CZ301377B6

CZ301377B6 - Analogy inzulínu, zpusob jejich prípravy a farmaceutické prípravky obsahující tyto analogy

Info

Publication number: CZ301377B6
Application number: CZ20004525A
Authority: CZ
Inventors: Ertl@Johann; Habermann@Paul; Geisen@Karl; Seipke@Gerhard; Wollmer@Axel
Original assignee: Sanofi - Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1998-06-06
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2010-02-03
Also published as: ZA200006835B; NO20006177L; HUP0102217A2; AR019852A1; JP4402296B2; CA2330183A1; ATE334201T1; WO1999064598A3; JP2002517247A; CN1304450A; CZ20004525A3; CN1304450B; NO20006177D0; US6686177B1; EP1084248A2; PT1084248E; AU4145499A; HK1036808A1; DK1084248T3; HU228908B1

Abstract

Analogy inzulínu, které projevují zvýšené schopnosti vázat zinek, a také komplexy inzulínu se zinkem, které ve srovnání s humánním inzulínem mají opoždený úcinek. Zpusob prípravy techto analogu a jejich použití zejména pro výrobu farmaceutických prípravku k lécení Diabetes mellitus I. a II. typu.

Description

Analogy inzulínu, způsob jejich přípravy a farmaceutické přípravky obsahující tyto analogy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká analogů inzulínu, které projevují zvýšené schopnosti vázat zinek, a také komplexů inzulínu se zinkem, které ve srovnání s humánním inzulínem mají opožděný profil účinku. Dále se vynález týká způsobů přípravy těchto analogů ajejich použití zejména ve io farmaceutických přípravcích k léčení Diabetes mellitus I. a II. typu.

Dosavadní stav techniky i? Celosvětově trpí onemocněním Diabetes mellitus asi 120 milionů lidí. Z toho asi 12 milionů lidí trpí diabetem I. typu, přičemž pro tyto diabetiky představuje v současné době jedinou možnou terapií substituční léčba nahrazující chybějící endokrinní sekreci. Postižení lidé jsou celoživotně, zpravidla několikrát denně, závislí na inzulínové injekci. Ve srovnání stím diabetes II. typu neznamená zásadní nedostatek inzulínu, avšak přesto v mnohých případech, zejména v pokroči20 lém stadiu, léčení inzulínem, případně v kombinaci s perorálními antidiabetiky, představuje účinnou formu terapie.

U zdravých jedinců je uvolňování inzulínu z pankreatu přísně svázáno s hladinou glukózy v krvi. Zvýšená glykémie, ke které dochází pojidle, je urychlené kompenzována odpovídajícím zvýše25 ním sekrece inzulínu. V lačném stavu klesá hladina inzulínu v plazmě na bazální hodnotu, která je dostatečná k tomu, aby bylo zajištěno kontinuálně zásobování glukózou orgánů a tkání vnímavých k inzulínu a přitom produkce glukózy v játrech byla v noci udržována na nízké úrovni. Náhrada tělu vlastní sekrece inzulínu exogenním inzulínem, většinou dodávaným subkutánní injekcí, se však kvalitou zpravidla nepřibližuje výše popsané fyziologické regulaci krevní glukoso zy. Často dochází k vychýlení hladiny glukózy v krvi směrem dolů nebo nahoru, což se v těžších případech může stát faktorem ohrožujícím život. Kromě toho po léta zvýšená hladina krevní glukózy bez počátečních příznaků představuje zvýšené zdravotní riziko. Rozsáhlá studie DCCT v USA (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, 1993, N. Engl. I Med. 329: 977-986) jasně ukázala, že chronické zvýšení glykémie je významně zodpovědné za rozvoj pozdních diabetických poškození. Tato pozdní diabetické poškození představují mikro- a makrovaskulámí poškození, která se manifestují jako různé retino-, nefro- a nebo neuropatie vedoucí k oslepnutí, selhání ledvin a ztrátě končetin, a jsou spojeny se zvýšeným rizikem srdečních a oběhových onemocnění. Z výše uvedeného je zřejmé, že terapie diabetů musí v první řadě být zacílena na to, aby byla udržena hladina krevní glukózy ve fyziologických mezích. Podle konceptu intenzivní inzulínové terapie je toho dosaženo pomocí injekcí rychle a pomalu působících inzulínových přípravků aplikovaných několikrát denně. Rychle působící přípravky se podávají současně s jídlem, aby se vyrovnal postprandiální vzestup krevní glukózy. Pomalu působící přípravky se podávají k udržení základního přísunu inzulínu, zejména k zabezpečení přes noc, aniž by došlo k hypoglykémii.

V současnosti užívané základní inzulínové přípravky tyto požadavky splňují jen nedokonale. Zejména Často užívané NPH-inzulíny projevují významné maximum účinnosti a přitom mají krátkodobý účinek. To při večerní aplikaci přináší nebezpečí noční hypoglykémie a ranní hyperglykémie.

Z Evropského patentu EP 0 821 006 jsou známy analogy inzulínu se zvýšenou schopností vázat zinek, které mají ve srovnání s humánním inzulínem prodloužený profil účinku. Tyto analogy se liší od humánního inzulínu změnou aminokyseliny v pozici A21 řetězce A a adicí histidinových zbytků nebo peptidu s 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, v nichž je 1 až 5 histidinových zbytků, na pozici B30 v řetězci B inzulínu.

- 1 CZ 301377 B6

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu bylo připravit další nové analogy (analogy humánního nebo zvířecího inzulínu), které mají zvýšenou schopnost vázat zinek, vytvářejí stabilní komplex obsahující hexamer inzulínových analogů a zinku, a jeho výhodné použití pro subkutánní injekce, které ve srovnání s humánním inzulínem mají opožděný profil účinku, což umožňuje zlepšit terapii Diabetes mellitus I. a II. typu.

to Analogy inzulínu jsou odvozeny z inzulínů přírodního původu, zejména humánního inzulínu (sekvence id. č. 1: řetězec A humánního inzulínu, sekvence id. č. 2: řetězec B humánního inzulínu) nebo zvířecího inzulínu buďto substitucí, nebo delecí alespoň jednoho přirozeně se vyskytujícího aminokyselinového zbytku a/nebo adicí alespoň jednoho přirozeně se vyskytujícího aminokyselinového zbytku v řetězci A a/nebo řetězci B přirozeně se vyskytujícího inzulínu,

Vynález poskytuje analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl, který má vzorec (I):

(A1 -A5)-Cys-Cys- R8-R9-R10-Cys-Ser-L&u-R14-(A15-A19)-Cys-R2t

S (0 s

Z-R1 -R2-R3-R4-His-Leu-Cys- (B8-B18)

S

Cys-(B20-B29)-R30

I), kde (A1-A5) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích Al až A5 v řetězci A humánního (viz sekvence id. č. 1) nebo zvířecího inzulínu, (A 15—A19) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích Al5 až A19 v řetězci A humánního (viz sekvence id. č. 1) nebo zvířecího inzulínu, (B8-B18) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích B8 až B18 v řetězci B humánního (viz sekvence id. č. 2) nebo zvířecího inzulínu, (B2OB29) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích B20 až B29 v řetězci B humánního (viz sekvence id. č. 2) nebo zvířecího inzulínu,

R8jeThr nebo Ala,

R9 je Ser nebo Gly,

R10 je Ile nebo Val,

R14 je Tyr, His, Asp nebo Glu,

-2CZ 301377 B6

R21 je Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu nebo Gin,

Rl je libovolný geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, nebo není přítomen, neboje to atom vodíku,

R2 je Val, Ala nebo Gly,

R3 je Asn, His, Glu nebo Asp,

R4 je Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gin, Gly nebo Glu,

R30 je libovolný geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo -OH,

Z je peptidový zbytek obsahující 1 až 4 geneticky kódovatelné aminokyselinové zbytky, z nichž 1 až 4 jsou histidinové zbytky (His), přičemž platí podmínka, že analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl se neodlišuje od humánního inzulínu (viz sekvence id. č. 1 a sekvence id. č. 2) pouze díky změnám aminokyselinových zbytků v pozici R3 nebo společně v pozicích R3 a R21 nebo společně v pozicích R3 a R4 ve vzorci I.

Výhodné analogy inzulínu nebo jejich fyziologicky přijatelné soli jsou ty, kde

2. R8 je Thr, R9 je Ser a R10 je Ile,

3. Rl je Phe, His, Asn, Asp nebo Gly,

4. R30 je Thr, Ala nebo Ser,

5. R21 je Asn a Rl je Phe.

6. Dalším výhodným provedením předkládaného vynálezu je analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce I, který se vyznačuje tím, že R2 je Val, R3 je Asn a R4 je Gin.

Dále je výhodný analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce I, kde R14 je

7. Tyr,

8. His,

9. Asp, nebo

10 Glu.

Dále je výhodný analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce Ϊ, kde R30je

11. Thr,

12. Ala,

13. Ser, nebo

14. -OH.

Zvláště výhodný je analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce I, kde 40 Z je

15. His,

16. His-Ala- nebo

17. His-Ala-Ala45

K příkladům výhodných provedení analogů inzulínu podle předkládaného vynálezu dále patří:

-3CZ 301377 Bó

18. Analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce 1, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 3)

His Phe Vsi Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Va Cys Gly Glu Arg Gly Phs Phe Tyr Thr Pro Lys např. His(B0),des(B30)-humánní inzulín.

19. Analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce I, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id, č. 4) io

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe TyrThr Pro Lys Thr např. His(B0)-humánní inzulín.

20. Analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce 1, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 5)

His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr např. His(B-l),Ala(BO)-humánní inzulín nebo

21. Analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, podle vzorce I, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 6)

His Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr ₂₅ Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr např. HÍs(B-2),Ala(B-l),Ala(B0)-humánní inzulín.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy analogů inzulínu nebo jejich fyziologicky 30 přijatelných solí podle vynálezu, přičemž tento způsob obsahuje konstrukci rep li kováte 1 ného expresního vektoru, který obsahuje sekvenci DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu s obecnou aminokyselinovou sekvencí podle vzorce II:

Met-X²m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-Bia)-Cys-(B20-B29)-R30-X¹i,-Arg(A1 -A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21 (II) kde

X'„ je peptidový řetězec obsahující n aminokyselinových zbytků, přičemž n je celé číslo 0 až 34, 40 X²m peptidový řetězec obsahující m aminokyselinových zbytků, přičemž n je celé číslo 0 až 20, pje 0, 1 nebo 2,

R30 je libovolná geneticky kódovatelná aminokyselina nebo není přítomen, a

-4CZ 301377 B6

Z je peptidový zbytek obsahující 1 až 4 geneticky kódovatelné aminokyseliny obsahující 1 až 4 histidinových zbytků (His) a zbývající proměnné mají stejný význam jako v předchozím vzorci I, stejně tak jako platí předchozí pravidla, a dále způsob obsahuje expresi v hostitelských buňkách a uvolnění analogů inzulínu zjejich prekurzorů chemickými a/nebo enzymatickými metodami.

Výhodné hostitelské buňky jsou baktérie, zejména pak baktérie E. coli. to

Výhodnými hostitelskými buňkami jsou také kvasinky, zvláště výhodné jsou buňky Saccharomyces cerevisiae..

Při expresi v E. coli vytvářejí tzv. fúzní proteiny (sekvence id. č. 7 až 9) zpravidla nerozpustné komplexy, tzv. inkluzní tělíska, která se po rozrušení buněk mohou izolovat centrifugací a pomocí chaotropních přísad (jako je např. 8M močovina nebo 6M guanidiniumchlorid) dále rozpouštět. Rozpuštěné fúzní proteiny se pak mohou podrobit sulfitolýze, při které jsou skupiny SH převedeny na S-sulfonátové skupiny (viz např. B. R. C. Marshall, A. S. Iglis, Practical Protein Chemistry - A Handbook, A. Darbre, 1986, str. 49-53). Tím se zlepší rozpustnost fúzních protei20 nů a usnadní další čištění, např. pomocí aniontové výměnné chromatografie nebo gelové permeační chromatografie.

K převedení derivatizovaných fuzních proteinů na preproinzulín s nativní prostorovou strukturou a správně vytvořenými disulfidickými můstky (sestavení proteinu, „folding“) dojde ve zředěném vodném roztoku přidáním vymezeného množství SH-cinidla jako je např. merkaptoetanol, cystein nebo glutathion, a následně vzdušnou oxidací. Alternativně může být rozpuštěný, nederivatizovaný fúzní protein za podobných podmínek také sestaven přímo (viz Evropské patenty EP A 0 600372, EP A 0 668292).

Preproinzulín je pak převeden omezeným proteolytickým štěpením na biologicky aktivní inzulín. K tomu se může využít trypsin, který ze sloučeniny podle vzorce II odstraňuje presekvenci MetX²m-(Arg)p a štěpí peptidový řetězec X^-Arg, čímž odděluje řetězce A a B, Zpravidla sekvence X¹ začíná Arg, Arg₂ nebo vůbec není (n=0), takže po štěpení je k dispozici derivát inzulínu, který je na C-konci řetězce B prodloužen o Arg nebo Arg₂, Tyto aminokyseliny mohou být odstraněny karboxypeptidázou B. Tryptické štěpení lze provést zvýšením koncentrace trypsinu nebo prodloužením reakční doby, takže je navíc štěpen Lysin(B29). V tomto případě vznikne derivát (B30)-inzulín. Inzulínové analogy získané štěpením je pak možné purifikovat standardními chromatografickými postupy (iontová výměnná chromatografie nebo chromatografie s reverzní fází) a nakonec izolovat vysrážením, krystalizací nebo jednoduše lyofilizací.

Prekurzor analogu inzulínu má výhodně sekvenci (sekvence id. č. 7)

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val GIu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly GIu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg GIu Ala GIu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val GIu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu GIu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu GIu Asn Tyr Cys

Asn

-5CZ 301377 Bó např. sekvenci His(BO)-preproinzulín, nebo sekvenci (sekvence id. č. 8)

Met AJa Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser AJa Arg

His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Va! Gly Gin Val Glu Leu Gly Giy Gly Pro Gly Ala

Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Gíu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys

Asn např. sekvenci desHis(Bl),Ala(BO)--preproinzulín, nebo sekvenci (sekvence id. č. 9)

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Va) Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Gíu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys

Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn io např. sekvenci desHis(B-2),Ala(B-l),Ala(B0)-preproinzulín.

Předkládaný vynález se dále týká prekurzorů inzulínových analogů podle vynálezu, zejména prepropinzulínu, sekvence DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu podle vynálezu, expresního vektoru, který obsahuje sekvenci DNA kódující prekurzor analogu inzulínu podle vynálezu, a také se týká hostitelských buněk, které jsou transformované takovým expresním vektorem.

Dále se předkládaný vynález týká farmaceutického přípravku, který obsahuje alespoň jeden inzulínový analog podle vynálezu a/nebo alespoň jednu jeho fyziologicky přijatelnou sůl.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu obsahuje analog inzulínu podle vynálezu a/nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl v rozpuštěné, amorfní nebo krystalické formě.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu obsahuje případně pomocné depotní látky, např. protaminsulfát, přičemž analog inzulínu, a/nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl je ve formě společně krystalizované např. s rotaminsulfátem.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu případně obsahuje navíc nemodifikovaný humánní inzulín a/nebo další analogy inzulínu, např. Gly(A21} - Arg(B3 l)-Arg(B32)-humánní inzulín.

Předkládaný vynález se dále týká injikovatelného roztoku s inzulínovou aktivitou, ktefy obsahuje farmaceutický přípravek podle vynálezu v rozpuštěné formě, s obsahem 1 pg až 2 mg zinku na 1 ml, zvláště výhodně s obsahem 5 až 200 pg zinku na 1 ml.

-6CZ 301377 B6

Vynález se dále týká použití analogů inzulínu a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí podle vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku, který projevuje inzulínovou aktivitu s opožděným nástupem účinku.

Cíl vynálezu byl dále splněn tím, že vynález poskytuje komplex inzulín-zinek, obsahující hexamer inzulínu a 4 až 10 iontů zinku najeden hexamer, přičemž inzulínový hexamer obsahuje Šest molekul analogů inzulínu podle vzorce 1 (AI -A5)-Cys-Cys-R&-R9-R10-Cya-Sef-Uu-R14-{ AI 5-A19)-Cys-R21

I

0) s

Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys- (B8-B18)

S

CyS-(B20-B29)-R30 kde (A1-A5) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích Al až A5 v řetězci A humánního (viz sekvence id. č. 1) nebo zvířecího inzulínu, (A15-A19) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích A15 až A19 v řetězci A humánního (viz sekvence id. č. 1) nebo zvířecího inzulínu, (B8-B18) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích B8 až B18 v řetězci B humánního (viz sekvence id. č. 2) nebo zvířecího inzulínu, (B20-B29) znamená aminokyselinové zbytky v pozicích B20 až B29 v řetězci B humánního (viz sekvence id. č. 2) nebo zvířecího inzulínu,

R8 je Thr nebo Ala,

R9je Ser nebo Gly,

R10 je Ile nebo Val,

R14 je Tyr, His, Asp nebo Glu,

R21 je Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu nebo Gin,

R2 je Val, Ala nebo Gly,

R3 je Asn, His, Glu nebo Asp,

R4 je Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gin, Gly nebo Glu,

R30 je libovolný geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo -OH,

-7CZ 301377 B6

Z je peptidový zbytek obsahující 1 až 4 geneticky kódovatelné aminokyselinové zbytky, z nichž 1 až 4 jsou histidinové zbytky (His).

Výhodně komplex inzulín-zinek obsahuje 5 až 8 iontů zinku najeden inzulínový hexamer.

Výhodně komplex inzulín-zinek obsahuje inzulínový hexamer, který se skládá z šesti molekul analogu inzulínu podle výše uvedeného vzorce I podle vynálezu.

Komplex inzulín-zinek podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje řetězec B analogu inzuio línu podle vzorce I, který má sekvenci (sekvence id. č. 10)

Phe Val His Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Vsi Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr např. His(B3)-humánní inzulín, nebo obsahuje řetězec B analogu inzulínu podle vzorce I, která má sekvenci (sekvence íd. ě. 11)

Phe Val Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr např. Asp(B3)-humánní inzulín.

Předkládaný vynález se dále také týká farmaceutického přípravku, který obsahuje alespoň jeden komplex inzulín-zinek podle vynálezu a také farmaceutického přípravku, který obsahuje kyselý roztok alespoň jednoho analogu inzulínu a/nebo jeho fyziologicky přijatelné soli s odpovídajícím množstvím iontů zinku, které umožní vytvoření komplexu inzulín-zinek podle vynálezu, přičemž analog inzulínu a/nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl jsou výhodně výše uvedený analog podle vzorce I podle vynálezu nebo analog podle vzorce I, jehož řetězec B má sekvenci odpovídající sekvence id. ě. 3, 4, 5, 10 nebo 11.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu obsahuje komplex inzulín-zinek v rozpuštěné, amorfní jo a/nebo krystalické formě.

Předkládaný vynález se dále týká injikovatelného roztoku s inzulínovou aktivitou, který obsahuje farmaceutický přípravek podle vynálezu v rozpuštěné formě, s obsahem 1 pg až 2 mg zinku na 1 ml, zvláště výhodně s obsahem 5 až 200 pg zinku na 1 ml.

Vynález se dále týká použití analogů inzulínu a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí podle vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku, který projevuje inzulínovou aktivitu se zpožděným nástupem účinku.

Analogy inzulínu podle předkládaného vynálezu jsou biologicky aktivní a při subkutánní aplikaci slabě kyselého, čirého roztoku obsahujícího 80 pg Zn⁺⁺/ml (zinek/ml) psům projevují silně opožděný účinek. U analogů, kde je N-konec řetězce B prodloužen o histidin, tj. Hi$(B0), např. des(B30)-humánní inzulín (sekvence id. č. 3), je účinný profil silně závislý např. na množství přidaných zinecnatých iontů. Přípravek neobsahující zinek nemá žádný depotní účinek (celkový úěi45 nek po 6 až 8 hodin, viz příklad 8) a sotva se farmakodynamikou liší od běžného humánního inzulínu, přičemž po přidání zinecnatých iontů (80 pg/ml) dochází k silnému opoždění/prodloužení účinku (celkový účinek po 16 hodin, viz příklad 8). Pozorovaný depotní účinek je také mnohem výraznější než u NPH-inzulínů. Tyto analogy mají tudíž výhodu, že farmakodynamika je prostřednictvím obsahu zinku široce regulovatelná, což u normálního humánního inzulínu není možné. Je možné také získat přípravky s rychlým nástupem účinku stejně tak jako přípravky se středně nebo silně opožděným účinkem prostřednictvím změn v obsahu zinku. Tím je také možné

-8CZ 301377 B6 účinný profil přípravku uzpůsobit individuálním potřebám pacienta, a to buď použitím přípravku s odpovídajícím, předem nastaveným obsahem zinku, nebo smícháním přípravku s vysokým a nízkým obsahem zinku, které provede buďto lékař, nebo sám pacient.

Analogy inzulínu podle vynálezu mají ve srovnání s humánním inzulínem zvýšenou afinitu k iontům zinku.

Humánní inzulín ve vodném neutrálním roztoku vytváří hexamery, které prostřednictvím His(B10)-postranního řetězce komplexují dva zinečnaté ionty. Tyto dva ionty nelze odstranit dialýio zou proti vodnému neutrálnímu pufru. Za stejných podmínek váží analogy podle vynálezu více než 4 zinečnaté ionty. V případě His(B0)-des(B30)- a His(B3)-inzulínu je to 7 iontů zinku/hexamer a v případě Asp(B3)-ínzulínu bylo naměřeno 4,2 iontů zinku/hexamer (viz příklad 9).

Je známo, že v neutrálním roztoku zinek vytváří vysokomolekulámí shluky a vede k vysrážení 15 inzulínu. Po injekci slabě kyselého přípravku obsahujícího zinek, který obsahuje čirý rozpuštěný inzulín, dojde v důsledku neutralizace v podkožní tkáni k vytvoření komplexů inzulín-zinek a následně k precipitaci inzulínu. Z tohoto depotu se inzulín zase postupně uvolňuje do roztoku a dochází tak ke zpoždění účinku. Takové zpomalení účinkuje u humánního inzulínu velmi slabé, avšak u analogů inzulínu podle vynálezu k němu dochází na základě jejich zvýšené afinity k zinku. Zvýšená vazba zinku je tudíž základem výše popsaného opoždění účinku závislého na zinku.

Předkládaný vynález se tudíž netýká jen výše popsaných analogů inzulínu, ale také příslušných komplexů inzulín-zinek. Tyto komplexy se odlišují od komplexů humánního inzulínu se zinkem v tom, že mají vyšší podíl pevně vázaného zinku. Je tedy nasnadě, že je možné k vytvoření komplexů kromě zinku užít také jiné ionty přechodných kovů jako je např. kobalt nebo měď.

Příklady provedení vvnálezu

Příklad 1

Konstrukce plazmidu píNT345d, který kóduje variantu His(B3)-preproinzulínu

Patent US 5 358 857 popisuje plazmid pINT90d. DNA tohoto plazmidu sloužila jako výchozí materiál ke konstrukci plazmidu pINT345d, který má proti původnímu plazmidu pINT90d dvě nové vlastnosti. Za prvé kóduje analog preproinzulínu, který v pozici 3 řetězce B obsahuje aminokyselinu histidin místo asparaginu a bezprostředně před počátkem kódující sekvence nese sekvenci rozpoznávanou restrikčním enzymem BssH2, takže sekvence kódující 10 aminokyselin N-konce preproinzulínu může být snadno použita pro genové manipulace, když se přihlédne k štěpnému místu Dra3 v sekvenci preproinzulínu.

Pro konstrukcí plazmidu pINT345d byla DNA z plazmidu pINT90d po dvojitém naštěpení v pozici 284 bp a pozici 351 bp restrikčními enzymy NcolzDra3 rozdělena, takže byly získány 2 fragmenty. Po elektroforetickém rozdělení štěpné směsí byl izolován velký DNA fragment zbytkového plazmidu.

Tento DNA fragment byl pak v reakci s T4-DNA-ligázou spojen $ následujícím DNA frag50 mentem

-9CZ 301377 B6

Ncol

33SH2

31

32

KÍ3

34

35

36

5*~

c

ATG

GCA

ACA

TCA

ACA

GGA

AAT

TCG

GCG CGC

TTT

GTG

CAC

CAG

CAC

CTG

3'-

CGT

TGT

AGT

TGT

CCT

TTA

AGC

CGC GCG

AAA

CAC

GTG

GTC

GTG

GAC

B7 3β 39 ij Dra3 TGC GGC TCC CAC CTA - 3'

ACG CCG AGG GTG -5'

Ligační směsí byly transformovány kompetentní buňky E. coli K12 a transformované buňky byly vysety na NA-plotny obsahující 20 mg/1 ampicilinu. Plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C.

Ze vzniklých kolonií byla izolována plazmidová DNA a naštěpena restrikčním enzymem BssH2. Požadovaná DNA tím byla linearizována a tím se odlišila od DNA plazmidu pINT90d, která neobsahuje žádné štěpné místo pro BssH2 a tudíž není štěpena.

Odpovídající plazmidová DNA ze správného klonu byla označena píNT345d.

!0

Tato DNA byla použita jako výchozí materiál pro konstrukci variant preproinzulínu popsaných v následujících příkladech.

Příklad 2

Konstrukce plazmidu pINT342d, který kóduje variantu His(BOý-preproinzulínu

DNA z plazmidu pINT345d byla dvojitě naštěpena restrikčními enzymy Nco\ a Dra3 a po elek2o troforetickém rozdělení štěpné směsi byl izolován velký DNA fragment zbytkového plazmidu. Tento DNA fragment byl pak v reakci s T4-DNA-ligázou spojen s následujícím DNA fragmentem

His

Bl

32

33

34

35

BS

B7

BS

39

310

5'- CG CGC

CAC

TTT

GTT

AAC

CAG

CAC

CTG

TGC

GGC

TCC

CAC CTA

- 3'

3'- G

GTG

AAA

CAA

TTG

GTC

GTG

GAC

ACG

CCG

AGG

GTG

- 5**

S93H2 Hpal 1] Dral

Vznikl tak plazmid pINT324d, který se od výchozího plazmidu liší štěpným místem HpaL Tento plazmid kóduje variantu preproinzulínu, která obsahuje v pozici BO histidin.

Příklad 3

Konstrukce plazmidu pINT343d, který kóduje variantu His(B-l),Ala(BO)-preproinzulínu

DNA fragment zbytkového plazmidu z předchozího příkladu byl v reakci s T4-DNA-ligázou 35 spojen s následujícím DNA fragmentem

His

Ala

Bl

32

33

34

35

36

37

3S

39

310

311

CG CGC

CAC

GCT

TTT

GTT

AAC

CAG

CAC

CTG

TGC

GGC

TCC

CAC

CTA

- 3*

3'- G

GTC

CGA

AAA

CAA

TTG

GTC

GTG

GAC

ACG

CCG

AGG

GTG

- 5'

*3 33SH2 Hpal S Dra3

- 10CZ 301377 B6

Vznikl tak plazmid pINT343d, který se, stejně jako plazmid pINT342d, liší od výchozího plazmidu dodatečným štěpným místem Hpal.

Příklad 4

Konstrukce plazmidu p(NT344d, který kóduje variantu His(B-2),Ala(B-l), Ala(BO>preproinzulínu io DNA fragment zbytkového plazmidu z příkladu 2 byl v reakci s T4-DNA-ligázou spojen s následujícím DNA fragmentem

His

Ala

Bl

32

B3

B4

B5

36

37

33

B9

BIO 311

5*- CG CGC

CAC

GCT

TTT

GTT

AAC

CAG

CAC

CTG

TGC

GGC

TCC

CAC CTA^-

3*- G

GTG

CGA

AAA

CAA

TTG

GTC

GTG

GAC

ACG

CCG

AGG

GTG

h 3SSH2

Hpal

Jj Dra3

Vznikl tak plazmid pINT344d, který se liší od výchozího vektoru dodatečným štěpným místem Hpal.

Příklad 5

Exprese konstruktů kódujících varianty inzulínu

Plazmidy pfNT342d, 343d a 344d byly transformovány do buněk E. coli K12 W3110. Rekombinantní baktérie, které byly získány pro každou variantu, byly fermentovány podle příkladu 4 z patentu US 5 227 293 a byla tak získána požadovaná výchozí surovina pro každou z inzulínových variant.

Příklad 6

Příprava His(B0),des(B30)~inzulínu

Varianty proinzulínu byly exprimovány v E. coli podle příkladu 5 a pak izolovány ve formě inkluzních tělísek centrifugací po rozrušení buněk. Inkluzní tělíska byla rozpuštěna v močovině (8 mol/1), podrobena sulfitolýze a pak přečištěna pomocí aniontové výměnné chromatografie (na

Q-Sepharose) a gelové permeační chromatografie (na Sephacryi S 200). Pufr použitý pro chromatografii obsahoval 4M močovinu a 50mM Tris/HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl), pH 8,5. Následovala frakcionovaná eluce z iontoměniče pomocí gradientu 0 až 0,5 M NaCl. Koncentrace močoviny byla nakonec ultrafiltrací a ředěním snížena na hodnotu nižší než 1M a preproinzulín-S-sulfonát byl izolován vysrážením při pH 4, a nakonec byl precipitát vysušen.

Pro vytvoření správných dísulfidických můstků, které existují v přírodním inzulínu, byl preproinzulín-S-sulfonát v koncentraci 0,3 g/1 rozpuštěn v pufru obsahujícím 20mM glycin při pH

10,8, doplněn merkaptoetanolem (asi 25 až 50 mol/mol preproinzulínu) a míchán po celou noc při 4 °C. Vzorek byl nakonec pomocí kyseliny fosforečné upraven na pH 3,5 a centrifugován. Preproinzulín obsažený v supematantu byl pak úpravou pH na 8,2 přídavkem Tris (25mM) a poté přidáním trypsinu (1,5 mg/g preproinzulínu) převeden na inzulín. Průběh proteolytického štěpení byl sledován pomocí HPLC s reverzní fází. Asi po 6 hodinách obsahoval vzorek vysoký podíl

His(B0),des(B30)-inzulínu. Reakce byla ukončena okyselením na pH 3,5. Pak pokračovalo čištění analogů inzulínu pomocí iontové výměnné chromatografie (S-hyper-D, Sepracor) a chromatoCZ 301377 Bó graťie s reverzní fází (PLRP-S RP300, Polymer Laboratories). Iontová výměnná chromatografie se prováděla v pufru, který obsahoval 30% 2-propanol a 50mM kyselinu mléčnou (pH 3,5). Eluce navázaného inzulínu byla provedena pomocí lineárního gradientu 0 až 0,5M NaCl. Chromatografie s reverzní fází probíhala v 0.1% trifluoroctové kyselině, která se pro eluci míchala s rostoucím množstvím acetonitrilu. Produkt byl izolován vysrážením při pH 5,4 a pak lyofilizován.

Příklad 7 io

Formulace analogů inzulínu pro parenterální podávání

Přípravek podle vynálezu obsahuje 40, popřípadě 100 IE inzulínu (I ΪΕ odpovídá přibližně 6,2 nmol), 20 mg 85% glycerinu, 2,7 mg m-kresolu a případně zinek⁺⁺ (jako chlorid zinečnatý) ve vodném sterilním roztoku s pH 4.

Příklad 8

Účinný profil His(B0),des(B30)-inzulínu u psu

Každý ze šesti psů (Beagl) dostal subkutánní injekci přípravku se 40 U/ml (přípravek z příkladu 7) a udaným množstvím zinku. Dávka byla 0,3 IE/kg. V dalším průběhu pokusu byla v daných časových okamžicích měřena hladina glukózy v krvi. Hodnoty byly normovány v procentech ke každé výchozí hodnotě a vyneseny do následující tabulky.

ČAS (hod.)	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12
bez Zn	100	59	50	61	75	84	89	98	103	97	104	100
80 gg Zn++/ml	100	97	83	75	65	56	51	58	68	72	78	32

Příklad 9

Vazba zinku analogy inzulínu

Inzulínový přípravek (0,3mM inzulín, 0,13M NaCl, 0,1% Fenol, 100 pg/ml zinek⁺⁺ (jako chlorid 35 zinečnatý), 25mM Tris/HCl, pH 7,4) byl extenzívně dialyzován proti neutrálnímu pufru bez zinku (3 hodin proti 0,l5M NaCl, lOmM Tris/HCl pH 7,4 při teplotě místnosti, 72 hodin proti lOmM Tris/HCl pH 7,4 při 15 °C a ještě 16 hodin proti lOmM Tris/HCl pH 7,4 při 15 °C. Poté byl dialyzát odsát a analyzován. Koncentrace inzulínu byla stanovena pomocí HPLC s reverzní fází a koncentrace zinku byla stanovena atomovou absorpční spektroskopií. Hodnoty pro zinek byly korigovány podle obsahu zinku kontrolních vzorků, které neobsahovaly žádný inzulín.

- 12CZ 301377 B6

Vázání zinku variantami inzulínu

Inzulín	mol Zn/mol hexamerů
humánní inzulín	2,5
His <B3)-inzulín	6,9
Asp(B3)-inzulín	4,2
His(B0),des(B30)-inzulín	6,8

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

io (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární 15 (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

Cly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...30

-13CZ 301377 Bó (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

phe Val Asn Gin His Leu Cya Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

5 10 IS

Leu Vál Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin ίο (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1.,.30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 15 10 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE; 1...31 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser Hi3 Leu Val Clu Ala Leu 15 10 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

- 14CZ 301377 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...32 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:

His Ala Phe Val Asn Gin Hia Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 15 10 15

Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: I...33 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:

His Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Olu 15 10 15

Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 ’ 30

Thr (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 98 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární 45 (ii) TYP MOLEKULY: protein

- 15C7. 301377 B6 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...98 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:

Het

Ala

Thr

Ser

Thr

Cly

Asn

Ser

Ala

Arg

His

Phe

Val

Asn

Gin

1

5

10

15

His

Leu

Cys

Cly

Ser

HÍ3

Leu

Val

Clu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

20

25

30

Clu

Arg

Cly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lvs

Thr

Arg

Glu

Ala

Glu

Asp

35

40

45

Pro

Gin

Val

Cly

Gin

Val

Clu

Leu

Cly

Pro

Cly

Ala

Gly

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Clu

Cly

Ser

Leu

cm

Lvs

Arg

Gly

Zle

Val

65

70

75

SO

Clu

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Clu

Asn

Tyr

85

50

95

Cys Asn (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 99 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...99 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

Het 1

Ala

Thr

Ser 5

Thr

Gly

Asn

Ser

Ala 10

Arg

His

Ala

Phe

Val 15

Asn

Gin

His

Leu

Cys 20

Gly

Ser

His

Leu

Val 25

Clu

Ala

Leu

Tyr

Leu 30

Val

Cys

Cly

Glu

Arg 35

Gly

Phe

^y r

Thr 40

Pro

Lys

Thr

Arg

Arg 45

Glu

Ala

Glu

Asp

Pro 50

Cln

Val

Gly

Cln

Val 55

Clu

Leu

Cly

Gly

Gly 60

Pro

Gly

Ala

Glv

- 16CZ 301377 B6

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Lys

Arg

Gly

ile

65

70

75

80

val

Glu

Gin

cys

Tys

Thr

Ser Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

85

90

95

Tyr

Cys

Asn

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...100

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID.	Č. 9:
Het Ala Thr Thr	Ser Thr Gly Asn Ser	Ala Arg	His	Ala	Ala	Phe	Val
1	5	10				15
Asn Gin His Leu	Cys Gly Ser His Leu	Val Glu	Ala	Leu	Tyr	Leu	Val
20	25				30

Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala 35 40 45

Glu

As? Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Cly Gly Gly Pro Gly

Ala

50

55

Ó0

Gly

Ser

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

85

50

55

Asn Tyr Cys Asn 100 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-17CZ 301377 B6 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...30 5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:

Phe Val Hia Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ty 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:

Pne Val Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

- 18CZ 301377 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Analog inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, který má vzorec I

S-S (AVA5}-Cys-Cys-R8-R9*Rl0*Cy3-Ser-Leu-R14-{A15-A19}-Cys-R21

I

S (1) s

Z-R1-R

2-R3-R4-HÍs-L0U-Cys- (B8-B18)

Cys-(B20-B29)-R30 (i), kde io (A1-A5) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích Al až A5 v řetězci A humánního nebo zvířecího inzulínu, (A15-A19) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích A15 až A19 v řetězci A humánního nebo 15 zvířecího inzulínu, (B8-B18) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích B8 až B18 v řetězci B humánního nebo zvířecího inzulínu,

20 (B20-B29) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích B20 až B29 v řetězci B humánního nebo

zvířecího inzulínu, R8 je Thr nebo Ala, R9 je Ser nebo Gly, R10 je Ile nebo Val, R14 je Tyr, His, Asp nebo Glu, R21 je Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu nebo Gin, Rl je libovolný geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, nebo není přítomen, neboje to atom vodíku, R2 je Val, Ala nebo Gly, R3 je Asn, His, Glu nebo Asp, R4 je Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gin, Gly nebo Glu, R30 je libovolný geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek nebo -ΌΗ, Z je peptidový zbytek s I až 4 geneticky kódovatelnými aminokyselinovými zbytky, obsahující 1 až 4 histidinové zbytky (His),

- 19CZ 301377 Bó přičemž platí podmínka, že analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle vzorce I se odlišuje od humánního inzulínu nejen změnami aminokyselinových zbytků v pozici R3 nebo v pozicích R3 v kombinaci R21 nebo R3 v kombinaci s R4 podle vzorce 1.

5 2. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 1, kde R8 je Thr, R9 je

Ser a R10 je He.

3. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 1 nebo 2, kde Rl je Phe, His, Asn, Asp nebo Gly.
4. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde R30 je Thr, Ala nebo Ser.
5. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, 15 kde R21 je Asn a Rl je Phe.
6. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde R2 je Val, R3 je Asn a R4 je Gin.

20
7. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde RI4 je Tyr.
8. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde R14 je His.
9. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde R14 je Asp.
10. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, 30 kdeR14jeGlu,
11. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde R30je Thr.

35
12. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde R30 je Ala.
13. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde R30 je Ser.
14. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a 5 až 10, kde R30je-OH.
15. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, 45 kde Z je His.
16. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde Z je His-Ala.

50
17* Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle kteréhokoliv z nároků I až 14, kde Z je His-Ala-Ala.

-20CZ 301377 B6
18. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 15, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 3):

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ₅ Thr Pro Lys
19. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 15, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 4):

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ₁₀ Thr Pro Lys Thr
20. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 16, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 5):

His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Gtu Arg Gly Phe Phe _|5 Tyr Thr Pro Lys Thr
21. Analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 17, kde řetězec B má sekvenci (sekvence id. č. 6):

His Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe ₂₀ Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
22. Způsob přípravy analogu inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelné soli podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že obsahuje kroky konstrukce replikovatelného expresního vektoru, který obsahuje sekvenci DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu

25 s obecnou aminokyselinovou sekvencí podle vzorce II:

Met· X^zm (Arg)p-Z- R1 - R2- R3- R4- His- Leu· Cys-(B8- B18)-Cys-(B20· B29)-R30· X¹„- Arg· (A1 · A5)-Cys-Cys-RB-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21 II, kde

X‘_n je peptidový řetězec obsahující n aminokyselinových zbytků, přičemž n je celé Číslo 0 až 34, X²m peptidový řetězec obsahující m aminokyselinových zbytků, přičemž n je celé číslo 0 až 20,

35 pjeO, l nebo 2,

R30 je libovolný, geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, nebo chybí, a

Z je peptidový zbytek s 1 až 4 geneticky kódovatelnými aminokyselinami obsahující 1 až 4 histi40 dinových zbytků (His) a ostatní proměnné mají stejný význam jako v nároku 1, přičemž platí i podmínky z nároku 1, exprese v hostitelských buňkách a uvolnění analogů inzulínu z jeho prekurzoru chemickými 45 a/nebo enzymatickými metodami.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že hostitelská buňka je baktérie.

-21 CZ 301377 B6
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že baktérie je E. coli.
25. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že hostitelská buňka je kvasinka.

5
26, Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že kvasinka je Saccharomyces cerevisiae.
27. Způsob podle nároků 22 až 26 přípravy analogu inzulínu podle nároku 19, vyznačující se t í m , že prekurzor analogu inzulínu má sekvenci (sekvence id. č. 7):

io

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Va! Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pra Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
28. Způsob podle nároků 22 až 26 přípravy analogu inzulínu podle nároku 20, vyznačující se t í m , že prekurzor analogu inzulínu má sekvenci (sekvence id. č. 8):

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gtn Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
29. Způsob podle nároků 22 az 26 přípravy analogu inzulínu podle nároku 21, vyznačující se t í m , že prekurzor analogu inzulínu má sekvenci (sekvence id. č. 9):

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pra Lys Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pra Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu

Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys

Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
30. Prekurzor analogu inzulínu definovaný v nároku 22.

25
31. Prekurzor analogu inzulínu definovaný v nároku 27.
32. Prekurzor analogu inzulínu definovaný v nároku 28.
33. Prekurzor analogu inzulínu definovaný v nároku 29.
34. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu podle nároku 30.
35. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu podle nároku 31.

35
36. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu podle nároku 32.
37. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor analogu inzulínu podle nároku 33.

-22CZ 3U1377 Bť>
38. Expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 34.
39. Expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 35.
40. Expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 36.
41. Expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 37.

10
42. Izolovaná hostitelská buňka, která je transformována expresním vektorem podle kteréhokoliv z nároků 38 až 41.
43. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden analog inzulínu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21 a/nebo alespoň jednu jeho fyziologicky přijatelnou

15 sůl.
44, Farmaceutický přípravek podle nároku 43, vyznačující se tím, že analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl je v rozpuštěné, amorfní a/nebo krystalické formě.

20 45. Farmaceutický přípravek podle nároku 43 nebo 44, vyznačující se tím, že dále obsahuje depotní pomocné látky.

46. Farmaceutický přípravek podle nároku 45, vyznačující se tím, že depotní pomocná látka je protaminsulfát, přičemž analog inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl

25 tvoří s protaminsulfátem společný krystalizát.

47. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 43 až 46, vyznačující se tím, že navíc obsahuje nemodifikovaný humánní inzulín.

30 48. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 43 až 47, vyznačující se tím, že navíc obsahuje analog inzulínu.

49. Farmaceutický přípravek podle nároku 48, vyznačující se tím, že analog inzulínu je Gly(A21}-Arg(B31)-Arg(B32)-humánní inzulín.

50. Injikovatelný roztok sinzulínovou aktivitou, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 43 až 49 v rozpuštěné formě.

51. Inj ikovatelný roztok podle nároku 50, vyznačující se tím, že obsahuje 1 pg až

40 2 mg zinku na 1 ml.

52. Inj ikovatelný roztok podle nároku 51, vyznačující se tím, že obsahuje 5 až 200 pg zinku na 1 ml.
45 53. Použití analogu inzulínu a/nebo jeho fyziologicky přijatelné soli podle kteréhokoliv z nároků

1 až 21 k výrobě farmaceutického přípravku, který projevuje inzulínovou aktivitu s opožděným nástupem účinku.

54. Komplex inzulín-zínek, kteiý obsahuje inzulínový hexamer a 4 až 10 zinečnatých iontů na
50 každý inzulínový hexamer, přičemž inzulínový hexamer sestává ze šesti molekul analogu inzulínu vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21.
55. Komplex inzulín-zinek podle nároku 54, který obsahuje 5 až 8 zinečnatých iontů na každý inzulínový hexamer.

-23CZ 301377 B6
56. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden komplex inzulín-zinek podle kteréhokoliv z nároků 54 až 55.
57. Farmaceutický přípravek podle nároku 56, vyznačující se tím, že obsahuje

5 kyselý roztok.
58. Farmaceutický přípravek podle nároku 57, vyznačující se tím, že obsahuje kyselý roztok analogu inzulínu podle kteréhokoliv znároků 1 až 21 a/nebo jeho fyziologicky přijatelné soli společně s odpovídajícím množstvím zinečnatých iontů, které umožní vznik komio plexu inzulín-zinek podle nároku 54.
59. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 56 až 58, vy znač u j í cí se tím, že obsahuje komplex inzulín-zinek v rozpuštěné, amorfní a/nebo krystalické formě.

15
60, I nj ikovatelný roztok s inzulínovou aktivitou, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceutický přípravek podle nároku 59 v rozpuštěné formě.
61. Inj ikovatelný roztok podle nároku 60, vyznačující se tím, že obsahuje 1 pg až 2 mg zinku na 1 ml.
62. Injikovatelný roztok podle nároku 61, vyznačující se tím, že obsahuje 5 až 200 pg zinku na 1 ml.
63. Použití komplexu inzulín-zinek definovaného v nároku 54 nebo 55 k výrobě farmaceutické25 ho přípravku, který projevuje inzulínovou aktivitu s opožděným nástupem účinku.