ES2811068T3 - Polipéptidos de acción prolongada y métodos para producir y administrar los mismos - Google Patents

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Abstract

Un polipeptido modificado con peptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina corionica que comprende una hormona de crecimiento (GH), en donde un CTP se une al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina corionica se unen en tandem al extremo carboxilo terminal de dicha hormona de crecimiento, que incluye opcionalmente un peptido senal unido al extremo amino de dicho un CTP, para usar en el mantenimiento de los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) dentro de un intervalo terapeutico normal de ±2 SDS en un sujeto humano durante seis meses, en donde el sujeto es un nino deficiente de la hormona de crecimiento (GHD), y dicha hormona de crecimiento modificada con CTP se administra una vez por semana a una dosis de 0,66 mg/kg/semana.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de acción prolongada y métodos para producir y administrar los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a usos médicos de polipéptidos de la hormona de crecimiento humana modificados con CTP.
Antecedentes de la invención
Los polipéptidos son susceptibles a la desnaturalización o degradación enzimática en la sangre, el hígado o el riñón. En consecuencia, los polipéptidos tienen generalmente tiempos cortos de vida media en circulación de varias horas. Debido a su baja estabilidad, los fármacos peptídicos se suministran usualmente en una frecuencia sostenida a fin de mantener una concentración plasmática eficaz del péptido activo. Además, ya que los fármacos peptídicos usualmente se administran mediante infusión, la inyección frecuente de los fármacos peptídicos provoca una incomodidad considerable al individuo.
Una farmacocinética desfavorable, como una vida media en suero corta, puede impedir el desarrollo farmacéutico de muchos candidatos a fármacos que de otro modo podrían ser prometedores. El tiempo de vida media en suero es una característica empírica de una molécula, y debe determinarse experimentalmente para cada nuevo posible medicamento. Por ejemplo, con fármacos polipeptídicos de bajo peso molecular, los mecanismos de eliminación fisiológica como la filtración renal pueden hacer que el mantenimiento de niveles terapéuticos de un fármaco no sea factible debido al coste o la frecuencia del régimen de dosificación requerido. Por el contrario, un largo tiempo de vida media en suero no es conveniente cuando un fármaco o sus metabolitos tienen efectos secundarios tóxicos.
Por lo tanto, existe una necesidad de tecnologías que prolonguen los tiempos de vida media de los polipéptidos terapéuticos a la vez que mantengan su alta eficacia farmacológica. Tales fármacos peptídicos deseados también deben cumplir con los requisitos de mejor estabilidad en suero, alta actividad y una baja probabilidad de inducir una respuesta inmunitaria no deseada cuando se inyecta en un individuo. La presente invención aborda esta necesidad al proporcionar péptidos modificados con CTP que tienen tiempos de vida media prolongados a la vez que mantienen una alta eficacia farmacológica, y a la vez tienen una mayor estabilidad en el suero, alta actividad y baja probabilidad de inducir respuestas inmunitarias no deseadas en un individuo.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un polipéptido modificado con péptido carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica que comprende una hormona de crecimiento (GH), en donde un CTP se une al extremo amino de la hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica se unen en tándem al extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento, que incluye, opcionalmente, un péptido señal unido al amino terminal del CTP, para usar en el mantenimiento de los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) dentro de un intervalo terapéutico normal de ± 2 SDS en un sujeto humano durante seis meses, en donde el sujeto es un niño con deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD), y la hormona de crecimiento modificada con CTP se administra una vez por semana a una dosis de 0,66 mg/kg/semana.
En una modalidad, al menos un CTP está glicosilado. En una modalidad, al menos un CTP está truncado. En una modalidad, al menos un CTP se une a la hormona de crecimiento a través de un enlazador, en donde el enlazador puede ser un enlace peptídico.
En una modalidad, la administración da como resultado un aumento de la velocidad de crecimiento en altura anualizada de al menos aproximadamente 14,37 cm, sobre la base de un análisis intermedio después de 6 meses de tratamiento.
En una modalidad, las dosis posteriores del polipéptido modificado con CTP pueden modificarse a partir de una dosis inicial sobre la base de los niveles de IGF-1 medidos 4 días después de la dosis anterior. En una modalidad, las dosis posteriores del polipéptido modificado con CTP se proporcionan semanalmente.
En una modalidad, los niveles de IGF-1 comprenden los niveles de IGF-1 de las muestras analizadas cuatro días después de la administración del polipéptido modificado con CTP.
En una modalidad, la hormona de crecimiento es una hormona de crecimiento humana (hGH).
En una modalidad, el sujeto es un sujeto virgen.
En una modalidad, la secuencia de al menos un CTP consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 18.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido señal se expone en la SEQ ID NO: 49.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del polipéptido modificado con CTP comprende la secuencia que se expone en los aminoácidos 27-301 de la SEQ ID NO: 39 o los aminoácidos 27-285 de la SEQ ID NO: 40. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del polipéptido modificado con CTP comprende la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 40.
En una modalidad, el polipéptido modificado con CTP está codificado por la secuencia de ácido nucleico que se expone en la SEQ ID NO: 44 o la SEQ ID NO: 45.
En una modalidad, el polipéptido modificado con CTP se administra en un aumento gradual de la dosis a intervalos de dos semanas hasta que se alcanza una dosis de 0,66 mg/kg/semana.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras.
Breve descripción de las figuras
Los siguientes dibujos forman parte del presente documento y se incluyen para demostrar además determinados aspectos de la presente descripción, cuyas invenciones pueden entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en este documento.
La Figura 1 es una transferencia Western que ilustra el peso molecular e identidad de MOD-4020 (SEQ ID NO: 36), MOD-4021 (SEQ ID NO: 37), MOD-4022 (SEQ ID NO: 38), MOD-4023 (SEQ ID NO: 39) y MOD-4024 (SEQ ID NO: 40). Un gel de SDS PAGE se transfirió y se tiñó con el uso de anticuerpos monoclonales anti-hGH. La fotografía indica que al igual que la hGH comercial y natural, las variantes MOD-7020-4 son reconocidas por anticuerpos anti-hGH.
La Figura 2 es un gráfico de barras que ilustra la ganancia de peso de ratas hipofisectomizadas después de la administración de polipéptidos GH-CTP.
La Figura 3 incluye dos esquemas (1) un mapa de un plásmido CTP-hGH-CTP-CTP pCI-dhfr y (2) la fórmula estructural de una proteína de CTP-hGH-CTP-CTP.
La Figura 4 son gráficos que muestran las concentraciones plasmáticas medias de CTP-hGH-CTP-CTP o GH (pg/ml) después de una dosis única i.v. o s.c. de CTP-hGH-CTP-CTP o GH en ratas (n=3-6 por dosis/vía).
La Figura 5 son gráficos que muestran la ganancia de peso gradual promedio después de una dosis única s.c. de CTP-hGH-CTP-CTP (0,4, 0,8 y 4 mg/kg) en ratas hipofisectomizadas en comparación con inyecciones de GH diarias (0,1 mg/kg/Día) (n=10 por dosis).
La Figura 6 es un gráfico que muestra que el área bajo la curva después de una inyección única de CTP-hGH-CTP-CTP se correlaciona con la ganancia de peso corporal en ratas.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la ganancia de peso gradual después de dosis s.c. de CTP-hGH-CTP-CTP (0,4, 0,8 y 4 mg/kg) con 4 días de diferencia en ratas hipofisectomizadas en comparación con inyecciones de GH diarias (0,1 mg/kg/Día) (n=10 por dosis).
La Figura 8 es un gráfico que muestra la concentración sérica de hGH en rata hipofisectomizada después de la inyección SC de CTP-hGH- CTP-CTP y hGH comercial. Se inyectó una dosis única de CTP-hGH-CTP-CTP 0,6 o 1,8 mg/kg y Biotropin 0,35 o 1,05 mg/kg por vía subcutánea a ratas hipofisectomizadas para la determinación del perfil PK/PD. La hGH sérica después de la inyección se midió mediante el uso de kits de ELISA específicos.
La Figura 9 es un gráfico que muestra los niveles de IGF-1 en suero en ratas hipofisectomizadas después de la inyección SC de CTP-hGH-CTP-CTP y hGH comercial. Se inyectó una dosis única de CTP-hGH-CTP-CTP 0,6 o 1,8 mg/kg y Biotropin 0,35 o 1,05 mg/kg por vía subcutánea a ratas hipofisectomizadas para la determinación del perfil PK/PD. El IGF-1 en suero después de la inyección se midió mediante el uso de kits de ELISA específicos (Roche Diagnostics).
La Figura 10 muestra una ilustración del diseño del estudio fase II.
La Figura 11 muestra SDS de IGF-1 después de la 4ta dosis semanal - Todas las cohortes.
La Figura 12 muestra el cambio promedio con respecto al valor inicial en las concentraciones plasmáticas de IGF-1 después de la administración subcutánea de MOD-4023 a adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento (Etapa I; después de la 4ta inyección).
La Figura 13 muestra niveles promedio de IGF-1 (determinados en el día 4 después de la dosificación) durante un estudio de extensión de 4 meses (52 pacientes).
La Figura 14 es una representación esquemática del estudio clínico fase II de MOD-4023.
La Figura 15 es un gráfico que muestra (A); un perfil PK de MOD-4023 semanal promedio, y (B); un perfil PK de hGH diaria promedio.
La Figura 16 es un gráfico que muestra el perfil de SDS de IGF-1 promedio en estudio pediátrico fase II con MOD-4023 durante 6 meses.
La Figura 17 es un gráfico que muestra el perfil de BP-3 de IGF-1 en estudio pediátrico fase 2 con MOD-4023 durante la 2da semana en cada dosis final.
La Figura 18 es un gráfico que muestra el perfil de BP-3 de IGF-1 promedio en estudio pediátrico fase II con MOD-4023 durante 6 meses.
La Figura 19 es un gráfico que muestra los resultados de la velocidad de crecimiento en altura anualizada en 6 meses en estudio pediátrico de HV Fase II con MOD-4023 para todos los pacientes que completaron el tratamiento de 6 m. La Figura 20 es un gráfico que muestra (A); los resultados de SDS de HV del preestudio pediátrico de fase II con MOD-4023 y (B); los resultados de SDS de HV de 6 meses.
La Figura 21 es un gráfico que muestra el perfil PD (de SDS de IGF-1) en estudio pediátrico fase II con MOD-4023 en cada dosis final.
La Figura 22 es un gráfico que muestra la SDS de Aaltura.
La Figura 23 es un gráfico que muestra el cambio de IGF-1 en estudio pediátrico Fase II con MOD-4023 con respecto a los valores iniciales en la dosis final.
La Figura 24 es una tabla que muestra lotes con GMP y sin GMP producidos en citrato 10 mM, NaCl 147 mM a pH 6. La Figura 25A es un gráfico que muestra la estabilidad en RP-HPLC de MOD-4023 clon 2 a -20 °C.
La Figura 25B es un gráfico que muestra la estabilidad en RP-HPLC de MOD-4023 clon 2 a 5 °C.
La Figura 26 es un gráfico que muestra la estabilidad en RP-HPLC de MOD-4023 clon 2 a 25 °C.
La Figura 27A es un gráfico que muestra la estabilidad del clon 28 (Xcellerex) a -20 °C (RP-HPLC).
La Figura 27B es ungráfico que muestra la estabilidad del clon 28 (Xcellerex)a 5 °C (RP-HPLC).
La Figura 28A es ungráfico que muestra estabilidad del clon 28 (Xcellerex) a 25 °C (RP-HPLC).
Figura 28Bes ungráfico que muestra una comparación de los perfiles de estabilidad de los clones 2 y 28 a 5 °C (RP-HPLC).
La Figura 29 es una tabla que muestra la transferencia de la fabricación de MOD-4023 de Xcellerex (XC) a Rentschler (RB).
La Figura 30A es un gráfico que muestra las diferencias en los resultados de estabilidad en RP-HPLC entre Rentschler (RB) y Xcellerex (XCLX) - pico principal.
La Figura 30B es una tabla que muestra los resultados de estabilidad del pico principal de GMP1 (RB).
La Figura 30C es una tabla que muestra los resultados de estabilidad del pico principal de XCLX (evaluado en RB). La Figura 31A es un gráfico que muestra las diferencias en los resultados de estabilidad en RP-HPLC entre Rentschler (RB) y Xcellerex (XCLX) - Pico 3.
La Figura 31B es una tabla que muestra los resultados de estabilidad del pico 3 de GMP1 (RB).
La Figura 31C es una tabla que muestra los resultados de estabilidad del pico 3 de XCLX (evaluado en RB). La Figura 32A es un gráfico que muestra las diferencias en los resultados de estabilidad en RP-HPLC entre Rentschler (RB) y Xcellerex (XCLX) - Pico 5.
La Figura 32B es una tabla que muestra los resultados de estabilidad del pico 5
Figure imgf000005_0001
de GMP1 (RB).
La Figura 32C es una tabla que muestra los resultados de estabilidad del pico 5
Figure imgf000005_0002
(evaluado en RB).
La Figura 33A es un gráfico que muestra los resultados de estabilidad después de 3 meses a 25 °C en RP-HPLC, Lote GMP Xcellerex. El pico 7 no se observó en el material XC.
La Figura 33B es un gráfico que muestra los resultados de estabilidad en RP-HPLC, Lote GMP-1 en Rentschler. El pico 7 que no se observó en el material XC aparece después de 2 semanas a 25 °C.
La Figura 34 es un gráfico que muestra la estabilidad en RP-HPLC GMP-1 después de 3 meses, 25 °C. La flecha señala un nuevo pico (7) que no se observó en el material XC.
La Figura 35A muestra el perfil de IEF de lotes de MOD-4023. Hay un patrón de bandas similar en un intervalo de valor de pl de 3,5 a 4,2 En un lote de XCLX hay menos isoformas poco visibles en el límite alto de pi. En el lote de RB hay más isoformas poco visibles en el límite de pi bajo.
La Figura 35B muestra los resultados de estabilidad (IEF) de RB y XCLX (3 meses a 25 °C). Bandas más difusas en la muestra de XCLX.
Las Figuras 36A-D muestran el efecto de altas temperaturas en el % de picos (clon 2) (Figura 36A, pico principal;
Figura 36D). La formación de ambos picos (3 y 5) depende de la temperatura y se acelera a alta temperatura (Fig. 36B y Fig. 36C)
Las Figuras 37A-D muestran el efecto del pH sobre el % de picos (clon 2) (Figura 37A, pico principal; Figura 37D).
Pico 3: No hubo cambios en el % del pico después de la incubación durante hasta 5 días a pH=4 y hasta 2 h a pH=12 (Figura 37B). Pico 5: No hubo cambios en el % del pico después de la incubación durante hasta 6 h a pH=4. Sin embargo, después de 6 h se observó un aumento brusco en el % del pico. En la incubación a pH 12 hasta 2 h el pico desaparece (Figura 37C).
La Figura 38 muestra estudios de degradación forzada en Rentschler (clon 28). Superposición de los acercamientos de la sustancia farmacológica MOD-4023 nativo (superior) y con estrés (inferior). Se preparó una muestra con estrés de la sustancia farmacológica MOD-4023 (CTP-hGH-CTP-CTP) (65 °C durante aproximadamente tres días) para el análisis de la forma relacionada 5 en la sustancia farmacológica MOD-4023 cuando el pico está por debajo del LOQ para la muestra sin estrés.
La Figura 39 muestra el efecto del pH sobre las formas relacionadas con RP-HPLC. Muestras analizadas: RB - 40 mg/ml, pH=5,9; RB - 10 mg/ml, pH=6,2; XCLX - 40 mg/ml, pH=6,2.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un polipéptido modificado con péptido carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica que comprende una hormona de crecimiento (GH), en donde un CTP se une al extremo amino de la hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica se unen en tándem al extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento, que incluye, opcionalmente, un péptido señal unido al amino terminal del CTP, para usar en el mantenimiento de los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) dentro de un intervalo terapéutico normal de ± 2 SDS en un sujeto humano durante seis meses, en donde el sujeto es un niño con deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD), y la hormona de crecimiento modificada con c Tp se administra una vez por semana a una dosis de 0,66 mg/kg/semana.
En la presente también se describe una formulación farmacéutica que comprende un tampón, un agente de tonicidad y un polipéptido modificado con CTP que consiste en una hormona de crecimiento y un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento.
En la presente también se describe un proceso para producir una formulación farmacéutica para una administración de una vez a la semana a un sujeto que tiene una deficiencia de la hormona de crecimiento, donde el proceso comprende las etapas de:
a. modificar una hormona de crecimiento mediante la unión de un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento;
b. mezclar la hormona de crecimiento modificada en la etapa a. con dicho tampón, y dicho agente de tonicidad a un pH de 6,2-6,4; y,
c. llenar previamente una jeringa con dicha formulación.
En el presente documento se describe, además, un proceso para llenar una jeringa con una formulación proporcionada en la presente descripción que comprende las etapas de a. formular una forma de dosificación para una vez por semana de dicha hormona de crecimiento humana modificada con CTP (hGH) que tiene una cantidad predeterminada de hGH modificada con CTP; y, b. llenar la jeringa con dicha formulación.
La presente solicitud describe polipéptidos de acción prolongada y métodos para producirlos y usarlos. Los polipéptidos de acción prolongada comprenden péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica humana (hCG) que pueden actuar como un protector contra la degradación de proteínas o péptidos derivados de estos, pueden extender los tiempos de vida media en circulación de las proteínas o péptidos derivados de estos, y pueden aumentar la potencia de proteínas o péptidos derivados de estos.
Los términos “péptido CTP”, “péptido carboxilo terminal", “secuencia de CTP" y “péptido C-terminal de la gonadotropina coriónica" se usan indistintamente en la presente descripción. En otra modalidad, el péptido carboxilo terminal es un CTP de longitud completa. En otra modalidad, el péptido carboxilo terminal es un CTP truncado.
Los términos “secuencia señal" y “péptido señal" se usan indistintamente en la presente descripción. En otra modalidad, “secuencia" cuando se usa en referencia a un polinucleótido puede referirse a una porción codificante.
Los términos “péptido de interés" y “secuencia polipeptídica de interés" se usan indistintamente en la presente descripción. En otra modalidad, el péptido de interés es una proteína de longitud completa. En otra modalidad, el péptido de interés es un fragmento de proteína.
En otra modalidad, la invención utiliza una formulación farmacéutica que comprende el polipéptido modificado con CTP. En otra modalidad, la formulación farmacéutica comprende además un tampón y un agente de tonicidad. En otra modalidad, el tampón es citrato 10 mM y el agente de tonicidad es NaCl 147 mM. En una modalidad, la formulación está a un pH de aproximadamente 6,0. En otra modalidad, la formulación está a un pH de aproximadamente 6,2. En otra modalidad, la formulación está a un pH de aproximadamente 6,4. En otra modalidad, la formulación está en un intervalo de pH de 6,0-6,4. En una modalidad, el tampón es citrato 10 mM, el agente de tonicidad es NaCl 147 mM, y el pH es 6,0. En otra modalidad, la formulación es una formulación líquida.
En el presente documento se describe, además, una forma de dosificación semanal que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción.
En otra modalidad, una hormona de crecimiento que comprende un CTP unido a su extremo amino y dos CTP unidos a su extremo carboxilo tiene una actividad biológica in vivo mejorada en comparación con la misma hormona de crecimiento sin CTP.
En una modalidad, el sujeto es masculino. En otra modalidad, el sujeto es femenino. En esta invención, el sujeto es un niño humano deficiente de la hormona de crecimiento previo a la pubertad (GHD). Como se demuestra en la presente, varias dosis de MOD-4023 (CTP-hGH-CTP-CTP) proporcionaron una buena respuesta de crecimiento de recuperación en niños que no han alcanzado la pubertad (ver el Ejemplo 10).
La frase “secuencia polipeptídica de interés" se refiere a una secuencia polipeptídica que comprende una actividad biológica que en esta invención es una hormona de crecimiento (GH). En otra modalidad, el polipéptido es una hormona de crecimiento humana (hGH).
En una modalidad, la configuración de CTP-hormona de crecimiento-CTP-CTP, como se describe en el presente documento, comprende una hormona de crecimiento o un fragmento activo de esta conectado a través de un enlazador a al menos una de las unidades de CTP. En una modalidad, el enlazador es un enlace peptídico. En otra modalidad, la configuración de CTP-hormona de crecimiento-CTP-CTP como se describe en el presente documento comprende una hormona de crecimiento o un fragmento activo de esta conectado mediante un enlace peptídico a al menos una unidad de CTP. En otra modalidad, una CTP-hormona de crecimiento-CTP-CTP como se describe en el presente documento comprende una hormona de crecimiento o un fragmento activo de esta conectado mediante un enlace peptídico a al menos una unidad de CTP que se conecta a una unidad de CTP adicional mediante un enlace peptídico. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido como se describe en el presente documento, que comprende una hormona de crecimiento y/o fragmentos de esta y unidades de CTP y/o fragmentos de estos.
En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia de CTP a la secuencia polipeptídica de interés es un enlace covalente. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia de CTP a la secuencia polipeptídica de interés es un enlace peptídico. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia de CTP a la secuencia polipeptídica de interés es un enlace peptídico sustituido.
En otra modalidad, la secuencia del péptido carboxilo terminal (CTP) comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 48. La SEQ ID NO: 48 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): DPRFQDSSSSKA- PPPSLPSPSRLPGPSDTPILQ (SEQ ID NO: 48).
En otra modalidad, el péptido carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica humana (hCG) se fusiona a una proteína o péptido de la hormona de crecimiento. En una modalidad, la proteína o péptido de esta es una hormona de crecimiento humana.
Como se describe en el presente documento, en algunas modalidades, una secuencia de CTP tanto en el extremo amino terminal de un polipéptido como en el extremo carboxilo terminal del polipéptido proporciona una mejor protección contra la degradación de una proteína. En algunas modalidades, las secuencias de CTP tanto en el extremo amino terminal de un polipéptido como en el extremo carboxilo terminal del polipéptido proporcionan una prolongación de la vida media a la proteína unida.
Como se describe en la presente, en algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal del polipéptido, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo carboxilo proporciona una mejor protección contra la degradación de una proteína. En algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal del polipéptido, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo carboxilo proporciona una prolongación de la vida media a la proteína unida. En algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal del polipéptido, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo carboxilo proporciona una mejor actividad de la proteína unida.
Como se describe en la presente, en algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal del polipéptido, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo amino terminal proporciona una mejor protección contra la degradación de la proteína unida. En algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal del polipéptido, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo amino proporciona una prolongación de la vida media a la proteína unida. En algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal del polipéptido, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo amino terminal proporcionan una mejor actividad de la proteína unida.
Como se describe en la presente, en algunas modalidades, las secuencias de CTP tanto en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento como en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento proporcionan una mejor protección contra la degradación de una hormona de crecimiento. En otra modalidad, al menos una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos unidades de CTP en el extremo carboxilo terminal de una hormona de crecimiento proporcionan una mejor protección contra la eliminación. En otra modalidad, al menos una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos unidades de CTP en el extremo carboxilo terminal de una hormona de crecimiento proporcionan una prolongación del tiempo de eliminación. En otra modalidad, al menos una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos unidades de CTP en el extremo carboxilo terminal de una hormona de crecimiento mejoran la Cmáx de una hormona de crecimiento. En otra modalidad, al menos una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos unidades de CTP en el extremo carboxilo terminal de una hormona de crecimiento mejoran el Tmáx de una hormona de crecimiento. En otra modalidad, al menos una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos unidades de CTP en el extremo carboxilo terminal de una hormona de crecimiento mejoran el T1/2.
Como se describe en la presente, en algunas modalidades, las secuencias de CTP tanto en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento como en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento prolongan el tiempo de vida media de la hormona de crecimiento modificada. En otra modalidad, al menos una única secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y al menos dos secuencias de CTP en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento proporcionan una prolongación de la vida media de la hormona de crecimiento modificada. En otra modalidad, una única secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos secuencias de CTP en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento proporcionan una prolongación de la vida media de la hormona de crecimiento unida. Como se utiliza en esta invención, una única secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento y dos secuencias de CTP en tándem en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento proporcionan una prolongación de la vida media de la hormona de crecimiento modificada.
Tal como se describe en la presente, en algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de un polipéptido, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo carboxilo proporciona una mejor protección contra la degradación a una hormona de crecimiento. En algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo carboxilo, extiende el tiempo de vida media de la hormona de crecimiento. En algunas modalidades, una secuencia de CTP en el extremo amino terminal de una hormona de crecimiento, una secuencia de CTP en el extremo carboxilo terminal de la hormona de crecimiento, y al menos una secuencia de CTP adicional unida en tándem a la secuencia de CTP en el extremo carboxilo mejora la actividad biológica de la hormona de crecimiento.
En una modalidad, la secuencia de al menos un CTP consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, el péptido carboxilo terminal (CTP) comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 112 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la SEQ ID NO: 17. En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 118 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, la secuencia de CTP también comienza desde cualquier posición entre las posiciones 112-118 y termina en la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana. En algunas modalidades, el péptido con secuencia de CTP tiene 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 aminoácidos de longitud y comienza en la posición 112, 113, 114, 115, 116, 117 o 118 de la secuencia de aminoácidos de CTP.
En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1-5 sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,712,122. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1 sustitución de aminoácidos conservadora. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 2 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 3 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 4 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 70 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 90 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 95 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta.
En otra modalidad, la secuencia de ADN del péptido CTP es al menos 70 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo. En otra modalidad, la secuencia de ADN del péptido CTP es al menos 80 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo. En otra modalidad, la secuencia de ADN del péptido CTP es al menos 90 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo. En otra modalidad, la secuencia de ADN del péptido CTP es al menos 95 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica está truncada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En otra modalidad, todas las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 11 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 12 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 13 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 14 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 15 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 16 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En una modalidad, el CTP truncado comprende los últimos 14 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica está glicosilada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica están glicosiladas. En otra modalidad, todas las secuencias de aminoácidos de CTP de gonadotropina coriónica están glicosiladas. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende al menos un sitio de glicosilación. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende 2 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende 3 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende 4 sitios de glicosilación.
En algunas modalidades, “homología” como se usa en la presente descripción, abarca, además, deleciones, inserciones, o variantes por sustitución, que incluyen una sustitución de aminoácidos de estos, y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de estos.
En algunas modalidades, la hormona de crecimiento humana (hGH) se utiliza de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. En algunas modalidades, la unión de la secuencia de CTP tanto a los extremos amino como carboxilo de la proteína hGH da como resultado un aumento de la potencia (Figuras 2, 3, 5, 7 y 9). En algunas modalidades, la unión de la secuencia de CTP tanto a los extremos amino como carboxilo de la proteína hGH da como resultado una actividad in vivo prolongada. En una modalidad, los polipéptidos CTP-hGH utilizados en la presente invención se exponen en la SEQ ID NO: 39 y 40.
Como se proporciona en la presente descripción, la ganancia de crecimiento se demostró en ratas hipofisectomizadas (que no tienen secreción de hormona de crecimiento) después de las inyecciones de CTP-hGH. Como se proporciona adicionalmente en la presente descripción, la ganancia de crecimiento con una excelente correlación con el crecimiento de recuperación de los pacientes se demostró en niños con deficiencia de la hormona de crecimiento previo a la pubertad (ver el Ejemplo 10, en la presente descripción).
En la presente también se describe un método para lograr la recuperación de crecimiento normal de un niño deficiente de la hormona de crecimiento previo a la pubertad, donde el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una hormona de crecimiento modificada con CTP proporcionada en la presente. También se describe en la presente un método para lograr la recuperación de crecimiento de un niño deficiente de la hormona de crecimiento previo a la pubertad, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una hormona de crecimiento modificada con CTP proporcionada en la presente.
En una modalidad, la frase “hormona de crecimiento humana” (hGH) se refiere a un polipéptido, tal como se expone en el núm. de registro del GenBank P01241 (SEQ ID NO: 47), que presenta actividad hGH (es decir, estimulación del crecimiento).
En otra modalidad, “hormona de crecimiento humana” (hGH) se refiere a un polipéptido, como se expone en el núm. de registro del GenBank P01241, que presenta actividad hGH (es decir, estimulación del crecimiento). En otra modalidad, “GH” se refiere además a homólogos. En otra modalidad, una secuencia de aminoácidos de GH para usar en la presente invención es al menos 50 % homóloga a una secuencia de GH establecida en la presente descripción como se determina mediante el uso del programa informático BlastP del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con el uso de parámetros predeterminados. En otra modalidad, el porcentaje de homología es 60 %. En otra modalidad, el porcentaje de homología es 70 %. En otra modalidad, el porcentaje de homología es 80 %. En otra modalidad, el porcentaje de homología es 90 %. En otra modalidad, el porcentaje de homología es al menos 95 %. En otra modalidad, el porcentaje de homología es mayor que 95 %.
Los polipéptidos CTP-GH ilustrativos y los polipéptidos CTP-hGH utilizados en la presente invención se exponen en la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 40.
Como se describe en la presente, un péptido GH que tiene adicionalmente un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C-terminal puede ser para usar en la estimulación del crecimiento muscular.
En la presente también se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GH que tiene adicionalmente un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C-terminal para estimular el crecimiento muscular. En otra modalidad, los métodos de la presente descripción proporcionan un ácido nucleico de SEQ ID NO: 45 que codifica un péptido GH que comprende un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C-terminal para estimular el crecimiento muscular.
En una modalidad, administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste en un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho CTP, reduce de esta manera la frecuencia de dosificación de la hormona de crecimiento en el sujeto.
En otra modalidad, administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste en un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho un CTP, mejora de esta manera el área bajo la curva (AUC) de la hormona de crecimiento en el sujeto.
Como se describe en el presente documento, una formulación que comprende un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste de un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho un CTP, tiene mayor estabilidad. En una modalidad, la formulación es estable durante al menos un año. En otra modalidad, la formulación es estable durante al menos dos años.
En una modalidad, la presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que necesita terapia con GH, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino terminal de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste en un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho un CTP, para reducir de esta manera la frecuencia de dosificación de una hormona de crecimiento en un sujeto.
En otra modalidad, administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste en un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho un CTP, aumenta de esta manera los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) en el sujeto.
En otra modalidad, administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste en un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho un CTP, mantiene de esta manera los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) en el sujeto. En otra modalidad, los niveles de IGF-1 se mantienen en un intervalo definido, como se proporciona adicionalmente en la presente descripción.
En otra modalidad, administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que consiste en una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, y en donde dicho polipéptido opcionalmente consiste en un péptido señal unido al extremo amino terminal de dicho un CTP, aumenta y mantiene de esta manera los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) dentro de un intervalo definido en el sujeto.
En otra modalidad, el intervalo definido es un intervalo de dosis terapéutica que se logra mediante la administración de una hormona de crecimiento modificada con CTP proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, el intervalo definido es uno en el que la Cmáx y la Cvalle del comportamiento sinusoidal de IGF-1 se mantienen después de administraciones consecutivas de una hormona de crecimiento modificada con CTP como se proporciona adicionalmente en la presente descripción (ver el Ejemplo 9). En otra modalidad, el intervalo definido es un intervalo de dosis terapéutica para administrar consecutivamente una hormona de crecimiento modificada con CTP proporcionada en la presente con una capacidad de respuesta excelente en un sujeto y con una necesidad mínima de modificación de la dosis. En otra modalidad, el intervalo definido es comparable al intervalo de los niveles de IGF-1 en individuos que se consideran normales. En otra modalidad, el intervalo definido es el intervalo normal de los niveles/valores de IGF-1 en individuos normales. En esta invención, el intervalo definido está dentro del intervalo normal cuando los valores de SDS de IGF-1 están dentro de ±2 SDS.
Se describe que los péptidos GH modificados con CTP descritos en la presente pueden ser para usar en la estimulación del crecimiento óseo.
Se describe además que una secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos GH modificados con CTP descritos en la presente puede ser para usar en la estimulación del crecimiento óseo.
En otra modalidad, las hormonas de crecimiento conjugadas de esta invención se usan de la misma manera que las hormonas de crecimiento no modificadas. En otra modalidad, las hormonas de crecimiento conjugadas de esta invención tienen un aumento en el tiempo de vida media en circulación y el tiempo de residencia en plasma, disminución de la eliminación, y aumento de la actividad clínica in vivo. En otra modalidad, debido a las propiedades mejoradas de las hormonas de crecimiento conjugadas como se describe en el presente documento, estos conjugados se administran con menos frecuencia que las hormonas de crecimiento no modificadas. En otra modalidad, las hormonas de crecimiento conjugadas como se describe en el presente documento, se administran una vez por semana. En otra modalidad, la disminución de la frecuencia de administración resultará en un mejor cumplimiento por parte del paciente, lo que lleva a mejores resultados del tratamiento, así como también mejor calidad de vida del paciente. En otra modalidad, en comparación con los conjugados convencionales de hormonas de crecimiento unidas a polietilenglicol), se ha descubierto que los conjugados de CTP con hormonas de crecimiento que tienen el peso molecular y la estructura del enlazador de los conjugados de esta invención tienen una potencia mejorada, estabilidad mejorada, niveles elevados de AUC, mayor vida media en circulación. En otra modalidad, en comparación con los conjugados convencionales de hormonas de crecimiento unidas a polietilenglicol), se ha descubierto que las hormonas de crecimiento que tienen el peso molecular y la estructura del enlazador de los conjugados de esta invención tienen una potencia mejorada, estabilidad mejorada, niveles elevados de AUC, mayor vida media en circulación. En otra modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de una hormona de crecimiento conjugada es la cantidad de conjugado que se necesita para la actividad biológica esperada que se puede medir in vivo. En otra modalidad, una hormona de crecimiento utilizada de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención muestra mayor potencia. En algunas modalidades, la unión de una secuencia de CTP tanto a los extremos amino como carboxilo de una hormona de crecimiento da como resultado una actividad in vivo prolongada.
En otra modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de una hormona de crecimiento conjugada se determina de acuerdo con factores como el tipo exacto de afección que se trata, la afección del paciente que se trata, así como los otros ingredientes en la composición. En esta invención, una cantidad con eficacia terapéutica de una hormona de crecimiento conjugada es de 0,66 mg por kg de peso corporal administrada una vez por semana. En otra modalidad, una composición farmacéutica que comprende una hormona de crecimiento conjugada se formula con una resistencia eficaz para la administración por varios medios a un paciente humano.
En otra modalidad, la hormona de crecimiento es cualquier hormona de crecimiento conocida por un experto en la técnica. En otra modalidad, la hormona de crecimiento es una hormona de crecimiento humana. En otra modalidad, la hormona de crecimiento es una hormona de crecimiento no humana. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos y/o la secuencia de aminoácidos de una hormona de crecimiento están disponibles en una base de datos de un banco de genes. En otra modalidad, la hormona de crecimiento es un homólogo. En otra modalidad, un homólogo se refiere además a una variante por deleción, inserción, o sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos de estos y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de estos.
En otra modalidad, la hormona de crecimiento es una variante de hGH con ausencia de los exones 2, 3, 4, o cualquier combinación de estos. En otra modalidad, la hormona de crecimiento comprende un péptido señal. En otra modalidad, la hormona de crecimiento comprende un sitio de escisión señal. En otra modalidad, los polipéptidos que comprenden GH modificada por los CTP para su uso en la presente invención comprenden GH recombinante.
Se describe que el péptido GH modificado con CTP utilizado en la presente invención actúa mediante el mantenimiento de la calidad muscular.
Se describe además que la GH modificada con CTP que se utiliza en la presente invención puede mantener la calidad ósea.
Se describe además que los péptidos GH modificados con CTP descritos en el presente documento pueden usarse en el \tratamiento de una enfermedad de desgaste.
Se describe además que los péptidos GH modificados con CTP descritos en el presente documento pueden usarse para aumentar la función cardiaca.
Se describe además que los péptidos GH modificados con CTP descritos en la presente pueden usarse en el aumento de la lipolisis.
Se describe además que los péptidos GH modificados con CTP descritos en el presente documento pueden usarse para mejorar el equilibrio de fluidos.
En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro AAA72260. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro AAK69708. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro CAA01435. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro CAA01329. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro CAA00380. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro AAA72555. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro NP_000506.2. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro NP_072053.1. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro NP_072054.1. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro NP_072055.1. En otra modalidad, una hormona de crecimiento de la invención comprende la secuencia de aminoácidos depositada en el banco de genes con el núm. de registro NP_072056.1.
Se describe además que el péptido GH modificado con CTP utilizado en la presente invención puede mejorar la capacidad de ejercicio.
Se describe además que un péptido GH que tiene adicionalmente un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C terminal puede mejorar la función pulmonar.
Se describe además que un péptido GH que tiene adicionalmente un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C terminal puede mejorar.
Se describe además que un péptido GH que tiene adicionalmente un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C terminal puede ser para el recultivo de órganos vitales.
También se describe que un péptido GH como se utiliza en la presente invención puede aumentar el sentido de bienestar.
Se describe además que un péptido GH que tiene adicionalmente un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y dos péptidos aminoacídicos CTP en el extremo C-terminal puede restaurar el sueño REM.
Se describe, además, que una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende hGH modificada por CTP puede ser para estimular el crecimiento muscular, aumentar la función cardiaca, estimular el crecimiento óseo, mantener la integridad muscular, equilibrar el metabolismo muscular, inducir el desarrollo muscular, inducir el desarrollo muscular de novo, mejorar la carga ósea, tratar síntomas asociados con la osteoporosis, tratar una enfermedad de desgaste, aumentar la lipolisis, mejorar el equilibrio de líquidos, tratar la osteoporosis, mejorar la función pulmonar, mejorar la inmunidad, recultivar un órgano vital, aumentar el sentido de bienestar, restaurar el sueño REM, o cualquier combinación de estos.
En algunas modalidades, “homología” abarca, además, deleciones, inserciones, o variantes por sustitución, que incluyen una sustitución de aminoácidos, de estos y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de estos. En una modalidad la variante por sustitución es una en la que la glutamina en posición 65 de hGH se sustituye por una valina [Gellerfors y otros, J Pharm Biomed Anal 1989, 7:173-83].
En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento como se describe en la presente codifica cualquier secuencia de aminoácidos de una hormona de crecimiento conocida por un experto en la técnica. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento como se describe en la presente codifica una hGH. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento comprende la secuencia de ácido nucleico depositada en el banco de genes con núm. de acceso NM_000515.3. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento comprende la secuencia de ácido nucleico depositada en el banco de genes con núm. de acceso NM_022559.2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento comprende la secuencia de ácido nucleico depositada en el banco de genes con núm. de acceso NM_022560.2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento comprende la secuencia de ácido nucleico depositada en el banco de genes con núm. de acceso NM_022561.2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una hormona de crecimiento comprende la secuencia de ácido nucleico depositada en el banco de genes con núm. de acceso NM_022562.2.
En una modalidad, el homólogo se refiere además a una variante por deleción, inserción, o sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos, de estos y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de estos.
En otra modalidad la secuencia polipeptídica de interés es una hGH. En otra modalidad la secuencia polipeptídica de interés es un péptido o una proteína que incluye cualquier forma modificada.
Se describe que la hGH que tiene adicionalmente al menos un péptido aminoacídico CTP en el extremo N-terminal y al menos un péptido aminoacídico CTP en el extremo C terminal puede ser para el tratamiento de una enfermedad de desgaste, SIDA, caquexia, o deficiencia de hGH.
En algunas modalidades, la modificación de las secuencias de CTP es ventajosa para permitir el uso de dosis más bajas.
En algunas modalidades, “polipéptido” como se usa en la presente descripción, abarca polipéptidos nativos (ya sea productos de degradación, polipéptidos sintetizados sintéticamente o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, polipéptidos sintéticos), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de polipéptidos, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que hacen que los polipéptidos sean incluso más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células.
En algunas modalidades, las modificaciones incluyen, pero sin limitarse a modificación del extremo N terminal, modificación del extremo C terminal, modificación de enlaces polipeptídicos, que incluyen, pero sin limitarse a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal, y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). A continuación se proporcionan más detalles.
En algunas modalidades, se sustituyen enlaces polipeptídicos (-CO-NH-) dentro del polipéptido. En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de cetometileno (-CO-CH2-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de tioamida (-CS-NH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de retro amida (-NH-CO-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por derivados de polipéptidos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral “normal”, que se presenta naturalmente en el átomo de carbono. En algunas modalidades, estas modificaciones se producen en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena polipeptídica e incluso en varios (2-3 enlaces) al mismo tiempo.
En algunas modalidades, los aminoácidos aromáticos naturales del polipéptido tal como Trp, Tyr y Phe, se sustituyen por ácido sintético no natural tal como fenilglicina, TIC, naftilelanina (Nol), derivados de Phe metilados en el anillo, derivados halogenados de Phe o-metil-Tyr. En algunas modalidades, los polipéptidos incluyen uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo, ácido graso, carbohidratos complejos, etc.).
En una modalidad, se entiende que “aminoácido” o “aminoácido” incluyen los 20 aminoácidos naturales; los aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero sin limitarse a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina. En una modalidad, “aminoácido” incluye D- y L-aminoácido.
En algunas modalidades, los polipéptidos se utilizan en productos terapéuticos que requieren que los polipéptidos estén en forma soluble. En algunas modalidades, los polipéptidos incluyen uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, que incluyen pero no se limitan a serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del polipéptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.
En algunas modalidades, los polipéptidos se utilizan en una forma lineal, aunque un experto en la técnica apreciará que en los casos en que la ciclización no interfiere gravemente con las características del polipéptido, también pueden utilizarse formas cíclicas del polipéptido.
En algunas modalidades, los polipéptidos se sintetizan bioquímicamente tal como mediante el uso de técnicas estándar en fase sólida. En algunas modalidades, estos métodos bioquímicos incluyen síntesis en fase sólida exclusiva, síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos, o síntesis clásica en solución. En algunas modalidades, estos métodos se usan cuando el polipéptido es relativamente corto (aproximadamente 5-15 kDa) y/o cuando no se puede producir mediante técnicas recombinantes (es decir, no codificado por una secuencia de ácido nucleico) y por lo tanto implica un proceso químico diferente.
Los procedimientos de síntesis de polipéptidos en fase sólida son conocidos por un experto en la técnica y se describen adicionalmente por John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Synthtesis (2da Ed., Pierce Chemical Company, 1984). En algunas modalidades, los polipéptidos sintéticos se purifican mediante cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.]y la composición de la cual puede confirmarse mediante secuenciación de aminoácidos por métodos conocidos por un experto en la técnica.
En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para generar los polipéptidos para su uso en la presente invención. En algunas modalidades, las técnicas de proteína recombinante se usan para la generación de polipéptidos relativamente largos (por ejemplo, más de 18-25 aminoácidos). En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para la generación de grandes cantidades del polipéptido. Las técnicas recombinantes se describen por Bitter y otros, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier y otros (1990) Methods in Enzymol.
185:60-89, Brisson y otros (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y otros (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi y otros (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli y otros (1984) Science 224:838-843, Gurley y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp.421­ 463.
En una modalidad, un polipéptido para usar en la presente invención se sintetiza mediante el uso de un polinucleótido que codifica el polipéptido. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica el polipéptido se liga a un vector de expresión, que comprende un control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (por ejemplo, una secuencia promotora). En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión constitutiva del polipéptido. En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión del polipéptido de manera específica en un tejido. En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión inducible del polipéptido.
En algunas modalidades, los polinucleótidos que expresan los polipéptidos para usar en la presente invención son como se expone en las SEQ ID NO: 44 y 45.
En algunas modalidades, los promotores adecuados específicos de tejidos incluyen secuencias que son funcionales en una población celular específica, por ejemplo promotores tales como el de albúmina que es específico del hígado [Pinkert y otros (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotores específicos de tejidos linfoides [Calame y otros (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; en promotores particulares de receptores de células T [Winoto y otros (1989) EMBO J. 8:729-733]e inmunoglobulinas; [Banerji y otros (1983) Cell 33729-740], promotores específicos de neuronas como el promotor de neurofilamentos [Byrne y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], promotores específicos de páncreas [Edlunch y otros (1985) Science 230:912-916]o promotores específicos de glándulas mamarias como el promotor del suero de leche (patente de Estados Unidos núm. 4,873,316 y publicación de solicitud europea núm.
264,166). Los promotores inducibles incluyen por ejemplo el promotor inducible por tetraciclina (Srour, M.A., y otros, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
En una modalidad, la frase “un polinucleótido” se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o una secuencia de polinucleótidos compuesta (por ejemplo, una combinación de los anteriores).
En una modalidad, “secuencia de polinucleótidos complementaria” se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa de un ARN mensajero mediante el uso de una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. En una modalidad, la secuencia puede amplificarse posteriormente in vivo o in vitro mediante el uso de una ADN polimerasa.
En una modalidad, “secuencia de polinucleótidos genómica” se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porción contigua de un cromosoma.
En una modalidad, “secuencia de polinucleótidos compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. En una modalidad, una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias de exones necesarias para codificar el polipéptido, así como también algunas secuencias intrónicas que se interponen entre ellas. En una modalidad, las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, que incluye otros genes, e incluirán típicamente secuencias señales de empalme conservadas. En una modalidad, las secuencias intrónicas incluyen elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
En una modalidad, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos para su uso en la presente invención comprenden además una secuencia señal que codifica un péptido señal para la secreción de los polipéptidos. En algunas modalidades, las secuencias señales incluyen la secuencia señal endógena para EPO como se expone en la SEQ ID NO: 19 o la secuencia señal endógena para IFN-pi como se expone en la SEQ ID NO: 26. En otra modalidad, la secuencia señal es N-terminal respecto de la secuencia de CTP que a su vez es N-terminal con respecto a la secuencia polipeptídica de interés; por ejemplo, la secuencia es (a) secuencia señal (b) CTP (c) secuencia de interés (d) opcionalmente 1 o más secuencias de CTP adicionales. En otra modalidad, 1 o más secuencias de CTP se insertan entre la secuencia señal de una secuencia polipeptídica de interés y la secuencia polipeptídica de interés en sí misma, lo que interrumpe así la secuencia de interés natural.
En otra modalidad, la hormona de crecimiento comprende además un péptido señal. En algunas modalidades, las secuencias señales incluyen, pero no se limitan a la secuencia señal endógena. En algunas modalidades, las secuencias señales incluyen, pero no se limitan a la secuencia señal endógena de cualquier hormona(s) de crecimiento conocida(s). En otra modalidad, los polipéptidos para usar en la presente invención proporcionan una hormona de crecimiento que tiene adicionalmente un péptido señal que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 49).
En una modalidad, después de la expresión y secreción, los péptidos señal se escinden de las proteínas precursoras, lo que da como resultado las proteínas maduras.
En algunas modalidades, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos para usar en la presente invención se preparan mediante el uso de técnicas de PCR con procedimientos y métodos conocidos por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento implica la ligación de dos secuencias de ADN diferentes (ver, por ejemplo, “Current Protocols in Molecular Biology”, eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons, 1992).
En una modalidad, los polinucleótidos se insertan en vectores de expresión (es decir, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión del polipéptido recombinante. En una modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas. En una modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en eucariotas. En una modalidad, el vector de expresión incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas y eucariotas. En algunas modalidades, los vectores de clonación comprenden secuencias de inicio de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).
En una modalidad, una variedad de células procariotas o eucariotas pueden usarse como sistemas de expresión en huésped para expresar los polipéptidos para su uso en la presente invención. En algunas modalidades, estos incluyen, pero sin limitarse a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN de cósmidos que contienen la secuencia codificante del polipéptido; levaduras transformadas con vectores de expresión en levaduras recombinantes que contienen la secuencia codificante del polipéptido; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, tales como el plásmido Ti, que contiene la secuencia codificante del polipéptido.
En algunas modalidades, se usan sistemas de expresión no bacterianos (por ejemplo, sistemas de expresión en mamíferos como las células CHO) para expresar el polipéptido para su uso en la presente invención. En una modalidad, el vector de expresión usado para expresar polinucleótidos en células de mamíferos es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gen de resistencia a neomicina. La construcción del vector pCI-dhfr se describe, de acuerdo con una modalidad, en el Ejemplo 1 y la Figura 3.
En algunas modalidades, en sistemas bacterianos, un conjunto de vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente según el uso previsto para el polipéptido expresado. En una modalidad, se desean grandes cantidades de polipéptido. En una modalidad, se desean vectores que dirigen la expresión de altos niveles del producto proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia señal hidrófoba, que dirige el producto expresado al periplasma de las bacterias o al medio de cultivo donde el producto proteico se purifica fácilmente. En una modalidad, determinada proteína de fusión se modifica genéticamente con un sitio de escisión específico para ayudar en la recuperación del polipéptido. En una modalidad, los vectores adaptables a tal manipulación incluyen, pero sin limitarse a, la serie de pET de vectores de expresión de E. coli [Studier y otros, Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
En una modalidad, se usan sistemas de expresión en levaduras. En una modalidad, una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles pueden usarse en levaduras como se describe en la patente de Estados Unidos núm: 5,932,447. En otra modalidad, se usan vectores que promueven la integración de secuencias de ADN extrañas en el cromosoma de levadura.
En una modalidad, el vector de expresión puede incluir, además, secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un solo ARNm tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotor-polipéptido quimérico.
En algunas modalidades, los vectores de expresión en mamíferos incluyen, pero sin limitarse a, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, comercializados por Invitrogen, pCI comercializado por Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV comercializados por Stratagene, pTRES comercializado por Clontech, y sus derivados.
En algunas modalidades, se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En algunas modalidades, los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1 MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p205. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus de sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores que demuestran eficacia para la expresión en células eucariotas.
En algunas modalidades, los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de los polipéptidos ya que ofrecen ventajas como infección lateral y especificidad de direccionamiento. En una modalidad, la infección lateral es inherente en el ciclo de vida de, por ejemplo, retrovirus y es el proceso mediante el cual una célula infectada individual produce muchos viriones de progenie que brotan e infectan las células vecinas. En una modalidad, el resultado es que un área grande se infecta rápidamente, la mayoría de la cual no se infectó inicialmente por las partículas virales originales. En una modalidad, se producen vectores virales que no pueden propagarse lateralmente. En una modalidad, esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico en solo un número localizado de células objetivo.
En una modalidad, pueden usarse varios métodos para introducir el vector de expresión en las células. Tales métodos se describen generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Michigan (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véanse las patentes de Estados Unidos núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
En algunas modalidades, la introducción de ácido nucleico por infección viral ofrece varias ventajas con respecto a otros métodos tales como la lipofección y electroporación, ya que puede obtenerse una mayor eficacia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
En una modalidad de la descripción, se apreciará que los polipéptidos pueden expresarse, además, a partir de una construcción de ácido nucleico administrada al individuo mediante el empleo de cualquier modo de administración adecuado, descrito anteriormente (es decir, terapia génica in vivo). En una modalidad, la construcción de ácido nucleico se introduce en una célula adecuada a través de un vehículo/método de administración de genes adecuado (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión según sea necesario y después las células modificadas se expanden en cultivo y se regresan al individuo (es decir, terapia génica ex-vivo).
En una modalidad, se usan vectores de expresión vegetal. En una modalidad, la expresión de una secuencia codificante del polipéptido está dirigida por una serie de promotores. En algunas modalidades, se usan promotores virales como los promotores de 35S a Rn y 19S ARN de CaMV [Brisson y otros, Nature 310:511-514 (1984)], o el promotor de la proteína de recubrimiento para TMV [Takamatsu y otros, EMBO J. 6:307-311 (1987)]. En otra modalidad, se usan promotores vegetales como, por ejemplo, la pequeña subunidad de RUBISCO [Coruzzi y otros, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); y Brogli y otros, Science 224:838-843 (1984)]o promotores de choque térmico, por ejemplo, de soja hsp17.5-E orhsp17.3-B [Gurley y otros, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. En una modalidad, las construcciones se introducen en células vegetales mediante el uso de plásmido Ti, plásmido Ri, vectores virales vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación y otras técnicas conocidas por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Weissbach y Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463 (1988)]. También pueden usarse otros sistemas de expresión tales como sistemas de células huésped de insectos y de mamíferos, que se conocen bien en la técnica.
Se apreciará que además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido), la construcción de expresión puede incluir además secuencias modificadas para optimizar la estabilidad, la producción, la purificación, el rendimiento o la actividad del polipéptido expresado.
En algunas modalidades, pueden usarse varios métodos para introducir el vector de expresión en el sistema de células huésped. En algunas modalidades, tales métodos se describen generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Michigan (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véanse las patentes de Estados Unidos núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
En algunas modalidades, las células transformadas se cultivan en condiciones eficaces, que permitan la expresión de grandes cantidades del polipéptido recombinante. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero sin limitarse a, medios eficaces, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir el polipéptido recombinante. En algunas modalidades, un medio incluye típicamente una solución acuosa que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. En algunas modalidades, las células pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. En algunas modalidades, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
En algunas modalidades, en dependencia del vector y el sistema de huésped usados para la producción, los polipéptidos resultantes permanecen dentro de la célula recombinante, se secretan hacia el medio de fermentación, se secretan hacia un espacio entre dos membranas celulares, como el espacio periplasmático en E. coli; o son retenidos en la superficie externa de una célula o membrana viral.
En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación del polipéptido recombinante.
En una modalidad, la frase “recuperar el polipéptido recombinante” que se usa en la presente descripción se refiere a recolectar todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación.
En una modalidad, los polipéptidos para usar en la presente invención se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede modificarse genéticamente para codificar el polipéptido y un resto escindible fusionado. En una modalidad, una proteína de fusión puede diseñarse de manera que el polipéptido pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una modalidad, un sitio de escisión se modifica genéticamente entre el polipéptido y la porción escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente adecuado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, ver Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
En una modalidad, el polipéptido para su uso en la presente invención se recupera en forma “sustancialmente pura”.
En una modalidad, la frase “sustancialmente puro” se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína en las aplicaciones descritas en el presente documento.
En una modalidad, el polipéptido para su uso en la presente invención puede sintetizarse, además, mediante el uso de sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.
En algunas modalidades, los polipéptidos recombinantes se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede analizarse in vivo o in vitro. En una modalidad, se lleva a cabo la producción de GH modificada por CTP mediante el uso de tecnología de ADN recombinante.
En algunas modalidades, los polipéptidos recombinantes se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede analizarse ya sea in vivo o in vitro. En una modalidad, las actividades de unión de la GH recombinante modificada por CTP pueden determinarse mediante el uso de diversos ensayos.
La presente invención utiliza polipéptidos CTP-GH-CTP-CTP. En una modalidad, los métodos de tecnología de ADN recombinante se usan para la producción de polipéptidos CTP-GH-CTP-CTP, como se ilustra en el Ejemplo 1 y la Figura 1. En una modalidad, la eficacia terapéutica de los polipéptidos CTP-GH-CTP-CTP se analiza in vivo. En una modalidad, la eficacia terapéutica de los polipéptidos CTP-GH-CTP-CTP se analiza in vitro. En una modalidad, las actividades de unión de los polipéptidos GH recombinantes se miden mediante el uso de Nb2 (una línea celular de linfoma de rata dependiente de prolactina (ECACC Cell Bank)) o una línea celular murina FCD-P1, transfectadas previamente con el receptor de la hormona de crecimiento humana. En una modalidad, la unión de GH a estos receptores induce la proliferación celular que en una modalidad se mide por los niveles de tinción celular con MTT como una función de la actividad de GH. En una modalidad, la actividad in vivo se deduce mediante la medición de la ganancia de peso en el tiempo en animales con deficiencia de la hormona de crecimiento que recibieron tratamiento.
En una modalidad, la administración al sujeto de una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que comprende una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido a un extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos a un extremo carboxilo de la hormona de crecimiento, induce de esta manera el crecimiento o la ganancia de peso en un sujeto.
Se describe que la presente invención puede actuar mediante la disminución de los depósitos de grasa en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención puede actuar al aumentar la masa muscular en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención puede actuar al promover el crecimiento muscular en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención puede actuar mediante el aumento de la relación entre músculo y grasa. En otra modalidad, la presente invención puede actuar mediante la disminución del índice de masa corporal (BMI) o el índice de Quetelet.
En otra modalidad, el crecimiento se mide por ganancia de peso. En otra modalidad, el crecimiento se mide por ganancia de altura. En otra modalidad, el crecimiento se mide por ganancia de masa muscular. En otra modalidad, el crecimiento se mide por ganancia de masa ósea. En otra modalidad, la ganancia de peso se debe a la ganancia de masa ósea y/o muscular. En otra modalidad, el crecimiento se mide mediante cualquier medida conocida por un experto en la técnica.
Como se describe en la presente, los polipéptidos de la hormona de crecimiento humana de la presente descripción pueden usarse para tratar a un sujeto, con afecciones relacionadas con el crecimiento y el peso, tales como un trastorno con deficiencia del crecimiento, desgaste por SIDA, envejecimiento, alteración de la función inmunitaria de individuos infectados por VIH, una enfermedad catabólica, recuperación de una cirugía, una cardiomiopatía congestiva, trasplante de hígado, regeneración hepática después de una hepatectomía, insuficiencia renal crónica, osteodistrofia renal, osteoporosis, acondroplasia/hipocondroplasia, displasia esquelética, un trastorno inflamatorio o nutricional crónico como la enfermedad de Crohn, síndrome del intestino corto, artritis crónica juvenil, fibrosis quística, infertilidad masculina, raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, síndrome de Down, espina bífida, síndrome de Noonan, obesidad, alteración de la resistencia muscular y fibromialgia.
En una modalidad, los polipéptidos utilizados en la presente invención pueden proporcionarse al individuo per se. En una modalidad, los polipéptidos utilizados en la presente invención pueden proporcionarse al individuo como parte de una composición farmacéutica donde se mezclan con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En una modalidad, el término “ingrediente activo” se refiere a la secuencia polipeptídica de interés, que es responsable del efecto biológico.
En una modalidad, la composición farmacéutica para su uso en la presente invención puede proporcionarse como preparaciones combinadas. En una modalidad, “una preparación combinada” define especialmente un “kit de partes” en el sentido de que las parejas de combinación como se definió anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de las parejas de combinación es decir, de manera simultánea, concurrente, separada o secuencial. Por tanto en algunas modalidades, las partes del kit de partes pueden, por ejemplo, administrarse simultáneamente o escalonarse cronológicamente, es decir en momentos diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La relación de las cantidades totales de las parejas de combinación, en algunas modalidades, puede administrarse en la preparación combinada. En una modalidad, la preparación combinada puede variarse, por ejemplo, para lidiar con las necesidades de una subpoblación de pacientes a tratar o las necesidades del paciente individual cuyas necesidades diferentes pueden deberse a una enfermedad en particular, a la gravedad de una enfermedad, la edad, el sexo o el peso corporal, lo que puede llevarse a cabo fácilmente por un experto en la técnica.
En una modalidad, las frases “portador fisiológicamente aceptable” y “portador farmacéuticamente aceptable” que pueden usarse de manera intercambiable se refieren a un portador o un diluyente que no provoca irritación significativa en un organismo y no bloquea la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Estas frases incluyen un adyuvante. En una modalidad, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad en medios orgánicos y acuosos (Mutter y otros (1979).
En una modalidad, “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. En una modalidad, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se encuentran en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
En una modalidad, las vías de administración adecuadas, por ejemplo, incluyen administración oral, rectal, transmucosal, transnasal, intestinal o parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.
En una modalidad, la preparación se administra de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo del paciente.
En una modalidad, cuando la formulación farmacéutica o la composición farmacéutica se administra mediante inyección a un sujeto, se realiza mediante el uso de una jeringa o un dispositivo tipo PEN.
En otra modalidad, los polipéptidos que comprenden GH modificada por CTP pueden administrarse en una dosis de 5 miligramos (mg) en 1 ml de solución, o 10 mg en 1 ml de solución, o 20 mg en 1 ml de solución.
En una modalidad, la administración es mediante inyección intramuscular (IM). En una modalidad, la administración es mediante inyección subcutánea (SC). En una modalidad, la administración es mediante inyección intravenosa (IV).
La dosificación de la GH modificada por los CTP en esta invención es 0,66 mg/kg/semana.
También se describe que la dosis de GH administrada a un sujeto puede ser 50 % de la dosificación estándar administrada a un sujeto de referencia de la misma población de sujetos (por ejemplo niños, ancianos, hombres, mujeres, deficientes de GH, de nacionalidad específica, etc.). En otra descripción la dosificación puede ser 30 % de la dosificación administrada a un sujeto de una población específica de sujetos. En otra descripción la dosificación puede ser 45 % de la dosificación administrada a un sujeto de una población específica de sujetos. En otra descripción la dosificación puede ser 100 % de la dosificación administrada a un sujeto de una población específica de sujetos.
En otra descripción la dosificación es de 1-5 mg/administración. En otra descripción la dosificación es 2 mg/administración. En otra descripción la dosificación es 4 mg/administración. En otra descripción la dosificación es 1,2 mg/administración. En otra descripción la dosificación es 1,8 mg/administración. En esta invención, la composición se administra una vez por semana.
En una modalidad, la GH modificada por CTP se formula en una formulación líquida.
En otra modalidad, la GH modificada por CTP se formula en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, la GH modificada por CTP se formula en una forma de dosificación inyectable.
En otra descripción una GH modificada por CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 2 mg a 6 mg. En otra descripción una GH modificada por CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 4 mg a 10 mg. En otra descripción una GH modificada por CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 5 mg y 15 mg.
En otra modalidad, una GH modificada por CTP se inyecta en el músculo (inyección intramuscular). En otra modalidad, una GH modificada por CTP se inyecta por debajo de la piel (inyección subcutánea). En otra modalidad, una GH modificada por CTP se inyecta en el músculo. En otra modalidad, una GH modificada por CTP se inyecta debajo de la piel.
En otra modalidad, proporcionar una GH modificada por CTP a un sujeto que lo necesite aumenta de esta manera el cumplimiento en el uso de la terapia con hormonas de crecimiento.
En otra modalidad, los fármacos proteicos de peso molecular inferior a 50000 Daltons, como GH modificada por CTP como se usa en la presente invención, son, en general, especies de vida corta in vivo, que tienen tiempos cortos de vida media en circulación de varias horas. En otra modalidad, la vía de administración subcutánea en general proporciona una liberación más lenta hacia la circulación. En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP prolonga el tiempo de vida media de fármacos proteicos de peso molecular menor que 50000 Daltons, como la GH. En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP posibilita que los interferones ejerzan sus efectos beneficiosos durante un período de tiempo más largo.
En otra modalidad, se describe que la inmunogenicidad de un polipéptido modificado con CTP que comprende una GH modificada por CTP puede ser igual a una GH aislada. En otra modalidad, la inmunogenicidad de un polipéptido modificado con CTP que comprende una GH modificada por CTP es comparable a una GH aislada. En otra modalidad, la modificación de una GH como se describe en el presente documento con péptidos CTP reduce la inmunogenicidad de la GH. En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP que comprende una GH es tan activo como una proteína GH aislada. En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP que comprende una GH es más activo que una GH aislada. En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP que comprende una GH maximiza la capacidad protectora de la hormona de crecimiento contra la degradación a la vez que minimiza las reducciones en la bioactividad.
En otra modalidad, la invención aumenta el cumplimiento de los sujetos afectados con enfermedades crónicas que necesitan una terapia con GH. En otra modalidad, la invención permite la reducción en la frecuencia de dosificación de una GH mediante la modificación de la GH con CTP como se describe en el presente documento más arriba. En otra modalidad, el término cumplimiento comprende adherencia. En otra modalidad, la invención incluye aumentar el cumplimiento de los pacientes que necesitan una terapia con GH mediante la reducción de la frecuencia de administración de la GH. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración de la GH se logra debido a las modificaciones de CTP que hacen más estable la GH modificada con CTP. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración de la GH se logra como resultado de aumentar el T1/2 de la hormona de crecimiento. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración de la GH se logra como resultado de aumentar el tiempo de eliminación de la GH. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración de la hormona de crecimiento se logra como resultado de aumentar la medición del AUC de la hormona de crecimiento.
En otra modalidad, administrar a dicho sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de un polipéptido que comprende una hormona de crecimiento, un péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxilo de dicha hormona de crecimiento, aumenta de esta manera los niveles de IGF-1 en dicho sujeto.
Se describe que aumentar los niveles de IGF-1 en un sujeto humano puede ser eficaz para tratar, prevenir o suprimir la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, esclerosis lateral amiotrófica (ALS conocida como “enfermedad de Lou Gehrig”), lesión grave por quemaduras y distrofia muscular miotónica (MMD).
La administración oral, en una modalidad, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende tabletas, cápsulas, grajeas, comprimidos masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Tales formas de dosificación unitaria comprenden una cantidad segura y eficaz del compuesto o compuestos deseados. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de formas de dosificación unitaria para la administración oral se conocen en la técnica. En algunas modalidades, los comprimidos comprenden típicamente adyuvantes convencionales compatibles farmacéuticamente como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes tales como almidón, gelatina y sacarosa; desintegrantes tales como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una modalidad, los deslizantes como dióxido de silicio pueden usarse para mejorar las características de flujo de la mezcla en polvo. En una modalidad, pueden agregarse agentes colorantes, tales como los colorantes FD&C, para su apariencia. Los endulzantes y agentes saborizantes, tales como aspartamo, sacarina, mentol, menta y sabores de frutas, son adyuvantes útiles para tabletas masticables. Las cápsulas comprenden típicamente uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. En algunas modalidades, la selección de componentes portadores depende de consideraciones secundarias como sabor, coste y estabilidad durante el almacenamiento, que no son críticos para los propósitos de esta invención, y pueden realizarse fácilmente por un experto en la técnica.
En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende un perfil de liberación predefinido. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende comprimidos, cápsulas, grajeas o comprimidos masticables de liberación prolongada. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende comprimidos, cápsulas, grajeas o comprimidos masticables de liberación lenta. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende comprimidos, cápsulas, grajeas o comprimidos masticables de liberación inmediata. En una modalidad, la forma de dosificación oral se formula de acuerdo con el perfil de liberación deseado del ingrediente farmacéutico activo, como se conoce por un experto en la técnica.
Las composiciones orales, en algunas modalidades, comprenden soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones, y similares. En algunas modalidades, los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de tales composiciones se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, las composiciones orales líquidas comprenden de aproximadamente 0,012 % a aproximadamente 0,933 % del compuesto o compuestos deseados, o en otra modalidad, de aproximadamente 0,033 % a aproximadamente 0,7 %.
En algunas modalidades, las composiciones para usar en esta invención comprenden soluciones o emulsiones, que en algunas modalidades son soluciones acuosas o emulsiones que comprenden una cantidad segura y eficaz de los compuestos GH modificados con CTP y opcionalmente, otros compuestos, destinados para la administración intranasal tópica. En algunas modalidades, las composiciones comprenden de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10,0 % p/v de un compuesto objetivo, con mayor preferencia de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 2,0, que se usa para el suministro sistémico de los compuestos por vía intranasal.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intravenosa, intraarterial, o intramuscular de una preparación líquida. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran tópicamente a las superficies del cuerpo, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos se combinan con un agente o agentes terapéuticos adecuados adicionales, preparados y aplicados como soluciones, suspensiones o emulsiones en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un portador farmacéutico.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas se fabrican mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de mezcla, disolución, granulación, elaboración de pastillas recubiertas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para su uso en la presente invención se formulan de manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. En una modalidad, la formulación depende de la vía de administración elegida.
En una modalidad, los inyectables se formulan en soluciones acuosas. En una modalidad, los inyectables se formulan en tampones fisiológicamente compatibles como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. En algunas modalidades, para la administración transmucosal, en la formulación se usan penetrantes apropiados a la barrera que se va a penetrar. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.
En una modalidad, las preparaciones descritas en el presente documento se formulan para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. En algunas modalidades, las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de múltiples dosis, opcionalmente con la adición de un conservante. En algunas modalidades, las composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones comprenden, además, en algunas modalidades, conservantes, tales como cloruro de benzalconio y tiomersal y similares; agentes quelantes, tales como edetato de sodio y otros; tampones tales como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; agentes de ajuste de la viscosidad, como polímeros, que incluyen celulosa y derivados de estos; y alcohol polivinílico y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones comprenden, además, en algunas modalidades, anestésicos locales u otros agentes activos. Las composiciones pueden usarse como atomizadores, nebulizadores, gotas y similares.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los ingredientes activos, en algunas modalidades, se preparan como suspensiones para inyección oleosas o acuosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen, en algunas modalidades, aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección contienen, en algunas modalidades, sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. En otra modalidad, la suspensión contiene, además, estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
En otra modalidad, el compuesto activo puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; en general ver ibid).
En otra modalidad, la composición farmacéutica suministrada en un sistema de liberación controlada se formula para infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, una jeringa, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se usa una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgery 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Engl. J. Med. 321:574(1989). En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos. Aún en otra modalidad, un sistema de liberación controlada puede colocarse cerca del objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, por lo que se requiere solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp. 115-138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se describen en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990).
En algunas modalidades, el ingrediente activo está en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una solución estéril, basada en agua sin pirógenos, antes de su uso. Las composiciones se formulan, en algunas modalidades, para la atomización y la administración por inhalación. En otra modalidad, las composiciones están contenidas en un envase con medios de atomización adjuntos.
En una modalidad, la preparación se formula en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, con el uso de, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
En una modalidad, la preparación se formula en formulaciones líquidas para inyección mediante una jeringa o dispositivo tipo Pen. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos se incluyen en una cantidad eficaz para lograr el propósito deseado. En algunas modalidades, una cantidad con eficacia terapéutica significa una cantidad de ingredientes activos que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se trata.
En una modalidad, la determinación de una cantidad con eficacia terapéutica está dentro de la competencia de los expertos en la técnica.
En una modalidad, las formulaciones proporcionadas en la presente comprenden, además, conservantes, tales como cloruro de benzalconio y tiomersal y similares; agentes quelantes, tales como edetato de sodio y otros; tampones tales como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; agentes para el ajuste de la viscosidad, como polímeros, que incluyen celulosa y sus derivados; y alcohol polivinílico y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones comprenden, además, anestésicos locales u otros agentes activos. Las composiciones pueden usarse como atomizadores, nebulizadores, gotas y similares.
Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables o componentes de estos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etil celulosa y metil celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, como los emulsionantes Tween™; agentes humectantes, como lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes; agentes para la formación de comprimidos, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y soluciones tampón de fosfato. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable para usarse junto con el compuesto se determina básicamente por la manera en la que el compuesto se administra. Si el compuesto objetivo se inyecta, en una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina fisiológica estéril, con un agente de suspensión compatible con la sangre, cuyo pH se ha ajustado a aproximadamente 7,4.
Además, las formulaciones comprenden además aglutinantes (por ejemplo, acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metil celulosa, povidona), agentes desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, goma guar, almidón glicolato de sodio), tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) de varios pH y fuerza iónica, aditivos como albúmina o gelatina para evitar la absorción a las superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de proteasas, tensioactivos (por ejemplo lauril sulfato de sodio), potenciadores de la penetración, agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilen glicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo carbómero, dióxido de silicio coloidal, etil celulosa, goma guar), edulcorantes (por ejemplo aspartamo, ácido cítrico), conservantes (por ejemplo, tiomersal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilen glicol, lauril sulfato de sodio), auxiliares de flujo (por ejemplo dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo carbómero, hidroxipropil celulosa, lauril sulfato de sodio), recubrimientos de polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes formadores de recubrimientos y películas (por ejemplo etil celulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
Los componentes típicos de portadores para jarabes, elíxires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa (por ejemplo Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y sorbitán de polioxietileno (por ejemplo, polisorbato 80). Los conservantes típicos incluyen metilparabeno y benzoato de sodio. En otra modalidad, las composiciones líquidas orales contienen, además, uno o más componentes tales como endulzantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.
Las formulaciones proporcionadas en la presente descripción incluyen, además, la incorporación del material activo en o sobre preparaciones de partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos, o esferoplastos. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la tasa de eliminación in vivo.
Se abarcan, además, composiciones en forma de partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos de tejidos, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos de tejidos.
En algunas modalidades, los compuestos se modifican por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina. En otra modalidad, los compuestos modificados exhiben un tiempo de vida media sustancialmente más largo en sangre después de una inyección intravenosa que los compuestos no modificados correspondientes. En una modalidad, las modificaciones aumentan además la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminan la agregación, mejoran la estabilidad física y química del compuesto, y reducen en gran medida la inmunogenicidad y la reactividad del compuesto. En otra modalidad, la actividad biológica in vivo deseada se logra mediante la administración de tales abductos polímero-compuesto con menos frecuencia o en dosis más bajas que con el compuesto no modificado.
En algunas modalidades, la preparación de una cantidad o dosis eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. En una modalidad, una dosis puede formularse en modelos animales y dicha información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.
En una modalidad, la toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales. En una modalidad, los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. En una modalidad, las dosis varían en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. En una modalidad, la formulación, vía de administración y dosificación exactas pueden ser elegidas por el médico del individuo en vista de la afección del paciente. [Ver por ejemplo, Fingl, y otros, (1975) “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Cap. 1 p.1].
En una modalidad, la cantidad de una composición o formulación a administrarse dependerá, por supuesto, del sujeto que se trata, la gravedad de la afección, la forma de administración, el criterio del médico especialista, etc.
En una modalidad, las composiciones formuladas en un portador farmacéutico compatible también se preparan, se colocan en un envase apropiado, y se etiquetan para el tratamiento de una afección indicada.
En otra modalidad, una GH modificada por CTP se administra por medio de una administración sistémica. En otra modalidad, una hormona de crecimiento como se describe en el presente documento, se administra por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea. En otra modalidad, una GH modificada por CTP es una preparación liofilizada (es decir, seca por congelación) en combinación con excipientes orgánicos complejos y estabilizadores tales como agentes tensoactivos no iónicos (es decir, surfactantes), varios azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina de suero humana. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende una GH liofilizada modificada por CTP como se describe en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende una hormona de crecimiento liofilizada como se describe en PBS estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende una hormona de crecimiento liofilizada como se describe en NaCl al 0,9 % estéril para inyección.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento, se formula adicionalmente para comprender portadores complejos tales como albúmina de suero humana, polioles, azúcares y agentes estabilizadores aniónicos activos en superficies. Véase, por ejemplo, el documento WO 89/10756 (Hara y otros, que contiene poliol y p-hidroxibenzoato). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una hormona de crecimiento como se describe en el presente documento y se formula adicionalmente para comprender ácido lactobiónico y un tampón de acetato/glicina. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento, se formula además para comprender aminoácidos, tales como arginina o glutamato que aumentan la solubilidad de las composiciones de interferón en agua. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una GH liofilizada modificada por CTP como se describe en el presente documento y se formula adicionalmente para comprender glicina o albúmina de suero humana (HSA), un tampón (por ejemplo, acetato) y un agente isotónico (por ejemplo, NaCl). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una GH liofilizada modificada por CTP como se describe en el presente documento y se formula adicionalmente para comprender un tampón fosfato, glicina y HSA.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH entre aproximadamente 4 y 7,2. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH entre aproximadamente 6 y 6,4. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH de 6,0. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH de 6,2. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH de 6,4. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento se estabiliza con un aminoácido como un agente estabilizante y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada). En una modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza a temperatura ambiente. En otra modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza a 4 °C. En otra modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza a 5 °C. En otra modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza a - 20 °C. En una modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza durante al menos tres meses. En una modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza durante al menos seis meses. En una modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza durante al menos un año. En una modalidad, la composición farmacéutica se estabiliza durante al menos dos años.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento, se formula en una composición líquida que comprende un agente estabilizante entre aproximadamente 0,3 % y 5 % en peso que es un aminoácido.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento proporciona la exactitud de la dosificación y la seguridad del producto. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento proporciona una formulación líquida biológicamente activa y estable para su uso en aplicaciones inyectables. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una GH no liofilizada modificada por CTP como se describe en el presente documento.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento proporciona una formulación líquida que permite el almacenamiento durante un período de tiempo largo en un estado líquido que facilita el almacenamiento y el transporte antes de la administración.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende lípidos sólidos como material matriz. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende lípidos sólidos como material matriz. En otra modalidad, la producción de micropartículas lipídicas mediante congelación por atomizado se describió por Speiser (Speiser y otros, Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido por nanogránulos lípidos para la administración oral (Speiser en el documento EP 0167825 (1990)). En otra modalidad, los lípidos que se usan, son bien tolerados por el cuerpo (por ejemplo, glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para la nutrición parenteral).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento, está en la forma de liposomas (J. E. Diederichs y otros, Pharm./nd. 56 (1994) 267-275).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende nanopartículas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende liposomas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en la presente comprende emulsión de lípidos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende microesferas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende nanopartículas lipídicas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende nanopartículas lipídicas que comprenden lípidos anfifílicos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP como se describe en el presente documento comprende nanopartículas lipídicas que comprenden un fármaco, una matriz lipídica y un tensioactivo. En otra modalidad, la matriz lipídica tiene un contenido de monoglicéridos que es al menos 50 % p/p.
En una modalidad, las composiciones para usar en la presente invención se presentan en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. En una modalidad, el paquete, por ejemplo, comprende metal o lámina de plástico, tal como un blíster. En una modalidad, el paquete o dispositivo dispensador se acompaña de instrucciones para la administración. En una modalidad, el paquete o dispensador se acompaña de una notificación asociada con el envase en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, dicha notificación refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones para su administración a seres humanos. En una modalidad, dicha notificación está etiquetada como aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para medicamentos recetados o es un prospecto del producto aprobado.
En una modalidad, se apreciará que la GH modificada por los CTP para su uso en la presente invención puede proporcionarse al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por sí solo. En otra modalidad, las medidas (por ejemplo, dosificación y selección del agente complementario) se toman para minimizar los efectos secundarios adversos asociados con las terapias de combinación.
Los objetivos, ventajas y características novedosas adicionales de la presente invención serán evidentes para un experto en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención como se delinean anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación tiene una base experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Generalmente, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican exhaustivamente en la literatura. Véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook y otros (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y otros, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y otros, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren y otros, (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se establece en las patentes de Estados Unidos núms. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” DE Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera edición; “Current Protocols in Immunology” Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y otros (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen exhaustivamente en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms.
3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture”, Frenhney R. I., ed. (1986); “Immovilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y otros, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). En este documento se proporcionan otras referencias generales.
Ejemplo 1
Generación de construcciones de hGH
Materiales y métodos
Se sintetizaron cuatro clones de hGH (variantes de una proteína de 20 kD). Los fragmentos Xbal -Not I que contienen las secuencias de hGH de las cuatro variantes se ligaron al vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr previamente digerido con Xbal-Notl. Se preparó el ADN de los 4 clones (401-0, 1,2, 3 y 4). También se sintetizó otro clon de hGH parcial (1-242 pb) de una proteína de 22 kD (0606114). Los cebadores se ordenaron de Sigma-Genosys. Las secuencias de los cebadores que se utilizaron para generar los polipéptidos hGH-CTP para su uso en la presente invención se resumen en la Tabla 1 de la presente descripción más abajo.
Tabla 1
Figure imgf000025_0001
Construcción de 402-0-p69-1 (hGH) SEQ ID NO: 36: MOD-4020 es la hormona de crecimiento humana recombinante natural (sin CTP) que se preparó para usarse como control en los experimentos descritos a continuación.
Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 25 y el cebador 32R y ADN plasmídico de 0606114 (clon parcial de hGH de 1-242 pb) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 245 pb.
La segunda reacción se realizó con el cebador 33 y el cebador 4 R y ADN plasmídico de 401-0-p57-2 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 542 pb.
La última reacción se realizó con los cebadores 25 y 4 R y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 705 pb y se ligó en el vector de clonación TA (lnvitrogen, catálogo K2000-01). El fragmento Xbal-Notl que contiene la secuencia de hGH-0 se ligó al vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr. El vector se transfectó en células CHO DG-44. Las células se cultivaron en medio libre de proteína.
Construcción de 402-1-p83-5 (hGH-CTP) - SEQ ID NO: 37 y 402-2-p72-3 (hGH-CTPx2) - SEQ ID NO: 38: MOD-4021 es una hormona de crecimiento humana recombinante que se fusionó a 1 copia del péptido C-terminal de la cadena beta de gonadotropina coriónica humana (CTP). El casete de CTP de MOD-4021 se unió al extremo C terminal (un casete). MOD-4022 es una hormona de crecimiento humana recombinante que se fusionó a 2 copias del péptido C terminal de la cadena beta de gonadotropina coriónica humana (CTP). Los dos casetes de CTP de MOD-4022 se unieron al extremo C terminal (dos casetes).
La construcción de hGH-CTP y hGH-CTP-CTP se realizó de la misma manera que la construcción de hGH-0. pCI-dhfr-401-1-p20-1 (hGH*-ctp) y pCI-dhfr-401-2-p21-2 (hGH*-ctp x2) se usaron como moldes en la segunda reacción de PCR.
MOD-4021 y MOD-4022 se expresaron en células CHO DG-44. Las células se cultivaron en medio libre de proteína. El peso molecular de MOD-4021 es ~30,5 Kd ya que hGH tiene un PM de 22 Kd, mientras que cada “casete de CTP” contribuye con 8,5 Kd al peso molecular total (ver la Figura 1). El peso molecular de MOD-4022 es -39 Kd (ver Figura 1).
Construcción de 402-3-p81-4 (CTP-hGH-CTP-CTP) - SEQ ID NO: 39 y 402-4-p82-9 (CTP*hGH-CTP-CTP) - SEQ ID NO: 40: MOD-4023 es una hormona de crecimiento humana recombinante que se fusionó a 3 copias del péptido C terminal de la cadena beta de gonadotropina coriónica humana (CTP). Los tres casetes de CTP de MOD-4023 se unieron tanto al extremo N-terminal (un casete) como al extremo C terminal (dos casetes). MOD-4024 es una hormona de crecimiento humana recombinante que se fusiona a 1 copia truncada y 2 copias completas del péptido C terminal de la cadena beta de gonadotropina coriónica humana (CTP). El casete de CTP truncado de MOD-4024 se unió al extremo N terminal y dos casetes CTP se unieron al extremo C terminal (dos casetes).
Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 25 y el cebador 35R y el ADN plasmídico de p401-3-p12-5 o 401-4-p22-1 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 265 o 220 pb. La segunda reacción se realizó con el cebador 34 y el cebador 37R y el ADN plasmídico de TA-hGH-2-q65-1 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 695 pb. La última reacción se llevó a cabo con los cebadores 25 y 37R y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 938 u 891 pb y se ligó en un vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01). El fragmento Xba I - Not I que contiene la secuencia de hGH se ligó en nuestro vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr. (Figura 3) MOD-4023 y MOD-4024 se expresaron en células CHO DG-44. Las células se cultivaron en medio libre de proteína. El peso molecular de MOD-4023 es ~47,5 Kd (ver Figura 1) y el peso molecular de MOD-4024 es ~43,25 Kd (Figura 1).
Construcción de 402-6-p95a-8 (CTP-hGH-CTP) - SEQ ID NO: 41: La construcción de hGH-6 se realizó de la misma manera que la construcción de hGH-3. pCl-dhfr-402-1-p83-5 (hGH-ctp) se usó como molde en la segunda reacción de PCR.
Construcción de 402-5-p96-4 (CTP-hGH) - SEQ ID NO: 4: La reacción de PCR se realizó mediante el uso del cebador 25 y el cebador 39R y el ADN plasmídico de pCI-dhfr-ctp-EPO-ctp (402-6-p95a-8) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de 763 pb y se ligó en un vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01). El fragmento Xba I - Not I que contiene la secuencia de ctp-hGH se ligó a nuestro vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr para producir el clon 402-5-p96-4.
Ejemplo 2
Pruebas de bioactividad in vivo de los polipéptidos de hGH-CTP
El siguiente experimento se realizó para probar la posible actividad biológica de acción prolongada de los polipéptidos hGH-CTP en comparación con la GH humana recombinante comercial y MOD-4020.
Materiales y métodos
Las ratas hembra hipofisectomizadas (60 -100 g) recibieron una inyección semanal por vía S.C. de 21,7 pg de polipéptidos hGH-CTP o una inyección diaria de 5 pg S.C. de rhGH comercial de control.
El peso se midió en todos los animales antes del tratamiento, 24 horas después de la primera inyección y después en días alternos hasta el final del estudio en el día 21. Cada punto representa el porcentaje de ganancia de peso promedio del grupo ((Peso del día 0-peso del último día)/Peso del día 0). La ganancia de peso promedio se normalizó contra la inyección una vez al día de la hGH comercial. El esquema de tratamiento se resume en la Tabla 2.
Tabla 2
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Resultados
Los resultados se resumen en la Figura 2. Estos resultados muestran que MOD-4023 (SEQ ID NO: 39) y MOD-4024 (SEQ ID NO: 40) indujeron una ganancia de peso de más de 120 % en comparación con la rhGH comercial que indujo una ganancia de peso del 100 %.
Conclusión
Tres dosis semanalmente (días de inyecciones: 1, 7 y 13) de 21,7 jg de MOD-4023 (SEQ ID NO: 39) y MOD-4024 (SEQ ID NO: 40) indujeron un aumento de peso mayor que 30 % en ratas hipofisectomizadas en comparación con la rhGH comercial inyectada a la misma dosis acumulada que se administró una vez al día a una dosis de 5 jg durante 13 días.
Ejemplo 3
Estudios farmacocinéticos de GH modificada con CTP
Los estudios farmacocinéticos de dosis única se llevaron a cabo en ratas Sprague-Dawley. Toda experimentación en animales se realizó de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y bajo la supervisión y aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Modigene, Biotechnology General Ltd. Las ratas se alojaron individualmente o dos por jaula en habitaciones con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad. Se proporcionó acceso al agua (suministro local) y al pienso para roedores no certificado, ad libitum.
Para comparar la farmacocinética de CTP-hGH-CTP-CTP y GH en ratas, se formaron cuatro grupos de ratas Sprague-Dawley (270-290 g), de tres a seis ratas macho por grupo. Las ratas fueron asignadas al azar a los cuatro grupos de tratamiento (ver la Tabla 3). Las ratas se administraron con una inyección única de GH por vía s.c. o i.v. (50 jg/kg i.v.
o s.c.) o CTP-hGH-CTP-CTP (108 jg/kg i.v. o s.c.). Con la excepción de la muestra previa a las dosis, que se recogió bajo anestesia con isoflurano, la extracción de sangre se realizó en animales no anestesiados. Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 0,25 ml) en tubos microtainers recubiertos con EDTA para análisis ELISA de la concentración plasmática de CTP-hGH-CTP-CTP en los puntos de tiempo descritos en la Tabla 11. Después de cada toma de muestras, el volumen sanguíneo se remplazó con un volumen igual de solución salina estéril al 0,9 %. Las muestras se almacenaron en hielo durante hasta 1 h antes de la centrifugación y la obtención del plasma. Las muestras de plasma se almacenaron a aproximadamente -20 °C antes del análisis.
Tabla 3. Diseño experimental del estudio farmacocinético en ratas
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Se usó un kit de ELISA sándwich comercial específico para la detección de la hormona de crecimiento humana (Roche Diagnostics) para la evaluación de las muestras de plasma de rata. Este kit detecta la hormona de crecimiento humana en plasma por medio de un formato de ELISA sándwich con anticuerpo. Este kit se usó inicialmente para medir la concentración de CTP-hGH-CTP-CTP en plasma de rata. Para estas muestras de plasma, se usó una curva estándar de CTP-hGH-CTP-CTP (1,2-100 ng/ml) y las concentraciones de CTP-hGH-CTP-CTP en plasma de rata se interpolaron a partir de esta curva.
Los parámetros de farmacocinética estándar, que incluyeron eliminación (CL o CL/F), volumen de distribución (Vd o Vd/F), tiempo de vida media (Í1/2), área bajo la curva de concentración en plasma versus tiempo (AUC), concentración plasmática máxima observada (Cmáx) y tiempo hasta la concentración plasmática máxima observada (Tmáx), se obtuvieron a partir de las curvas de concentración/tiempo de albutropina o GH en plasma para un análisis no compartimental mediante el uso del programa de modelación WinNonlin (Pharsight, versión 3.1). Los datos de concentración plasmática de CTP-hGH-CTP-CTP o GH se ponderaron uniformemente para este análisis. El AUC se calculó mediante el uso del análisis trapezoidal lineal logarítmico para los datos i.v. y el método trapezoidal lineal ascendente/logarítmico descendente para los datos s.c. Los perfiles de concentración plasmática para cada rata (con la excepción de los datos de albutropina s.c.) o mono se analizaron individualmente, y los valores de media ± error estándar de la media (S.E.M.) para los parámetros farmacocinéticos se informan en la Tabla 4 y la Figura 4.
CTP-hGH-CTP-CTP es una proteína de cadena simple de 275 aminoácidos y hasta doce carbohidratos unidos a O. La estructura consiste en la hormona de crecimiento humana modificada (somatropina) unida a tres copias del péptido C-terminal (CTP) de la cadena beta de gonadotropina coriónica humana (hCG); una copia en el extremo N terminal y dos copias (en tándem) en el extremo C terminal. La hormona de crecimiento humana está compuesta por 191 aminoácidos. El CTP está compuesto por 28 aminoácidos y cuatro cadenas de azúcar unidas a O.
Ejemplo 4
Farmacocinética de GH modificada con CTP en ratas SD
La farmacocinética de CTP-hGH-CTP-CTP se evaluó y comparó con la de hGH comercial (Biotropin).
Tabla 4. Parámetros farmacocinéticos promedio después de la administración de una dosis única por vía i.v. y s.c.
de CTP-hGH-CTP-CTP y g H (Biotropin) en ratas Sprague-Dawley.
Figure imgf000029_0001
Análisis estadístico de los datos
El análisis de las muestras de suero se realizó para determinar los niveles de concentración específicos para cada muestra. Los datos de concentración y los puntos de tiempo se procesaron mediante el uso del análisis no compartimental de WinNonLin.
Los parámetros que se determinaron incluyeron: AUC, MRT, t1/2, Cmáx y Tmáx. La Figura 4 demuestra el perfil farmacocinético superior de la concentración plasmática de CTP-hGH-CTP-CTP en comparación con las concentraciones de GH (pg/ml) después de una dosis única i.v. o s.c. de CTP-hGH-CTP-CTP o GH en ratas (n=3-6 por dosis/vía).
Después de una inyección única S.C. de 50 pg/kg, la eliminación de CTP-hGH-CTP-CTP de la sangre de las ratas SD fue significativamente más lenta que la de CTP-hGH-CTP y de Biotropin. Los tiempos de vida media correspondientes calculados y las AUC fueron:
Biotropin T1/2 1,7 h, AUC 41 h*ng/ml
CTP-hGH-CTP T1/28,5 h, AUC 424 h*ng/ml
CTP-hGH-CTP-CTP T1/29,0 h, AUC 680 h*ng/ml
Conclusión: CTP-hGH-CTP-CTP se eligió como el candidato final de otras 6 variantes. CTP-hGH-CTP-CTP demostró un rendimiento superior en términos de actividad biológica y farmacocinética.
Ejemplo 5
Ensayo de ganancia de peso (WGA) para dosis única/dosis repetida de GH modificada con CTP
Se obtuvieron ratas machos hipofisectomizadas (método interaural), de 3-4 semanas de edad, de CRL Laboratories. Durante un período de adaptación posquirúrgica de 3 semanas, las ratas se examinaron y se pesaron dos veces por semana para eliminar los animales que se consideró que tenían una hipofisectomía incompleta, evidenciada por una ganancia de peso similar a la de ratas operadas de manera simulada. Las ratas con hipofisectomía incompleta se eliminaron del estudio. Los pesos corporales promedio de la hipofisectomizada fueron de 70-90 gramos, en el momento del experimento. Este es el USP estándar y bioensayo de EP para hGH. Las ratas hipofisectomizadas (ratas de las cuales se extirpó la glándula pituitaria) pierden su capacidad para ganar peso. Las inyecciones de hGH (y de CTP-hGH-CTP-CTP) a estas ratas resultan en ganancia de peso. En función de la ganancia de peso medida a lo largo de un período de tiempo definido y la cantidad de hGH inyectada, se determina la actividad específica de hGH (y CTP-hGH-CTP-CTP). Las ratas se administraron con dosis únicas por vía s.c. de 0,4, 0,8 y 4 mg/kg o dosis repetidas por vía s.c. de 0,6 y 1,8 mg/kg separadas por 4 días durante 3 semanas. Los pesos corporales individuales de todos los animales se determinan en el momento de la aleatorización, antes de la primera dosificación, después cada dos días o en caso de decesos en el momento de la muerte, y antes del sacrificio.
Ensayo de ganancia de peso con dosis única y repetida
Los resultados que comparan la respuesta de crecimiento corporal completo después de diferentes patrones de dosificación de CTP-hGH-CTP-CTP en ratas hipofisectomizadas se muestran en la Figura 5. Los resultados demuestran que una sola inyección de dosis de 0,4 y 0,8 mg/kg/día de hGH-CTP fue equivalente a 4 inyecciones diarias de 0,1 mg/kg/día de Biotropin. El pico del efecto de hGH-CTP fue después de 2 días.
La Figura 6 demuestra además que el área bajo la curva después de una inyección única de CTP-hGH-CTP-CTP se correlaciona con la ganancia de peso corporal en ratas. Por lo tanto, los datos en conjunto demuestran que la ganancia de peso corporal se correlaciona estrechamente con el AUC acumulativa.
La construcción hGH-CTP administrada con una separación de 4 días promueve la misma ganancia de peso que las inyecciones diarias de Biotropin como se demuestra en la Figura 7. Se espera que la vida media de hGH en los seres humanos sea 5x mejor que en ratas, lo que indica un posible efecto máximo en los seres humanos después de 10 días para una sola inyección. Estos resultados apoyan la administración de la construcción hGH-CTP, CTP-hGH-CTP-CTP, una vez a la semana o bisemanalmente en seres humanos.
Ejemplo 6
Estudios de farmacodinámica/farmacocinética de GH modificada con CTP
Se obtuvieron ratas machos hipofisectomizadas (método interaural), de 3-4 semanas de edad, de CRL Laboratories. Durante un período de adaptación posquirúrgica de 3 semanas, las ratas se examinaron y se pesaron dos veces por semana para eliminar los animales que se consideró que tenían una hipofisectomía incompleta, evidenciada por una ganancia de peso similar a la de ratas operadas de manera simulada. Las ratas con hipofisectomía incompleta se eliminaron del estudio. Los pesos corporales promedio de las ratas hipofisectomizadas y operadas de manera simulada fueron 70 y 150 g, respectivamente, en el momento del experimento.
Las ratas se administraron por vía s.c. con una dosis única de CTP-hGH-CTP-CTP, vehículo, la hormona de crecimiento humana CTP-hGH-CTP-CTP o la hormona de crecimiento humana (20 pg/rata) se administró por vía s.c. en un volumen de inyección de 0,2 ml/rata. La dosis de GH fue de 0,35 y 1,05 pg/Kg, una dosis de hormona de crecimiento que fue equimolar con la cantidad de GH en una dosis correspondiente de 0,6 y 1,8 pg/Kg de CTP-hGH-CTP-CTP. Los grupos de tratamiento se resumen en la Tabla 5. Después de la inyección, las muestras de plasma para los análisis de IGF-1 se obtuvieron en los momentos descritos en la Tabla 5. Las muestras se analizaron para determinar la concentración de IGF-1 mediante el uso de un ELISA comercial (R&D systems).
Tabla 5. Esquema de tratamiento para el estudio de ratas hipofisectomizadas
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El análisis farmacocinético no compartimental se realizó en las curvas de concentración promedio en suero versus tiempo para cada grupo. La Cmáx de CTP-hGH-CTP-CTP fue significativamente mayor que la Cmáx de Biotropin. El tiempo de vida media terminal de CTP-hGH-CTP-CTP fue 6 veces mayor que el de Biotropin.
Tabla 6: Estimados de parámetros farmacocinéticos de CTP-hGH-CTP-CTP y Biotropin después de una sola inyección subcutánea en ratas hipofisectomizadas
Figure imgf000031_0001
El AUCo-t y el AUC0-», fueron muy similares lo que sugiere que la duración del muestreo fue adecuado para caracterizar los perfiles farmacocinéticos. El AUC de CTP-hGH-CTP-CTP fue 10 veces mayor que el de Biotropin. Además, la Cmáx era generalmente proporcional a la dosis y para CTP-hGH-CTP-CTP y fue dos veces mayor que la Cmáx de Biotropin. Sin embargo, como se muestra en la Figura 8, Tmáx de CTP-hGH-CTP-CTP fue de 8 h en comparación con 0,5 h de Biotropin, y los tiempos de vida media terminales no pareció variar con el nivel de dosis. El T1/2 de CTP-hGH-CTP-CTP fue 6,8 veces mayor que el de Biotropin.
Los efectos indirectos de la GH están mediados principalmente por un factor de crecimiento similar a la insulina l (IGF-1), una hormona secretada por el hígado y otros tejidos en respuesta a la hormona de crecimiento. La mayoría de los efectos promotores del crecimiento de la hormona de crecimiento se deben realmente al IGF-1 que actúa sobre sus células objetivo. Por consiguiente, se midió el efecto de la construcción CTP-hGH, CTP-hGH-CTP-CTP, sobre los niveles de IGF-1 en suero en ratas hipofisectomizadas. La Figura 9 presenta los resultados de los niveles de IGF-1 en suero en ratas hipofisectomizadas después de la inyección SC de CTP-hGH-CTP-CTP y hGH comercial.
Se inyectó una dosis única de CTP-hGH-CTP-CTP 0,6 o 1,8 mg/kg y Biotropin 0,35 o 1,05 mg/kg por vía subcutánea a ratas hipofisectomizadas para la determinación del perfil PK/PD. El IGF-1 en suero después de la inyección se midió mediante el uso de kits de ELISA específicos (Roche Diagnostics).
Los niveles séricos acumulados de IGF-1 después de la inyección de CTP-hGH-CTP-CTP fueron significativamente mayores que después de la inyección de Biotropin. La Cmáx era generalmente proporcional a la dosis y para CTP-hGH-CTP-CTP fue 3-4 veces mayor que la Cmáx de Biotropin. El Tmáx de CTP-hGH-CTP-CTP fue de 36-48 h en comparación con 20-24 h de Biotropin. En conclusión, mayores niveles y una presencia más prolongada de hGH en suero dan como resultado un aumento significativo en los niveles de IGF-1.
Ejemplo 7
Contenido de carbohidratos y contenido de ácido siálico de GH modificada con CTP
El análisis de O-glicanos se basa en un kit Prozyme. Los O-glicanos se escinden química y enzimáticamente de la proteína y se separan de los péptidos mediante el uso de cromatografía en papel. La secuenciación del grupo de O-glicanos se realiza por digestiones enzimáticas secuenciales (exo-glicosidasas) seguido por análisis HPLC en comparación con los patrones.
Glicoperfil con análisis de secuencias
El glicoperfil fue realizado por Ludger Ltd. Se tomaron dos muestras (EN648 y RS0708) a través de liberaciones por triplicado y cada liberación se analizó, además, mediante HPLC por triplicado. Las muestras triplicadas de 300 gg de EN648 y RS0708 y una muestra única de 100 gl de tampón de citrato/cloruro de sodio, más una fetuína de control positivo (250 gg) y un control negativo de agua de 100 gl, se ultrafiltraron mediante centrifugación con el uso de una membrana de corte de peso molecular de 10 000 Da para reemplazar el tampón con agua, después se sometió a hidrazinolisis en condiciones de modo O (6 h a 60 °C). Los glicanos liberados se re-A/-acetilaron y se limpiaron mediante cartuchos LudgerClean CEX. Una alícuota de los glicanos liberados se marcó después con 2-aminobenzamida (2AB), se limpió con cartuchos LudgerClean S y se analizó con LudgerSep-N2 HILIC-HPLC.
Contenido de monosacáridos
El análisis de monosacáridos neutros requiere la hidrólisis de los glicanos a sus componentes monosacáridos constituyentes. La hidrólisis se realizó por Ludger Ltd, en muestras de glicoproteínas intactas. Específicamente, 50 gg de glicoproteína intacta se hidrolizaron en ácido, 2-AB (2-aminobenzamida) se marcó y se corrió en una columna de HPLC de fase inversa. Este método hidroliza todos los glicanos presentes en la glicoproteína incluidos los tipos unidos a N y O.
Perfil de ácido siálico
Se analizaron dos muestras (EN648 y RS0708) y un control tampón. El análisis de ácido siálico requiere la liberación ácida suave de los monosacáridos seguido de marcaje con fluoróforo DMB y el análisis por HPLC en una columna LudgerSep-RI. Se hidrolizaron en ácido 50 pg de glicoproteína intacta para cada análisis.
Glicoanálisis de CTP-hGH-CTP-CTP
Tabla 7. Análisis de glicanos. Las asignaciones estructurales y las áreas porcentuales de picos se basan en HPLC y las digestiones de matrices enzimáticas.
Figure imgf000032_0001
Los perfiles de monosacáridos indican que las muestras de glicoproteínas CTP-hGH-CTP-CTP contienen predominantemente glicanos con enlace tipo O. El pico de O-glicano principal es el núcleo sialilado 1 (NeuNAca2-3Galp1-3GalNAc). El ácido siálico principal es Neu5Ac y hay algunos picos menores que sugieren la presencia de 3­ 4 % de ácido siálico diacetilado ácido A/-acetil-9-O-acetilneuramínico (Neu5, 9Ac2) y menos de 1 % de ácido N-glicolilneuramínico. Existen, además, pequeñas cantidades de NeuNAca2-6(Galp1-3)GalNAc.
Ejemplo 8
Análisis farmacocinético/toxicocinético de GH modificada con CTP en monos Rhesus
Se generaron las curvas de concentraciones en suero versus tiempo para cada animal. El análisis no compartimental se realizó con WinNonlin profesional versión 5.2.1 (Pharsight Corporation, Mt View CA.). Los parámetros farmacocinéticos estimados se muestran en la Tabla 8 a continuación:
Tabla 8 : Estimados de parámetros farmacocinéticos de CTP-hGH-CTP-CTP (media ± SD) a partir del análisis no compartimental después de una inyección subcutánea única en monos Rhesus
Figure imgf000033_0001
El AUCo-t y el AUC0-» fueron muy similares, lo que sugiere que la duración del muestreo fue adecuada para caracterizar los perfiles farmacocinéticos. La Cmáx fue proporcional a la dosis. El Tmáx fue más tardío a una dosis más alta. El Tmáx fue a las 4 horas para todos los animales en el grupo de dosis baja y fue a las 8 o 24 horas en el grupo de dosis alta. Los tiempos de vida media terminales son similares para los dos grupos de dosis.
El AUC fue aproximadamente proporcional a la dosis con un AUC ligeramente mayor que el proporcional con la dosis mayor, lo que produjo un estimado ligeramente menor para CL/F y Vz/F en comparación con la dosis menor. No es posible decir si CL y Vz son menores con la dosis más alta o si F es menor con la dosis menor. Hubo superposición entre los grupos, por lo que es cuestionable que esto represente una diferencia significativa en CL/F y Vz/F.
Los parámetros farmacocinéticos estimados por el modelo fueron muy similares a los del análisis no compartimental. La absorción y el tiempo de vida media de eliminación se muestran en la Tabla 9 a continuación:
Tabla 9: Estimados de la absorción de CTP-hGH-CTP-CTP y tiempos de vida media de eliminación (media ± SD) después de una inyección subcutánea derivada de la modelación farmacocinética en monos Rhesus
Figure imgf000033_0002
Los datos indican que las tasas de eliminación son bastante similares entre los grupos con un T1/2 ligeramente más largo en el grupo de menor dosis. La absorción, sin embargo, es más de 5 veces más lenta después de la administración subcutánea de 90 mg/kg en comparación con la de 1,8 mg/kg. Como en el caso del análisis no compartimental, la modelación indicó un Tmáx más tardío a la dosis alta.
Aunque el suplemento con GH es eficaz en el tratamiento de la deficiencia de GH en niños y adultos, las desventajas de las inyecciones diarias durante períodos prolongados limitan su uso por los médicos en determinadas poblaciones de pacientes, así como también aumentan el riesgo de error en la dosificación, la cantidad de cuidadores, el coste del tratamiento y/o el incumplimiento. Especialmente importante en determinadas poblaciones, como niños de baja estatura que pueden no comprender las implicaciones de no seguir el régimen de dosificación de GH prescrito, es la necesidad de cumplimiento para lograr el beneficio óptimo de la terapia con GH. El problema de encontrar una alternativa más adecuada a las inyecciones diarias de GH y el posterior cumplimiento gana mayor importancia a medida que los niños deficientes de GH transitan a adultos con una necesidad continua del tratamiento de GH. El requisito de la terapia diaria se debe en gran parte al tiempo corto de vida media en plasma de la GH recombinante y ha conducido al desarrollo de una forma de liberación sostenida de GH (Reiter EO. Attire KM., Mashing TJ. Silverman BL. Kemp SF. Neolith RB. Ford KM. y Sanger P. A multimember study of the efficacy and safety of sustained release GH in the treatment of naive pediatric patients with GH deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001), pp. 4700­ 4706).
GH-CTP, una proteína de fusión de la hormona de crecimiento humana recombinante-CTP, como se describe en el presente documento, tiene un perfil farmacocinético en la rata que es mayor en duración que el de GH. Este perfil farmacocinético único permite la administración intermitente de GH-CTP para lograr efectos farmacodinámicos en ratas con deficiencia de la hormona de crecimiento como se evidencia por el crecimiento y elevaciones en los niveles de IGF-1 en plasma, respectivamente.
GH-CTP ofrece un perfil farmacocinético superior en comparación con el de GH cuando se administra por vía s.c. en la rata. Existen diferencias sustanciales en la eliminación en plasma de GH-CTP en comparación con GH. Específicamente, GH-CTP se elimina del plasma más de 6 veces más lento que GH después de una dosificación por vía s.c. El tiempo de vida media terminal y el tiempo de residencia promedio de GH-CTP fueron aproximadamente seis veces más largos que el de GH en ratas después de la administración por vía s.c. Además, Cl/F después de la dosificación s.c. es 10 veces más lento para GH-CTP que para GH.
En un esfuerzo por examinar si las ventajas farmacocinéticas en la rata se traducen en un beneficio farmacodinámico, la posibilidad de que GH-CTP pudiera estimular el crecimiento en ratas hipofisectomizadas con deficiencia de GH con regímenes de dosificación menos frecuentes que diariamente se analizó a niveles de dosis equimolares de CTP-hGH-CTP-CTP y GH. Una inyección única por vía SC de GH-CTP promovió la ganancia de peso gradual que fue igual a 4 inyecciones consecutivas diarias de GH. Además, el esquema de administración cada cuatro días para GH-CTP muestra un aumento de la ganancia de peso corporal con respecto a GH.
Farmacodinámicamente, el largo tiempo de circulación de GH-CTP con relación a GH en las ratas hipofisectomizadas dio como resultado una respuesta prolongada de IGF-1 medida en el plasma sanguíneo después de una sola inyección s.c. La administración subcutánea de una dosis única de GH-CTP aumentó las concentraciones circulantes de IGF-1 en una manera dependiente de la dosis en las ratas hipofisectomizadas. A la dosis más alta de albutropina, las concentraciones de IGF-1 se elevaron por encima de la línea base durante un período de tiempo de 75 horas después de una sola administración. Por lo tanto, el tiempo de circulación mejorado de una dosis única de GH-CTP resultó en una mejora farmacodinámica sustancial con respecto a una única dosis de GH, lo que aumenta la posibilidad de que GH-CTP pudiera ofrecer una mejora del crecimiento similar con una frecuencia de dosificación reducida en comparación con los regímenes de tratamiento con GH estándar.
Una dosis única de hGH modificada con CTP de 90 mg/kg en Rhesus y 180 mg/kg en ratas se toleró bien en ambas especies. El factor alométrico entre ratas y primates es aproximadamente X2 que se basa en la eliminación anticipada de proteínas en estos animales. En línea con modelos de extrapolación aceptados en la industria para el aumento del tiempo de vida media de proteínas terapéuticas entre especies (Guía de la FDA). 90 mg/kg en primates tiene un perfil PK ligeramente mejor que 180 mg/kg de hGH modificada con CTP en ratas. Por lo tanto, la extrapolación alométrica a los seres humanos apoya una inyección semanal o una/2 sem.
El presente concepto que utiliza una construcción CTP-GH, redujo la frecuencia de dosificación en comparación con el producto de GH recombinante comercial. Nutropin Depot® es una formulación de liberación sostenida de GH aprobada para su uso en poblaciones pediátricas; sin embargo, las comparaciones con los controles históricos han revelado que las tasas de crecimiento de 1 y 2 años son significativamente menores (p<0 ,001 ) en los niños que recibieron Nutropin Depot® (velocidad de crecimiento en 1 año, 8,2 ± 1,8 cm/año) que en los niños tratados con GH (velocidad de crecimiento en un año 10,1 ±2,8 cm/año) (Silverman BL, y otros, J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 15 (2002), pp. 715-722). Los efectos locales de Nutropin Depot® administrados por vía subcutánea incluyen nódulos, eritema, dolor en el lugar de la inyección, dolor de cabeza y vómitos. Los estudios de toxicología preclínica tanto en ratas como en monos han demostrado que la administración por vía s.c. de CTP-hGH-CTP-CTP no produce reacciones locales en comparación con el vehículo. Dada la necesidad médica de una forma de GH administrada con menos frecuencia, las propiedades farmacológicas de CTP-hGH-CTP-CTP en este estudio en ratas sugieren que este producto es favorable, además, en términos de toxicología y cumplimiento de los pacientes. La actividad sostenida de CTP-hGH-CTP-CTP en la rata respalda su utilidad potencial como un agente que sólo requiere una administración intermitente para lograr un beneficio terapéutico que se logra actualmente con una dosificación diaria.
Ejemplo 9
La versión de la hormona de crecimiento humana modificada con CTP de acción prolongada (hGH-CTP) fue altamente eficaz en adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento - Ensayo clínico Fase II
Se llevó a cabo un ensayo clínico Fase II, aleatorizado, abierto para evaluar la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética y propiedades farmacodinámicas de hGH-CTP inyectado ya sea semanal o dos veces al mes en pacientes que actualmente reciben inyecciones diarias de hormona de crecimiento. El ensayo se llevó a cabo en múltiples sitios en seis países. Las tres cohortes principales en el ensayo recibieron una dosis semanal única de hGH-CTP, que contenía el 30 %, 45 % o 100 % de la dosis de hGH comercial acumulativa equivalente que los pacientes adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento reciben en el transcurso de siete días en la forma de inyecciones diarias (referidas como las cohortes “30 %”, “45 %” y “100 %”, respectivamente). Los datos reflejan los resultados de 39 pacientes, 13 en cada cohorte. 2 mujeres se incluyeron en cada cohorte.
Además de las tres cohortes principales, los adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento se incluyeron en una cuarta cohorte experimental, que se llevó a cabo fuera del ensayo Fase II formal. Los pacientes en la cuarta cohorte experimental reciben una sola inyección de hGH-CTP una vez cada dos semanas que contiene el 50 % de la dosis comercial acumulativa que los pacientes adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento reciben en un período de dos semanas en forma de inyecciones diarias.
La eficacia para las tres cohortes principales que recibieron una sola inyección semanal de hGH-CTP se define midiendo diariamente los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) dentro del intervalo terapéutico deseado durante un período de siete días (durante la última semana de tratamiento en el estudio). El intervalo terapéutico deseado se define como entre 2 desviaciones estándar y - 2 desviaciones estándar a partir de los niveles promedio de IGF-1 esperados en una población normal, estratificados por el grupo de edad y el género. Además, el ensayo midió los niveles de IGF-1 dentro de un intervalo más estrecho de /-1,5 desviaciones estándar con el propósito de observar la varianza de los pacientes dentro del intervalo normal.
Resultados:
La Tabla 10 contiene el por ciento promedio de días dentro del intervalo terapéutico normal (+/- 2 SD), el por ciento promedio de días dentro de un intervalo terapéutico normal más estrecho (+/-1,5 SD), y Cmáx promedio (nivel de concentración más alto) de IGF-1 para varones, medidos durante la última semana de tratamiento, expresados en desviaciones estándar de los niveles promedio de IGF-1 de la población normal.
Tabla 10: Resultados del ensayo clínico Fase II en seres humanos.
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Dos mg por semana de hGH-CTP, que contienen el 50 % de la dosis de hGH semanal acumulativa que un paciente adulto normalmente recibiría como la dosis de tratamiento inicial, tiene una alta probabilidad de definirse como la dosis inicial para hombres y mujeres en la Fase III en adultos.
No hubo evidencia de problemas de seguridad y/o tolerabilidad, y sin indicación de que hGH-CTP, cuando se usó en dosis altas, indujo niveles excesivos de IGF-1 en pacientes o incluso niveles por encima del intervalo normal.
Resumen y perspectivas de IGF-1 Fase II
Diseño y objetivos del estudio fase II con MOD-4023:
Se completó un estudio Fase II en dos etapas para confirmar el régimen de administración semanal de CTP-hGH-CTP-CTP (MOD-4023) (ver la Figura 10). El ensayo fue un estudio de cambio realizado en pacientes con deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD) que actualmente recibían un tratamiento diario con hGH que se consideró normalizado en su tratamiento diario antes de la administración de MOD-4023, como lo reflejan los niveles de SDS de IGF-1 dentro del intervalo normal (±2 SDS). La Etapa I del estudio fue un estudio de búsqueda de dosis de 4 semanas (4 inyecciones) respaldado por un análisis completo de farmacocinética-farmacodinámica (PK-PD) durante la semana después de la 4ta dosis de MOD-4023. El objetivo principal de esta parte fue identificar un intervalo de dosis terapéutica en el que el nivel de IGF-1 se mantiene dentro de un intervalo definido. Otro objetivo fue evaluar el perfil PK-PD de MOD-4023 en 3 dosis/multiplicadores diferentes, y confirmar una respuesta dependiente de la dosis. La segunda etapa del estudio (Etapa II) fue un tratamiento con MOD-4023 de 16 semanas y un período de titulación de dosis. Todos los pacientes que continuaron en la Etapa II comenzaron con el mismo nivel de dosis de MOD-4023 (61,7 % de su dosis de r-hGH acumulativa semanal, personal y optimizada), pero podrían tener una modificación de su dosis sobre la base de los niveles de IGF-1 monitoreados.
En la primera parte del estudio las dosis se administraron sobre la base del porcentaje de hGH acumulada semanalmente para evaluar la respuesta inicial después de un régimen semanal de MOD-4023. Por ejemplo: Un paciente que recibía 1 mg / día de hGH que se asignó al azar a la cohorte del 55 % se inyectó con una dosis de MOD-4023 de 1 mg*7días*0,55 semanalmente.
Resultados
El criterio principal de valoración de la eficacia de este estudio fue el intervalo de tiempo promedio de los niveles de IGF-1 que estuvieron dentro del intervalo normal después de la última administración de la dosis durante la Etapa I, expresada en horas. En el análisis final los niveles de IGF-1 de la mayoría de los pacientes durante esa semana estaban dentro del intervalo normal para toda la semana (Tabla 11). A los pacientes que estaban dentro del intervalo de SDS especificado en el punto de tiempo final se les asignó un intervalo de tiempo de 168 horas. Ninguno de los pacientes excedió 2 SDS en Cmáx, lo que indica que no hay niveles de IGF-1 excesivos. El ochenta y cinco por ciento de los hombres (28/33 hombres) tuvieron una SDS de IGF-1 promedio dentro del intervalo normal (±2 SDS) (Figura 11). El intervalo de tiempo medio de los niveles de IGF-1 que están dentro de ± el intervalo normal de las tres cohortes no mostró un cambio significativo ya que todos los intervalos de tiempo promedio se encontraron dentro de 1 desviación estándar entre sí.
Ta
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Como se anticipó, la administración del 37 % de la hGH semanalmente condujo a valores de SDS de IGF-1 en la parte inferior del intervalo normal y la duración más corta dentro del intervalo normal. Se observó una mejora significativa en los niveles de IGF-1 como se refleja en la duración dentro del intervalo normal cuando se administró una dosis mayor (55 % de la dosis de hGH acumulada semanal).
Una respuesta de IGF-1 dependiente de la dosis en comparación con la referencia se muestra en la Figura 12. Los resultados presentados en la Figura 12, apoyan la idea de que los niveles de IGF-1 aumentan en una manera dependiente de la dosis de MOD-4023, lo que permite el ajuste del perfil semanal de IGF-1. Adicionalmente, el cambio promedio con respecto al valor de referencia de los valores de IGF-1 a las 120-168 h después de la dosificación regresa a los valores iniciales, lo que sugiere que los niveles de IGF-1 son estables sin deterioro en esta población de adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento normalizada (GHDA) (Fig. 12).
La Cprom (AUC/Tiempo) que representa la exposición media a IGF-1, de los pacientes normalizados tratados diarios se comparó con la del tratamiento semanal con MOD-4023 de los mismos pacientes (AUC 0-24/24 h contra AUC 0-168/168 h respectivamente). Las dosis semanales de 55-123,4 % de la dosis semanal acumulativa de hGH proporcionaron una exposición comparable a IGF-1 como se refleja por Cprom, mientras que para los pacientes tratados con 37 % de la dosis semanal se observó una reducción de Cprom, que coincidió con nuestras expectativas debido a la dosis semanal relativamente baja (Tablas 12 y 13).
Tabla 12: Resumen de los parámetros farmacodinámicos para IGF-1 después de una administración subcutánea de r-hGH a adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento antes de la administración de MOD-4023 (Etapa 1; 4 sem)
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Tabla 13: Resumen de los parámetros farmacodinámicos para IGF-1 después de la administración subcutánea de MOD-4023 en adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento (Etapa I; 4 sem)
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En función del análisis PD de la Etapa I Fase II se concluyó lo siguiente: 1) Aunque el objetivo del estudio no fue optimizar los niveles de IGF-1 de los pacientes, específicamente, dirigir el valor de SDS de IGF-1 a 0, (ya que la optimización de SDS de IGF-1 requiere un período de titulación relativamente largo), aún así podría establecerse el intervalo de dosis terapéutica para la administración semanal de MOD-4023: alrededor de 56 %-123 % de la dosis acumulativa semanal de hGH diaria. 2) El perfil de IGF-1 después de una administración semanal de MOD-4023 es relativamente plano, como se refleja por una diferencia bastante pequeña entre Cmáx y Cvalle. 3) La Cprom (AUC 0-168/168 h) que representa la exposición a IGF-1 semanal media se correlacionó con los valores del Día 4. Por lo tanto, el día 4 después de la administración de MOD-4023 se eligió como el día de monitoreo para los niveles de IGF-1.
Resultados y perspectivas de la Fase II Etapa II (extensión de 4 meses):
La capacidad de la administración semanal de MOD-4023 para mantener IGF-1 dentro del intervalo normal a una dosis óptima y por un período de tiempo más largo se abordó durante la segunda parte del estudio (Etapa II- período de extensión de 4 meses; Figura 10). En este estudio, la misma población de pacientes de la primera etapa se administró con 61,7 % de su dosis semanal de hGH y se monitoreó el IGF-1 cada dos semanas. La mayoría de los pacientes mantienen el valor de SDS de IGF-1 dentro del intervalo normal a lo largo del estudio, según se midió en el día 4 después de la inyección. Los pacientes que demostraron niveles de IGF-1 por debajo del intervalo normal se titularon adicionalmente y se aumentó su dosis de MOD-4023 (según la práctica clínica).
La minoría de los pacientes con valores de SDS de IGF-1 por debajo del intervalo normal requirió una titulación adicional pero demostró una mejora notable en la SDS de IGF-1, lo que indica que el perfil de IGF-1 puede optimizarse por el incremento/disminución de la dosis de MOD-4023. Una capacidad de respuesta excelente y una modificación mínima de la dosis se necesitaron como se presenta en la Figura 13 y se resume en la Tabla 14 en la presente descripción.
Tabla 14: Resumen de las modificaciones requeridas de la dosis durante la Etapa II.
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Sobre la base de los valores de SDS de IGF-1 en el día 4 (correlacionados con Cprom), se observó una mejora significativa en los niveles de IGF-1, en comparación con la Etapa I del estudio para los pacientes individuales. Esta observación también apoyó la idea de que es necesario un período de ajuste para alcanzar los niveles y perfil óptimos de IGF-1. Se conoce que las mujeres son menos sensibles al tratamiento de reemplazo de hGH (MOD-4023 también) y usualmente requieren dosis más altas y un período de titulación más largo. Además, los niveles de SDS de IGF-1 medidos en el día 4 se mantuvieron constantemente en un valor similar dentro del intervalo normal durante el período de extensión de 4 meses, lo que indica que MOD-4023 puede administrarse en un régimen semanal. Después de las administraciones consecutivas de MOD-4023 no se observó una disminución importante en los niveles de IGF-1 en el día 4 lo que indica que la Cmáx y la Cvalle del comportamiento “sinusoidal” de IGF-1 se mantienen a lo largo del estudio, lo que confirma nuevamente el régimen semanal de MOD-4023.
En conclusión, MOD-4023 debe evitar la necesidad de las numerosas inyecciones requeridas actualmente para el tratamiento de GHD. Los resultados de este estudio han demostrado que MOD-4023 puede inyectarse una vez por semana y lograr los criterios de valoración de eficacia clínica que se evaluaron, a la vez que se mantiene un perfil de seguridad favorable. Un régimen de tratamiento con GH que requiera inyecciones menos frecuentes puede mejorar el cumplimiento y posiblemente los resultados generales.
Por lo tanto, en función del perfil de IGF-1 logrado y los resultados de seguridad y tolerabilidad de fase II, la frecuencia de inyección y la dosificación recomendadas para el estudio Fase III son: una sola inyección semanal de MOD-4023 que contiene 61,7 % de la dosis de hGH semanal acumulativa, personalizada para cada paciente.
Ejemplo 10
La administración de una versión de la hormona de crecimiento humana modificada con CTP (hGH-CTP) mejoró la farmacocinética en niños con deficiencia de hormona de crecimiento previos a la pubertad (GHD)
Se llevó a cabo un ensayo clínico Fase II, aleatorizado, abierto para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética y las propiedades farmacodinámicas de tres dosis de MOD-4023 con las de una hormona de crecimiento humana recombinante estándar disponible comercialmente, administrada diariamente. El estudio consistió en un período de selección de 6 meses y dos períodos de tratamiento activo: un tratamiento de 6 meses que incluyó muestreo para PK/PD seguido de otro período de dosificación repetida continua por 6 meses, como se representa en la Figura 14. Los objetivos secundarios fueron evaluar los perfiles de farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de tres dosis diferentes de MOD-4023 en niños con deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD) previos a la pubertad y seleccionar la dosis óptima de MOD-4023 para el estudio fase 3 posterior sobre la base de la seguridad y la eficacia.
Para introducir pacientes vírgenes a la dosis de MOD-4023 asignada (ver la Tabla 15) de una manera gradual, se implementó un aumento escalonado de la dosis. Todos los pacientes asignados al azar para recibir una de las tres dosis de MOD-4023 comenzaron el tratamiento durante 2 semanas con la dosis baja de MOD-4023 (0,25 mg/kg). En función de la asignación de dosis del paciente, esto fue seguido de un aumento de la dosis al siguiente nivel de dosis cada dos semanas hasta que se haya alcanzado la dosis final asignada.
Tabla 15: Cohortes de dosis
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Posterior a la segunda administración de la dosis objetivo, se realizó el muestreo de PK y PD limitado (basado en las poblaciones) como se describe en la Tabla 16.
Tabla 16: Esquema de aumento de la dosis para las cohortes de MOD-4023
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Los pacientes asignados a una cohorte de dosis de MOD-4023 se asignaron al azar dentro de la cohorte a uno de tres bloques y se sometieron a una toma de muestras de PK/PD limitada (4 muestras por paciente durante un período de una semana), de acuerdo con la Tabla 17 más abajo.
Tabla 17: Esquema de muestreo para PK y PD de población con MOD-4023
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Los pacientes asignados a la Cohorte 1 se sometieron a muestreo limitado para PK/PD después de la 2da dosis de MOD-4023 (V2a-g - semana 2) y regresaron a los centros médicos para una sola visita 4 días después de la dosificación durante la semana 6 (V4h).
Los pacientes asignados a la Cohorte 2 regresaron a los centros médicos para una sola visita 4 días después de la dosificación durante la semana 2 (V2h), se sometieron a un muestreo limitado para PK/PD después de la 4ta dosis de MOD-4023 (semana 4: la segunda dosis al nivel de dosis asignado; V3a-g) y regresaron a los centros médicos para una sola visita 4 días después de la dosificación durante la semana 6 (V4h).
Los pacientes asignados a la Cohorte 3 acudieron a los centros médicos para una sola visita 4 días después de la dosificación durante las semanas 2 y 4 (V2h y V3h) y se sometieron a muestreo limitado después de la 6ta dosis de MOD-4023 (semana 6 : la segunda dosis al nivel de dosis asignado, V4a-g).
En las visitas 2a y 2h, 3a y 3h, y 4a y 4h, los pacientes se sometieron a examen físico, signos vitales, EA, tolerabilidad local, medicamentos concomitantes, parámetros del metabolismo de glucosa (glucosa e insulina en ayunas; HbA1 C solo en V4), otros niveles hormonales (TSH, fT4, T3, cortisol), ensayos de bioquímica y hematología de rutina para seguridad (visitas 2a y 2h, 4a y 4h), altura y peso del paciente, parámetros del metabolismo de lípidos y niveles séricos de IGF-1 e IGFBP-3.
Los pacientes asignados a la cohorte de Genotropina (cohorte 4) regresaron a los centros médicos para las visitas 2 y 4, durante la 2da y la 6ta semana de tratamiento. Se realizaron los siguientes procedimientos: examen físico, signos vitales, EA, tolerabilidad local, medicamentos concomitantes, parámetros del metabolismo de glucosa (glucosa e insulina en ayunas; HbA1 C solo en V4), otros niveles hormonales (TSH, fT4, T3, cortisol), análisis de bioquímica y hematología de rutina para seguridad, altura y peso del paciente, parámetros del metabolismo de lípidos, niveles séricos de IGF-1 y BP-3 de IGF-1 (Figura 17).
Además, después de la 8a dosis de Genotropina (inicio de la semana 2 de dosificación), los pacientes asignados a la cohorte de Genotropina se asignaron al azar a uno de tres bloques y se sometieron a una toma de muestras limitada para PK/PD (4 muestras por paciente durante un período de 24 horas), de acuerdo con la Tabla 18 a continuación:
Tabla 18: Esquema de muestreo en la población con genotropina para PK y PD (Visita 2)
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Después de las primeras 6 semanas del estudio, todos los pacientes visitaron el hospital cada mes (semanas 10, 14, 18, 22 y 26). Se les pidió que los pacientes asignados a las cohortes de dosis de MOD-4023 (cohortes 1-3) regresaran 4 días después de la administración de MOD-4023 para obtener los niveles de MOD-4023, iGf -1 e IGFBP-3 y realizar evaluaciones de seguridad de rutina. Además, después de 5 meses de dosificación, se les pidió a los pacientes asignados a la dosificación con MOD-4023 que regresaran al centro médico en las horas de la mañana antes de la dosificación para obtener muestras para el nivel de valle de MOD-4023 y PD (IGF-1 y BP-3 de IGF-1). Se pidió que los pacientes asignados a la cohorte con dosis de genotropina (cohorte 4) regresaran cualquier día durante la semana de dosificación de interés.
Resultados:
Los datos demográficos del estudio de todos los pacientes se presenta en la Tabla 19 a continuación:
Tabla 19: Datos demográficos iniciales del ensayo Fase 2:
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El perfil PK promedio de MOD-4023 administrado a GHD vírgenes en su dosis administrada final se proporciona en la Figura 15 mientras que los parámetros PK se proporcionan en la Tabla 20 a continuación:
Tabla 20: Parámetros de PK promedio comparativos
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Como se esperaba, MOD-4023 administrado una vez por semana demostró un tiempo de vida media prolongado que se demostró que era 8 veces mayor en comparación con hGH diaria. Además, se observó una respuesta dependiente de la dosis como se refleja por los valores de AUC de cada dosis de MOD-4023.
La respuesta dependiente de la dosis se mantuvo a lo largo de los primeros 6 meses de administración semanal de MOD- 4023 (datos no mostrados).
El IGF-1 que es un marcador sustituto validado de la actividad hGH aumentó, además, a un nivel dependiente de la dosis (Figura 23) manteniendo los valores objetivos (por encima de la puntuación de -2 SD [SDS]de la altura) para la mayoría de la semana sin niveles excesivos (>2SDS, Figura 21). Los niveles de SDS de IGF-1 continuaron elevándose moderadamente de manera dependiente de la dosis durante los primeros 6 meses del estudio, sin alcanzar niveles excesivos que están por encima de 2SDS (Figura 16).
El brazo tratado con hGH (cohorte 4) demostró además una elevación en los valores de SDS de IGF-1 que fueron muy similares a la tendencia observada con las dos cohortes más altas de MOD-4023. Además, los valores de BP-3 de IGF-1 aumentaron además de una manera dependiente de la dosis después de que la administración de MOD-4023 alcanzó valores en estado estable alrededor de la semana 15 (Figuras 17 y 18 respectivamente). En conjunto, los dos perfiles farmacodinámicos de IGF-1 e IGF1BP-3 confirman que una sola inyección semanal de MOD-4023 puede reemplazar 7 inyecciones diarias en un intervalo de dosis similar
La velocidad de crecimiento en altura se monitoreó previo a la dosis y 6 meses después de la dosificación semanal de MOD-4023 o la dosificación diaria de hGH. Para todas las cohortes se obtuvo una excelente respuesta de crecimiento sin diferencia estadística entre las diferentes cohortes (Tabla 21 y Figura 19), lo que confirma además que la inyección semanal de MOD-4023 puede permitir el crecimiento adecuado como la hGH diaria.
Tabla 21 Velocidad de crecimiento en altura anualizada con MOD-4023 por 6 m - todos los pacientes que completaron tratamiento de 6 m
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En paralelo, se obtuvo además un aumento excelente en la SDS de la velocidad de crecimiento en altura (Tabla 22, Tabla 23 y Figura 20). Finalmente, delta de SDS de altura demostró una correlación excelente con el crecimiento de actualización de los pacientes (Figura 22).
Tabla 22: MOD-4023 Ped. Fase 2 - Resultados de SDS de HV antes del estudio
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Tabla 23: MOD-4023 Ped. Fase 2 - Resultados de SDS de HV 6 m
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Conclusión
Todas las dosis proporcionaron una buena respuesta de crecimiento de actualización. El análisis estadístico preliminar indica que no hay diferencias estadísticamente significativas entre las cohortes pero existen algunas limitaciones en cuanto al número limitado de pacientes por cohorte y los pacientes GHD relativamente graves.
Ejemplo 11
Desarrollo de la formulación de MOD-4023
La proteína: MOD-4023 es una hormona de crecimiento humana recombinante de acción prolongada (hGH) para la administración subcutánea. MOD-4023 consiste en hGH fusionada a tres copias del péptido C-terminal (CTP) de la cadena beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG); el CTP incluye cuatro sitios de O-glicosilación y por lo tanto, la proteína es una cadena simple de 275 aminoácidos con hasta doce carbohidratos enlazados a O. La proteína se produce en células CHO a partir de un clon productor.
Clon productor: El Clon # 2 fue el clon original usado para los estudios toxicológicos tempranos, Fase I y Fase II (adultos). Los datos de estabilidad para DS y DP para este clon están disponibles por hasta 2 años a -20 °C y 5 °C. La conversión a un nuevo clon productor (Clon #28) se llevó a cabo para mejorar la productividad y la estabilidad del clon. El DP del Clon # 28 respaldó los estudios toxicológicos a largo plazo y la Fase II en niños, y respaldará todas las actividades clínicas y la fabricación comercial adicionales. Los datos de estabilidad para el DP para este clon están disponibles por hasta 1 año a -20 °C y 5 °C.
CMO para la fabricación: La fabricación de MOD-4023 se ejecutó por Xcellerex (Estados Unidos) en etapas tempranas y respaldó los estudios no clínicos hasta la Fase II. El proceso se transfirió a Rentschler Biotechnologie (RB), (Alemania). Ya se produjeron dos lotes GMP en RB.
Información adicional
Propiedades fisicoquímicas -Altamente glicosilado y cargado negativamente con pl = 3-4,5
Densidad: 1,0216 g/ml
Soluble en solución acuosa
Formulación líquida para DS y DP: citrato 10 mM, NaCl 147 mM pH 6.
Concentración final de DS: 40 mg/ml
Concentración final de DP: 5, 10, 20 y 40 mg/ml
Empaque primario
Frascos 2R (Schott)
Tapones (West)
Sellos de aluminio (West)
Empaque primario futuro - Dispositivo tipo PEN
Objetivo de la optimización de la formulación
Desarrollar una formulación líquida estable para MOD-4023:
1. Primer objetivo: estabilidad por 2 años a 5 °C en frascos
2. Segundo objetivo: estabilidad por 2 años a 5 °C en cartuchos
Pruebas analíticas necesarias:
RP-HPLC (método validado)
SEC-HPLC (método validado)
CZE (TBD) (método establecido)
Cronograma:
En función de los datos de estabilidad, se pueden emplear 2 sem a 25 °C para predecir la estabilidad del producto a 5 °C para permitir una evaluación inicial para el estudio de formulación de matriz integral.
Datos de estabilidad
Los datos muestran lotes con GMP y sin GMP producidos en citrato 10 mM, NaCl 147 mM pH 6 (Figura 24). Los datos también muestran que MOD-4023 Clon 2 es estable a 5 °C durante 24 meses en 20 mg/m y que hay un perfil de estabilidad similar entre 5 mg/ml y 20 mg/ml (ver las Figuras 25A y 25B). Además, MOD-4023 Clon 2 es estable durante 3 meses a temperatura ambiente (ver la Figura 26). MOD-4023 Clon 28 es estable a 5 °C durante 12 meses a 20 mg/ml o 40 mg/ml; Especificación de pico principal de DP > 88 % (Figura 27A y Figura 27B). MOD-4023 clon 28 es estable durante al menos un mes a temperatura ambiente. (Figura 28A).
Sobre la base de la similitud entre el clon 28 y el clon 2, que es estable a 5 °C para 24 m, se espera que el clon 28 producido en Xcellerex (XC) sea estable durante 24 m a 5 °C; la especificación del pico principal de DP > 88 % (Figura 28B).
Fabricación de MOD-4023
Perfil comparable en T=0 entre DS de Xcellerex (XC) y Rentschler (RB) (Figura 29). Las Figuras 30-34 muestran diferencias en la estabilidad entre XC y RB. El enfoque isoeléctrico (IEF) demuestra que hay un patrón de banda similar en un intervalo de valor de pl de 3,5 a 4,2. En un lote de XC hay menos isoformas poco visibles en el límite de pi alto y en un lote de RB hay más isoformas poco visibles en el límite de pi bajo (Figura 35A). Además, hay bandas más difusas en la muestra de XC en comparación con la muestra de RB (Figura 35B).
Observaciones adicionales mostraron que la formación de ambos picos (3 y 5 - ver a continuación para las definiciones de los picos) depende de la temperatura y se acelera a alta temperatura (Figura 36A-D)). Además, no hubo ningún cambio en el % del pico 3 después de la incubación durante hasta 5 días a pH=4 y hasta 2 h a pH=12 (Figura 37B, 37D) y no hubo ningún cambio en el % del pico después de la incubación durante hasta 6 h a pH=4. Sin embargo, después de 6 h se observó un aumento brusco en el % del pico; en la incubación a pH 12 durante hasta 2 h - el pico desaparece (Figura 37A-D).
Estudios de degradación forzada en RB (clon 28)
Se preparó una muestra con estrés de la sustancia farmacológica MOD-4023 (65 °C durante aproximadamente tres días) para el análisis de la forma relacionada 5 en la sustancia farmacológica MOD-4023 cuando el pico está por debajo del LOQ para la muestra sin estrés.
Para analizar el efecto de pH en las formas relacionadas con RP-HPLC se analizaron tres muestras:
RB - 40 mg/ml, pH=5,9.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido modificado con péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica que comprende una hormona de crecimiento (GH), en donde un CTP se une al extremo amino de dicha hormona de crecimiento, y dos CTP de gonadotropina coriónica se unen en tándem al extremo carboxilo terminal de dicha hormona de crecimiento, que incluye opcionalmente un péptido señal unido al extremo amino de dicho un CTP, para usar en el mantenimiento de los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) dentro de un intervalo terapéutico normal de ±2 SDS en un sujeto humano durante seis meses,
en donde el sujeto es un niño deficiente de la hormona de crecimiento (GHD), y dicha hormona de crecimiento modificada con CTP se administra una vez por semana a una dosis de 0,66 mg/kg/semana.
2. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos un CTP está glicosilado.
3. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos un CTP está truncado.
4. El polipéptido modificado con CTP para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos un CTP se une opcionalmente a dicha hormona de crecimiento a través de un enlazador, en donde el enlazador puede ser un enlace peptídico.
5. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la administración da como resultado un aumento de la velocidad de crecimiento en altura anualizada de al menos aproximadamente 14,37 cm, sobre la base de un análisis intermedio después de 6 meses de tratamiento.
6. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las dosis posteriores del polipéptido modificado con CTP pueden modificarse a partir de la dosis inicial en función de los niveles de IGF-1 medidos 4 días después de la dosis anterior.
7. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los niveles de IGF-1 comprenden los niveles de IGF-1 de muestras analizadas cuatro días después de la administración de dicho polipéptido modificado con CTP.
8. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las dosis posteriores del polipéptido modificado con CTP se proporcionan semanalmente.
9. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la hormona de crecimiento es una hormona de crecimiento humana (hGH).
10. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho sujeto es un sujeto virgen.
11. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de al menos un CTP consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
12. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido señal se expone en la SEQ ID NO: 49.
13. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido modificado con CTP comprende la secuencia que se expone en los aminoácidos 27-301 de la SEQ ID NO: 39 o los aminoácidos 27-285 de la SEQ ID NO: 40.
14. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido modificado con CTP comprende la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 40.
15. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido modificado con CTP está codificado por la secuencia de ácido nucleico que se expone en la SEQ ID NO: 44 o la SEQ ID NO: 45.
16. El polipéptido modificado con CTP para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido modificado con CTP se administra en un aumento gradual de la dosis a intervalos de dos semanas hasta que se alcanza una dosis de 0,66 mg/kg/semana.
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