JP6153206B2 - ヒト・インスリン類似体及びそのアシル化誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、新規ヒト・インスリン類似体及びそのアシル化誘導体、それらの製造方法、当該類似体及びそのアシル化誘導体を含有する医薬組成物、及び治療薬としての、特に糖尿病治療薬としてのその使用に関する。

糖尿病（真性糖尿病、DM）は一般的な代謝内分泌疾患である。糖尿病は臨床的には慢性全身性代謝異常症候群であり、慢性的高血糖や、炭水化物、脂質及びタンパク質の代謝障害を特徴とし、絶対的若しくは相対的インスリン欠乏、又はインスリンに対する標的組織の非感受性に起因する。糖尿病は、種々の体組織を侵す遺伝因子や環境因子の相互作用によって起こり、心臓−脳血管、腎臓、眼、神経及びその他の臓器の合併症を含む。糖尿病は生涯にわたる疾患であり、人の健康に著しく有害である。

糖尿病は一般的で頻発する疾患であり、がんと循環器疾患に続き、人命を脅かす３番目に多い疾患となっている。全人類に対する挑戦である。人種や国家に関わらず糖尿病は人々の健康に危険である。国際糖尿病連合（IDF）の統計によれば、前世紀の1980年代中頃から1990年代中頃までの10年間に、糖尿病患者の総数は4倍に増加し、1億2000万人に達している。2007年では全世界の糖尿病患者数は2億4600万人であり、この内46％は40~59歳の労働力人口であった。2025年には全世界の糖尿病患者数は3億8千万人に増加し、世界成人人口の7.1％を占めると予測されている。

2011年1月にADA（米国糖尿病協会）が発表したデータによれば、米国には2560万人の糖尿病患者がおり、米国人口の8.3％を占める。米国における莫大な医療費のうち、10ドルごとにつき1ドルは糖尿病に支出される。中国では、近年20年間に糖尿病患者が著しく増加している。疫学調査で、2002年以前には糖尿病有病率は4％未満であることが示されていた。近年では、糖尿病全国疫学調査により、成人中国人（20歳以上）の糖尿病有病率は10％を上回ることが示されている。全体の糖尿病有病率は9.7％であった。現在では糖尿病患者は9200万人を上回り、これとは別に1億5000万人が糖尿病になるであろう。中国はインドに代わり、最多の糖尿病患者数を有する国家になろうとしている。

糖尿病は主にインスリン依存性糖尿病（I型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（II型糖尿病）及びその他の特殊型糖尿病に分類される。I型糖尿病は主に小児と青少年に生じ、ピーク年齢は12歳であり、糖尿病患者の10％未満の割合を占める。II型糖尿病は主に成人に生じ、糖尿病患者の90％を上回る割合を占める。糖尿病の根底にある正確な病理学的機序はいまだに分かっておらず、糖尿病の根治療法はない。近年、糖尿病の治療は薬物治療と管理に重点が置かれている。II型糖尿病を患っている患者のごく一部に対しては、疾患を管理するために食事制限と運動療法を用いることができるが、患者の大多数に対しては薬物治療必要である。薬物治療には漢方薬と西洋薬が含まれる。西洋薬は重要であり、2種類に分類される：すなわち、インスリン及びその類似体に代表されるタンパク質及びポリペプチド薬並びに経口投与される低分子抗糖尿病薬である。

世界的な糖尿病患者数の急増に伴い、糖尿病薬の世界市場もまた急成長している。統計によると、2005年における糖尿病薬市場は186億米国ドルに達し、前年と比較して11.5％の増加であった。2006年の糖尿病薬市場は212億米国ドルであり、14％の増加であった。2007年には241億米国ドルで13.7％の増加であり、世界医薬品市場の第5位の順位であった。毎年15~20％の増加率が予測されている。Research and Markets社は、インスリン及びその類似体は全糖尿病薬市場の40.1％を占め、経口血糖降下薬は58％であり、その他の薬剤は残りの1.9％を占めると報告している。

一連の特許出願でいくつかのインスリン類似体が開示されており、これらのインスリン類似体は天然ヒト・インスリン配列の様々な位置でアミノ酸置換基を含む。特許文献１は、B25位にHis又はTyr置換基を有するインスリン類似体を開示する。特許文献２は、B3位に置換基を有し、同時にA5若しくはA15にGln置換基を有するか、又はA21若しくはA18にAsn置換基を有するインスリン類似体を開示する。特許文献３は、A21に特定のアミノ酸置換基を、またA4、A17、B13又はB21に特定のアミノ酸置換基を有するインスリン類似体を開示する。特許文献４は、B24、B25、B26及びB27位のひとつでアミノ酸欠失したインスリン類似体を開示する。特許文献５は、A8、A9、A10及びB30位に置換基を有するインスリン類似体を開示する。特許文献６は、B3位に置換基を有し、またB27、B28及びB29位のひとつに少なくともひとつの置換基を有する結晶型インスリン類似体を開示する。特許文献７は、A0（Arg）A21（Gly）B31（Arg）B32（Arg）であるインスリン類似体を開示する。

しかしながら、より優れた修飾効果を獲得するため、より優れた有効性を得るため、薬物とインスリン様成長因子−１（IGF-1）受容体の間の結合活性を減少させるため、また、より選択的な薬物を提供するため、より多く修飾したインスリン類似体が、糖尿病の治療に今なお必要とされている。

EP0425482B1 EP0419504B1 US5008241A US5164366A CN1195777C US7193035B2 CN1780854

そのため本発明は、糖尿病治療に対して優れた特性を有する新規薬物を提供することである。より具体的には、本発明は、新規ヒト・インスリン類似体及びそのアシル化誘導体、その類似体及び誘導体の製造方法、これらを含有する医薬組成物、並びに糖尿病治療用のヒト・インスリンの使用を提供する。

本発明は、第一の態様において、下記式で表されるＡ鎖及びＢ鎖を有するヒト・インスリン類似体及び製薬学的に許容されるその塩を提供する。

［式中、
A₀はRであり、又は欠失してもよく；
A₂₁はN又はGであり；
B₃はK、D又はNであり；
B₂₇はE、T、D又はKであり；
B₂₈はE、D、P又はKであり；
B₂₉はE、K又はPであり；
B₃₀はK、R、E若しくはTであり、又は欠失してもよく；
B₃₁及びB₃₂はRであり、任意に一方が欠失してもよく、又は両方が欠失してもよい；
ただし、
前記A₀が欠失しており、A₂₁がNであり、B₃がNである場合：
B₃₁B₃₂は欠失しており、B₂₇B₂₈B₂₉B₃₀はTPKT、TKPT若しくはTDKTではなく；又は、
B₃₀ B₃₁B₃₂は欠失しており、B₂₇B₂₈B₂₉はTPKではない；
別途、前記A₀が欠失しており、A₂₁はNであり、B₃はKであり、またB₃₁B₃₂が欠失している場合：
B₂₇B₂₈B₂₉B₃₀はTEKTではない；
別途、前記A₀が欠失しており、A₂₁がGであり、またB₃がNである場合：
B₂₇B₂₈B₂₉B₃₀ B₃₁B₃₂はTPKTRRではない。］

好ましくは、B₃、B₂₇〜B₃₀位のひとつのアミノ酸残基のみはリジン（K）残基である。

Ａ鎖上のA₀が欠失しており、Ｂ鎖上のB₃がNである場合：
B₂₈は、好ましくはE及びDから選択され、B₂₉はE、K及びPから選択され、B₃₀はR、E及び欠失から選択され、またB₃₁及びB₃₂は欠失であり；より好ましくは、B₃₀B₃₁B₃₂が欠失している場合、B₂₈B₂₉はKEである。

Ｂ鎖上のB₃がDである場合：
B₂₈及びB₂₉は、好ましくはP又はKであり、B₃₀はT又は欠失であり、B₃₁及びB₃₂はR又は欠失であり；最も好ましくは、B₂₈B₂₉はPKである。

Ａ鎖上のA₀が欠失しており、Ｂ鎖上のB₃がKである場合：
B₂₈及びB₂₉は、好ましくはP又はEであり、B₃₀はE又はRであり、B₃₁はR又は欠失であり、B₃₂は欠失であり；最も好ましくは、B₂₈B₂₉はPEである。

本発明は、ヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩を提供する。ここで、ヒト・インスリン類似体のＡ鎖及びＢ鎖はジスルフィド結合（A7−B7、A20−B19）により結合され、Ａ鎖上のA6及びA11はスルフィド結合により結合され；配列は下記の配列より選択されるが、これらに限定されない。

また本発明は、他の態様において、上記ヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩の好ましい例を提供する。ここで当該ヒト・インスリン類似体は、本発明によるペグ（PEG）化インスリンを得るためにペグ化されている。前記ペグ（PEG）分子の分子量は5〜100 KDであり、好ましくは10〜80 KDであり、より好ましくは15〜45 KDであり、最も好ましくは20〜40 KDである。前記ペグ分子は分枝型又は直鎖型である。

また本発明は、ヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩の製造方法を提供する。この方法には、発現ベクターの作成、宿主細胞での形質転換されたベクターの発現、発現前駆体の単離と精製、発現前駆体から化学的及び／又は酵素的方法により前記インスリン類似体の遊離が含まれる。任意には、ヒト・インスリン類似体はさらにペグ化され、当該ペグ化は、好ましくは化学的アシル化修飾法である。当該修飾法には、アシル化試薬の合成、ヒト・インスリン類似体中に位置するアミノ基のアシル化、及びアシル化基から保護基の除去が含まれる。

ここで、前記発現前駆体は下記式（I）で表される。
［式中、
R1は0〜5アミノ酸残基を有するペプチド断片であり、当該ペプチド断片はアラニン（A）、リジン（K）及びアルギニン（R）からなり；
A及びBは、ヒト・インスリン類似体のそれぞれＡ鎖及びＢ鎖に相当する。］

好ましくは、前記前駆体は、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（SEQ ID NO. 19）、
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG（SEQ ID NO. 20）、
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN（SEQ ID NO. 21）、及び、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG（SEQ ID NO. 77）からなる群より選ばれる。

また本発明は、前記発現前駆体をコードするDNAを提供する。

また本発明は、前記DNAを含む発現ベクターを提供する。

また本発明は、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。当該宿主細胞は、好ましくは細菌であり、より好ましくは大腸菌である。好ましくは、当該宿主細胞は酵母であり、より好ましくはピキア・パストリス又はサッカロマイセス・セレビシエである。

また本発明は、アシル化インスリンが、アシル化基を当該インスリンのＡ鎖及びＢ鎖のＮ末端にあるα-アミノ基に、又はB3、B27〜B30のリジン（K）残基にあるε-アミノ基に結合させることにより生成され、当該アシル化インスリンが下記式で表されるインスリン誘導体を提供する。

［式中、
Sはインスリン又は第一の態様に従うインスリン類似体であり；

-W-X-Y-Zはインスリン類似体のアシル化基であり、
Wは、
（１）-OC(CH₂)_mCO-の2個のアシル構造を有する基であり、mは2〜10の整数であり、アミド結合が、前記構造上のカルボン酸基のひとつと、親インスリン若しくはその類似体のＡ鎖若しくはＢ鎖のＮ末端アミノ酸残基にあるα-アミノ基又はＢ鎖に存在するLys残基にあるε-アミノ基との間に形成される；又は、
（２）側鎖にカルボン酸基を有するα-アミノ基残基又は側鎖にカルボン酸基を有する2〜4個のα-アミノ酸を持つペプチドであり、アミド結合が、前記残基又は前記ペプチドと、親インスリン若しくはその類似体のＡ鎖若しくはＢ鎖のＮ末端アミノ酸残基にあるα-アミノ基又はＢ鎖に存在するLys残基にあるε-アミノ基との間に形成される；
から選ばれ；

Xは、
（１）-CO-；又は、
（２）カルボン酸基を含むジアミノ化合物であり、アミド結合が当該ジアミノ化合物のα-アミノ基のひとつとWのカルボン酸基との間に形成される；
ａ）Wがα-アミノ基残基又は2〜4個のα-アミノ酸を持つペプチドである場合、アミド結合は、Wのアミノ基とXの-CO-との間に形成される；
ｂ）Wが2個のアシル構造を有する基である場合、前記X基は、そのアミノ基のひとつを介して2個のアシル構造に連結する；
から選ばれ；

Yは、
（１）-A(CH₂)_m-、ここでmは6〜32の整数であり、またAは非存在又はCO-である；
（２）アシル基を含む二価の炭化水素鎖であり、炭化水素鎖上に全体として10〜32個の炭素原子を得るのに十分な1、2又は3個の-CH=CH-基及び数個の-CH₂-基を含む；又は、
（３）-B(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w-の式を持つ二価の炭化水素鎖であり、Bは非存在又はCO-であり、v及びwは整数又はそのひとつが0であって、v及びwは6〜30の範囲にある；
ａ）XがCO-である場合、A又はBは非存在であり；又は、
ｂ）Xがジアミノ化合物である場合、A又はBはCO-である；
から選ばれ；

Zは、-OH、-NH₂、-COOH、-SO₃H及び-PO₃Hからなる群より選ばれる。］

本発明は、好ましくは、アシル化基-W-X-Y-Zが、親インスリンのB3、B27〜B30のリジン（K）残基にあるε-アミノ基に結合するインスリン誘導体を提供する。

上記インスリン誘導体は、好ましくは、アシル化基-W-X-Y-Zが、親インスリンのＡ鎖及びＢ鎖のＮ末端にあるα-アミノ基に結合する誘導体である。

本発明は、好ましくは、Sが、
Ａ鎖：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
Ｂ鎖：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10、

Ａ鎖：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
Ｂ鎖：FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9、
及び、
Ａ鎖：GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2
Ｂ鎖：FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16
からなる群より選ばれるインスリン類似体であるインスリン誘導体を提供する。

好ましくは、本発明は、アシル化基-W-X-Y-Zが、
N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu、
N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu、及び、
N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(3-acyl acid*)-Lys（ここで、アスタリスク（*）は、インスリンへの結合位置を示す。）
からなる群より選ばれるインスリン誘導体を提供する。

好ましくは、本発明は、
B28D-N^εB29-N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン（番号：HS061）、
B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30E ヒト・インスリン（番号：HS062）、
N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH（番号：HS067）、
N^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリン（番号：HS605）、
N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH（番号：HS606）、
N^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリン（番号：HS607）、
N^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン（番号：HS608）、
N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン))-Lys-OH（番号：HS609）、
及び、
N^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン（番号：HS610）
からなる群より選ばれるインスリン誘導体を提供する。

また本発明は、本発明によるインスリン類似体及び／又は製薬学的に許容されるその塩、又は上記のインスリン誘導体を含有する医薬製剤を提供する。

前記医薬製剤は、好ましくは、溶解型、非晶型及び／又は結晶型にあるヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩を含有する。

前記医薬製剤は、好ましくは長期アジュバントを含有し、当該長期アジュバントは共結晶化の形で薬物と共在する。

また本発明は、溶解型で存在する前記医薬製剤を含有し、インスリン活性を有する注射剤を提供する。

また本発明は、II型糖尿病、高血糖症、肥満又はインスリン抵抗性症候群治療用薬物の製造における、ヒト・インスリン類似体及び／若しくは製薬学的に許容されるその塩又はインスリン誘導体の使用を提供する。

また本発明は、インスリン活性を有する速効性及び／又は長時間作用性医薬製剤の製造における、前記ヒト・インスリン類似体及び／又は製薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。

本発明は、優れた修飾効果とより良い薬理活性を持つ新規ヒト・インスリン類似体、及び糖尿病治療に対する臨床上の選択肢となるさらに多くの薬物を提供する。

（用語）
本明細書では、アミノ酸に対する１文字コード及び３文字コードは、J. Biol. Chem., 243, p3558 (1968) に記載に従って記載した。

DNA配列において、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、並びにTはチミンを指す。

「ヒト・インスリン類似体」は、１個以上のアミノ酸残基が欠失した、及び／若しくは他のアミノ酸残基で置換したヒトのインスリン、又はアミノ酸残基が追加導入され、アミノ酸残基数が51を超えるヒトのインスリンを指す。

「インスリン誘導体」は、アシル基が、インスリンのＡ鎖及びＢ鎖のＮ末端にあるα-アミノ基、又はB3、B27〜B30のリジン残基にあるε-アミノ基に結合して生成されるアシル化インスリンを指す。当該アシル化インスリンは式（S-W-X-Y-Z）であり、各記号は本明細書中に定義される。

「ペグ化インスリン」は、ペグ化されたヒト・インスリン類似体を指す；ここで、ペグ（PEG）分子は、5〜100 KD、好ましくは10〜80 KD、より好ましくは15〜45 KD、最も好ましくは20〜40 KDの分子量を有し、分枝型又は直鎖型である。本発明において、ペグ化（20 KD）インスリンは、ヒト・インスリン類似体の各サブユニットが20 KDペグ分子と結合していることを意味し；ペグ化（30 KD）インスリンは、ヒト・インスリン類似体の各サブユニットが30 KDペグ分子と結合していることを意味し；ペグ化（分枝型40 KD）インスリンは、ヒト・インスリン類似体の各サブユニットが40 KD分枝型ペグ分子と結合していることを意味する。

「長期アジュバント」は硫酸プロタミンを指す。

「インスリン活性を有する速効性医薬製剤」は、速効性インスリン活性を有するヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩を含有する製剤を指す。

「インスリン活性を有する長時間作用性医薬製剤」は、長時間作用性インスリン活性を有するヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩を含有する製剤を指す。

本発明の配列は、天然ヒト・インスリンのアミノ酸配列に基づいて設計される。ヒト・インスリンの全長は、Ａ鎖とＢ鎖の2本の鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖はジスルフィド結合を介して結合しており、Ａ鎖には別のジスルフィド結合がある。ヒト・インスリンには、線を付けた3個のジスルフィド結合がある。各鎖上のアミノ酸の通し番号は、以下の規則で示される：例えば、Ａ鎖の1〜21位のアミノ酸残基は、A1、A2、A3 ・・・ と表示される；Ｂ鎖の1〜30位のアミノ酸残基は、B1、B2、B3 ・・・ と表示される。さらに、アミノ酸残基がＡ鎖及びＢ鎖のＮ末端に付加された場合、係るアミノ酸はそれぞれA0、A (-1)、A (-2)、・・・及びB (0)、B (-1)、B (-2 )、・・・と表示される。アミノ酸残基がＡ鎖及びＢ鎖のＣ末端に付加された場合、係るアミノ酸はそれぞれA22、A23、・・・、及びB31、B32、・・・と表示される。ヒト・インスリン類似体の具体的な式を表示するため、特定されたアミノ酸はアミノ酸コードにより示されるが、アミノ酸の不確かな置換又は欠失は、本発明の式において示されるとおり、位置の通し番号により示表示される。

本発明の実施態様において、本明細書中で用いられるB (1-29)は、ヒト・インスリンのB1〜B29からなる短縮されたＢ鎖を指し、B (1-30)は、ヒト・インスリンのB1〜B30からなるＢ鎖を指し、B (1-31)は、ヒト・インスリンのB1〜B31からなるＢ鎖を指し、B (1-32)は、ヒト・インスリンのB1〜B32からなるＢ鎖を指す；またA (1-21)はヒト・インスリンのＡ鎖を指し、A (0-21)は、A0位にアミノ酸残基が追加されたヒト・インスリンのＡ鎖を指す。本発明の具体的な実施態様によれば、ヒト・インスリンの置換残基は、ヒト・インスリンの通し番号により表示される。例えば、B (1-2)-D-B-(4-30), A(1-21)ヒト・インスリンは、Ｂ鎖の3位でNがDで置換されたヒト・インスリン類似体を指す。別段の指定がない限り、B (1-30), A (1-21)の略号は天然ヒト・インスリンを指し；B (1-29), A (1-21)は、B30位で欠失のあるヒト・インスリンを指し；B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21)は、B3位でKが置換し、B29B30位でEEが置換していることを意味する（実施例６）。さらに、ヒト・インスリンのように、ヒト・インスリン類似体のＢ鎖及びＡ鎖は、A (7) CysとB (7) Cysとの間及びA (20) CysとB (19) Cysとの間で形成された鎖間ジスルフィド結合を介して結合している。同時に、Ａ鎖には、A (6) CysとA (11) Cysとの間で形成された鎖内ジスルフィド結合がある。

本発明によれば、組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来技術により行われる。得られた形質転換細胞は従来法により培養し、本発明による遺伝子にコードされたポリペプチドを発現させる。用いる宿主細胞により、使用する培養液は通常の種々の培養液から選択することができる。宿主細胞は、増殖に適した条件下で培養した。発現した前駆体からインスリン類似体を遊離させる化学的方法及び／又は酵素的方法は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼB、リジン・エンドペプチダーゼ等の使用等の当業者に周知の従来技術である。

組換えヒト・インスリンB (1-30), A (1-21) 前駆体のクローニングについての概要図である。 挿入された組換えヒト・インスリンB (1-30), A (1-21) 前駆体断片のPCR増幅後の電気泳動結果を示す図である。 HS061及びHS060について、長時間作用活性のインビボアッセイの比較結果を示す図である。 HS062及びHS060について、長時間作用活性のインビボアッセイの比較結果を示す図である。 HS067及びHS060について、長時間作用活性のインビボアッセイの比較結果を示す図である。 ペグ化（20 kD）B (1-27)-D-K-E, A (1-21) (PEG (20kD)-156) 及びペグ化（20 kD）B(1-2)-K-B(4-28) –E-E, A(1-21) (PEG (20kD) -107) について、長時間作用活性のインビボアッセイの比較結果を示す図である。 PEG(30kD)-107、PEG (40kD)-107、PEG (30kD)-156及びPEG (40kD)-156について、長時間作用活性のインビボアッセイの比較結果を示す図である。

本発明は、下記の実施例によりさらに記述されるが、本発明の範囲をなんら限定するものではない。

本発明で使用された試薬処方は下記の通りである：
YPDブロス（1 L）（1％酵母エキス；2％ペプトン；2％グルコース）：
１．10 g酵母エキス及び20 gペプトンを900 mLの水に溶解した；
２．20分間オートクレーブした；
３．100 mLの無菌20％グルコースを添加した。

基本グルコース培養液（1 L）（1.34％ YNB；4×10^-5 ％ビオチン；2％グルコース）：
１．800 mLの水を20分間オートクレーブした（寒天板の調製のため、オートクレーブ前に15〜20 gの寒天を加えた。）；
２．60℃に冷却した後、100 mLの無菌10×YNB、2 mLの無菌0.02％ビオチン及び100 mLの無菌20％グルコースを添加した。

BMMY液体培養液（1 L）：
１．10 g酵母エキス及び20 gペプトンを700 mLの水に溶解した；
２．20分間オートクレーブした；
３．室温に冷却した後、以下の物質を添加し混合した：
100 mLの無菌1 M リン酸カリウム緩衝液、pH 6.0；100 mLの無菌10×YNB；2 mLの無菌0.02％ビオチン；100 mLの無菌5％メタノール。

発現誘導培養液（1 L）（BMGY）：
１．10 g酵母エキス及び20 gペプトンを700 mLの水に溶解した；
２．20分間オートクレーブした；
３．室温に冷却した後、以下の物質を添加し混合した：
100 mLの無菌1 M リン酸カリウム緩衝液、pH 6.0；100 mLの無菌10×YNB；2 mLの無菌0.02％ビオチン；100 mLの無菌10％グリセロール。

本明細書に記載された実施例は、全体として従来の条件、例えば、Sambrookらのモレキュラークローニング：実習マニュアル（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）;ピキア酵母発現実習マニュアル（バージョン：2009年4月10日）に従って実施し、又は具体的な条件が示されていなければ、製品製造会社の推奨に従いながら実施した。本明細書で使用される試薬は、通常製造会社から購入した。本発明の下記の実施例で言及される分子量単位は、ダルトン（Dalton）である。

組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 及びB(1-29), R-A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 前駆体を持つ発現ベクターの構築
組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 前駆体をコードする遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を3巡させて合成した。5種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社により合成し、プライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：
5' GTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTG 3'
SEQ ID NO. 45
プライマー２：
5' GTAGAGGGAGCAGATGCTGGTACAGCATTGTTCCACAATGCCACGCTTGG 3'
SEQ ID NO. 46
プライマー３：
5' TGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGG 3'
SEQ ID NO. 47
プライマー４：
5' CTGACTGAATTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGGGAGCAGAT 3'
SEQ ID NO. 48
プライマー５：
5' ACTTGCTCGAGAAAAGATTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTG 3'
SEQ ID NO. 49

PCRの第１巡は、KOD合成キット（東洋紡, Cat. KOD-201）（50 μL系：5 μL 10×KOD緩衝液、2 μL 2 mM dNTPs、1.5 μLプライマー１（10 μM）、1.5μLプライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、2 μL 25 mM MgSO₄、38μL dd H₂O）を用いて行った。増幅プログラムでは、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で30秒間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で2分間インキュベーションした。85個のヌクレオチドを有するPCR産物１を合成し、次に、1.2％アガロースゲルで同定し、回収した。

PCRの第２巡は、50 μL PCR系（5 μL 10×KOD緩衝液、2 μL 2 mM dNTPs、1 μL 産物１、1.5 μLプライマー３（10 μM）、1.5 μLプライマー４（10 μM）、0.5 μL KODプラス、2 μL 25 mM MgSO₄、37 μL dd H₂O）で行った。増幅プログラムでは、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で30秒間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で2分間インキュベーションした。得られた155個のヌクレオチドを有するPCR産物２を、1.2％アガロースゲルで同定し、回収した。

PCRの第２巡は、50 μL PCR系（5 μL 10×KOD緩衝液、2 μL 2mM dNTPs、1 μL産物２、1.5 μLプライマー４（10 μM）、1.5 μLプライマー５（10 μM）、0.5 μL KODプラス、2 μL 25 mM MgSO₄、37 μL dd H₂O）で行った。合成プログラムでは、94℃で2分間、94℃で30秒間、 55℃で30秒間、68℃で30秒間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で2分間インキュベーションした。産物３は1.2％アガロースゲルで同定し、回収した。

産物３は、Tベクターキット（タカラ、Cat. D103A）によりTベクターに連結した後、EcoR I／Xho I（ニュー・イングランド・バイオラボ、Cat. R0101S／R0146V）で二重消化した。得られた断片は1.2％アガロースゲルにより回収した後、T4リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ、Cat.M0202S）を用いてpPIC9K発現ベクター（インビトロジェン、Cat. K1750-01）に連結した。この構造は図１に示した。

得られた組換え発現ベクターの配列分析は、インビトロジェン社で実施した。産物３は、ヒト・インスリンB (1-30), A (1-21) 前駆体をコードするDNA断片であることを確認した。配列は以下の通りである。
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG
SEQ ID NO. 32

（２）組換えヒト・インスリンB (1-30), A (1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
上記ステップで得られた組換えヒト・インスリン前駆体を含む5〜10 μgの発現ベクターを、SalI（タカラ、Cat. D1080a）により直線化した後、1／10容量の3 M 酢酸ナトリウム及び2容量の無水エタノールを加えた。十分混合した後、混合物を−20℃で2時間放置した。混合物は高速（13,000 rpm）で5分間遠心分離し、上清を除去し、沈渣を75％エタノールで2回洗浄した。沈渣は転倒して乾燥させ、10 μLのdd H₂Oに溶解した。80 μLの直線化プラスミド及びコンピテント細胞（ピキア・パストリスGS115、インビトロジェン、Cat. K1750-01）を、氷上で5分間、エレクトロポレーション・キュベット（バイオ・ラド、Cat. 1652086）に加えた。エレクトロポレーター（バイオ・ラド、マイクロパルサー）の設定値は、2 kV、25 Ω、200 uFとした。エレクトロポレーションを実行した後、1 mLの冷却したD-ソルビトール（バイオロジカル・エンジニアリング株式会社）を素早く加えて混合した。100〜300 μLの混合物をMD培養プレートに入れ、コロニーが形成されるまで60℃で3日間培養した。

（３）G418による組換えヒト・インスリン前駆体クローンの選別
MD培養プレート上のコロニーは3 mLのYPDブロスにより溶離し、再懸濁して、再懸濁細胞濃度（1 OD₆₀₀ = 5×10⁷細胞／mL）を分光光度計（ベックマン、DU800）により測定した。1×10⁵細胞を、種々の濃度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL）のG418（ギブコ、Cat. 11811-031）と共にYPD培養プレートに播種し、コロニーが形成されるまで30℃で5日間培養した。G418濃度が異なる5枚のプレートから30個の単一クローンを選抜し、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により確認した。

（４）組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 前駆体が挿入されたクローンのPCRによる同定
G418抵抗性コロニーに挿入された断片はPCRにより確認した。18 μLのブロスを1.5 mLチューブに入れ、2 μLのチターゼ（cytase）（5 U/μL、シグマ、Cat. L2524）を加えて、30℃で10分間インキュベートした。次に、試料を−80℃で10分間放置し、完全に溶解させた。同定はKODキット（東洋紡、Cat KOD-201）（25 μL PCR系：2.5 μL 10×反応緩衝液、1.5 μL 25 mM MgCl₂、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μL 5’ AOX1プライマー（10 pmol/μL）、1 μL 3’ AOX1プライマー（10 pmol/μL)、0.5 μL KODポリメラーゼ、15 μL dd H₂O、1 μL 可溶化緩衝液）を用いて行った。混合物はPCR機器システム（エッペンドルフ、22331型）に置き、増幅プログラムは94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で4分間とし、25回の増幅サイクルの後、68℃で10分間インキュベートした。10 μLのPCR産物を1.0％アガロースゲル（シグマ、A9539）で同定した。結果を図２に示した。２本の明瞭な増幅バンドが観察された。2.2 Kbの大きなバンドは、GS115自体に運ばれたAOX遺伝子に一致し、635 bpの小さなバンドは、挿入された外来遺伝子に相当する。図２のレーン６は、クローンNo. 1001-17に一致する。クローンNo. 1001-17を選択し、さらに使用した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
クローンNo. 1001-17の単一コロニーを、50 mL BMGY培養液中で、30℃、250 rpmで、一晩培養した。翌日、検出されたOD₆₀₀値は2〜6であった。細胞は、室温で5分間、低速（1,500 g）で遠心分離（ベックマン・コールター）することにより集め、OD₆₀₀が1.0になるようBMGY培養液に懸濁した。全容量の1／200量の100％メタノールを培養液に加えて、終濃度を0.5％とした。次に、培養液を28℃、250 rpmで72時間培養し、培養期間中、全容量の1／200量の100％メタノールを24時間ごとに添加した。培養後、培養液を低速（1,500 g）で遠心分離し、上清を集めた。クローンNo. 1001-17前駆体タンパク質の発現は、SDS-PAGE（インビトロジェン、Cat. No. 456-1083）により確認した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-30), A(1-21) 前駆体の発酵
１．菌種：発現菌株No.1001-17
２．5 L発酵槽に関する作業工程
２．１ 菌株の活性化と培養
前記菌株のグリセロール・ストック1 mLを100 mLのBMGY培養液に播種し、30℃、220 r/min（rpm）で20時間培養した。
２．２ 播種
播種サイズは5％で、0.4％滅菌PTM1溶液を加えて、発酵を開始した。
２．３ 初期発酵段階
順応期（10〜12時間）の後、菌株発酵は指数増殖期に入る。撹拌速度及び通気は連続的に増加させ、細胞増殖に対してDO>30％の要件を満たした。撹拌速度は毎回50〜100 rpm増加させた。25％工業用アンモニアを自動供給し、pHを設定値に固定した。
２．４ 増殖期におけるグリセロール供給
初期培養液中の基質が消費された場合（18〜24時間）、50％グリセロールを供給回分によって制限された速度で添加した。
２．５ メタノール誘導期
グリセロールによる一過性の細胞増殖の4〜6時間後、グリセロール供給を停止した。飢餓状態を30分間維持し、残っているグリセロールを完全に消費させた。次に、メタノールを加えて、誘導を始めた。96時間後、発酵を停止した。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
得られた発酵ブロスを従来の方式で限外濾過し、SPセファロースFF（GE、Cat. 17-0729-10）及びQセファロースFF（GE、Cat. 17-0510-10）カラムで精製した。精製した産物はHPLC（ウォーターズe2695-2489液体メータ、カラム：フェノメネクス、ジュピターC18、250×4.6 mm、5 μm、300 Å）により分析した。純度は90％以上である。
得られた発現前駆体の配列は以下の通りである。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 22
得られた産物のLC-MS（液体MS）により検出した分子量は6074であり、これは理論的に予測された分子量6074と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
上記の精製した産物を50 mMトリスでpH 9.0に調整し、トリプシン（シグマ、Cat. T1426）及びCPB（シグマ、C9584）で消化した。反応過程はHPLCで分析した。完全に消化した後、pH値を1 M HClで2に調整して反応を終了させた。ふたつのインスリン産物を逆相（ジュピターC4、10 μm、300Å、50×250 mm）により下記の通り調製した。
産物１：組換えヒト・インスリンB (1-30), A (1-21)（hIと略称する）
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT SEQ ID NO. 5
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5807であり、これは理論的に予測された分子量5807.7と一致する。
産物２：組換えヒト・インスリンB (1-29), R-A (1-21)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 78
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 4
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5863であり、これは理論的に予測された分子量5862.7と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
上記にて調製された産物１及び産物２を、GluC（シグマ、P6181）により37℃で4時間消化した。2 μLの1 M HClを加えて反応を停止させた。産物はLC-MSにより分析した。結果は以下の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB (1-30), A (1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから任意に選択される２つの間に形成される。

これらの結果より、ヒト・インスリンB (1-29), R-A (1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから任意に選択される２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体を持つ発現ベクターの構築
B (1-29), A (1-21) は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いることにより、部位特異的な変異誘発を介して得られた。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' CTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAAC 3' SEQ ID NO. 50
プライマー２：5' GTTCCACAATGCCACGCTTGGGTGTGTAGAAG 3' SEQ ID NO. 51

実施例１で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として適用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を利用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅を25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化し、TOP10コンピテント細胞に形質転換して、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG
SEQ ID NO. 33

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリン前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリン前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリン前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリン前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 006-15を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリン前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 006-15は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) 前駆体の発酵
クローンNo. 006-15を発酵用に選定した。発酵法は、実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 23
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5844.7であり、理論的に予測された分子量は5846.2である。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した酵素的消化産物は下記の通りであった。
組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21)（Des (B30)-hIと略称する）
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 78
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5578であり、これは理論的に予測された分子量5578と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-29), A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-27)-K-E-R, A(1-21) は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：
5' GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAGAGCTGCTAAAGGTATCGTTGAGC 3'
SEQ ID NO. 52
プライマー２：
5' GCTCAACGATACCTTTAGCAGCTCTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO. 53

実施例１で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体をコードするDNA断片の配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAGAGCTGCTAAAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO. 34

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリン前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリン前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りに選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリン前駆体クローンの挿入された断片は、実施例１に記載の通りに確認した。クローンNo. 064-6を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
方法は、実施例１に記載の通りであった。結果より、クローンNo. 064-6は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリン前駆体の発酵
クローンNo. 064-6を発酵用に選定した。発酵法は、実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKERAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 24
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6147であり、理論的に予測された分子量6147と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
上記の精製した産物を50 mMトリスでpH 9.0に調整し、トリプシン（シグマ、Cat. T1426）で消化した。反応過程はHPLCで分析した。完全に消化した後、pH値を1 M HClで2に調整して反応を終了させた。逆相（ジュピターC4、10 μm、300Å、50×250 mm）により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21)：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKER SEQ ID NO. 6
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5894であり、これは理論的に予測された分子量5894.7と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21)におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E-R, A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-27)-K-E, A(1-21) は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発により得られた。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO. 54
プライマー２：5' CAACGATACCTCTTTTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO. 55

実施例１で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO. 35

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 062-6を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリン前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 062-6は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリン前駆体の発酵
No. 062-6クローンを発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 25
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6004.91であり、理論的に予測された分子量6006.3と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21)：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO. 7
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5738.54であり、これは理論的に予測された分子量5738.8と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21)におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-21)におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-27)-K-P-E, A(1-21) は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO. 56
プライマー２：5' CAACGATACCTCTTTTTTCAGGCTTGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO. 57

実施例１で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO. 36

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体クローンの挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 061-5を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 061-5は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) 前駆体の発酵
クローンNo. 061-5を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物である前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 26
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6102であり、理論的に予測された分子量6102と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21)：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPE SEQ ID NO. 8
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5835であり、これは理論的に予測された分子量5835.7と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-P-E, A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GAGAAAAGATTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGG 3'
SEQ ID NO. 58
プライマー２：5' CCACACAAGTGCTGCTTGACGAATCTTTTCTC 3'
SEQ ID NO. 59
プライマー３：5' GTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO. 60
プライマー４：5' CAACGATACCTCTTTTTTCTTCAGGGGTGTAAAAGAAAC 3'
SEQ ID NO. 61

実施例１で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO.37

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21)前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 070-4を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 070-4は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) 前駆体の発酵
クローンNo. 070-4を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物である前駆体は下記の通りであった。
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 21
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6117であり、理論的に予測された分子量6117と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21)：
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO. 9
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5850であり、これは理論的に予測された分子量5850.7と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 及びB(1-27)-D-K-E, A(1-20)-Gの製造
［第１部］組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21)の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-27)-D-K-E, A(1-21) は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO. 62
プライマー２：5' CAACGATACCTCTTTTTTCCTTATCGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO. 63

実施例１で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO.38

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 068-4を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 068-4は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) 前駆体の発酵
クローンNo. 068-4を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物である前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 19
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6119.99であり、理論的に予測された分子量6119.5と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21)：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO. 10
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5853.6であり、これは理論的に予測された分子量5853と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りである：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

［第２部］組換えヒト・インスリンB (1-27)-D-K-E, A (1-20)-Gの製造
組換えヒト・インスリンB (1-27)-D-K-E, A (1-21) の製造に係るステップ１〜３を、下記のプライマー及び鋳型を使用したことを除き、繰り返した。

（１）ステップ１における部位特異的な変異誘発用のプライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO. 66
プライマー２：5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO. 67
B(1-27)-D-K-E, A (1-21) (SEQ ID NO.38) を含む組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。

（２）ステップ２において、クローンNo. 115-1を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

（３）ステップ３において、発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物である前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO. 77

（４）ステップ４において、発酵産物の酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-20)-G：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO. 10
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2

（５）ステップ５において、開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。得られた結果より、実施例で得られた産物は、正確な配置を有することが確認された。

組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-Gの製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。4種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GGTTTCTTTTACACCCCTAAGACTAGAAGAGGTATCGTTGAG 3'
SEQ ID NO. 64
プライマー２：5' CTCAACGATACCTCTTCTAGTCTTAGGGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO. 65
プライマー３：5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO. 66
プライマー４：' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO. 67

部位特異的な変異誘発の手順において、KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGACTAGAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAA
SEQ ID NO.39

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 073-16を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 073-16は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリン前駆体の発酵
クローンNo. 073-16を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた産物は下記の通りであった。
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO. 27
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6046.3であり、理論的に予測された分子量6045.96と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例３に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
産物１：ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-G
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR SEQ ID NO.11
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6064.8であり、これは理論的に予測された分子量6063.96と一致する。
産物２：ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-G
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR SEQ ID NO.12
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.3
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6064.8であり、これは理論的に予測された分子量6063.96と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R-R, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。
ヒト・インスリンB (1-2)-D-B (4-30)-R, R-A (1-20)-Gのジスルフィドの分析結果は以下である。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-30)-R, R-A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' CTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAG 3'
SEQ ID NO. 68
プライマー２：5' CTCAACGATACCTCTTCTTTCAGGGGTGTAAAAG 3'
SEQ ID NO. 69

実施例６で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO.40

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21)前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 072-16を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 072-16は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) 前駆体の発酵
クローンNo. 072-16を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物である前駆体は下記の通りであった。
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 28
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6015.1であり、理論的に予測された分子量6015.93と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例３に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21)：
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERR SEQ ID NO. 13
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6064.8であり、これは理論的に予測された分子量6063.96と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21)におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) の製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21)及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21)前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' CTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATG 3'
SEQ ID NO. 70
プライマー２：5' CATTGCTCAACGATACCTCTCTTAGGGGTGTAAAAG 3'
SEQ ID NO. 71

部位特異的な変異誘発の手順において、KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO.41

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 087-1を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) 前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 087-1は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21)前駆体の発酵
クローンNo. 087-1を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物は下記の通りであった。
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO. 29
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5846.2であり、理論的に予測された分子量5845.74と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例３に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物１は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21)：
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 14
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5707.53であり、これは理論的に予測された分子量5708と一致する。

ステップ３で得られた産物をLys-C（シグマ、P3428）を用いて消化した。逆相により得られた消化産物２は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB (1-2)-D-B (4-29), R-A (1-21)：
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 14
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 4
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5864.5であり、これは理論的に予測された分子量5863.72と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) におけるジスルフィド結合構造の分析結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。
ヒト・インスリンB (1-2)-D-B (4-29), R-A (1-21) のジスルフィド結合構造の分析結果は以下である。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-21) におけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-Gの製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO. 72
プライマー２：5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO. 73

実施例４で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAG
SEQ ID NO.42

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体の断片が挿入されたクローンは、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 094-4を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 094-4は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリン前駆体の発酵
クローンNo. 094-4を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られたB(1-27)-K-E, A(1-20)-G前駆体は下記の通りであった。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO. 30
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5948であり、理論的に予測された分子量5947.85と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-G：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO. 15
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5681であり、これは理論的に予測された分子量5681.49と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合構造の分析から得られた結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-27)-K-E, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gの製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO. 74
プライマー２：5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO. 75

実施例６で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG
SEQ ID NO.43

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体の断片が挿入されたクローンは、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 093-15を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 093-15は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリン前駆体の発酵
クローンNo. 093-15を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物は下記の通りであった。
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO. 20
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は6060であり、理論的に予測された分子量6060と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-G：
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO. 16
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5793であり、これは理論的に予測された分子量5793.6と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合構造の分析から得られた結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-Gの製造
［ステップ１］組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G 及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体のクローニングと発現
（１）組換えヒト・インスリン前駆体を持つ発現ベクターの構築
B(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的な変異誘発を介して変異導入した。2種の一本鎖DNA断片をインビトロジェン社で合成し、部位特異的な変異誘発用のプライマーとして使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
プライマー１：5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO. 76
プライマー２：5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO. 67

実施例１０で最終的に得られた組換えベクターを、部位特異的な変異誘発の手順において鋳型として使用した。KODキット（東洋紡, Cat. KOD-201）25 μL系を適用した：すなわち、2.5 μL 10×KOD緩衝液、2.5 μL 2 mM dNTPs、1 μLプライマー１（10 μM）、1 μL プライマー２（10 μM）、0.5 μL KODプラス、1 μL 25 mM MgSO₄、16 μL dd H₂Oである。増幅プログラムは次の通りとした：すなわち、94℃で2分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で11分間の増幅サイクルを25回行った後、68℃で11分間インキュベーションした。PCR産物は、1 μLのDpnI（NEB、Cat. R0176L）を直接添加することにより1時間消化した後、TOP10コンピテント細胞に形質転換し、目的のプラスミドを得た。得られた組換え発現ベクターは、配列分析のためインビトロジェン社に送付した。

（２）配列分析の結果
連結した組換えプラスミドは、インビトロジェン社で分析した。得られたヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体をコードするDNAの配列は、下記の通りであった。
TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG
SEQ ID NO.44

（３）エレクトロポレーションによる組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターの形質転換
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体を含む発現ベクターは、実施例１に記載の通りに形質転換させた。

（４）G418による組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体クローンの選別
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体のクローンは、実施例１に記載の通りにG418により選別した。

（５）組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体の断片が挿入されたクローンのPCRによる同定
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体の挿入された断片は、実施例１に記載の通りにPCRにより確認した。クローンNo. 096-4を選択し、さらに使用した。

（６）組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体の発現と特性評価
組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体は、実施例１に記載の通りに発現させ、同定した。結果より、クローンNo. 096-4は目的のタンパク質を発現していることが示され、下記の発酵用に選定した。

［ステップ２］組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G及びB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G前駆体の発酵
クローンNo. 096-4を発酵用に選定した。発酵法は実施例１に記載の通りであった。

［ステップ３］発酵産物の単離と精製
発酵産物は、実施例１に記載の通りに単離し、精製した。得られた発現産物は下記の通りであった。
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTP KRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO. 31
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5789であり、理論的に予測された分子量5788.67と一致する。

［ステップ４］発酵産物の酵素的消化と精製
酵素的消化と精製の方法は、実施例３に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物１は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-G：
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKR SEQ ID NO. 17
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5807であり、これは理論的に予測された分子量5806.67と一致する。
酵素的消化と精製の方法は、実施例１に記載の通りである。酵素反応系の最適化後、逆相により調製した消化産物２は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), A(1-20)-G：
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 18
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5651であり、これは理論的に予測された分子量5650.48と一致する。
ステップ３（096-4発酵）で得られた産物は、実施例１０に記載されたものと同一の酵素的方法を用いて消化した。逆相により調製した消化産物３は下記の通りであった。
ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29), R-A(1-20)-G：
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 18
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 3
得られた産物のLC-MSにより検出した分子量は5807であり、これは理論的に予測された分子量5806.7と一致する。

［ステップ５］開裂産物におけるジスルフィド結合構造の分析
開裂産物におけるジスルフィド結合構造は、実施例１に記載の通りに分析した。ヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合構造の分析から得られた結果は下記の通りであった。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

ヒト・インスリンB (1-2)-D-B (4-29), A (1-20)-Gのジスルフィド結合構造の分析結果は以下である。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

ヒト・インスリンB (1-2)-D-B(4-29), R-A (1-20)-Gのジスルフィド結合構造の分析結果は以下である。

上記の結果より、組換えヒト・インスリンB(1-2)-D-B(4-29)-R, A(1-20)-Gにおけるジスルフィド結合の配置は次の通りであることが確認された：すなわち、１つがA20とB19との間に形成され、他の２つは、A6 Cys、A7 Cys、A11 Cys及びB7 Cysから選択される任意の２つの間に形成される。

B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン（HS061）の製造
（１）メチルヘキサデカンジオイル−Glu (OSu)-OMeの製造
ヘキサデカン二酸（5.0 g、17.48 mmol）を無水メタノール（50 mL）に溶解し、液体窒素で−10℃まで冷却した後、塩化チオニル（3.2 mL、43.7 mmol）を−10℃、20分間で滴下し、反応溶液を徐々に加温し、4時間還流した。反応を終了し、反応液を室温まで冷却して濃縮乾固し、ヘキサデカン二酸ジメチル5.15 g（94％）を得た。

ヘキサデカン二酸ジメチル（5.0 g、15.92 mmol）を無水メタノール（50 mL）に溶解し、メタノールに溶解したBa (OH) ₂ ・8H₂O（5.0 g, 15.8 mmol）をヘキサデカン二酸ジメチル中に滴下し、反応溶液を30℃まで徐々に加温して、反応混合物を24時間撹拌した。メタノールを減圧濃縮により除去した後、残渣を酢酸エチルに溶解し、0.1 M HClで3回洗浄した。有機層を集めて無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮、真空乾燥して、ヘキサデカン二酸モノメチル4.55 g（収率95％）を得た。

ヘキサデカン二酸モノメチル（2.0 g、6.67 mmol）をDCM（50 mL）に溶解し、HOSu（0.92 g、8.0 mmol）を加えた後、DCC（2.06 g、10 mmol）を加え、24時間室温で撹拌した。反応溶液を濾過し、有機層を200 mLの0.1 M HClで3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、メチルセタン二酸サクシニミドエステル2.45 g（92％）を得た。

H-Glu-OMe（0.81 g、5.04 mmol）を5 mLの純水に溶解し、得られた溶液を、メチルセタン二酸サクシニミドエステル（1.0 g、2.52 mmol）を溶解したTHF（50 mL）に添加した。得られた混合物にDIEA（0.65 g、5.04 mmol）を加え、室温で24時間撹拌した。反応溶液を濾過し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、有機層を200 mLの0.1 M HClで3回洗浄した後、有機層を集めて無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過、減圧濃縮し、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、濃縮後、0.7 g（63％）のメチルヘキサデカンジオイル−Glu-OMeを得た。ESI-MS：444.3（[M+H]⁺）

メチルヘキサデカンジオイル−Glu-OMe（0.3 g、0.677 mmol）をDCM（20 mL）に溶解後、HOSu（85.7 mg、0.745 mmol）及びDCC（0.167 g、0.812 mmol）を加え、室温で24時間撹拌、濾過し、0.1 M HClで洗浄した。有機層を集め、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過、減圧濃縮し、真空乾燥して、0.3 g（82％）の下記構造を有するメチルヘキサデカンジオイル−Glu (OSu)-OMeを得た。

（２）B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体の製造
組換えB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリン（50 mg、8.5 mmol）（実施例７）を10 mLの10 mM HClに溶解した。pH値を0.2 M NaOHにより約10.5に調節した。メチルヘキサデカンジオイル−Glu (OSu)-OMe（13.9 mg、25.6 mmol）を10 mLのアセトニトリルに溶解後、上記B(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリン溶液に加え、40分間の反応を開始した。反応過程はRP-HPLCにより制御した。40分後、溶液のpH値を10％HClにより約2.2に調節して、反応を停止させ、粗前駆体溶液を得た。

（３）B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体の精製
上記の粗前駆体溶液を水で希釈し、有機層含量を約30％（v：v）とした。この溶液を、0.45 μm膜で濾過した後、RP-HPLCで精製した。ここで、逆相カラムはLuna C18、250×25 mm、5 μm、100 Åを使用し、移動相Ａは0.1％TFA／H₂O、移動相Ｂは0.1％TFA／ACNとした。所望産物を、38％〜68％のグラジエント相Ｂ、流速20mL／分で60分以内に溶出し、集めて、精製前駆体溶液を得た。ESI-MS：1570.8（[M+4H]⁴⁺）

（４）B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体のけん化
精製した前駆体溶液から、減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した。その後、溶液のpH値を10％NaOH溶液により8.0に調節し、等量の0.2 M氷冷NaOHを加えてけん化した。けん化産物はRP-HPLCにより分析した。反応は10％HClの添加により停止させた。

（５）けん化B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体溶液の精製と凍結乾燥
上記のけん化前駆体溶液をアセトニトリルで希釈し、有機層含量を約30％（v：v）とした。この溶液を、0.45 μm膜で濾過した後、RP-HPLCで精製した。ここで、逆相カラムはLuna C18、250×25 mm、5 μm、100Å、を使用し、移動相Ａは0.1％TFA／H₂O、移動相Ｂは0.1％TFA／ACNとした。所望産物を、35％〜65％のグラジエント相Ｂ、流速20mL／分で60分以内に溶出し、集めて凍結乾燥し、3.6 mgの産物（純度97.9％）を得た。得られた生成物の構造は下記の通りである。

（６）B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリンの構造の確認
ESI-MSアッセイにより検出したB28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリンの分子量は6251.65であり、理論的に予測された分子量6251.16と一致する。

B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリンをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ4865及び1403であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F2は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。

B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン（HS062）の製造
（１）16-ヒドロキシヘキサデカノイル−Glu (OSu)-OMeの製造
16-ヘキサデカン酸（3.0 g、11.03 mmol）をDCM（50 mL）に溶解後、O-(N-サクシニミジル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸エステル及びN, N-ジイソプロピルエチルアミン（1.71 g、13.2 mmol）を添加した。反応溶液を室温で24時間撹拌した。濾過後、有機層を0.1 M HClで3回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機層を減圧濃縮して、3.5 g（70％）の16-ヒドロキシヘキサデカンサクシニミドエステルを得た。

5 mLの純水に溶解したH-Glu-OMe（3.4 g、21.64 mmol）を、16-ヒドロキシヘキサデカンサクシニミドエステルを溶解したTHF溶液（50 mL）に加えた。DIEA（2.8 g、21.64 mmol）を加えて室温で24時間撹拌した。反応溶液を濾過し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、有機層を200 mLの0.1 M HClで3回洗浄した。有機層を集め、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過、減圧濃縮し、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。最終的に濃縮後、2.5 g（45％）の16-ヒドロキシヘキサデカノイル−Glu-OMeを得た。ESI-MS：417（[M+H]⁺）

16-ヒドロキシヘキサデカノイル−Glu-OMe（1.0 g、2.4 mmol）をDCM（20 mL）に溶解後、HOSu（0.305 g、2.65 mmol）及びEDC・HCl（0.69 g、3.61 mmol）を添加した。室温で24時間撹拌、濾過し、0.1 M HClで洗浄し、有機層を集めた。これを無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮、真空乾燥して、0.9 gの16-ヒドロキシヘキサデカノイル−Glu (OSu)-OMe（純度73％）を得た。得られた生成物は下記の構造である。

（２）B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体の製造
組換えB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリン（50 mg、8.5 mmol）を10 mLの10 mM HClに溶解した。pH値を0.2 M NaOHにより約10.5に調節した。16-ヒドロキシヘキサデカノイル−Glu (OSu)-OMe（13.2 mg、25.5 mmol）を10 mLのアセトニトリルに溶解後、上記B(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリン溶液に加え、40分間の反応を開始した。反応過程はRP-HPLCにより制御した。40分後、溶液のpH値を10％HClにより約2.2に調節して、反応を停止させ、粗前駆体溶液を得た。

（３）B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体の精製
上記の粗前駆体溶液を水で希釈し、有機層含量を約30％（v：v）とした。この溶液を、0.45 μm膜で濾過した後、RP-HPLCで精製した。ここで、逆相カラムはLuna C18、250×25 mm、5 μm、100 Åを使用し、移動相Ａは0.1％TFA／H₂O、移動相Ｂは0.1％TFA／ACNとした。所望産物を、35％〜65％のグラジエント相Ｂ、流速20mL／分で60分以内に溶出し、集めて、精製前駆体溶液を得た。ESI-MS：1563.4（[M+4 H]⁴⁺）

（４）B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体のけん化
精製した前駆体溶液から、減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した。その後、溶液のpH値を10％NaOH溶液により8.0に調節し、等量の0.2 M氷冷NaOHを加えて50分間けん化した。けん化産物はRP-HPLCにより分析した。50分後、反応を10％HClの添加により停止させた。

（５）けん化B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリン前駆体溶液の精製と凍結乾燥
上記のけん化前駆体溶液をアセトニトリルで希釈し、有機層含量を約30％（v：v）とした。この溶液を、0.45 μm膜で濾過した後、RP-HPLCで精製した。ここで、逆相カラムはLuna C18、250×25 mm、5 μm、100 Åを使用し、移動相Ａは0.1％TFA／H₂O、移動相Ｂは0.1％TFA／ACNとした。所望産物を、35％〜65％のグラジエント相Ｂ、流速20mL／分で60分以内に溶出し、集めて凍結乾燥し、10 mgの産物（純度94.3％）を得た。得られた生成物の構造式は下記の通りである。

（６）B28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリンの構造の確認
ESI-MSにより検出したB28D-N^εB29-(N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリンの分子量は6237.52であり、理論的に予測された分子量6237.17と一致する。

B28D-N^εB29-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30Eヒト・インスリンをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ4865及び1389であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F2は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。

N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH（HS067）の製造
（１）N^α-(メチルヘキサデカンジオイル)-Nε-(3-アシルプロピオン酸-OSu)リジンメチルエステルの製造
5 mLの純水に溶解したH-Lys(Fmoc)-OMe（4.33 g、11.29 mmol）を、メチルヘキサデカン酸サクシニミジルエステル（3.0 g、7.55 mmol）を溶解したTHF溶液（50 mL）に加え、DIEA（1.46 g、11.29 mmol）を加えて室温で24時間撹拌した。反応溶液を濾過し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、有機層を200 mLの0.1 M HClで3回洗浄した。次に、有機層を集め、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過した後、減圧濃縮した。生成物は200 mLのアセトニトリル：水 = 10：1（v：v）を用いて結晶化し、5.0 g（99.6％）のメチルヘキサデカンジオイル−Lys (Fmoc)-OMeを得た。

メチルヘキサデカンジオイル−Lys (Fmoc)-OMe（5.0 g、7.52 mmol）をTHF（80 mL）に溶解した後、ヘキサヒドロ−ピリジン（20 mL）を加え、室温で20分間撹拌した。この溶液を減圧濃縮した。得られた固形物を酢酸エチル（100 mL）に溶解し、水で3回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウム上で30分間乾燥させた。濾過、減圧濃縮後、得られた固形物をクロロホルム（100 mL）に溶解し、ここへ無水コハク酸（11.34 g、113.4 mmol）及びN, N-ジイソプロピルエチルアミン（14.1 g、113.4 mmol）を加えて、反応混合物を室温で2時間撹拌した。この反応溶液に、洗浄するため100℃の純水を加えた。有機層を無水硫酸ナトリウム上で30分間乾燥させた。濾過、減圧濃縮後、得られた固形物を逆相HPLCにより精製し、濃縮後、3.45 g（84.7％）のN^α-(メチルヘキサデカンジオイル)- N^ε- (3-アシルプロピオン酸) Lysメチルエステルを得た。ESI-MS： 543.6（[M+H]⁺）

N^α-(メチルヘキサデカンジオイル)-N^ε-(3-アシルプロピオン酸)リジンメチルエステル（0.5 g、0.9 mmol）をDCM（50 mL）に溶解し、HOSu（0.116 g、2.0 mmol）及びEDC・HCl（0.265 g、2.0 mmol）を加えた後、室温で48時間撹拌した。濾過した後、0.1 M HClで洗浄し、有機層を集めた。有機層は無水硫酸ナトリウム上で30分間乾燥させ、濾過及び減圧濃縮後、0.36 g（63％）のN^α-(メチルヘキサデカンジオイル)-N^ε-(3-アシルプロピオン酸-OSu) リジンメチルエステルを得た。得られた生成物の構造式は下記の通りである。

（２）N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH前駆体の製造
B(1-27)-D-K-E, A(1-21)（50 mg、8.5 mmol）を10 mLの10 mM HClに溶解した後、pH値を0.2 M NaOHにより約10.5に調節した。10 mLのアセトニトリルに溶解したN^α-(メチルヘキサデカンジオイル)-N^ε-(3–アシルプロピオン酸-OSu) リジンメチルエステル（16.4 mg、25.6 mmol）を、上記B(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリン溶液に加え、反応を開始した。反応過程はRP-HPLCにより制御した。40分後、溶液のpH値を10％HClにより約2.2に調節して、反応を停止させ、粗前駆体溶液を得た。

（３）ヒト・インスリンN^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH前駆体の精製
上記の粗前駆体溶液を水で希釈し、有機層含量を約30％（v：v）とした。この溶液を、0.45 μm膜で濾過した後、RP-HPLCで精製した。ここで、逆相カラムはLuna C18、250×25 mm、5 μm、
100Å、を使用し、移動相Ａは0.1％TFA／H₂O、移動相Ｂは0.1％TFA／ACNとした。所望産物を、38％〜68％のグラジエント相Ｂ、流速20mL／分で60分以内に溶出し、集めて、精製前駆体溶液を得た。ESI-MS：1595（[M+4H]⁴⁺）

（４）N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH前駆体のけん化
精製した前駆体溶液から、減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した。その後、溶液のpH値を10％NaOH溶液により8.0に調節し、等量の0.2 M氷冷NaOHを加えてけん化を開始した。けん化産物はRP-HPLCにより分析した。50分後、反応を10％HClの添加により停止させた。

（５）けん化N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH前駆体溶液の精製と凍結乾燥
上記のけん化前駆体溶液をアセトニトリルで希釈し、有機層含量を約30％（v：v）とした。この溶液を、0.45 μm膜で濾過した後、RP-HPLCで精製した。ここで、逆相カラムはLuna C18、250×25 mm、5 μm、100 Åを使用し、移動相Ａは0.1％TFA／H₂O、移動相Ｂは0.1％TFA／ACNとした。所望産物を、35％〜65％のグラジエント相Ｂ、流速20mL／分で60分以内に溶出し、集めて凍結乾燥し、4 mgの産物（純度94.5％）を得た。得られた生成物の構造式は下記の通りである。

（６）N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))- Lys-OHの構造の確認
ESI-MSにより検出したN^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OHの分子量は6350.68であり、理論的に予測された分子量6350.28と一致する。

N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OHをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ4865及び1502であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F2は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-Des(B30) ヒト・インスリン（HS060）の製造
本試料の製造手順は、実施例１４で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリン（配列６）を、組換えDes (B30) ヒト・インスリン（50 mg、8.76 mmol）（実施例２）で置き換えた以外は、実施例１４に記載したN^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-Des(B30) ヒト・インスリンの分子量は6103.9であり、理論的に予測された分子量6103.5と一致する。

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-Des(B30) ヒト・インスリン をトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ4865及び1256であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F2は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

N^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリン（HS065）の製造
本試料の製造手順は、実施例１４で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリンを、組換えB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) ヒト・インスリン（27.2 mg、4.65 mmol）（実施例６）で置き換えた以外は、実施例１４に記載したN^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンの分子量は6249であり、理論的に予測された分子量6248.23と一致する。

N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ5277.2及び989であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F1は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH（HS606）の製造
本試料の製造手順は、実施例１６で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリンを、組換えB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) ヒト・インスリン（25 mg、4.27 mmol）（実施例６）で置き換えた以外は、実施例１６に記載したN^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OHの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO- (N^εB3-B29E-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OHの分子量は6248であり、理論的に予測された分子量6247.4と一致する。

N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30Eヒト・インスリン))- Lys-OHをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ5376.3及び989であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F1は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

N^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリン（HS607）の製造
本試料の製造手順は、実施例１５で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリンを、組換えB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) ヒト・インスリン（27.2 mg、4.65 mmol）（実施例６）で置き換えた以外は、実施例１５に記載したN^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンの分子量は6236であり、理論的に予測された分子量6234.3と一致する。

N^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30Eヒト・インスリンをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ5263.2及び989であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F1は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

N^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン（HS608）の製造
本試料の製造手順は、実施例１４で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリンを、組換えB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gヒト・インスリン（24.3 mg、4.19 mmol）（実施例１２）で置き換えた以外は、実施例１４に記載したN^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリンの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu) -B29E-B30E, A21Gヒト・インスリンの分子量は6192.5であり、理論的に予測された分子量6190.5と一致する。

N^εB3-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリンをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ5219.5及び989であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F1は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO- (N^εB3-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン))-Lys-OH（HS609）の製造
本試料の製造手順は、実施例１６で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリンを、組換えB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gヒト・インスリン（24.1 mg、4.16 mmol）（実施例１２）で置き換えた以外は、実施例１６に記載したN^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン))-Lys-OHの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン))-Lys-OHの分子量は6289であり、理論的に予測された分子量6289.6と一致する。

N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(N^εB3-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン))-Lys-OHをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ5318.5及び989であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F1は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

N^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu) -B29E-B30E, A21Gヒト・インスリン（HS610）の製造
本試料の製造手順は、実施例１５で使用したB(1-27)-D-K-E, A(1-21) ヒト・インスリンを、組換えB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gヒト・インスリン（24.8 mg、4.28 mmol）（実施例１２）で置き換えた以外は、実施例１５に記載したN^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリンの製造手順と同一であった。

ESI-MSにより検出したN^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu) -B29E-B30E, A21Gヒト・インスリンの分子量は6177であり、理論的に予測された分子量6176.5と一致する。

N^εB3-(N^α-(HOC(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B29E-B30E, A21Gヒト・インスリンをトリプシンで消化した。消化産物はLC-MSで分析した。分析結果より、２つの断片F1及びF2の分子量は、それぞれ5205.4及び989であることが示され、消化産物の理論的な分子量と一致した。断片F1は、修飾Ｂ鎖断片に相当する。修飾位置は、予測されたものと同一であることが証明された。得られた生成物の構造は下記の通りである。

ペグ化（20 KD）インスリンの製造
（１）B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンのペグ化（20 KD）
50 mgのB(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンを25 mLの水に溶解し、pH値を1.0 M Na₂CO₃により11.40に調節した後、500 mgのm-PEG-OSu溶液を徐々に加えた（m-PEG-OSuは、10 mLのアセトニトリルと6 mLのTHFとの混合溶媒に溶解した。）。反応溶液を室温で2時間撹拌した後、反応系のpHを0.1 M HClで6.0に調節して反応を止め、有機溶媒を減圧下で除去した。反応を停止させ、精製をGE SP−セファロース陽イオン交換ゲルを用いて行った。最終反応生成物は10倍の溶液Ａ（溶液Ａ：20 mM Gly pH 3.0；溶液Ｂ：20 mM Gly pH 3.0、1 M NaCl）で希釈し、カラムに添加した。カラムは5倍量の溶液Ａで平衡化し、0〜100％Ｂ（20倍カラム量）の直線勾配で溶出した。溶出ピークを集めて脱塩し、10 KD捕捉限外濾過チューブで濃縮して、所望の産物PEG (20 KD)-156を得た。

（２）B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンのペグ（20 KD）修飾位置の同定
ペグ化の前後でB(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンをGLu-Cで消化し、LC-MS分析にかけた。消化産物は以下の通りである。

酵素的に消化した産物はHPLC分析により比較した。その結果、酵素消化断片F-I、F-II及びF-IIIは、酵素消化の前後で変化しなかったが、酵素消化したペグ化B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンから得られたF-IV断片の疎水性は著しく増大した。このデータより、ペグ化位置はB29Kであり、構造は下記の通りである。

（３）ペグ化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) インスリンは上記ステップ（１）に記載の通りに製造し、目的産物であるPEG (20 KD)−107を得た。得られた産物は、ステップ（２）に示した方法により同定し、得られた産物の還元にはDTT（10 mM）を使用した。Ａ鎖には変化は検出されなかった。Ｂ鎖の疎水性は著しく増大した。このデータより、修飾位置はB3Kにあることが示された。得られた修飾産物の分子構造は下記の通りである。

ペグ化（30 KD）インスリンの製造
（１）B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンのペグ化（30 KD）
50 mgのB(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンを25 mLの水に溶解し、pH値を1.0 M Na₂CO₃により11.40に調節した後、750 mgのm-PEG-OSu（30 K）溶液（m-PEG-OSuは、10 mLのアセトニトリルと6 mLのTHFとの混合溶媒に溶解した。）を徐々に加えた。反応溶液を室温で2時間撹拌した後、反応系のpHを0.1 M HClで6.0に調節して反応を止め、有機溶媒を減圧下で除去した。反応を停止させ、精製をGE SP−セファロース陽イオン交換ゲルを用いて行った。最終反応生成物は10倍の溶液Ａ（溶液Ａ：20 mM Gly pH 3.0；溶液Ｂ：20 mM Gly pH 3.0、1 M NaCl）で希釈し、カラムに添加した。カラムは5倍量の溶液Ａで平衡化し、0〜100％Ｂ（20倍カラム量）の直線勾配で溶出した。溶出ピークを集めて脱塩し、10 KD捕捉限外濾過チューブで濃縮して、所望の産物PEG (30 KD)-156を得た。

（２）B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンのペグ（30 KD）修飾位置の同定
ペグ化の前後でB(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンをGLu-Cで消化した。消化産物は以下の通りである。

酵素的に消化した産物はHPLCにより分析した。その結果、酵素消化断片F-I、F-II及びF-IIIには、ペグ化の前後で変化は示されなかった。しかしながら、消化産物断片F-IVの疎水性は著しく増大した。このデータより、ペグ化位置はB29Kであることが示され、構造は下記の通りである。

（３）ペグ化（30 KD）B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) インスリンは上記ステップ（１）に記載の通りに製造し、目的産物であるPEG (30 KD)-107を得た。得られた産物は、ステップ（２）に示した方法により同定し、得られた産物の還元にはDTT（10 mM）を使用した。Ａ鎖には変化は検出されなかった。Ｂ鎖の疎水性は著しく増大した。これより、修飾位置はB3Kにある。得られた修飾産物の分子構造は下記の通りである。

ペグ化（分枝型40 KD）インスリンの製造
（１）B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンのペグ化（40 KD）
50 mgのB(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンを25 mLの水に溶解し、pH値を1.0 M Na₂CO₃により11.40に調節した後、1000 mgのm-PEG-OSu（40 K）溶液（m-PEG-OSuは、10 mLのアセトニトリルと6 mLのTHFとの混合溶媒に溶解した。）を徐々に加えた。反応溶液を室温で2時間撹拌した後、反応系のpHを0.1 M HClで6.0に調節して反応を止め、有機溶媒を減圧下で除去した。反応を停止させ、精製をGE SP−セファロース陽イオン交換ゲルを用いて行った。最終反応生成物は10倍の溶液Ａ（溶液Ａ：20 mM Gly pH 3.0；溶液Ｂ：20 mM Gly pH 3.0、1 M NaCl）で希釈し、カラムに添加した。カラムは5倍量の溶液Ａで平衡化し、0〜100％Ｂ（20倍カラム量）の直線勾配で溶出した。溶出ピークを集めて脱塩し、10 KD捕捉限外濾過チューブで濃縮して、所望の産物PEG (40 KD)-156を得た。

（２）B(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンのペグ（40 KD）修飾位置の同定
ペグ化の前後でB(1-27)-D-K-E, A(1-21) インスリンをGLu-Cで消化した。消化産物は以下の通りである。

酵素的に消化した産物はHPLCにより分析した。その結果、酵素消化断片F-I、F-II及びF-IIIには、ペグ化の前後で変化は示されなかった。しかしながら、消化産物断片F-IVの疎水性は著しく増大した。このデータより、ペグ化位置はB29Kであることが示され、構造は下記の通りである。

（３）ペグ化（40 KD）B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21) インスリンは上記ステップ（１）に記載の通りに製造し、目的産物であるPEG (40 KD)-107を得た。得られた産物は、ステップ（２）に示した方法により同定し、得られた産物の還元にはDTT（10 mM）を使用した。Ａ鎖には変化は検出されなかった。Ｂ鎖の疎水性は著しく増大した。これより、修飾位置はB3Kにあることが確認された。得られた修飾産物の分子構造は下記の通りである。

試験例１

インスリン受容体（IR）又はインスリン様成長因子−１受容体（IGF1-R）に対するヒト・インスリン類似体の結合試験
本発明に係るヒト・インスリン類似体のインスリン受容体又はインスリン様成長因子−１受容体に対する相対的結合強度は、競合的受容体結合試験により測定した。

インスリン受容体及びインスリン様成長因子−１受容体を発現する細胞膜を、IM-9細胞及びH19-7細胞（ATCC）から採取した。5×10⁸細胞を収集し、PBSで洗浄し、溶解緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH7.8、150 mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤（ロシュ社））に6×10⁷細胞／mLで再懸濁した。試料は氷上に置いた。試料を電動ホモジナイザーにより25000 rpm、10秒間で2回ホモジナイズした後、低速（2000 g、15分間）で遠心分離し、上清を集めた。沈殿画分は、適量の溶解緩衝液に再懸濁した。上記のステップは3回繰り返し、各回の上清をプールした。プールした上清は、高速（4℃、35000 rpm、60 min）で遠心分離した後、得られた上清を捨てた。沈殿画分は適量の細胞溶解緩衝液に再懸濁し、試験用膜タンパク質を得た。IM-9細胞から採取された膜タンパク質はインスリン受容体であり、IM-9細胞膜タンパク質と称する。H19-7細胞から採取された膜タンパク質はインスリン様成長因子−１受容体であり、IM-9細胞膜タンパク質と称する。タンパク質濃度はブラッドフォード法により定量した。

インスリン受容体結合試験では、96ウェルプレートの各ウェルに、40 μLの125 pM [¹²⁵I]同位体インスリン（パーキンエルマー社、Cat. No. 420010UC）、3 μgのIM-9細胞膜タンパク質（50 μL）及び段階希釈した試験対象のヒト・インスリン類似体10 μLを添加した。上記溶液のすべては、反応溶液（50 mM Tris-HCl、pH 7.8、150 mM NaCl、0.1％BSA）を用いて調製した。上記混合物は、室温で1時間穏やかに撹拌した。インキュベートした膜タンパク質は、フィルターメイトハーベスター（パーキンエルマー社、Cat. No. S/N：DA12073369）により、予め0.3％PEIにより湿潤させたマイクロベータフィルターマットＢ（パーキンエルマー社、Cat. No. 1450-521）膜上に捕集した。フィルター膜は反応溶液で3回洗浄し、オーブン中で60℃、1時間乾燥させた。乾燥させたフィルター膜は封入膜に入れ、15 mLのシンチレーション液を加えて密封した。最後に、マイクロベータプレートカウンター（パーキンエルマー社、Cat. No.1450）で結果を読み取った。

インスリン様成長因子−１受容体結合試験では、96ウェルプレートの各ウェルに、40 μLの125 pM [¹²⁵I]同位体IGF-1、9 μgのH19-7細胞膜タンパク質（50 μL）及び段階希釈した試験対象のヒト・インスリン類似体10 μLを添加した。残りのステップは、インスリン受容体結合試験におけるものと同一とした。

上記試験で得られたデータは、グラフパッド・プリズムを用いて非線形フィッティングさせた。IC₅₀ 値（nM）は、インスリン受容体又はインスリン様成長因子−１受容体に対するヒト・インスリン類似体の結合競合試験で得た。結果を下表に示した。

（注記）hI、ヒト・インスリン；Des (B30)-hI、B30欠失ヒト・インスリン。いずれも陽性対照として使用。

データより、本発明のインスリン類似体は、陽性対照の結合親和性に匹敵し、B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-GとIRとの結合親和性は陽性対照（hI）のそれと比較して1.9倍強く、IGF1-Rへの親和性はhIのそれと比較して1／10に減少することが示された。

試験例２

ヒト・インスリン類似体のインビボ活性評価
（１）本試験で使用したICR雄性マウス（18〜20 g）は、SINO-BRITSH SIPPR/BK実験動物有限公司から購入した。マウスは、温度20〜25℃、湿度40〜60％の実験室環境で3日間飼育した。

（２）本試験で使用した薬物ヒューマリンＲ（リリー・エジプト社、HRE046、100 IU/mL）は、0.05 N HCl（0.05 mg/kg）で1 IU/mLに処方した後、0.9％NaClで希釈し、0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 IU/mLの濃度の溶液とした。

（３）40匹の雄性マウスは、本試験前に16時間絶食させた。最初にこれらのマウスの体重を測定し、基礎血糖値を測定した（尾を切り取り、血糖値をロシュ社グルコメーター及びこれ以降同様に対応する試験紙で測定した。）。血糖値に基づいてマウスを無作為に8群（マウス5匹／群）に分けた。各群への投与量は次の通りとした：すなわち、0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 IU/kgとし、投与体積は体重20 gあたり100 μLとした。

（４）各マウスの血糖値は、投与後1時間で測定した。

（５）データ分析：測定した血糖値は、投与前血糖値の百分率として示した。薬物反応（血糖降下）曲線は、グラフパッド・プリズム５によりプロットし、ED₅₀値（IU/kg又はmg/kg）を得た。ED₅₀値は、皮下注において、最大血糖降下作用の50％に達する薬物投与量を意味する。

インスリン類似体のED₅₀値は下表に示した。

（注記）相対活性は、ヒト・インスリン類似体のED₅₀値対Des (B30)-hIのED₅₀値の比を示す。Des (B30)-hIは各試験の対照として使用した。Des (B30)-hIのED₅₀値は1に設定した。

上記結果より、本発明のヒト・インスリン類似体のインビボ活性は、陽性対照の活性と同等であることが示された。B(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-20)-Gなどのヒト・インスリン類似体のインビボ活性は、hI （ヒト・インスリン）又はDes (B30)-hI（B30欠失ヒト・インスリン）と比較して50％以上増加し、陽性対照より顕著に優れていた。

試験例３

インスリン誘導体のインビボ長時間作用型活性評価
本試験で使用した雄性SDラット（18〜20 g）はSINO-BRITSH SIPPR/BK実験動物有限公司から購入した（ライセンス番号：SCXK (Shanghai) 2008-0016）。ラットはSPF環境で飼育した。雄性SDマウスは、温度20〜25℃、湿度40〜60％の実験室環境で3日間飼育した。ラットは、試験前に8時間絶食させた。100 mg/kg STZを腹腔内投与し、糖尿病のラットモデルを確立した。２日後、絶食時血糖値を測定した。血糖値が11.1 mmol/Lより大きいラットを糖尿病罹患ラットとみなした。試験開始時、ラットの体重を測定し、また血糖値を測定した（尾を切り取り、血糖値をロシュ社グルコメーター及びこれ以降同様に対応する試験紙で測定した。）。血糖値に基づいてラットを無作為に群分け（ラット43匹／群）した。使用する薬物を必要な濃度で調製した。薬物を皮下投与した後、血糖値を複数の時点で測定した。IP（延長指数）を血糖値に従って算出した。

陽性対照：
（１）ヒューマリンＲ（Humulin R）：リリー社から購入した組換えヒト・インスリン注射液
（２）デテミル（Detemir）：ノボ・ノルディスク社から購入したデテミルインスリン注射液
（３）HS060はデグルデク（Degludec）であり、ノボ・ノルディスク社により第３相臨床試験にある分子N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-Des(B30) である（実施例１７参照）。

被験化合物は、以下に示すアシル化ヒト・インスリン類似体であるインスリン誘導体である。
（１）HS061、B28D -N^εB29- (N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E（実施例１４参照）
（２）HS062、B28D-N^εB29- (N^α-(HO(CH₂)₁₅CO)-γ-Glu)-B30E（実施例１５参照）
（３）HS067, N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-N^ε-(OCCH₂CH₂CO-(B28D-N^εB29-B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH（実施例１６参照）

表２５に示された結果より、HS061（IP：117.9）、HS062（IP：112.3）及びHS067（IP：132.9）の長時間作用活性は、すべてデテミル（(IP：100）又はHS060（IP：105.9）（いずれも対照）より優れていることが示された。特にHS067は、本モデルにおいて、12時間まで基礎血糖値を維持した（結果は表２７に示す。）。

試験例４

インスリン受容体（IR）に対するペグ化インスリンの結合試験
（１）試験方法は試験例４に記載のものと同一であった。
（２）被験化合物：
ペグ化（20 KD）インスリン：PEG (20 KD)-107は、ペグ化インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E，A(1-21) を表し、ペグ（PEG）の分子量は20 KDである；PEG (20 KD)-156は、ペグ化インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) を表し、ペグ（PEG）の分子量は20 KDである。具体的には実施例２４を参照する。
（３）競合結合試験において、インスリン受容体へのペグ化（20 KD）インスリン結合のIC₅₀値（nM）は、表２６に示した。本発明による好ましい配列は、ペグ化後であってもインスリン受容体（IR）に結合することが示された。

試験例５

ペグ化インスリンのインビボ長時間作用型活性評価
（１）試験方法は試験例３に記載のものと同一であった。

（２）被験化合物：
１）ペグ化（20 KD）インスリン：PEG (20 KD)-107は、ペグ化（20 KD）インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E，A(1-21) を表し、ペグ（PEG）の分子量は20 KDである；PEG (20 KD)-156は、ペグ化（20 KD）インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21)を表す。具体的には実施例２４を参照する。
２）ペグ化（30 KD）インスリン：PEG (30 KD)-107は、ペグ化（30 KD）インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E, A(1-21)；PEG (30 KD)-156は、ペグ化（30 KD）インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) を表す。具体的には実施例２５を参照する。
３）ペグ化（40 KD）インスリン：PEG (40 KD)-107は、ペグ化（分枝型40 KD）インスリンB(1-2)-K-B(4-28)-E-E，A(1-21)；PEG(40KD)-156は、ペグ化（分枝型40 KD）インスリンB(1-27)-D-K-E, A(1-21) を表す。具体的には実施例２６を参照する。

（３）試験結果
１）ペグ化（20 KD）インスリンの長時間作用型活性に対するインビボ評価結果は、次の表２７及び図６に示した。

結論：表２７の結果より、PEG (20 KD)-107及びPEG (20 KD)-156は、32〜46時間まで安定した血糖値を維持することが示された（図６参照）。この２化合物のIP（延長指数）は、それぞれ207.36及び204.26であり（表２７参照）、陽性対照のIPより著しく優れていた。

２）ペグ化（30 KD）インスリン及びペグ化（40 KD）インスリンの長時間作用型活性に対するインビボ評価結果は、次の表２８及び図７に示した。

結論：表２８及び図７の結果より、PEG (30 KD)-107（IP：282.5）は、マウスにおいて血糖値を48時間まで安定に維持する；PEG (40 KD)-107（IP：285.0）は、マウスにおいて血糖値を60時間まで安定に維持する；PEG (30 KD)-156（IP：289.8）は、マウスにおいて血糖値を56時間まで安定に維持する；PEG (40 KD)-156（IP：297.4）は、マウスにおいて血糖値を76時間まで安定に維持することが示され、陽性対照のIPより著しく優れていた。

Claims (20)

1. ヒト・インスリン誘導体が、アシル基をB29のリジン残基にあるε-アミノ基に結合させることにより形成されるアシル化インスリンであることを特徴とし、当該アシル化インスリンが下記式で表されるヒト・インスリン誘導体。
   S-W-X-Y-Z
   ［式中、Sは、下記式で表されるＡ鎖及びＢ鎖を有するヒト・インスリン類似体。］
   ［式中、
   A₀は欠失しており；
   A₂₁はN又はGであり；
   B₃はNであり；
   B₂₇はTであり；
   B₂₈はDであり；
   B₂₉はKであり；
   B₃₀はEであり；
   B₃₁及びB₃₂はともに欠失しており；
   -W-X-Y-Zは、N ^α -(HOOC(CH ₂ ) ₁₄ CO)-N ^ε -(3-アシルプロピオン酸*)-Lysのアシル基である。（アスタリスク（*）は、インスリンへの結合位置を示す。）］
2. 前記Ａ鎖及びＢ鎖の配列が、
   Ａ鎖：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
   Ｂ鎖：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10、
   及び、
   Ａ鎖：GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2
   Ｂ鎖：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10
   からなる群より選ばれる、請求項１に記載のヒト・インスリン誘導体。
3. 発現ベクターの作成、宿主細胞での形質転換されたベクターの発現、発現された前駆体の単離と精製、発現された前駆体から化学的及び／又は酵素的方法により前記ヒト・インスリン類似体の遊離を含む、請求項１又は２に記載のヒト・インスリン誘導体の製造方法。
4. 下記式（I）：
   B-R1-A（I）
   ［式中、
   R1は0〜5アミノ酸残基を有するペプチド断片であり、当該ペプチド断片はアラニン（A）、リジン（K）及びアルギニン（R）からなり；
   A及びBは、前記ヒト・インスリン類似体のそれぞれＡ鎖及びＢ鎖に相当する。］
   で表される、請求項１又は２に記載のヒト・インスリン誘導体の製造に使用される発現前駆体。
5. 前記発現前駆体が、
   SEQ ID NO.19：
   FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN、
   及び、
   SEQ ID NO.77：
   FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
   からなる群より選ばれる、請求項４に記載の発現前駆体。
6. 請求項４又は５に記載の発現前駆体をコードするDNA。
7. 請求項６に記載のDNAを含む発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
9. 前記宿主細胞が細菌である、請求項８に記載の宿主細胞。
10. 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項９に記載の宿主細胞。
11. 前記宿主細胞が酵母である、請求項８に記載の宿主細胞。
12. 前記宿主細胞がピキア・パストリス又はサッカロマイセス・セレビシエである、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. Sが、
    Ａ鎖：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
    Ｂ鎖：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10、
    を有するヒト・インスリン類似体である、請求項１に記載のヒト・インスリン誘導体。
14. N ^α -(HOOC(CH ₂ ) ₁₄ CO)-N ^ε -(OCCH ₂ CH ₂ CO-(B28D-N ^εB29 -B30Eヒト・インスリン))-Lys-OH
    である、請求項１に記載のヒト・インスリン誘導体。
15. 請求項１、２、１３又は１４に記載のヒト・インスリン誘導体を含有する医薬製剤。
16. 溶解型、非晶型及び／又は結晶型にあるヒト・インスリン類似体又は製薬学的に許容されるその塩を含有する、請求項１５に記載の医薬製剤。
17. 長期アジュバントを含有し、当該長期アジュバントは共結晶化の形で薬物と共在する、請求項１５に記載の医薬製剤。
18. 溶解型で存在する請求項１５に記載の医薬製剤を含有する、インスリン活性を有する注射剤。
19. II型糖尿病、高血糖症、肥満又はインスリン抵抗性症候群治療用薬物の製造における、請求項１、２、１３又は１４に記載のヒト・インスリン誘導体の使用。
20. インスリン活性を有する速効性及び／又は長時間作用性医薬製剤の製造における、請求項１、２、１３又は１４に記載のヒト・インスリン誘導体の使用。