PL198190B1 - Analogi insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory analogów insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej, zastosowanie analogów insuliny, kompleksy insuliny z cynkiem i ich zastosowanie - Google Patents

Analogi insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory analogów insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej, zastosowanie analogów insuliny, kompleksy insuliny z cynkiem i ich zastosowanie

Info

Publication number
PL198190B1
PL198190B1 PL345898A PL34589899A PL198190B1 PL 198190 B1 PL198190 B1 PL 198190B1 PL 345898 A PL345898 A PL 345898A PL 34589899 A PL34589899 A PL 34589899A PL 198190 B1 PL198190 B1 PL 198190B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
insulin
gly
ala
leu
glu
Prior art date
Application number
PL345898A
Other languages
English (en)
Other versions
PL345898A1 (en
Inventor
Johann Ertl
Paul Habermann
Karl Geisen
Gerhard Seipke
Axel Wollmer
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland filed Critical Sanofi Aventis Deutschland
Publication of PL345898A1 publication Critical patent/PL345898A1/xx
Publication of PL198190B1 publication Critical patent/PL198190B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

1. Analogi insuliny o ogólnym wzorze I w którym (A1-A5) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 lancucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierz ecej, (A15-A19) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A15 do A19 lancucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierz ecej, (B8-B18) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 lancucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierz ecej, (B20-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B29 lancucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierz ecej, R8 oznacza Thr lub Ala, R9 oznacza Ser lub Gly, R10 oznacza Ile lub Val, R14 oznacza Tyr, His, Asp lub Glu, R21 oznacza Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu lub Gln ......... PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są analogi insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory analogów insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej, zastosowanie analogów insuliny, kompleksy insuliny z cynkiem i ich zastosowanie.
Na całym świecie około 120 milionów ludzi choruje na cukrzycę, w tym około 12 milionów ludzi choruje na cukrzycę typu I i dla nich jedyna obecnie możliwa terapia polega na substytucji wstrzymanego wewnątrzwydzielniczego wydzielania insuliny. Chorzy są skazani przez całe życie na wstrzykiwanie insuliny, zazwyczaj kilka razy dziennie. W przeciwieństwie do cukrzycy typu I, cukrzyca typu II nie jest zasadniczo związana z brakiem insuliny, jednak w wielu przypadkach, przede wszystkim w zaawansowanym stadium choroby, uważ a się , ż e wł a ś ciwą terapią jest leczenie insuliną , ewentualnie w połączeniu z doustnym lekiem przeciwcukrzycowym.
U zdrowych ludzi wydzielanie insuliny przez trzustkę jest ściśle związane ze stężeniem glukozy we krwi. Podwyższony poziom glukozy we krwi, występujący po posiłkach, jest szybko kompensowany przez odpowiednie zwiększenie wydzielania insuliny. Na czczo poziom insuliny w osoczu obniża się do wartości podstawowej, wystarczającej dla zapewnienia ciągłego zaopatrywania w glukozę narządów i tkanek wrażliwych na insulinę, jak również utrzymywania w nocy niskiego poziomu produkcji glukozy w wątrobie. Substytucja endogennego wydzielania insuliny przez egzogenne, najczęściej podskórne podawanie insuliny zazwyczaj nie umożliwia osiągnięcia, nawet w przybliżeniu, wyżej opisanej fizjologicznej jakości regulacji poziomu glukozy we krwi. Często dochodzi do zaburzenia poziomu glukozy we krwi w dół lub górę, które w najcięższych postaciach mogą zagrażać życiu. Poza tym podwyższony poziom glukozy we krwi, utrzymujący się przez lata bez początkowych objawów, stanowi znaczne ryzyko dla zdrowia. Przeprowadzone na wielką skalę w USA badania DCCT (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N, Engl. J. Med. 329, 977 - 986) wskazują jednoznacznie na to, że przewlekły podwyższony poziom glukozy we krwi jest w znacznym stopniu odpowiedzialny za rozwój późnych uszkodzeń cukrzycowych. Późne uszkodzenia cukrzycowe są uszkodzeniami mikro- i makronaczyniowymi, objawiającymi się ewentualnie jako retynopatia, nefropatia lub neuropatia. Uszkodzenia te mogą doprowadzić do utraty wzroku, niewydolności nerek i utraty kończyn. Ponadto z tymi uszkodzeniami jest związane podwyższone ryzyko chorób serca i układu krążenia. Stąd można wywnioskować, że ulepszona terapia cukrzycy musi być ukierunkowana przede wszystkim na utrzymywanie poziomu glukozy we krwi w zakresie możliwie bliskim fizjologicznemu. Zgodnie z koncepcją intensywnej terapii insulinowej, powinno to być osiągnięte przez kilkukrotne w cią gu dnia iniekcje szybko i wolno działają cych preparatów insuliny. Szybko dział ają ce preparaty podaje się w czasie posiłków dla skompensowania poposiłkowego zwiększenia poziomu glukozy we krwi. Wolno działająca insulina podstawowa powinna zapewnić podstawowe zaopatrzenie w insulinę, szczególnie podczas nocy, bez doprowadzania do hipoglikemii.
Dostępne obecnie insuliny podstawowe spełniają te wymagania w niewystarczającym stopniu. W szczególności często stosowane insuliny NPH wykazują za bardzo wyraź ne maksimum działania i mają za krótki czas całkowitego działania. Przy podawaniu wieczornym niesie to z sobą niebezpieczeństwo nocnej hipoglikemii i rannej hiperglikemii.
Z EP 0821006 znane są analogi insuliny o zwiększonej zdolności wiązania cynku, które w połączeniu z cynkiem wykazują opóźniony profil działania, w porównaniu z insuliną ludzką. Analogi te różnią się od insuliny ludzkiej zasadniczo zmianą aminokwasu w pozycji A21 łańcucha A i dodatkową resztą histydyny lub ugrupowaniem peptydu zawierającego 2-35 reszt aminokwasów, w tym 1-5 reszt histydyny, w pozycji B30 łańcucha B.
Istniało zapotrzebowanie na dalsze analogi insuliny (analogi insuliny ludzkiej lub zwierzęcej) wykazujące zwiększoną zdolność wiązania cynku, tworzące trwałe kompleksy zawierające heksamer analogu insuliny i cynk, jak również umożliwiające polepszoną terapię cukrzycy typu I i typu II wskutek opóźnionego profilu działania po wstrzyknięciu podskórnym w postaci odpowiedniego preparatu, w porównaniu do insuliny ludzkiej.
Analogi insuliny stanowią pochodne insulin występujących w naturze, a mianowicie insuliny ludzkiej (SEQ ID NO: 1: łańcuch A insuliny ludzkiej i SEQ ID NO: 2: łańcuch B insuliny ludzkiej) lub insulin zwierzęcych, powstałe w wyniku podstawienia lub usunięcia co najmniej jednej występującej w naturze reszty aminokwasu i/lub dodania co najmniej jednej reszty aminokwasu do łańcucha A i/lub łańcucha B insuliny występującej w naturze.
PL 198 190 B1
Wynalazek dotyczy analogów insuliny o ogólnym wzorze I
w którym (A1-A5) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (A15-A19) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A15 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B8-B18) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B20-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej,
R8 oznacza Thr lub Ala,
R9 oznacza Ser lub Gly,
R10 oznacza Ile lub Val,
R14 oznacza Tyr, His, Asp lub Glu,
R21 oznacza Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu lub Gln,
R1 oznacza Phe, His, Asn, Asp lub Gly,
R2 oznacza Val, Ala lub Gly,
R3 oznacza Asn, His, Glu lub Asp,
R4 oznacza Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly lub Glu,
R30 oznacza Thr lub -OH,
Z oznacza atom wodoru, His, His Ala lub His Ala Ala, przy czym w przypadku gdy Z oznacza atom wodoru, to wówczas R1 lub R3 oznacza His, Glu lub Asp, a R3 oznacza His gdy R1 oznacza obojętną lub ujemnie naładowaną resztę aminokwasu, albo w przypadku gdy Z oznacza atom wodoru, to wówczas R14 oznacza His, Asp lub Glu, a ponadto analog insuliny lub fizjologicznie zgodna sól analogu o wzorze I różni się od insuliny ludzkiej nie tylko zmianą reszt aminokwasów we wzorze I w pozycji R3, albo R3 w połączeniu z R21, albo R3 w połączeniu z R4, oraz ich fizjologicznie zgodnych soli.
Korzystne są analogi insuliny, w których R8 oznacza Thr, R9 oznacza Ser, a R10 oznacza Ile, oraz ich fizjologicznie zgodne sole
Korzystne są analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R30 oznacza Thr, Ala lub Ser, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Korzystne są analogi insuliny, w których R21 oznacza Asn, a R1 oznacza Phe, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Korzystne są analogi insuliny, w których R2 oznacza Val, R3 oznacza Asn, a R4 oznacza Gln, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Korzystne są analogi insuliny, w których R14 oznacza Tyr, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Korzystne są analogi insuliny, w których R14 oznacza His, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Korzystne są analogi insuliny, w których R14 oznacza Asp, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
PL 198 190 B1
Korzystne są analogi insuliny, w których R14 oznacza Glu, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są analogi insuliny, w których R30 oznacza Thr, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są analogi insuliny, w których R30 oznacza Ala, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są analogi insuliny, w których R30 oznacza Ser, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są analogi insuliny, w których R30 oznacza -OH, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są analogi insuliny, w których Z oznacza His, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Korzystne są analogi insuliny, w których Z oznacza His-Ala-, oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Korzystne są analogi insuliny, w których Z oznacza His-Ala-Ala-, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Szczególnie korzystne są analogi insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 3), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Szczególnie korzystne są analogi insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 4), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Szczególnie korzystne są analogi insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję
His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 5), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
Szczególnie korzystne są analogi insuliny, w których łańcuch B ma sekwencję His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 6), oraz ich fizjologicznie zgodne sole. Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania analogów insuliny oraz ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych powyżej, polegającego na tym, że konstruuje się zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję aminokwasów o ogólnym wzorze II
Met-X2-Arg-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21 II w którym
X1 oznacza Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly
Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys,
X2 oznacza Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala,
R30 oznacza Thr lub -OH
Z jest nieobecny, albo oznacza His, His-Ala lub His-Ala-Ala, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, przy czym zachowane są również warunki podane w definicji analogów o wzorze I, prowadzi się ekspresję w komórkach gospodarza oraz uwalnia się analog insuliny z tego prekursora metodami chemicznymi i/lub enzymatycznymi.
Korzystnie jako komórki gospodarza stosuje się bakterie, a zwłaszcza E. coli.
Korzystnie jako komórki gospodarza stosuje się drożdże, a zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae.
W przypadku wytwarzania analogu insuliny, w którym ł a ń cuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 4, prekursor analogu insuliny ma sekwencję
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys
Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
Gly Gly Pro Gly Ala
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 7).
W przypadku wytwarzania analogu insuliny, w którym ł a ń cuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 5, prekursor analogu insuliny ma sekwencję
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val
Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
PL 198 190 B1
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu
Gly Gly Gly Pro Gly Ala
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 8).
W przypadku wytwarzania analogu insuliny, w którym ł a ń cuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 6, prekursor analogu insuliny ma sekwencję
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val
Glu Ala Leu Tyr Leu
Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
Gly Gly Pro Gly Ala
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 9).
Wynalazek dotyczy ponadto prekursorów analogów insuliny zdefiniowanych powyżej.
W szczególności wynalazek dotyczy prekursora analogu insuliny mającego sekwencję SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9.
Wynalazek dotyczy ponadto sekwencji DNA kodujących prekursory analogów insuliny mających sekwencje zdefiniowane powyżej.
W szczególności wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodującej prekursor insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9.
Wynalazek dotyczy również wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje DNA zdefiniowane powyżej.
W szczególności wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9.
Wynalazek dotyczy ponadto komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję zdefiniowaną powyżej, szczególnie SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9.
Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera co najmniej jeden analog insuliny i/lub co najmniej jedną jego fizjologicznie zgodną sól zdefiniowane powyżej, korzystnie w postaci rozpuszczonej, amorficznej i/lub krystalicznej, oraz ewentualnie dodatkowo zawiera substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie, zwłaszcza siarczan protaminy, przy czym analog insuliny i/lub jego fizjologicznie zgodna sól razem z siarczanem protaminy występuje w postaci substancji współwykrystalizowanej.
Środek farmaceutyczny ewentualnie zawiera dodatkowo niemodyfikowaną insulinę ludzką i/lub analog insuliny, a zwłaszcza Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-insulinę ludzką.
Wynalazek dotyczy także roztworu o aktywności insulinowej do wstrzykiwań, charakteryzującego się tym, że zawiera środek farmaceutyczny w postaci rozpuszczonej, zdefiniowany powyżej.
Korzystnie roztwór do iniekcji zawiera od 1 μg do 2 mg cynku na ml, a zwłaszcza 5 - 200 μg cynku na ml.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania analogów insuliny i/lub ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych powyżej do wytwarzania środka farmaceutycznego wykazującego aktywność insulinową z opóźnionym wystąpieniem działania.
Ponadto wynalazek dotyczy kompleksów insuliny z cynkiem, zawierających heksamer insuliny i 4 - 10 jonów cynku na heksamer insuliny, przy czym heksamer insuliny składa się z sześciu cząsteczek analogu insuliny o ogólnym wzorze I
PL 198 190 B1
w którym (A1-A5) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (A15-A19) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A15 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B8-B18) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B20-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej,
R8 oznacza Thr lub Ala,
R9 oznacza Ser lub Gly,
R10 oznacza Ile lub Val,
R14 oznacza Tyr, His, Asp lub Glu,
R21 oznacza Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu lub Gln,
R1 oznacza Phe, His, Asn, Asp lub Gly,
R2 oznacza Val, Ala lub Gly,
R3 oznacza Asn, His, Glu lub Asp,
R4 oznacza Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly lub Glu,
R30 oznacza Thr -OH,
Z oznacza atom wodoru lub His, His Ala albo His Ala Ala.
Korzystny jest kompleks insuliny z cynkiem, zawierający 5-8 jonów cynku na heksamer insuliny.
Korzystnie kompleks insuliny z cynkiem zawiera heksamer insuliny składający się z sześciu cząsteczek wyżej opisanego analogu insuliny o wzorze I.
Korzystny jest kompleks insuliny z cynkiem, w którym łańcuch B analogu insuliny o wzorze I ma sekwencję Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 10).
Korzystny jest kompleks insuliny z cynkiem, w którym łańcuch B analogu insuliny o wzorze I ma sekwencję Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 11).
Wynalazek dotyczy również środka farmaceutycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera co najmniej jeden kompleks insuliny z cynkiem, zdefiniowany powyżej.
Korzystnie środek farmaceutyczny zawiera kwaśny roztwór co najmniej jednego analogu insuliny zdefiniowanego powyżej i/lub jego fizjologicznie zgodnej soli, z odpowiednią ilością jonów cynku, umożliwiającą utworzenie kompleksu insuliny z cynkiem, zdefiniowanego powyżej, a zwłaszcza komPL 198 190 B1 pleksu insuliny z cynkiem, w którym łańcuch B analogu insuliny o wzorze I ma sekwencję SEQ ID NO: 10 lub SEQ ID NO: 11.
Korzystnie środek farmaceutyczny zawiera kompleks insuliny z cynkiem w postaci rozpuszczonej, amorficznej i/lub krystalicznej.
Wynalazek dotyczy również roztworu o aktywności insulinowej do wstrzykiwań, charakteryzującego się tym, że zawiera środek farmaceutyczny zdefiniowany powyżej w postaci rozpuszczonej.
Korzystnie roztwór do iniekcji zawiera od 1 μg do 2 mg cynku na ml, a zwłaszcza 5 - 200 μg cynku na ml.
Wynalazek dotyczy także zastosowania kompleksów insuliny z cynkiem zdefiniowanych powyżej do wytwarzania środka farmaceutycznego, wykazującego aktywność insulinową z opóźnionym wystąpieniem działania.
W realizacji wynalazku szczególnie przydatne są prekursory analogów insuliny mające sekwencję SEQ ID NO: 7, np. His(B0)-preproinsuliny, SEQ ID NO: 8, np. His(B-1), Ala(B0)-preproinsuliny lub SEQ ID NO: 9, np. His(B-2), Ala(B-1), Ala(B0)-preproinsuliny.
Korzystnie stosuje się kompleksy insuliny z cynkiem, w których łańcuch B analogu insuliny ma sekwencję SEQ ID NO: 10, np. His (B3)-insulina ludzka lub SEQ ID NO: 11, np. Asp(B3)-insulina ludzka.
Korzystnie wytwarza się środek farmaceutyczny zawierający analog insuliny o wzorze I, którego łańcuch B ma sekwencję SEQ ID NO: 3, 4, 5, 10 lub 11.
Przy ekspresji w E. coli powstają określone białka fuzyjne (SEQ ID NO: 7 do 9), zazwyczaj nierozpuszczalne ciała inkluzyjne, które można wyodrębnić po rozłożeniu komórek przez odwirowanie i ponownie rozpuścić z użyciem dodatku chaotropowego (np. 8 M mocznik lub 6 M chlorek guanidyny). Rozpuszczone białko fuzyjne można poddać siarczynolizie, podczas której grupę -SH przeprowadza się w ugrupowanie S-sulfonianu (np. R.C. Marshall i A.S. Iglis w podręczniku „Practical Protein Chemistry - A Handbook, wydawnictwo A. Darbre (1986), str. 49 - 53). Dzięki temu polepsza się rozpuszczalność białka fuzyjnego i ułatwia oczyszczanie, np. metodą chromatografii anionowymiennej lub chromatografii żelowo-permeacyjnej.
Derywatyzowane białko fuzyjne przeprowadza się w prepro-insulinę o natywnej strukturze przestrzennej i prawidłowo ukształtowanych mostkach disulfidowych (struktura sfałdowana) w rozcieńczonym roztworze wodnym, poprzez dodanie ograniczonej ilości SH-reagentu, takiego jak merkaptoetanol, cysteina lub glutation, a następnie utlenianie powietrzem. Alternatywnie rozpuszczone, nie derywatyzowane białko fuzyjne można również bezpośrednio sfałdować w podobnych warunkach (EP-A-0600372; EP-A-0668292).
Preproinsulinę następnie przeprowadza się w biologicznie czynną insulinę, poprzez ograniczone proteolityczne rozszczepienie. Do tego celu można stosować trypsynę, usuwającą presekwencję oznaczoną we wzorze II jako Met-X2-Arg i rozszczepiającą łańcuch peptydowy oznaczony jako X1-Arg, a więc rozdzielającą łańcuchy B i A. Zazwyczaj sekwencja X1 rozpoczyna się od reszty Arg, tak że po rozszczepieniu istnieje pochodna insuliny, wydłużona na C-końcu łańcucha B resztą Arg. Aminokwasy te można usunąć z użyciem karboksypeptydazy B. Rozszczepienie z użyciem trypsyny można również przeprowadzić tak, że przez zwiększenie stężenia trypsyny lub przedłużenie czasu reakcji dodatkowo odszczepia się lizynę(B29). W takim przypadku powstaje pochodna (B30)-insuliny. Powstały w wyniku rozszczepienia analog insuliny można oczyścić standardową metodą chromatograficzną (np. metodą chromatografii jonowymiennej i chromatografii z odwróconymi fazami) i w końcu wyodrębnić przez wytrącenie, krystalizację lub prostą liofilizację.
Analogi insuliny według wynalazku są biologicznie czynne i po podskórnym podaniu psom słabo kwaśnego, klarownego roztworu zawierającego 80 μg Zn++/ml (cynku/ml) wykazały znacznie opóźnione działanie. W przypadku analogu insuliny przedłużonego resztą histydyny na N-końcu łańcucha B, His(B0),des(B30)-insulina ludzka (patrz SEQ ID NO: 3), profil działania w znacznym stopniu zależy np. od ilości dodanych jonów cynku. Preparat nie zawierający cynku nie wykazuje żadnego efektu depot (całkowite działanie 6-8 godzin, przykład 8) i niewiele różni się od farmakologicznej dynamiki ludzkiej insuliny, podczas gdy po dodaniu jonów cynku (80 μg/ml) stwierdza się znaczne opóźnienie działania (całkowite działanie około 16 godzin, przykład 8). Stwierdzony efekt depot jest więc znacznie wyraźniejszy niż w przypadku insuliny NPH. Poza tym zaletą tych analogów jest to, że dynamikę farmakologiczną można kontrolować w szerokim zakresie przez ustalenie zawartości cynku, co nie jest możliwe w przypadku insuliny ludzkiej. Preparaty zawierające substancję czynną, odznaczające się szybkim wystąpieniem działania oraz preparaty odznaczające się umiarkowanie lub znacznie opóźnionym
PL 198 190 B1 działaniem, można wytwarzać jedynie przez zmianę zawartości cynku. Zatem profil działania można indywidualnie dostosowywać do potrzeb pacjentów, albo przez zastosowanie preparatu o odpowiednio ustalonej zawartości cynku, albo przez zmieszanie preparatów o dużej i małej zawartości cynku, dokonywane przez lekarza lub samego pacjenta.
Opisane tu analogi insuliny ponadto odznaczają się zwiększonym powinowactwem do jonów cynku, w porównaniu do insuliny ludzkiej.
W wodnych, oboję tnych roztworach insulina ludzka tworzy heksamery, kompleksujące dwa jony cynku przez łańcuch boczny His(B10). Tych jonów cynku nie można usunąć metodą dializy w wodnym buforze o odczynie obojętnym. W tych samych warunkach opisane tutaj analogi wiążą powyżej 4 jonów cynku. Ustalono, że w przypadku analogu His(B0)-Des(B30)-insuliny i His(B3)-insuliny według wynalazku wiążą one około 7 jonów cynku na heksamer, a w przypadku Asp(B3)-insuliny wiąże ona
4,2 jonów cynku na heksamer (przykład 9).
Wiadomo, że w obojętnych roztworach cynk powoduje utworzenie wielkocząsteczkowych asocjatów i wytrącenie insuliny. Po iniekcji słabo kwaśnego klarownego roztworu zawierającego rozpuszczoną insulinę i cynk, w podskórnej tkance dochodzi w wyniku zobojętnienia do utworzenia kompleksu insuliny z cynkiem, a następnie do wytrącenia insuliny. Z tego depotu insulina ponownie przechodzi do roztworu i z opóźnieniem przedostaje się do krwioobiegu i do miejsca działania. Takie opóźnienie działania jest niewielkie w przypadku insuliny ludzkiej, ale bardzo wyraźnie występuje w przypadku opisanych tu analogów insuliny wskutek ich zwiększonego powinowactwa do cynku. Większa skłonność do wiązania cynku jest zatem podstawą powyżej opisanego, zależnego od cynku przedłużenia czasu działania.
Wynalazek dotyczy więc nie tylko opisanych tu analogów insuliny, lecz także kompleksów insuliny z cynkiem. Kompleksy te odróżniają się od odpowiednich kompleksów insuliny ludzkiej z cynkiem tym, że mają większą zawartość trwale związanego cynku. Jest zatem zrozumiałe, że do wytwarzania odpowiednich kompleksów, oprócz jonów cynku można również stosować jony innych metali przejściowych, takich jak np. kobalt lub miedź.
P r z y k ł a d 1. Konstruowanie plazmidu plNT345d kodującego wariant His(B3)-preproinsuliny
W opisie patentowym US 5358857 opisano plazmid pINT90d. DNA tego plazmidu służy jako materiał wyjściowy dla konstrukcji plazmidu pINT345d, który w porównaniu z pINT90d ma dwie nowe właściwości. Koduje on analog preproinsuliny, który w pozycji 3 łańcucha B zamiast aminokwasu asparaginy zawiera aminokwas histydynę, oraz posiada sekwencję rozpoznawalną dla enzymu restrykcyjnego BssH2, bezpośrednio przed początkiem sekwencji kodującej wariant preproinsuliny, tak że kodującą sekwencją dla N-końcowych 10 aminokwasów analogu preproinsuliny można łatwo operować, jeśli w sekwencji preproinsuliny uwzględni się miejsce rozszczepienia Dra3.
Dla skonstruowania plazmidu pINT345d rozszczepia się DNA plazmidu pINT90d w trawieniu podwójnym, w pozycji 284bp przez enzym restrykcyjny Ncol i w pozycji 351 bp przez enzym restrykcyjny Dra3, wskutek czego powstają dwa fragmenty. Po rozdzieleniu rozszczepionej mieszaniny metodą elektroforezy w żelu, wyodrębnia się duży fragment DNA pozostałego plazmidu.
Ten fragment DNA przekształca się z użyciem syntetycznego fragmentu DNA w postaci ½ Ncol BssH2 B1 B2 His B4 B5 B6
5' - C ATG GCA ACA ACA TCA ACA GGA AAT TCG GCG CGC TTT GTG CAC CAG CAC CTG
3'- CGT TGT TGT AGT TGT CCT TTA AGC CGC GCG AAA CAC GTG GTC GTG GAC
B7 B8 B9 ½ Dra3
TGC GGC TCC CAC CTA - 3'
ACG CCG AGG GTG - 5' w reakcji z T4-DNA-ligazą. Kompetentne komórki E. coli K12 transformuje się mieszaniną uzyskaną przez ligację i transformowany materiał nanosi się na płytki NA zawierające 20 mg/l ampicyliny. Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C. Z powstałych kolonii izoluje się DNA plazmidu, rozszczepiony enzymem restrykcyjnym BssH2. Pożądany DNA plazmidu ulega przy tym linearyzacji i róż ni się od DNA plNT90d, nie zawierają cego miejsca cię cia BssH2 i odpowiednio do tego nie ulegającego rozszczepieniu.
Plazmidowy DNA klonu o prawidłowych właściwościach oznaczono jako pINT345d.
Jest to materiał wyjściowy do konstruowania opisanych poniżej wariantów preproinsuliny.
PL 198 190 B1
P r z y k ł a d 2. Konstruowanie plazmidu pINT342d kodującego wariant His(B0)-preproinsuliny
DNA plazmidu pINT345d poddaje się podwójnemu trawieniu enzymami BssH2 i Dra3 i duży fragment pozostałego plazmidu izoluje się po rozdzieleniu metodą elektroforezy w żelu. Ten fragment DNA przekształca się z użyciem syntetycznego fragmentu DNA w postaci
His B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10
5'- CG CGC CAC TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA - 3'
3'- G GTG AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG - 5' ½ BssH2 Hpa1 ½ Dra3 w reakcji z T4-DNA-ligazą. Powstaje plazmid pINT342d, mający dodatkowe miejsce cięcia Hpa1, w porównaniu z wyjściowym plazmidem. Plazmid koduje wariant preproinsuliny, mającej w pozycji B0 histydynę.
P r z y k ł a d 3. Konstruowanie plazmidu pINT343d kodującego wariant His(B-1), Ala(B0)preproinsuliny
DNA opisanego w przykładzie b fragmentu pozostałego plazmidu przekształca się z użyciem syntetycznego fragmentu DNA w postaci
His Ala B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11
5'- CG CGC CAC GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA - 3'
3'- G GTG CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG - 5' ½ BssH2 Hpa1 ½ Dra3 w reakcji z T4-DNA-ligazą. Powstaje plazmid pINT343d, który tak jak pINT342d, zawiera dodatkowe miejsce cięcia Hpa1, w porównaniu do wektora wyjściowego.
P r z y k ł a d 4. Konstruowanie plazmidu pINT344d kodującego wariant His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-preproinsuliny
DNA opisanego w przykładzie b fragmentu pozostałego plazmidu przekształca się z użyciem syntetycznego fragmentu DNA w postaci
His Ala Ala B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11
5'- CG CGC CAC GCT GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA - 3'
3'- G GTG CGA CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG - 5' ½ BssH2 Hpa1 ½ Dra3 w reakcji z T4-DNA-ligazą. Powstaje plazmid pINT344d, mający dodatkowe miejsce cięcia Hpa1, w porównaniu do wektora wyjściowego.
P r z y k ł a d 5. Ekspresja skonstruowanego wariantu insuliny
Plazmidy pINT 342d, 343d i 344d transformuje się na przykład w E. coli K12 W3110. Zrekombinowane bakterie, zawierające plazmidy dla danych wariantów, następnie poddaje się fermentacji, zgodnie z przykładem 4 opisu patentowego US 5227293, w wyniku czego wytwarza się pożądany surowiec, służący do wytwarzania danego wariantu insuliny.
P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie His(B0),Des(B30)-insuliny
Zgodnie z przykładem 5, wariant preproinsuliny eksprymowano w E. coli i w postaci ciał inkluzyjnych wyodrębniono przez odwirowanie, po rozłożeniu komórek. Ciała inkluzyjne rozpuszczono w moczniku (8 moli/l), poddano siarczynolizie i oczyszczono z użyciem anionitu (Q-Sepharose) oraz metodą chromatografii żelowo-permeacyjnej (Sephacryl S 200). Bufor stosowany w chromatografii zawierał 4 M mocznik i 50 mM Tris/HCl (tris(hydroksymetylo)aminometan/HCl), pH 8,5. Frakcjonowane wymywanie na anionicie przeprowadzono z zastosowaniem gradientu od 0 do 0,5 M NaCl. Następnie stężenie mocznika zmniejszono do < 1 M przez ultrafiltrację i rozcieńczenie oraz S-sulfonian preproinsuliny wyodrębniono przez wytrącenie przy pH 4 i końcowe wysuszenie.
Dla ukształtowania prawidłowych mostków disulfidowych, jakie istnieją w naturalnej proinsulinie, S-sulfonian preproinsuliny rozpuszczono w stężeniu 0,3 g/l w buforze o pH 10,8 zawierającym 20 mM glicyny, dodano merkaptoetanolu (około 25-50 moli/mol preproinsuliny) i całość mieszano przez noc w 4°C. Odczyn mieszaniny doprowadzono do pH 3,5 z użyciem kwasu fosforowego, po czym mieszaninę odwirowano. Dla przeprowadzenia zawartej w osadzie preproinsuliny w insulinę, po dodaniu Tris (25 mM) nastawiono wartość pH 8,2 i dodano trypsyny (1,5 mg/g preproinsuliny). Przebieg proteolitycznego rozszczepienia kontrolowano metodą HPLC z odwróconymi fazami. Po około 6 godzinach mieszanina zawierała wysoki udział His (B0),Des(B30)-insuliny. Reakcję zakończono przez zakwa10
PL 198 190 B1 szenie do pH 3,5. Oczyszczanie analogu insuliny przeprowadzono metodą chromatografii jonowymiennej (S-Hyper-D, Sepracor) i chromatografii z odwróconymi fazami (PLRP-S RP300, Polymer Laboratories). Chromatografię jonowymienną przeprowadzono w buforze zawierającym 30% 2-propanol i 50 mM kwas mlekowy (pH 3,5). Wymywanie związanej insuliny przeprowadzono z zastosowaniem liniowego gradientu od 0 do 0,5 M NaCl. Chromatografię z odwróconymi fazami przeprowadzono w 0,1% kwasie trifluorooctowym, do którego przy wymywaniu dodawano wzrastające iloś ci acetonitrilu. Produkt wyizolowano przez wytrącenie przy pH 5,4, a następnie liofilizację.
P r z y k ł a d 7. Preparaty analogów insuliny do podawania pozajelitowego
Preparaty zawierały w jednym ml 40 lub 100 IE insuliny (1 IE odpowiada około 6,2 nmola), mg 85% gliceryny, 2,7 mg m-krezolu i ewentualnie cynk++ (jako chlorek cynku) w wodnym, jałowym roztworze o pH 4.
P r z y k ł a d 8. Profil działania His(B0),Des(B30)-insuliny u psa
Wszystkim 6 psom (rasy beagle) podawano podskórnie preparat zawierający 40 U/ml (przykład 7) i podaną ilość cynku. Dawki wynosił y 0,3 lE/kg. W dalszym przebiegu próby po podanym czasie mierzono stężenie glukozy we krwi. Uzyskane wartości uśredniano i podawano w procentach w stosunku do wartości wyjściowej.
Czas (godziny) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
Bez cynku 100 59 50 61 75 84 89 98 103 97 104 100
80 pg Zn++/ml 100 97 83 75 65 56 51 58 68 72 78 82
P r z y k ł a d 9. Wiązanie cynku przez analogi insuliny
Preparat insuliny (0,3 mM insulina, 0,13 M NaCI, 0,1% fenol, 100 pg/ml Zn++ (jako chlorek cynku), 25 mM Tris/HCl, pH 7,4) ekstensywnie dializowano wobec obojętnego buforu nie zawierającego cynku (3 godziny wobec 0,15 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, w temperaturze pokojowej, 72 godziny wobec 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, w temperaturze 15°C oraz ponownie 16 godzin wobec 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, w temperaturze 15°C). Stężenie insuliny oznaczono metodą HPLC z odwróconymi fazami, a cynk oznaczono metodą absorpcyjnej spektroskopii atomowej. Wartość dla cynku skorygowano z uwzględnieniem zawartości cynku w mieszaninie kontrolnej nie zawierającej insuliny.
Wiązanie cynku
Insulina Mole cynku/mol heksameru
Insulina ludzka 2,5
His(B3)-insulina 6,9
Asp(B3)-insulina 4,2
His(B0),Des(B30)-insulina 6,8
PL 198 190 B1
Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający:
(A) Nazwa: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH (B) Ulica: - ' (C) Miasto: Frankfurt (D) Land: (E) Kraj: Niemcy (F) Kod pocztowy (ZIP) : 65926 (G) Telefon: 069-305-5307 (H) Telefax: 069-357175 (I) Teleks: (ii) Tytuł wynalazku: Nowe pochodne insuliny do leczenia cukrzycy (iii) Liczba sekwencji: 11 (iv) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPA) (2) Informacja o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 21 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko .
(B) Położenie: 1..21
PL 198 190 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
1 5 10 1S
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
(2) Informacj a O SEQ ID NO: 2:
(i) Charakterystyka.sekwencji:
(A) Długość; 30 aminokwasów (3) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (3) Położenie: 1..30
(xi) Opis se kwencj i : SEQ ID NO: 2:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly PhePhe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
2) Informacj a O SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1. . 30 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:
Hls Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15
PL 198 190 B1
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly phe Phe Tvr Thr P-u Lys 20 25 ' 3o (2) Informacja o SEQ ID NO: 4:
ii) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
Nazwa/klucz : białko
(B) Położenie: 1. .31
(xi) Opis sekwencj i: SEQ ID NO: 4:
is Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
5 10 15
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
25 30 (2) Informacja o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 32 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz : białko
[B) Położenie: 1. .32
Opis sekwencj i: 5EQ ID NO
His Ala phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala i 5 10 15
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
25 30 (2) Informacja o SEQ ID NO: 6:
PL 198 190 B1 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza.
. (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..33 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:
Erg Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu 1 5 io 15
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lvs 20 25 30 ’
Thr (2) Informacja o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 38 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie:1..98 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gin
5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp
35 40 45
PL 198 190 B1
Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly p-o Gly Ala 50 =s ' Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin lvs Arg Glv 63 70 75 ' '
Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ils Cy3 Se_ Leu ?yr Gln Leu SS 50 *
Cys Asn (2) Informacja o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 99 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy: .
(A) Nazwa/klucz: białko (3) Położenie: 1..99 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:
Gly Ser
Ile Val BO
Asn Tyr 95
Wet T_ Gin Ala Thr Thr Cys 20 Ser 3 Gly Thr Ser Gly Asn His Leu Ser Ala 10 Val Glu 25 Arg His Ala Phe Leu 30 Val 15 Val Asn Cys
ais Leu Ala Leu Tyr
Gly Glu Arg Glv Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu
35 40 45
Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly
50 ΞΞ 60
Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile
£5 70 75 80
Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn
85 90 95
Tyr Cys Asn (2) Informacja o 3EQ ID NO: 9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 100 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
PL 198 190 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..100 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 9:
Met 1 Ais Thr Thr Ser 5 Thr Gly Asn Ser Ala 10 Arg His Ala Ala Phe 15 Val
Asn Gin His Leu 20 Cys Gly Ser His Leu 25 Val Glu Ala ' Leu Tyr 30 Leu Val
Cys Gly Glu 35 Arg Gly Phe Phe Tyr 40 Thr Pro Lys Thr Arg 45 Arg Glu Ala
Glu ASp 50* Pro Gin Val Gly Gin 55 Val Glu Leu Gly Gly 60 Gly Pro Gly Ala
Gly 65 Ser Leu Gin Pro Leu 70 Ala Leu Glu Gly Ser 75 Leu Gin Lys Arg Gly 80
Ile Val Glu Gin Cys 85 Cys Thr Ser Ile Cys 90 Ser Leu Tyr Gin Leu 95 Glu
Asn Tyr Cys Asn 100 (2) Informacja o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Na2wa/klucz: białko (B) Położenie: 1..30 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 10:
PL 198 190 B1
Phe Val His Gin His Leu Cys Gly Sar His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr-
20* 25 30
(2) Informacja o SSQ ID NO: 11
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz :: biał: ko
(B) Położenie: 1. .30
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: : 11 •
Phe Val Asp Gl n His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
2 5 ’ 10 15
Leu Val Cys Gl y Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
25 30

Claims (66)

1. Analogi insuliny o ogólnym wzorze I
PL 198 190 B1 w którym (A1-A5) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (A15-A19) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A15 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B8-B18) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B20-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej,
R8 oznacza Thr lub Ala,
R9 oznacza Ser lub Gly,
R10 oznacza Ile lub Val,
R14 oznacza Tyr, His, Asp lub Glu,
R21 oznacza Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu lub Gln,
R1 oznacza Phe, His, Asn, Asp lub Gly,
R2 oznacza Val, Ala lub Gly,
R3 oznacza Asn, His, Glu lub Asp,
R4 oznacza Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly lub Glu,
R30 oznacza Thr lub -OH,
Z oznacza atom wodoru, His, His Ala lub His Ala Ala, przy czym w przypadku gdy Z oznacza atom wodoru, to wówczas R1 lub R3 oznacza His, Glu lub Asp, a R3 oznacza His gdy R1 oznacza obojętną lub ujemnie naładowaną resztę aminokwasu, albo w przypadku gdy Z oznacza atom wodoru, to wówczas R14 oznacza His, Asp lub Glu, a ponadto analog insuliny lub fizjologicznie zgodna sól analogu o wzorze I różni się od insuliny ludzkiej nie tylko zmianą reszt aminokwasów we wzorze I w pozycji R3, albo R3 w połączeniu z R21, albo R3 w połączeniu z R4, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
2. Analogi insuliny według zastrz. 1, w których R8 oznacza Thr, R9 oznacza Ser, a R10 oznacza Ile, oraz ich fizjologicznie zgodne sole
3. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R30 oznacza Thr, Ala lub Ser, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
4. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R21 oznacza Asn, a R1 oznacza Phe, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
5. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R2 oznacza Val, R3 oznacza Asn, a R4 oznacza Gln, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
6. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R14 oznacza Tyr, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
7. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R14 oznacza His, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
8. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R14 oznacza Asp, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
9. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R14 oznacza Glu, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
10. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R30 oznacza Thr, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
11. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R30 oznacza Ala, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
12. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R30 oznacza Ser, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
13. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których R30 oznacza -OH, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
14. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których Z oznacza His, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
15. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których Z oznacza His-Ala-, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
16. Analogi insuliny według zastrz. 1 albo 2, w których Z oznacza His-Ala-Ala-, oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
PL 198 190 B1
17. Analogi insuliny według zastrz. 14, w których łańcuch B ma sekwencję His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 3), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
18. Analogi insuliny według zastrz. 14, w których łańcuch B ma sekwencję His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 4), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
19. Analogi insuliny według zastrz. 15, w których łańcuch B ma sekwencję His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 5), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
20. Analog insuliny według zastrz. 16, w których łańcuch B ma sekwencję His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 6), oraz ich fizjologicznie zgodne sole.
21. Sposób wytwarzania analogów insuliny oraz ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych w zastrz. 1, znamienny tym, ż e konstruuje się zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję aminokwasów o ogólnym wzorze II
Met-X2-Arg-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21 II w którym
X1 oznacza Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly
Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys,
X2 oznacza Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala,
R30 oznacza Thr lub -OH
Z jest nieobecny, albo oznacza His, His-Ala lub His-Ala-Ala, a pozostałe symbole mają znaczenie podane w zastrz. 1, przy czym zachowane są również warunki podane w zastrz. 1, prowadzi się ekspresję w komórkach gospodarza oraz uwalnia się analog insuliny z tego prekursora metodami chemicznymi i/lub enzymatycznymi.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się bakterie.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako bakterie stosuje się E. coli.
24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się drożdże.
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że jako drożdże stosuje się Saccharomyces cerevisiae.
26. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania analogu insuliny zdefiniowanego w zastrz. 18 prekursor analogu insuliny ma sekwencję
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys
Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
Gly Gly Pro Gly Ala
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 7).
27. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania analogu insuliny zdefiniowanego w zastrz. 19 prekursor analogu insuliny ma sekwencję
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val
Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
Gly Gly Pro Gly Ala
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
PL 198 190 B1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 8).
28. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania analogu insuliny zdefiniowanego w zastrz. 20 prekursor analogu insuliny ma sekwencję
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val
Glu Ala Leu Tyr Leu
Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
Gly Gly Pro Gly Ala
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 9).
29. Prekursory analogów insuliny zdefiniowane w zastrz. 21.
30. Prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7.
31. Prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 8.
32. Prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 9.
33. Sekwencje DNA kodujące prekursory analogów insuliny zdefiniowane w zastrz. 29.
34. Sekwencja DNA kodująca prekursor insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7.
35. Sekwencja DNA kodująca prekursor insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 8.
36. Sekwencja DNA kodująca prekursor insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 9.
37. Wektory ekspresyjne zawierające sekwencje DNA zdefiniowane w zastrz. 33.
38. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 7.
39. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 8.
40. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję SEQ ID NO: 9.
41. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą prekursor analogu insuliny mający sekwencję zdefiniowaną w zastrz. 37, korzystnie SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 lub SEQ ID NO: 9.
42. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden analog insuliny i/lub co najmniej jedną jego fizjologicznie zgodną sól zdefiniowane w zastrz. 1.
43. Środek farmaceutyczny według zastrz. 42, znamienny tym, że zawiera analog insuliny i/lub jego fizjologicznie zgodną sól w postaci rozpuszczonej, amorficznej i/lub krystalicznej.
44. Środek farmaceutyczny według zastrz. 42, znamienny tym, że dodatkowo zawiera substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie.
45. Środek farmaceutyczny według zastrz. 44, znamienny tym, że jako substancję pomocniczą zapewniającą przedłużone działanie zawiera siarczan protaminy, przy czym analog insuliny i/lub jego fizjologicznie zgodna sól razem z siarczanem protaminy występuje w postaci substancji współwykrystalizowanej.
46. Środek farmaceutyczny według zastrz. 42, znamienny tym, że zawiera dodatkowo niemodyfikowaną insulinę ludzką.
47. Środek farmaceutyczny według zastrz. 42 albo 43, albo 44, albo 46, znamienny tym, że zawiera dodatkowo analog insuliny.
48. Środek farmaceutyczny według zastrz. 47, znamienny tym, że jako analog insuliny zawiera Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-insulinę ludzką.
49. Roztwór o aktywności insulinowej do wstrzykiwań, znamienny tym, że zawiera środek farmaceutyczny w postaci rozpuszczonej, zdefiniowany w zastrz. 42.
50. Roztwór do iniekcji według zastrz. 49, znamienny tym, że zawiera od 1 μg do 2 mg cynku na ml.
51. Roztwór do iniekcji według zastrz. 50, znamienny tym, że zawiera 5 - 200 μg cynku na ml.
52. Zastosowanie analogów insuliny i/lub ich fizjologicznie zgodnych soli zdefiniowanych w zastrz. 1 do wytwarzania środka farmaceutycznego wykazującego aktywność insulinową z opóźnionym wystąpieniem działania.
PL 198 190 B1
53. Kompleksy insuliny z cynkiem, zawierające heksamer insuliny i 4 - 10 jonów cynku na heksamer insuliny, przy czym heksamer insuliny składa się z sześciu cząsteczek analogu insuliny o ogólnym wzorze I
S- g (Al-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(Al 5-A19)-Cys-R21
S s w którym (A1-A5) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A1 do A5 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (A15-A19) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A15 do A19 łańcucha A insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B8-B18) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B8 do B18 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej, (B20-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B20 do B29 łańcucha B insuliny ludzkiej lub insuliny zwierzęcej,
R8 oznacza Thr lub Ala,
R9 oznacza Ser lub Gly,
R10 oznacza Ile lub Val,
R14 oznacza Tyr, His, Asp lub Glu,
R21 oznacza Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu lub Gln,
R1 oznacza Phe, His, Asn, Asp lub Gly,
R2 oznacza Val, Ala lub Gly,
R3 oznacza Asn, His, Glu lub Asp,
R4 oznacza Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly lub Glu,
R30 oznacza Thr -OH,
Z oznacza atom wodoru lub His, His Ala albo His Ala Ala.
54. Kompleks insuliny z cynkiem według zastrz. 53, zawierający 5-8 jonów cynku na heksamer insuliny.
55. Kompleks insuliny z cynkiem według zastrz. 53 albo 54, w którym heksamer insuliny składa się z sześciu cząsteczek analogu insuliny o wzorze I zdefiniowanego w zastrz. 1.
56. Kompleks insuliny z cynkiem według zastrz. 53 albo 54, w którym łańcuch B analogu insuliny o wzorze I ma sekwencję
Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 10).
57. Kompleks insuliny z cynkiem według zastrz. 53 albo 54, w którym łańcuch B analogu insuliny o wzorze I ma sekwencję
Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 11).
PL 198 190 B1
58. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden kompleks insuliny z cynkiem, zdefiniowany w zastrz. 53.
59. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera kwaśny roztwór co najmniej jednego analogu insuliny zdefiniowanego w zastrz. 53 i/lub jego fizjologicznie zgodnej soli, z odpowiednią ilością jonów cynku, umożliwiającą utworzenie kompleksu insuliny z cynkiem, zdefiniowanego w zastrz. 53.
60. Środek farmaceutyczny według zastrz. 59, znamienny tym, że zawiera kwaśny roztwór analogu insuliny i/lub jego fizjologicznie zgodnej soli zdefiniowanych w zastrz. 1, z odpowiednią ilością jonów cynku, umożliwiającą utworzenie kompleksu insuliny z cynkiem, zdefiniowanego w zastrz. 55.
61. Środek farmaceutyczny według zastrz. 59, znamienny tym, że zawiera kwaśny roztwór co najmniej jednego analogu insuliny według zastrz. 56 albo 57 i/lub jego fizjologicznie zgodnej soli, z odpowiednią ilością jonów cynku, umożliwiającą utworzenie kompleksu insuliny z cynkiem, zdefiniowanego w zastrz. 56 albo 57.
62. Środek farmaceutyczny według zastrz. 58 albo 59, albo 60, albo 61, znamienny tym, że zawiera kompleks insuliny z cynkiem w postaci rozpuszczonej, amorficznej i/lub krystalicznej.
63. Roztwór o aktywności insulinowej do wstrzykiwań, znamienny tym, że zawiera środek farmaceutyczny zdefiniowany w zastrz. 62 w postaci rozpuszczonej.
64. Roztwór do iniekcji według zastrz. 63, znamienny tym, że zawiera od 1 μg do 2 mg cynku na ml.
65. Roztwór do iniekcji według zastrz. 64, znamienny tym, że zawiera 5 - 200 μg cynku na ml.
66. Zastosowanie kompleksów insuliny z cynkiem zdefiniowanych w zastrz. 53 do wytwarzania środka farmaceutycznego, wykazującego aktywność insulinową z opóźnionym wystąpieniem działania.
PL345898A 1998-06-06 1999-05-21 Analogi insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory analogów insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej, zastosowanie analogów insuliny, kompleksy insuliny z cynkiem i ich zastosowanie PL198190B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19825447A DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1998-06-06 Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
PCT/EP1999/003490 WO1999064598A2 (de) 1998-06-06 1999-05-21 Neue insulinanaloga mit erhöhter zinkbindung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL345898A1 PL345898A1 (en) 2002-01-14
PL198190B1 true PL198190B1 (pl) 2008-06-30

Family

ID=7870213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL345898A PL198190B1 (pl) 1998-06-06 1999-05-21 Analogi insuliny, sposób ich wytwarzania, prekursory analogów insuliny, sekwencje DNA kodujące te prekursory, wektory ekspresyjne, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, roztwór o aktywności insulinowej, zastosowanie analogów insuliny, kompleksy insuliny z cynkiem i ich zastosowanie

Country Status (23)

Country Link
US (1) US6686177B1 (pl)
EP (1) EP1084248B1 (pl)
JP (1) JP4402296B2 (pl)
KR (1) KR100649339B1 (pl)
CN (1) CN1304450B (pl)
AR (1) AR019852A1 (pl)
AT (1) ATE334201T1 (pl)
AU (1) AU757275B2 (pl)
BR (1) BR9910978A (pl)
CA (1) CA2330183C (pl)
CZ (1) CZ301377B6 (pl)
DE (2) DE19825447A1 (pl)
DK (1) DK1084248T3 (pl)
ES (1) ES2268871T3 (pl)
HU (1) HU228908B1 (pl)
MX (1) MXPA00011456A (pl)
NO (1) NO329956B1 (pl)
PL (1) PL198190B1 (pl)
PT (1) PT1084248E (pl)
RU (1) RU2225723C2 (pl)
TR (1) TR200003606T2 (pl)
WO (1) WO1999064598A2 (pl)
ZA (1) ZA200006835B (pl)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
WO2002067969A2 (en) 2001-02-21 2002-09-06 Medtronic Minimed, Inc. Stabilized insulin formulations
US20040038864A1 (en) * 2002-06-27 2004-02-26 Per Balschmidt Use of dimethyl sulfone as isotonicity agent
MX2007000883A (es) 2004-07-19 2007-04-02 Biocon Ltd Conjugados de insulina-oligomero, formulaciones y usos de los mismos.
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
BRPI0818004B8 (pt) * 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
ES2612736T3 (es) * 2007-11-16 2017-05-18 Novo Nordisk A/S Composiciones farmacéuticas estables que comprenden liraglutida y degludec
PL219335B1 (pl) 2008-07-04 2015-04-30 Inst Biotechnologii I Antybiotyków Pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, jej zastosowanie oraz zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna
KR20110061552A (ko) * 2008-07-31 2011-06-09 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 할로겐 안정화된 인슐린
US20130085101A1 (en) * 2010-02-22 2013-04-04 Case Western Reserve University Long-acting insulin analogue preparations in soluble and crystalline forms
PL222975B1 (pl) 2012-05-23 2016-09-30 Inst Biotechnologii I Antybiotyków Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny
FR3013049B1 (fr) 2013-11-14 2015-11-13 You-Ping Chan Analogue de l'insuline glargine
WO2016144658A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
UY36870A (es) * 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI78616C (fi) 1982-02-05 1989-09-11 Novo Industri As Foerfarande foer framstaellning av en foer infusionsaendamaol avsedd stabiliserad insulinloesning, som har en foerhoejd zinkhalt.
DE3326472A1 (de) 1983-07-22 1985-02-14 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus
DE3327709A1 (de) * 1983-07-29 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
SU1250303A1 (ru) * 1983-12-30 1986-08-15 Филиал По Разработке Готовых Лекарственных Средств Научно-Исследовательского Института По Биологическим Испытаниям Химических Соединений Способ стабилизации суспензии цинк-инсулина кристаллического
DE3440988A1 (de) 1984-11-09 1986-07-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US5008241A (en) 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
DE3526995A1 (de) 1985-07-27 1987-02-05 Hoechst Ag Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
PH25772A (en) * 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
DE3541856A1 (de) 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
DE3636903A1 (de) 1985-12-21 1987-07-02 Hoechst Ag Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil
RU2104305C1 (ru) * 1986-08-29 1998-02-10 Ново Нордиск А.С. Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций
CA1340522C (en) 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
DE3805150A1 (de) 1987-04-11 1988-10-20 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden
DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1991-10-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3726655A1 (de) 1987-08-11 1989-02-23 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten
DE3739347A1 (de) 1987-11-20 1989-06-01 Hoechst Ag Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen
DK257988D0 (da) * 1988-05-11 1988-05-11 Novo Industri As Nye peptider
ATE101620T1 (de) 1988-06-23 1994-03-15 Hoechst Ag Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung.
DE3827533A1 (de) 1988-08-13 1990-02-15 Hoechst Ag Pharmazeutische zubereitung zur behandlung des diabetes mellitus
DE3837825A1 (de) 1988-11-08 1990-05-10 Hoechst Ag Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
US5358857A (en) 1989-08-29 1994-10-25 The General Hospital Corp. Method of preparing fusion proteins
GR1005153B (el) 1989-08-29 2006-03-13 The General Hospital Corporation Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους.
US5227293A (en) 1989-08-29 1993-07-13 The General Hospital Corporation Fusion proteins, their preparation and use
EP0600372B1 (de) 1992-12-02 1997-02-05 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
JP2837956B2 (ja) * 1993-06-21 1998-12-16 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ａｓｐ▲上Ｂ２８▼インスリン結晶
SI0792290T1 (en) * 1993-09-17 2001-12-31 Novo Nordisk As Acylated insulin
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
DK0821006T3 (da) * 1996-07-26 2004-08-16 Aventis Pharma Gmbh Insulinderivater med öget zinkbinding
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999064598A3 (de) 2000-03-16
EP1084248A2 (de) 2001-03-21
DE59913711D1 (de) 2006-09-07
ATE334201T1 (de) 2006-08-15
MXPA00011456A (es) 2002-10-17
AU4145499A (en) 1999-12-30
CN1304450B (zh) 2012-10-10
PL345898A1 (en) 2002-01-14
DK1084248T3 (da) 2006-11-20
BR9910978A (pt) 2001-02-13
ES2268871T3 (es) 2007-03-16
US6686177B1 (en) 2004-02-03
CN1304450A (zh) 2001-07-18
NO20006177D0 (no) 2000-12-05
JP4402296B2 (ja) 2010-01-20
NO20006177L (no) 2000-12-05
NO329956B1 (no) 2011-01-31
HU228908B1 (hu) 2013-06-28
CZ301377B6 (cs) 2010-02-03
TR200003606T2 (tr) 2001-06-21
CZ20004525A3 (cs) 2001-04-11
KR100649339B1 (ko) 2006-11-24
RU2225723C2 (ru) 2004-03-20
WO1999064598A2 (de) 1999-12-16
HUP0102217A2 (hu) 2001-10-28
HUP0102217A3 (en) 2004-04-28
DE19825447A1 (de) 1999-12-09
PT1084248E (pt) 2006-11-30
CA2330183C (en) 2009-10-20
JP2002517247A (ja) 2002-06-18
AU757275B2 (en) 2003-02-13
CA2330183A1 (en) 1999-12-16
AR019852A1 (es) 2002-03-20
HK1036808A1 (en) 2002-01-18
EP1084248B1 (de) 2006-07-26
ZA200006835B (en) 2001-07-09
KR20010052635A (ko) 2001-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3676573B2 (ja) 迅速な作用発現を示す新規インスリン誘導体
CN114901680B (zh) 长效glp-1化合物
RU2529952C2 (ru) Новые производные инсулина с сильно замедленным профилем время/действие
JP5695909B2 (ja) 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体
US7229964B2 (en) Insulin derivatives
JP3872105B2 (ja) インスリン誘導体
JP5694779B2 (ja) 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体
RU2176646C2 (ru) Инсулин и его производные с повышенной способностью связывать цинк
CN118420743A (zh) 胰岛素衍生物
JP2000504732A (ja) インスリン誘導体類とその使用
JP4402296B2 (ja) 亜鉛結合性が増大された新規なインスリン同族体
HK40115534A (zh) 长效glp-1化合物
HK1036808B (en) Novel insulin analogs with enhanced zinc binding
MXPA98004945A (en) New insulin derivatives with rapid initiation of efe
MXPA97007056A (en) Insulated derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification