PL222975B1 - Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny - Google Patents
Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insulinyInfo
- Publication number
- PL222975B1 PL222975B1 PL399287A PL39928712A PL222975B1 PL 222975 B1 PL222975 B1 PL 222975B1 PL 399287 A PL399287 A PL 399287A PL 39928712 A PL39928712 A PL 39928712A PL 222975 B1 PL222975 B1 PL 222975B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- insulin
- seq
- arg
- sk3r
- chain
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 460
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 81
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 81
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 226
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 226
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 208
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 51
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 43
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 43
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 34
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 26
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 claims description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 8
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 claims description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 30
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 11
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 abstract description 8
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 abstract description 7
- 229940100066 Long-acting insulin Drugs 0.000 abstract description 7
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 80
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 77
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 71
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 59
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 50
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 45
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 description 40
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 27
- 208000007241 Experimental Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 22
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 21
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 21
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 21
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 9
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 9
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 229960003948 insulin detemir Drugs 0.000 description 6
- 229940060975 lantus Drugs 0.000 description 6
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 6
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- 108010089308 Insulin Detemir Proteins 0.000 description 5
- 238000003639 Student–Newman–Keuls (SNK) method Methods 0.000 description 5
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- -1 insulin amino acids Chemical class 0.000 description 5
- UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N levemir Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=2C=CC=CC=2)C(C)C)CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 101150101866 SRR gene Proteins 0.000 description 4
- DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 238000012153 long-term therapy Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 4
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- KQRHTCDQWJLLME-XUXIUFHCSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)N KQRHTCDQWJLLME-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 3
- RUQBGIMJQUWXPP-CYDGBPFRSA-N Ala-Leu-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O RUQBGIMJQUWXPP-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036123 Far upstream element-binding protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710133942 Far upstream element-binding protein 2 Proteins 0.000 description 3
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 3
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011704 WAG rat Methods 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 108010054982 alanyl-leucyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- FAAHJOLJYDXKKU-ZHDGNLTBSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CN)C1=CC=C(O)C=C1 FAAHJOLJYDXKKU-ZHDGNLTBSA-N 0.000 description 2
- QEVHRUUCFGRFIF-UHFFFAOYSA-N 6,18-dimethoxy-17-[oxo-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methoxy]-1,3,11,12,14,15,16,17,18,19,20,21-dodecahydroyohimban-19-carboxylic acid methyl ester Chemical compound C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(C(=O)OC)C(OC)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100533283 Dictyostelium discoideum serp gene Proteins 0.000 description 2
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 101000802091 Homo sapiens Thyroid hormone-inducible hepatic protein Proteins 0.000 description 2
- 101800000120 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 description 2
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 2
- 101800000517 Leader protein Proteins 0.000 description 2
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102100035717 Serine racemase Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 102100034700 Thyroid hormone-inducible hepatic protein Human genes 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 101100323865 Xenopus laevis arg1 gene Proteins 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000003819 low-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 1
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N Ala-Leu-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- RDRMWJBLOSRRAW-BYULHYEWSA-N Asp-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O RDRMWJBLOSRRAW-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- LJRPYAZQQWHEEV-FXQIFTODSA-N Asp-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LJRPYAZQQWHEEV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- HRJLVSQKBLZHSR-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HRJLVSQKBLZHSR-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N Cys-Asn-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N Cys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N Gln-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KZEUVLLVULIPNX-GUBZILKMSA-N Gln-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N KZEUVLLVULIPNX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GNDJOCGXGLNCKY-ACZMJKKPSA-N Gln-Cys-Cys Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O GNDJOCGXGLNCKY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N Glu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JWNZHMSRZXXGTM-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- NBJAAWYRLGCJOF-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NBJAAWYRLGCJOF-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N Ile-Phe-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- KBDIBHQICWDGDL-PPCPHDFISA-N Ile-Thr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N KBDIBHQICWDGDL-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- 108010081368 Isophane Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000005237 Isophane Insulin Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LSPYFSHXDAYVDI-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LSPYFSHXDAYVDI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- MUMXFARPYQTTSL-BQBZGAKWSA-N Met-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O MUMXFARPYQTTSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N Thr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N Thr-Leu-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JAKHAONCJJZVHT-DCAQKATOSA-N Val-Lys-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JAKHAONCJJZVHT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N caninsulin Chemical compound [Zn].C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC3N=CN=C3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1C=NC=N1 LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010025376 glycyl-glutamyl-arginyl-glycyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól zawierający dwa polipeptydy tworzące łańcuch A i łańcuch B, charakteryzuje się tym, że określony jest wzorem ogólnym 1, gdzie X stanowi aminokwas zasadowy i oznacza lizynę lub argininę, zaś R oznacza obojętny aminokwas, wybrany spośród glicyny, alaniny, seryny lub treoniny, przy czym sekwencja aminokwasowa łańcucha A jest wybrana spośród SEQ ID Nr 1 do 4, natomiast sekwencja aminokwasowa łańcucha B jest wybrana spośród SEQ ID Nr 5 lub SEQ ID Nr 6, oraz, że analog insuliny ma punkt izoelektryczny o wartości od 6 do 8. Wynalazek obejmuje również kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym, zastosowanie analogu insuliny, sposób dawkowania oraz sposób leczenia cukrzycy. Rozwiązanie dotyczy związków stanowiących stabilne insuliny, aktywnych farmakologicznie, charakteryzujących się przedłużonym, płaskim, bezszczytowym przebiegiem stężenia glukozy podczas wielokrotnego podawania oraz nie wykazujących w tym czasie silnych dobowych wahań stężenia glukozy, czyli tzw. efektu "zębów piły".
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy związków stanowiących stabilne insuliny, aktywne farmakologicznie, charakteryzujących się przedłużonym, płaskim, prawdziwie bezszczytowym przebiegiem stężenia glukozy w czasie podczas wielokrotnego podawania oraz nie wykazujących w tym czasie silnych dobowych wahań stężenia glukozy, czyli tzw. efektu „zębów piły”. Wyniki badań związków objętych niniejszym zgłoszeniem wskazują na poprawę efektów terapii cukrzycy przez uniknięcie dotychczasowego negatywnego wpływu zmian stężenia glukozy w ciągu doby na organizm pacjenta, np. hipoglikemii nocnych, gdyż prawdziwie bezszczytowe insuliny długodziałające powinny odtwarzać w terapii prawidłowe, endogenne wydzielanie insuliny jakie na właściwym i stałym dobowym poziomie zabezpiecza zdrowa trzustka.
Insulina i jej rozmaite analogi są stosowane powszechnie w leczeniu cukrzycy. Niektóre z nich są wytwarzane w dużej skali przemysłowej. Chociaż znanych jest wiele różnych modyfikowanych pochodnych insuliny i zawierających je preparatów farmaceutycznych o różnych profilach działania, to stale poszukiwany jest lek, dzięki któremu możliwe byłoby utrzymywanie stałego, tzw. podstawowego poziomu glukozy w organizmie ludzkim w ciągu długiego okresu czasu, to jest w nocy i między posiłkami.
W terapii cukrzycy stosuje się różne analogi insuliny ludzkiej, wykazujące efekt przedłużonego działania. Modyfikacje pierwszorzędowej struktury insuliny prowadzą do zmiany właściwości fizykochemicznych i biologicznych analogów, a w konsekwencji do zmiany ich parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych.
Analogi insuliny o przedłużonym działaniu są nazywane bezszczytowymi lub prawie bezszczytowymi ze względu na ich parametry farmakokinetyczne i farmakodynamiczne. Istotną bowiem poszukiwaną cechą takich analogów insuliny jest utrzymywanie podstawowego poziomu glukozy w organizmie bez wykazywania wahań, a w szczególności bez występowania wyraźnych maksimów i minimów działania. Analogi o takiej charakterystyce najlepiej naśladują naturalną sekrecję insuliny, co zapobiega i redukuje incydenty szkodliwej hipoglikemii, szczególnie nocnej (Heter S, Kozlovski P, Kurtzhals P. Insulin's 85th anniversary - An enduring medical miracle. Diabetes Rasearch and Clinical Practice 2007; 78(2): 149-158).
Znane i stosowane w lecznictwie rekombinowane analogi insuliny ludzkiej o przedłużonym działaniu konstruuje się albo acylując grupę ε-aminową lizyny w pozycji B29 kwasem alifatycznym o kilkunastu atomach węgla, co powoduje powstanie powinowactwa do albuminy, albo wprowadzając do C-końca łańcucha B naturalnej insuliny dodatkowe zasadowe aminokwasy, co powoduje podwyższenie punktu izoelektrycznego do wartości powyżej 6. W tym drugim przypadku uzyskuje się w konsekwencji możliwość wytworzenia formy farmaceutycznej leku w postaci roztworu do to iniekcji w lekko kwaśnym środowisku, z którego substancja czynna wytrąca się po podaniu podskórnym i po zetknięciu z płynami ustrojowymi o pH ok. 7,4. Z takiego mikrodepozytu uwalnia się aktywna pochodna insuliny ze stałą, stosunkowo niską szybkością, czego efektem jest jej przedłużone działanie. Jednym z przykładów takiej pochodnej jest związek opisany w zgłoszeniu patentowym WO 2006/096079. Obok korzystnej zmiany właściwości farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, wynikającej z wprowadzenia dodatkowych zasadowych aminokwasów, obserwuje się jednak pogorszenie stabilności chemicznej tych analogów w roztworach o kwaśnym pH, wynikające przede wszystkim z zachodzącej w środowisku kwaśnym deamidacji asparaginy w pozycji A21. Problem ten rozwiązywany jest drogą wymiany A21Asn na inny aminokwas, taki m.in., jak kwas asparaginowy, glicyna, alanina, treonina i inne. Jednym z takich analogów Jest pochodna rekombinowanej insuliny ludzkiej, w której w łańcuchu A asparagina (A21Asn) została zastąpiona glicyną (A21Gly) oraz do C-końca łańcucha B zostały przyłączone dwie reszty argininy. Jest to tak zwana insulina glargine wytwarzana pod nazwą Lantus® (US 5656722). Inne stabilne pochodne, w których grupę karboksylową reszty A21Asn zabezpiecza się przez dodanie jednego aminokwasu w pozycji A22, opisano w WO 2010/002283 A2.
Pomimo istniejących rozwiązań stale trwają poszukiwania analogu insuliny, który nie będzie wykazywał niepożądanych efektów takich jak wyraźne wykazywanie maksimum działania pomimo tworzenia po podaniu podskórnym mikrodepozytu, gdyż jedynie stabilny i płaski profil działania zabezpiecza przed pojawieniem się nagłych wahań poziomu cukru we krwi i - co bardzo ważne - zapewnia uzyskanie korzystnych dla pacjenta wartości parametrów wyrównania cukrzycy (takich jak np.
PL 222 975 B1
HbA1C, którego stabilne poziomy zmniejszają ryzyko cukrzycowych powikłań makro- i mikroangiopatycznych) oraz, zabezpiecza przed poważnymi epizodami hipoglikemii, zwłaszcza nocnej. W przypadku istniejących rozwiązań obok korzystnej zmiany właściwości farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, wynikającej z wprowadzenia dodatkowych zasadowych aminokwasów, obserwuje się jednak pogorszenie stabilności chemicznej tych analogów w roztworach o kwaśnym pH.
Znane długodziałające analogi insuliny o budowie zbliżonej do związków objętych niniejszym zgłoszeniem, stanowiąc postęp w leczeniu cukrzycy, wykazują jednak kilka niepożądanych cech, na przykład stosowany szeroko w terapii analog insuliny - insulina glargine, pomimo tworzenia po podaniu podskórnym mikrodepozytu, wykazuje wyraźne maksimum działania (np. Heise T, Nosek L, R0nn BB, Endahl l, Heinemann L, Kapitza C, Draegeret E. Lower within-subject variability of insulin detemir in comparison to NPH insulin and insulin glargine in people with type 1 diabetes. Diabetes. 2004; 53(6): 1614-1620; Klein O, Lynge J, Endahl L, Damholt B, Nosek L, Heise T. Albumin-bound basal insulin analogues (insulin detemir and NN344): comparable time-action profiles but less variability than insulin glargine in type 2 diabetes. Diabetes Obes. Metab. 2007; 9(3), 290-299). Jednocześnie dla tego analogu obserwuje się w długotrwałej terapii (12 dni) efekt tzw. „zębów piły”, polegający na dużych różnicach pomiędzy maksymalnymi i minimalnymi poziomami glukozy w ciągu doby, świadczący o dużej zmienności działania tego związku (http://www.novonordisk.com/images/investors/investor presentations/2009/Piper Jaffray.pdf).
Drugi ze znanych i stosowanych w lecznictwie analogów długodziałających - insulina detemir, o odmiennej w stosunku do insuliny glargine budowie i innym mechanizmie przedłużonego działania, również nie jest prawdziwie bezszczytowa (Klein O, Lynge J, Endahl L, Damholt B, Nosek L, Heise T. Albumin-bound basal insulin analogues (insulin detemir and NN344): comparable time-acfion profies but less variability than insulin glargine in type 2 diabetes. Diabetess Obes Metab. 2007; 9(3), 290-291; Chaykin LB. Insulin Detemir and Its Unique Mechanism of Action, The Internet Journal of Endocrinology. 2007; 4(1), ISSN: 1540-2606, http://www.ispub.com/journal/the-internet-journal-of- endocrinology/volume-4-number-1/ insulin-detemir-and-its-unique-mechanism-of-action.html/). Analog ten charakteryzuje się także krótszym czasem działania (Porcellati F, Rossetti P, Busciantella NR, Marzotti S, Lucidi P, Luzio S, Owens DR, Bolli GB, Fanelli CG. Comparison of Pharmacokinetics and Dynamics of the Long-Acting Insulin Analogs Glargine and Detemir AT Steady State in Type 1 Diabetes: A double-blind, randomized, crossover study. Diabetes Care. 2007; 30/(10): 2447-2452).
Celem niniejszego wynalazku było uzyskanie związków stanowiących stabilne insuliny, aktywne farmakologicznie, charakteryzujących się przedłużonym, płaskim, prawdziwie bezszczytowym przebiegiem stężenia glukozy w czasie podczas wielokrotnego podawania (4 tygodnie) oraz nie wykazujących w tym czasie silnych dobowych wahań stężenia glukozy, czyli tzw. efektu „zębów piły”. Żaden z dotychczas znanych i opisanych długodziałających analogów insuliny nie wykazuje takiego pożądanego i korzystnego dla pacjenta - połączenia parametrów działania. Jednocześnie nowe analogi insuliny, objęte niniejszym zgłoszeniem, wykazują dodatkowe, potencjalnie korzystne właściwości farmaceutyczne, np. stabilność odpowiednią do tworzenia trwałych form farmaceutycznych leku. Badania nowych analogów insuliny, jak i ich form farmaceutycznych, wskazują na ich bardzo korzystne parametry farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, obserwowane podczas długotrwałej terapii, a także wykazują, że ich stabilność chemiczna jest równie dobra, jak stabilność insuliny ludzkiej oraz znanych i stosowanych w terapii jej analogów i jest zdecydowanie lepsza od wielu znanych pochodnych insuliny, np. opisanych w zgłoszeniu WO 2010/002283 A2.
Określony powyżej cel został nieoczekiwanie osiągnięty w niniejszym wynalazku. W tym przypadku zależność aktywności od budowy, powodująca przedłużone działanie oraz płaski dobowy profil działania po podaniu wielokrotnym i odpowiednią dla leku stabilność, działając synergistycznie przewyższa oczekiwania, nie będąc sumą ani uśrednieniem działania biologicznego tych białek. Omawiane wymagania spełniają analogi insuliny według wynalazku.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że przedłużony, płaski i prawdziwie bezszczytowy przebieg stężenia glukozy w czasie podczas wielokrotnego podawania oraz nie wykazujący w tym czasie silnych dobowych wahań profil gikemii wykazują pochodne insuliny ludzkiej, tworzące mikrodepozyt po podaniu podskórnym w postaci roztworu o lekko kwaśnym pH w wyniku zmniejszonej rozpuszczalności w obojętnym środowisku fizjologicznym, charakteryzujące się tym, że ich punkt izoelektryczny został podniesiony w porównaniu z insuliną ludzką przez zastąpienie asparaginy w pozycji 3 łańcucha B przez zasadowy aminokwas taki jak lizyna (B3Lys) lub arginina (B3Arg). Dodatkową zmianę punktu izoelektrycznego osiągnięto przez dodanie argininy do C-końca łańcucha B (831Arg). Stabilność tych
PL 222 975 B1 związków w środowisku słabo kwaśnym koniecznym do wytwarzania preparatów farmaceutycznych tych pochodnych w postaci roztworu osiągnięto przez przyłączenie dodatkowego obojętnego aminokwasu (w pozycji A22).
Nieoczekiwanie okazało się, że związki tego typu dawały w kolejnych dobach po osiągnięciu stanu równowagi praktycznie płaski dobowy przebieg krzywej stężenia glukozy we krwi w czasie, co umożliwia uzyskanie w przewlekłej terapii stałego, podstawowego poziomu glukozy, wiernie naśladującego naturalną sekrecję tego hormonu. Profil glikemiczny pozostaje w zasadzie niezmienny w przedziale dawkowania ustalonym w badaniach na 12 godzin, co obserwuje się w przypadku analogów będących przedmiotem niniejszego zgłoszenia.
Rozwiązanie ma więc na celu dostarczenie nowych analogów insuliny, które charakteryzują się pożądaną aktywnością biologiczną, tj. przedłużonym działaniem o stałym poziomie bez wytwarzania maksimum aktywności biologicznej, równoważnym z naturalną sekrecją podstawowego poziomu insuliny w zdrowym organizmie i zapewniającym stabilny poziom glukozy we krwi w czasie długotrwałej terapii (przy podawaniu 1 raz na dobę lub rzadziej), wykazując jednocześnie odpowiednią dla form farmaceutycznych leków stabilność chemiczną w kwaśnych roztworach iniekcyjnych o pH wartości od 3,5 do 5.
Według wynalazku, przykładami pochodnych o wzorze ogólnym są przedstawione poniżej insuliny, takie jak:
A22Gly-B3LyS-B31Arg - insulina ludzka (insulina GK3R)
A22Ala-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina AK3R)
A22Ser-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina SK3R)
A22Thr-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina TK3R)
A22Gly-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina 6R3R)
A22Ala-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina AR3R)
A22Ser-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina SR3R)
A22Thr-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina TR3R)
W opisie wynalazku, w świetle stosowanej terminologii, przez rekombinowaną proinsulinę rozumie się łańcuch polipeptydowy, w którym łańcuchy A i B insuliny ludzkiej są połączone łącznikiem C, który korzystnie stanowi dipeptyd Lys-Arg albo Arg-Arg, albo nawet samą pojedynczą resztę Arg. Jako rekombinowaną preproinsulinę uznaje się połączenie proinsuliny z dodatkowym polipeptydem liderowym, np. ubikwityną, lub SOD, lub ich fragmentami albo zmodyfikowanymi fragmentami.
Dla uproszczenia nazw analogów rekombinowanej insuliny ludzkiej oraz ich proinsulin (i preproinsulin), będących przedmiotem niniejszego wynalazku, przyjęto dla nich symbole składające się z nazwy: (pre)pro)insulina oraz kodu alfanumerycznego składającego sie z kilku znaków, oznaczających reszty aminokwasów dodatkowe lub wstawione zamiast obecnych w macierzystej (pre)pro)insulinie ludzkiej. W omawianym przypadku litery te są zgodne z uznanym w światowym piśmiennictwie jednoliterowym oznaczeniem reszt aminokwasowych.
Jednym z aspektów wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera efektywnie działającą ilość analogu insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej sol. Solą rekombinowanego analogu insuliny ludzkiej według wynalazku może być na przykład sól metalu alkalicznego lub sól amoniowa.
Generalnie, środkami pomocniczymi w kompozycjach według wynalazku są standardowo stosowane środki pomocnicze, takie same, jakie stosuje się w farmaceutycznych formulacjach białkowych, w tym insulin i ich analogów.
Substancją izotonizującą według wynalazku może być każda dopuszczalna w farmacji substancja, która pozwala na otrzymywanie roztworu izoosmotycznego w stosunku do osocza krwi ludzkiej. Do typowych środków izotonizujących stosowanych w farmacji należą takie jak chlorek sodowy, mannitol, glicyna i glicerol. Korzystne jest stosowanie glicerolu.
Użytecznymi czynnikami konserwującymi do stosowania w kompozycji według wynalazku są związki wybrane z grupy, do której należą m-krezol, fenol lub ich mieszaniny, zaś jako substancje przeciwdziałające agregacji analogów insuliny - polisorbaty lub alkilosacharydy.
Nowe analogi, podobnie jak rekombinowana insulina ludzka, korzystnie są stabilizowane dodatkiem jonów cynku, wprowadzanych do roztworu szczególnie korzystnie w postaci między innymi chlorku, octanu tub tlenku cynku.
PL 222 975 B1
Przedmiotem wynalazku jest analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól zawierający dwa polipeptydy tworzące łańcuch A i łańcuch B, charakteryzujący się tym, że określony jest wzorem ogólnym 1
Ρ-s
Gly-ii6-Val-Ghj-Gin-Cys-Cys-Thr-Ser-lle -Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu13 3 4 s e β a 10 ti 12 ts u 15 te
S i S Łańcuch A
Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-R
1? 18 18 20 21 22 g /
Phe-Val-X-Gln-His-Leti-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Vał-Glu-Ala-Leu-Tyr12 3 4 3 8 ? 8 8 10 11 12 13 14 1S 13
Leu-Val-Cy3-Giy-Glu-ArgGły-Phe-Phe-Tyr-Thr- Pro- Lys -Thr-Arg 17 I® 19 20 21 22 23 24 2S 28 2? 28 29 30 31
Łańcuch B (wzórl), gdzie X stanowi aminokwas zasadowy i oznacza lizynę lub argininę, zaś R oznacza obojętny aminokwas, wybrany spośród glicyny, alaniny, seryny lub treoniny, przy czym sekwencja aminokwasowa łańcucha A jest wybrana spośród SEQ ID Nr 1 do 4, natomiast sekwencja aminokwasowa łańcucha B jest wybrana spośród SEQ ID Nr i lub SEQ ID Nr 6, oraz, że analog insuliny ma punkt izoelektryczny o wartości od 6 do 8.
Korzystnie, gdy analog stanowi analog rekombinowanej insuliny ludzkiej.
Korzystnie, gdy sekwencje aminokwasowe są wybrane w taki sposób, że gdy X oznacza Lys, to R oznacza Gly albo Ala albo Ser albo Thr, natomiast gdy X oznacza Arg, to R oznacza Gly albo Ala albo Ser albo Thr.
Korzystnie, gdy X oznacza Lys to R oznacza Ser lub Ala.
Korzystnie, gdy sekwencje aminokwasowe łańcucha A i łańcucha B zostały wybrane spośród sekwencji SEQ ID Nr 1 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 2 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 3 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 4 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 1 z SEQ ID Nr 6, SEQ ID Nr 2 z SEQ ID Nr 6, SEQ ID Nr 3 z SEQ
ID Nr 6 lub SEQ ID Nr 4 z SEQ ID Nr 6.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym, charakteryzująca się tym, że zawiera analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól określony powyżej w ilości 1,3 mg/ml do 20 mg/ml, przy czym profil glikemiczny kompozycji pozostaje niezmienny w przedziale dawkowania ustalonym, w badaniach na co najmniej 12 godzin i, że w kolejnych dobach po osiągnięciu stanu równowagi utrzymywany jest płaski dobowy przebieg krzywej stężenia glukozy we krwi w czasie.
Korzystnie, gdy analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól zawarty jest w ilości 1,4 mg/ml do 10 mg/ml.
Korzystnie, gdy wykazuje przedłużone działanie o stałym poziomie bez wytwarzania maksimum aktywności biologicznej, farmakologicznie równoważnym z naturalną sekrecją podstawowego poziomu insuliny w zdrowym organizmie, wykazując jednocześnie odpowiednią dla form farmaceutycznych leków stabilność w kwaśnych roztworach iniekcyjnych o pH o wartości od 3,8 do 5.
Korzystnie, gdy dodatkowo zawiera od 0 do 60 μg/ml cynku, szczególnie korzystnie 10 do 60 μg/ml.
Korzystnie, gdy dodatkowo zawiera substancję izotonizującą, substancję konserwującą i ewentualnie substancję buforującą i ewentualnie substancje przeciwdziałające agregacji, stosowane w formulacjach białkowych.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest analog insuliny tub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli określony powyżej do leczenia cukrzycy u ssaków.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie analogu insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli określonego powyżej do wytwarzania leku o przedłużonym działaniu terapeutycznym do leczenia cukrzycy.
PL 222 975 B1
Korzystnie, gdy efektywnie działająca ilość leku na dawkę zawarta jest w przedziale 0,3 do 180 μg/kg masy ciała, przy czym lek podaje się raz na dobę lub rzadziej.
W celu lepszego zobrazowania wynalazku rozwiązanie przedstawiono na rysunku, gdzie:
Figura 1 przedstawia strukturę plazmidu p5/ZUlNSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) zawierającego gen kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR;
Figura 2 przedstawia strukturę plazmidu p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) zawierającego gen kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR;
Figura 3 przedstawia wykres zbiorczy obrazujący charakterystyczny dla bezszczytowych preparatów profil stężenia glukozy we krwi szczurów po jednorazowym podaniu insuliny SK3R w dawkach: 2,5 j./kg mc., 5 j./kg mc. i 7,5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej. Wartości średnie ± SEM;
Figura 4 przedstawia wykres stężenia glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine i grupą kontrolną. Wartości średnie ± SEM;
Figura 5 przedstawia wykres stężenia glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną GEKR i grupą kontrolną (wyniki wstępne). Wartości średnie ± SEM;
Figura 6 przedstawia wykres 12-godzinnych profili stężenia glukozy po 2 tygodniach podawania insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy treptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine. Wartości średnie ± SEM;
Figura 7 przedstawia wykres 12-godzinnych profili stężenia glukozy po 4 tygodniach podawania insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy treptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine. Wartości średnie ± SEM;
Figura 8 przedstawia wykres zbiorczy 12-godzinnych profili stężenia glukozy po 1, 2 i 4 tygodniach podawania insuliny SK3R w dawce 2x5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną GEKR w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę (wyniki wstępne). Wartości średnie ± SEM;
Figura 9 przedstawia indywidualne wykresy obrazujące różnice w kształcie 12- godzinnych profili stężenia glukozy we krwi małp z cukrzycą po jednorazowym podaniu insuliny SK3R i insuliny AKR w dawce 1 j./kg mc., gdzie: M128, M210, F143, F156, M51 - numery i kody zwierząt w badaniu;
Figura 10 przedstawia wykresy obrazujące różnice w kształcie 24-godzinnych średnich profili stężenia glukozy we krwi psów Beagle po jednorazowym podaniu insuliny SK3R i insuliny AKR w dawkach 0,5 j./kg mc. i 1 j./kg mc.
Figura 11 przedstawia wykres zbiorczy obrazujący charakterystyczny dla bezszczytowych preparatów profil stężenia glukozy we krwi szczurów po jednorazowym podaniu insuliny AK3R w dawkach: 2,5 j./kg mc., 5 j./kg mc. i 7,5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej. Wartości średnie ± SEM.
Figura 12 przedstawia wykres stężenia glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny AR3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine i grupą kontrolną. Wartości średnie ± SEM;
Figura 13 przedstawia wykres zbiorczy 12-godzinnych profili stężenia glukozy po 2 i 4 tygodniach podawania insuliny AK3R w dawce 1x5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej. Wartości średnie ± SEM;
Figura 14 stanowi porównanie dobowych profili stężenia glukozy po jednorazowym podaniu insuliny GKR, insuliny GEKR, insuliny AKR, insuliny GR oraz insuliny SK3R i insuliny AK3R w dawce 1 x 5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej. Wartości średnie ± SEM;
Figura 15 przedstawia wyniki stabilności chemicznej (mierzone zmianą zawartości protein pokrewnych) dla produktów farmaceutycznych insuliny AK3R i insuliny SK3R w porównaniu do insuliny ludzkiej i wybranych znanych analogów długodziałających: insuliny lizarg (WO 2006/096079 A2) i insuliny GR (WO 201000/2283 A2);
Figura 16 przedstawia struktury przestrzenne monomerów insuliny ludzkiej oraz jej wybranych analogów, w tym insuliny SK3R wg wynalazku, wyznaczona na podstawie danych z NMR (International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49, 548-554 oraz dane własne niepublikowane).
Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o szczegółowe omówienie jego przykładowych realizacji
PL 222 975 B1
P r z y k ł a d y
Według wynalazku, przykładami pochodnych o wzorze ogólnym są przedstawione poniżej insuliny, takie jak:
A22Gly-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina GK3R)
A22Ala-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina AK3R)
A22Ser-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina SK3R)
A22Thr-B3Lys-B31Arg - insulina ludzka (insulina TK3R)
A22Gly-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina GR3R)
A22Ala-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina AR3R)
A22Ser-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina SR3R)
A22Thr-B3Arg-B31Arg - insulina ludzka (insulina TR3R)
Analogi insuliny będące przedmiotem wynalazku wytworzono wykorzystując standardowe metody inżynierii genetycznej. W tym celu skonstruowane zostały modyfikacje genu rekombinowanej proinsuliny ludzkiej przy wykorzystaniu technik genetycznych, takich jak np. reakcja miejscowospecyficznej mutagenezy. Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzano przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5), jako matrycę wykorzystywano DNA plazmidowe plGALZUlNS p5/ZUINS lub pIGTETZUINS - p6/ZUINS. Jako matrycę można również wykorzystywać dowolny inny DNA zawierający odpowiednią sekwencję kodującą rekombinowaną ludzką proinsulinę lub preproinsulinę.
Mieszaniną reakcyjną transformowano komórki kompetentne odpowiedniego szczepu Escherichia coli, jak np. DH5a, DH5, czy HB101, przy czym - zgodnie z ideą wynalazku - możliwe jest wykorzystanie komórek innych szczepów E. coli lub komórek innych mikroorganizmów albo innych znanych linii komórkowych nadających się do ekspresji białek rekombinowanych. Plazmid zawierający określoną modyfikację genu rekombinowanej proinsuliny ludzkiej izolowano i sekwencjonowano, w celu sprawdzenia poprawności sekwencji nukleotydowej. Zgodnie z wariantem wynalazku plazmid ze zmodyfikowanym genem rekombinowanej proinsuliny ludzkiej stosowano do transformacji komórek kompetentnych E. coli DH5a i przeprowadzano hodowlę bakteryjną na podłożu LB z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego (0,01 mg/ml) w objętości 500 ml, temperaturze 37°C, 200 obr/min w czasie 18 godzin. Materiał bakteryjny kierowano do banku szczepów, próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej i 40% glicerolu zdeponowano w temperaturze - 70°C.
Wytwarzane na drodze ekspresji w szczepach E. coli warianty rekombinowanej preproinsuliny izolowano po rozbiciu komórek w postaci ciałek inkluzyjnych, które następnie poddawano standardowym procesom czyszczenia białek fuzyjnych. Uzyskane po renaturacji białko hybrydowe z analogiem insuliny (preproinsulinę) lub proinsulinę poddawano kontrolowanemu działaniu trypsyny, analogicznie jak w przypadku szeregu metod znanych uprzednio i opisanych (np. Kemmler W, Peterson JD, Steiner DF. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B, J. Biol. Chem. 1971: 246: 6786-6791 oraz patenty US 6686177 i US 6100376). Otrzymane analogi insuliny poddawano procesowi oczyszczania przy zastosowaniu znanych metod, przede wszystkim chromatografii niskociśnieniowej, ultrafiltracji i/lub HPLC, Z oczyszczonego w dostatecznym stopniu roztworu analogu insuliny wytrącano substancje, korzystnie z dodatkiem jonów metalu, szczególnie korzystnie cynku, w celu uzyskania postaci krystalicznej.
Podstawową właściwością fizykochemiczną analogów rekombinowanej insuliny ludzkiej według wynalazku, która odróżnia je od insuliny ludzkiej, jest wartość ich punktu izoelektrycznego, wynosząca od 6 do 8. Oznacza to dobrą rozpuszczalność związków w roztworach o pH kwaśnym do słabo kwaśnego. Właściwość ta pozwoliła na przygotowanie kompozycji - roztworów nowych pochodnych insuliny w pH kwaśnym.
Dla kompozycji farmaceutycznej według wynalazku wartość pH roztworu wynosi od około 3,5 do około 5, korzystnie 4,0-4,5.
Struktury cząsteczki insuliny ludzkiej i analogów, zawierające ten sam rdzeń ugrupowania białkowego przedstawione powyżej różnią się między sobą. Labilność niezdefiniowanego końcowego fragmentu łańcucha B insuliny SK3R, który jest mniej ruchliwy w porównaniu do insuliny A22GlyB31Arg - insuliny ludzkiej, czyli tzw. insuliny GR (WO 201000/2283 A2), ma także wpływ na właściwości związku według wynalazku, w tym zwiększoną stabilność chemiczną i działanie biologiczne tego analogu.
Opracowano przykładowy następujący skład kompozycji zawierających rekombinowane pochodne insuliny ludzkiej według wynalazku: 10-500 j./ml rekombinowanego analogu insuliny ludzkiej
PL 222 975 B1 lub jego farmakologicznie dopuszczalna sól, 16 mg/ml glicerolu, 3 mg/ml m-krezolu, 10-60 μg/ml cynku oraz woda do iniekcji do 1 ml. Ilość zastosowanej w kompozycji według wynalazku substancji aktywnej wynosi około 1-1600, korzystnie 10-1200, szczególnie korzystnie 10-500 j./ml. W przypadku każdego analogu insuliny ludzkiej, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, przez 1 jednostkę (1 j.) rozumie się 1 jednostkę umowną, zawierającą taką samą ilość moli analogu, co 1 jednostka międzynarodowa insuliny ludzkiej, odpowiadająca ilości 6 nmoli (czyli 6 x 10-9 mola).
Aspektem wynalazku jest też sposób leczenia pacjentów cierpiących na cukrzycę, według którego pacjentowi wymagającemu takiego leczenia podaje się efektywnie działającą ilość kompozycji farmaceutycznej zawierającej analog lub sól analogu insuliny według wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny SK3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B), kodujący rekombinowaną proinsulinę SRR, opisany w zgłoszeniu patentowym WO 2010/002283 A2, Przykład 3. W plazmidzie tym, fragment DNA kodujący prekursor rekombinowanej insuliny jest dołączony do zmodyfikowanego genu syntetycznej ubikwityny. Peptyd stanowiący część ubikwityny jest nośnikiem warunkującym dużą wydajność syntezy białka fuzyjnego w E. coli. Region kodujący modyfikowane białko fuzyjne umieszczono pod kontrolą promotora pms (WO05066344 A2). Plazmid posiada gen oporności na ampicylinę i jest pochodną wektora plGAL1 (Bank Genów AY424310). W genie ubikwityny kodony dla argininy zostały zamienione na kodony dla alaniny oraz do C-końca genu ubikwityny dołączony został dodatkowy kodon dla argininy.
Gen rekombinowanej proinsuliny SK3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny SRR tym, że kodon AAC (Asn) zamieniony jest na kodon AAA dla lizyny (Lys) w pozycji 3 w łańcuchu B. W celu zmodyfikowania sekwencji kodującej genu rekombinowanej proinsuliny SRR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej.
KSRL
5' GGTGGTCGTTTTGTCAAACAGCAC 3'
Lys
KSRP
5' ACCACACAGGTGCTGTTTGACAM 3'
Lys
Wykorzystując jako matrycę DNA plazmidowe p5/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B), przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5) przeprowadzono reakcję mutagenezy punktowej. Przy zastosowaniu znanych metod, mieszaniną reakcyjną transformowano komórki kompetentne Escherichia coli DH5a. Plazmid izolowano i sekwencjonowano w celu sprawdzenia obecności nukleotydów AAA kodujących lizynę oraz poprawności sekwencji plazmidu. Otrzymany plazmid p5/ZUINSSer(22A) Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) z genem rekombinowanej proinsuliny SK3RR zastosowano do transformacji komórek kompetentnych E. coli DH5a i przeprowadzono hodowlę bakteryjną w podłożu LB z dodatkiem ampicyliny (0,01 mg/ml) w objętości 500 ml, temperaturze 37°C, 200 obr/min w czasie 18 godzin. Przygotowano materiał bakteryjny do banku szczepów; próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej 140% glicerolu zdeponowano w temperaturze -70°C.
Uzyskany szczep Escherichia coli stanowi wyjściowy materiał biologiczny w procesie wytwarzania na drodze biosyntezy insuliny SK3R, zgodnie z Przykładem 13.
Konstrukcja genetyczna plazmidu p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) Plazmid p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) o wielkości 4775 par zasad jest zbudowany z następujących sekwencji regulatorowych oraz genów:
- od 374 pz do 1234 pz zlokalizowany jest gen oporności na ampicylinę AMP R,
- od 4158 pz do 4323 pz znajduje się region kodujący promotor pms,
- od 4327 pz do 4554 pz zawarta jest sekwencja kodująca modyfikowany gen ubikwityny syntetycznej ZUBI,
- od 4558 pz do 4722 pz znajduje się sekwencja kodująca gen rekombinowanej proinsuliny
SK3RR,
- od 4729 pz do 4775 pz zlokalizowany jest region kodujący terminator transkrypcji Ter.
Strukturę plazmidu p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) zawierającego gen kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR przedstawiono schematycznie na Fig. 1, zaś jego sekwencję nukleotydową i aminokwasową jako SEQ, No. 27.
PL 222 975 B1
P r z y k ł a d 2
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSGIy(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny GK3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR, otrzymany zgodnie z Przykładem 1. Gen rekombinowanej proinsuliny GK3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny SK3RR zamianą kodonu TCT (Ser) na kodon GGT dla glicyny (Gly) w pozycji 22 w łańcuchu A.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny SK3RR w sposób podany jak wyżej, zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
GLYP
5' TACTGCAATGGTTAAGTCGACTCTAGC 3'
Gly STOP
GLYL
5' GAGTCGACTTAACCATTGCAGTAGTT 3'
Gly
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSGIy(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
Uzyskany szczep Escherichia coli stanowi wyjściowy materiał biologiczny w procesie wytwarzania na drodze biosyntezy insuliny GK3R, zgodnie z Przykładem 11.
P r z y k ł a d 3
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSAIa(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny AK3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR, otrzymany zgodnie z Przykładem 1. Gen rekombinowanej proinsuliny AK3KK różni się od wyjściowego genu proinsuliny SK3RR zamianą kodonu TCT (Ser) na kodon GCT dla alaniny (Ala) w pozycji 22 w łańcuchu A.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny SK3RR w sposób podany jak wyżej, zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
ALAP
5' TACTGCAATGCTTAAGTCGACTCTAGC 3'
Ala STOP
ALAL
5' GAGTCGACTTAAGCATTGCAGTAGTT 3'
Ala
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5), Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSAla(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
Uzyskany szczep Escherichia coli stanowi wyjściowy materiał biologiczny w procesie wytwarzania na drodze biosyntezy insuliny AK3R, zgodnie z Przykładem 12.
P r z y k ł a d 4
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSThr(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny TK3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR, otrzymany zgodnie z Przykładem 1. Gen rekombinowanej proinsuliny TK3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny SK3RR zamianą kodonu TCT (Ser) na kodon ACC dla treoniny (Thr) w pozycji 22 w łańcuchu A.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny SK3RR w sposób podany jak wyżej, zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
PL 222 975 B1
THRP
5' TACTGCAATACCTAAGTCGACTCTAGC 3'
Thr STOP
THRL
5' GAGTCGACTTAGGTATTGCAGTAGTT 3*
Thr
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSThr(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
P r z y k ł a d 5
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSGIy(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny GR3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSGly(22A)Arg(31B)Arg(32B), kodujący rekombinowaną proinsuliną GRR, opisany w zgłoszeniu patentowym WO 2010/002283 A2, Przykład 2. Gen rekombinowanej proinsuliny GR3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny GRR zamianą kodonu AAC (Asn) na kodon GGT dla argininy (Arg) w pozycji 3 w łańcuchu B.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny GRR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
ARGP
5' TTTGTCCGTCAGCACCTGTGTGGTTCT 3'
Arg
ARGL
5' CAGGTGCTGACGGACAAAACGACCACC 3'
Arg
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSGIy(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg (32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
P r z y k ł a d 6
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSAIa(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny AR3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSGIy(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę GR3RR, otrzymany zgodnie z Przykładem 5. Gen rekombinowanej proinsuliny AR3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny GR3RR zamianą kodonu GGT (Gly) na kodon GCT dla alaniny (Ala) w pozycji 22 w łańcuchu A.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny GR3RR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
ALAP
5' TACTGCAATGCTTAAGTCGACTCTAGC 3'
Ala STOP
ALAL
5' AGAGTCGACTTAAGCATTGCAGTAGTT 3'
Ala
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSAIa(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1
P r z y k ł a d 7
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSSer(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny SR3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSGIy(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę GR3RR, otrzymany zgodnie z Przykładem 5. Gen rekombinowanej proinsuliny SR3RR różni się od wyjściowego genu
PL 222 975 B1 proinsuliny GR3RR zamianą kodonu GGT (Gly) na kodon TCT dla seryny (Ser) w pozycji 22 w łańcuchu A.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny GR3RR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
SERP
5' TACTGCAATTCTTAAGTCGACTCTAGC 3'
Ser STOP
SERL
5'AGAGT CGACTTAAGAATT GCAGTAGTT 3'
Ser
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSSer(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
Uzyskany szczep Escherichia coli stanowi wyjściowy materiał biologiczny w procesie wytwarzania na drodze biosyntezy insuliny SR3R, zgodnie z Przykładem 14.
P r z y k ł a d 8
Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSThr(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny TR3RR wykorzystano plazmid p5/ZUINSGIy(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę GR3RR, otrzymany zgodnie z Przykładem 5. Gen rekombinowanej proinsuliny TR3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny GR3RR zamianą kodonu GGT (Gly) na kodon ACT dla treoniny (Thr) w pozycji 22 w łańcuchu A.
W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję rekombinowanej proinsuliny GR3RR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
THRG
5' TACTGCAATACTTAAGTCGACTCTAGC 3'
Thr STOP
THRD
5' AGAGTCGACTTAAGTATTGCAGTAGTT 3'
Thr
Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p5/ZUINSThr(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
P r z y k ł a d 9
Konstrukcja plazmidu p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny SK3RR wykorzystano plazmid p6/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B), kodujący rekombinowaną proinsulinę SRR, opisany w zgłoszeniu patentowym WO 2010/002283 A2, Przykład 8. Gen rekombinowanej proinsuliny, podobnie jak w wektorze p5 (Przykład 1), jest dołączony do zmodyfikowanego genu syntetycznej ubikwityny oraz posiada gen oporności na tetracyklinę. Region kodujący modyfikowane białko fuzyjne umieszczony jest pod kontrolą promotora pms (zgłoszenie patentowe WO 05066344 A2).
Gen rekombinowanej proinsuliny SK3RR różni się od wyjściowego genu proinsuliny SRR zamianą kodonu AAC (Asn) na kodon AAA dla lizyny (Lys) w pozycji 3 w łańcuchu B. W celu zmodyfikowania sekwencji kodującej gen rekombinowanej proinsuliny SRR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
KSRL
5' GGTGGTCGTTTTGTCAAACAGCAC 3'
Lys
KSRP
5' ACCACACAGGTGCTGTTTGACAAA 3'
Lys
PL 222 975 B1
Wykorzystując jako matrycę DNA plazmidowe p6/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B), przy użyciu zestawu firmy Strategene (nr kat. 200518-5) przeprowadzono reakcję mutagenezy punktowej. Z wykorzystaniem znanych metod, mieszaniną reakcyjną transformowano komórki kompetentne Escherichia coli DH5a. Plazmid izolowano i sekwencjonowano w celu sprawdzenia obecności nukletydów AAA kodujących lizynę oraz poprawności sekwencji plazmidu. Plazmid p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) z genem rekombinowanej proinsuliny SK3RR zastosowano do transformacji komórek kompetentnych E. coli DH5a i przeprowadzono hodowlę bakteryjną w podłożu LB z dodatkiem ampicyliny (0,01 mg/ml) w objętości 500 ml, temperaturze 37°C, 200 obr/min w czasie 18 godzin. Przygotowano materiał bakteryjny do banku szczepów; próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej i 40% glicerolu zdeponowano w temperaturze -70°C.
Konstrukcja genetyczna plazmidu p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B)
Plazmid p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) o wielkości 4911 par zasad jest zbudowany z następujących sekwencji regulatorowych oraz genów:
- od 146 pz do 1336 pz zlokalizowany jest gen oporności na tetracyklinę TET R,
- od 4304 pz do 4469 pz znajduje się region kodujący promotor pms,
- od 4473 pz do 4703 pz zawarta jest sekwencja kodująca modyfikowany gen ubikwityny syntetycznej ZUBI,
- od 4704 pz do 4868 pz znajduje się sekwencja kodująca gen proinsuliny SK3RR,
- od 4875 pz do 4911 pz zlokalizowany jest region kodujący terminator transkrypcji Ter.
Strukturę plazmidu p6ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) zawierającego gen kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR przedstawiono schematycznie na Fig. 2, zaś jego sekwencję nukleotydową i aminokwasową jako SEQ. No. 28.
P r z y k ł a d 10
Konstrukcja plazmidu p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B) i uzyskanie transformowanego nim szczepu
W celu otrzymania genu rekombinowanej proinsuliny SK3R, posiadającego tylko jedną resztę argininową na końcu łańcucha B, wykorzystano plazmid p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) kodujący rekombinowaną proinsulinę SK3RR.
Gen rekombinowanej proinsuliny SK3R różni się od wyjściowego genu proinsuliny SK3RR delecją kodonu CGC (Arg) w pozycji 32 w łańcuchu B. W celu zmodyfikowania sekwencji kodującej gen rekombinowanej proinsuliny SK3RR w sposób podany jak wyżej zaprojektowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:
SARGL
5' ACTCCTAAAACACGTGGCATCGTT 3'
SARGP
5' AACGATGCCACGTGTTTTAGGAGT 3'
Wykorzystując jako matrycę DNA plazmidowe p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5) przeprowadzono reakcję mutagenezy punktowe.
Z wykorzystaniem znanych metod mieszaniną reakcyjną transformowano komórki kompetentne Escherichia coli DH5a. Plazmid izolowano i sekwencjonowano w celu sprawdzenia delecji nukleotydów CGC kodujących argininę oraz poprawności sekwencji plazmidu. Otrzymanie bakterii E. coli DH5a z plazmidem p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31 B) wykonano tak jak w Przykładzie 1.
P r z y k ł a d 11
Wytwarzanie insuliny GK3R
Insulinę GK3R wytwarzano w procesie biosyntezy realizowanym w sposób klasyczny (inokulum, hodowla posiewowa, hodowla produkcyjna), stosując szczep Escherichia coli zawierający fragment
DNA kodujący rekombinowaną proinsulinę GK3RR, skonstruowany zgodnie z Przykładem 2. Hodowlę 3 produkcyjną prowadzono w fermentorze 150 dm3 przez 20 godzin, w temperaturze 37°C, kontrolując pH, temperaturę, obroty mieszadła, gęstość optyczną, stężenie glukozy i napowietrzanie. W warunkach fermentacji preproinsulina GK3RR wytwarzana była wewnątrzkomórkowo, w ciałkach inkluzyjnych. Po zakończeniu fermentacji brzeczkę schładzano i zagęszczano, a pozostały materiał biologiczny odmywano z substancji mineralnych wchodzących w skład pożywki, po czym poddawano trawieniu lizozymem w buforze z Tritonem. Następnie prowadzono proces dezintegracji komórek i wytworzoną zawiesinę ciał inkluzyjnych wirowano, odmywano i powtórnie wirowano, uzyskując ostatecznie shomogenizowany osad ciał inkluzyjnych zawierających preproinsulinę GK3RR. Otrzymany homogenizat
PL 222 975 B1 3 rozpuszczano (10-15 mg/cm3) w roztworze wodorowęglanu sodu z dodatkiem EDTA, poddawano renaturacji i dla zabezpieczenia lizynowych grup aminowych poddawano odwracalnemu procesowi cytrakonylacji w reakcji z bezwodnikiem cytrakonowym. Rozpuszczone białko poddawano trawieniu trypsyną w celu odcięcia białka liderowego rozcięcia łańcuchów insuliny. W wyniku działania trypsyny otrzymywano insulinę GK3R. Otrzymane białko w roztworze poddawano oczyszczaniu za pomocą niskociśnieniowej chromatografii cieczowej na żelu DEAE Sepharose FF, po czym dokonywano decytrakonylacji i strącenia surowego białka z dodatkiem chlorku cynku. Surową insulinę GK3R poddawano oczyszczaniu za pomocą cieczowej chromatografii niskociśnieniowej na żelu Q Sepharose FF, a następnie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na żelu Kromasil RP C8 100A 13 μm. Z głównej frakcji wydzielano oczyszczoną insulinę GK3R w wyniku dokonania kolejno: wytrącenia z dodatkiem chlorku cynku, filtracji żelowej na złożu Sephadex G-25 i końcowej krystalizacji, przy użyciu octanu cynku.
Z jednej serii ciał inkluzyjnych otrzymano około 5,4 g krystalicznej insuliny GK3R, o czystości HPLC 99%.
Strukturę produktu potwierdziły następujące wyniki:
- masa cząsteczkowa oznaczana za pomocą spektroskopii masowej wynosi 6035 i jest zgodna z wartością teoretyczną (6035,0);
- mapa peptydowa: zgodna;
- sekwencja oraz skład aminokwasowy: zgodne z teoretycznymi.
P r z y k ł a d 12
Wytwarzanie insuliny AK3R
Postępując analogicznie jak w Przykładzie 11, przy zastosowaniu szczepu Escherichia coli zawierającego fragment DNA kodujący prekursor insuliny AK3R, skonstruowanego zgodnie z Przykładem 3, otrzymano z analogicznej porcji ciał inkluzyjnych 5,2 g insuliny AK3R, o czystości HPIC wynoszącej 88%.
Strukturę produktu potwierdziły następujące wyniki;
- masa cząsteczkowa oznaczana za pomocą spektroskop masowej wynosi 6049 i jest zgodna z wartością teoretyczną (6649,0);
- mapa peptydowa: zgodna,
- sekwencja oraz skład aminokwasowy: zgodne z teoretycznymi.
Punkt izoelektryczny wyznaczany metodą elektroforezy kapilarnej wynosi 7,0.
P r z y k ł a d 13
Wytwarzania insuliny SK3R
Postępując analogicznie jak w Przykładzie 11, przy zastosowaniu albo szczepu Escherichia coli zawierającego fragment DNA kodujący proinsulinę SK3RR, skonstruowanego zgodnie z Przykładem 1, bądź skonstruowanego zgodnie z Przykładem 9, albo przy zastosowaniu szczepu Escherichia coli zawierającego fragment DNA kodujący proinsulinę SK3R, skonstruowanego zgodnie z Przykładem 10, otrzymywano z analogicznej porcji ciał inkluzyjnych 5,0-6,2 g insuliny SK3R, o czystości HPLC wynoszącej 99%.
W każdym przypadku strukturę produktu potwierdziły następujące wyniki:
- masa cząsteczkowa oznaczana za pomocą spektroskopii masowej wynosi 6065 i jest zgodna z wartością teoretyczną (6065,0);
- mapa peptydowa: zgodna.
Punkt izoelektryczny wyznaczany metodą elektroforezy kapilarnej wynosi 7,0.
P r z y k ł a d 14
Wytwarzanie insuliny SR3R
Insulinę SR3R wytwarzano w procesie biosyntezy, stosując szczep Escherichia coli zawierający fragment DNA kodujący proinsulinę SR3RR, skonstruowany zgodnie z Przykładem 7. Proces biosyn3 tezy prowadzono w fermentorze 150 dm3 i otrzymany materiał biologiczny przerabiano stosując postępowanie analogiczne do opisanego w Przykładzie 11. Otrzymany homogenizat ciał inkluzyjnych poddawano kontrolowanej trypsynolizie, mającej na celu odcięcie białka liderowego i rozdęcie łańcuchów insuliny. Wszystkie te operacje, jak również oczyszczanie w kolejnych etapach, prowadzone były przy zastosowaniu postępowania podobnego do opisanego w Przykładzie 11.
Otrzymano z analogicznej porcji ciał inkluzyjnych 3,5 g insuliny SR3R, o czystości HPLC wynoszącej 97%.
PL 222 975 B1
Strukturę produktu potwierdziły następujące wyniki:
- masa cząsteczkowa oznaczana za pomocą spektroskopii masowej wynosi 6094 (przy wartości teoretycznej wynoszącej 6093,0);
- mapa peptydowa: zgodna.
P r z y k ł a d 15
Wytwarzanie produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml)
Wykonano 100 ml produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml) o następującym składzie, w przeliczeniu na 1,0 ml gotowego produktu:
- Insulina SK3R (Przykład 13) - 3,64 mg/ml (100 j./ml)
- m-krezol - 2,7 mg/ml
- Glicerol bezwodny - 16,0 mg/ml
- Cynk - 30,0 μg/ml
- Woda do iniekcji - do 1,0 ml pH 4,0
Otrzymaną mieszaninę filtrowano w jałowych warunkach przez filtr 0,22 μm i rozdozowano do wkładów 3 ml.
Stwierdzono, że produkt farmaceutyczny insulina SK3R roztwór (100 j./ml) wykazuje stabilność w teście stabilności przyspieszonej (Przykład 19).
P r z y k ł a d 16
Wytwarzanie produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml).
Wykonano 100 ml produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml) o następującym składzie, w przeliczeniu na 1,0 ml gotowego produktu:
- Insulina SK3R (Przykład 13) - 3,64 mg/ml (100 j./ml)
- m-krezol - 2,7 mg/ml
- Glicerol bezwodny - 16,0 mg/ml
- Cynk - 11,0 μg/ml
- Woda do iniekcji - do 1,0 ml pH 4,0
Otrzymaną mieszaninę filtrowano w jałowych warunkach przez filtr 0,22 μm i rozdozowano do wkładów 3 ml.
P r z y k ł a d 17
Wytwarzanie produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml).
Wykonano 100 ml produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml) o następującym składzie, w przeliczeniu na 1,0 ml gotowego produktu:
- Insulina SK3R (Przykład 13) - 3,64 mg/ml (100 j./ml)
- m-krezol - 2,7 mg/ml
- Glicerol bezwodny - 16,0 mg/ml
- Cynk - 11,0 μg/ml
- Polisorbat 20 - 20,0 mg/ml
- Woda do iniekcji - do 1,0 ml pH 4,0
Otrzymaną mieszaninę filtrowano w jałowych warunkach przez filtr 0,22 μm i rozdozowano do wkładów 3 ml.
P r z y k ł a d 18
Wytwarzanie produktu farmaceutycznego insulina AK3R roztwór (100 j./ml).
Wykonano 100 ml produktu farmaceutycznego insulina AK3R roztwór (100 j./ml) o następującym składzie, w przeliczeniu na 1,0 ml gotowego produktu:
- Insulina SK3R (Przykład 12) - 3,63 mg/ml (100 j./ml)
- m-krezol - 2,7 mg/ml
- Glicerol bezwodny - 16,0 mg/ml
- Cynk - 30,0 μg/ml
- Polisorbat 20 - 20,0 mg/ml
- Woda do iniekcji - do 1,0 ml pH 4,0
Sposób postępowania był identyczny jak w Przykładzie 15 z tym, że zamiast insuliny SK3R zastosowano insulinę AK3R (w ilości 363 mg, 10000 j).
PL 222 975 B1
Stwierdzono, że produkt farmaceutyczny insulina AK3R (100 j./ml) wykazuje stabilność w teście stabilności przyspieszonej (Przykład 19).
P r z y k ł a d 19
Badanie stabilności długoterminowej produktu farmaceutycznego insulina SK3R roztwór (100 j./ml) oraz insulina AK3R roztwór (100 j./ml)
Produkty farmaceutyczne: insulina SK3R roztwór (100 j./ml) oraz insulina AK3R roztwór (100 j./ml), wytworzone odpowiednio zgodnie z Przykładami 15 i 18, poddano badaniu stabilności długoterminowej.
W trakcie badania stabilności długoterminowej analizowano zawartość protein pokrewnych, substancji aktywnej oraz kowalencyjnych polimerów. Zmiana tych parametrów jest miarą stabilności chemicznej białka. Na Fig. 15 przedstawiono zmianę zawartości protein pokrewnych dla produktów farmaceutycznych insuliny AK3R i insuliny SK3R w porównaniu do insuliny ludzkiej i innych wybranych analogów długodziałających będących przedmiotem zgłoszeń WO 2006/096079 A2 i WO 201000/2283 A2.
P r z y k ł a d 20
Badanie aktywności insuliny SK3R na zwierzętach z doświadczalną cukrzycą
Badania na doświadczalnym modelu cukrzycy u szczurów WAG (indukcja streptozotocyną w dawce 38 mg/kg mc.) potwierdziły w niepodważalny sposób działanie hipoglikemizujące insuliny SK3R. Działanie to ma wyraźne cechy działania przedłużonego. Badaniami objęto w sumie grupę 109 szczurów szczepu WAG.
Po jednorazowym podaniu analogu SK3R stężenie glukozy we krwi szczurów obniża się stopniowo do wartości prawie normoglikemii (ok. 100 mg/dl), niezależnie od dawki (dawki badane: 2,5; 5 i 7,5 j./kg mc.). Średni czas pojawienia się stężenia maksymalnego wskazuje na wydłużoną absorpcję z miejsca podania. Maksymalne działanie hipoglikemiczne występuje od 1 do 6 godziny po podaniu analogu. Przebieg wykresu w tym czasie ma płaski kształt („plateau”), charakterystyczny dla bezszczytowych preparatów insuliny. Następnie, stężenie glukozy stopniowo wzrasta, osiągając wartości wyjściowe po 24 godzinach.
Preparatem odniesienia była w badaniach długo działająca insulina glargine (preparat Lantus). Statystycznie (Newman-Keuls, a = 0,05) stwierdzone istotne różnice w przebiegu profili glikemii po jednorazowym podaniu insuliny SK3R i insuliny glargine świadczą o nieco odmiennym profilu farmakodynamicznym obu insulin - profil analogu SK3R ma bardziej płaski i łagodny przebieg. Po podaniu wielokrotnym (2 razy na dobę w dawce 5 j./mc., przez 28 dni) insulina 5K3R powoduje trwale utrzymujące się na stałym poziomie obniżenie stężenia glukozy we krwi. Działanie to jest stabilne, czym różni się istotnie od działania preparatu referencyjnego - insuliny glargine. Dowodzi tego również uśredniona wartość współczynniki zmienności CV% kolejnych stężeń w profilach pomiędzy 14 a 28 dniem badania (tzn. po uzyskaniu stabilnego efektu), który dla analogu SK3R wynosi 11,3%, zaś dla insuliny glargine - 21,1%. Działanie insuliny SK3R jest przy tym istotnie silniejsze (potwierdzone statystycznie: Newman-Keuls, a = 0,05), co może sugerować większą aktywność biologiczną tej insuliny w porównaniu z insuliną glargine.
Wyznaczony po 2 i 4 tygodniach podawania wielokrotnego, 12-godzinny profil glikemii wykazał, że krzywa hipoglikemiczna w jednostkach czasu pomiaru (0,5-12 godzin) przebiega podobnie, niezależnie od terminu badania. Obserwacje te potwierdzają tezę o wyrównanym i niezwykle stabilnym efekcie hipoglikemizującym insuliny SK3R, zapewniającym utrzymanie jej stałego poziomu w organizmie w czasie długotrwałej terapii. Jest to cecha wyraźnie odróżniająca ją od insuliny glarginy, w porównaniu z którą prowadzono badania (stwierdzona istotność statystyczna w większości punktów badanych, a = 0,05).
Podobne do opisanych powyżej różnice w profilach działania można zauważyć porównując wyniki badań insuliny SK3R ze wstępnymi wynikami badań dla insuliny GEKR (przedstawicielem grupy związków objętych zgłoszeniem patentowym WO 2010/002283 A2, nie posiadających aminokwasu zasadowego Lys w pozycji B3). Na podstawie tych porównań można stwierdzić, że umieszczenie aminokwasu Lys w pozycji B3 całkowicie znosi silną i bardzo szybką składową efektu (która charakteryzuje całą grupę tych związków), wyraźnie przedłuża czas trwania efektu farmakologicznego i powoduje, że jest on niezwykle wyrównany w czasie długotrwałej terapii. Badania są kontynuowane.
Na podstawie przedstawionych wyników badań można stwierdzić, że analog SK3R posiada właściwości bezszczytowych insulin długodziałających i może mieć zastosowanie terapeutyczne jako insulina bazowa, podawana 1 raz na dobę. Jednocześnie insulina SK3R różni się zdecydowanie lep16
PL 222 975 B1 szym od dostępnych na rynku odpowiedników stabilnym i wyrównanym profitem hipoglikemicznym. W leczeniu cukrzycy tak wyrównany poziom stężenia insuliny w ciągu doby, naśladujący endogenną stałą sekretę z trzustki, jest szczególnie pożądany. Przypuszczalnie większa aktywność biologiczna analogu SK3R może pozwolić na obniżenie stosowanych dawek insuliny dla uzyskania oczekiwanego efektu, co poza zmniejszeniem ryzyka wystąpienia działań niepożądanych zależnych od dawki jest również korzystne ekonomicznie.
Wyniki przedstawiające stężenie glukozy we krwi szczurów po jednorazowym podaniu insuliny SK3R w dawkach: 2,5 j./kg mc., 5 j./kg mc. i 7,5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 1.
Zbiorczy wykres przedstawiający charakterystyczny dla bezszczytowych preparatów profil stężenia glukozy we krwi szczurów po jednorazowym podaniu insuliny SK3R w dawkach: 2,5 j./kg mc., 5 j./kg mc. i 7,5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, przedstawiono na Fig. 5.
Wyniki przedstawiające stężenie glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 2 i na Fig. 4 .
Wyniki wstępne przedstawiające stężenie glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną GEKR, przedstawiono w Tabeli 3 i na Fig. 5.
Wyniki przedstawiające 12-godzinne profile stężenia glukozy po 2 i po 4 tygodniach podawania insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 4 i na Fig. 6-7.
Wyniki wstępne przedstawiające 12-godzinne profile stężenia glukozy po 1, 2 i 4 tygodniach podawania insuliny SK3R w dawce 2x5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną GEKR, przedstawiono w Tabeli 5.
Zbiorczy wykres 12-godzinnych profili stężenia glukozy po 1, 2 i 4 tygodniach podawania insuliny SK3R w dawce 2x5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną GEKR, przedstawiono na Fig. 8 (wyniki wstępne).
PL 222 975 B1
Φ
Β
Ε ό
Ε ιη ι<
υ
Ε dB « S —· (Λ •Λ ΠΓ ?! S € 8 $ Ν gg φ
cr c co σι ν' Ł? ω 55 >>2 c nr = « 3 C (Λ
C Ν <0 3 &! >1 I»
C g* i g ο Ł Ο- u S •e 8
Ο
U ^Ν Φ <η ±= »
? >~ &
Φ ΰ ν ii ϋΓ
Αέ
ο) φ. Φ ο c .2 Φ C ν -δ S-£ ω -δ
| stężenie glukozy we krwi szczurów wartość średnia (mg/dl) ± SEM | czas pobierania krwi po podaniu jednorazowym preparatu | godziny | 24 | 462,6 ± 17,6 | 506,3 ±26,5 | 476,2 ±21,2 | 438,4 ± 17,6 | 427,3 ±37,3 | 482,0 ±27,4 | 513,7 ±17,0 |
| CM | 422,9 ±32,1 * | 537,0 ±15,6 | 393,9 ±26,8 Λ | 352,3 ±29,8 | 408,5 ±47,5 | 458,0 ±23,4 | 472,2 ± 17,1 | |||
| O | co r^S < CO co * CO -H | 464,6 ±54,2 | 261,3 ±28,6 Λ | 207,9 ±27,0 | 296,5 ±37,7 * Λ | 191,0 ±7,3 | 450,3 ±12,7 | |||
| 00 | 241,3 ±28,6 «Α | 387,7 ±45,9 | 186,5 ±26,9 * Λ | 86,0 ±10,2 | 188,1 ±27,6 Λ | 167,7 ±8,4 | 430,1 ±22,4 | |||
| <o | 165,0 ± 16,5 Λ | 234,6 ±49,1 | T OJ Ϊ.'· | 93,6 ±13,4 | 116,5 ±11,2 Λ | 128,1 ±9,2 | 407,7 ±19,2 | |||
| M· | 156,4 ±21,6 Λ | 122,7 ±31,8 | 171,7 ±17,9 *A | 69,7 ±5,6 | 131,5 ±19,4 A | 110,3 ±5,0 | 461,6 ± 17,4 | |||
| CM | 171,3 ±25,9 * Λ | co T- σ> r. _h | r- °_ o’ °o < o CM * OJ -H | V 0°. co <D OJ -H | I 154,5 ±28,6 * Λ | co co oj’ Τ CO +J | 475,6 ± 15,7 | |||
| 214,8 ±21,9 Λ | 220,3 ±23,5 | 224,7 ±23,5 Λ | 249,6 ±35,8 | 150,8 ±20,5 Λ | 173,0 ± 10,6 | 460,6 ± 12,2 | ||||
| 0,5 | 276,5 ±21,5 Λ | OJ CN_ oj' 00 OJ <O CM +| | 335,9 ± 15,5 * A | 412,9 ± 17,8 | 246,6 ±27,7 A | 303,0 ±20,7 | 493,6 ± 13,4 | |||
| hiperglike- mia utrwalona | O | 489,6 ± 19,7 | 496,3 ± 33,3 | 480,3 ± 16,0 | 487,4 ± 17,8 | 531,1 ± 15,4 | 519,0 ± 26,0 | Η σ> ο CN 00 ο ιθ | ||
| normo- glikemia | 86,8 ± 1,0 | H CD CO 3 | H O o‘ *00 | H CO CO 00 θ r- | •Η ιο 10 Τ00 | 81,3 ± 2,0 | Η | |||
| ilość szczurów w grupie | CM | in | h- | ο | Ο τ- | |||||
| dawka s.c. | D) ο ιη Ε CM | j? ££ o -E uf> | .s* .^4. υ ιο Ε r*- | 30 μΙ/ 300g mc. | ||||||
| badany preparat — | insulina SK3R | insulina glargine | insulina SK3R | insulina glargine | insulina SK3R | insulina glargine | kontrola | |||
| model cukrzycy | średniociężka (streptozotocyna - 38 mg/kg mc., i.m.) |
Oziom istotności (test Newmana-Keulsa): p < 0,05 insulina SK3R vs insulina glargine p < 0,05 insulina SK3R vs kontrola
PL 222 975 B1
Tabela 2. Stężenie glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniocięźkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną).
| stężenie glukozy we krwi szczurów wartość średnia (mg/dl, ± SEM | kolejne doby badania | M· | 137,9 ±2,7 *A | 262,7 ±22,7 | 502,6 ±15,4 | by badania | CO CM | 137,6 ±6,3 *A | 262,6 ±23,7 | 465,1 ±16,9 |
| co | 141,3 ±5,3 * Λ | 233,7 ±21,9 | 446,3 ±18,0 | h- CM | 144,2 ±3,0 *A _ | 324,0 ± 19,4 | 458,0 ±16,2 | |||
| CM | 138,2 ±5,4 * Λ | 230,0 ±22,6 | 499,4 ± 15,7 | CO CM | 139,9 ±4,7 AA | 338,3 ± 18,4 | 461,1 ±12,5 | |||
| - | 143,6 ±4,4 * Λ | 248,0 ±25,2 | 506,4 ± 13,2 | tO CM | 137,3 ±6,0 *A | 340,3 ± 18,3 | 466,0 ±10,1 | |||
| o | 166,2 ±9,0 * Λ | 209,4 ±22,6 | 491,8 ±20,0 | 24 | 134,3 ±4,8 *A | 322,8 ±26,6 | 464,8 ± 12,6 | |||
| cn | 155,5 ±8,4 * Λ | 232,8 ±20,9 | 497,5 ±25,3 | CM | 135,2 ±4,8 *A | 291,0 ±25,2 | 463,8 ±17,8 | |||
| co | 198,9 ±13,7 Α | 226,8 ±22,5 | 482,6 ± 12,3 | CM CM | 146,6 ±3,3 *A | 310,5 ±32,6 | 465,8 ±13,5 | |||
| r- | 173,4 ± 13,7 Λ | 210,7 ±17,9 | 507,8 ± 12,3 | kolejne doi | CM | 164,2 ±7,8 *A | 312,0 ±21,5 | 488,8 ±8,1 | ||
| CC> | 272,0 ±21,9 * Α | 209,3 ± 14,9 | 493,4 ±8,6 | O CM | 163,7 ±6,7 *A | 338,3 ±21,1 | 485,4 ±22,0 | |||
| 10 | 273,4 ±20,0 Α | 250,3 ±24,2 | 477,5 ± 10,8 | σ> | CM T- v- +1 | 336,9 ±16,4 | 496,0 ± 15,2 | |||
| t | 268,4 ± 19,1 Λ | 281,5 ±23,0 | 458,9 ±11,5 | 00 | 135,4 ±2,1 *A | 325,4 ±17,5 | 510,3 ± 12,1 | |||
| eo | 301,8 ±20,5 Λ | 292,4 ±30,2 | 459,3 ±12,5 | h- | 136,3 ±2,0 *A | 296,6 ±17,3 | 513,3 ±12,3 | |||
| CM | 363,6 ±21,1 Λ | 336,2 ±35,6 | 455,6 ± 13,8 | CO | 140,8 ±3,2 *A | 271,1 ± 19,8 | « r- CO CO | |||
| - | 433,9 ± 14,0 | 458,8 ±20,4 | 468,4 ±10,4 | m | 143,9 ±4,7 *A | 235,7 ±26,4 | UO ΓΜ cn co σ> -H | |||
| hiper- glikemia utrwalona | 496,3 ± 11,5 | 497,8 ± 13,0 | 480,9 ± 13,6 | hiper- glikemia utrwalona | 496,3 ± 11,5 | 497,8 ± 13,0 | 480,9 ± 13,6 | |||
| normo- glikemia | ο σ> σΓ ° Γ Ή | 82,7 ± 1,4 | 81,5 ±1,8 | normo- glikemia | 79,9 ±0,9 | CO -H | 81,5 ± 1,8 | |||
| ilość szczurów w grupie | CM | CM | CO | ilość szczurów w grupie | CM | CM | 00 | |||
| badany preparat | insulina SK3R 2x5 j./kg m.c./dobę | insulina glargine 2x5 j./kg m.c./dobę | kontrola 30 pl/300g m.c./dobę | badany preparat | insulina SK3R 2x5 j./kg mc./dobę | insulina glargine 2x5 j./kg mc./dobę | kontrola 30 pl/300g mc./dobę |
Poziom istotności: * p < 0,05 insulina ŚK3R 2x5 j./kg mc./dobę vs insulina glargine 2x5 j./kg mc./dobę Λ p < 0,05 insulina SK3R 2x5 j./kg mc./dobę vs kontrola
PL 222 975 B1
Tabela 3. Stężenie glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny SK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej
| stężenie glukozy we krwi szczurów wartość średnia (mg/dl) ± SEM | kolejne doby badania | 137,9 ±2,7 | 248,2 ±37,7 | 502,6 ±15,4 | kolejne doby badania I | 28 | 137,6 ±6,3 *A | 223,6 ±22,3 | 465,1 ±16,9 | |
| 141,3 ±5,3 | 250,9 ± 30,9 | 446,3 ±18,0 | H- CM | 144,2 ±3,0 •A | 221,3 ± 21,0 | 458,0 ±16,2 | ||||
| CM | 138,2 ±5,4 | 279,2 ±29,3 | 499,4 ± 15,7 | (O CM | 139,9 ±4,7 *A | 192,3 ±21,6 | 461,1 ±12,5 | |||
| 1“ | 143,6 ±4,4 | 295,2 ± 31,1 | 506,4 ±13,2 | W CM | 137,3 ±6,0 *A | 205,7 ±22,2 | 466,0 ±10,1 | |||
| O | 166,2 ±9,0 | 300,7 ±32,3 | 491,8 ±20,0 | M- CM | 134,3 ±4,8 *A | 218,8 ±22,9 | 464,8 ±12,6 | |||
| σ> | 155,5 ±8,4 | 308,4 ± 34,2 | 497,5 ±25,3 | 23 | 135,2 ±4,8 *A | 203,8 ± 25,8 | 463,8 ± 17,8 | |||
| 00 | 198,9 ± 13,7 | 324,7 ±33,6 | 482,6 ± 12,3 | 22 | 146,6 ±3,3 *A | 220,7 ±26,4 | 465,8 ±13,5 | |||
| 173,4 ± 13,7 | 345,4 ± 34,1 | 507,8 ±12,3 | CM | 164,2 ±7,8 *A | 251,1 ± 28,7 | 488,8 ±8,1 | ||||
| CO | 272,0 ±21,9 | 352,6 ± 34,1 | 493,4 ±8,6 | O CM | 163,7 ±6,7 *A | 228,3 ± 27,8 | 485,4 ±22,0 | |||
| W | 273,4 ±20,0 | 364,6 ± 26,1 | 477,5 ±10,8 | σι | 151,2 ±6,1 •A | 221,1 ± 29,1 | 496,0 ±15,2 | |||
| 268,4 ±19,1 | 370,5 ± 28,7 | 458,9 ±11,5 | co | 135,4 ±2,1 *A | 240,4 ± 28,9 | 510,3 ± 12,1 | ||||
| c*> | 301,8 ±20,5 | 384,4 ± 26,7 | 459,3 ± 12,5 | 17 | 136,3 ±2,0 *A | 226,6 ± 29,5 | 513,3 ±12,3 | |||
| CM | 363,6 ±21,1 | 388,9 ±29,6 | 455,6 ±13,8 | CO | ? -H | 221,9 ±28,8 | 496,3 ±8,7 | |||
| - | 433,9 ±14,0 | in co CM ’Τ -H | 468,4 ±10,4 | co | 143,9 ±4,7 *A | 234,8 ±28,8 | 499,5 ± 16,2 | |||
| hiper- glikemia utrwalona | 496,3 ±11,5 | 445,3 ±17,2 | 480,9 ±13,6 | hiper- glikemia utrwalona | 496,3 ±11,5 | 445,3 ±17,2 | 480,9 ± 13,6 | |||
| ilość szczurów w grupie | CM | 00 | 00 | ilość szczurów w grupie | CM | 00 | 00 | |||
| badany preparat | insulina SK3R 2x5i. | insulina GEKR 2x5i. | kontrola 0,9 % NaCI | badany preparat | insulina SK3R 2x5j. | insulina GEKR 2x5j. | kontrola 0,9 % NaCI |
PL 222 975 B1
PL 222 975 B1
PL 222 975 B1
P r z y k ł a d 21
Badanie aktywności insuliny AK3R na zwierzętach z doświadczalną cukrzycą
Działanie hipoglikemizujące insuliny AK3R potwierdzono w badaniach na szczurach z cukrzycą streptozotocynową o przebiegu średniociężkim. Analog AK3R podawano szczurom szczepu WAG z cukrzycą wywołaną doświadczalnie podaniem streptozotocyny jednorazowo lub wielokrotnie (jeden raz na dobę przez okres 4 tygodni). Preparatem odniesienia była insulina glargine (preparat Lantus); dodatkowo zastosowano kontrolę placebo (roztwór soli fizjologicznej bez insuliny). Badania wykonano łącznie na 110 szczurach.
W grupie otrzymującej jednorazowo badany analog zaobserwowano powolne, stopniowe obniżanie poziomu glukozy we krwi badanych szczurów, co jest dowodem na spowolnione wchłanianie insuliny AK3R z miejsca podania. Stwierdzono zasadniczo podobny profil zmian glikemii jak dla insuliny glargine.
Działanie hipoglikemiczne insuliny AK3R obserwowano najczęściej od 1 do 8 godziny, po czym stężenie glukozy wzrastało do wartości wyjściowej, Znaczne obniżenie stężenia glukozy po podaniu insuliny AK3R w dawce 5 j./kg m.c, utrzymywał się nawet do 12 godzin.
Przebieg krzywej glikemii był plaski, bez wyraźnie zaznaczonego maksimum działania. Preparat referencyjny wykazywał wyraźne maksymalne działanie hipoglikemiczne w 4 godzinie po podaniu, niezależnie od wielkości dawki. Czas trwania efektu dla insuliny glargine byt krótszy w porównaniu z AK3R - utrzymywał się on najczęściej od 2 do 6 godziny po podaniu.
W porównaniu z insuliną glargine, jak i związkami objętymi zgłoszeniem WO 2010/002283 A2, analog AK3R wyraźnie dłużej zachowuje działanie hipoglikemiczne, a profil jego działania ma wybitnie charakter bezszczytowy, nie wykazując zwłaszcza, co jest charakterystyczne dla grupy związków objętych zgłoszeniem WO 2010/002283 A2, silnego, szybkiego efektu farmakologicznego.
Wielokrotne podawanie insuliny AK3R w dawce 5 j./kg m.c. powodowało już od pierwszej doby stosowania stałe obniżanie poziomu glukozy, który w czwartym tygodniu osiągnął wartości około 60% niższe od wyjściowych. Działanie to jest stabilne i podobne do preparatu referencyjnego - insuliny glargine, choć widać tendencję do bardziej stabilnego utrzymywania glikemi na statystycznie niższym poziomie, zwłaszcza od 14 dnia terapii (Newman-Keuls, α = 0,05). Po zaprzestaniu podawania obu badanych insulin stężenie glukozy we krwi szczurów stopniowo wzrasta do wartości wyjściowych.
Przebieg dobowych profili stężenia glukozy we krwi szczurów wyznaczonych po 2 i po 4 tygodniach podawania insuliny AK3R i insuliny glargine potwierdza wyrównane działanie hipoglikemiczne badanej insuliny, a także statystycznie istotną odmienność od preparatu referencyjnego (NewmanKeuls, α = 0,05). W badaniach wszystkich dawek nie obserwowano zmian, w wyglądzie i zachowaniu zwierząt Nie obserwowano też różnic w tolerancji miejscowej obu preparatów (zmian w miejscu wstrzyknięć podskórnych). Analiza makroskopowa i mikroskopowa tkanek z pobranych narządów dla wszystkich grup badanych zwierząt nie wykazała żadnych zmian patologicznych.
Na podstawie wyników powyższych badań można stwierdzić, że analog AK3R posiada właściwości insulin długodziałających, bezszczytowych i może mieć zastosowanie terapeutyczne jako insulina bazowa podawana 1 raz na dobę. Jednocześnie, podobnie jak insulina SK3R, insulina AK3R wykazuje oryginalny (lepszy od dostępnych na rynku analogów długodziałających) stabilny i wyrównany dobowy profil hipoglikemiczny w trakcie prowadzonej przewlekle terapii, czym odróżnia się również od analogów objętych zgłoszeniem WO 2010/002283 A2
Wyniki przedstawiające stężenie glukozy we krwi szczurów po jednorazowym podaniu insuliny AK3R w dawkach: 2,5 j./kg mc,, 5 j./kg mc. i 7,5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 6.
Zbiorczy wykres przedstawiający charakterystyczny dla bezszczytowych preparatów profil stężenia glukozy we krwi szczurów po jednorazowym podaniu insuliny AK3R w dawkach: 2,5 j./kg mc. 5 j./kg mc, i 7.5 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, przedstawiono na Fig. 11.
Wyniki przedstawiające stężenie glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny AK3R w dawce 1 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 7 i na Fig. 12.
Wyniki przedstawiające 12-godzinne profile stężenia glukozy po 2 i 4 tygodniach podawania insuliny AK3R w dawce 1 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 8.
PL 222 975 B1
Zbiorczy wykres 12-godzinnych profili stężenia glukozy po 2 i 4 tygodniach podawania insuliny AK3R w dawce 1 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej przedstawiono na fig. 13.
Porównanie dobowych profili stężenia glukozy po jednorazowym podaniu insuliny GKR, insuliny GEKR, insuliny AKR, insuliny GR oraz insuliny SK3R i insuliny AK3R w dawce 1 x 5 lub 10 j./kg mc., w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, przedstawiono na Fig. 14.
<D g
e d
E
Ul r~-‘ d
E σι d a E «-s 5,43 10
-u
CM
O O 5 N φ s li £-1 m
< ra >. σι E nr 3 .S
Ul =
E 3 3 .E C N Π) -, g i
CL tO ii h
O _= c ar
II
II h
a I
1£ s £ S £ 8.3 ?>
αί-Ό co jrt
| stężenie glukozy we krwi szczurów wartość średnia (mg/dl) ± SEM | czas pobierania krwi po podaniu jednorazowym preparatu | godziny | 36 | 444,1 ±19,2 | 460,7 ±13,7 | 448,0 ±7,7 A | 465,1 ±14,5 | 418,8 ±20,8 | 447,3 ± 13,8 | 458,3 ±22,5 |
| 24 | 403,0 ± 13,7 * -— | 446,9 ±14,2 | 406,9 ±16,2 | 435,3 ±21,5 | 393,1 ±28,1 | 397,6 ±21,3 | 460,2 ±21,4 | |||
| CM | 436,2 ± 11,5 | 446,8 ±14,4 | T- CT> C i- CM < CM -H | 233,9 ±36,3 | 334,9 ±23,4 A | 346,0 ±22,5 | 453,5 ±21,3 | |||
| O | 386,8 ±23,5 Λ | 361,3 ±15,3 | o SR* -H | 166,6 ±18,0 | 259,9 ±20,0 *Λ | 185,0 ± 14,2 | 458,3 ±18,1 | |||
| 00 | 237,5 ±28,6 Λ | r- <?, T- -CO 05 *“ Ή | 124,3 ±13,9 A | 128,3 ±6,9 | 165,3 ± 17,4 A | 162,7 ± 17,4 | 461,0 ±13,6 | |||
| CD | 218,6 ±21,1 *A | 119,9 ±9,2 | 116,7 ±12,9 Λ | 108,6 ±8,3 | 12,35 ' ± 14,3 Λ | 127,4 ± 15,7 | 455,3 ±21,9 | |||
| 226,7 ±18,5 *A | CM t0 co (0 00 -H | I 117,8 ±13,4 A | CM « co to CO -u | 138,2 ±17,1 * A | 83,2 ± 11,3 | 459,8 ±23,8 | ||||
| CM | 198,6 ± 16,0 •A | 101,0 ±10,6 | 122,9 ± 13,4 A | 107,4 ± 15,3 | 128,9 ± 10,0 A | 143,0 ±13,7 | 453,3 ±33,6 | |||
| V | 187,8 ± 17,3 A | 198,0 ±18,8 | 160,3 ±9,3 A | 162,6 ±18,2 | 131,3 ±11,5 •A | 247,1 ±31,5 | 449,3 ±24,7 | |||
| 0,5 | 298,0 ± 13,6 * A | 353,2 ± 16,0 | 264,8 ±8,7 • A | 321,8 ± 18,7 | 239,8 ±21,9 *A | 366,8 ±31,4 | 452,5 ±24,7 | |||
| hiperglikemia utrwalona | O | 479,4 ± 6,8 | 465,3 ±13,9 | O co H «0 ω b- | 468,1 ±14,4 | 00 in H co CD h- | 00 H CO r- | LD CM H iO_ ID ID | ||
| normo- glikemia | 78,9 ± 1,5 | 83,0 ± 1,2 | 81,8 ± 1,8 | 84,1 ± 1,9 | 78,3 ± 2,2 | 83,3 ± 1,8 | 84,2 ± 1,4 | |||
| O i | szczurów w grupie | CM | O> | CM T- | 05 | CM | 05 | CD | ||
| dawka s.c. | 2,5 j./kg m.c. | σ> . | 05 o ID E K | 30 μΙ/300 g m.c. | ||||||
| badany preparat | insulina AK3R | Lantus | insulina AK3R | Lantus | insulina AK3R | Lantus | kontrola |
S>
ω cn
CD ro c
tz a:
to Γ3
X.
<
CD <
AJ
ID LT5 o o o
V
o.
O
ΧΛ
O i
E
O
N
O
Q_ o
V
CŁ
PL 222 975 B1
Tabela 7. Stężenie glukozy we krwi szczurów po wielokrotnym (28 dni) podaniu insuliny AK3R w dawce 2 x 5 j./kg mc./dobę, w modelu średniociężkiej cukrzycy streptozotocynowej, w porównaniu z insuliną glargine (wraz z oceną statystyczną).
| stężenie glukozy we krwi szczurów wartość średnia (mg/dl) ± SEM | kolejne doby badania | v— | 257,2 ± 14,7 Λ | 270,8 ± 22,7 | 491,9 ±6,3 | kolejne doby badania | 28 | 202,0 ± 10,1 A | 225,2 ±7,4 | oo Ϊ2 -H O E ™ | |
| CO | 253,2 ± 14,20 Λ | 278,6 ± 16,9 | 485,3 ± 12,3 | 27 | 191,4 ±9,9 A | 215,3 ±6,6 | 497,4 ± 18,3 | ||||
| CM | 284,3 ± 16,0 A | 268,3 ±9,3 | 480,1 ±9,0 | 26 | 194,4 ±9,6 A | 224,4 ±8,9 | 497,5 ±8,8 | ||||
| - | 275,2 ± 13,9 Λ | 258,3 ± 19,3 | 478,6 ± 9,9 | m CM | 198,5 ±8,6 • A | 231,8 ±9,7 | 496,1 ±7,1 | ||||
| o | 285,0 ± 12,6 A | 264,4 ± , 16,6 | 486,5 ±8,5 | stężenie glukozy we krwi szczurów wartość średnia (mg/dl, ± SEM | T2 | 203,9 ± 11,3 *A | 264,0 ± 15,7 | 494,3 ±7,3 | |||
| ot | 291,9 ± 12,3 A | O iO OT'tO r- TCM -H | 485,1 ±4,9 | 23 | 217,6 ± 10,4 * Λ | 260,7 ± 15,7 | 490,4 ±3,6 | ||||
| 00 | 301.9 ± 11.9 A | 306,1 ± 19,2 | 486,5 ±6,7 | 22 | 222,2 ± 10,7 A | 260,7 ± 18,6 | 487,9 ± 10,0 | ||||
| r- | 308,3 ± 12,4 Λ | 334,8 ± 15,1 _ | 498,8 ±8,2 | CM | 247,4 ±11,3 A | 267,0 ±20,5 | 483,4 ± 10,2 | ||||
| to | 319,5 ± 13,4 A | 342,2 ± 16,2 | 486,8 ±7,2 | O CN | 250,3 ± 11,2 A | 278,2 ± 19,1 | 479,8 ± 13,2 | ||||
| to | 335,3 ± 13,9 A | 355,1 ±17,8 | 486,1 ±5,8 | OT | 249,5 ± 11,2 A | 286,9 ± 17,1 | 486,9 ±7,7 | ||||
| 'M- | 338,2 ± 14,3 A | 380,2 ±15,2 | 473,6 ± 12,5 | 00 | 248,3 ± 11,5 *A | 305,4 ±17,9 | 485,3 ±10,9 | ||||
| CO | 364,8 ± 12,3 A | 382,3 ±24,6 | o co -H | r- | 244,0 ±11,7 A | 280,9 ±14,1 | 483,8 ±6,9 | ||||
| CM | 404,6 ± 14,3 A | 391,0 ± 25,8 | 480,1 ±6,7 | to | 248,0 ± 13,5 A | 273,9 ± 14,4 | 493,0 ±5,1 | ||||
| 444,4 ±5,5 | 442,1 ± 15,4 | 474,6 ±6,9 | m | 228,3 ± 12,7 * A | 274,4 ± 18,9 | 502,6 ±4,0 | |||||
| hiper- glikemia utrwalona | 474,0 ±5,3 | 466,2 ± 10,5 | 472,3 ± 7,2 | hiper- glikemia utrwalona | 474,0 ± 5,3 | 466,2 ±10,5 | 472,3 ± 7,2 | ||||
| ΠΟΠΤ1Ο- glike- mia | 81,0 ± 1,4 | 81,1 ±1,8 | co h | hi | 81,0 ±1,4 | 81,1 ± 1,8 | 84,6 ±2,7 | ||||
| szczurów w grupie | 24 | OT | 00 | Ό 1 | szczurów w grupie | 24 | OT | OO | |||
| badany preparat | insulina AK3R 5 j./kg m.c./dobę | Lantus 5 j./kg m.c./dobę | kontrola 30 μΙ/300 9 m.c./dobę | badany preparat | insulina AK3R 5 j./kg m.c./dobę | Lantus 5 j./kg m.c./dobę | kontrola 30 μΙ/300 g m.c./dobę |
Poziom istotności: * p < 0,05 insulina AK3R 5 j./kg m.c./dobę vs insulina glargine 5 j./kg m.c./dobę Λρ<0,05 insulina AK3R 5 j./kg m.c./dobę vs kontrola
PL 222 975 B1 cc Μ
O CO w >* c N >* o o
P σι m to S c a φ φ
M H o o Fc £]g
CD-TO a o CL E
| CO | io | CD | |||||
| co | 20 | co' | ’Μ | ||||
| CM | Ή | +1 | -H | +1 | |||
| *” | CO * | co | CM * | CO~ | |||
| T— | o> | 00 | |||||
| CD | b- | O | |||||
| CM | CM | ||||||
| CM | CM | CD | CO | ||||
| co' | oo' | in | co | ||||
| O | -H | +ł | Ή | +1 | |||
| m * | o | b- | M- | ||||
| SEM | o co T— | 200, | 152 | 150, | |||
| co | CM_ | r- | b-_ | ||||
| -H | co' | CM | in | CO | |||
| 5 | Ξ3 *» cu | 00 | +1 co | 2± | +1 * | 0± | |
| σ | re | CD | _ r | CM | - | ||
| E. | CL £ | co | CM CD | LO | CM | ||
| ednis | niu p | co | 13,6 | CO LO' | b- cm | ||
| V) Ό | oda | co | Ή CM | -H b- | +1 CM* | -H CD | |
| Φ O t; | d od | >* e N | CM | 129, | co | 65, | |
| wa | ϊ | D O | 00 | CD | cd | CD | |
| szczurów | tierania kr | O | 116,2 ± 3 « | b-' Ή b- b-' r- | Ή CO * co' T- | 58,9 ±1, | |
| ł | od | σ> | b* | Ol | b* | ||
| e kr | (0 (Q N | CM | CD Ή | có H | Tf +1 * | w— Ή | |
| Ϊ g | O | σί | 69,3 | 99,5 | 63,4 | ||
| 3 | CO | co | CO | ||||
| □) | K | M- | co' | ||||
| Φ | -H | Ή | Ή . | -H | |||
| c | o | CO | T— | CM | |||
| Φ | co' | b-' | |||||
| Φ» « | CD | b- | co | b- | |||
| lO | o | co | TJ- | ||||
| co | ŁD | b-' | |||||
| w | Ή | +1 | +1 | +1 | |||
| o | O | co | O | ||||
| 00 | co | b- | |||||
| o | CM | o | O | ||||
| E 3 | CD | CO | |||||
| 3 .2 | O . 8 c. | a> ro | +1 | -H | CD_ | co | |
| dni dan | z £ η « 2_a | CM f>. i< | 00 f'o cm | -H Tt | +1 co | ||
| > n 5 X2 | * | 9 φ 0 k o. a | m CM | b- CM CM | CD | 215, | |
| dniu | |||||||
| c TO 3 » Μ Ξ | dni | ||||||
| O | O | ||||||
| s | CD | CD | |||||
| IM O | ” *5 O. | a | żr | ||||
| ΓΊ >> m | CM | ||||||
| f | O | C | 1 | ||||
| O. | O. | ||||||
| ** ni | |||||||
| U | 0^ | Ol· | rt> | a> | |||
| X | Xł | -Q | -Ω | -Q | |||
| ]) | K £ | O | Di O | O | |||
| co P | Ό | Ό | |||||
| i >» | o | b | O | ||||
| i | Π3 t | w 23 CD 4= | ca £ | E | |||
| CO o | .£ σ> — | ,Ε σ> — _5<ί | § O) 4= 2Z | ||||
| £Z > | C | ||||||
| -Q | OJ —' | ω .-k | Π3 —’ | ||||
| .E co | -J IO | .£ m | _J CO |
PL 222 975 B1
P r z y k ł a d 22
Badanie aktywności insuliny SK3R na naczelnych
Przeprowadzono badania porównawcze aktywności insuliny SK3R na małpach z rodzaju Rhesus z utrwaloną hiperglikemią, stanowiących doświadczalny model cukrzycy typu 2 u naczelnych. Wyniki badań bezsprzecznie potwierdzają aktywność farmakologiczną insuliny SK3R i zaobserwowane wcześniej właściwości, w tym charakterystyczny kształt profilu glikemi po zastosowaniu badanego związku.
Aktywność hipoglikemiczną insuliny SK3R oceniano na podstawę zmian wartości stężeń glukozy w czasie, w porównaniu z insuliną AKR, będącą przedstawicielem związków objętych zgłoszeniem patentowym WO 2010/002283 A2. Badaniom poddano 6 małp - 3 samce i 3 samice. Związek badany i referencyjny podawano jednorazowo (rano), w dawce 1 j./kg mc. Wybrano podskórną drogę podania (sc.), gdyż taka jest planowana docelowo w zastosowaniu klinicznym. Przed wystąpieniem hipoglikemi zwierzęta zabezpieczano 20% roztworem glukozy, podawanym tuż przed wstrzyknięciem badanych związków.
Stężenia glukozy analizowano w 9 punktach czasowych, do 24 godziny po podaniu insulin. Profile porównywano indywidualnie u każdego zwierzęcia ze względu na niewielką grupę i dużą zmienność wyjściowych poziomów glukozy pomiędzy zwierzętami.
Z przebiegu krzywych glikemicznych możemy wnioskować o odmienności profili działania obu porównywanych analogów. Insulinę SK3R, w porównaniu do insuliny AKR, charakteryzuje wyraźnie wolniejszy początek działania (wydłużona absorpcja), późniejsze osiąganie maksymalnego efektu (4 godz. vs 1-2 godz.) i bardziej płaski kształt profilu glikemii w czasie do 10 godzin po podaniu preparatu (mniejsze wahania stężeń w profilach).
Na podstawie przedstawionych wyników badań można stwierdzić, że analog SK3R posiada stabilny, wyrównany profil działania, już po jednorazowym podaniu, charakterystyczny dla tzw. bezszczytowych insulin długodziałających oraz przedłużone działanie. Właściwości te potwierdzają możliwość zastosowania terapeutycznego analogu SK3R jako insuliny bazowej, podawanej 1 raz na dobę.
Wyniki przedstawiające stężenie glukozy we kiwi dla 5 uczestniczących w badaniu małp Rhesus (jedna małpa ze względu na symptomy hipoglikemii została wyłączona z badania), po jednorazowym podaniu insuliny SK3R w dawce 1 j./kg mc., w porównaniu z insuliną AKR przedstawiono w Tabeli 9.
Zbiorcze wykresy przedstawiające różnice w profilach działania hipoglikemizującego insuliny SK3R i insuliny AKR u małp Rhesus po jednorazowym podaniu w dawce 1 j./kg mc. przedstawiono na Fig. 9.
PL 222 975 B1
| Stężenie glukozy we krwi poszczególnych małp (mmol/l) | Czas pobierania krwi (godziny) | CM | co co' | co o | T— | 13,8 | 5,2 | LD' | CM | 16.0 | 14 4 | 6,3 |
| CM V | o LD | M- O | o co' | o· | K- LD | | 9 9 | 10 8 | CD LD' | 13,3 | 6,5 | ||
| O | co | CD CD | co co’ | co co' | 5,4 | I 0 9 | o | CM | σ> cm | CD | ||
| 00 | co | r-' | CD CD | cm CD | 5,2 | CM ld' | tT cd' | cm' T” | T— | 6,3 | ||
| CD | 6,55 | 7,4 | 13,8 | CM ld' | CO co' | 6,15 | CO M | 0 4 | LD | |||
| r- CM | 6,0 | T— id' | co CD | 3,6 | O | CD CM | 5,0 | 2,4 | ||||
| CM | 2,8 | m h- | o LÓ | CD co' | 3,7 | r- T— | CO co' | CM co' | co_ | CD cm | ||
| T | 3,7 | r- CD | 8,6 | in o | 5,7 | 2,8 j | 8,3 l | o o | CO oo | CD | ||
| 1 0,5 | cm ld' | cd | ł- | CM | 10,2 | 4,4 | 12,0 | | cd' | co | ’τΤ | ||
| O | ! 4,0 | I 10,9 | cm' | LD | 4,4 | 4,6 l | CD O | 16,7 | | K- | 5,2 | ||
| Nr i kod zwierzęcia | 00 CM i | M210 j | M51 | co LL· | F156 | M128 | M210 | M51 | | co LL | F156 | ||
| Insulina | SK3R 1 j./kg mc. | AKR 1 j./kg mc. |
CD
E ω
b
o.
9?
(Λ
Φ o>
E tn
O
T3
Φ
E φ
-ić o
c §
Φ
N
U
Φ £
CL
E φ
φ
O o
c co
Ό
O
CL >»
O
-2Ć
Φ
IM
0>
CD
PL 222 975 B1
P r z y k ł a d 23
Badanie aktywności insuliny SK3R na psach
Badania aktywności hipoglikemicznej insuliny SK3R w porównaniu z insuliną AKR (przedstawicielem grupy związków objętych zgłoszeniem patentowym WO 2010/002283 A2) przeprowadzone na zdrowych psach rasy Beagle potwierdziły obserwacje z badań na innych ssakach świadczące o innowacyjnym sposobie działania farmakologicznego analogu SK3R.
Badania prowadzono na 16 psach (8 samic i 8 samców). Psy podzielono na grupy w zależności od podawanej dawki: 8 zwierząt otrzymało badane insuliny w dawce 0,5 j/kg mc., a 8 innych - w dawce 1 j./kg mc. Oba związki podawano jednorazowo podskórnie. Przed wystąpieniem hipoglikemi zwierzęta zabezpieczano 20% roztworem glukozy, podawanym tuż przed wstrzyknięciem insulin. Profil glikemiczny wyznaczano do 24 godziny po podaniu preparatów, stężenie glukozy oznaczano w 8 punktach czasowych.
W analizie porównano poziomy glukozy w grupach otrzymujących insulinę SK3R i insulinę AKR w obu dawkach. Istotność statystyczną różnic w stężeniach glukozy w poszczególnych punktach czasowych testowano testem t dla zmiennych niesmarowanych α = 0,05).
Zarówno po podaniu dawki 0,5 j/kg mc. jak i po podaniu 1 j/kg mc. obserwowano istotne statystycznie różnice pomiędzy poziomami glukozy we krwi po podaniu insuliny AKR i insuliny SK3R w punktach pomiarowych od 0,5 do 6-8 godziny. Średnie profile glikemii po podaniu insuliny SK3R mają wyraźnie bezszczytowy, bardzo wyrównany przebieg, w przeciwieństwie do profili dla insuliny AKR, gdzie obserwuje się szybkie i silne działanie początkowe. W przebiegu glikemii po podaniu insuliny SK3R nie zaobserwowano istotnych fluktuacji, w tym wahań poposiłkowych, co świadczy o zapewnieniu przez ten związek stabilnego poziomu glukozy aż do 24 godziny po jego podaniu.
Wyniki przedstawiające średnie stężenia glukozy we krwi zdrowych psów rasy Beagle po jednorazowym podaniu insuliny SK3R w dawkach; 0,5 j./kg mc. i 1 j./kg mc, w porównaniu z insuliną AKR (wraz z oceną statystyczną), przedstawiono w Tabeli 10.
Wykresy przedstawiające różnice w uśrednionych profilach działania hipoglikemizującego insuliny SK3R i insuliny AKR u psów rasy Beagle po jednorazowym podaniu w dawkach 0,5 j./kg mc. i 1 j./kg mc. przedstawiono na Fig. 10.
PL 222 975 B1
LO Γ O
Εθ c it a
σι —k o _ 'W o ·— c d £ E £
S5 E 2 —N ui o o
c
P o CD
CD Ό *!
£ ω c
Z3 cn c Φ .2 | cii £ οΞ
P E E φ ω § £ CD E O C (= c Ό O (D £
Z? w θ ° O. C <b Ό <.S2, $ iS co o
>· 8 u> .y
P o oω o O. -Ul g t * g i > er >, ν' s<
= £ ™ = CD (Λ
Έ .£ S N a> 2 w c <D <9
Ό
E <o £
o
o.
CD
-O
CD ł—
| | Średnie stężenie glukozy we krwi psów w poszczególnych grupach (mmol/l) I | Czas pobierania krwi (godziny) | | TT CM | 4,863 | h- <31 CM C3 | 5,138 | 0,226 | 0,0281* | 4,900 | 0,262 | 5,150 | 0,359 | 0,0668 |
| CM | 4,675 | CO in ’κΤ o’ | 4,950 | CO <31 CM O | 0,0865* | 4,738 | 0,532 | 5,025 | 0,526 | 0,1476 | ||
| 00 | 4,900 | 0,421 | 4,975 | 0,306 | 0,3448 | 4,750 | 0,393 | 5,400 | 0,535 | 0,0075* | ||
| (D | 4,775 | 0,311 | 5,113 | 0,348 | 0,0300* | 4,463 | 0,354 | O o Ul | 0,605 | 0,0010* | ||
| 4,800 | _0,239 | 5,013 | 0,785 | 0,2379 | m r- to | 0,205 | 3,550 | 1,627 | 0,0495* | |||
| CM | 4,750 | 0,233 | 2,138 | 0,478 | 0,0000* | 4,725 | 0,282 | 2,488 | 1,217 | ♦ s o o o | ||
| 4,250 | 0,621 | 1,900 | 0,262 | 0,0000* | 3,725 | 0,547 | 1,825 | 0,392 | i « o o o o o | |||
| ui o” | 4,225 | 0,908 | 2,213 | co CM o | 0,0000* | 3,200 | 0,845 | 1,971 | 0,335 | 0,0016* | ||
| o | 13,825 | 6,652 | 11,075 | 2,639 | 0,147721 | 11,250 | 4,530 | 10,613 | 1,836 | 0,3588576 | ||
| Średnia | SD | Średnia | SD | Wartość p | Średnia | SD | Średnia | SD | Wartość p | |||
| Insulina/Grupa | SK3R 0,5 j./kg mc. | AKR 0,5 j./kg mc. | SK3R 0,5 j./kg mc. | AKR 0,5 j./kg mc. |
* - potwierdzona istotność statystyczna różnic
Stężenia glukozy podano w mmol/l. Celem przeliczenia wartości glikemii na jednostki mg/dl stosuje się przelicznik: 1 mmol/l = 18 mg/dl.
PL 222 975 B1
Kompleksowe badania na zwierzętach wykazały, że preparaty, w tym kompozycje farmaceutyczne wytworzone ze związków o wzorze ogólnym charakteryzują się po podawaniu wielokrotnym nie tylko przedłużonym działaniem, ale także płaskim profilem uwalniania naśladującym wydzielanie naturalnej insuliny, co z klinicznego punktu widzenia oznacza potencjalną redukcję hipoglikemii, szczególnie nocnych. Pozwala to spodziewać się, że właściwości analogów, będących przedmiotem wynalazku, umożliwią otrzymywania leków, które zwiększą skuteczność, bezpieczeństwo i komfort terapii pacjentów. Ze względu na swój płaski profil uwalniania wykazują zdecydowane podobieństwo do podstawowej sekrecji insuliny ludzkiej.
Dodatkowo wprowadzone modyfikacje doprowadziły do otrzymania stabilnych kompozycji farmaceutycznych zawierających nowe analogi insuliny lub/oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole, przy jednoczesnym zachowaniu ich aktywności biologicznej, charakteryzujących się zmniejszeniem ich rozpuszczalności w fizjologicznym pH miejsca iniekcji. Powoduje to wytrącenie mikrodepozytu analogu insuliny w tkance podskórnej i następnie jego stopniowe, powolne wydzielanie się do krwi, przez co utrzymywanie poziomu terapeutycznego trwa przez dłuższy czas, który po jednorazowej dawce określono na co najmniej 24 godziny. Właściwości tych związków i ich kompozycji zostały potwierdzone przez badania stabilności i badania aktywności na zwierzętach z doświadczalną cukrzycą, w trakcie których stwierdzono znacznie przedłużony efekt działania hipoglikemizującego.
Fig. 6 do 8 oraz Fig. 13 przedstawiają wykresy 12-godzinnych profili glikemii po wielokrotnym podaniu insuliny SK3R, insuliny AK3R, insuliny glargine i insuliny GEKR). W porównaniu do insuliny glargine oraz związków opisanych w zgłoszeniu WO 2010/002283 A2, działanie to jest dużo bardziej stabilne, bowiem przykładowo dla insuliny glargine słabnie ono już od 6-8 godziny i przed podaniem kolejnej dawki preparatu glikemia powraca niemal do wartości wyjściowych, co powoduje stan hiperglikemii i zmniejszenie efektu terapeutycznego.
W porównaniu do związków hipoglikemizujących będących przedmiotem zgłoszenia WO 2010/002283 A2, analogi objęte niniejszym zgłoszeniem po jednorazowym podaniu zwierzętom z doświadczalną cukrzycą i zdrowym, charakteryzują się zdecydowanym wydłużeniem absorpcji, co powoduje utrzymywanie obniżonego poziomu glukozy do 8-10 godziny po ich podaniu. Profile glikemii są płaskie, bez większych wahnięć od 1 do co najmniej 8 godziny po aplikacji preparatów. Nie zaobserwowano tzw. „szczytów” działania, co oznacza, że zgłaszane związki są insulinami prawdziwie bezszwowymi. Fig. 3, Fig. 9, Fig. 10 i Fig. 11 obrazują profile glikemii ssaków, w tym naczelnych, po jednorazowym podaniu preparatów insuliny SK3R, insuliny AK3R w porównaniu z roztworem kontrolnym i innymi analogami.
Przedłużone, stabilne działanie hipoglikemizujące związków wg wynalazku jest jeszcze lepiej widoczne w badaniach na zwierzętach po wielokrotnym podawaniu (4 tygodnie), gdzie zaobserwowano dla nich stabilny i bardzo korzystny kształt profilu glikemii, pozbawiony opisywanego wcześniej efektu „zębów piły”. Fig. 4, Fig. 5, Fig. 12 przedstawiają profile glikemii u szczurów po wielokrotnym podaniu preparatów insuliny SK3R, insuliny AK3R, w porównaniu z insuliną glargine i insuliną GEKR.
Ze wstępnych badań wykonanych za pomocą zaawansowanych technik NMR (do badań struktury wykorzystano widma 1H NMR i 13C NMR wykonane techniką NOESY, TOCSY, 1H/13C-GHSQC i 1H/13C-GHSQC-TOCSY) wynika, że przy zachowaniu takiego samego rdzenia struktury białkowej insuliny brak jest znaczących różnic w obecności i usytuowaniu zdefiniowanych elementów struktury ll-rzędowej insuliny ludzkiej i analogów będących przedmiotem wynalazku. Dodatkowe aminokwasy (lizyna i arginina) wprowadzone do cząsteczki insuliny ludzkiej powodują inne oddziaływania struktur II-rzędowych miedzy sobą oraz zmianę labilności regionów niezdefiniowanych, co prowadzi do rozluźnienia struktury III-rzędowej. Może mieć to wpływ na podatność na degradację a tym samym, zmianę stabilności chemicznej białka. Szczególne różnice widoczne są pomiędzy budową insuliny SK3R (dane własne niepublikowane) będącą przedmiotem wynalazku, a znaną strukturą insuliny GR (International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 40, 548-554), będącą przedmiotem zgłoszenia WO 201000/2283 A2.
Struktury przestrzenne monomerów insuliny ludzkiej oraz jej wybranych analogów, w tym insuliny SK3R, wyznaczone na podstawie danych z NMR zostały przedstawione na Fig. 16.
PL 222 975 B1
Lista sekwencji <110> Instytut Biotechnologii i Antybiotyków <120> Nowe analogi insuliny o przedłużonym działaniu <130> 610/RW <160> 23 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> mutant łańcucha A insuliny <4Q0> 1
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn Gly 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> mutant łańcucha A insuliny <400> 2
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn Ala · <21O> 3 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> mutant łańcucha A insuliny <400> 3
| Gly 1 | Ile | Val | Glu | Gin 5 | Cys Cys | Thr Ser Ile Cys Ser 10 ' | Leu Tyr Gin Leu 15 |
| Glu | Asn | Tyr | Cys 20 | Asn | Ser |
PL 222 975 B1 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> artificial seąuence <220>
<223> mutant łańcucha A insuliny <400> 4
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn Thr 20 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> mutant łańcucha B insuliny <400> 5
| Phe 1 | Val | Lys | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly Ser | His 10 | Leu | Val | Glu | Ala | Leu Tyr 15 |
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg |
25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> mutant łańcucha B insuliny <400> 6
| Phe 1 | Val | Arg | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly | Ser | His 10 | Leu | Val | Glu | Ala | Leu Tyr 15 |
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg |
25 30 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer KSRL <400> 7 ggtggtcgtt ttgtcaaaca gcac
PL 222 975 B1 <210 8 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer KSRP <400> 8 accacacagg tgctgtttga caaa <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220 <223> primer GLYP <400 9 tactgcaatg gttaagtcga ctctagc <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer GLYL <400 10 gagtegaett aaccattgca gtagtt <210> II <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer ALAP <400> 11 tactgcaatg cttaagtcga ctctagc <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> artificial· <220 <223> primer ALAL <40 0 12 gagtegaett aageattgea gtagtt
PL 222 975 B1 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer THRP <400> 13 tactgcaata cctaagtcga ctctagc <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer THRL <400> 14 gagtcgactt aggtattgca gtagtt <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer ARGP <400> 15 tttgtccgtc agcacctgtg tggttct <210 16 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer ARGL <400> 16 caggtgctga cggacaaaac gaccacc <210 17 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220 <223> primer SERP <40Q> 17 tactgcaatt cttaagtcga ctctagc
PL 222 975 B1 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer SERL <400> 18 agagtcgact taagaattgc agtagtt <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer THRG <400> 19 tactgcaata cttaagtcga ctctagc <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer THRD <400> 20 agagtcgact taagtattgc agtagtt <210> 21 <211> 24 < 212 > DNA <213> artificial <220>
<223> primer SARGL <400> 21 actccraaaa cacgtggcat c.gtt <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> primer SARGP <400 22 aacgatgcca cgtgttttag gagt
PL 222 975 B1
SEQ. No. 23
Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa plazmidu p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31 B)Arg(32B).
TAGAGCGCAC GAATGAGGGC CGACAGGAAG CAAAGCTGAA AGGAATCAAA
ATCTCGCGTG CTTACTCCCG GCTGTCCTTC GTTTCGACTT TCCTTAGTTT
TTTGGCCGCA GGCGTACCGT GGACAGGAAC GTCGTGCTGA CGCTTCATCA
AAACCGGCGT CCGCATGGCA CCTGTCCTTG CAGCACGACT GCGAAGTAGT
101 GAAGGGCACT GGTGCAACGG AAATTGCTCA TCAGCTCAGT ATTGCCCGCT
CTTCCCGTGA CCACGTTGCC TTTAACGAGT AGTCGAGTCA TAACGGGCGA
151 CCACGGTTTA TAAAATTCTT GAAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT
GGTGCCAAAT ATTTTAAGAA CTTCTGCTTT CCCGGAGCAC TATGCGGATA
201 TTTTATAGGT TAATGTCATG ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC
AAAATATCCA ATTACAGTAC TATTATTACC AAAGAATCTG CAGTCCACCG
251 ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT
TGAAAAGCCC CTTTACACGC GCCTTGGGGA TAAACAAATA AAAAGATTTA
301 ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC
TGTAAGTTTA TACATAGGCG AGTACTCTGT TATTGGGACT ATTTACGAAG
351 AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC
TTATTATAAC TTTTTCCTTC TCATACTCAT AAGTTGTAAA GGCACAGCGG
401 CTTATTCCGT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA
GAATAAGGGA AAAAACGCCG TAAAACGGAA GGACAAAAAC GAGTGGGTCT
451 AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG
TTGCGACCAC TTTCATTTTC TACGACTTCT AGTCAACCCA CGTGCTCACC
501 GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC
CAATGTAGCT TGACCTAGAG TTGTCGCCAT TCTAGGAACT CTCAAAAGCG
551 CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG
GGGCTTCTTG CAAAAGGTTA CTACTCGTGA AAATTTCAAG ACGATACACC
601 CGCGGTATTA TCCCGTGTTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA
GCGCCATAAT AGGGCACAAC TGCGGCCCGT TCTCGTTGAG CCAGCGGCGT
651 TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG
ATGTGATAAG AGTCTTACTG AACCAACTCń TGAGTGGTCA GTGTCTTTTC
701 CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC
GTAGAATGCC TACCGTACTG TCATTCTCTT AATACGTCAC GACGGTATTG
751 CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC
GTACTCACTA TTGTGACGCC GGTTGAATGA AGACTGTTGC TAGCCTCCTG
801 CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC
GCTTCCTCGA TTGGCGAAAA AACGTGTTGT ACCCCCTAGT ACATTGAGCG
851 CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG
GAACTAGCAA CCCTTGGCCT CGACTTACTT CGGTATGGTT TGCTGCTCGC
901 TGACACCACG ATGCCTGCAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA
ACTGTGGTGC TACGGACGTC GTTACCGTTG TTGCAACGCG TTTGATAATT
951 CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG
GACCGCTTGA TGAATGAGAT CGAAGGGCCG TTGTTAATTA TCTGACCTAC
1001 GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG
CTCCGCCTAT TTCAACGTCC TGGTGAAGAC GCGAGCCGGG AAGGCCGACC
1051 CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA
GACCAAATAA CGACTATTTA GACCTCGGCC ACTCGGACCC AGAGCGCCAT
1101 TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC
AGTAACGTCG TGACCCCGGT CTACCATTCG GGAGGGCATA GCATCAATAG
1151 TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC
ATGTGGTGCC CCTCAGTCCG TTGATACCTA CTTGCTTTAT CTGTCTAGCG
1201 TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT
ACTCTATCCA CGGAGTGACT AATTCGTAAC CATTGACAGT CTGGTTCAAA
PL 222 975 B1
1251 ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG
TGAGTATATA TGAAATCTAA CTAAATTTTG AAGTAAAAAT TAAATTTTCC
1301 ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG
TAGATCCACT TCTAGGAAAA ACTATTAGAG TACTGGTTTT AGGGAATTGC
1351 TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CATCGCCGTT CTCGATACGC
ACTCAAAAGC AAGGTGACTC GCAGTCTGGG GTAGCGGCAA GAGCTATGCG
1401 TGAACCGTGC gcacgctcat CCCGGACAGT tcagcaagct GCTCCTGGGA
ACTTGGCACG CGTGCGAGTA GGGCCTGTCA AGTCGTTCGA CGAGGACCCT
1451 CCAGGCACGC GCAAGACGCA GCGACCTGAA TTTGTTGGTA TCACTCATTT
GGTCCGTGCG CGTTCTGCGT CGCTGGACTT AAACAACCAT AGTGAGTAAA
1501 CCTGTCTCCG AATGGAAGAT GGTCAGCACA CAGTGTTGAC CGCGTAATCC
GGACAGAGGC TTACCTTCTA CCAGTCGTGT GTCACAACTG GCGCATTAGG
1551 TGCGCGACCA CGATCTTAAC CCGACAGTAA CGTGACAGCG GTCTGACATG
ACGCGCTGGT GCTAGAATTG GGCTGTCATT GCACTGTCGC CAGACTGTAC
1601 CCGCATTGAG GTCTTTGAAA CCGTAACTTC AGAAGCATGT ACGGTCAGAT
GGCGTAACTC CAGAAACTTT GGCATTGAAG TCTTCGTACA TGCCAGTCTA
1651 TTAACATAAG AGTTCATTGT ACGCACCGTT AAAACGCGCT CAGCGCGCTT
AATTGTATTC TCAAGTAACA TGCGTGGCAA TTTTGCGCGA GTCGCGCGAA
1701 CTGGCGCAAA AACCGTAAAA ATGGATGTTT TCCCCCGGGT AAACCGGAAA
GACCGCGTTT TTGGCATTTT TACCTACAAA AGGGGGCCCA TTTGGCCTTT
1751 AATGCGTCAG GAACGCTTTC AGCGCGTTGC ATGACTATGC ATGAAACTGA
TTACGCAGTC CTTGCGAAAG TCGCGCAACG TACTGATACG TACTTTGACT
1801 ATGGCGATCG GTTTGGGCGC GTCTGATGCC CATAAGGCGT ATTTTCGGAC
TACCGCTAGC CAAACCCGCG CAGACTACGG GTATTCCGCA TAAAAGCCTG
1851 GTTTTCAGCC CTGATAAGAA GAAATCAGAC TGTAGTTACA GACGAGTCGT
CAAAAGTCGG GACTATTCTT CTTTAGTCTG ACATCAATGT CTGCTCAGCA
1901 GAGCGATTCA CTACGGGAGT CGTCGGCGAG TCATCCAGTA TTTTTCCTCG
CTCGCTAAGT GATGCCCTCA GCAGCCGCTC AGTAGGTCAT AAAAAGGAGC
1951 CGACTCTCTG GCGACTCGCC TTCTCTGAAC ACCAGAGCGA CAGTGTGTTG
GCTGAGAGAC CGCTGAGCGG AAGAGACTTG TGGTCTCGCT GTCACACRAC
2001 AGTCATCGAT AAATCACCGA CGACTCGTTG CCGAGTCATC CAGTAGTCGC
TCAGTAGCTA TTTAGTGGCT GCTGAGCAAC GGCTCAGTAG GTCATCAGCG
2051 CGACGAGCCG CTTTTGTATA AATCCGAATA AGAAAATATA TTTTTCAAAC
GCTGCTCGGC GAAAACATAT TTAGGCTTAT TCTTTTATAT AAAAAGTTTG
2101 CATAACAACA TGATTTAAAA AGCAAATCAG AAAAAAGTTA GTTTTGCGTG
GTATTGTTGT ACTAAATTTT TCGTTTAGTC TTTTTTCAAT CAAAACGCAC
2151 GGGTGTGGGC ATCCTGGGAA TGAGAACAGA CTCGCGTTTT TCTGGAGGAA
CCCACACCCG TAGGACCCTT ACTCTTGTCT GAGCGCAAAA AGACCTCCTT
2201 CTGCGGGGAT TTTTGATTAA ACAATAGTCA CCGCAGAGCG GAATTTTATG
GACGCCCCTA AAAACTAATT TGTTATCAGT GGCGTCTCGC CTTAAAATAC
2251 CAACGCTGGC TGTGCGGCAC GGGGATTTTT AATCCCCCGG CCCGTTATTC
GTTGCGACCG ACACGCCGTG CCCCTAAAAA TTAGGGGGCC GGGCAATAAG
2301 ATCTCCACGG GCGACGGGGA TACATAAACC CGACAGCAGA GGACGGGTGA
TAGAGGTGCC CGCTGCCCCT ATGTATTTGG GCTGTCGTCT CCTGCCCACT
2351 GCGCGAATCC CAGAGATGAT GAAAAAAGAG GCAGAGAAAC GCGCCCAGGT
CGCGCTTAGG GTCTCTACTA CTTTTTTCTC CGTCTCTTTG CGCGGGTCCA
2401 ACGTTTTATC TTATTGCTTT GGTGTTGTCC AGGGTGTCGG GGCTGTGCCC
TGCAAAATAG AATAACGAAA CCACAACAGG TCCCACAGCC CCGACACGGG
2451 TGACCAGGTG GCATTTGTCT GATTGCGCGT GCGCGGTCCG ACAAATGGAC
ACTGGTCCAC CGTAAACAGA CTAACGCGCA CGCGCCAGGC TGTTTACGTG
2501 ATCCTGCCGC GTCCTGTACG TGTTTTTTTC ACCAGAACAA CTTCACGAAG
TAGGACGGGG CAGGACATGC ACAAAAAAAG TGGTCTTGTT GAAGTGCTTC
2551 TGGCGGATGA ACGCTACCAA CGTTGCCGGG AACGCTTCGG CGATGATGGC
ACCGCCTACT TGCGATGGTT GCAACGGCCC TTGCGAAGCC GCTACTACCG
2601 ATAACGGGCT GATACAGGCA CCTCCCGGAG ACGGACACAG CTTGCCTGTG
TATTGCCCGA CTATGTCCGT CGAGGGCCTC TGCCTGTGTC GAACGGACAC
2651 AGCGGATGCC GGGAGCCGAC AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTTTTA
TCGCCTACGG CCCTCGGCTG TTCGGGCAGT CCCGCGCAGT CGCCCAAAAT
2701 GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA TAGCGGAGTG
CGCCCACAGC CCCGCGTCGG TACTGGGTCA GTGCATCGCT ATCGCCTCAC
2751 TATACTGGCT TAATATGTTA AATCGGAGTG GTAATTCAGG GAAGTGCTTC
PL 222 975 B1
ATATGACCGA ATTATACAAT TTAGCCTCAC CATTAAGTCC CTTCACGAAG
2801 ATGTGGCAAA GGAAAAATGT GGCTATCGTG CGTAAGTGCA ACATGTAGGT
TACACCGTTT CCTTTTTACA CCGATAGCAC GCATTCACGT TGTACATCCA
2851 AAAGGTGAAA TGACGCCTCC TCGCTCACTC GGTCGCTACG CTCCTGCCGT
TTTCCACTTT ACTGCGGAGG AGCGAGTGAG CCAGCGATGC GAGGACGGCA
2901 GAGACTGCGG CGGGCGTTAC CGGCTCACAA ATAACGGGAT ACGCAGGCAG
CTCTGACGCC GCCCGCAATG GCCGAGTGTT TATTGCCCTA TGCGTCCGTC
2951 TGCTCAAATC AGGAAGGACC GGAAAAAGGA TGCGGCGTAG CCGTTTTTCC
ACGAGTTTAG TCCTTCCTGG CCTTTTTCCT ACGCCGCATC GGCAAAAAGG
3001 ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC AAGCATCACG AAATCTGACG CTCAAATCAG
TATCCGAGGC GGGGGGACTG TTCGTAGTGC TTTAGACTGC GAGTTTAGTC
3051 TGGCGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TCCCAGGCGT TTCCCCCTGG
ACCGCCGCTT TGGGCTGTCC TGATATTTCT AGGGTCCGCA AAGGGGGACC
3101 TAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCTGC CTTTCGGTTT ACCGGTGTCA
ATCGAGGGAG CACGCGAGAG GACAAGGACG GAAAGCCAAA TGGCCACAGT
3151 TTCCGCTGTT ATGGCCGCGT TTGTCTCATT CCACGCCTGA CACTCAGTTC
AAGGCGACAA TACCGGCGCA AACAGAGTAA GGTGCGGACT GTGAGTCAAG
3201 CGGGTAGGCA GTTCGCTCCA AGCTGGACTG TATGCACGAA CCCCCCGTTC
GCCCATCCGT CAAGCGAGGT TCGACCTGAC ATACGTGCTT GGGGGGCAAG
3251 AGTCCGACTA CCACGCCCGT TCCGGTAACT ATCAACTTGA GTCCAACCCG
TCAGGCTGAT GGTGCGGGCA AGGCCATTGA TAGTTGAACT CAGGTTGGGC
3301 GAAAGACACG ACAAATCGCC AGTGGCGGTA GCCATTGGTA A.CTGAGATGT
CTTTCTGTGC TGTTTAGCGG TCACCGCCAT CGGTAACCAT TGACTCTACA
3351 GCGAGAGATT TATCTGGAGT TCTTGAAGTG GGGGCCTGAG TGCGGCTACA
CGCTCTCTAA ATAGACCTCA AGAACTTCAC CCCCGGACTC ACGCCGATGT
3401 CTGGAAGGAC AGTTTAGGTG ACTCGTCTCG CACAAGACAG TTACCAGGTT
GACCTTCCTG TCAAATCCAC TGAGCAGAGC GTGTTCTGTC AATGGTCCAA
3451 AAGCAGTTCC CCAACTGACC TAACCTTCGA TCAAACCACC TCCCCAGGTG
TTCGTCAAGG GGTTGACTGG ATTGGAAGCT AGTTTGGTGG AGGGGTCCAC
3501 GTTTTTTCGT TTTCAGAGCA AGAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA
CAAAAAAGCA AAAGTCTCGT TCTCTAATGC GCGTCTTTTT TTCCTAGAGT
3551 AGAAGATCCT TTTTACAGGA GCGATTATCG TCTTCATCCA TGAAGGCGTT
TCTTCTAGGA AAAATGTCCT CGCTAATAGC AGAAGTAGGT ACTTCCGCAA
3601 TGAAGATTAA ACCGGCCTAT TTCATAGATC GTAAAATCAG GGTTTTGGGA
ACTTCTAATT TGGCCGGATA AAGTATCTAG CATTTTAGTC CCAAAACCCT
3651 TGGCCGATGA AACCCCATAA AAACCCATAA ATACATACAC CTACTAACAA
ACCGGCTACT TTGGGGTATT TTTGGGTATT TATGTATGTG GATGATTGTT
3701 TCATCTTTTG CTGTACCAGG GTATGAAAAG TCTCAGGGTT CCACCCCAGA
AGTAGAAAAC GACATGGTCC CATACTTTTC AGAGTCCCAA GGTGGGGTCT
3751 ATACGCCATC AACAAGTCCT GTCACACCGC CAAATAACAT GCAAAAAATT
TATGCGGTAG TTGTTCAGGA CAGTGTGGCG GTTTATTGTA CGTTTTTTAA
3801 GCGGATGACC GTAATCCGGG GTGCAGATCA ATGACTGAGA CAAGTATAAA
CGCCTACTGG CATTAGGCCC CACGTCTAGT TACTGACTCT GTTCATATTT
3851 CTTCATGCAA AAAGTAATTA CAATCAGTCC CAAAGTCAGC GGTGTCCCGG
GAAGTACGTT TTTCATTAAT GTTAGTCAGG GTTTCAGTCG CCACAGGGCC
3901 CCCTGATAAT CATGCCCGGA TTATCTGAAT TTCTCAGCGG GGGCTGTGAG
GGGACTATTA GTACGGGCCT AATAGACTTA AAGAGTCGCC CCCGACACTC
3951 CGCCACAACC TGTATCCAAG AGCGGTGCCT ACGAGCAGTC CTGCCGTCAT
GCGGTGTTGG ACATAGGTTC TCGCCACGGA TGCTCGTCAG GACGGCAGTA
4001 CATTGTAAGG CTTACGCCAG CAAGTTTTGT CTCAGTGATA ACACCTTATG
GTAACATTCC GAATGCGGTC GTTCAAAACA GAGTCACTAT TGTGGAATAC
4051 CTCCCCATAC AAGGAAAAGT ATCGGGAGAA AAAACAAACG CCCGGTTGTC
GAGGGGTATG TTCCTTTTCA TAGCCCTCTT TTTTGTTTGC GGGCCAACAG
4101 ATCTCCCGGT CATAAAGAGC AGCAAAACCG CGTCGTAGTA AAAAAGCCAG
TAGAGGGCCA GTATTTCTCG TCGTTTTGGC GCAGCATCAT TTTTTCGGTC
4151 CAGGATCAAG CTTCAGGGTT GAGATGTGTA TAAGAGACAG ACTCTAGCCA
GTCCTAGTTC GAAGTCCCAA CTCTACACAT ATTCTCTGTC TGAGATCGGT
4201 GTTTCCAAGT AGAAACTACA GTTTCTAAAC TGCAACTTTT TCTACTTTTT
CAAAGGTTCA TCTTTGATGT CAAAGATTTG ACGTTGAAAA AGATGAAAAA
4251 GCAACTTAAT CTATTGACTA GTCCTTTATA AATGTTAAAA CATATATATA
CGTTGAATTA GATAACTGAT CAGGAAATAT TTACAATTTT GTATATATAT
PL 222 975 B1
MetGln IlePheVal LysThrLeu 4301 GAAATAAATA AAAAGAGGAG GTTCATATGC AAATTTTTGT TAAAACTTTA CTTTATTTAT TTTTCTCCTC CAAGTATACG TTTAAAAACA ATTTTGAAAT
ThrGlyLysThr IleThrLeu GluValGiu SerSerAspThr IleAspAsn 4351 ACTGGTAAAA CCATTACCTT AGAAGTTGAA TCTTCAGATA CCATTGATAA
TGACCATTTT GGTAATGGAA TCTTCAACTT AGAAGTCTAT GGTAACTATT •ValLysSer LysIleGlnAsp LysGluGly IleProPro AspGlnGln·
4401 TGTTAAATCT AAAATTCAAG ATAAAGAAGG TATTCCTCCA GATCAACAAG
ACAATTTAGA TTTTAAGTTC TATTTCTTCC ATAAGGAGGT CTAGTTGTTC
AlaLeullePhe AlaGlyLys GlnLeuGluAsp GlyAlaThr LeuSerAsp 4451 CTCTAATATT TGCAGGTAAA CAGTTAGAAG ATGGTGCTAC CCTGTCTGAT
GAGATTATAA ACGTCCATTT GTCAATCTTC TACCACGATG GGACAGACTA
TyrAsnlleGln LysGluSer ThrLeuHis LeuValLeuAla LeuAlaGly 4501 TATAACATTC AGAAAGAATC TACCTTACAT CTGGTCTTAG CTCTCGCTGG
ATATTGTAAG TCTTTCTTAG ATGGAATGTA GACCAGAATC GAGAGCGACC •GlyArgPhe ValLysGlnHis LeuCysGly SerHisLeu ValGluAla·
4551 TGGTCGTTTT GTCAAACAGC ACCTGTGTGG TTCTCACCTG GTTGAAGCAC
ACCAGCAAAA CAGCTTGTCG TGGACACACC AAGAGTGGAC CAACTTCGTG
LeuTyrLeuVal CysGlyGlu ArgGlyPhePhe TyrThrPro LysThrArg 4601 TGTACCTGGT ATGTGGCGAA CGTGGTTTCT TCTACACTCC TAAAACACGT
ACATGGACCA TACACCGCTT GCACCAAAGA AGATGTGAGG ATTTTGTTTC
ArgGlyIleVal GluGlnCys CysThrSer IleCysSer LeuTyrGlnLeu 4651 CGCGGCATCG TTGAACAGTG CTGTACCTCT ATCTGTTCCC TGTACCAACT
GCGCCGTAGC AACTTGTCAC GACATGGAGA TAGACAAGGG ACATGGTTGA •GluAsnTyr CysAsnSer***
4701 GGAGAACTAC TGCAATTCTT AAGTCGACTC TAGCTACAGC CTCCTTTCGG
CCTC1TGATG ACGTTACCAA TTCAGCTGAG ATCGATGTCG GAGGAAAGCC
4751 AGGCTGTTTT TTATCTCGAG GATCC
TCCGACAAAA AATAGAGCTC CTAGG
SEQ. No. 24
Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa plazmidu p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B)
ATTATCATGA CATTAACGTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG
TAATAGTACT GTAATTGGAT ATTTTTATCC GCATAGTGCT CCGGGAAAGC
TCTTCAAGAA TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC
AGAAGTTCTT AAGAGTACAA ACTGTCGAAT AGTAGCTATT CGAAATTACG
101 GGTAGTTTAT CACAGTTAAA TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA
CCATCAAATA GTGTCAATTT AACGATTGCG TCAGTCCGTG GCACATACTT
151 ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG CACCGTCACC CTGGATGCTG
TAGATTGTTA CGCGAGTAGC AGTAGGAGCC GTGGCAGTGG GACCTACGAC
201 TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT GCGGGATATC
ATCCGTATCC GAACCAATAC GGCCATGACG GCCCGGAGAA CGCCCTATAG
251 GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA
CAGGTAAGGC TGTCGTAGCG GTCAGTGATA CCGCACGACG ATCGCGATAT
301 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC
ACGCAACTAC GTTAAAGATA CGCGTGGGCA AGAGCCTCGT GACAGGCTGG
351 GCTTTGGCCG CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC
CGAAACCGGC GGCGGGTCAG GACGAGCGAA GCGATGAACC TCGGTGATAG
401 GACTACGCGA TCATGGCGAC CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG
CTGATGCGCT AGTACCGCTG GTGTGGGCAG GACACCTAGG AGATGCGGCC
451 ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT
TGCGTAGCAC CGGCCGTAGT GGCCGCGGTG TCCACGCCAA CGACCGCGGA
501 ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCCCCA CTTCGGGCTC
TATAGCGGCT GTAGTGGCTA CCCCTTCTAG CCCGAGCGGT GAAGCCCGAG
551 ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG
TACTCGCGAA CAAAGCCGCA CCCATACCAC CGTCCGGGGC ACCGGCCCCC
601 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC
PL 222 975 B1
651
701
751
801
851
901
951
1001
1051
1101
1151
1201
1251
1301
1351
1401
51
1501
1551
1601
1651
1701
1751
1801
1851
1901
1951
2001
2051
2101
TGACAACCCG
TCAACGGCC?
AGTTGCCGGA
AAGGGAGAGC
TTCCCTCTCG
CTTCCGGTGG
GAAGGCCACC
TCTTTATCAT
AGAAATAGTA
TTCGGCGAGG
AAGCCGCTCC
TGCGGTATTC
ACGCCATAAG
CCGCCACCAA
GGCGGTGGTT
GCCGACGCGC
CGGCTGCGCG
GGCCTTCCCC
CCGGAAGGGG
CGTTGCAGGC
GCAACGTCCG
CTTCAAGGAT
GAAGTTCCTA
GCTGATCGTC
CGACTAGCAG
TGGCATGGAT
ACCGTACCTA
CGTCGCGGTG
GCAGCGCCAC
ATAGGTGCCT
TATCCACGGA
ATATATACTT
TATATATGAA
AGGTGAAGAT
TCCACTTCT?i
TTTTCGTTCC
AAAAGCAAGG
CCGTGCGCAC
GGCACGCGTG
GCACGCGCAA
CGTGCGCGTT
TCTCCGAATG
AGAGGCTTAC
CGACCACGAT
GCTGGTGCTA
ATTGAGGTCT
TAACTCCAGA
CATAAGAGTT
GTATTCTCAA
CGCAAAAACC
GCGTTTTTGG
CGTCAGGAAC
GCAGTCCTTCCGATCGGTTT
GCTAGCCAAA
TCAGCCCTGA
AGTCGGGACT
GATTCACTAC
CTAAGTGATG
TCTCTGGCGA
AGAGACCGCT
CGGTAGAGGA
CAACCTACTA
GTTGGATGAT
GTCGACCGAT
CAGCTGGCTA
GCGCGGGGCA
CGCGCGCCGT
GCAACTCGTA
CGTTGAGCAT
ACCGCTTTCG
TGGCGAAAGC
GGGATCTTGC
CCCTAGAACG
ACGTTTCGGC
TGCAAAGCCG
TGGGCTACGT
ACCCGATGCA
ATTATGATTC
TAATACTAAG
CATGCTGTCC
GTACGACAGG
CGCTCGCGGC
GCGAGCGCCG
ACGGCGATTT
TGCCGCTAAA
TGTAGGCGCC
ACATCCGCGG
CATGGAGCCG
GTACCTCGGC
CACTGATTAA
GTGACTAATT
TAGATTGATT
ATCTAACTAA
CCTTTTTGAT
GGAAAAACTA
ACTGAGCGTC
TGACTCGCAG
GCTCATCCCG
CGAGTAGGGC
GACGCAGCGA
CTGCGTCGCT
GAAGATGGTC
CTTCTACCAG
CTTAACCCGA
GAATTGGGCT
TTGAAACCGT
AACTTTGGCA
CATTGTACGC
GTAACATGCG
GTAAAAATGG
CATTTTTACC
GCTTTCAGCG
CGAAAGTCGC
GGGCGCGTCT
CCGGCGCAGA
TAAGAAGAAA
ATTCTTCTTT
GGGAGTCGTC
CCCTCAGCAG
CTCGCCTTCT
GAGCGGAAGA
ACGTACGTGG
CTGGGCTGCT
GACCCGACGA
GCCCTTGAGA
CGGGAACTCT
TGACTATCGT
ACTGATAGCA
GGACAGGTGC
CCTGTCCACG
CTGGAGCGCG
GACCTCGCGC
ACGCCCTCGC
TGCGGGAGCG
GAGAAGCAGG
CTCTTCGTCC
CTTGCTGGCG
GAACGACCGC
TTCTCGCTTC
AAGAGCGAAG
AGGCAGGTAG
TCCGTCCATC
TCTTACCAGC
AGAATGGTCG
ATGCCGCCTC
TACGGCGGAG
GCCCTATACC
CGGGATATGG
GGCCACCTCG
CCGGTGGAGC
GCATTGGTAA
CGTAACCATT
TAAAACTTCA
ATTTTGAAGT
AATCTCATGA
TTAGAGTACT
AGACCCCATC
TCTGGGGTAG
GACAGTTCAG
CTGTCAAGTC
CCTGAATTTG
GGACTTAAAC
AGCACACAGT
TCGTGTGTCA
CAGTAACGTG
GTCATTGCAC
AACTTCAGAA
TTGAAGTCTT
ACCGTTAAAA
TGGCAATTTT
ATGTTTTCCC
TACAAAAGGG
CGTTGCATGA
GCAACGTACT
GATGCCCATA
CTACGGGTAT
TCAGACTGTA
AGTCTGACAT
GGCGAGTCAT
CCGCTCAGTA
CTGAACACCA
GACTTGTGGT
TAAGGAACGC
TCCTAATGCA
AGGATTACGT
GCCTTCAACC
CGGAAGTTGG
CGCCGCACTT
GCGGCGTGAA
CGGCAGCGCT
GCCGTCGCGA
ACGATGATCG
TGCTACTAGC
TCAAGCCTTC
AGTTCGGAAG
CCATTATCGC
GGTAATAGCG
TTCGCGACGC
AAGCGCTGCG
CGGCGGCATC
GCCGCCGTAG
ATGACGACCA
TACTGCTGGT
CTAACTTCGA
GATTGAAGCT
GGCGAGCACA
CCGCTCGTGT
TTGTCTGCCT
AACAGACGGA
ACCTGAATGG
TGGACTTACC
CTGTCAGACC
GACAGTCTGG
TTTTTAATTT
AAAAATTAAA
CCAAAATCCC
GGTTTTAGGG
GCCGTTCTCG
CGGCAAGAGC
CAAGCTGCTC
GTTCGACGAG
TTGGTATCAC
AACCATAGTG
GTTGACCGCG
CAACTGGCGC
ACAGCGGTCT
TGTCGCCAGA
GCATGTACGG
CGTACATGCC
CGCGCTCAGC
GCGCGAGTCG
CCGGGTAAAC
GGCCCATTTG
CTATGCATGA
GATACGTACT
AGC-CGTATTT
TCCGCATAAA
GTTACAGACG
CAATGTCTGC
CCAGTATTTT
GGTCATAAAA
GAGCGACAGT
CTCGCTGTCA
CGCCGCCACG
GGAGTCGCAT
CCTCAGCGTA
CAGGCAGCTC
GTCAGTCGAG
ATGACTGTCT
TACTGACAGA
CTGGGTCATT
GACCCAGTAA
GCCTGTCGCT
CGGACAGCGA
GTCACTGGTC
CAGTGACCAG
CGGCATGGCG
GCCGTACCGC
GAGGCTGGAT
CTCCGACCTA
GGGATGCCCG
CCCTACGGGC
TCAGGGACAG
AGTCCCTGTC
TCATTGGACC
AGTAACCTGG
TGGAACGGGT
ACCTTGCCCA
CCCCGCGTTG
GGGGCGCAAC
AACCGCGGAG
TTGGCGCCTC
AAGTTTACTC
TTCAAATGAG
AAAAGGATCT
TTTTCCTAGA
TTAACGTGAG
AATTGCACTC
ATACGCTGAA
TATGCGACTT
CTGGGACCAG
GACCCTGGTC
TCATTTCCTG
AGTAAAGGAC
TAATCCTGCG
ATTAGGACGC
GACATGCCGC
CTGTACGGCG
TCAGATTTAA
AGTCTAAATT
GCGCTTCTGG
CGCGAAGACC
CGGAAAAATG
GCCTTTTTAC
AACTGAATGG
TTGACTTACG
TCGGACGTTT
AGCCTGCAAA
AGTCGTGAGC
TCAGCACTCG
TCCTCGCGAC
AGGAGCGCTG
GTGTTGAGTC
CACAACTCAG
PL 222 975 B1
2151 ATCGATAAAT CACCGACGAC TCGTTGCCGA GTCATCCAGT AGTCGCCGAC
TAGCTATTTA GTGGCTGCTG AGCAACGGCT CAGTAGGTCA TCAGCGGCTG
2201 GAGCCGCTTT TGTATAAATC CGAATAAGAA ΑΑΤΑΤΑΓΤΤΤ TCAAACCATA
CTCGGCGAAA ACATATTTAG GCTTATTCTT TTATATAAAA AGTTTGGTAT
2251 ACAACATGAT TTAAAAAGCA AATCAGAAAA AAGTTAGTTT TGCGTGGGGT
TGTTGTACTA AATTTTTCGT TTACTCTTTT TTCAATCAAA ACGCACCCCA
2301 GTGGGCATCC TGGGAATGAG AACAGACTCG CGTTTTTCTG GAGGAACTGC
CACCCGTAGG ACCCTTACTC TTGTCTGAGC GCAAAAAGAC CTCCTTGACG
2351 GGGGATTTTT GATTAAACAA TAGTCACCGC AGAGCGGAAT TTTATGCAAC
CCCCTAAAAA CTAATTTGTT ATCAGTGGCG TCTCGCCTTA AAATACGTTG
2401 GCTGGCTGTG CGGCACGGGG ATTTTTAATC CCCCGGCCCG TTATTCATCT
CGACCGACAC GCCGTGCCCC TAAAAATTAG GGGGCCGGGC AATAAGTAGA
2451 CCACGGGCGA CGGGGATACA TAAACCCGAC AGCAGAGGAC GGGTGAGCGC
GGTGCCCGCT GCCCCTATGT ATTTGGGCTG TCGTCTCCTG CCCACTCGCG
2501 GAATCCCAGA GATGATGAAA AAAGAGGCAG AGAAACGCGC CCAGGTACGT
CTTAGGGTCT CTACTACTTT TTTCTCCGTC TCTTTGCGCG GGTCCATGCA
2551 TTTATCTTAT TGCTTTGGTG TTGTCCAGGG TGTCGGGGCT GTGCCCTGAC
AAATAGAATA ACGAAACCAC AACAGGTCCC ACAGCCGCGA CACGGGACTG
2601 CAGGTGGCAT TTGTCTGATT GCGCGTGCGC GGTCCGACAA ATGCACATCC
GTCCACCGTA AACAGACTAA CGCGCACGCG CCAGGCTGTT TACGTGTAGG
2651 TGCCCCGTCC TGTACGTGTT TTTTTCACCA GAACAACTTC ACGAAGTGGC
ACGGGGCAGG ACATGCACAA AAAAAGTGGT CTTGTTGAAG TGCTTCACCG
2701 GGATGAACGC TACCAACGTT GCCGGGAACG CTTCGGCGAT GATGGCATAA
CCTACTTGCG ATGGTTGCAA CGGCCCTTGC GAAGCCGCTA CTACCGTATT
2751 CGGGCTGATA CAGGCAGCTC CCGGAGACGG ACACAGCTTG CCTGTGAGCG
GCCCGACTAT GTCCGTCGAG GGCCTCTGCC TGTGTCGAAC GGACACTCGC
2801 GATGCCGGGA GCCGACAAGC CCGTCAGGGC GCGTCAGCGG GTTTTAGCGG
CTACGGCCCT CGGCTGTTCG GGCAGTCCCG CGCAGTCGGC CAAAATCGCC
2851 GTGTCGGGGC GCAGGCATGA CCCAGTCACG TAGCGATAGC GGAGTGTATA
CACAGCCCCG CGTCGGTACT GGGTCAGTGC ATCGCTATCG CCTCACATAT
2901 CTGGCTTAAT ATGTTAAATC GGAGTGGTAA TTCAGGGAAG TGCTTCATGT
GACCGAATTA TACAATTTAG CCTCACCATT AAGTCCCTTC ACGAAGTACA
2951 GGCAAAGGAA AAATGTGGCT ATCGTGCGTA AGTGCAACAT GTAGGTAAAG
CCGTTTCCTT TTTACACCGA TAGCACGCAT TCACGTTGTA CATCCATTTC
3001 GTGAAATGAC GCCTCCTCGC TCACTCGGTC GCTACGCTCC TGCCGTGAGA
CACTTTACTG CGGAGGAGCG AGTGAGCCAG CGATGCGAGG ACGGCACTCT
3051 CTGCGGCGGG CGTTACCGGC TCACAAATAA CGGGATACGC AGGCAGTGCT
GACGCCGCCC GCAATGGCCG AGTGTTTATT GCCCTATGCG TCCGTCACGA
3101 CAAATCAGGA AGGACCGGAA AAAGGATGCG GCGTAGCCGT TTTTCCATAG
GTTTAGTCCT TCCTGGCCTT TTTCCTACGC CGCATCGGCA AAAAGGTATC
3151 GCTCCGCCCC CCTGACAAGC ATCACGAAAT CTGACGCTCA AATCAGTGGC
CGAGGCGGGG GGACTGTTCG TAGTGCTTTA GACTGCGAGT TTAGTCACCG
3201 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATCCC AGGCGTTTCC CCCTGGTAGC
CCGCTTTGGG CTGTCCTGAT ATTTCTAGGG TCGGCAAAGG GGGACCATCG
3251 TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCTGCCTTT CGGTTTACCG GTGTCATTCC
AGGGAGCACG CGAGAGGACA AGGACGGAAA GCCAAATGGC CACAGTAAGG
3301 GCTGTTATGG CCGCGTTTGT CTCATTCCAC GCCTGACACT CAGTTCCGGG
CGACAATACC GGCGCAAACA GAGTAAGGTG CGGACTGTGA GTCAAGGCCC
3351 TAGGCAGTTC GCTCCAAGCT GGACTGTATG CACGAACCCC CCGTTCAGTC
ATCCGTCAAG CGAGGTTCGA CCTGACATAC GTGCTTGGGG GGCAAGTCAG
3401 CGACTACCAC GCCCGTTCCG GTAACTATCA ACTTGAGTCC AACCCGGAAA
GCTGATGGTG CGGGCAAGGC CATTGATAGT TGAACTCAGG TTGGGCCTTT
3451 GACACGACAA ATCGCCAGTG GCGGTAGCCA TTGGTAACTG AGATGTGCGA
CTGTGCTGTT TAGCGGTCAC CGCCATCGGT AACCATTGAC TCTACACGCT
3501 GAGATTTATC TGGAGTTCTT GAAGTGGGGG CCTGAGTGCG GCTACACTGG
CTCTAAATAG ACCTCAAGAA CTTCACCCCC GGACTCACGC CGATGTGACC
3551 AAGGACAGTT TAGGTGACTC GTCTCGCACA AGACAGTTAC CAGGTTAAGC
TTCCTGTCAA ATCCACTGAG CAGAGCGTGT TCTGTCAATG GTCCAATTCG
3601 AGTTCCCCAA CTGACCTAAC CTTCGATCAA ACCACCTCCC CAGGTGGTTT
TCAAGGGGTT GACTGGATTG GAAGCTAGTT TGGTGGAGGG GTCCACCAAA
3651 TTTCGTTTTC AGAGCAAGAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA
PL 222 975 B1
AAAGCAAAAG TCTCGTTCTC TAATGCGCGT CTTTTTTTCC TAGAGTTCTT
3701 GATCCTTTTT ACAGGAGCGA TTATCGTCTT CATCCATGAA GGCGTTTGAA
CTAGGAAAAA TGTCCTCGCT AATAGCAGAA GTAGGTACTT CCGCAAACTT
3751 GATTAAACCG GCCTATTTCA TAGATCGTAA AATCAGGGTT TTGGGATGGC
CTAATTTGGC CGGATAAAGT ATCTAGCATT TTAGTCCCAA AACCCTACCG
3801 CGATGAAACC CCATAAAAAC CCATAAATAC ATACACCTAC TAACAATCAT
GCTACTTTGG GGTATTTTTG GGTATTTATG TATGTGGATG ATTGTTAGTA
3851 CTTTTGCTGT ACCAGGGTAT GAAAAGTCTC AGGGTTCCAC CCCAGAATAC
GAAAACGACA TGGTCCCATA CTTTTCAGAG TCCCAAGGTG GGGTCTTATG
3901 GCCATCAACA AGTCCTGTCA CACCGCCAAA TAACATGCAA AAAATTGCGG
CGGTAGTTGT TCAGGACAGT GTGGCGGTTT ATTGTACGTT TTTTAACGCC
3951 ATGACCGTAA TCCGGGGTGC AGATCAATGA CTGAGACAAG TATAAACTTC
TACTGGCATT AGGCCCCACG TCTAGTTACT GACTCTGTTC ATATTTGAAG
4001 ATGCAAAAAG TAATTACAAT CAGTCCCAAA GTCAGCGGTG TCCCGGCCCT
TACGTTTTTC ATTAATGTTA GTCAGGGTTT CAGTCGCCAC AGGGCCGGGA
4051 GATAATCATG CCCGGATTAT CTGAATTTCT CAGCGGGGGC TGTGAGCGCC
CTATTAGTAC GGGCCTAATA GACTTAAAGA GTCGCCCCCG ACACTCGCGG
4101 ACAACCTGTA TCCAAGAGCG GTGCCTACGA GCAGTCCTGC CGTCATCATT
TGTTGGACAT AGGTTCTCGC CACGGATGCT CGTCAGGACG GCAGTAGTAA
4151 GTAAGGCTTA CGCCAGCAAG TTTTGTCTCA GTGATAACAC CTTATGCTCC
CATTCCGAAT GCGGTCGTTC AAAACAGAGT CACTATTGTG GAATACGAGG
4201 CCATACAAGG AAAAGTATCG GGAGAAAAAA CAAACGCCCG GTTGTCATCT
GGTATGTTCC TTTTCATAGC CCTCTTTTTT GTTTGCGGGC CAACAGTAGA
4251 CCCGGTCATA AAGAGCAGCA AAACCGCGTC GTAGTAAAAA AGCCAGCAGG
GGGCCAGTAT TTCTCGTCGT TTTGGCGCAG CATCATTTTT TCGGTCGTCC
4301 ATCAAGCTTC AGGGTTGAGA TGTGTATAAG AGACAGACTC TAGCCAGTTT
TAGTTCGAAG TCCCAACTCT ACACATATTC TCTGTCTGAG ATCGGTCAAA
4351 CCAAGTAGAA ACTACAGTTT CTAAACTGCA ACTTTTTCTA CTTTTTGCAA
GGTTCATCTT TGATGTCAAA GATTTGACGT TGAAAAAGAT GAAAAACGTT
4401 CTTAATCTAT TGACTAGTCC TTTATAAATG TTAAAACATA TATATAGAAA
GAATTAGATA ACTGATCAGG AAATATTTAC AATTTTGTAT ATATATCTTT
MetGlnlle PheValLys ThrLeuThr·
4451 TAAATAAAAA GAGGAGGTTC ATATGCAAAT TTTTGTTAAA ACTTTAACTG
ATTTATTTTT CTCCTCCAAG TATACGTTTA AAAACAATTT TGAAATTGAC
GlyLysThrlle ThrLeuGlu ValGluSerSer AspThrlle AspAsnVal 4501 GTAAAACCAT TACCTTAGAA GTTGAATCTT CAGATACCAT TGATAATGTT
CATTTTGGTA atggaatctt caacttagaa gtctatggta actattacaa
LysSerLysIle GlnAspLys GluGlylle ProProAspGln GlnAlaLeu 4551 AAATCTAAAA TTCAAGATAA AGAAGGTATT CCTCCAGATC AACAAGCTCT
TTTAGATTTT AAGTTCTATT TCTTCCATAA GGAGGTCTAG TTGTTCGAGA •IlePheAla GlyLysGlnLeu GluAspGly AlaThrLeu SerAspTyr4601 AATATTTGCA GGTAAACAGT TAGAAGATGG TGCTACCCTG TCTGATTATA
TTATAAACGT CCATTTGTCA ATCTTCTACC ACGATGGGAC AGACTAATAT
AsnlleGlnLys GluSerThr LeuHisLeuVal LeuAlaLeu AlaGlyGly 4651 ACATTCAGAA AGAATCTACC TTACATCTGG TCTTAGCTCT CGCTGGTGGT
TGTAAGTCTT TCTTAGATGG AATGTAGACC AGAATCGAGA GCGACCACCA
ArgPheValLys GlnHisLeu CysGlySer HisLeuValGlu AlaLeuTyr 4701 CGTTTTGTCA AACAGCACCT GTGTGGTTCT CACCTGGTTG AAGCACTGTA
GCAAAACAGT TGGTCGTGGA CACACCAAGA GTGGACCAAC TTCGTGACAT •LeuValCys GlyGluArgGly PhePheTyr ThrProLys ThrArgArg4751 CCTGGTATGT GGCGAACGTG GTTTCTTCTA CACTCCTAAA ACACGTCGCG
GGACCATACA CCGCTTGCAC CAAAGAAGAT GTGAGGATTT TGTGCAGCGC
GlyIleValGlu GlnCysCys ThrSerlleCys SerLeuTyr GlnLeuGlu 4Θ01 GCATCGTTGA ACAGTGCTGT ACCTCTATCT GTTCCCTGTA CCAACTGGAG
CGTAGCAACT TGTCACGACA TGGAGATAGA CAAGGGACAT GGTTGACCTC
AsnTyrCysAsn Ser***
4851 AACTACTGCA ATTCTTAAGT CGACTCTAGC TACAGCCTCC TTTCGGAGGC
TTGATGACGT TACCAATTCA GCTGAGATCG ATGTCGGAGG AAAGCCTCCG
4901 TGTTTTTTAT C
ACAAAAAATA G
Claims (13)
1. Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól zawierający dwa polipeptydy tworzące łańcuch A i łańcuch B, znamienny tym, że określony jest wzorem ogólnym 1
S-----s
.. i i
Gly-ii6-Val-Gkj-Gin-Cys-Cys-Thr-Ser-lle -Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu13 3 4 s e β a w n 12 ta 14 15 te
S i S Łańcuch A
Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-R
17 13 18 2Q 21 22 g /
Phe-V8l-X-Gln-His-Leu-Cys-Giy-Ser-His-Leu-Val-Głu-Ala-Leu-Tyr1 2 3 4 3 8 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15
Leu-VahCys-Gly-Glu-Arg-GIy-Phe-Phs-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg 17 13 19 20 21 22 23 24 25 25 27 28 29 30 31
Łańcuch B (wzórl), gdzie X stanowi aminokwas zasadowy i oznacza lizynę lub argininę, zaś R oznacza obojętny aminokwas, wybrany spośród glicyny, alaniny, seryny lub treoniny, przy czym sekwencja aminokwasowa łańcucha A jest wybrana spośród SEQ ID Nr 1 do 4, natomiast sekwencja aminokwasowi łańcucha B jest wybrana spośród SEQ ID Nr 5 lub SEQ ID Nr 6, oraz, im analog insuliny ma punkt izoelektryczny o wartości od 6 do 8.
2. Analog według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi analog rekombinowanej insuliny ludzkiej.
3. Analog insuliny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sekwencje aminokwasowe są wybrane w taki sposób, ze gdy X oznacza Lys, to R oznacza Gly albo Ala albo Ser albo Thr, natomiast gdy X oznacza Arg, to R oznacza Gly albo Ala albo Ser albo Thr.
4. Analog insuliny według zastrz., 1 albo 2, znamienny tym, że gdy X oznacza Lys to R oznacza Ser lub Ala.
5. Analog insuliny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje aminokwasowe łańcucha A i łańcucha B zostały wybrane spośród sekwencji SEQ ID Nr 1 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 2 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 3 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 4 z SEQ ID Nr 5, SEQ ID Nr 1 z SEQ ID Nr 6, SEQ ID Nr 2 z SEQ ID Nr 6, SEQ ID Nr 3 z SEQ ID Nr 6 lub SEQ ID Nr 4 z SEQ ID Nr 6.
6. Kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym, znamienna tym, że zawiera analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól określony zastrzeżeniami 1 do 5 w ilości 1,3 mg/ml do 20 mg/ml, przy czym profil glikemiczny kompozycji pozostaje niezmienny w przedziale dawkowania ustalonym w badaniach na co najmniej 12 godzin i, że w kolejnych dobach po osiągnięciu stanu równowagi utrzymywany jest płaski dobowy przebieg krzywej stężenia glukozy we krwi w czasie.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól zawarty jest w ilości 1,4 mg/ml do 10 mg/ml.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że wykazuje przedłużone działanie o stałym poziomie bez wytwarzania maksimum aktywności biologicznej, farmakologicznie równoważnym z naturalną sekrecją podstawowego poziomu insuliny w zdrowym organizmie, wykazując jednocześnie odpowiednią dla form farmaceutycznych leków stabilność w kwaśnych roztworach infekcyjnych o pH o wartości od 3,5 do 5.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że dodatkowo zawiera od 0 do 60 μg/ml cynku, korzystnie 10 do 60 μg/ml.
10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżeń 6 do 9, znamienna tym, że dodatkowo zawiera substancję izotonizującą, substancję konserwującą i ewentualnie substancję buforującą i ewentualnie substancje przeciwdziałające agregacji, stosowane w formulacjach białkowych.
PL 222 975 B1
11. Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli według zastrzeżeń 1 do 5 do leczenia cukrzycy u ssaków.
12. Zastosowanie analogu insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól określonego zastrzeżeniami 1 do 5 do wytwarzania leku o przedłużonym działaniu terapeutycznym do leczenia cukrzycy.
13 Zastosowanie analogu insuliny według zastrz. 12, w którym efektywnie działająca ilość leku na dawkę zawarta jest w przedziale 0,3 do 180 μg/kg masy ciała, przy czym lek podaje się raz na dobę lub rzadziej.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399287A PL222975B1 (pl) | 2012-05-23 | 2012-05-23 | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny |
| EP13730664.3A EP2852400B1 (en) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | An insulin analogue or its pharmaceutically acceptable salt, pharmaceutical composition with prolonged therapeutic effect, use of the insulin analogue, dosage method and method of treatment of diabetes |
| PCT/PL2013/000066 WO2013176560A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | An insulin analogue or its pharmaceutically acceptable salt, pharmaceutical composition with prolonged therapeutic effect, use of the insulin analogue, dosage method and method of treatment of diabetes |
| US14/403,513 US9585942B2 (en) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | Insulin analogue or its pharmaceutically acceptable salt, pharmaceutical composition with prolonged therapeutic effect, use of the insulin analogue, dosage method and method of treatment of diabetes |
| EA201492182A EA030519B1 (ru) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | Аналог человеческого инсулина и его применение |
| PL13730664T PL2852400T3 (pl) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym, zastosowanie analogu insuliny, sposób dawkowania oraz sposób leczenia cukrzycy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399287A PL222975B1 (pl) | 2012-05-23 | 2012-05-23 | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL399287A1 PL399287A1 (pl) | 2013-11-25 |
| PL222975B1 true PL222975B1 (pl) | 2016-09-30 |
Family
ID=48670747
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL399287A PL222975B1 (pl) | 2012-05-23 | 2012-05-23 | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny |
| PL13730664T PL2852400T3 (pl) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym, zastosowanie analogu insuliny, sposób dawkowania oraz sposób leczenia cukrzycy |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL13730664T PL2852400T3 (pl) | 2012-05-23 | 2013-05-22 | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym, zastosowanie analogu insuliny, sposób dawkowania oraz sposób leczenia cukrzycy |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9585942B2 (pl) |
| EP (1) | EP2852400B1 (pl) |
| EA (1) | EA030519B1 (pl) |
| PL (2) | PL222975B1 (pl) |
| WO (1) | WO2013176560A1 (pl) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3837825A1 (de) | 1988-11-08 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| PL213561B1 (pl) | 2004-01-09 | 2013-03-29 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Sposób otrzymywania plazmidu, plazmid oraz zastosowania |
| PL373543A1 (pl) | 2005-03-10 | 2006-09-18 | Instytut Biotechnologii i Antybiotyków | Kompozycja farmaceutyczna zawierająca biosyntetyczny analog insuliny ludzkiej, oraz jej zastosowanie w terapii cukrzycy |
| PL219335B1 (pl) * | 2008-07-04 | 2015-04-30 | Inst Biotechnologii I Antybiotyków | Pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, jej zastosowanie oraz zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna |
-
2012
- 2012-05-23 PL PL399287A patent/PL222975B1/pl unknown
-
2013
- 2013-05-22 PL PL13730664T patent/PL2852400T3/pl unknown
- 2013-05-22 EP EP13730664.3A patent/EP2852400B1/en not_active Not-in-force
- 2013-05-22 EA EA201492182A patent/EA030519B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-05-22 WO PCT/PL2013/000066 patent/WO2013176560A1/en active Application Filing
- 2013-05-22 US US14/403,513 patent/US9585942B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9585942B2 (en) | 2017-03-07 |
| EP2852400A1 (en) | 2015-04-01 |
| WO2013176560A1 (en) | 2013-11-28 |
| EA030519B1 (ru) | 2018-08-31 |
| EP2852400B1 (en) | 2017-04-12 |
| PL399287A1 (pl) | 2013-11-25 |
| PL2852400T3 (pl) | 2017-10-31 |
| US20150164998A1 (en) | 2015-06-18 |
| EA201492182A1 (ru) | 2015-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2321344A2 (en) | New insulin analogues of prolonged activity | |
| ES2477390T3 (es) | Polipéptidos de larga duración de acción y procedimientos para producirlos y administrarlos | |
| JP3676573B2 (ja) | 迅速な作用発現を示す新規インスリン誘導体 | |
| ES2770776T3 (es) | Análogo de la insulina y uso del mismo | |
| JP5694779B2 (ja) | 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体 | |
| TWI513705B (zh) | 纖維母細胞生長因子２１蛋白質 | |
| JP2018508504A (ja) | 持続型インスリンまたはインスリンアナログ結合体 | |
| TW201607553A (zh) | 包含長效胰島素類似物接合物及長效促胰島素肽接合物之治療糖尿病組成物 | |
| JP2014518207A (ja) | 多置換インスリン | |
| JP2015501819A (ja) | ヒト・インスリン類似体及びそのアシル化誘導体 | |
| IT8948564A1 (it) | Processo per la preparazione di costrutti genetici per l'espressione del fattore di crescita nervoso in cellule eucariote. | |
| JP2022088521A (ja) | 長期活性型ポリペプチドならびに当該ポリペプチドの製造方法および投与方法 | |
| KR20160007295A (ko) | 인슐린 아날로그 | |
| KR100649339B1 (ko) | 아연 결합이 향상된 인슐린 동족체 | |
| JP6013330B2 (ja) | 追加のジスルフィド結合を含有するヒトインスリン | |
| JP2018531899A (ja) | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 | |
| ES2693273T3 (es) | Preparación farmacéutica | |
| PL222975B1 (pl) | Analog insuliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu terapeutycznym oraz zastosowanie analogu insuliny | |
| CN117337299A (zh) | 葡萄糖响应性胰岛素类似物葡萄糖传感器的分子设计 | |
| ES2683983T3 (es) | Proteína recombinante |