KR20010052635A - 아연 결합이 향상된 신규한 인슐린 동족체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아연 결합능이 향상된 인슐린 동족체, 및 사람 인슐린과 비교하여 활성이 지연된 이의 안정한 아연 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 인슐린 동족체의 제조 방법 및 이의 용도, 특히 I형 및 II형 진성 당뇨병을 치료하기 위한 약제 제조에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

아연 결합이 향상된 신규한 인슐린 동족체{Novel insulin analogs with enhanced zinc binding}
본 발명은 아연 결합이 증가된 인슐린 동족체 및 사람 인슐린과 비교하여 작용 프로파일이 지연된 이의 안정한 아연 복합체, 이의 제조방법, 및 특히 I형 및 II형 진성 당뇨병의 치료를 위한 약제 제조에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
전세계적으로, 대략 120,000,000명의 사람들이 진성 당뇨병으로 고생하고 있다. 이들 중에서, 대략 12,000,000명이 I형 당뇨병 환자로서, 이들에 대한 현재의 유일한 치료방법은 결여된 엔도크린 인슐린 분비를 대체하는 것이다. 발병된 환자에게는 생존하는 동안 원칙적으로 1일 수회의 인슐린 주사가 처방된다. I형 당뇨병과는 달리, II형 당뇨병에서는 기본적으로 인슐린이 결핍되지는 않지만, 다수의 경우, 특히 진행된 상태에 있어서는 경우에 따라 경구 항당뇨병제와 함께 인슐린을 사용한 치료가 가장 바람직한 치료 형태로서 간주된다.
건강한 사람에 있어서, 췌장에 의한 인슐린 방출은 혈중 글루코즈 농도와 엄격하게 결부된다. 식사후 발생하는 혈중 글루코즈 농도의 증가는 상응하는 인슐린 분비의 증가에 의해 신속하게 상쇄된다. 단식 상태에 있어서, 혈장 인슐린 수준은 글루코즈를 인슐린-감수성 기관 및 조직에 지속적으로 공급하고 간의 글루코즈 생성을 밤새 낮은 수준으로 유지시키기에 충분한 기저값으로 감소시킨다. 원칙적으로, 내생 인슐린 분비를 인슐린의 외래 투여, 대부분 피하 투여로 대체하는 것은 상술된 혈중 글루코즈에 대한 생리학적 조절의 질을 거의 달성하지 못한다. 종종, 혈중 글루코즈의 조절이 그 이상 또는 그 이하로 손실되는데, 이는 이들의 가장 중요한 형태에 있어서 삶을 위협할 수 있다. 또한, 초기의 징후 없이 수년간 상승된 혈중 글루코즈 수준은 건강에 대한 상당한 위험 요인이다. USA에서 대규모 DCCT 연구(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N, Engl. J. Med. 329, 977-986)는 만성적으로 상승된 혈중 글루코즈 수준이 대부분 당뇨성 후기 손상의 발생에 관여한다는 것을 명백히 입증하였다. 당뇨성 후기 손상은 특정한 상황, 예를 들어 망막증, 신장병증 또는 신경병하에 나타나고 실명, 신부전증 및 체지 소실을 유도하며 심혈관 질병의 고도의 위험이 추가로 수반되는 미세- 및 거대혈관 손상이다. 이는 개선된 당뇨병 치료가 가능한 한 생리학적 범위와 유사한 혈중 글루코즈의 유지를 주요 목적으로 하지 않으면 않된다는 것으로부터 유도될 수 있다. 집중적인 인슐린 치료의 개념에 따라, 이는 신속하게 및 느리게 작용하는 인슐린 제제를 1일 수회 주사하여 달성되어야 한다. 신속히 작용하는 제형은 식후 혈중 글루코즈 증가를 안정화시키기 위해 식사중에 제공된다. 느리게 작용하는 기초 인슐린은 저혈당증을 유도하지 않으면서 특히 밤새 기본적인 인슐린 공급을 보장하여야 한다.
현재 이용가능한 기초 인슐린은 이러한 요건을 부적절하게 충족시킨다. 빈번히 사용되는 NPH 인슐린은 특히 최대 작용을 너무 강력하게 나타내고, 전체적인 작용 기간이 너무 짧다. 저녁에 투여하는 경우에 있어서, 이는 밤의 저혈당증 위험 및 아침의 고혈당증 위험을 수반한다.
EP 0 821 006호는 아연과 배합하는 경우 사람 인슐린과 비교하여 지연된 작용 프로파일을 갖는, 아연 결합 능력이 증가된 인슐린 동족체를 기술한다. 이들 동족체는 A 쇄의 A21번 위치의 아미노산이 변화되어 있고 B 쇄의 B30번 위치에서, 1 내지 5개의 히스티딘 잔기를 함유하는, 2 내지 35개 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 히스티딘 잔기가 부가되었다는 점에서 사람 인슐린과는 본질적으로 상이하다.
본 발명의 목적은 아연 결합 능력이 증가되어 있고, 인슐린 동족체의 헥사머와 아연을 포함하는 안정한 복합체를 형성하며, 적합한 제제에 있어서 사람 인슐린과 비교하여 지연된 작용 프로파일의 결과로서 피하 주사에 대해 I형 및 II형 진성 당뇨병의 치료를 개선시킬 수 있는 인슐린 동족체(사람 또는 동물 인슐린의 동족체)를 제공하는 것이다.
인슐린 동족체는 하나 이상의 천연 아미노산 잔기의 치환 또는 결실 및/또는 천연 인슐린의 A 쇄 및/또는 B 쇄에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가에 의해 천연 인슐린, 즉 사람 인슐린(서열 1: 사람 인슐린의 A 쇄 및 서열 2: 사람 인슐린의 B 쇄)로부터 유도된다.
본 발명의 목적은 다음에 의해서 달성된다:
1. 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염(이는 화학식 I(서열 1 및 서열 2)에 있어서 R3번 위치 또는 R3번 위치와 R21번 위치 또는 R3번 위치와 R4번 위치에서 아미노산 잔기의 변화에 의해 사람 인슐린과 상이하다):
위의 식에서,
(A1-A5)는 사람 인슐린(서열 1 참조) 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A1번 내지 A5번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
(A15-A19)는 사람 인슐린(서열 1 참조) 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A15번 내지 A19번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
(B8-B18)은 사람 인슐린(서열 2 참조) 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B8번 내지 B18번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
(B20-B29)는 사람 인슐린(서열 2 참조) 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B20번 내지 B29번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
R8은 Thr 또는 Ala이고,
R9는 Ser 또는 Gly이며,
R10은 Ile 또는 Val이고,
R14는 Tyr, His, Asp 또는 Glu이며,
R21은 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu 또는 Gln이고,
R1은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이거나, 부재하거나, 수소 원자이며,
R2는 Val, Ala 또는 Gly이고,
R3은 Asn, His, Glu 또는 Asp이며,
R4는 Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly 또는 Glu이고,
R30은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기 또는 -OH이며,
Z는 수소 원자 또는 1 내지 4개의 히스티딘 잔기(His)를 포함하는, 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기가 1 내지 4개인 펩타이드 잔기이고,
단, Z가 수소 원자인 경우 R1 또는 R3은 His, Glu 또는 Asp이고, R3이 His인 경우 R1은 중성 또는 네가티브 하전된 아미노산 잔기이거나,
Z가 수소 원자인 경우 R14는 His, Asp 또는 Glu이다.
바람직하게는, 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 2. R8이 Thr이고, R9가 Ser이며, R10이 Ile인 것;
3. R1이 Phe, His, Asn, Asp 또는 Gly인 것;
4. R30이 Thr, Ala 또는 Ser인 것; 또는
5. R21이 Asn이고 R1이 Phe인 것이다.
6. 본 발명의 바람직한 양태는 R2가 Val이고 R3이 Asn이며 R4가 Gln인 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염이다.
화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 R14가 7. Tyr, 8. His, 9. Asp 또는 10. Glu이라는 점에서 구별되는 것이 또한 바람직하다.
화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 R30이 11. Thr, 12. Ala, 13. Ser 또는 14. -OH라는 점에서 구별되는 것이 또한 바람직하다.
화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 Z가 15. His, 16. His-Ala- 또는 17. His-Ala-Ala-라는 점에서 구별되는 것이 또한 바람직하다.
본 발명에 따르는 인슐린 동족체의 예는 18. B 쇄가 서열 His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys(서열 3), 예를 들어 His(B0), des(B30) 사람 인슐린이라는 점에서 구별되는 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염,
19. B 쇄가 서열 His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 4), 예를 들어 His(B0)-사람 인슐린이라는 점에서 구별되는 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염,
20. B 쇄가 서열 His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 5), 예를 들어 His(B-1), Ala(B0) 사람 인슐린이라는 점에서 구별되는 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는
21. B 쇄가 서열 His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 6), 예를 들어 His(B-2), Ala(B-1), Ala(B0)-사람 인슐린이라는 점에서 구별되는 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염이다.
본 발명은 또한 아미노산 서열(II)를 갖는 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 복제가능한 발현 비히클을 작제하고, 숙주 세포에서 발현시키며, 화학적 및/또는 효소적 방법을 사용하여 이의 전구체로부터 인슐린 동족체를 방출시킴을 포함하는, 본 발명에 따르는 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염(이는 화학식 I(서열 1 및 서열 2)에 있어서 R3번 위치 또는 R3번 위치와 R21번 위치 또는 R3번 위치와 R4번 위치에서 아미노산 잔기의 변화에 의해 사람 인슐린과 상이하다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
위의 식에서,
X1n은 아미노산 잔기가 n개(여기서, n은 0 내지 34의 정수이다)인 펩타이드 쇄이고,
X2m은 아미노산 잔기가 m개(여기서, m은 0 내지 20의 정수이다)인 펩타이드 쇄이며,
p는 0, 1 또는 2이고,
R30은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이거나 부재하며,
Z는 부재하거나, 1 내지 4개의 히스티딘 잔기(His)를 포함하는, 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기가 1 내지 4개인 펩타이드 잔기이고,
다른 변수는 화학식 I에서 전술된 의미를 가지며,
상술된 단서가 또한 적용된다.
숙주 세포는 바람직하게는 세균, 특히 바람직하게는 이. 콜라이 세균이다.
숙주 세포는 바람직하게는 효모, 특히 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다.
이. 콜라이에서 발현시키는 동안, 원칙적으로 언급된 융합 단백질(서열 7 내지 9)는 불용성 봉입체를 형성하는데, 이는 세포 파괴후에 원심분리에 의해 분리하고 카오트로픽 첨가제(예: 8M 우레아 또는 6M 구아니디늄 클로라이드)를 사용하여 다시 용해시킬 수 있다. 용해된 융합 단백질은 설파이트 분해시킬 수 있는데, 여기서 SH 라디칼은 S-설포네이트로 전환된다[참조: R.C. Marshall and A.S. Iglis in, Practical Protein Chemistry-A Handbook, edited by A. Darbre(1986), pages 49-53]. 융합 단백질의 용해도는 이에 의해 개선되며, 예를 들어 음이온-교환 또는 겔 투과 크로마토그래피에 의한 정제가 용이해진다. 자연 공간 구조 및 정확하게 형성된 디설파이드 브릿지(폴딩)을 이용한 유도체화된 융합 단백질의 프리프로인슐린으로의 전환은 머캅토에탄올, 시스테인 또는 글루타티온 등의 SH 시약의 한정량 부가 또는 후속적인 공기 산화에 의해 희석 수용액에서 수행한다. 또는, 용해되고 유도체화된 융합 단백질을 직접 유사한 조건하에 폴딩할 수 있다(EP-A-0 600 372; EP-A-0 668 292). 이어서, 프리프로인슐린을 제한된 단백질분해 절단으로 생물학적 활성 인슐린으로 전환시킨다. 이를 위해, Met-X2m-(Arg)p로 화학식 II에 제시된 프리서열을 제거하고 X1n-Arg로 제시된 펩타이드 쇄를 절단하여 B 쇄와 A 쇄를 분리하는 트립신을 사용할 수 있다. 원칙적으로, 서열 X1은 Arg, Arg2로 시작하거나 부재(n=0)하여, 절단 후 B 쇄의 C 말단에서 Arg 또는 Arg2에 의해 신장된 인슐린 유도체가 존재한다. 이들 아미노산은 카복시펩티다제 B를 사용하여 제거할 수 있다. 트립신 절단은 또한 트립신 농도를 증가시켜 수행하거나, 리신(B29)에서 추가로 절단되도록 반응 시간을 연장시켜 수행할 수 있다. 이 경우, des(B30) 인슐린 유도체가 수득된다.
절단하는 동안에 형성된 인슐린 동족체는 표준 크로마토그래피 공정(예: 이온-교환 및 역상 크로마토그래피)에 의해 정제할 수 있고, 마지막으로 침전, 결정화 또는 단순 동결-건조에 의해 분리할 수 있다.
인슐린 동족체의 전구체는 바람직하게는 서열 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 7), 예를 들어 His(B0)-프리프로인슐린의 서열, 또는
서열 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 8), 예를 들어 His(B-1), Ala(B0) 프리프로인슐린의 서열, 또는
서열 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 9), 예를 들어 His(B-2), Ala(B-1), Ala(B0)-프리프로인슐린의 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 인슐린 동족체의 상술된 전구체, 특히 프리프로인슐린, 본 발명에 따른 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열, 본 발명에 따르는 인슐린 동족체의 신규한 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 비히클, 및 이러한 발현 비히클을 사용하여 형질전환시킨 숙주 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 하나 이상의 인슐린 동족체 및/또는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
바람직하게는, 약제학적 제제는 본 발명에 따르는 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 용해된 형태, 무정형 형태 및/또는 결정질 형태로 함유한다는 점에서 구별된다.
약제학적 제제는 또한 데포우 보조제, 바람직하게는 프로타민 설페이트를 추가로 함유하며, 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 프로타민 설페이트와의 공결정화물로서 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약제학적 제제는 변형되지 않은 사람 인슐린 및/또는 추가의 인슐린 동족체, 바람직하게는 Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-사람 인슐린을 추가로 함유한다.
본 발명은 또한 바람직하게는 아연 1㎍ 내지 2mg/ml, 특히 아연 5㎍ 내지 200㎍/ml를 함유하는 본 발명에 따르는 약제학적 제제를 용해된 형태로 함유하는, 인슐린 활성을 갖는 주사 액제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 작용 개시가 지연된 인슐린 활성을 갖는 약제학적 제제를 제조하기 위한 본 발명에 따르는 인슐린 동족체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
초기에 설정된 목적은 또한 화학식 I의 인슐린 동족체의 6개 분자로 이루어진 인슐린 헥사머와, 인슐린 헥사머당 4 내지 10개의 아연 이온을 포함하는 인슐린-아연 복합체에 의해 달성된다.
화학식 I
위의 식에서,
(A1-A5)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A1번 내지 A5번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
(A15-A19)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A15번 내지 A19번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
(B8-B18)은 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B8번 내지 B18번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
(B20-B29)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B20번 내지 B29번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
R8은 Thr 또는 Ala이고,
R9는 Ser 또는 Gly이며,
R10은 Ile 또는 Val이고,
R14는 Tyr, His, Asp 또는 Glu이며,
R21은 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu 또는 Gln이고,
R1은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이거나, 부재하거나, 수소 원자이며,
R2는 Val, Ala 또는 Gly이고,
R3은 Asn, His, Glu 또는 Asp이며,
R4는 Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly 또는 Glu이고,
R30은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기 또는 -OH이며,
Z는 수소 원자 또는, 1 내지 4개의 히스티딘 잔기(His)를 포함하는, 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기가 1 내지 4개인 펩타이드 잔기이다.
인슐린-아연 복합체는 바람직하게는 인슐린 헥사머당 5 내지 8개의 아연 이온을 함유한다.
인슐린-아연 복합체는 바람직하게는 본 발명에 따라 상술된 화학식 I의 인슐린 동족체의 6개 분자로 이루어진 인슐린 헥사머를 함유한다.
본 발명에 따르는 인슐린-아연 복합체는 바람직하게는 화학식 I의 인슐린 동족체의 B 쇄가 서열 Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 10), 예를 들어 His(B3)-사람 인슐린, 또는
서열 Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 11), 예를 들어 Asp(B3)-사람 인슐린을 갖는 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 하나 이상의 인슐린-아연 복합체를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이며, 여기서 약제학적 제제는 본 발명에 따르는 인슐린-아연 복합체를 형성할 수 있는 적절한 양의 아연 이온과 함께 하나 이상의 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 산성 용액을 포함하며, 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 바람직하게는 상술된 본 발명에 따르는 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 B 쇄가 서열 3, 4, 5, 10 또는 11의 서열을 갖는 화학식 I의 인슐린 동족체를 함유한다.
약제학적 제제는 바람직하게는 인슐린-아연 복합체를 용해된, 무정형 및/또는 결정질 형태로 포함하는 것이다.
본 발명은 또한 아연 1㎍ 내지 2mg/ml, 특히 바람직하게는 아연 5㎍ 내지 200㎍/ml을 함유하는 약제학적 제제를 용해된 형태로 포함하는, 인슐린 활성을 갖는 주사 액제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 작용 개시가 지연된 인슐린 활성을 갖는 약제학적 제제를 제조하기 위한 인슐린-아연 복합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 인슐린 동족체는 생물학적으로 활성적이며, 개에서 80㎛의 Zn++/㎖(아연/ml)를 함유하는 약산성의 투명한 용액으로서 피하 투여한 후에 강력히 지연된 작용을 나타낸다. 히스티딘, His(B0), des(B30) 사람 인슐린(서열 3 참조)에 의해 B 쇄의 N-말단에서 신장된 인슐린 동족체의 경우, 작용 프로파일은 예를 들어 첨가된 아연 이온의 양에 따라 매우 강력히 달라진다. 아연-비함유 제제는 전혀 데포우 효과가 없으며(전체 작용 6 내지 8시간, 실시예 8) 사람 인슐린과는 이의 약역학이 거의 상이한 반면, 아연 이온(80㎍/ml)를 첨가한 후 강력한 작용 지연이 발견되었다(전체 작용: 대략적으로 16시간, 실시예 8). 관찰된 데포우 효과는 NPH-인슐린의 것보다 더욱 현저하다. 게다가, 이러한 동족체는 약역학이 사람 인슐린에 의해서는 불가능한 범위내에서 아연 함량의 전처리에 의해 조절될 수 있다는 잇점이 있다. 작용 개시가 신속한 제형은 아연 함량을 변화시킴으로써 활성 물질에 의해 작용이 적절히 또는 강력히 지연된 것과 유사하게 제조할 수 있다. 따라서, 작용 프로파일은 적절히 조절된 아연 함량을 갖는 제제를 사용하거나 주치의 또는 환자 자신이 높거나 낮은 아연 함량을 갖는 제제를 혼합함으로써 환자의 요건에 개별적으로 적용할 수 있다.
본원에 기술된 동족체는 또한 사람 인슐린과 비교하여 아연 이온에 대한 친화력이 증가된 것이다.
수성의 중성 용액에 있어서, 사람 인슐린은 각각의 경우 His(B10) 측쇄를 통해 2개의 아연 이온을 착화시키는 헥사머를 형성한다. 이들 아연 이온은 중성 용액중의 수성 완충액에 대해 투석함으로써 제거될 수 없다. 동일한 조건하에, 본원에 기술된 동족체는 4개 이상의 아연 이온을 결합시킨다. 본 발명에 따르는 His(B0)-des(B30)- 및 His(B3)-인슐린의 경우에는 약 7개의 아연 이온/헥사머이고; Asp(B3) 인슐린의 경우에는 4.2개의 아연 이온/헥사머인 것으로 측정되었다(실시예 9).
중성 용액에서 아연은 비교적 높은 분자량 결합물을 형성시키고 인슐린을 침전시키는 것으로 알려져 있다. 투명한 용액을 제공하기 위해 용해시킨 인슐린을 함유하는 약산성의 아연-함유 제제를 주사한 후, 인슐린 아연 복합체의 형성, 및 이로 인한 인슐린의 침전이 중화에 기인하여 피하 조직에서 발생한다. 인슐린은 이러한 데포우로부터 다시 용액으로 된 다음 혈류 및 지연된 상태로 작용 부위로 통과한다. 이러한 작용 지연은 사람 인슐린의 경우에 있어서 매우 약하지만, 아연에 대한 친화성이 증가되었기 때문에 본원에 기술된 동족체의 경우에는 강력히 나타난다. 따라서, 아연 결합의 증가는 상술된 아연-의존성 작용 지연에 기초한다. 따라서, 본 발명은 기술된 인슐린 동족체 뿐만 아니라 관련된 인슐린-아연 복합체에 관한 것이다. 이들 복합체는 이들이 높은 함량의 확고히 결합된 아연을 가진다는 점에서 상응하는 사람 인슐린-아연 복합체과는 상이하다. 따라서, 아연 이외에, 예를 들어 코발트 또는 구리와 같은 기타 전이 금속 이온을 상응하는 복합체의 형성을 위해 사용할 수 있다.
실시예 1
변이체 His(B3)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT345d의 작제
미국 특허 제5,358,857호는 플라스미드 pINT90d를 기술한다. 이 플라스미드의 DNA를 플라스미드 pINT345d의 작제를 위한 출발 물질로서 사용하며, 이는 pINT90d와 비교하여 2가지의 새로운 특성으로 특징지워진다. 한편으로, 이는 B 쇄의 3번 위치에서 아스파라긴 대신에 아미노산 히스티딘을 함유하는 프리프로인슐린을 암호화하고, 다른 한편으로, 이러한 프리프로인슐린 변이체를 암호화하는 서열의 출발 서열 바로 앞에 제한 효소 BssH2에 대한 인지 서열을 포함하여, 프리프로인슐린 서열중의 Dra3 절단 부위를 고려하는 경우 프리프로인슐린 동족체의 N-말단의 10개 아미노산을 암호화하는 서열을 용이하게 조작할 수 있다. 플라스미드 pINT345d의 작제를 위해, 플라스미드 pINT90d의 DNA를 이중 분해 혼합물중에서 위치 284bp에서 제한 효소 NcoI에 의해 및 위치 351bp에서 제한 효소 Dra3에 의해 절단하여, 2개의 단편을 형성한다. 겔 전기영동에 의해 절단 혼합물을 분리한 후, 거대한 잔류 플라스미드 DNA 단편을 단리한다. 이어서, 이 DNA 단편을 T4-DNA 리가제 반응으로 하기 형태의 합성 DNA 단편과 반응시킨다:
경쟁 이. 콜라이 K12 세포를 연결 혼합물로 형질전환시키고, 형질전환 혼합물을 20mg/l의 암피실린이 함유된 NA 플레이트에 플레이팅한다. 이 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리한다. 플라스미드 DNA를 수득된 콜로니로부터 분리하고, 제한 효소 BssH2를 사용하여 절단한다. 목적하는 플라스미드 DNA를 이러한 과정에서 선형화시키고, BssH2 절단 부위를 함유하지 않는, 따라서 절단되지 않는 pINT90d DNA와 구별된다.
정확하게 반응을 나타내는 클론의 플라스미드 DNA를 pINT345d로 명명한다. 이는 하기에 기술된 프리프로인슐린 변이체를 작제하기 위한 출발 물질로서 사용된다:
실시예 2
변이체 His(B0)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT342d의 작제
플라스미드 pINT345d의 DNA를 효소 BssH2 및 Dra3으로 이중 분해하고, 거대한 잔류 플라스미드 단편을 겔 전기영동에 의해 분리한 후에 단리한다. 이 DNA 단편을 T4 DNA 리가제 반응으로 하기 형태의 합성 DNA 단편과 반응시킨다:
플라스미드 pINT342d가 형성되는데, 이는 출발 플라스미드와 비교하여 추가의 Hpa1 절단 부위를 포함한다. 플라스미드는 B0번 위치에 히스티딘을 갖는 프리프로인슐린 변이체를 암호화한다.
실시예 3
변이체 His(B-1), Ala(B0)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT343d의 작제
실시예 b에 기술된 잔류 플라스미드 단편의 DNA를 T4 DNA 리가제 반응으로 하기 형태의 합성 DNA 단편과 반응시킨다.
플라스미드 pINT343d가 형성되는데, pINT342d와 마찬가지로, 출발 벡터와 비교하여 추가의 Hpa1 절단 부위를 함유한다.
실시예 4
변이체 His(B-2), Ala(B-1), Ala(B0)-프리프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT344d의 작제
실시예 b에 기술된 잔류 플라스미드 단편의 DNA를 T4 DNA 리가제 반응으로 하기 형태의 합성 DNA 단편과 반응시킨다:
플라스미드 pINT344d가 생성되며, 이는 출발 벡터와 비교하여 추가의 Hpa1 절단 부위를 포함한다.
실시예 5
작제된 인슐린 변이체의 발현
플라스미드 pINT 342d, 343d 및 344d는 예를 들어 각각의 경우에 이. 콜라이 K12 W3110에 형질전환시킨다. 이어서, 각각의 변이체에 대해 상기 플라스미드를 함유하는 재조합체 세균을 미국 특허 제5,227,293호의 실시예 4에 따라 발효시키고, 이렇게 하여 각각의 인슐린 변이체를 제조하기 위한 목적하는 원료가 생성된다.
실시예 6
His(B0), des(B30)-인슐린의 제조
실시예 5에 따라, 프리프로인슐린 변이체를 이. 콜라이에서 발현시키고, 원심분리에 의해 세포를 파괴한 후 봉입체의 형태로 단리한다. 봉입체를 우레아(8mol/l)에 용해시키고, 설파이트 분해시킨 다음 음이온 교환(Q-세파로즈) 및 겔 투과 크로마토그래피(Sephacryl S 200)에 의해 정제한다. 크로마토그래피에 사용된 완충액은 4M 우레아 및 50mM 트리스/HCl(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄/HCl)(pH 8.5)를 함유한다. 음이온 교환기상에서의 분획 용출은 0 내지 0.5M NaCl의 구배를 적용하여 수행한다. 이어서, 우레아의 농도를 한외여과 및 희석에 의해 1M 미만으로 감소시키고, 프리프로인슐린-S-설포네이트를 pH 4에서 침전시켜 단리한 다음 마지막으로 건조시킨다. 천연 프로인슐린에 존재하는 정확한 디설파이드 브릿지를 형성하기 위해, 프리프로인슐린-S-설포네이트를 pH 10.8에서, 20mM 글리신을 0.3g/l의 농도로 함유하는 완충액에 용해시키고, 머캅토에탄올(약 25 내지 50mol/mol의 프리프로인슐린)으로 처리하고, 4℃에서 밤새 교반한다. 이어서, 배치의 pH를 인산으로 pH 3.5로 조절하고 원심분리한다. 상등액에 함유된 프리프로인슐린을 pH 8.2로 조절하여 트리스(25mM)을 첨가한 후에 인슐린으로 전환시키고, 트립신(1.5mg/g의 프리프로인슐린)으로 처리한다. 단백질 분해 절단 과정은 역상 HPLC에 의해 모니터한다. 대략 6시간 후, 배치는 함량이 높은 His(B0), des(B30)-인슐린을 함유한다. 반응은 pH 3.5로 산성화시켜 종결한다. 인슐린 동족체는 이온-교환 크로마토그래피(S-하이퍼-D, Sepracor) 및 역상 크로마토그래피(PLRP-S RP300, Polymer Laboratories)에 의해 정제한다. 이온-교환 크로마토그래피는 30% 2-프로판올 및 50mM 락트산(pH 3.5)를 함유하는 완충액에서 수행한다. 결합된 인슐린은 0 내지 0.5M NaCl의 선형 구배로 용출한다. 역상 크로마토그래피는 0.1% 트리플루오로아세트산에서 수행하는데, 용출을 위해 증가량의 아세토니트릴을 혼합한다. 생성물은 pH 5.4에서 침전에 의해 단리하고, 동결건조시킨다.
실시예 7
비경구 투여를 위한 인슐린 동족체의 제형화
제제는 ml당 40 또는 100IU의 인슐린(1 IU는 대략 6.2nmol에 상응한다), 20mg의 85% 글리세롤, 2.7mg의 m-크레졸 및, 경우에 따라, 아연++(염화아연으로서)를 pH 4의 멸균 수용액중에 함유한다.
실시예 8
개에서 His(B0), des(B30)-인슐린의 작용 프로파일
각각의 경우에 6마리의 개(비글)에게 40U/ml(실시예 7) 및 지시된 함량의 아연을 함유하는 제제를 피하 투여한다. 용량은 0.3IU/kg이다. 추가의 실험 과정에 있어서, 혈중 글루코즈 농도는 지시된 시간 후에 측정한다. 이 값을 각각의 출발 값에 대한 비율로서 표준화시켜 평균한다.
시간(H) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
아연 비함유 100 59 50 61 75 84 89 98 103 97 104 100
80㎍ 아연++/ml 100 97 83 75 65 56 51 58 68 72 78 82
실시예 9
인슐린 동족체의 아연 결합
인슐린의 제조(0.3mM 인슐린, 0.13M NaCl, 0.1% 페놀, 100㎍/ml 아연++(염화아연으로서), 25mM 트리스/HCl, pH 7.4)를 아연 비함유 중성 완충액(0.15M NaCl, 10mM 트리스/HCl(pH 7.4)에 대해 실온에서 3시간 동안, 10mM 트리스/HCl(pH 7.4)에 대해 15℃에서 72시간 동안 및 10mM 트리스/HCl(pH 7.4)에 대해 15℃에서 16시간 동안)에 대해 광범위하게 투석한다. 이어서, 투석물을 산성화시키고 분석한다. 인슐린의 농도는 역상 HPLC로 측정하고, 원자 흡수 스펙트럼에 의해 아연의 농도를 측정한다. 아연 값은 인슐린을 함유하지 않는 대조군 배치의 아연 함량을 사용하여 보정한다.
아연 결합
인슐린 아연 mol/헥사머 mol
사람 인슐린His(B3)-인슐린 2.56.9
Asp(B3)-인슐린 4.2
His(B0), des(B30)-인슐린 6.8
＜110＞ Aventis Pharma Deutschland GmbH
＜120＞ Novel insulin analogs with enhanced zinc binding
＜130＞ 5-1998-084662-6
＜150＞ DE198 25 447.4
＜151＞ 1998-06-06
＜160＞ 11
＜170＞ KopatentIn 1.55
＜210＞ 1
＜211＞ 21
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..21
＜400＞ 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
＜210＞ 2
＜211＞ 30
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..30
＜400＞ 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
＜210＞ 3
＜211＞ 30
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..30
＜400＞ 3
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25 30
＜210＞ 4
＜211＞ 31
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..31
＜400＞ 4
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
＜210＞ 5
＜211＞ 32
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..32
＜400＞ 5
His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
1 5 10 15
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
＜210＞ 6
＜211＞ 33
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..33
＜400＞ 6
His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25 30
Thr
＜210＞ 7
＜211＞ 98
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; Linear; NAME/KEY: Protein; Location: 1..98
＜400＞ 7
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln
1 5 10 15
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
20 25 30
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp
35 40 45
Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val
65 70 75 80
Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
85 90 95
Cys Asn
＜210＞ 8
＜211＞ 99
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..99
＜400＞ 8
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn
1 5 10 15
Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
20 25 30
Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu
35 40 45
Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly
50 55 60
Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile
65 70 75 80
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
85 90 95
Tyr Cys Asn
＜210＞ 9
＜211＞ 100
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..100
＜400＞ 9
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val
1 5 10 15
Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val
20 25 30
Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala
35 40 45
Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala
50 55 60
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly
65 70 75 80
Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu
85 90 95
Asn Tyr Cys Asn
100
＜210＞ 10
＜211＞ 30
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..30
＜400＞ 10
Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
＜210＞ 11
＜211＞ 30
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION: 1..30
＜400＞ 11
Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30

Claims (67)

  1. 화학식 I의 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염(화학식 I에 있어서 R3번 위치 또는 R3번 위치와 R21번 위치 또는 R3번 위치와 R4번 위치에서의 아미노산 잔기의 변화에 의해 사람 인슐린과 상이하다):
    화학식 I
    위의 식에서,
    (A1-A5)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A1번 내지 A5번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
    (A15-A19)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A15번 내지 A19번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
    (B8-B18)은 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B8번 내지 B18번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
    (B20-B29)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B20번 내지 B29번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
    R8은 Thr 또는 Ala이고,
    R9는 Ser 또는 Gly이며,
    R10은 Ile 또는 Val이고,
    R14는 Tyr, His, Asp 또는 Glu이며,
    R21은 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu 또는 Gln이고,
    R1은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이거나, 부재하거나, 수소 원자이며,
    R2는 Val, Ala 또는 Gly이고,
    R3은 Asn, His, Glu 또는 Asp이며,
    R4는 Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly 또는 Glu이고,
    R30은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기 또는 -OH이며,
    Z는 수소 원자 또는 1 내지 4개의 히스티딘 잔기(His)를 포함하는, 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기가 1 내지 4개인 펩타이드 잔기이고,
    단, Z가 수소 원자인 경우 R1 또는 R3은 His, Glu 또는 Asp이고, R3이 His인 경우 R1은 중성 아미노산 잔기 또는 네가티브로 하전된 아미노산 잔기이거나,
    Z가 수소 원자인 경우 R14는 His, Asp 또는 Glu이다.
  2. 제1항에 있어서, R8이 Thr이고 R9가 Ser이며 R10이 Ile인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 Phe, His, Asn, Asp 또는 Gly인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, R30이 Thr, Ala 또는 Ser인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, R21이 Asn이고 R1이 Phe인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, R2가 Val이고 R3이 Asn이며 R4가 Gln인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, R14가 Tyr인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, R14가 His인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, R14가 Asp인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, R14가 Glu인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, R30이 Thr인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  12. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, R30이 Ala인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  13. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, R30이 Ser인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  14. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, R30이 -OH인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, Z가 His인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  16. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, Z가 His-Ala-인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  17. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, Z가 His-Ala-Ala-인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  18. 제15항에 있어서, B 쇄의 서열이 His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys(서열 3)인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  19. 제15항에 있어서, B 쇄의 서열이 His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 4)인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  20. 제16항에 있어서, B 쇄의 서열이 His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 5)인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  21. 제17항에 있어서, B 쇄의 서열이 His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 6)인 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  22. 아미노산 서열(II)의 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 복제가능한 발현 비히클을 작제하고, 숙주 세포에서 발현시키며, 화학적 및/또는 효소적 방법을 사용하여 이의 전구체로부터 인슐린 동족체를 방출시킴을 포함하는, 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 인슐린 동족체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염(이는 화학식 I에 있어서 R3번 위치 또는 R3번 위치와 R21번 위치 또는 R3번 위치와 R4번 위치에서의 아미노산 잔기의 변화에 의해 사람 인슐린과 상이하다)의 제조방법.
    화학식 II
    위의 식에서,
    X1n은 아미노산 잔기가 n개(여기서, n은 0 내지 34의 정수이다)인 펩타이드 쇄이고,
    X2m은 아미노산 잔기가 m개(여기서, m은 0 내지 20의 정수이다)인 펩타이드 쇄이며,
    p는 0, 1 또는 2이고,
    R30은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이거나 부재하며,
    Z는 부재하거나, 1 내지 4개의 히스티딘 잔기(His)를 포함하는, 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기가 1 내지 4개인 펩타이드 잔기이고,
    단, Z가 수소 원자인 경우 R1 또는 R3은 His, Glu 또는 Asp이고, R3이 His인 경우 R1은 중성 아미노산 잔기 또는 네가티브로 하전된 아미노산 잔기이거나,
    Z가 수소 원자인 경우 R14는 His, Asp 또는 Glu이다.
  23. 제22항에 있어서, 숙주 세포가 세균인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세균이 이. 콜라이인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 숙주 세포가 효모인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 동족체의 전구체 서열이 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 7)인, 제19항에 따르는 인슐린 동족체의 제조방법.
  28. 제22항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 동족체의 전구체 서열이 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 8)인, 제20항에 따르는 인슐린 동족체의 제조방법.
  29. 제22항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 동족체의 전구체 서열이 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 9)인, 제21항에 따르는 인슐린 동족체의 제조방법.
  30. 제22항에 기재된 인슐린 동족체의 전구체.
  31. 제27항에 기재된 인슐린 동족체의 전구체.
  32. 제28항에 기재된 인슐린 동족체의 전구체.
  33. 제29항에 기재된 인슐린 동족체의 전구체.
  34. 제30항에 따르는 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
  35. 제31항에 따르는 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
  36. 제32항에 따르는 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
  37. 제33항에 따르는 인슐린 동족체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
  38. 제34항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
  39. 제35항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
  40. 제36항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
  41. 제37항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
  42. 제38항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따르는 발현 비히클을 사용하여 형질전환된 숙주 세포.
  43. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 하나 이상의 인슐린 동족체 및/또는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 약제학적 제제.
  44. 제43항에 있어서, 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 용해된 형태, 무정형 형태 및/또는 결정질 형태로 함유하는 약제학적 제제.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 데포우 보조제(depot auxiliary)를 추가로 함유하는 약제학적 제제.
  46. 제45항에 있어서, 데포우 보조제가 프로타민 설페이트이고, 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염이 프로타민 설페이트와의 공결정화물로 존재하는 약제학적 제제.
  47. 제43항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형되지 않은 사람 인슐린을 추가로 함유하는 약제학적 제제.
  48. 제43항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 동족체를 추가로 함유하는 약제학적 제제.
  49. 제48항에 있어서, 인슐린 동족체가 Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-사람 인슐린인 약제학적 제제.
  50. 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 따르는 약제학적 제제를 용해된 형태로 포함하는, 인슐린 활성을 갖는 주사 액제.
  51. 제50항에 있어서, ㎖당 아연 1㎍ 내지 2mg을 함유하는 주사 액제.
  52. 제51항에 있어서, ㎖당 아연 5㎍ 내지 200㎍을 함유하는 주사 액제.
  53. 작용 개시가 지연된 인슐린 활성을 갖는 약제학적 제제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 용도.
  54. 화학식 I의 인슐린 동족체의 6개 분자로 이루어진 인슐린 헥사머와 인슐린 헥사머당 4 내지 10개의 아연 이온을 포함하는 인슐린-아연 복합체.
    화학식 I
    위의 식에서,
    (A1-A5)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A1번 내지 A5번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
    (A15-A19)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A 쇄의 A15번 내지 A19번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
    (B8-B18)은 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B8번 내지 B18번 위치 중의 아미노산 잔기이고,
    (B20-B29)는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B 쇄의 B20번 내지 B29번 위치 중의 아미노산 잔기이며,
    R8은 Thr 또는 Ala이고,
    R9는 Ser 또는 Gly이며,
    R10은 Ile 또는 Val이고,
    R14는 Tyr, His, Asp 또는 Glu이며,
    R21은 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu 또는 Gln이고,
    R1은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기이거나, 부재하거나, 수소 원자이며,
    R2는 Val, Ala 또는 Gly이고,
    R3은 Asn, His, Glu 또는 Asp이며,
    R4는 Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly 또는 Glu이고,
    R30은 목적하는 임의의 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기 또는 -OH이며,
    Z는 수소 원자 또는, 1 내지 4개의 히스티딘 잔기(His)를 포함하는, 유전적으로 암호화가능한 아미노산 잔기가 1 내지 4개인 펩타이드 잔기이다.
  55. 제54항에 있어서, 인슐린 헥사머당 5 내지 8개의 아연 이온을 포함하는 인슐린-아연 복합체.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 인슐린 헥사머가 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 인슐린 동족체의 6개 분자로 이루어진 인슐린-아연 복합체.
  57. 제54항 또는 제55항에 있어서, 화학식 I의 인슐린 동족체의 B 쇄 서열이 Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 10)인 인슐린-아연 복합체.
  58. 제54항 또는 제55항에 있어서, 화학식 I의 인슐린 동족체의 B 쇄 서열이 Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(서열 11)을 갖는 인슐린-아연 복합체.
  59. 제54항 내지 제58항 중의 어느 한 항에 따르는 하나 이상의 인슐린-아연 복합체를 포함하는 약제학적 제제.
  60. 제54항 내지 제58항 중의 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 산성 용액을, 제54항 내지 제58항 중의 어느 한 항에 따르는 인슐린-아연 복합체를 형성할 수 있게 하는 적절한 양의 아연 이온과 함께 포함하는 약제학적 제제.
  61. 제60항에 있어서, 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 산성 용액을, 제56항에 따르는 인슐린-아연 복합체를 형성할 수 있게 하는 적절한 양의 아연 이온과 함께 포함하는 약제학적 제제.
  62. 제60항에 있어서, 제57항 또는 제58항에 기재된 하나 이상의 인슐린 동족체 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 산성 용액을, 제57항 또는 제58항에 따르는 인슐린-아연 복합체를 형성할 수 있게 하는 적절한 양의 아연 이온과 함께 포함하는 약제학적 제제.
  63. 제59항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린-아연 복합체를 용해된 형태, 무정형 형태 및/또는 결정질 형태로 함유하는 약제학적 제제.
  64. 제63항에 따르는 약제학적 제제를 용해된 형태로 포함하는, 인슐린 활성을 갖는 주사 액제.
  65. 제64항에 있어서, ㎖당 아연 1㎍ 내지 2mg을 함유하는 주사 액제.
  66. 제65항에 있어서, ㎖당 아연 5㎍ 내지 200㎍을 함유하는 주사 액제.
  67. 작용 개시가 지연된 인슐린 활성을 갖는 약제학적 제제를 제조하기 위한, 제54항 내지 제58항 중의 어느 한 항에 따르는 인슐린-아연 복합체의 용도.
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