter lyticus) 유래의 엔도프로테아제 Lys-C는 시판품이다(Merck/Calbiochem). 이 반응은 문헌[Jekel, P.A. et al. Anal. Biochem. 134, 347-354, (1983)]에 기술된 것으로 약간 변형시켜 수행한다. pH는 9.5로 설정하고 반응 온도는 30℃이다.

1 용기 반응으로, 프리서열은 제거하고, Thr(B30)으로 시작하는 C 펩타이드를 B 쇄의 C 말단 말단이 효소-촉매된 커플링 반응의 반응 부위로 존재하는 리신으로 형성되도록 절단해낸다.

실시예 18: 아르기닌아미드 또는 리신아미드와의 커플링에 의한 2-쇄 전구체로부터의 Arg-NH₂ 또는 Lys-NH₂ 인슐린 화합물의 제조

추가 산성 아미노산의 위치와 상관없이, 표준 반응은 다음과 같이 수행한다: Arg(A0), Gly(A21), Arg(B31)-인슐린 유사체 100mg을 아르기닌아미드 용액(446g/L) 0.95ml에 용해하고, M Na 아세테이트 완충액(pH 5.8) 0.13ml 및 DMF 2ml를 첨가한다. 이 반응 혼합물은 12℃로 냉각하고, 트립신(0.075mg, Roche Diagnostics) 0.094ml를 첨가하여 개시한다. 반응은 8시간 후에 TFA를 pH 2.5까지 첨가하여 정지시키고 HPLC로 분석한다. >60%의 Arg(A0), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂-인슐린 유사체가 형성된다. 트립신 저해제 용액을 첨가한 후에 아미드화된 유사체를 US 5,656,722와 유사하게 정제한다.

대응하는 리신아미드 화합물의 제조는 유사하게 수행한다. 하지만, 용액 중에 리신아미드 366g/L를 함유하는 리신아미드 스톡 수용액을 출발 물질로 사용한다.

실시예 19: Lys(A-1), Arg(A0), His(A8), Gly(A21), Arg(B30)-인슐린 아미드의 반합성 제조

Arg(A0), His(A8), Gly(A21), Arg(B30)-인슐린 아미드 구조의 인슐린 유도체에 대응하는 실시예 11에 기술된 화합물 YKL202-8을, 화합물 YKL202-11, Lys(A-1), Arg(A0), His(A8), Gly(A21), Arg(B30)-인슐린 아미드를 제조하는 출발 물질로 제공한다. 이 화합물 200mg을 100mM Na₂HPO₄/CH₃CN(50:50) 혼합물 40ml에 용해하고 pH 7.7-8.2로 세팅한다. 추가 물질로, Boc-Lys(Boc)-NHS 에스테르는 0.3mM Boc-Lys(Boc)-OH, 0.4mM N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 0.4mM 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 디클로로메탄에 40분 동안 혼합하여 제조한다. 이 반응 혼합물을 회전 진공 증발기에서 농축 건조시킨다. 이 혼합물을 그 다음 메탄올 5ml에 용해하고, 용해된 초기 인슐린에 첨가한다. 반응물은 실온에서 적어도 60분, 최대 120분 동안 교반한다. 반응은 TFA 200㎕를 첨가하여 정지시킨다. 반응 산물의 질량은 LC-MS 질량분광분석기로 분석하여 3 성분으로 이루어진 모노아실화된 산물의 존재를 증명한다. 성분은 HPLC로 분리한다. 그 동안, 디아실화 및 트리아실화된 부산물은 제거된다. HPLC 분리로부터의 분획은 질량 분광분석기로 분석한다. 각각 모노아실화된 산물을 함유하는 3 분획을 아미노산 서열 분석으로 처리하고, 그 해독을 통해 목적 화합물을 함유하는 HPLC 분획을 동정하고, 이어서 가수분해하여 Boc 보호 그룹을 제거한다. 재생 HPLC 정제 후에, 목적 산물은 생물학적 성질에 대해 검사한다.

실시예 20: His(A8), Gly(A21) 프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT358_ha8의 제조

실시예 2의 제조식에 따르고 PCR1 및 PCR2의 주형으로 플라스미드 pINT358d의 DNA를 이용하여 His(A8), Gly(A21) 프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT358_ha8을 수득한다. 이 플라스미드에 의해 암호화된 프로인슐린은 His(A8), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂-사람 인슐린 화합물의 전구체로 작용한다. 이 경우에 아미드화 전에 중간체로서 His(A8), Gly(A21), Arg(B31)을 제공하는 프리프로인슐린의 가공은 WO 91/03550에 기술된 바와 같이 수행한다. 통상의 트립신이 이 경우에 이용된다.

실시예 21: 아미드화된 인슐린 유도체의 제형

본 발명의 인슐린 유도체의 생물약리학적 성질 및 생리화학적 성질을 시험하기 위해, 화합물의 용액을 다음과 같이 제조했다: 본 발명의 인슐린 유도체를 80㎍/ml 아연(아연 염화물로서)과 함께 1mM 염산 중에 240±5 μM의 목표 농도로 용해했다. 이 목적을 위해, 먼저 분자량 기준으로 필요한 농도보다 약 30% 더 높은 동결건조물의 양 및 바람직한 농도를 칭량한다. 그 다음, 존재하는 농도를 분석용 HPLC로 측정하고, 이어서 용액을 80㎍/ml 아연과 5mM 염산으로 목표 농도를 달성하는데 필요한 용적이 되도록 만든다. 필요한 경우, pH는 3.5±0.1로 재조정한다. 목표 농도 240±5μM을 입증하기 위해 HPLC로 최종 분석한 후, 마무리처리된 용액을 0.2㎛ 필터가 장착된 주사기를 이용해 멸균 바이알로 옮긴 후, 중격 및 주름진 캡으로 봉인했다. 본 발명의 인슐린 유도체의 단기 단일 검사에는 등장제, 보존제 또는 완충제 물질의 첨가 등에 관한 제형의 최적화는 수행하지 않았다.

실시예 22: 효모 발현에 의한 His(A8), Gly(A21), Arg(B31) 사람 인슐린의 제조

EP-A 1 364 032는 효모에 의한 히루딘 및 미니프로인슐린의 융합 단백질의 발현 및 분비에 대해 설명하고 있다. 이와 관련하여 특히 유익하다고 언급된 효모 숙주 유기체는 에스. 세레비지에(S. cerevisiae), 케이. 락티스(K. lactis), 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 및 피. 파스토리스(P. pastoris)이다. 상기 특허 출원의 실시예 4에는 피. 파스토리스에서 융합 단백질의 제조를 허용하고 DNA가 A 쇄의 위치 A8, A15, A18 및 A21의 아미노산 서열이 아미노산 히스티딘(A8), 글루탐산(A15), 아스파르트산(A18) 및 글리신(A21)인 것을 특징으로 하는 미니프로인슐린을 제조하기 위한 주형으로 작용하는 플라스미드의 작제에 대해 설명되어 있다. 프라이머로는 pichia_H_if1이 사용된다. 다음 프라이머는 새로 합성되고 합성 후에 정제했다:

굵은 활자로 강조된 코돈은 A21 위치를 표시한 것이다.

굵은 활자로 강조된 코돈은 A8 위치를 표시한 것이다.

굵은 활자로 강조된 코돈은 A8 위치를 표시한 것이다.

부분 중첩된 프라이머 pichia_G21_rev와 프라이머 pichia_H8f의 등몰량(1㎍)을 4가지 데옥시뉴클레오타이드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 5'를 함유하는 폴리머라제 완충액과 호열성 폴리머라제의 존재 하에 95℃에서 변성시킨 다음, 56℃에서 10 내지 15분 동안 항온처리한다. 이 반응물 1의 반응 용적은 25㎕이다. 표준 폴리머라제 연쇄 반응(반응물 2)에서, 프라이머 pichia_H_1f1 및 pichia_a1_12rev는 기술된 주형 DNA와 나란히 반응시킨다. 추가 폴리머라제 연쇄 반응에서, 반응물 1과 2는 프라이머 pichia_H_if1 / pichia_G21rev를 이용하여 주형으로 반응시킨다. 이 반응의 반응 산물은 겔 전기영동으로 정제한다. 반응 효소 XhoI 및 SacII와 반응시킨 후, 융합 산물을 포함하는 DNA 단편을 실시예 4와 유사하게 하여 기술된 벡터 pPICZαA에 삽입시킨다. 그 결과는 플라스미드 pPIC_ins202이다. 이 플라스미드에 의해 암호화된 융합 단백질은 기술된 시판 발현 키트를 이용하여 발현시킨다. His(A8), Gly(A21), Arg(B31)-사람 인슐린 전구체를 제조한 다음, 아르기닌(B31)에 대한 설명에 따라 아르기닌 아미드를 커플링시킨다. 그 결과, 실시예 20에 대응하는 신규 서방형 인슐린을 나타내는 화합물 His(A8), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂-인슐린(YKL203)이 수득되고, 래트 실험으로 검사했다. 리신 아미드와의 커플링에서는 유사하게 His(A8), Gly(A21), Arg(B31), Lys(B32)-NH₂-인슐린으로 표현되는 화합물 YKL203b가 수득된다.

하지만, 이 화합물은 또한 화합물 Arg(A0), His(A8), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂-인슐린을 제조하기 위한 중간체로 사용될 수 있고, 그 제법은 문헌[Kohn et al., Peptides 28(2007) 935-948]을 기초로 한다. 이 목적을 위해, 화합물 His(A8), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂-사람 인슐린 200mg을 100mM Na₂HPO₄/CH₃CN(50:50)의 혼합물 40ml에 용해하고 pH는 7.7-8.2로 조정한다.

추가 물질로, Boc-Arg-NHS 에스테르는 0.3mM Boc-Arg-OH, 0.4mM N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 0.4mM 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 디클로로메탄에서 40분 동안 혼합하여 제조한다. 이 반응 혼합물을 회전 진공 증발기에서 농축 건조시킨다. 이 혼합물을 그 다음 5ml 메탄올에 용해하고 용해된 초기 인슐린에 첨가한다. 이 반응물은 실온에서 적어도 60분, 최대 120분 동안 교반한다. 이 반응은 TFA 200㎕를 첨가하여 정지시킨다. 반응 산물의 질량은 LC-MS 질량 분광분석법으로 분석하여 3 성분으로 이루어진 모노아실화된 산물의 존재를 입증한다. 성분은 HPLC로 분리한다. 그 동안, 디아실화 및 트리아실화된 부산물은 제거된다. HPLC 분리로부터의 분획은 질량 분광분석기로 분석한다. 각각 모노아실화된 산물을 함유하는 3 분획을 아미노산 서열 분석으로 처리하고, 그 해독을 통해 목적 화합물을 함유하는 HPLC 분획을 동정하고, 이어서 완만한 가수분해로 Boc 보호 그룹을 제거한다. 재생 HPLC 정제 후에, 목적 산물은 생물학적 성질에 대해 검사한다.

실시예 23: 신규 인슐린 유사체의 래트에서의 혈당 저하 효과의 평가

선택한 신규 인슐린 유사체의 혈당 저하 효과는 건강한 수컷 정상 혈당의 위스타(Wistar) 래트에서 검사했다. 수컷 래트에게 인슐린 유사체 9nmol/kg의 용량을 피하 주사했다. 인슐린 유사체 주사 직전 및 주사 후 8시간까지 일정 간격마다 동물로부터 혈액 샘플을 채취해서, 함유된 혈당 함량을 측정한다. 본 실험은 본 발명의 인슐린 유사체가 분명하게 지연된 작용 개시 및 더 긴 균일한 작용 기간을 유도한다는 것을 분명하게 보여준다(도 1 참조).

실시예 24: 신규 인슐린 유사체의 개에서의 혈당 저하 효과의 평가

선택한 신규 인슐린 유사체의 혈당 저하 효과는 건강한 수컷 정상혈당의 비글(beagle) 개에서 검사했다. 수컷 동물에게 인슐린 유사체 6nmol/kg의 용량을 피하 주사했다. 인슐린 유사체 주사 직전 및 주사 후 48시간까지 일정 간격마다 동물로부터 혈액 샘플을 채취해서, 함유된 혈당 함량을 측정한다. 본 실험은 본 발명의 인슐린 유사체가 분명하게 지연된 얕은 작용 개시 및 더 긴 균일한 작용 기간을 야기한다는 것을 분명하게 보여준다.

<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile <130> DE2008/002 <150> DE 10 2008 003 566.1 <151> 2008-01-09 <150> US 61/044,662 <151> 2008-04-14 <150> DE 10 2008 025 007.4 <151> 2008-05-24 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A-Chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa corresponds to Lys, Arg or an amino group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa corresponds to Lys, Arg or a chemical bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa corresponds to Arg or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa corresponds to Ala, Ser, Thr or Gly <400> 1 Xaa Xaa Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Xaa Leu Glu Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> B-Chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or an amino group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or a chemical bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu, Phe or a chemical bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa corresponds to Asp, Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa corresponds to Arg, Lys or an amino acid selected from the group comprising the amino acids Phe, Ala, Thr, Ser, Val, Leu, Glu or Asp, or a chemical bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa corresponds to Thr or a chemical bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa corresponds to Arg, Lys or a chemical bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa corresponds to Arg-amide or Lys-amide <400> 2 Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 1 5 10 15 Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3580_glya21rev <400> 3 caaaggtcga ctattagccg cagtagttct ccagctgg 38 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> arg_cjuncf <400> 4 gtccctgcag cgtcgcggca tcgtggagca g 31 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> arg_cjunc_rev <400> 5 ccacgatgcc gcgacgctgc agggacccct ccagcg 36 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3580_Ha8f <400> 6 agcagtgctg ccacagcatc tgctccctct ac 32 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3580_Ha8rev <400> 7 gagcagatgc tgtggcagca ctgctccacg atg 33 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Ea5f <400> 8 gcatcgtgga ggagtgctgc cacagcatct g 31 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Ea5rev <400> 9 ctgtggcagc actcctccac gatgccgcga cg 32 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3580_Da18rev <400> 10 caaaggtcga ctattagccg cagtagtcct ccagctggta gagggag 47 <210> 11 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3580_Ea15rev <400> 11 caaaggtcga ctattagccg cagtagttct ccagctcgta gagggagcag atgctg 56 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Db3f <400> 12 gcacgatttg tggaccagca cctgtgcggc 30 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Db3rev <400> 13 cacaggtgct ggtccacaaa tcgtgccgaa tttc 34 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Eb4f <400> 14 acgatttgtg aacgagcacc tgtgcggctc 30 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Eb4rev <400> 15 cgcacaggtg ctcgttcaca aatcgtgccg aatttc 36 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Eb0f1 <400> 16 caacaggaaa ttcggcacga gagtttgtga accagcacct gtg 43 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Eb01f2 <400> 17 tatcgaccat ggcaacaaca tcaacaggaa attcggcacg agag 44 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Eb0f1 <400> 18 caacaggaaa ttcggcaaag tttgtgaacc agcacctgtg 40 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pint3581_Eb01f2 <400> 19 tatcgaccat ggcaacaaca tcaacaggaa attcggcaga g 41 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3702_arg_cjuncf <400> 20 tgcagaagcg cagaggcatc gtggagcagt gc 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3702_cjunc_rev <400> 21 tccacgatgc ctctgcgctt ctgcagggac cc 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3703_Δ Ga1f <400> 22 tgcagaagcg cagaatcgtg gagcagtgct gc 32 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3703_Δ Ga1rev <400> 23 tgctccacga ttctgcgctt ctgcagggac cc 32 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pichia_G21_rev <400> 24 ttttttggcg ccgaattcac tattagccac agtagttttc cagctggta 49 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pichia_H8_f <400> 25 gaacaatgtt gtcatagtat ctgttctttg taccagctgg aaaactactg 50 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pichia-a1-12rev <400> 26 gaacagatac tatgacaaca ttgttcaacg atacc 35

Claims

화학식 I의 인슐린 유사체.
화학식 I

상기 화학식 I에서,
A-1은 Lys, Arg 또는 아미노 그룹에 해당하고;
A0은 Lys, Arg 또는 화학적 결합에 해당하며;
A1은 Arg 또는 Gly에 해당하고;
A5는 Asp, Glu 또는 Gln에 해당하며;
A15는 Asp, Glu 또는 Gln에 해당하고;
A18은 Asp, Glu 또는 Asn에 해당하고;
A21은 Ala, Ser, Thr 또는 Gly에 해당하고;
B-1은 Asp, Glu 또는 아미노 그룹에 해당하고;
B0은 Asp, Glu 또는 화학 결합에 해당하며;
B1은 Asp, Glu, Phe 또는 화학 결합에 해당하고;
B3은 Asp, Glu 또는 Asn에 해당하고;
B4는 Asp, Glu 또는 Gln에 해당하고;
B29는 Arg, Lys, 또는 아미노산 Phe, Ala, Thr, Ser, Val, Leu, Glu 또는 Asp를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산, 또는 화학 결합에 해당하고;
B30은 Thr 또는 화학 결합에 해당하고;
B31은 Arg, Lys 또는 화학 결합에 해당하고;
B32는 Arg-아미드 또는 Lys-아미드에 해당하며,
A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 및 B4를 포함하는 그룹 중의 1개 이하의 아미노산 잔기는 동시에 서로 독립적으로 Asp 또는 Glu에 해당한다.
제1항에 있어서, A-1이 Arg에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 또는 제2항에 있어서, A0이 Arg에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, A5가 Glu에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A15가 Glu에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, A18이 Asp에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, A8이 His에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, A21이 Gly에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, B0이 Glu에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, B3이 Asp에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, B4가 Glu에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, B30이 Arg에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, B30이 Lys에 해당하는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,

을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 인슐린 유사체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체를 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 인슐린 유사체의 전구체를 재조합으로 제조하고, 상기 전구체를 2-쇄 인슐린으로 효소적으로 가공하고, 아르기닌아미드와의 커플링을 트립신 활성이 있는 효소의 존재 하에 수행한 다음, 인슐린 유사체를 분리하는, 방법.
진성당뇨병을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 용도.
제17항에 있어서, I형 또는 II형 진성당뇨병을 치료하거나, 연골을 재생시키거나, 또는 베타 세포 재생을 보조하기 위한 약제를 제조하는 방법에 있어서의 용도.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제.
용해된 인슐린 유사체를 포함하는 수성 형태인, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 제형.
분말 형태인, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 제형.
제21항에 있어서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체가 결정형 및/또는 무정형으로 존재하는 제형.
현탁액 형태인, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 제형.
화학적 샤페론을 추가로 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 제형.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 전구체를 암호화하는 DNA.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 A 쇄를 암호화하는 DNA.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 B 쇄를 암호화하는 DNA.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하는 숙주 유기체.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 DNA 또는 제28항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 유기체.
C 펩타이드가 이의 N 말단에 아미노산 잔기 아르기닌을 보유하고 C 말단은 Arg Arg, Arg Lys 또는 Lys Arg Arg 형태를 특징으로 하는, 프리프로인슐린(preproinsulin) 유사체.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP1) 또는 이의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘(exendin)-3 또는 -4 또는 이의 유사체 또는 유도체를 추가로 포함하는 제형.
제31항에 있어서, 엑센딘-4를 추가로 포함하는 제형.
제31항에 있어서, 엑센딘-4의 유사체가

를 포함하는 그룹 중에서 선택되거나, 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염인 제형.
제31항에 있어서, 엑센딘-4의 유사체가

를 포함하는 그룹 중에서 선택되거나, 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염인 제형.
제31항에 있어서, 펩타이드 -Lys₆-NH₂가 엑센딘-4의 유사체의 C 말단에 부착되어 있는 제형.
제31항에 있어서, 엑센딘-4의 유사체가

를 포함하는 그룹 중에서 선택되거나, 또는 이의 약리학적으로 허용되는 염인 제형.
제31항에 있어서, Arg³⁴, Lys²⁶ (N^ε(γ-글루타밀(N^α-헥사데카노일))) GLP-1 (7-37) [리라글루타이드(liraglutide)]를 추가로 포함하는 제형.