EA030519B1 - Аналог человеческого инсулина и его применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к аналогу человеческого инсулина и его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции с пролонгированным терапевтическим эффектом, применению аналога инсулина для лечения сахарного диабета и способу лечения сахарного диабета. Конкретнее, данное решение относится к аналогу человеческого инсулина и его фармацевтически приемлемой соли, содержащим два полипептида, образующие А-цепь и В-цепь, которые определены общей формулой 1где X представляет собой остаток основной аминокислоты Lys или Arg, a R представляет собой остаток нейтральной аминокислоты Gly, Ala, Ser или Thr; причем аналог человеческого инсулина характеризуется изоэлектрической точкой со значениями от 6 до 8. Результаты исследований показали улучшение эффектов лечения сахарного диабета посредством устранения наблюдавшегося до сих пор неблагоприятного влияния, которое оказывают изменения концентрации глюкозы в течение дня на организм пациента.

Description

изобретение относится к аналогу человеческого инсулина и его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции с пролонгированным терапевтическим эффектом, применению аналога инсулина для лечения сахарного диабета и способу лечения сахарного диабета. Конкретнее, данное решение относится к аналогу человеческого инсулина и его фармацевтически приемлемой соли, содержащим два полипептида, образующие А-цепь и В-цепь, которые определены общей формулой 1

$- S

I I

Gly-Be-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle -Cys-Ser-Leu-Tуг-Gln-Leu12 3 4 3 6 7\' е ί 1C 11 12 '3 14 15 16

I S А-цепь

Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-R J 17 16 19 20 21 22 θ

/

Phe-Val-X-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Vai-Glu-Ala-Leu-Tyr·

1 2 Э 4 £ 6 7 8 S 10 11 12 13 Μ 15 16

Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Ars-Gly-Phe-Phe-Ty^r-Thr-Pro-Lys -Thr-Arg 17 13 19 2D 21 22 23 24 25 26 27 2Б 29 3D 31

В-цепъ

(формула 1),

где X представляет собой остаток основной аминокислоты Lys или Arg, a R представляет собой остаток нейтральной аминокислоты Gly, Ala, Ser или Thr; причем аналог человеческого инсулина характеризуется изоэлектрической точкой со значениями от 6 до 8. Результаты исследований показали улучшение эффектов лечения сахарного диабета посредством устранения наблюдавшегося до сих пор неблагоприятного влияния, которое оказывают изменения концентрации глюкозы в течение дня на организм пациента.

030519

Настоящее изобретение относится к аналогу человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции с пролонгированным терапевтическим эффектом, применению аналога человеческого инсулина и способу лечения сахарного диабета. Конкретнее, настоящее изобретение относится к соединениям, которые представляют собой стабильные аналоги инсулина, являющиеся фармацевтически активными и характеризующиеся продолжительным пологим истинно безпиковым ходом кривой зависимости концентрации глюкозы от времени при многократном введении, которые не демонстрируют сильные 24-часовые колебания концентрации глюкозы, или так называемый "эффект зубьев пилы" в течение этого времени. Результаты исследований соединений, включенных в объем настоящей заявки, указывают на улучшение эффектов лечения сахарного диабета посредством устранения наблюдавшегося до сих пор неблагоприятного влияния, которое оказывают изменения концентрации глюкозы в течение дня на организм пациента, например, эпизодов ночной гипогликемии, поскольку истинно безпиковый инсулин длительного действия должен воспроизводить надлежащую секрецию эндогенного инсулина, которая обеспечивается здоровой поджелудочной железой на должном и постоянном уровне в течение 24 ч, в ходе терапии.

Инсулин и его различные аналоги обычно применяются в лечении сахарного диабета. Некоторые из них производятся в больших промышленных масштабах. Известны многие различные модифицированные производные инсулина и фармацевтические препараты с различными профилями действия, содержащие эти соединения; однако, не прекращается поиск лекарственного препарата, который был бы способен поддерживать постоянный, т.е. базовый, уровень глюкозы в организме человека в течение продолжительного периода времени, т.е. в течение ночи и между приемами пищи.

В лечении сахарного диабета применяются различные аналоги человеческого инсулина, проявляющие эффект пролонгированного действия. Модификации первичной структуры инсулина приводят к изменению физико-химических и биологических свойств аналогов и, как следствие, к изменению их фармакокинетических и фармакодинамических параметров.

Аналоги инсулина с пролонгированной активностью называются безпиковыми или практически безпиковыми соединениями ввиду их фармакокинетических и фармакодинамических параметров. Важной и необходимой особенностью таких аналогов инсулина, следовательно, является поддержание базового уровня глюкозы в организме без его колебаний, в частности, без явно выраженных максимумов и минимумов их эффекта. Аналоги с такими характеристиками наилучшим образом имитируют естественную секрецию инсулина, предупреждая опасную гипогликемию, в частности, ночную гипогликемию, и снижая частоту ее возникновения (Heller S., Kozlovski P., Kurtzhals P. Insulin's 85^th anniversary - An enduring medical 5 miracle. Diabetes Research and Clinical Practice. 2007; 78(2): 149-158).

Аналоги рекомбинантного человеческого инсулина с пролонгированным эффектом, которые известны и применяются в медицине, получают либо путем ацилирования ε-аминогруппы лизина в положении В29 с использованием алифатической кислоты, содержащей около дюжины атомов углерода, в результате чего формируется сродство к альбумину, либо путем встраивания дополнительных основных аминокислот в С-конец В-цепи человеческого инсулина, что приводит к повышению изоэлектрической точки до значения, превышающего 6. В последнем случае, как следствие, существует возможность получения такой фармацевтической формы лекарственного препарата, которая представляет собой раствор для инъекций в слабокислой среде, из которой происходит осаждение активного вещества после подкожного введения и вступления в контакт с биологическими жидкостями с рН, составляющим приблизительно 7,4. Из такого микроосадка происходит высвобождение активного производного инсулина с постоянной, относительно низкой скоростью, что обеспечивает его пролонгированное действие. Соединение, описанное в заявке на патент № WO 2006/096079, является одним из примеров такого производного. Однако, помимо благоприятного изменения фармакокинетических и фармакодинамических свойств в результате встраивания дополнительных основных аминокислот, наблюдается ухудшение химической стабильности этих аналогов в растворах с рН, соответствующим кислой среде, что чаще всего является результатом дезамидирования аспарагина в положении А21, которое происходит в кислой среде. Эта проблема решается путем замены A21Asn на другую аминокислоту, такую как аспарагиновая кислота, глицин, аланин, треонин и др. Одним из таких аналогов является производное рекомбинантного человеческого инсулина, в котором аспарагин А-цепи (A21Asn) заменен глицином (A21Gly), а к С-концу Вцепи присоединены два аргининовых остатка. Это так называемый инсулин гларгин, производимый под названием Лантус® (патент США 5656722). Другие стабильные производные, в которых карбоксильная группа в остатке A21Asn защищена путем добавления одной аминокислоты в положение А22, описаны в патенте WO 2010/002283 А2.

Несмотря на имеющиеся решения, постоянно продолжается поиск аналога инсулина, который не будет проявлять нежелательные эффекты, такие как наличие явно выраженного максимума активности, несмотря на образование микроосадка после подкожного введения, поскольку только в случае стабильного и пологого профиля активности происходит защита от быстрых колебаний уровня сахара в крови и что очень важно - обеспечиваются достижение таких значений параметров контроля состояния сахарного диабета, которые являются благоприятными для пациента (например, HbAjc, стабильные уровни которо- 1 030519

го снижают риск развития макро- и микроангиопатических осложнений сахарного диабета), а также защита от возникновения эпизодов тяжелой гипогликемии, особенно в течение ночи. В случае имеющихся решений, однако, помимо благоприятного изменения фармакокинетических и фармакодинамических свойств в результате встраивания дополнительных аминокислот наблюдается ухудшение химической стабильности этих аналогов в растворах с рН, соответствующим кислой среде.

Тем не менее, известные аналоги инсулина длительного действия со структурой, аналогичной структуре соединений, включенных в настоящую заявку, и представляющие прогрессивные препараты для лечения сахарного диабета, имеют ряд нежелательных особенностей, например, широко используемый в терапии аналог инсулина, инсулин гларгин, несмотря на образование микроосадка после подкожного введения, проявляет явно выраженный максимум активности (например, Heise T., Nosek L., Ronn B.B., Endahl L., Heinemann L., Kapitza C., Draegeret E. Lower within-subject variability of insulin detemir in comparison to NPH insulin and insulin glargine in people with type 1 diabetes. Diabetes. 2004; 53(6): 16141620; Klein O., Lynge J., Endahl L., Damholt B., Nosek L., Heise T. Albumin-bound basal insulin analogues (insulin detemir and NN344): comparable time-action profiles but less variability than insulin glargine in type 2 diabetes. Diabetes Obes. Metab. 2007; 9(3): 290-299). В то же время в ходе длительной терапии (12 дней) для этого аналога наблюдается так называемый "эффект зубьев пилы", заключающийся в существовании значительных различий между максимальным и минимальным уровнями глюкозы в течение дня и ночи, что указывает на большую изменчивость действия этого соединения (http://www.novonordisk.com/images/investors/investor_presentations/2009/Piper_Jaf fray.pdf).

Второй из известных и используемых в медицине аналогов длительного действия, инсулин детемир, имеющий структуру, отличную от структуры инсулина гларгин, и другой механизм пролонгированного действия, также не является истинно безпиковым соединением (Klein О., Lynge J., Endahl L., Damholt В., Nosek L., Heise T. Albumin-bound basal insulin analogues (insulin detemir and NN344): comparable time-action profiles but less variability than insulin glargine in type 2 diabetes. Diabetes Obes Metab. 2007; 9(3): 290-299; Chaykin LB. Insulin Detemir and Its Unique Mechanism of Action. The Internet Journal of Endocrinology. 2007; 4(1), ISSN: 1540-2606, http://www.ispub.com/ioumal/the-internet-iournal-of-

endocrinology/volume-4-number-1/insulin-detemir-and-its-unique-mechanism-of-action.html). Этот аналог также характеризуется более коротким периодом активности (Porcellati F., Rossetti P., Busciantella N.R., Marzotti S., Lucidi P., Luzio S., Owens D.R., Bolli G.B., Fanelli C.G. Comparison of Pharmacokinetics and Dynamics of the Long-Acting Insulin Analogues Glargine and Detemir at Steady State in Type 1 Diabetes: A double-blind, randomised, crossover study. Diabetes Care. 2007; 30(10): 2447-2452).

Цель настоящего изобретения заключалась в получении соединений, представляющих собой стабильные аналоги человеческого инсулина, которые являются фармацевтически активными и характеризуются продолжительным пологим истинно безпиковым ходом кривой зависимости концентрации глюкозы от времени при многократном введении (4 недели) и которые не демонстрируют сильные 24часовые колебания концентрации глюкозы или так называемый "эффект зубьев пилы" в течение этого времени. Ни один из известных и описанных на сегодняшний день аналогов инсулина длительного действия не имеет такого сочетания параметров активности, желательного и благоприятного для пациента. В то же время новые аналоги инсулина, которые включены в настоящую заявку, проявляют дополнительные, возможно, благоприятные фармацевтические свойства, например, стабильность, которая подходит для создания стабильных фармацевтических форм данного лекарственного средства. Исследования как новых аналогов человеческого инсулина, так и их фармацевтических форм, проводимые с применением стандартных способов в соответствии с действующими фармакопейными требованиями, указывают на их очень благоприятные фармакокинетические и фармакодинамические параметры, наблюдаемые в ходе длительной терапии, а также доказывают, что они обладают такой же хорошей химической стабильностью, как и у человеческого инсулина и его аналогов, известных и применяемых в терапии, и что их химическая стабильность определенно лучше, чем у многих известных производных инсулина, например, описанных в заявке № WO 2010/002283 А2.

Цель, которая определена выше, была достигнута в настоящем изобретении. В этом случае зависимость между активностью и структурой, обуславливающая пролонгированную активность и пологий 24часовой профиль активности после многократного введения, и подходящая для лекарственного средства стабильность превосходят ожидания за счет синергического действия, которое не равно ни сумме, ни среднему значению биологической активности этих белков. Аналоги человеческого инсулина согласно настоящему изобретению удовлетворяют обсуждаемым требованиям.

Было установлено, что продолжительный пологий истинно безпиковый ход кривой зависимости концентрации глюкозы от времени при многократном введении и гликемический профиль, в котором не проявляются значительные 24-часовые колебания в течение этого времени, демонстрировались производными человеческого инсулина, образующими микроосадок после подкожного введения в форме раствора со значением рН, соответствующим слабокислой среде, по причине сниженной растворимости в нейтральной физиологической среде, что характеризовалось повышением их изоэлектрической точки по сравнению с таковой для человеческого инсулина при замене аспарагина в положении 3 В-цепи на основную аминокислоту, такую как лизин (B3Lys) или аргинин (B3Arg). Дополнительное изменение изо- 2 030519

электрической точки достигалось при добавлении аргинина к С-концу В-цепи (B31Arg). Стабильность этих соединений в слабокислой среде, необходимая для получения из этих производных фармацевтических препаратов в форме раствора, достигалась путем добавления другой нейтральной аминокислоты (в положении А22).

Было обнаружено, что соединения такого типа обуславливали практически пологий 24-часовой ход кривой зависимости концентрации глюкозы в крови от времени в течение нескольких дней после достижения равновесной концентрации, что позволяло получить постоянный базовый уровень глюкозы при длительной терапии, точно имитируя естественную секрецию гормона. Гликемический профиль в целом остается неизменным в диапазоне доз, установленном в исследованиях, в течение 12 ч, что наблюдается в случае аналогов, являющихся предметом настоящей заявки.

Таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в получении новых аналогов человеческого инсулина, характеризующихся желательной биологической активностью, т.е. пролонгированным действием на постоянном уровне без формирования максимума биологической активности, что является эквивалентным секреции инсулина на базовом уровне в здоровом организме, обеспечивающих постоянный уровень глюкозы в крови в ходе длительной терапии (при введении один раз в день или реже) и в то же время проявляющих химическую стабильность, подходящую для фармацевтических форм в кислых растворах для инъекций с рН от 3,5 до 5,0.

Согласно настоящему изобретению перечисленные ниже формы инсулина представляют собой примеры производных с общей формулой 1

A22Gly-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин GK3R);

A22Ala-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин AK3R);

A22Ser-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин SK3R);

A22Thr-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин TK3R);

A22Gly-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин GR3R);

A22Ala-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин AR3R);

A22Ser-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин SR3R);

A22Thr-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин TR3R).

В описании настоящего изобретения, с учетом применяемой терминологии, рекомбинантный проинсулин означает полипептидную цепь, в которой А- и В-цепи человеческого инсулина соединены между собой линкером С, который предпочтительно представляет собой дипептид Lys-Arg или Arg-Arg или даже только один остаток Arg. Как и в случае с рекомбинантным препроинсулином, допускаются комбинации проинсулина с дополнительным лидерным полипептидом, например, с убиквитином или SOD, или с их фрагментами или модифицированным фрагментами.

Для упрощения названий аналогов рекомбинантного человеческого инсулина и соответствующих форм проинсулина (и препроинсулина), являющихся объектом настоящего изобретения, для них предполагались обозначения, состоящие из названия (пре)про)инсулин и буквенно-цифрового кода, состоящего из нескольких символов, обозначающих аминокислотные остатки, которые являются дополнительными или которыми были заменены остатки, имеющиеся в исходном рекомбинантном человеческом (пре)про)инсулине. В обсуждаемом случае, эти буквы соответствуют однобуквенному обозначению аминокислотных остатков, признанному в мировой литературе. Один аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, отличающуюся тем, что она содержит эффективное количество аналога инсулина или его фармацевтически приемлемой соли. Солью аналога рекомбинантного человеческого инсулина согласно настоящему изобретению может быть, например, соль щелочного металла или соль аммония.

В целом вспомогательные средства в составе композиций согласно настоящему изобретению представляют собой традиционно применяемые вспомогательные средства, такие же, как и применяемые в фармацевтических белковых составах, включая составы на основе форм инсулина и их аналогов.

Веществом для придания изотоничности согласно настоящему изобретению может быть любое фармацевтически приемлемое вещество, позволяющее получить раствор, изоосмотический по отношению к плазме крови человека. Типичные средства для придания изотоничности, применяемые в фармацевтике, включают хлорид натрия, маннит, глицин и глицерин. Применение глицерина является предпочтительным.

Консерванты, пригодные для применения в фармацевтической композиции согласно настоящему

- 3 030519

изобретению, представляют собой соединения, выбранные из группы, которая включает м-крезол, фенол или их смеси и вещества, препятствующие агрегации аналогов инсулина - полисорбаты или алкилсахариды.

Новые аналоги, как и рекомбинантный человеческий инсулин, предпочтительно стабилизируются за счет внесения в раствор смеси, содержащей ионы цинка, наиболее предпочтительно в виде, помимо прочего, хлорида, ацетата или оксида цинка.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к аналогу человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли, которые содержат два полипептида, образующие А-цепь и Вцепь, и характеризуются тем, что они определены общей формулой 1

s ........................S

I I

Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle “Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu1 2 а Л S 6 7\' 5 9 1C 11 12 1Э 14 15 16

g —--——s А-цепъ

Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-R j

17 IB 19 20 21 22 θ

/

Phe-VaLX-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Vai-Glu-Ala-Leu-Tyr12 3 4 6 6 7 8 β 10 11 12 13 14 16 16

Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-G(y-Phe-Phe-Ty^r-Thr-Pro-Lys -Thr-Arg 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 26 29 30 31

В-цепъ

(формула 1),

где X представляет собой остаток основной аминокислоты Lys или Arg, a R представляет собой остаток нейтральной аминокислоты Gly, Ala, Ser или Thr,

где аминокислотная последовательность А-цепи выбрана из SEQ ID NO:1-4, а аминокислотная последовательность В-цепи выбрана из SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6,

причем аналог человеческого инсулина характеризуется изоэлектрической точкой со значениями от 6 до 8.

Согласно одному варианту осуществления представлен аналог человеческого инсулина, где если X представляет собой Lys, то R представляет собой Ser или Ala.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции с пролонгированным терапевтическим эффектом, содержащей аналог человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящему изобретению в количестве от 1,3 до 20 мг/мл.

Согласно одному варианту осуществления представлена фармацевтическая композиция, содержащая аналог человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемую соль в количестве от 1,4 до 10 мг/мл.

Согласно другому варианту осуществления представлена фармацевтическая композиция, дополнительно содержащая до 60 мкг/мл цинка, предпочтительно от 10 до 60 мкг/мл.

Согласно другому варианту осуществления представлена фармацевтическая композиция, дополнительно содержащая вещество для придания изотоничности, консервант и буферное вещество.

Согласно другому варианту осуществления представлена фармацевтическая композиция, дополнительно содержащая вещество для придания изотоничности, консервант, буферное вещество и вещества, препятствующие агрегации, применяемые в белковых составах.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению аналога человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению для лечения сахарного диабета у млекопитающих.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению аналога человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства с пролонгированным терапевтическим эффектом для лечения сахарного диабета у млекопитающих.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающих, страдающих сахарным диабетом, где млекопитающему, которое нуждается в таком лечении, вводят один раз в день фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению в количестве от 0,3 до 180 мкг/кг массы тела.

Согласно одному варианту осуществления представлен способ лечения млекопитающих, где млекопитающим является человек.

Для лучшей иллюстрации настоящего изобретения решение отражено в фигурах, на которых показано следующее.

На фиг. 1 показана структура плазмиды p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), которая со- 4 030519

держит ген, кодирующий рекомбинантный проинсулин SK3RR.

На фиг. 2 показана структура плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), которая содержит ген, кодирующий рекомбинантный проинсулин SK3RR.

На фиг. 3 показан комплексный график, на котором изображен профиль концентрации глюкозы в крови крыс, характерный для безпиковых препаратов, после однократного введения инсулина SK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 4 показан график изменения концентрации глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин и контрольной группой. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 5 показан график изменения концентрации глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR и контрольной группой (предварительные результаты). Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 6 показан график 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 2 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 7 показан график 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 8 показан комплексный график 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 1, 2 и 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR в дозе 2x 5 Ед/кг массы тела/день (предварительные результаты). Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 9 показан комплексный график, на котором изображен профиль концентрации глюкозы в крови крыс, характерный для безпиковых препаратов, после однократного введения инсулина AK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 10 показан график изменения концентрации глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина AK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин и контрольной группой. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 11 показан комплексный график 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 2 и 4 недель введения инсулина AK3R в дозе 1x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 12 показано сравнение 24-часовых профилей концентрации глюкозы после однократного введения инсулина GKR, инсулина GEKR, инсулина AKR, инсулина GR, инсулина SK3R и инсулина AK3R в дозе 1 x 5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести. Показаны средние значения ± SEM.

На фиг. 13 показаны отдельные графики, изображающие различия в форме 12-часовых профилей концентрации глюкозы в крови обезьян с сахарным диабетом после однократного введения инсулина SK3R и инсулина AKR в дозе 1 Ед/кг массы тела, где М128, М210, F143, F156, М51 - номера и коды животных в исследовании.

На фиг. 14 показаны графики, изображающие различия в форме 24-часовых профилей концентрации глюкозы в крови собак породы бигль после однократного введения инсулина SK3R и инсулина AKR в дозах 0,5 Ед/кг массы тела и 1 Ед/кг массы тела.

На фиг. 15 показаны результаты исследования химической стабильности (которая оценивалась по изменению в содержании родственных белков) для фармацевтических препаратов инсулина AK3R и инсулина SK3R по сравнению с человеческим инсулином и отдельными аналогами с известным длительным действием: инсулин лизарг (WO 2006/096079 А2) и инсулин GR (WO 2010/002283 А2).

На фиг. 16 показаны пространственные структуры мономеров человеческого инсулина и его отдельных аналогов, включая инсулин SK3R, согласно настоящему изобретению, установленные на основании данных, полученных методом ЯМР (International Journal of Biological Macromolecules. 2011, 49:548-554 и собственные неопубликованные данные).

На фиг. 17 показан комплексный график 12-часовых средних профилей концентрации глюкозы через 1, 2, 3 и 4 недели введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR в

- 5 030519

дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день с учетом половых различий.

На фиг. 18 показаны графики 12-часовых средних профилей концентрации глюкозы после 2 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR. Графики для самцов и самок показаны отдельно.

На фиг. 19 показаны графики 12-часовых средних профилей концентрации глюкозы после 3 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR. Графики для самцов и самок показаны отдельно.

На фиг. 20 показаны графики 12-часовых средних профилей концентрации глюкозы после 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR. Графики для самцов и самок показаны отдельно.

В целях лучшего пояснения настоящего изобретения описание дополнено подробным обсуждением вариантов его осуществления.

Примеры

Согласно настоящему изобретению перечисленные ниже формы инсулина представляют собой примеры производных с общей формулой 1

A22Gly-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин GK3R);

A22Ala-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин AK3R);

A22Ser-B3Lys-B31Arg - человеческий инсулин (инсулин SK3R);

A22Thr-B3Lys-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин TK3R);

A22Gly-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин GR3R);

A22Ala-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин AR3R);

A22Ser-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин SR3R);

A22Thr-B3Arg-B3 lArg - человеческий инсулин (инсулин TR3R).

Аналоги инсулина, являющиеся объектом настоящего изобретения, получали с применением стандартных способов генной инженерии. С этой целью модификации гена рекомбинантного человеческого проинсулина производили с применением генетических методик, таких как реакция сайт-направленного мутагенеза. Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора Stratagene (№ по каталогу 200518-5), а в качестве матрицы применяли ДНК плазмиды pIGALZUINS - p5/ZUINS или pIGTETZUINS -p6/ZUINS. Любую другую ДНК, содержащую подходящую последовательность, кодирующую рекомбинантный человеческий проинсулин или препроинсулин, можно также применять в качестве матрицы.

Реакционную смесь применяли для трансформации компетентных клеток подходящего штамма Escherichia coli, таких как клетки DH5a, DH5 или НВ101, при этом в соответствии с идеей настоящего изобретения могут применяться и клетки других штаммов Е. coli, или клетки других микроорганизмов, или другие известные клеточные линии, подходящие для экспрессии рекомбинантных белков. Плазмиду, содержащую определенную модификацию гена рекомбинантного человеческого проинсулина, выделяли и секвенировали, чтобы проверить правильность нуклеотидной последовательности. Согласно одному варианту настоящего изобретения плазмиду с модифицированным геном рекомбинантного человеческого проинсулина применяли для трансформации компетентных клеток Е. coli DH5a, а бактериальные клетки культивировали на питательной среде LB с добавлением селективного антибиотика (0,01 мг/мл) в объеме 500 мл при 37°С и 200 оборотах в минуту в течение 18 ч. Бактериальный материал переносили в банк штаммов, а образцы с соотношением бактериальной культуры и 40% глицерина, составляющим 1:1, хранили при -70°С.

Варианты рекомбинантного препроинсулина, полученные путем экспрессии в штаммах Е. coli, выделяли после расщепления клеток в виде телец включения, которые затем подвергали стандартным способам очистки белков слияния. Гибридный белок с аналогом инсулина (препроинсулином) или проинсулином, полученный после ренатурации, подвергали контролируемому действию трипсина таким же образом, как и в некоторых ранее известных и описанных способах (например, Kemmler W., Peterson J.D., Steiner D.F. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B. J. Biol. Chem. 1971; 246: 6786-6791, а также патенты США 6686177 и 6100376). Полученные аналоги инсулина подвергали очистке с применением известных способов, преимущественно хроматографии низкого давления, ультрафильтрации и/или HPLC. Чтобы получить кристаллическую форму, вещества осаждали из надлежащим образом очищенно- 6 030519

го раствора аналога инсулина, предпочтительно с добавлением иона металла, наиболее предпочтительно цинка.

Основным физико-химическим свойством аналогов рекомбинантного человеческого инсулина согласно настоящему изобретению, отличающим их от человеческого инсулина, является значение их изоэлектрической точки, составляющее от 6 до 8. Это означает хорошую растворимость соединений в растворах с рН, соответствующим среде от кислой до слабокислой. Это свойство обеспечило получение фармацевтической композиции - растворов новых производных инсулина при рН, соответствующем кислой среде.

В случае фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению значение рН раствора составляет от приблизительно 3,5 до приблизительно 5,0, предпочтительно от 4,0 до 4,5.

Структуры молекул рекомбинантного человеческого инсулина и их аналогов, показанных выше, содержащих одну и ту же группу в сердцевине белка, отличаются друг от друга. Подвижность неопределенного конечного фрагмента В-цепи инсулина SK3R, который является менее подвижным по сравнению с человеческим инсулином A22Gly-B31Arg, или так называемым инсулином GR (WO 2010/002283 А2), также влияет на свойства соединения согласно настоящему изобретению, включая повышенную химическую стабильность и биологическую активность данного аналога.

Был разработан следующий приведенный в качестве примера состав композиций, содержащих рекомбинантные производные человеческого инсулина согласно настоящему изобретению: 10-500 Ед/мл аналога рекомбинантного человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли, 16 мг/мл глицерина, 3 мг/мл м-крезола, 10-60 мкг/мл цинка и до 1 мл воды для инъекций.

Количество активного вещества, применяемого в композиции согласно настоящему изобретению, составляет приблизительно 1-1600, предпочтительно 10-1200, более предпочтительно 10-500 Ед/мл. В случае каждого аналога человеческого инсулина, который является объектом настоящего изобретения, под 1 единицей (1Ед) понимается 1 внутрилабораторная единица, содержащая то же количество молей аналога, что и 1 международная единица человеческого инсулина, что соответствует 6 нмоль (или 6 х 10⁹ моль).

Другой аспект настоящего изобретения также представляет собой способ лечения пациентов с сахарным диабетом, в соответствии с которым эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей аналог инсулина или его соль согласно настоящему изобретению, вводят пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Пример 1.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина SK3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B), которая кодирует рекомбинантный проинсулин SRR и описана в примере 3 заявки на патент № 2010/002283 А2. В этой плазмиде фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантного инсулина, присоединен к модифицированному гену синтетического убиквитина. Пептид, составляющий часть убиквитина, является носителем, необходимым для высокого выхода синтезируемого белка слияния в Е. coli. Участок, кодирующий модифицированный белок слияния, помещали под контроль промотора pms (WO 05066344 А2). Плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину и является производным вектора plGAL.1 (AY424310 в GenBank). В гене убиквитина кодоны аргинина были заменены кодонами аланина, и дополнительный кодон аргинина был присоединен к Сконцу гена убиквитина.

Ген рекомбинантного проинсулина SK3RR отличается от исходного гена проинсулина SRR тем, что кодон AAC (Asn) заменен на кодон ААА лизина (Lys) в положении 3 В-цепи. Для того, чтобы модифицировать кодирующую последовательность гена рекомбинантного проинсулина SRR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

KSRL

5’ GGTGGTCGTTTTGTCAAACAGCAC 3’

Lys

KSRP

5’ ACCACACAGGTGCTGTTTGACAAA 3’

Lys

Используя ДНК плазмиды p5/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B) в качестве матрицы, проводили реакцию точечного мутагенеза с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). При помощи

- 7 030519

известных способов реакционную смесь применяли для трансформации компетентных клеток Escherichia coli DH5a. Плазмиду выделяли и секвенировали для подтверждения присутствия нуклеотидов кодона ААА, кодирующего лизин, и правильности последовательности плазмиды. Полученную плазмиду p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) с геном рекомбинантного проинсулина SK3RR применяли для трансформации компетентных клеток Е. coli DH5a, а бактериальные клетки культивировали на питательной среде LB с добавлением ампициллина (0,01 мг/мл) в объеме 500 мл при 37°С и 200 оборотах в минуту в течение 18 ч. Получали бактериальный материал для банка штаммов, и образцы с соотношением бактериальной культуры и 40% глицерина, составляющим 1: 1, хранили при -70°С.

Полученный штамм Escherichia coli представляет собой исходный биологический материал в способе получения инсулина SK3R путем биосинтеза в соответствии с примером 13.

Генная конструкция на основе плазмиды p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B)

Плазмида p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), содержащая 4775 пар оснований, состоит из следующих регуляторных последовательностей и генов:

в пределах от 374 п.о. до 1234 п.о. расположен ген устойчивости к ампициллину AMP R, в пределах от 4158 п.о. до 4323 п.о. расположен участок, кодирующий промотор pms, в пределах от 4327 п.о. до 4554 п.о. содержится последовательность, кодирующая модифицированный ген синтетического убиквитина ZUBI,

в пределах от 4558 п.о. до 4722 п.о. расположена последовательность, кодирующая ген рекомбинантного проинсулина SK3RR,

в пределах от 4729 п.о. до 4775 п.о. расположен участок, кодирующий терминатор транскрипции

Ter.

Структура плазмиды p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), которая содержит ген, кодирующий рекомбинантный проинсулин SK3RR, схематически изображена на фиг. 1, а ее нуклеотидные и аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO:23.

Пример 2.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSGly(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина GK3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин SK3RR и полученную в соответствии с примером 1. Ген рекомбинантного проинсулина GK3RR отличается от исходного гена проинсулина SK3RR тем, что кодон ТСТ (Ser) заменен на кодон GGT глицина (Gly) в положении 22 А-цепи.

Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина SK3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

GLYP

5’ TACTGCAATGGTTAAGTCGACTCTAGC 3’

Gly стоп-кодон

GLYL

5’ GAGTCGACTTAACCATTGCAGTAGTT 3’

Gly

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды p5/ZUINSGly(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Полученный штамм Escherichia coli представляет собой исходный биологический материал в способе получения инсулина GK3R путем биосинтеза в соответствии с примером 11.

Пример 3.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSAla(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина AK3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин SK3RR, полученную в соответствии с примером 1. Ген рекомбинантного проинсулина AK3RR отличается от исходного гена проинсулина SK3RR тем, что кодон ТСТ (Ser) заменен на кодон GCT аланина (Ala) в положении 22 А-цепи.

- 8 030519

Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина SK3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

ALAP

5’ TACTGCAATGCTTAAGTCGACTCTAGC 3’

Ala стоп-кодон

ALAL

5’ GAGTCGACTTAAGCATTGCAGTAGTT 3’

Ala

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды

p5/ZUINSAla(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Полученный штамм Escherichia coli представляет собой исходный биологический материал в способе получения инсулина AK3R путем биосинтеза в соответствии с примером 12.

Пример 4.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSThr(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина TK3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин SK3RR, полученную в соответствии с примером 1. Ген рекомбинантного проинсулина TK3RR отличается от исходного гена проинсулина SK3RR тем, что кодон ТСТ (Ser) заменен на кодон АСС треонина (Thr) в положении 22 А-цепи.

Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина SK3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

THRP

5’ TACTGCAATACCTAAGTCGACTCTAGC 3’

Thr стоп-кодон

THRL

5’ GAGTCGACTTAGGTATTGCAGTAGTT 3’

Thr

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды

p5/ZUINSThr(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Пример 5.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSGly(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина GR3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSGly(22A)Arg(31B)Arg(32B), которая кодирует рекомбинантный проинсулин GRR и описана в примере 2 заявки на патент № WO 2010/002283 А2. Ген рекомбинантного проинсулина GR3RR отличается от исходного гена проинсулина GRR тем, что кодон AAC (Asn) заменен на кодон CGT аргинина (Arg) в положении 3 В-цепи.

Для того, чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинантного проинсулина GRR, вышеуказанным способом, были

разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

- 9 030519

ARGP

5’ TTTGTCCGTCAGCACCTGTGTGGTTCT 3’

Arg

ARGL

5’ CAGGTGCTGACGGACAAAACGACCACC 3’

Arg

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды p5/ZUINSGly(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Пример 6.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSAla(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина AR3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSGly(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин GR3RR, полученную в соответствии с примером 5. Ген рекомбинантного проинсулина AR3RR отличается от исходного гена проинсулина GR3RR тем, что кодон GGT (Gly) заменен на кодон GCT аланина (Ala) в положении 22 А-цепи.

Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина GR3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

ALAP

5’ TACTGCAATGCTTAAGTCGACTCTAGC 3’

Ala стоп-кодон

ALAL

5’ AGAGTCGACTTAAGCATTGCAGTAGTT 3’

Ala

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды p5/ZUINSAla(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Пример 7.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSSer(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина SR3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSGly(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин GR3RR, полученную в соответствии с примером 5. Ген рекомбинантного проинсулина SR3RR отличается от исходного гена проинсулина GR3RR тем, что кодон GGT (Gly) заменен на кодон ТСТ серина (Ser) в положении 22 А-цепи.

Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина GR3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

- 10 030519

SERP

5’ TACTGCAATTCTTAAGTCGACTCTAGC 3’

Ser стоп-кодон

SERL

5’ AGAGTCGACTTAAGAATTGCAGTAGTT 3’

Ser

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды

p5/ZUINSSer(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Полученный штамм Escherichia coli представляет собой исходный биологический материал в способе получения инсулина SR3R путем биосинтеза в соответствии с примером 14.

Пример 8.

Конструирование плазмиды p5/ZUINSThr(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина TR3RR, применяли плазмиду p5/ZUINSGly(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин GR3RR, полученную в соответствии с примером 5. Ген рекомбинантного проинсулина TR3RR отличается от исходного гена проинсулина GR3RR тем, что кодон GGT (Gly) заменен на кодон ACT треонина (Thr) в положении 22 А-цепи.

Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина GR3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

THRG

5’ TACTGCAATACTTAAGTCGACTCTAGC 3’

Thr стоп-кодон

THRD

5’ AGAGTCGACTTAAGTATTGCAGTAGTT 3’

Thr

Реакцию точечного мутагенеза проводили с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). Выделение и подтверждение правильности нуклеотидной последовательности плазмиды, а также получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды

p5/ZUINSThr(22A)Arg(3B)Arg(31B)Arg(32B) проводили в соответствии с примером 1.

Пример 9.

Конструирование плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина SK3RR, применяли плазмиду p6/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B), которая кодирует рекомбинантный проинсулин SRR и описана в примере 6 заявки на патент № WO 2010/002283 А2. Ген рекомбинантного проинсулина - подобно вектору р5 (пример 1) - присоединен к модифицированному гену синтетического убиквитина и содержит ген устойчивости к тетрациклину. Участок, кодирующий модифицированный белок слияния, помещают под контроль промотора pms (заявка на патент № WO 05066344 А2).

Ген рекомбинантного проинсулина SK3RR отличается от исходного гена проинсулина SRR тем, что кодон AAC (Asn) заменен на кодон ААА лизина (Lys) в положении 3 В-цепи. Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина SRR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

- 11 030519

KSRL

5’ GGTGGTCGTTTTGTCAAACAGCAC 3’

Lys

KSRP

5’ ACCACACAGGTGCTGTTTGACAAA 3’

Lys

Используя ДНК плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Arg(31B)Arg(32B) в качестве матрицы, проводили реакцию точечного мутагенеза с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5). При помощи известных способов реакционную смесь применяли для трансформации компетентных клеток Escherichia coli DH5a. Плазмиду выделяли и секвенировали для подтверждения присутствия нуклеотидов кодона ААА, кодирующего лизин, и правильности последовательности плазмиды. Полученную плазмиду p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) с геном рекомбинантного проинсулина SK3RR применяли для трансформации компетентных клеток Е. coli DH5a, а бактериальные клетки культивировали на питательной среде LB с добавлением тетрациклина (0,01 мг/мл) в объеме 500 мл при 37°С и 200 оборотах в минуту в течение 18 ч. Получали бактериальный материал для банка штаммов, и образцы с соотношением бактериальной культуры и 40% глицерина, составляющим 1:1, хранили при -70°С.

Генная конструкция на основе плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B)

Плазмида p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), содержащая 4911 пар оснований, состоит из следующих регуляторных последовательностей и генов:

в пределах от 146 п.о. до 1336 п.о. расположен ген устойчивости к тетрациклину ТЕТ R, в пределах от 4304 п.о. до 4469 п.о. расположен участок, кодирующий промотор pms, в пределах от 4473 п.о. до 4703 п.о. содержится последовательность, кодирующая модифицированный ген синтетического убиквитина ZUBI,

в пределах от 4704 п.о. до 4868 п.о. расположена последовательность, кодирующая ген проинсулина SK3RR,

в пределах от 4875 п.о. до 4911 п.о. расположен участок, кодирующий терминатор транскрипции

Ter.

Структура плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), которая содержит ген, кодирующий рекомбинантный проинсулин SK3RR, схематически изображена на фиг. 2, а ее нуклеотидные и аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO:24.

Пример 10.

Конструирование плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B) и получение штамма, трансформированного с ее помощью

Для того, чтобы получить ген рекомбинантного проинсулина SK3R с единственным аргининовым остатком на конце В-цепи, применяли плазмиду p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B), кодирующую рекомбинантный проинсулин SK3RR.

Ген рекомбинантного проинсулина SK3R отличается от исходного гена проинсулина SK3RR делецией кодона CGC (Arg) в положении 32 В-цепи. Для того, чтобы модифицировать ген кодирующей последовательности рекомбинантного проинсулина SK3RR вышеуказанным способом, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

SARGL

5’ ACTCCTAAAACACGTGGCATCGTT 3’

SARGP

5’ AACGATGCCACGTGTTTTAGGAGT 3’

Используя ДНК плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B) в качестве матрицы, проводили реакцию точечного мутагенеза с применением набора от Stratagene (№ по каталогу 200518-5).

При помощи известных способов реакционную смесь применяли для трансформации компетентных клеток Escherichia coli DH5a. Плазмиду выделяли и секвенировали для подтверждения делеции нуклеотидов кодона CGC, кодирующего аргинин, и правильности последовательности плазмиды. Получение бактерий Е. coli DH5a с помощью плазмиды p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B) проводили в соответствии с примером 1.

- 12 030519

Пример 11. Получение инсулина GK3R

Инсулин GK3R получали в способе биосинтеза, который выполняли классическим путем (инокулят, инокулируемая культура, продуцирующая культура) с применением штамма Escherichia coli, который содержал фрагмент ДНК, кодирующий рекомбинантный проинсулин GK3RR, сконструированный в соответствии с примером 2. Функционирование продуцирующей культуры поддерживали в ферментере объемом 150 дм в течение 20 ч при температуре 37°С с контролем рН, температуры, числа оборотов мешалки, оптической плотности, концентрации глюкозы и аэрации. В условиях ферментации препроинсулин GK3RR продуцировался внутриклеточно в виде телец включения. По окончании ферментации бульон охлаждали и концентрировали, а оставшийся биологический материал отмывали от минеральных веществ, содержащихся в питательной среде. Затем его подвергали расщеплению лизоцимом в буфере, содержащем Triton. Затем осуществляли процесс дезинтеграции клеток, и полученную суспензию телец включения центрифугировали, отмывали и снова центрифугировали, получая в конечном итоге гомогенизированный осадок телец включения, содержащих препроинсулин GK3RR.

Полученный гомогенат растворяли (10-15 мг/см³) в растворе бикарбоната натрия с добавлением EDTA и подвергали ренатурации и обратимому цитраконилированию в ходе реакции с цитраконовым ангидридом для защиты аминогрупп лизина. Растворенный белок подвергали расщеплению трипсином для отрезания лидерного белка и разрезания цепей инсулина. В результате действия трипсина получали инсулин GK3R. Полученный белок в растворе подвергали очистке с применением жидкостной хроматографии низкого давления на геле DEAE-сефарозы FF, а затем проводили децитраконилирование и осаждение неочищенного белка с добавлением хлорида цинка. Неочищенный инсулин GK3R подвергали очистке с применением жидкостной хроматографии низкого давления на геле Q-сефарозы FF, а затем - с применением жидкостной хроматографии высокого давления на геле Kromasil RP С8 100А, 13 мкм. Очищенный инсулин GK3R выделяли из основной фракции в результате последовательного выполнения осаждения с добавлением хлорида цинка, гель-фильтрации на слое Sephadex G-25 и заключительной кристаллизации с применением ацетата цинка.

Из одной порции телец включения было получено приблизительно 5,4 г кристаллического инсулина GK3R с чистотой по HPLC более 99%.

Структура продукта подтверждалась следующими результатами:

молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии, составляет 6035 и соответствует теоретическому значению (6035,0);

пептидная карта: соответствует;

аминокислотные последовательность и состав: соответствуют теоретическим значениям.

Пример 12. Получение инсулина AK3R

Следуя процедуре, аналогичной той, которая описана в примере 11, применяя штамм Escherichia coli, содержащий фрагмент ДНК, который кодирует предшественник инсулина AK3R, где фрагмент сконструирован в соответствии с примером 3, из аналогичной порции телец включения получали 5,2 г инсулина AK3R с чистотой по HPLC более 98%.

Структура продукта подтверждалась следующими результатами:

молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии, составляет 6049 и соответствует теоретическому значению (6049,0);

пептидная карта: соответствует;

аминокислотные последовательность и состав: соответствуют теоретическим значениям.

Значение изоэлектрической точки, определенное с помощью капиллярного электрофореза, составляет 7,0.

Пример 13. Получение инсулина SK3R

Следуя процедуре, аналогичной той, которая описана в примере 11, применяя штамм Escherichia coli, содержащий фрагмент ДНК, который кодирует проинсулин SK3RR, где фрагмент сконструирован в соответствии с примером 1 или примером 9, или штамм Escherichia coli, содержащий фрагмент ДНК, который кодирует проинсулин SK3R, где фрагмент сконструирован в соответствии с примером 10, из аналогичной порции телец включения получали 5,0-6,2 г инсулина SK3R с чистотой по HPLC более 99%.

В каждом случае структура продукта подтверждалась следующими результатами:

молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии, составляет 6065 и соответствует теоретическому значению (6065,0); пептидная карта: соответствует.

Значение изоэлектрической точки, определенное с помощью капиллярного электрофореза, составляет 7.0.

Пример 14. Получение инсулина SR3R

Инсулин SR3R получали в способе биосинтеза с применением штамма Escherichia coli, содержащего фрагмент ДНК, который кодирует проинсулин SR3RR, сконструированный в соответствии с примером 7. Способ биосинтеза осуществляли в ферментере объемом 150 дм³, а полученный биологический материал обрабатывали с применением процедуры, аналогичной описанной в примере 11. Полученный гомогенат телец включения подвергали контролируемому трипсинолизу для отрезания лидерного белка

- 13 030519

и разрезания цепей инсулина.

Все эти действия, а также очистку на последующих этапах проводили с применением процедуры, аналогичной описанной в примере 11.

Из аналогичной порции телец включения получали 3,5 г инсулина SR3R с чистотой по HPLC более

97%.

Структура продукта подтверждалась следующими результатами:

молекулярная масса, определенная с помощью масс-спектроскопии, составляет 6094 (тогда как теоретическое значение составляет 6093,0);

пептидная карта: соответствует.

Пример 15. Получение фармацевтического препарата - раствора инсулина SK3R (100 Ед/мл)

100 мл фармацевтического препарата - раствора инсулина SK3R (100 Ед/мл) получали в следующем

составе на 1 мл готового препарата:

инсулин SK3R (пример 13) 3,64 мг/мл (100 Ед/мл);

м-крезол

безводный глицерин

цинк

вода для инъекций

2,7 мг/мл;

16,0 мг/мл;

30,0 мкг/мл;

до 1,0 мл.

pH 4,0

Полученную смесь фильтровали в стерильных условиях через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, а затем отмеряли в картриджи объемом 3 мл.

Было обнаружено, что фармацевтический препарат - раствор инсулина SK3R (100 Ед/мл) является стабильным по результатам ускоренного испытания на стабильность (пример 19).

Пример 16. Получение фармацевтического препарата - раствора инсулина SK3R (100 Ед/мл)

100 мл фармацевтического препарата - раствора инсулина SK3R (100 Ед/мл) получали в следующем

составе на 1 мл готового препарата:

инсулин SK3R (пример 13) 3,64 мг/мл (100 Ед/мл);

м-крезол

безводный глицерин

цинк

вода для инъекций

2,7 мг/мл;

16,0 мг/мл;

11,0 мкг/мл; до 1,0 мл.

pH 4,0

Полученную смесь фильтровали в стерильных условиях через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, а затем отмеряли в картриджи объемом 3 мл.

Пример 17. Получение фармацевтического препарата - раствора инсулина SK3R (100 Ед/мл)

100 мл фармацевтического препарата - раствора инсулина SK3R (100 Ед/мл) получали в следующем

составе на 1 мл готового препарата:

- 14 030519

инсулин SK3R (пример 13)	3,64 мг/мл (100 Ед/мл);
м-крезол	2,7 мг/мл;
безводный глицерин	16,0 мг/мл;
цинк	11,0 мкг/мл;
полисорбат 20	20,0 мг/мл;
вода для инъекций	до 1,0 мл.
pH	4,0

Полученную смесь фильтровали в стерильных условиях через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, а затем отмеряли в картриджи объемом 3 мл.

Пример 18. Получение фармацевтического препарата - раствора инсулина AK3R (100 Ед/мл)

100 мл фармацевтического препарата - раствора инсулина AK3R (100 Ед/мл) получали в следующем составе на 1 мл готового препарата:

инсулин AK3R (пример 12) 3,63 мг/мл (100 Ед/мл);

pH 4,0

Процедура была идентична описанной в примере 15, но вместо инсулина SK3R применяли инсулин AK3R (в количестве 363 мг, 10000 Ед).

Было обнаружено, что фармацевтический препарат - раствор инсулина AK3R (100 Ед/мл) является стабильным по результатам ускоренного испытания на стабильность (пример 19).

Пример 19. Исследование долгосрочной стабильности фармацевтических препаратов: раствор инсулина SK3R (100 Ед/мл) и раствор инсулина AK3R (100 Ед/мл)

Фармацевтические препараты - раствор инсулина SK3R (100 Ед/мл) и раствор инсулина AK3R (100 Ед/мл) - полученные в соответствии с примерами 15 и 18 соответственно, подвергали испытанию долгосрочной стабильности.

В ходе исследования долгосрочной стабильности анализировали содержание родственных белков, активного вещества и ковалентных полимеров. Любые изменения этих параметров являются критерием химической стабильности белка. На фиг. 15 показано изменение в содержании родственных белков для фармацевтических препаратов инсулина AK3R и инсулина SK3R по сравнению с человеческим инсулином и другими отдельными аналогами длительного действия, которые являются предметами заявок №№

WO 2006/096079 А2 и WO 2010/002283 А2.

Пример 20. Исследование активности инсулина SK3R на животных с экспериментальным сахарным диабетом

Результаты исследований в модели экспериментального сахарного диабета у крыс WAG (индуцированного стрептозоцином в дозе 38 мг/кг массы тела) однозначно подтвердили гипогликемическое действие инсулина SK3R. Это действие имеет явно выраженные признаки пролонгированного действия. Исследования включали группу крыс линии WAG общей численностью 109 особей.

После однократного введения аналога SK3R, концентрация глюкозы в крови крыс постепенно снижается до практически нормогликемических значений (приблизительно 100 мг/дл) независимо от дозы (исследуемые дозы: 2,5, 5 и 7,5 Ед/кг массы тела). Среднее время достижения максимального эффекта указывает на длительное всасывание из участка введения. Максимальное гипогликемическое действие имеет место в период от 1 до 6 ч после введения аналога. Ход кривой в это время имеет вид плато, что характерно для препаратов безпикового инсулина. Концентрация глюкозы затем постепенно повышается, достигая исходных значений через 24 ч.

Инсулин гларгин длительного действия (препарат Лантус) был эталонным препаратом в исследованиях. Установленные статистически значимые (критерий Ньюмана-Кейлса, α=0,05) различия в ходе гли- 15 030519

кемических профилей после однократного введения инсулина SK3R и инсулина гларгин подтверждают небольшую разницу в фармакодинамических профилях обеих форм инсулина - профиль аналога SK3R имеет более пологий и равномерный ход. После многократного введения (2 раза в день в дозе 5 Ед/кг массы тела в течение 28 дней) инсулин SK3R вызывает непрерывное снижение концентрации глюкозы в крови. Это действие является стабильным, значительно отличаясь от действия эталонного препарата инсулина гларгин. Это также подтверждается средним значением коэффициента вариации CV% последовательных концентраций в профилях в период между 14-м и 28-м днями исследования (т.е. после достижения стабильного эффекта), которое составляет 11,3% для аналога SK3R и 21,1% для инсулина гларгин. Действие инсулина SK3R также является значительно более сильным (подтверждено статистически: критерий Ньюмана-Кейлса, α=0,05), что может свидетельствовать о более высоком уровне активности этого инсулина по сравнению с инсулином гларгин.

12-часовой гликемический профиль, который определяли после 2 и 4 недель многократного введения, подтвердил, что гипогликемическая кривая во всех моментах времени (0,5-12 ч) характеризуется аналогичным ходом вне зависимости от дня исследования. Эти наблюдения подтверждают предположение о равномерном и чрезвычайно стабильном гипогликемизирующем эффекте инсулина SK3R, что обеспечивает поддержание его постоянного уровня в организме в ходе длительной терапии. Такая особенность выразительно отличает его от инсулина гларгин, с которым его сравнивали в проведенных исследованиях (установленная статистическая значимость в большинстве исследованных моментов, α=0,05).

Различия в профилях действия, подобные описанным выше, могут быть замечены при сравнении результата исследований инсулина SK3R с предварительными результатами исследований инсулина GEKR (представителя группы соединений, включенных в заявку на патент № WO 2010/002283 А2, которые не содержат основной аминокислоты Lys в положении ВЗ). Основываясь на этих сравнениях, можно утверждать, что включение аминокислоты Lys в положение B3 полностью подавляет сильный и очень быстрый компонент эффекта (характеризующий всю группу этих соединений), явно увеличивает продолжительность фармакологического эффекта и делает его нетипичным даже в ходе длительной терапии.

На основании показанных результатов можно утверждать, что аналог SK3R обладает свойствами безпиковых форм инсулина длительного действия и может иметь терапевтическое применение в качестве базального инсулина, вводимого один раз в день. В то же время инсулин SK3R отличается от коммерчески доступных эквивалентов значительно лучшим, стабильным и равномерным гипогликемическим профилем. Такой равномерный уровень концентрации инсулина в течение дня, имитирующий эндогенную постоянную секрецию поджелудочной железой, является особенно желательным в лечении сахарного диабета.

Возможно, что более высокая биологическая активность аналога SK3R может позволять понижать дозы инсулина, применяемые для достижения ожидаемого эффекта, не только снижая риск возникновения дозозависимого нежелательного эффекта, но также обеспечивая экономические преимущества.

Результаты, показывающие концентрацию глюкозы в крови крыс после однократного введения инсулина SK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой), показаны в таблице 1.

Комплексный график, на котором изображен профиль концентрации глюкозы в крови крыс, характерный для безпиковых препаратов после однократного введения инсулина SK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести, показан на фиг. 3.

Результаты, представляющие концентрацию глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой), показаны в таблице 2 и на фиг. 4.

Результаты, представляющие концентрацию глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR, показаны в табл. 3 и на фиг. 5.

Результаты, представляющие 12-часовые профили концентрации глюкозы после 2 и 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой), показаны в табл. 4 и на фиг. 6-7.

Результаты, представляющие 12-часовые профили концентрации глюкозы после 1, 2 и 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR, показаны в табл. 5.

Комплексный график 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 1, 2 и 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного

- 16 030519

диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR показан на фиг. 8 (предварительные результаты).

Таблица 1. Концентрация глюкозы в крови крыс после однократного введения инсулина SK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой)

Модель сахарного диабета

Изучаемый препарат

Подкожная доза

Число крыс в Группе

Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) + SEM

Нормогликемия

Хроническая гипергликемия

Время забора крови после однократного введения препарата

Часы

0

0,5

1

2

4

6

8

10

12

24

Средней степени тяжести (стрептозоцин 38 мг/кг массы тела, внутримышечно)

Инсулин SK3R

2,5 Ед/кг массы тела

12

86,8 ± 1,0

489,6 ± 19,7

276,5 ± 21,5 Λ

214,8 ± 21,9 Λ

171,3 ±25,9 *А

156,4 ± 21,6 Λ

165,0 ± 16,5 Λ

241,3 ± 28,6 *Л

337,3 ± 34,7 * Λ

422,9 ± 32,1 *

462,6 ± 17,6

Инсулин гларгин

7

84,6 ± 2,3

496,3 ±33,3

299,9 ± 38,2

220,3 ± 23,5

71,6 ± 9,1

122,7 ± 31,8

234,6 ±49,1

387,7 ± 45,9

464 6 ± 54,2

537,0 ± 15,6

506,3 ± 26,5

Инсулин SK3R

5 Ед/кг массы тела

15

80,0 ± 1,4

480,3 ± 16,0

335,9 ± 15,5 *А

224,7 ± 23,5 Λ

200,7 ±28,0 *А

171,7 ± 17,9 *А

104,4 ±7,9 Λ

186,5 ± 26,9 *А

261,3 ± 28,6 Λ

393,9 ± 26,8 Λ

476,2 ± 21,2

Инсулин гларгин

7

78,3 ±0,8

487,4 ± 17,8

412,9 ± 17,8

249,6 ± 35,8

98,1 ± 6,8

69,7 ± 5,6

93,6 ± 13,4

86,0 ± 10,2

207,9 ± 27,0

352,3 ± 29,8

438,4 ± 17,6

Инсулин SK3R

7,5 Ед/кг массы тела

10

85,7 ± 1,5

531,1 ± 15,4

246,6 ± 27,7 Λ

150,8 ± 20,5 Λ

4Ί -т й ιι-, ΓΊ -н

131,5 ± 19,4 Λ

116,5 ± 11,2 Λ

188,1 ± 27,6 Λ

296,5 ± 37,7 *А

408,5 ± 47,5

427,3 ± 37,3

Инсулин гларгин

7

81,3 ±2,0

519,0 ±26,0

303,0 ± 20,7

173,0 ± 10,6

69,3 ± 4,3

110,3 ± 5,0

128,1 ±9,2

167,7 ± 8,4

191,0 ± 7,3

458,0 ± 23,4

482,0 ± 27,4

Контроль

30 мкл/300 г массы тела

10

81,7 ± 1,8

502,9 ± 18,0

493,6 ± 13.4

460,6 ± 12.2

475,6 ± 15.7

461,6 ± 17.4

407,7 ± 19.2

430,1 ± 22.4

450,3 ± 12.7

472,2 ± 17.1

513,7 ± 17.0

Уровень значимости (критерий Ньюмана-Кейлса):

* р < 0,05 инсулин SK3R по сравнению с инсулином гларгин

^Λ р < 0,05 инсулин SK3R по сравнению с контролем

Таблица 2. Концентрация глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения

инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой)

Изучаемый препарат

Число крыс в группе

Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM

Нормогликемия

Хроническая гипергликемия

Последовательные дни исследования

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день

21

79,9 ± 0,9

496,3 ± 11,5

433,9 ± 14,0

363,6 ±21,1 А

301,8 ±20,5 А

268,4 ± 19,1 А

273,4 ±20,0 А

272,0 ±21,9 *А

173,4 ± 13,7 А

198,9 ± 13,7 А

155,5 ±8,4 *А

166,2 ±9,0 *А

143,6 ±4,4 *А

138,2 ± 5,4 *А

141,3 ±5,3 *А

137,9 ±2,7 *А

Инсулин гларгин, 2x5 Ед/кг массы тела/день

12

82,7 ± 1,4

497,8 ± 13,0

458,8 ± 20,4

336,2 ±35,6

292,4 ± 30,2

281,5 ±23,0

250,3 ±24,2

209,3 ± 14,9

210,7 ± 17,9

226,8 ±22,5

232,8 ±20,9

209,4 ±22,6

248,0 ±25,2

230,0 ±22,6

233,7 ±21,9

262,7 ±22,7

Контроль, 30 мкл/300 г массы тела/день

8

81,5 ± 1,8

480,9 ± 13,6

468,4 ± 10,4

455,6 ± 13,8

459,3 ± 12,5

458,9 ± 11,5

477,5 ± 10,8

493,4 ±8,6

507,8 ± 12,3

482,6 ± 12,3

497,5 ±25,3

491,8 ±20,0

506,4 ± 13,2

499,4 ± 15,7

446,3 ± 18,0

502,6 ± 15,4

Изучаемый препарат

Число крыс в группе

Нормогликемия

Хроническая гипергликемия

Послед

овательные дни исследования

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день

21

79,9 ± 0,9

496,3 ± 11,5

143,9 ± 4,7 *А

140,8 ±3,2 *А

136,3 ±2,0 * А

1354 ±2,1 *А

151,2 ±6,1 *А

163,7 ±6,7 * А

164,2 ±7,8 *А

146,6 ±3,3 *А

135,2 ±4,8 *А

134,3 ±4,8 *А

137,3 ±6,0 * А

139,9 ±4,7 * А

144,2 ±3,0 *А

137,6 ±6,3 *А

Инсулин гларгин, 2x5 Ед/кг массы тела/день

12

82,7 ± 1,4

497,8 ± 13,0

235,7 ± 26,4

271,1 ± 19,8

296,6 ± 17,3

325,4 ± 17,5

336,9 ± 16,4

338,3 ±21,1

312,0 ±21,5

310,5 ±32,6

291,0 ±25,2

322,8 ±26,6

340,3 ± 18,3

338,3 ± 18,4

324,0 ± 19,4

262,6 ±23,7

Контроль, 30 мкл/300 г массы тела/день

8

81,5 ± 1,8

480,9 ± 13,6

499,5 ± 16,2

496,3 ±8,7

513,3 ± 12,3

510,3 ± 12,1

495,0 ± 15,2

485,4 ±22,0

488,8 ±8,1

465,8 ± 13,5

463,8 ± 17,8

464,8 ± 12,6

466,0 ± 10,1

461,1 ± 12,5

458,0 ± 16,2

465,1 ± 16,9

Уровень значимости: * р < 0,05 инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день по сравнению с инсулином гларгин, 2x5 Ед/кг массы тела/день

^Λ р < 0,05 инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день по сравнению с контролем

- 17 030519

Таблица 3. Концентрация глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR (предварительные результаты)

Изучаемый препарат

Число крыс в группе

Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM

Хроническая гипергликемия

Последовательные дни исследования

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Инсулин SK3R, 2x5 Ед

21

496,3 ± 11,5

433,9 ± 14,0

363,6 ± 21,1

301,8 ± 20,5

268,4 ± 19,1

273,4 ± 20,0

272,0 ± 21,9

173,4 ± 13,7

198,9 ± 13,7

155,5 ± 8,4

166,2 ± 9,0

143,6 ± 4,4

138,2 ± 5,4

141,3 ± 5,3

137,9 ± 2,7

Инсулин GEKR, 2 х 5 Ед

8

445,3 ± 17,2

414,5 ± 23,4

388,9 ± 29,6

384,4 ± 26,7

370,5 ± 28,7

364,6 ± 26,1

352,6 ± 34,1

345,4 ± 34,1

324,7 ± 33,6

308,4 ± 34,2

300,7 ± 32,3

295,2 ± 31,1

279,2 ± 29 3

250,9 ± 30,9

248,2 ± 37,7

Контроль, 0,9% NaCl

8

480,9 ± 13,6

468,4 ± 10,4

455,6 ± 13,8

459,3 ± 12,5

458,9 ± П,5

477,5 ± 10,8

493,4 ± 8,6

507,8 ± 12,3

482,6 ± 12,3

497,5 ± 25,3

491,8 ± 20,0

506,4 ± 13,2

499,4 ± 15,7

446,3 ± 18,0

-н чо '"f О '/Ί

Изучаемый препарат

Число крыс в группе

Хроническая гипергликемия

Последовательные дни исследования

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Инсулин SK3R, 2x5 Ед

21

496,3 ±11,5

143,9 ± 4,7 *А

140,8 ± 3,2 *А

136,3 ± 2,0 *А

135,4 ± 2,1 * А

151,2 ± 6,1 *А

163,7 ± 6,7 *А

164,2 ± 7,8 *А

146,6 ± 3,3 *А

135,2 ± 4,8 *А

134,3 ± 4,8 * А

137,3 ± 6,0 *А

139,9 ± 4,7 *А

144,2 ± 3,0 *А

137,6 ± 6,3 *А

Инсулин GEKR, 2 х 5 Ед

8

445,3 ± 17,2

234,8 ± 28,8

221,9 ± 28,8

226,6 ± 29,5

240,4 ± 28,9

221,1 ± 29,1

228,3 ± 27,8

251,1 ± 28,7

220,7 ± 26,4

203,8 ± 25,8

218,8 ± 22,9

205,7 ± 22,2

192,3 ± 21,6

221,3 ± 21,0

223,6 ± 22,3

Контроль, 0,9% NaCl

8

480,9 ± 13,6

499,5 ± 16,2

496,3 ± 8,7

513,3 ± 12,3

510,3 ± 12,1

496,0 ± 15,2

4854 ± 22,0

488,8 ± 8,1

465,8 ± 13,5

463,8 ± 17,8

464,8 ± 12,6

466,0 ± 10,1

461,1 ± 12,5

458,0 ± 16,2

465,1 ± 16,9

Таблица 4. Ход 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 2 и 4 недель многократного введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой)

Изучаемый препарат	Время определения профиля	Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM
Вдень исследования перед введением препарата	Время забора крови после введения препарата
Часы
0,5	1	2	4	6	8	10	12
Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день	После 2-х недель	137,8 ±3,0 *	56,8 ±1,9 *	79,0 ±3,8 *	103,8 ±5,3 *	98,8 ±5,1 *	108,7 ±5,4	124,1 ± 4,4	133,5 ±4,1 *	166,9 ±3,5 *
Инсулин гларгин, 2x5 Ед/кг массы тела/день	246,2 ± 17,1	101,0 ±8,1	58,2 ±4,4	51,1 ±3,8	64,2 ± 7,5	99,3 ± 18,0	131,3 ±21,2	187,5 ±21,2	269,8 ± 27,3
Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день	После 4-х недель	142,6 ±2,8 *	65,8 ±2,9 *	90,9 ±3,8	113,8 ±7,1 *	105,6 ±6,8 *	112,7 ±5,5	126,6±5,3	156,7 ±3,9 *	171,6 ±4,3 *
Инсулин гларгин, 2x5 Ед/кг массы тела/день	319,1 ±20,5	146,8 ±9,1	90,7 ±6,7	65,4 ±4,7	58,0 ± 3,9	101,7 ± 13,7	179,3 ±31,9	244,6 ±35,0	348,4 ± 26,0

Уровень значимости: * р < 0,05 инсулин SK3R по сравнению с инсулином гларгин

- 18 030519

Таблица 5. Ход 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 1, 2 и 4 недель многократного введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR (предварительные результаты)

Изучаемый препарат	Время определения профиля	Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM
В день исследования перед введением препарата	Время забора крови после введения препарата
часы
0,5	1	2	4	6	8	10	12
Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день	После 1-й недели	492,8	149,3	57,3	95,8	86,3	112,8	120,8	125,0	152,3
SEM 36,7	8,4	10,5	13,8	12,4	10,7	12,5	16,0	8,8
Инсулин GEKR, 2x5 Ед/кг массы тела/день	474,0	244,3	58,3	42,7	47,3	95,7	111,0	112,0	151,7
SEM 28,0	39,2	1,8	2,4	8,2	8,1	14,9	18,4	21,7
Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день	После 2-х недель	479,3	137,8	56,8	79,0	103,8	98,8	108,7	124,1	133,5
SEM 10,7	3,0	1,9	3,8	5,3	5,1	5,4	4,4	4,1
Инсулин GEKR, 2x5 Ед/кг массы тела/день	480,8	246,2	101,0	58,2	51,1	73,9	99,3	133,9	187,5
SEM 13,2	17,1	8,1	4,4	3,8	7,5	18,0	21,2	21,2
Инсулин SK3R, 2x5 Ед/кг массы тела/день	После 4-х недель	479,3	142,6	65,8	90,9	113,8	105,6	112,7	126,6	156,7
SEM 10,7	2,8	2,9	3,8	7,1	6,8	5,5	5,3	3,9
Инсулин GEKR, 2x5 Ед/кг массы тела/день	480,8	319,1	146,8	90,7	65,4	69,6	127,0	188,3	244,6
SEM 13,2	20,5	9,1	6,7	4,7	3,9	13,7	31,9	35,0

Пример 21. Исследование активности инсулина AK3R на животных с экспериментальным сахарным диабетом

Гипогликемическое действие инсулина AK3R подтверждали в исследованиях на крысах с индуцированным стрептозоцином сахарным диабетом средней степени тяжести. Аналог AK3R вводили крысам линии WAG с сахарным диабетом, индуцированным в ходе эксперимента путем однократного или многократного введения стрептозоцина (один раз в день в течение 4 недель). Инсулин гларгин (препарат Лантус) применяли в качестве эталонного препарата; дополнительно применяли плацебо-контроль (физиологический солевой раствор без инсулина). Испытания были проведены в общей сложности на 110 крысах.

В группе, получавшей однократную дозу исследуемого аналога, наблюдалось медленное и постепенное снижение уровня глюкозы в крови исследуемых крыс, что подтверждало замедленное всасывание инсулина AK3R из участка его введения. Фактически было установлено, что профиль изменений уровня гликемии аналогичен таковому для инсулина гларгин.

Гипогликемическое действие инсулина AK3R чаще всего наблюдалось в течение периода от 1 до 8 ч, а затем концентрация глюкозы повышалась до ее исходного значения. Существенное снижение концентрации глюкозы после введения инсулина AK3R в дозе 5 Ед/кг массы тела продолжалось даже в течение периода до 12 ч.

Ход гликемической кривой был пологим, без явно выраженного максимума активности. Эталонный препарат проявлял явно выраженный максимум гипогликемического действия в 4-й час после введения независимо от дозы. Длительность эффекта инсулина гларгин была меньшей по сравнению с аналогом AK3R - чаще всего эффект продолжался в течение 2-6 ч после введения.

По сравнению как с инсулином гларгин, так и с соединениями, включенными в заявку № WO 2010/002283 А2, инсулин AK3R сохраняет гипогликемическое действие явно дольше, и его профиль действия имеет заметный безпиковый характер, в частности, не показывая сильного и быстрого фармакологического эффекта, который характерен для групп соединений, включенных в заявку № WO 2010/002283 А2.

Многократное введение инсулина AK3R в дозе 5 Ед/кг массы тела вызывало непрерывное снижение уровня глюкозы уже в первый день лечения, а на 4-й неделе ее уровень достигал значений, приблизительно на 60% более низких, чем исходные. Это действие является стабильным и сходно с действием эталонного препарата - инсулина гларгин; однако отмечается тенденция к более стабильному поддержанию гликемии на статистически более низком уровне, в частности, начиная с 14-го дня терапии (критерий Ньюмана-Кейлса, α=0,05). После прекращения введения обоих изучаемых типов инсулина концентрация глюкозы в крови крыс постепенно повышается до исходных значений.

Ход 24-часовых профилей концентрации глюкозы в крови крыс, который определяли после 2 и 4 недель введения инсулина AK3R и инсулина гларгин, подтверждает единообразное гипогликемическое действие исследуемого инсулина, а также статистически значимое различие по сравнению с эталонным

- 19 030519

препаратом (критерий Ньюмана-Кейлса, α=0,05).

В исследованиях всех доз не наблюдалось никаких изменений во внешнем виде и поведении животных. Также не отмечалось никаких различий в местной переносимости обоих препаратов (изменений мест подкожных инъекций). Макроскопический и микроскопический анализы тканей отобранных органов не показали никаких патологических изменений во всех группах обследованных животных.

Основываясь на результатах вышеописанных исследований, можно утверждать, что аналог AK3R обладает свойствами безпиковых форм инсулина длительного действия и может иметь терапевтическое применение в качестве базального инсулина, который вводят один раз в день. В то же время, как и в случае с инсулином SK3R, инсулин AK3R проявляет оригинальный (лучший, чем у коммерчески доступных аналогов длительного действия), стабильный и равномерный 24-часовой гипогликемический профиль в ходе длительной терапии, который также отличает его от аналогов, включенных в заявку № WO 2010/002283 А2.

Результаты, представляющие концентрацию глюкозы в крови крыс после однократного введения инсулина AK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой), показаны в табл. 6.

Комплексный график, на котором изображен профиль концентрации глюкозы в крови крыс, характерный для безпиковых препаратов после однократного введения инсулина AK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести, показан на фиг. 9.

Результаты, представляющие концентрацию глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина AK3R в дозе 1x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой), показаны в табл. 7 и на фиг. 10.

Результаты, представляющие 12-часовые профили концентрации глюкозы после 2 и 4 недель введения инсулина AK3R в дозе 1x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой), показаны в табл. 8.

Комплексный график 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 2 и 4 недель введения инсулина AK3R в дозе 1x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести показан на фиг. 11.

Сравнение 24-часовых профилей концентрации глюкозы после однократного введения инсулина GKR, инсулина GEKR, инсулина AKR, инсулина GR, инсулина SK3R и инсулина AK3R в дозе 1x5 Ед/кг массы тела или 10 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести показано на фиг. 12.

Таблица 6. Концентрация глюкозы в крови крыс после однократного введения инсулина AK3R в дозах 2,5 Ед/кг массы тела, 5 Ед/кг массы тела и 7,5 Ед/кг массы тела в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой)

Изучаемый препарат

Подкожная доза

Число крыс в группе

Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) + SEM

Нормогликемия

Хроническая гипергликемия

Время забора крови после однократного введения препарата

Часы

0

0,5

1

2

4

6

8

10

12

24

36

Инсулин AK3R

2,5 Ед/кг массы тела

12

78,9 ± 1,5

479,4 ±6,8

298,0 ± 13,6 *А

187,8 ± 17,3 А

198,6 ± 16,0 *А

226,7 ± 18,5 * А

218,6 ± 21,1 *А

237,5 ± 28,6 А

386,8 ± 23,5 А

436,2 ± П,5

403,0 ± 13,7 *

444,1 ± 19,2

Лантус

9

83,0 ± 1,2

465,3 ± 13,9

353,2 ± 16,0

198,0 ± 18,8

101,0 ± 10,6

88,2 ± 6,6

119,9 ± 9,2

191,7 ± 13,3

361,3 ± 15,3

446,8 ± 14,4

446,9 ± 14,2

460,7 ± 13,7

Инсулин AK3R

5 Ед/кг массы тела

12

81,8 ± 1,8

473,5 ± 8,0

264,8 ± 8,7 *А

160,3 ± 9,3 А

122,9 ± 13,4 А

117,8 ± 13,4 А

116,7 ± 12,9 А

124,3 ± 13,9 А

159,0 ± 31,4 А

219,1 ± 27,3 А

406,9 ± 16,2

448,0 ± 7,7 А

Лантус

9

84,1 ± 1,9

468,1 ± 14,4

321,8 ± 18,7

162,6 ± 18,2

107,4 ± 15,3

83,2 ± 6,5

108,6 ± 8,3

128,3 ± 6,9

166,6 ± 18,0

233,9 ± 36,3

435,3 ± 21,5

465,1 ± 14,5

Инсулин AK3R

7,5 Ед/кг массы тела

12

78,3 ± 2,2

479,8 ± 5,8

239,8 ± 21,9 *А

131,3 ± 11,5 *А

128,9 ± 10,0 А

138,2 ± 17,1 * А

12,35 ± 14,3 А

165,3 ± 17,4 А

259,9 ± 20,0 *А

334,9 ± 23,4 А

393,1 ± 28,1

418,8 ± 20,8

Лантус

9

83,3 ± 1,8

477,3 ± 11,8

366,8 ± 31,4

247,1 ± 31,5

143,0 ± 13,7

83,2 ± 11,3

127,4 ± 15,7

162,7 ± 17,4

185,0 ± 14,2

346,0 ± 22,5

397,6 ± 21,3

447,3 ± 13,8

Контроль

30 мкл/300 г массы тела

6

84,2 ± 1,4

455,5 ± 25,4

452,5 ± 24,7

449,3 ± 24,7

453,3 ± 33,6

459,8 ± 23,8

455,3 ± 21,9

461,0 ± 13,6

458,3 ± 18,1

453,5 ± 21,3

460,2 ± 21,4

458,3 ± 22,5

Уровень значимости: * р < 0,05 инсулин AK3R по сравнению с инсулином гларгин

^Λ р < 0,05 инсулин AK3R по сравнению с контролем

Таблица 7. Концентрация глюкозы в крови крыс после многократного (в течение 28 дней) введения инсулина AK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой)

- 20 030519

Изучаемый препарат

Число крыс в группе

Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM

Нормогликемия

Хроническая

Последовательные дни исследования

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Инсулин AK3R, 5 Ед/кг массы тела/день

24

81,0 ± 1,4

474,0 ± 5,3

444,4 ± 5,5

404,6 ± 14,3 Λ

364,8 ± 12,3 Λ

338,2 ± 14,3 Λ

335,3 ± 13,9 А

319,5 ± 13,4 А

308,3 ± 12,4 А

301,9 ± П,9 А

291,9 ± 12,3 А

285,0 ± 12,6 А

275,2 ± 13,9 А

284,3 ± 16,0 А

253,2 ± 14,20 А

257,2 ± 14,7 А

Лантус, 5 Ед/кг массы тела/день

9

81,1 ± 1,8

466,2 ± 10,5

442,1 ± 15,4

391,0 ± 25,8

382,3 ± 24,6

380,2 ± 15,2

355,1 ± 17,8

342,2 ± 16,2

334,8 ± 15,1

306,1 ± 19,2

279,0 ± 16,5

264,4 ± 16,6

258,3 ± 19,3

268,3 ± 9,3

278,6 ± 16,9

270,8 ± 22,7

Контроль, 30 мкл/300 г массы тела/день

8

84,6 ± 2,7

472,3 ±7,2

474,6 ± 6,9

480,1 ± 6,7

484,0 ± 5,3

473,6 ± 12,5

486,1 ± 5,8

486,8 ± 7,2

498,8 ± 8,2

486,5 ± 6,7

485,1 ± 4,9

486,5 ± 8,5

478,6 ± 9,9

480,1 ± 9,0

485,3 ± 12,3

491,9 ± 6,3

Изучаемый препарат

Число крыс в группе

Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM

Нормогликемия

Хроническая гипер гл икемия

Последовательные дни исследования

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Инсулин AK3R, 5 Ед/кг массы тела/день

24

81,0 ± 1,4

474,0 ±5,3

228,3 ± 12,7 *А

248,0 ± 13,5 Λ

244,0 ± 11,7 Λ

248,3 ± П,5 *А

249,5 ± П,2 А

250,3 ± П,2 А

247,4 ± 11,3 А

222,2 ± 10,7 А

217,6 ± 10,4 * А

203,9 ± 11,3 *А

198,5 ± 8,6 *А

194,4 ± 9,6 А

191,4 ± 9,9 А

202,0 ± 10,1 А

Лантус, 5 Ед/кг массы тела/день

9

81,1 ± 1,8

466,2 ± 10,5

274,4 ± 18,9

273,9 ± 14,4

280,9 ± 14,1

305,4 ± 17,9

286,9 ± 17,1

278,2 ± 19,1

267,0 ± 20,5

260,7 ± 18,6

260,7 ± 15,7

264,0 ± 15,7

231,8 ± 9,7

224,4 ± 8,9

215,3 ± 6,6

225,2 ± 7,4

Контроль, 30 мкл/300 г массы тела/день

8

84,6 ± 2,7

472,3 ±7,2

502,6 ± 4,0

493,0 ± 5,1

483,8 ± 6,9

485,3 ± 10,9

486,9 ± 7,7

479,8 ± 13,2

483,4 ± 10,2

487,9 ± 10,0

490,4 ± 3,6

494,3 ± 7,3

496,1 ± 7,1

497,5 ± 8,8

497,4 ± 18,3

515,8 ± 20,1

Уровень значимости: * р < 0,05 инсулин AK3R, 5 Ед/кг массы тела/день, по сравнению с инсулином гларгин, 5 Ед/кг массы тела/день

р < 0,05 инсулин AK3R, 5 Ед/кг массы тела/день, по сравнению с контролем

Таблица 8. Ход 12-часовых профилей концентрации глюкозы после 2 и 4 недель многократного

введения инсулина AK3R в дозе 1 х5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином гларгин (вместе со статистической оценкой)

Изучаемый препарат	Время определения профиля	Концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± SEM
Вдень исследования перед введением препарата	Время забора крови после введения препарата
Часы
0,5	1	2	4	6	8	10	12
Инсулин AK3R, 5 Ед/кг массы тела/день	После 2-х недель	257,2 ± 14,7	108,4 ± 8,5	94,0 ± 7,3	119,0 ±6,9 *	116,2 ±3,8 *	121,2 ±6,1	139,3 ±6,3	160,5 ± 6,2 *	191,3 ±8,5 *
Лантус, 5 Ед/кг массы тела/день	270,8 ± 22,7	120,1 ± 11,0	73,6 ± 4,6	69,3 ± 3,7	77,7 ±7,9	129,7 ± 13,6	162,2 ± 12,2	200,0 ± 18,2	234,6 ± 20,3
Инсулин AK3R, 5 Ед/кг массы тела/день	После 4-х недель	191,4 ±9,9	103,8 ±5,6	87,1 ±4,4 *	99,5 ± 4,9 *	113,3 ±4,9 *	131,2± 5,6 *	152,4 ±5,7 *	152,7 ±5,9	179,2 ± 6,5 *
Лантус, 5 Ед/кг массы тела/день	215,3 ±6,6	107,0 ± 7,4	71,2 ±3,6	63,4 ± 1,7	58,9 ± 1,9	65,6 ±2,7	121,0 ± 15,7	150,4 ± 16,6	208,6 ± 4,9

Уровень значимости: * р < 0,05 инсулин AK3R по сравнению с инсулином гларгин

Пример 22. Исследование активности инсулина SK3R на приматах

Сравнительные исследования активности инсулина SK3R проводились на обезьянах из рода Rhesus с хронической гипогликемией, представляющих экспериментальную модель сахарного диабета 2 типа у приматов. Результаты исследований однозначно подтверждают фармацевтическую активность инсулина SK3R и его свойства, которые наблюдались ранее, включая характерную форму гликемического профиля после применения изучаемого соединения.

Гипогликемическую активность инсулина SK3R оценивали на основании изменений значений концентрации глюкозы с течением времени по сравнению с инсулином AKR, который является представителем группы соединений, включенных в заявку на патент № WO 2010/002283 А2. Испытания проводили на 6 обезьянах - 3 самцах и 3 самках. Исследуемое и эталонное соединения вводили один раз (утром) в дозе 1 Ед/кг массы тела. Был выбран способ подкожного введения, поскольку в клинической практике предполагается применение такого способа введения. Перед наступлением гипогликемии животным в качестве защиты вводили 20% раствор глюкозы непосредственно перед инъекцией исследуемых соединений.

Концентрации глюкозы анализировали в 9 моментов времени в течение периода до 24 ч после введения форм инсулина. Профили сравнивали для каждого животного по отдельности в связи с небольшой численностью группы и высокой изменчивостью исходных уровней глюкозы у животных.

Исходя из хода гликемических кривых, можно сделать вывод о несходстве профилей действия обоих сравниваемых аналогов. Инсулин SK3R, по сравнению с инсулином AKR, характеризуется явно более медленным началом действия (длительное всасывание), более поздним наступлением максимального эффекта (4 ч по сравнению с 1-2 ч) и более пологим гликемическим профилем в течение периода до 10 ч после введения препарата (меньшие колебания концентрации в профилях).

- 21 030519

На основании представленных результатов исследований может быть установлено, что аналог SK3R имеет стабильный профиль пролонгированной активности даже после однократного введения, что характерно для так называемых безпиковых форм инсулина длительного действия, и пролонгированное действие. Эти свойства подтверждают возможность терапевтического применения аналога SK3R в качестве базального инсулина, вводимого один раз в день.

Результаты, представляющие концентрацию глюкозы в крови 5 обезьян из рода Rhesus, участвовавших в испытании (одна из обезьян была исключена из испытания ввиду наличия симптомов гипогликемии), после однократного введения инсулина SK3R в дозе 1 Ед/кг массы тела по сравнению с инсулином AKR, показаны в табл. 9.

Комплексные графики, демонстрирующие различия в профилях гипогликемизирующего действия инсулина SK3R и инсулина AKR у обезьян из рода Rhesus после однократного введения в дозе 1 Ед/кг массы тела, показаны на фиг. 13.

Таблица 9. Концентрация глюкозы в крови обезьян из рода Rhesus после однократного введения инсулина SK3R в дозе 1 Ед/кг массы тела по сравнению с инсулином AKR

Инсулин	№ и код животного	Концентрация глюкозы в крови отдельных обезьян (ммоль/л)
Время забора крови (часы)
0	0,5	1	2	4	6	8	10	12	24
SK3R, 1 Ед/кг массы тела	М128	4,0	5,2	3,7	2,8	2,7	4,4	4,3	4,3	5,0	3,8
М210	10,9	П,9	9,7	7,5	6,0	6,55	7,1	9,6	10,4	10,3
М51	12,1	П,1	8,6	5,0	5,1	7,4	9,6	8,8	13,0	11,1
F143	П,5	12,1	10,5	8,6	9,3	13,8	16,2	13,8	14,4	13,8
F156	4,4	10,2	5,7	3,7	3,6	5,2	5,2	5,4	5,7	5,2
AKR, 1 Ед/кг массы тела	М128	4,6	4,4	2,8	1,7	1,0	3,3	5,2	6,0	5,6	5,1
М210	10,6	12,0	8,3	3,8	2,9	6,15	9,4	10,4	10,8	12,1
М51	16,7	16,1	10,0	3,2	5,0	14,3	12,1	14,2	15,6	16,0
F143	11,7	13,1	8,3	1,3	1,4	7,0	П,1	12,9	13,3	14,4
F156	52	4,1	1,9	26	2,4	5,1	6,3	6,1	6,5	6,3

Значения концентрации глюкозы представлены в ммоль/л. Для пересчета значений гликемии в единицы мг/дл используется следующий коэффициент пересчета: 1 ммоль/л =18 мг/дл.

Пример 23. Исследование активности инсулина SK3R на собаках

Исследование гипогликемической активности инсулина SK3R по сравнению с инсулином AKR (представителем группы соединений, включенных в заявку на патент № WO 2010/002283 А2), которое было проведено на здоровых собаках породы бигль, подтвердило наблюдения из исследований, проведенных на других млекопитающих, которые подтверждают новый принцип фармакологического действия аналога SK3R.

Исследование было проведено на 16 собаках (8 самках и 8 самцах). Собаки были разделены на группы в зависимости от вводимой дозы: 8 животных получали исследуемые формы инсулина в дозе 0,5 Ед/кг массы тела, а 8 других - в дозе 1 Ед/кг массы тела. Оба соединения вводили однократно подкожно. Перед наступлением гипогликемии животным в качестве защиты вводили 20% раствор глюкозы непосредственно перед инъекцией форм инсулина. Гликемический профиль определяли в течение периода до 24 ч после введения препаратов, и концентрацию глюкозы определяли в 8 моментов времени.

В анализе сравнивали уровни глюкозы в группах, получавших инсулин SK3R и инсулин AKR в обеих дозах. Статистическую значимость различий концентраций глюкозы в отдельные моменты времени проверяли с применением критерия Стьюдента для непарных переменных (α=0,05).

После введения как 0,5 Ед/кг массы тела, так и 1 Ед/кг массы тела между уровнями глюкозы в крови после введения инсулина AKR и инсулина SK3R в моментах измерения в период от 0,5 до 6-8 ч наблюдались значительные статистические различия. Средние гликемические профили после введения инсулина SK3R характеризуются явно безпиковым, довольно равномерным ходом, в отличие от профилей инсулина AKR, где наблюдается быстрое и сильное первоначальное действие. После введения инсулина SK3R в ходе гликемической кривой не наблюдалось никаких существенных колебаний, включая постпрандиальные колебания, что подтверждает тот факт, что данное соединение обеспечивает стабильный уровень глюкозы в течение периода до 24 ч после его введения.

Результаты, представляющие средние значения концентрации глюкозы в крови здоровых собак породы бигль после однократного введения инсулина SK3R в дозах 0,5 Ед/кг массы тела и 1 Ед/кг массы тела по сравнению с инсулином AKR (вместе со статистической оценкой), показаны в таблице 10.

Графики, демонстрирующие различия в усредненных профилях гипогликемизирующего действия инсулина SK3R и инсулина AKR у собак породы бигль после однократного введения в дозах 0,5 Ед/кг массы тела и 1 Ед/кг массы тела, показаны на фиг. 14.

- 22 030519

Таблица 10. Средние концентрации глюкозы в крови собак породы бигль после однократного введения инсулина SK3R в дозах 0,5 Ед/кг массы тела и 1 Ед/кг массы тела по сравнению с инсулином AKR. Р-значение рассчитывается с применением одностороннего критерия Стьюдента для непарных переменных; уровень значимости α=0,05.

Инсул ин/Г руппа		Средняя концентрация глюкозы в крови собак в отдельных группах (ммоль/л)
Время забора крови (часы)
0	0,5	1	2	4	6	8	12	24
SK3R, 0,5 Ед/кг массы гела	Среднее значение	13,825	4,225	4,250	4,750	4,800	4,775	4,900	4,675	4,863
SD	6,652	0,908	0,621	0,233	0,239	0,311	0,421	0,453	0,297
AKR, 0,5 Ед/кг массы гела	Среднее значение	11,075	2,213	1,900	2,138	5,013	5,113	4,975	4,950	5,138
SD	2,639	0,426	0,262	0,478	0,785	0,348	0,306	0,298	0,226
	Р-значение	0,147721	0,0000*	0,0000*	0,0000*	0,2379	0,0300*	0,3448	0,0865*	0,0281*
SK3R, 0,5 Ед/кг массы гела	Среднее значение	11,250	3,200	3,725	4,725	4,575	4,463	4,750	4,738	4,900
SD	4,530	0,845	0,547	0,282	0,205	0,354	0,393	0,532	0,262
AKR, 0,5 Ед/кг массы гела	Среднее значение	10,613	1,971	1,825	2,488	3,550	5,400	5,400	5,025	5,150
SD	1,836	0,335	0,392	1,217	1,627	0,605	0,535	0,526	0,359
	Р-значение	0,3588576	0,0016*	0,0000*	0,0001*	0,0495*	0,0010*	0,0075*	0,1476	0,0668

* - подтвержденная статистическая значимость различий

Концентрации глюкозы представлены в ммоль/л. Для пересчета значений гликемии в мг/дл применяли следующий коэффициент преобразования: 1 ммоль/л = 18 мг/дл.

Пример 24. Исследование на крысах с экспериментальным сахарным диабетом, в котором инсулин SK3R с пролонгированной активностью сравнивается с инсулином GEKR, с распределением по полу

Данное исследование проводили на крысах с экспериментальным сахарным диабетом. В общей сложности в исследование было включено 36 животных. Были сформированы три группы исследования: группа SK3R, группа GEKR и контрольная группа. В каждой группе испытаниям подвергали 6 самцов и 6 самок. Для статистических сравнений между группами применяли однофакторный дисперсионный анализ и критерий Стьюдента.

Препараты аналогов инсулина вводили 2 раза в день в дозе 5 Ед/кг массы тела в течение 28 дней. Гликемические профили определяли в начале и через 1, 2, 3 и 4 недели многократного введения в течение периода до 12 ч после введения утренней дозы. После достижения равновесного состояния (приблизительно 7-14 дней) недельные профили характеризовались аналогичным ходом независимо от даты проведения испытания.

Результаты исследования однозначно подтверждают предположение, включенное в пример 20. Сравнение инсулина SK3R с аналогом GEKR с учетом половых различий явно показывает, что инсулин SK3R вызывает очень стабильный и равномерный фармакодинамический эффект как у самцов, так и у самок после достижения равновесного состояния. Не наблюдалось существенных различий между полами.

Природа и особенности этого эффекта совершенно отличаются от таковых для инсулина GEKR. Гликемические профили после 7, 14, 21 и 28 дней введения аналога SK3R безусловно демонстрируют пологий и очень стабильный 12-часовой гликемический профиль после введения инсулина SK3R по сравнению с инсулином GEKR, эффект которого является стабильным только в течение 4-6 ч после инъекции, после чего уровни возвращаются к исходным значениям. Это означает, что после достижения в организме равновесия инсулин SK3R способен поддерживать стабильный уровень глюкозы, близкий к нормогликемии, в течение всего дня, без суточных колебаний в ходе длительного лечения. Это в точности имитирует нормальную эндогенную секрецию. Такой эффект неизвестен для других препаратов аналогов инсулина.

Результаты, представляющие концентрацию глюкозы в крови крыс после 1, 2, 3 и 4 недель введения инсулина SK3R в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести по сравнению с инсулином GEKR, и примеры отдельных гликемических профилей с учетом половых различий показаны в табл. 11 и на фиг. 17-20.

Таблица 11. Сравнение 12-часовых гликемических профилей в дни исследования 0, 7, 14, 21 и 28 после многократного введения инсулина SK3R и инсулина GEKR в дозе 2x5 Ед/кг массы тела/день в модели индуцированного стрептозоцином сахарного диабета средней степени тяжести с учетом половых различий (среднее значение ± SD)

- 23 030519

Время после введения инсулина [ч.]	Инсулин GEKR	Инсулин SK3R
самцы п=6	самки п=6	самцы п=6	самки п=6
День 0	0*	26,07 ± 4,68	22,42 ±4,80	21,38 ±3,88	22,61 ±4,84
0,5	16,42 ± 6,52	12,86 ±5,20	12,55 ± 8,88	14,29±10,53
1	12,24 ±7,70	6,96 ±4,32	12,99 ±9,63	14,57 ±9,31
2	12,05 ±6,52	6,55 ± 3,69	13,93 ±9,09	14,21 ±9,98
4	20,23 ±6,97*	15,77 ±8,91	12,70 ±8,08	13,38 ±8,35
6	21,91 ±4,03	21,33 ±4,48	14,51 ±7,48	13,96 ±8,32
8	21,87 ±6,85	21,82 ±4,59	15,87 ±7,93	15,21 ±8,38
10	21,75 ±6,16	20,69 ± 4,83	18,29 ±7,79	14,39 ±8,45
12	20,26 ±3,83	24,13 ±5,63	21,06 ±6,82	15,87 ±8,10
День 7	0*	27,17 ±4,20	24,27 ±3,31	24,78 ±3,40	19,90 ±6,58
0,5	17,31 ±6,46	9,79 ±5,59	16,28 ±3,79	11,59 ±6,54
1	11,40 ±7,13	6,49 ± 3,67*	17,93 ±6,27	14,14 ±7,48
2	10,77 ±6,22*	11,75 ±5,04	20,36 ± 5,75	16,27 ±6,92
4	23,04 ±5,13*	20,90 ± 1,88	18,69 ±5,27	16,43 ± 6,03
6	22,91 ±3,72	21,85 ±3,44	18,21 ±5,74	16,71 ±6,00
8	25,13 ±4,25	21,78 ±2,46	17,80 ±6,70	18,52 ±7,46
10	22,92 ± 5,04	22,10± 3,19	21,26 ±4,73	19,06 ±7,10
12	25,10 ±3,89	22,00 ± 1,82	25,77 ±3,85	20,03 ± 7,93
День 14	0*	27,37 ±3,76	25,53 ±4,93	23,57 ±3,97	18,47 ±8,00
0,5	17,48 ±7,15	10,10 ±7,47	16,53 ±6,05	11,17 ±6,84
1	12,51 ±7,01	8,05 ±7,30	17,99 ±6,41	12,44 ±7,98
2	13,20 ±7,97	13,87 ±9,04	21,05 ±4,96	14,40 ±7,44
4	22,30 ±5,83	19,39 ±3,22	19,09 ±4,57	15,19 ±6,67
6	24,98 ±4,80*	19,81 ±6,10	18,54 ±3,73	14,23 ±7,66
8	24,50 ±4,42*	20,88 ± 4,79	18,91 ±4,59	15,34 ±7,22
10	25,66 ±4,16*	22,10 ±4,93	21,37 ±4,57	16,00 ±8,36
12	26,62 ± 3,84*	23,26 ±5,27	21,04 ±6,04	18,71 ±8,77
День 21	0*	27,90 ±4,96	21,48 ±6,06	21,55 ±4,26	15,45 ±9,56
0,5	18,88 ±8,24	8,79 ±8,64	14,05 ±5,64	8,46 ±7,78
1	14,20 ± 10,72	6,78 ± 7,03	16,01 ±7,01	10,65 ±8,13
2	14,27 ±9,24	11,26 ±8,67	19,93 ±6,12	13,08 ±9,26
4	26,00 ±4,51*	17,59 ±7,37	18,78 ±6,44	12,77 ±7,66
6	26,95 ±3,57*	17,05 ±9,22	18,69 ±6,23	12,82 ±8,14
8	25,72 ±4,15*	17,18 ±8,35	19,29 ±7,07	12,66 ±8,08
10	26,62 ±4,18	18,59 ±6,93	19,85 ±8,27	14,13 ±6,45
12	28,36 ±2,79*	18,72 ±5,91	22,87 ±5,51	15,38 ±7,86
День 28	0*	29,03 ± 3,64*	19,07 ±8,19	21,35 ±7,71	15,64 ± 10,44
0,5	19,32 ±7,51	7,93 ±8,42	16,73 ±7,87	9,69 ± 10,04
1	15,47 ± 10,14	6,81 ±6,81	17,31 ±7,50	11,28 ±9,37
2	18,80 ±7,51	9,33 ±7,40	20,51 ±6,92	14,10 ±9,19
4	26,10 ±4,87*	15,74 ± 11,19	19,13 ±5,66	13,17 ±8,97
6	26,12 ±3,99*	15,95 ± 10,39	17,37 ±6,22	12,09 ±8,81
8	27,18 ±3,16*	15,12 ±8,02	17,92 ±7,05	13,45 ±7,24
10	26,17 ±3,58	13,93 ±7,38	20,32 ±5,93	12,48 ±7,14
12	27,66 ± 3,34*	16,94 ±9,23	22,33 ± 5,96	14,58 ±7,45

• - измерение до введения инсулина

* - статистически значимое различие с р < 0,05, критерий Стьюдента n - число исследованных животных

Комплексные испытания на животных подтвердили то, что препараты, включая фармацевтические композиции, полученные из соединений с общей формулой 1, характеризуются, после многократного введения, не только пролонгированным действием, но также пологим профилем высвобождения, имитирующим секрецию естественного инсулина, что означает, с клинической точки зрения, потенциальное снижение частоты возникновения эпизодов гипогликемии, в частности, эпизодов ночной гипогликемии. Исходя из этого, можно ожидать, что свойства аналогов, являющихся объектом настоящего изобретения, позволят получить лекарственные средства, которые повысят эффективность, безопасность и удобство терапии. С учетом пологого профиля высвобождения они проявляют сходство с секрецией человеческого инсулина на базовом уровне.

Дополнительно, внедренные модификации приводят к получению стабильных фармацевтических композиций, которые содержат новые аналоги инсулина и/или их физиологически приемлемые соли и

- 24 030519

при этом сохраняют свою биологическую активность; такие композиции характеризуются снижением их растворимости при физиологическом рН в месте инъекции. Это вызывает осаждение с формированием микроосадка аналога инсулина в подкожной ткани, после чего происходит постепенное, медленное высвобождение в кровь, благодаря чему терапевтический уровень поддерживается в течение более длительного периода времени, который определяется как по меньшей мере 24 ч после введения однократной дозы. Свойства этих соединений и их композиций подтверждались в испытаниях на стабильность и в испытаниях активности на животных с экспериментальным сахарным диабетом, во время которых было установлено значительно пролонгированное гипогликемизирующее действие.

На фиг. 6-8, на фиг. 11 и на фиг. 17-20 показаны графики 12-часовых гликемических профилей после многократного введения инсулина SK3R, инсулина AK3R, инсулина гларгин и инсулина GEKR. По сравнению с инсулином гларгин и соединениями, описанными в заявке на патент № WO 2010/002283 А2, это действие является значительно более стабильным, потому что, например, в случае инсулина гларгин оно ослабевает уже через 6-8 ч, и гликемия возвращается практически к ее исходным значениям до введения следующей дозы, что вызывает гипергликемию и ослабление терапевтического эффекта.

По сравнению с гипогликемическими соединениями, которые являются предметом заявки на патент № WO 2010/002283 А2, аналоги, включенные в настоящую заявку, характеризуются явным увеличением времени всасывания после однократного введения животным с экспериментальным сахарным диабетом и здоровым животным, что приводит к поддержанию сниженного уровня глюкозы в течение периода до 8-10 ч после их введения. Гликемические профили являются пологими, без значительных колебаний в течение периода времени от 1 до по меньшей мере 8 ч после введения препаратов. Так называемых "пиков" активности не наблюдалось, что означает, что представленные соединения являются истинно безпиковыми формами инсулина. На фиг. 3, фиг. 9, фиг. 13 и фиг. 14 проиллюстрированы гликемические профили у животных, включая приматов, после однократного введения препарата инсулина SK3R и инсулина AK3R по сравнению с контрольными растворами и другими аналогами.

Пролонгированное, стабильное гипогликемическое действие соединений согласно настоящему изобретению видно еще лучше в испытаниях на животных после многократного введения (в течение 4 недель), где наблюдалась стабильная и очень благоприятная форма гликемического профиля, лишенная "эффекта зубьев пилы", описанного ранее. На фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 10 показаны гликемические профили у крыс после многократного введения препаратов инсулина SK3R и инсулина AK3R по сравнению с инсулином гларгин и инсулином GEKR.

Результаты предварительных исследований, проведенных с применением передовых методик на основе ЯМР (для исследований структуры использовались 'Н-ЯМР- и ¹³С-ЯМР-спектры, полученные с применением методик NOESY, TOCSY, 1H/13C-GHSQC и 1H/13C-GHSQC-TOCSY), показали, что пространственные структуры человеческого инсулина и его аналогов, являющихся объектом настоящего изобретения, сходны в статических, четко определенных участках. Различия возникают лишь в нечетко определенных участках. Дополнительные аминокислоты (лизин и аргинин), встроенные в молекулу человеческого инсулина, вызывают взаимодействия между вторичными структурами и изменения в подвижности неопределенных участков. Это может влиять на подверженность распаду, вызывая, таким образом, изменения в химической стабильности белка. Видны конкретные отличия между структурой инсулина SK3R (собственные неопубликованные данные), являющегося объектом настоящего изобретения, и известной структурой инсулина GR (International Journal of Biological Macromolecules. 2011; 49: 548554), являющегося предметом заявки № WO 2010/002283 А2.

Пространственные структуры мономеров человеческого инсулина и его отдельных аналогов, включая инсулин SK3R, определенные на основании данных ЯМР, показаны на фиг. 16.

- 25 030519

Перечень последовательностей <110> Институт биотехнологии и антибиотиков <120> АНАЛОГ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 23337/РСТ/13

<140> PCT/PL13/0000

<141> 2013-05-21

<150> PL399287

<151> 2012-05-23

<160> 22

<170> Patentln версия 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A-цепь инсулина с мутацией

<400> 1

Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly 20

<210> 2

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A-цепь инсулина с мутацией

<400> 2

Gly Не Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Ala 20

<210> 3

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A-цепь инсулина с мутацией

<400> 3

Gly Не Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1	5	10	15
Glu Asn	Tyr Cys Asn Ser

- 26 030519

<210> 4

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A-цепь инсулина с мутацией

<400> 4

Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Thr 20

<210> 5

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> В-цепь инсулина с мутацией

<400> 5

Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg 20 25 30

<210> 6

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> В-цепь инсулина с мутацией

<400> 6

Phe Val Arg Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg 20 25 30

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер KSRL

<400> 7

ggtggtcgtt ttgtcaaaca gcac

- 27 030519

<210> 8

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер KSRP

<400> 8

accacacagg tgctgtttga сааа

<210> 9

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер GLYP

<400> 9

tactgcaatg gttaagtcga ctctagc

<210> 10

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер GLYL

<400> 10

gagtcgactt aaccattgca gtagtt

<210> 11

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер ALAP

<400> 11

tactgcaatg cttaagtcga ctctagc

<210> 12

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ALAL

<400> 12

gagtcgactt aagcattgca gtagtt

<210> 13

- 28 030519

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер THRP

<400> 13

tactgcaata cctaagtcga ctctagc

<210> 14

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер THRL

<400> 14

gagtcgactt aggtattgca gtagtt

<210> 15

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ARGP

<400> 15

tttgtccgtc agcacctgtg tggttct

<210> 16

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ARGL

<400> 16

caggtgctga cggacaaaac gaccacc

<210> 17

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер SERP

<400> 17

tactgcaatt cttaagtcga ctctagc

<210> 18

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 29 030519

<223> праймер SERL

<400> 18

agagtcgact taagaattgc agtagtt

<210> 19

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер THRG

<400> 19

tactgcaata cttaagtcga ctctagc

<210> 20

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер THRD

<400> 20

agagtcgact taagtattgc agtagtt

<210> 21

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер SARGL

<400> 21

actcctaaaa cacgtggcat cgtt

<210> 22

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер SARGP

<400> 22

aacgatgcca cgtgttttag gagt

SEQ ID N0:23

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности плазмиды

p5/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B).

1 TAGAGCGCAC GAATGAGGGC CGACAGGAAG CAAAGCTGAA AGGAATCAAA

ATCTCGCGTG CTTACTCCCG GCTGTCCTTC GTTTCGACTT TCCTTAGTTT

51 TTTGGCCGCA GGCGTACCGT GGACAGGAAC GTCGTGCTGA CGCTTCATCA

AAACCGGCGT CCGCATGGCA CCTGTCCTTG CAGCACGACT GCGAAGTAGT

101 GAAGGGCACT GGTGCAACGG AAATTGCTCA TCAGCTCAGT ATTGCCCGCT

CTTCCCGTGA CCACGTTGCC TTTAACGAGT AGTCGAGTCA TAACGGGCGA

151 CCACGGTTTA ТААААТТСТТ GAAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT

GGTGCCAAAT ATTTTAAGAA CTTCTGCTTT CCCGGAGCAC TATGCGGATA

- 30 030519

201 TTTTATAGGT TAATGTCATG ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC

AAAATATCCA ATTACAGTAC TATTATTACC AAAGAATCTG CAGTCCACCG

251 ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT

TGAAAAGCCC CTTTACACGC GCCTTGGGGA TAAACAAATA AAAAGATTTA

301 ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC

TGTAAGTTTA TACATAGGCG AGTACTCTGT TATTGGGACT ATTTACGAAG

351 AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC

TTATTATAAC TTTTTCCTTC TCATACTCAT AAGTTGTAAA GGCACAGCGG

401 CTTATTCCCT I I ITTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA

GAATAAGGGA AAAAACGCCG TAAAACGGAA GGACAAAAAC GAGTGGGTCT

451 AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG

TTGCGACCAC TTTCATTTTC TACGACTTCT AGTCAACCCA CGTGCTCACC

501 GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC

CAATGTAGCT TGACCTAGAG TTGTCGCCAT TCTAGGAACT CTCAAAAGCG

551 CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG

GGGCTTCTTG CAAAAGGTTA CTACTCGTGA AAATTTCAAG ACGATACACC

601 CGCGGTATTA TCCCGTGTTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA

GCGCCATAAT AGGGCACAAC TGCGGCCCGT TCTCGTTGAG CCAGCGGCGT

651 TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG

ATGTGATAAG AGTCTTACTG AACCAACTCA TGAGTGGTCA GTGTCTTTTC

701 CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC

GTAGAATGCC TACCGTACTG TCATTCTCTT AATACGTCAC GACGGTATTG

751 CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC

GTACTCACTA TTGTGACGCC GGTTGAATGA AGACTGTTGC TAGCCTCCTG

801 CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC

GCTTCCTCGA TTGGCGAAAA AACGTGTTGT ACCCCCTAGT ACATTGAGCG

851 CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG

GAACTAGCAA CCCTTGGCCT CGACTTACTT CGGTATGGTT TGCTGCTCGC

901 TGACACCACG ATGCCTGCAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA

ACTGTGGTGC TACGGACGTC GTTACCGTTG TTGCAACGCG TTTGATAATT

951 CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG

GACCGCTTGA TGAATGAGAT CGAAGGGCCG TTGTTAATTA TCTGACCTAC

1001 GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG

CTCCGCCTAT TTCAACGTCC TGGTGAAGAC GCGAGCCGGG AAGGCCGACC

1051 CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA

GACCAAATAA CGACTATTTA GACCTCGGCC ACTCGCACCC AGAGCGCCAT

1101 TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC

AGTAACGTCG TGACCCCGGT CTACCATTCG GGAGGGCATA GCATCAATAG

1151 TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC

ATGTGCTGCC CCTCAGTCCG TTGATACCTA CTTGCTTTAT CTGTCTAGCG

1201 TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT

ACTCTATCCA CGGAGTGACT AATTCGTAAC CATTGACAGT CTGGTTCAAA

1251 ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCAI IΤI IA ATTTAAAAGG

TGAGTATATA TGAAATCTAA CTAAATTTTG AAGTAAAAAT TAAATTTTCC

1301 ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG

TAGATCCACT TCTAGGAAAA ACTATTAGAG TACTGGTTTT AGGGAATTGC

1351 TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CATCGCCGTT CTCGATACGC

ACTCAAAAGC AAGGTGACTC GCAGTCTGGG GTAGCGGCAA GAGCTATGCG

1401 TGAACCGTGC GCACGCTCAT CCCGGACAGT TCAGCAAGCT GCTCCTGGGA

ACTTGGCACG CGTGCGAGTA GGGCCTGTCA AGTCGTTCGA CGAGGACCCT

1451 CCAGGCACGC GCAAGACGCA GCGACCTGAA TTTGTTGGTA TCACTCATTT

GGTCCGTGCG CGTTCTGCGT CGCTGGACTT AAACAACCAT AGTGAGTAAA

1501 CCTGTCTCCG AATGGAAGAT GGTCAGCACA CAGTGTTGAC CGCGTAATCC

GGACAGAGGC TTACCTTCTA CCAGTCGTGT GTCACAACTG GCGCATTAGG

1551 TGCGCGACCA CGATCTTAAC CCGACAGTAA CGTGACAGCG GTCTGACATG

ACGCGCTGGT GCTAGAATTG GGCTGTCATT GCACTGTCGC CAGACTGTAC

1601 CCGCATTGAG GTCTTTGAAA CCGTAACTTC AGAAGCATGT ACGGTCAGAT

GGCGTAACTC CAGAAACTTT GGCATTGAAG TCTTCGTACA TGCCAGTCTA

1651 TTAACATAAG AGTTCATTGT ACGCACCGTT AAAACGCGCT CAGCGCGCTT

AATTGTATTC TCAAGTAACA TGCGTGGCAA TTTTGCGCGA GTCGCGCGAA

1701 CTGGCGCAAA AACCGTAAAA ATGGATGTTT TCCCCCGGGT AAACCGGAAA

GACCGCGTTT TTGGCATTTT TACCTACAAA AGGGGGCCCA TTTGGCCTTT

1751 AATGCGTCAG GAACGCTTTC AGCGCGTTGC ATGACTATGC ATGAAACTGA

TTACGCAGTC CTTGCGAAAG TCGCGCAACG TACTGATACG TACTTTGACT

1801 ATGGCGATCG GTTTGGGCGC GTCTGATGCC CATAAGGCGT ATTTTCGGAC

TACCGCTAGC CAAACCCGCG CAGACTACGG GTATTCCGCA TAAAAGCCTG

1851 GTTTTCAGCC CTGATAAGAA GAAATCAGAC TGTAGTTACA GACGAGTCGT

CAAAAGTCGG GACTATTCTT CTTTAGTCTG ACATCAATGT CTGCTCAGCA

- 31 030519

1УО1 GAGCGATTCA CTACGGGAGT CGTCGGCGAG TCATCCAGTA TTTTTCCTCG

CTCGCTAAGT GATGCCCTCA GCAGCCGCTC AGTAGGTCAT AAAAAGGAGC

1951 CGACTCTCTG GCGACTCGCC TTCTCTGAAC ACCAGAGCGA CAGTGTGTTG

GCTGAGAGAC CGCTGAGCGG AAGAGACTTG TGGTCTCGCT GTCACACAAC

2001 AGTCATCGAT AAATCACCGA CGACTCGTTG CCGAGTCATC CAGTAGTCGC

TCAGTAGCTA TTTAGTGGCT GCTGAGCAAC GGCTCAGTAG GTCATCAGCG

2051 CGACGAGCCG CTTTTGTATA AATCCGAATA AGAAAATATA TTTTTCAAAC

GCTGCTCGGC GAAAACATAT TTAGGCTTAT TCTTTTATAT AAAAAGTTTG

2101 CATAACAACA TGATTTAAAA AGCAAATCAG AAAAAAGTTA GTTTTGCGTG

GTATTGTTGT ACTAAATTTT TCGTTTAGTC TTTTTTCAAT CAAAACGCAC

2151 GGGTGTGGGC ATCCTGGGAA TGAGAACAGA CTCGCGTTTT TCTGGAGGAA

CCCACACCCG TAGGACCCTT ACTCTTGTCT GAGCGCAAAA AGACCTCCTT

2201 CTGCGGGGAT TTTTGATTAA ACAATAGTCA CCGCAGAGCG GAATTTTATG

GACGCCCCTA AAAACTAATT TGTTATCAGT GGCGTCTCGC CTTAAAATAC

2251 CAACGCTGGC TGTGCGGCAC GGGGATTTTT AATCCCCCGG CCCGTTATTC

GTTGCGACCG ACACGCCGTG CCCCTAAAAA TTAGGGGGCC GGGCAATAAG

2301 ATCTCCACGG GCGACGGGGA TACATAAACC CGACAGCAGA GGACGGGTGA

TAGAGGTGCC CGCTGCCCCT ATGTATTTGG GCTGTCGTCT CCTGCCCACT

2351 GCGCGAATCC CAGAGATGAT GAAAAAAGAG GCAGAGAAAC GCGCCCAGGT

CGCGCTTAGG GTCTCTACTA СI I I ITTCTC CGTCTCTTTG CGCGGGTCCA

2401 ACGTTTTATC TTATTGCTTT GGTGTTGTCC AGGGTGTCGG GGCTGTGCCC

TGCAAAATAG AATAACGAAA CCACAACAGG TCCCACAGCC CCGACACGGG

2451 TGACCAGGTG GCATTTGTCT GATTGCGCGT GCGCGGTCCG ACAAATGCAC

ACTGGTCCAC CGTAAACAGA CTAACGCGCA CGCGCCAGGC TGTTTACGTG

2501 ATCCTGCCCC GTCCTGTACG TG IT I И Г1C ACCAGAACAA CTTCACGAAG

TAGGACGGGG CAGGACATGC ACAAAAAAAG TGGTCTTGTT GAAGTGCTTC

2551 TGGCGGATGA ACGCTACCAA CGTTGCCGGG AACGCTTCGG CGATGATGGC

ACCGCCTACT TGCGATGGTT GCAACGGCCC TTGCGAAGCC GCTACTACCG

2601 ATAACGGGCT GATACAGGCA GCTCCCGGAG ACGGACACAG CTTGCCTGTG

TATTGCCCGA CTATGTCCGT CGAGGGCCTC TGCCTGTGTC GAACGGACAC

2651 AGCGGATGCC GGGAGCCGAC AA6CCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGI I I I A

TCGCCTACGG CCCTCGGCTG TTCGGGCAGT CCCGCGCAGT CGCCCAAAAT

2701 GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA TAGCGGAGTG

CGCCCACAGC CCCGCGTCGG TACTGGGTCA GTGCATCGCT ATCGCCTCAC

2751 TATACTGGCT TAATATGTTA AATCGGAGTG GTAATTCAGG GAAGTGCTTC

ATATGACCGA ATTATACAAT TTAGCCTCAC CATTAAGTCC CTTCACGAAG

2801 ATGTGGCAAA GGAAAAATGT GGCTATCGTG CGTAAGTGCA ACATGTAGGT

TACACCGTTT CCTTTTTACA CCGATAGCAC GCATTCACGT TGTACATCCA

2851 AAAGGTGAAA TGACGCCTCC TCGCTCACTC GGTCGCTACG CTCCTGCCGT

TTTCCACTTT ACTGCGGAGG AGCGAGTGAG CCAGCGATGC GAGGACGGCA

2901 GAGACTGCGG CGGGCGTTAC CGGCTCACAA ATAACGGGAT ACGCAGGCAG

CTCTGACGCC GCCCGCAATG GCCGAGTGTT TATTGCCCTA TGCGTCCGTC

2951 TGCTCAAATC AGGAAGGACC GGAAAAAGGA TGCGGCGTAG CCGI IT П CC

ACGAGTTTAG TCCTTCCTGG CCTTTTTCCT ACGCCGCATC GGCAAAAAGG

3001 ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC AAGCATCACG AAATCTGACG CTCAAATCAG

TATCCGAGGC GGGGGGACTG TTCGTAGTGC TTTAGACTGC GAGTTTAGTC

3051 TGGCGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TCCCAGGCGT TTCCCCCTGG

ACCGCCGCTT TGGGCTGTCC TGATATTTCT AGGGTCCGCA AAGGGGGACC

3101 TAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCTGC CTTTCGGTTT ACCGGTGTCA

ATCGAGGGAG CACGCGAGAG GACAAGGACG GAAAGCCAAA TGGCCACAGT

3151 TTCCGCTGTT ATGGCCGCGT TTGTCTCATT CCACGCCTGA CACTCAGTTC

AAGGCGACAA TACCGGCGCA AACAGAGTAA GGTGCGGACT GTGAGTCAAG

3201 CGGGTAGGCA GTTCGCTCCA AGCTGGACTG TATGCACGAA CCCCCCGTTC

GCCCATCCGT CAAGCGAGGT TCGACCTGAC ATACGTGCTT GGGGGGCAAG

3251 AGTCCGACTA CCACGCCCGT TCCGGTAACT ATCAACTTGA GTCCAACCCG

TCAGGCTGAT GGTGCGGGCA AGGCCATTGA TAGTTGAACT CAGGTTGGGC

3301 GAAAGACACG ACAAATCGCC AGTGGCGGTA GCCATTGGTA ACTGAGATGT

CTTTCTGTGC TGTTTAGCGG TCACCGCCAT CGGTAACCAT TGACTCTACA

3351 GCGAGAGATT TATCTGGAGT TCTTGAAGTG GGGGCCTGAG TGCGGCTACA

CGCTCTCTAA ATAGACCTCA AGAACTTCAC CCCCGGACTC ACGCCGATGT

3401 CTGGAAGGAC AGTTTAGGTG ACTCGTCTCG CACAAGACAG TTACCAGGTT

GACCTTCCTG TCAAATCCAC TGAGCAGAGC GTGTTCTGTC AATGGTCCAA

3451 AAGCAGTTCC CCAACTGACC TAACCTTCGA TCAAACCACC TCCCCAGGTG

TTCGTCAAGG GGTTGACTGG ATTGGAAGCT AGTTTGGTGG AGGGGTCCAC

3501 GTTTTTTCGT TTTCAGAGCA AGAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA

CAAAAAAGCA AAAGTCTCGT TCTCTAATGC GCGTCTIT П TTCCTAGAGT

3551 AGAAGATCCT TTTTACAGGA GCGATTATCG TCTTCATCCA TGAAGGCGTT

TCTTCTAGGA AAAATGTCCT CGCTAATAGC AGAAGTAGGT ACTTCCGCAA

- 32 030519

3601

3651

3701

3751

3801

3851

3901

3951

4001

4051

4101

4151

4201

4251

4301

4351

4401

4451

4501

4551

4601

4651

4701

4751

SEQ ID

TGAAGATTAA ACCGGCCTAT TTCATAGATC GTAAAATCAG GGTTTTGGGA ACTTCTAATT TGGCCGGATA AAGTATCTAG CATTTTAGTC CCAAAACCCT TGGCCGATGA AACCCCATAA AAACCCATAA ATACATACAC CTACTAACAA ACCGGCTACT TTGGGGTATT TTTGGGTATT TATGTATGTG GATGATTGTT TCATCTTTTG CTGTACCAGG GTATGAAAAG TCTCAGGGTT CCACCCCAGA AGTAGAAAAC GACATGGTCC CATACTTTTC AGAGTCCCAA GGTGGGGTCT ATACGCCATC AACAAGTCCT GTCACACCGC CAAATAACAT GCAAAAAATT TATGCGGTAG TTGTTCAGGA CAGTGTGGCG GTTTATTGTA CGTTTTTTAA GCGGAT6ACC GTAATCCGGG GTGCAGATCA ATGACTGAGA CAAGTATAAA CGCCTACTGG CATTAGGCCC CACGTCTAGT TACTGACTCT GTTCATATTT CTTCATGCAA'AAAGTAATTA CAATCAGTCC CAAAGTCAGC GGTGTCCCGG GAAGTACGTT TTTCATTAAT GTTAGTCAGG GTTTCAGTCG CCACAGGGCC CCCTGATAAT CATGCCCGGA TTATCTGAAT TTCTCAGCGG GGGCTGTGAG GGGACTATTA GTACGGGCCT AATAGACTTA AAGAGTCGCC CCCGACACTC CGCCACAACC TGTATCCAAG AGCGGTGCCT ACGAGCAGTC CTGCCGTCAT GCGGTGTTGG ACATAGGTTC TCGCCACGGA TGCTCGTCAG GACGGCAGTA CATTGTAAGG CTTACGCCAG CAAGTTTTGT CTCAGTGATA ACACCTTATG GTAACATTCC GAATGCGGTC GTTCAAAACA GAGTCACTAT TGTGGAATAC CTCCCCATAC AAGGAAAAGT ATCGGGAGAA AAAACAAACG CCCGGTTGTC GAGGGGTATG TTCCTTTTCA TAGCCCTCTT TTTTGTTTGC GGGCCAACAG ATCTCCCGGT CATAAAGAGC AGCAAAACCG CGTCGTAGTA AAAAAGCGAG TAGAGGGCCA GTATTTCTCG TCGTTTTGGC GCAGCATCAT TTTTTCGGTC CAGGATCAAG CTTCAGGGTT GAGATGTGTA TAAGAGACAG ACTCTAGCCA GTCCTAGTTC GAAGTCCCAA CTCTACACAT ATTCTCTGTC TGAGATCGGT GTTTCCAAGT AGAAACTACA GTTTCTAAAC TGCAACTTTT TCTACTTTTT CAAAGGTTCA TCTTTGATGT CAAAGATTTG ACGTTGAAAA AGATGAAAAA GCAACTTAAT CTATTGACTA GTCCTTTATA AATGTTAAAA CATATATATA CGTTGAATTA GATAACTGAT CAGGAAATAT TTACAATTTT GTATATATAT

' MetGln IlePheVal LysThrLeu

GAAATAAATA AAAAGAGGAG GTTCATATGC AAA I I 1 ITGT TAAAACTTTA CTTTATTTAT TTTTCTCCTC CAAGTATACG TTTAAAAACA ATTTTGAAAT

ThrGlyLysThr lleThrLeu GluValGlu SerSerAspThr ileAspAsn ACTGGTAAAA ССДТТАССТТ AGAAGTTGAA TCTTCAGATA CCATTGATAA TGACCATTTT GGTAATGGAA TCTTCAACTT AGAAGTCTAT GGTAACTATT

•ValLysSer LyslleGlnAsp LysGluGly IlePropro AspGlnGln· TGTTAAATCT AAAATTCAAG ATAAAGAAGG TATTCCTCCA GATCAACAAG ACAATTTAGA TTTTAAGTTC TATTTCTTCC ATAAGGAGGT CTAGTTGTTC

AlaLeullePhe AlaGlyLys GlnLeuGluAsp GlyAlaThr LeuserAsp CTCTAATATT TGCAGGTAAA CAGTTAGAAG ATGGTGCTAC CCTGTCTGAT GAGATTATAA ACGTCCATTT GTCAATCTTC TACCACGATG GGACAGACTA

TyrAsnlleGln LysGluSer ThrLeuHis LeuvalLeuAla LeuAlaGly TATAACATTC AGAAAGAATC TACCTTACAT CTGGTCTTAG CTCTCGCTGG ATATTGTAAG TCTTTCTTAG ATGGAATGTA GACCAGAATC GAGAGCGACC

•GlyArgPhe valLysGlnHis LeucysGly SerHisLeu valGluAla· TGGTCGTTTT GTCAAACAGC ACCTGTGTGG TTCTCACCTG GTTGAAGCAC ACCAGCAAAA CAGCTTGTCG TGGACACACC AAGAGTGGAC CAACTTCGTG

LeuTyrLeuVal CysGlyGlu ArgGlyPhePhe TyrThrPro LysThrArg TGTACCTGGT ATGTGGCGAA CGTGGTTTCT TCTACACTCC TAAAACACGT ACATGGACCA TACACCGCTT GCACCAAAGA AGATGTGAGG ATTTTGTTTC

ArgGlylleval GluGlnCys CysThrser llecysser LeuTyrGlnLeu CGCGGCATCG TTGAACAGTG CTGTACCTCT ATCTGTTCCC TGTACCAACT GCGCCGTAGC AACTTGTCAC GACATGGAGA TAGACAAGGG ACATGGTTGA

•GluAsnTyr CysAsnSer***

GGAGAACTAC TGCAATTCTT AAGTCGACTC TAGCTACAGC CTCCTTTCGG CCTCTTGATG ACGTTACCAA TTCAGCTGAG ATCGATGTCG GAGGAAAGCC AGGCTGTTTT TTATCTCGAG GATCC

TCCGACAAAA AATAGAGCTC CTAGG

N0:24

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности плазмиды

p6/ZUINSSer(22A)Lys(3B)Arg(31B)Arg(32B).

1 ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG

TAATAGTACT GTAATTGGAT Al 1Ί Г1ATCC GCATAGTGCT CCGGGAAAGC

51 TCTTCAAGAA TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC

- 33 030519

AGAAGTTCTT AAGAGTACAA ACTGTCGAAT AGTAGCTATT CGAAATTACG 101 GGTAGTTTAT CACAGTTAAA TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA

CCATCAAATA GTGTCAATTT AACGATTGCG TCAGTCCGTG GCACATACTT 151 ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG CACCGTCACC CTGGATGCTG

TAGATTGTTA CGCGAGTAGC AGTAGGAGCC GTGGCAGTGG GACCTACGAC 201 TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT GCGGGATATC

ATCCGTATCC GAACCAATAC GGCCATGACG GCCCGGAGAA CGCCCTATAG 251 GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA

CAGGTAAGGC TGTCGTAGCG GTCAGTGATA CCGCACGACG ATCGCGATAT 301 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC

ACGCAACTAC GTTAAAGATA CGCGTGGGCA AGAGCCTCGT GACAGGCTGG 351 GCTTTGGCCG CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC

CGAAACCGGC GGCGGGTCAG GACGAGCGAA GCGATGAACC TCGGTGATAG 401 GACTACGCGA TCATGGCGAC CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG

CTGATGCGCT AGTACCGCTG GTGTGGGCAG GACACCTAGG AGATGCGGCC 451 ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT

TGCGTAGCAC CGGCCGTAGT GGCCGCGGTG TCCACGCCAA CGACCGCGGA 501 ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCGCCA CTTCGGGCTC

TATAGCGGCT GTAGTGGCTA CCCCTTCTAG CCCGAGCGGT GAAGCCCGAG 551 ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG

TACTCGCGAA CAAAGCCGCA CCCATACCAC CGTCCGGGGC ACCGGCCCCC 601 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC

TGACAACCCG CGGTAGAGGA ACGTACGTGG TAAGGAACGC CGCCGCCACG 651 TCAACGGCCT CAACCTACTA CTGGGCTGCT TCCTAATGCA GGAGTCGCAT

AGTTGCCGGA GTTGGATGAT GACCCGACGA AGGATTACGT CCTCAGCGTA 701 AAGGGAGAGC GTCGACCGAT GCCCTTGAGA GCCTTCAACC CAGTCAGCTC

TTCCCTCTCG CAGCTGGCTA CGGGAACTCT CGGAAGTTGG GTCAGTCGAG 751 CTTCCGGTGG GCGCGGGGCA TGACTATCGT CGCCGCACTT ATGACTGTCT

GAAGGCCACC CGCGCCCCGT ACTGATAGCA GCGGCGTGAA TACTGACAGA 801 TCTTTATCAT GCAACTCGTA GGACAGGTGC CGGCAGCGCT CTGGGTCATT

AGAAATAGTA CGTTGAGCAT CCTGTCCACG GCCGTCGCGA GACCCAGTAA 851 TTCGGCGAGG ACCGCTTTCG CTGGAGCGCG ACGATGATCG GCCTGTCGCT

AAGCCGCTCC TGGCGAAAGC GACCTCGCGC TGCTACTAGC CGGACAGCGA 901 TGCGGTATTC GGGATCTTGC ACGCCCTCGC TCAAGCCTTC GTCACTGGTC

ACGCCATAAG CCCTAGAACG TGCGGGAGCG AGTTCGGAAG CAGTGACCAG 951 CCGCCACCAA ACGTTTCGGC GAGAAGCAGG CCATTATCGC CGGCATGGCG

GGCGGTGGTT TGCAAAGCCG CTCTTCGTCC GGTAATAGCG GCCGTACCGC 1001 GCCGACGCGC TGGGCTACGT CTTGCTGGCG TTCGCGACGC GAGGCTGGAT

CGGCTGCGCG ACCCGATGCA GAACGACCGC AAGCGCTGCG CTCCGACCTA 1051 GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC CGGCGGCATC GGGATGCCCG

CCGGAAGGGG TAATACTAAG AAGAGCGAAG GCCGCCGTAG CCCTACGGGC 1101 CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA TCAGGGACAG

GCAACGTCCG GTACGACAGG TCCGTCCATC TACTGCTGGT AGTCCCTGTC 1151 CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCATTGGACC

GAAGTTCCTA GCGAGCGCCG AGAATGGTCG GATTGAAGCT AGTAACCTGG 1201 GCTGATCGTC ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT

CGACTAGCAG TGCCGCTAAA TACGGCGGAG CCGGTCGTGT ACCTTGCCCA 1251 TGGCATGGAT TGTAGGCGCC GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG

ACCGTACCTA ACATCCGCGG CGGGATATGG AACAGACGGA GGGGCGCAAC 1301 CGTCGCGGTG CATGGAGCCG GGCCACCTCG ACCTGAATGG AACCGCGGAG

GCAGCGCCAC GTACCTCGGC CCGGTGGAGC TGGACTTACC TTGGCGCCTC 1351 ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC

TATCCACGGA GTGACTAATT CGTAACCATT GACAGTCTGG TTCAAATGAG 1401 ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA I I I I IAATTT AAAAGGATCT

TATATATGAA ATCTAACTAA ATTTTGAAGT AAAAATTAAA TTTTCCTAGA 1451 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG

TCCACTTCTA GGAAAAACTA TTAGAGTACT GGTTTTAGGG AATTGCACTC 1501 TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCATC GCCGTTCTCG ATACGCTGAA

AAAAGCAAGG TGACTCGCAG TCTGGGGTAG CGGCAAGAGC TATGCGACTT 1551 CCGTGCGCAC GCTCATCCCG GACAGTTCAG CAAGCTGCTC CTGGGACCAG

GGCACGCGTG CGAGTAGGGC CTGTCAAGTC GTTCGACGAG GACCCTGGTC 1601 GCACGCGCAA GACGCAGCGA CCTGAATTTG TTGGTATCAC TCATTTCCTG

CGTGCGCGTT CTGCGTCGCT GGACTTAAAC AACCATAGTG AGTAAAGGAC 1651 TCTCCGAATG GAAGATGGTC AGCACACAGT GTTGACCGCG TAATCCTGCG

AGAGGCTTAC CTTCTACCAG TCGTGTGTCA CAACTGGCGC ATTAGGACGC 1701 CGACCACGAT CTTAACCCGA CAGTAACGTG ACAGCGGTCT GACATGCCGC

GCTGGTGCTA GAATTGGGCT GTCATTGCAC TGTCGCCAGA CTGTACGGCG 1751 ATTGAGGTCT TTGAAACCGT AACTTCAGAA GCATGTACGG TCAGATTTAA

- 34 030519

TAACTCCAGA AACTTTGGCA TTGAAGTCTT CGTACATGCC AGTCTAAATT 1801 CATAAGAGTT CATTGTACGC ACCGTTAAAA CGCGCTCAGC GCGCTTCTGG

GTATTCTCAA GTAACATGCG TGGCAATTTT GCGCGAGTCG CGCGAAGACC 1851 CGCAAAAACC GTAAAAATGG ATGTTTTCCC CCGGGTAAAC CGGAAAAATG

GCGTTTTTGG CATTTTTACC TACAAAAGGG GGCCCATTTG GCCTTTTTAC 1901 CGTCAGGAAC GCTTTCAGCG CGTTGCATGA CTATGCATGA AACTGAATGG

GCAGTCCTTG CGAAAGTCGC GCAACGTACT GATACGTACT TTGACTTACC 1951 CGATCGGTTT GGGCGCGTCT GATGCCCATA AGGCGTATTT TCGGACGTTT

GCTAGCCAAA CCCGCGCAGA CTACGGGTAT TCCGCATAAA AGCCTGCAAA 2001 TCAGCCCTGA TAAGAAGAAA TCAGACTGTA GTTACAGACG AGTCGTGAGC

AGTCGGGACT ATTCTTCTTT AGTCTGACAT CAATGTCTGC TCAGCACTCG 2051 GATTCACTAC GGGAGTCGTC GGCGAGTCAT CCAGTATTTT TCCTCGCGAC

CTAAGTGATG CCCTCAGCAG CCGCTCAGTA GGTCATAAAA AGGAGCGCTG 2101 TCTCTGGCGA CTCGCCTTCT CTGAACACCA GAGCGACAGT GTGTTGAGTC

AGAGACCGCT GAGCGGAAGA GACTTGTGGT CTCGCTGTCA CACAACTCAG 2151 ATCGATAAAT CACCGACGAC TCGTTGCCGA GTCATCCAGT AGTCGCCGAC

TAGCTATTTA GTGGCTGCTG AGCAACGGCT CAGTAGGTCA TCAGCGGCTG 2201 GAGCCGCTTT TGTATAAATC CGAATAAGAA AATATATTTT TCAAACCATA

CTCGGCGAAA ACATATTTAG GCTTATTCTT TTATATAAAA AGTTTGGTAT 2251 ACAACATGAT TTAAAAAGCA AATCAGAAAA AAGTTAGTTT TGCGTGGGGT

TGTTGTACTA AAI TT ITCGT TTAGTCTTTT TTCAATCAAA ACGCACCCCA 2301 GTGGGCATCC TGGGAATGAG AACAGACTCG CGI I T !I CTG GAGGAACTGC

CACCCGTAGG ACCCTTACTC TTGTCTGAGC GCAAAAAGAC CTCCTTGACG 2351 GGGGATTTTT GATTAAACAA TAGTCACCGC AGAGCGGAAT TTTATGCAAC

CCCCTAAAAA CTAATTTGTT ATCAGTGGCG TCTCGCCTTA AAATACGTTG 2401 GCTGGCTGTG CGGCACGGGG ATTTTTAATC CCCCGGCCCG TTATTCATCT

CGACCGACAC GCCGTGCCCC TAAAAATTAG GGGGCCGGGC AATAAGTAGA 2451 CCACGGGCGA CGGGGATACA TAAACCCGAC AGCAGAGGAC GGGTGAGCGC

GGTGCCCGCT GCCCCTATGT ATTTGGGCTG TCGTCTCCTG CCCACTCGCG 2501 GAATCCCAGA GATGATGAAA AAAGAGGCAG AGAAACGCGC CCAGGTACGT

CTTAGGGTCT CTACTACTTT TTTCTCCGTC TCTTTGCGCG GGTCCATGCA 2551 TTTATCTTAT TGCTTTGGTG TTGTCCAGGG TGTCGGGGCT GTGCCCTGAC

AAATAGAATA ACGAAACCAC AACAGGTCCC ACAGCCCCGA CACGGGACTG 2601 CAGGTGGCAT TTGTCTGATT GCGCGTGCGC GGTCCGACAA ATGCACATCC

GTCCACCGTA AACAGACTAA CGCGCACGCG CCAGGCTGTT TACGTGTAGG 2651 TGCCCCGTCC TGTACGTGTT TTTTTCACCA GAACAACTTC ACGAAGTGGC

ACGGGGCAGG ACATGCACAA AAAAAGTGGT CTTGTTGAAG TGCTTCACCG 2701 GGATGAACGC TACCAACGTT GCCGGGAACG CTTCGGCGAT GATGGCATAA

CCTACTTGCG ATGGTTGCAA CGGCCCTTGC GAAGCCGCTA CTACCGTATT 2751 CGGGCTGATA CAGGCAGCTC CCGGAGACGG ACACAGCTTG CCTGTGAGCG

GCCCGACTAT GTCCGTCGAG GGCCTCTGCC TGTGTCGAAC GGACACTCGC 2801 GATGCCGGGA GCCGACAAGC CCGTCAGGGC GCGTCAGCGG GTTTTAGCGG

CTACGGCCCT CGGCTGTTCG GGCAGTCCCG CGCAGTCGCC CAAAATCGCC 2851 GTGTCGGGGC GCAGCCATGA CCCAGTCACG TAGCGATAGC GGAGTGTATA

CACAGCCCCG CGTCGGTACT GGGTCAGTGC ATCGCTATCG CCTCACATAT 2901 CTGGCTTAAT ATGTTAAATC GGAGTGGTAA TTCAGGGAAG TGCTTCATGT

GACCGAATTA TACAATTTAG CCTCACCATT AAGTCCCTTC ACGAAGTACA 2951 GGCAAAGGAA AAATGTGGCT ATCGTGCGTA AGTGCAACAT GTAGGTAAAG

CCGTTTCCTT TTTACACCGA TAGCACGCAT TCACGTTGTA CATCCATTTC 3001 GTGAAATGAC GCCTCCTCGC TCACTCGGTC GCTACGCTCC TGCCGTGAGA

CACTTTACTG CGGAGGAGCG AGTGAGCCAG CGATGCGAGG ACGGCACTCT 3051 CTGCGGCGGG CGTTACCGGC TCACAAATAA CGGGATACGC AGGCAGTGCT

GACGCCGCCC GCAAT6GCCG AGTGTTTATT GCCCTATGCG TCCGTCACGA 3101 CAAATCAGGA AGGACCGGAA AAAGGATGCG GCGTAGCCGT TTTTCCATAG

GTTTAGTCCT TCCTGGCCTT TTTCCTACGC CGCATCGGCA AAAAGGTATC 3151 GCTCCGCCCC CCTGACAAGC ATCACGAAAT CTGACGCTCA AATCAGTGGC

CGAGGCGGGG GGACTGTTCG TAGTGCTTTA GACTGCGAGT TTAGTCACCG 3201 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATCCC AGGCGTTTCC CCCTGGTAGC

CCGCTTTGGG CTGTCCTGAT ATTTCTAGGG TCCGCAAAGG GGGACCATCG 3251 TCCCTCGTGC GCTCTCCT6T TCCTGCCTTT CGGTTTACCG GTGTCATTCC

AGGGAGCACG CGAGAGGACA AGGACGGAAA GCCAAATGGC CACAGTAAGG 3301 GCTGTTATGG CCGCGTTTGT CTCATTCCAC GCCTGACACT CAGTTCCGGG

CGACAATACC GGCGCAAACA GAGTAAGGTG CGGACTGTGA GTCAAGGCCC 3351 TAGGCAGTTC GCTCCAAGCT GGACTGTATG CACGAACCCC CCGTTCAGTC

ATCCGTCAAG CGAGGTTCGA CCTGACATAC GTGCTTGGGG GGCAAGTCAG 3401 CGACTACCAC GCCCGTTCCG GTAACTATCA ACTTGAGTCC AACCCGGAAA

GCTGATGGTG CGGGCAAGGC CATTGATAGT TGAACTCAGG TTGGGCCTTT 3451 GACACGACAA ATCGCCAGTG GCGGTAGCCA TTGGTAACTG AGATGTGCGA

- 35 030519

CTGTGCTGTT TAGCGGTCAC CGCCATCGGT AACCATTGAC TCTACACGCT 3501 GAGATTTATC TGGAGTTCTT GAAGTGGGGG CCTGAGTGCG GCTACACTGG

CTCTAAATAG ACCTCAAGAA CTTCACCCCC GGACTCACGC CGATGTGACC 3551 AAGGACAGTT TAGGTGACTC GTCTCGCACA AGACAGTTAC CAGGTTAAGC

TTCCTGTCAA ATCCACTGAG CAGAGCGTGT TCTGTCAATG GTCCAATTCG 3601 AGTTCCCCAA CTGACCTAAC CTTCGATCAA ACCACCTCCC CAGGTGGTTT

TCAAGGGGTT GACTGGATTG GAAGCTAGTT TGGTGGAGGG GTCCACCAAA 3651 TTTCGTTTTC AGAGCAAGAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA

AAAGCAAAAG TCTCGTTCTC TAATGCGCGT СП Π П 1 CC TAGAGTTCTT 3701 GATCCTTTTT ACAGGAGCGA TTATCGTCTT CATCCATGAA GGCGTTTGAA

CTAGGAAAAA TGTCCTCGCT AATAGCAGAA GTAGGTACTT CCGCAAACTT 3751 GATTAAACCG GCCTATTTCA TAGATCGTAA AATCAGGGTT TTGGGATGGC

CTAATTTGGC CGGATAAAGT ATCTAGCATT TTAGTCCCAA AACCCTACCG 3801 CGATGAAACC CCATAAAAAC CCATAAATAC ATACACCTAC TAACAATCAT

GCTACTTTGG GGTATTTTTG GGTATTTATG TATGTGGATG ATTGTTAGTA 3851 CTTTTGCTGT ACCAGGGTAT GAAAAGTCTC AGGGTTCCAC CCCAGAATAC

GAAAACGACA tggtcccata cttttcagag tcccaaggtg GGGTCTTATG 3901 gccatcaaca agtcctgtca caccgccaaa taacatgcaa aaaattgcgg

cggtagttgt tcaggacagt gtggcggttt attgtacgtt ttttaacgcc

3951 atgaccgtaa tccggggtgc agatcaatga ctgagacaag tataaacttc

tactggcatt aggccccacg tctagttact gactctgttc atatttgaag

4001 atgcaaaaag taattacaat cagtcccaaa gtcagcggtg tcccggccct

tacgtttttc attaatgtta gtcagggttt cagtcgccac agggccggga

4051 gataatcatg cccggattat ctgaatttct cagcgggggc tgtgagcgcc

ctattagtac gggcctaata gacttaaaga gtcgcccccg acactcgcgg

4101 ACAACCTGTA TCCAAGAGCG GTGCCTACGA GCAGTCCTGC CGTCATCATT

TGTTGGACAT AGGTTCTCGC CACGGATGCT CGTCAGGACG GCAGTAGTAA

4151 GTAAGGCTTA CGCCAGCAAG TTTTGTCTCA GTGATAACAC CTTATGCTCC

CATTCCGAAT GCGGTCGTTC AAAACAGAGT CACTATTGTG GAATACGAGG

4201 CCATACAAGG AAAAGTATCG GGAGAAAAAA CAAACGCCCG GTTGTCATCT

GGTATGTTCC TTTTCATAGC CCTCI I I I IT GTTTGCGGGC CAACAGTAGA

4251 CCCGGTCATA AAGAGCAGCA AAACCGCGTC GTAGTAAAAA AGCCAGCAGG

GGGCCAGTAT TTCTCGTCGT TTTGGCGCAG CATCATTTTT TCGGTCGTCC

4301 ATCAAGCTTC AGGGTTGAGA TGTGTATAAG AGACAGACTC TAGCCAGTTT

TAGTTCGAAG TCCCAACTCT ACACATATTC TCTGTCTGAG ATCGGTCAAA

4351 CCAAGTAGAA ACTACAGTTT CTAAACTGCA ACTTTTTCTA СГПIIGCAA

GGTTCATCTT TGATGTCAAA GATTTGACGT TGAAAAAGAT GAAAAACGTT

4401 CTTAATCTAT TGACTAGTCC TTTATAAATG TTAAAACATA TATATAGAAA

GAATTAGATA ACTGATCAGG AAATATTTAC AATTTTGTAT ATATATCTTT

MetGlnile PhevalLys ThrLeuThr·

4451 TAAATAAAAA GAGGAGGTTC ATATGCAAAT TTTTGTTAAA ACTTTAACTG

АТТТАП ГГ I CTCCTCCAAG TATACGTTTA AAAACAATTT TGAAATTGAC

GlyLysThrlle ThrLeuGlu ValGluSerSer AspThrlle AspAsnVal 4501 GTAAAACCAT TACCTTAGAA GTTGAATCTT CAGATACCAT TGATAATGTT

CATTTTGGTA ATGGAATCTT CAACTTAGAA GTCTATGGTA ACTATTACAA LysSerLyslle GlnAspLys GluGlylle ProProAspGln GlnAlaLeu

4551 AAATCTAAAA TTCAAGATAA AGAAGGTATT CCTCCAGATC AACAAGCTCT

TTTAGATTTT AAGTTCTATT TCTTCCATAA GGAGGTCTAG TTGTTCGAGA

•llePheAla GlyLysGlnLeu GluAspGly AlaThrLeu SerAspTyr· 4601 AATATTTGCA GGTAAACAGT TAGAAGATGG TGCTACCCTG TCTGATTATA

TTATAAACGT CCATTTGTCA ATCTTCTACC ACGATGGGAC AGACTAATAT AsnileGlnLys GluSerThr LeuHisLeuval LeuAlaLeu AlaGlyGly

4651 ACATTCAGAA AGAATCTACC TTACATCTGG TCTTAGCTCT CGCTGGTGGT

TGTAAGTCTT TCTTAGATGG AATGTAGACC AGAATCGAGA GCGACCACCA

ArgPheValLys GlnHisLeu CysGlySer HisLeuvalGlu AlaLeuTyr 4701 CGTTTTGTCA AACAGCACCT GTGTGGTTCT CACCTGGTIG AAGCACTGTA

GCAAAACAGT TGGTCGTGGA CACACCAAGA GTGGACCAAC TTCGTGACAT •LeuValCys GlyGluArgGly PhePheTyr ThrRroLys ThrArgArg·

4751 CCTGGTATGT GGCGAACGTG GTTTCTTCTA CACTCCTAAA ACACGTCGCG

GGACCATACA CCGCTTGCAC CAAAGAAGAT GTGAGGATTT TGTGCAGCGC

GlylleValGlu GlnCysCys ThrSerlleCys SerLeuTyr GlnLeuGlu 4801 GCATCGTTGA ACAGTGCTGT ACCTCTATCT GTTCCCTGTA CCAACTGGAG

CGTAGCAACT TGTCACGACA TGGAGATAGA CAAGGGACAT GGTTGACCTC AsnTyrCysAsn Ser***

4851 AACTACTGCA ATTCTTAAGT CGACTCTAGC TACAGCCTCC TTTCGGAGGC

TTGATGACGT TACCAATTCA GCTGAGATCG ATGTCGGAGG AAAGCCTCCG

4901 TGTTTTTTAT C

ACAAAAAATA G

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Аналог человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие два полипептида, образующие А-цепь и В-цепь, характеризующиеся тем, что они определены общей формулой 1

   - 36 030519

   8-S

   ί I

   Gly-lte-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle -Cy s-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu 12 3 4 s £ /V 6 9 1C 11 72 13 14 IS 18

   g ............. —ί S А-цепъ

   Giu-AsrvTyr-Cys-Asn-R j 17 IB 19 20 21 22 g

   /

   PtiG-Val-X-GIri-His-Leu-Cys-Gfy-Ser-His-Leu-Val-Giu-AIa^Leu-Tyr1 2 3 4b 6 7 В e 10 -It 12 13 14 1S 16

   β —-—-——η

   Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys -Thr-Arg

   17 IS 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2Б 29 30 31

   В-цепъ

   (формула 1),

   где X представляет собой остаток основной аминокислоты Lys или Arg, a R представляет собой остаток нейтральной аминокислоты Gly, Ala, Ser или Thr,

   где аминокислотная последовательность А-цепи выбрана из SEQ ID NO:1-4, а аминокислотная последовательность В-цепи выбрана из SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6,

   причем аналог человеческого инсулина характеризуется изоэлектрической точкой со значениями от 6 до 8.
2. 2. Аналог человеческого инсулина по п.1, характеризующийся тем, что если X представляет собой Lys, то R представляет собой Ser или Ala.
3. 3. Фармацевтическая композиция с пролонгированным терапевтическим эффектом, содержащая аналог человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп. 1, 2 в количестве от 1,3 до 20 мг/мл.
4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, содержащая аналог человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемую соль в количестве от 1,4 до 10 мг/мл.
5. 5. Фармацевтическая композиция по п.3 или 4, дополнительно содержащая до 60 мкг/мл цинка, предпочтительно от 10 до 60 мкг/мл.
6. 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-5, дополнительно содержащая вещество для придания изотоничности, консервант и буферное вещество.
7. 7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-5, дополнительно содержащая вещество для придания изотоничности, консервант, буферное вещество и вещества, препятствующие агрегации, применяемые в белковых составах.
8. 8. Применение аналога человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1, 2 для лечения сахарного диабета у млекопитающих.
9. 9. Применение аналога человеческого инсулина или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1, 2 для получения лекарственного средства с пролонгированным терапевтическим эффектом для лечения сахарного диабета у млекопитающих.
10. 10. Способ лечения млекопитающих, страдающих сахарным диабетом, отличающийся тем, что млекопитающему, которое нуждается в таком лечении, вводят один раз в день фармацевтическую композицию по любому из пп.3-7 в количестве от 0,3 до 180 мкг/кг массы тела.
11. 11. Способ лечения млекопитающих по п.10, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

    - 37 030519