CN106163543A - 长效多肽以及产生和投予其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开CTP修饰的人类生长激素多肽和包含其的药物调配物和药物组合物以及产生和使用其的方法。

Description

长效多肽以及产生和投予其的方法
技术领域
公开CTP修饰的人类生长激素多肽和包含其的药物调配物和药物组合物以及产生和使用其的方法。
背景技术
多肽在血液、肝脏或肾脏中易受变性或酶促降解。因此，多肽通常具有几小时的短循环半衰期。由于其低稳定性，肽类药物通常以持续频率传递以便维持活性肽的有效血浆浓度。此外，由于肽类药物通常通过输注来投予，频繁注射肽类药物对个体造成大量不适。
不利的药物动力学(例如短血清半衰期)可能会防碍多种否则的话有前景的候选药物的药学开发。血清半衰期是分子的经验特征，并且对于每种新的潜在药物必须以实验方式测定。举例来说，在较低分子量的多肽药物的情况下，如肾过滤的生理清除机制可能由于所需给药方案的成本或频率而使得药物的治疗水平的维持不可行。相反，长血清半衰期在药物或其代谢物具有毒性副作用时非所需。
因此，需要将延长治疗多肽的半衰期，同时维持其高药理学功效的技术。此类所要肽类药物应该还符合以下要求：血清稳定性增强、活性高并且当注射到个体中时诱导非所要免疫反应的概率低。本发明通过提供具有延长的半衰期，同时维持高药理学功效，且同时具有增强的血清稳定性、高活性和在个体中诱发不合需要的免疫反应的低机率的CTP修饰的肽来满足此需要。
发明内容
在一个实施例中，本发明涉及一种包含缓冲液、张力剂和CTP修饰的多肽的药物调配物，所述多肽由生长激素和连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和两个连接到所述生长激素的羧基末端的绒膜促性腺激素CTP组成。在一个实施例中，生长激素为人类生长激素。在一个实施例中，张力剂为氯化钠。在一个实施例中，张力剂为147mM氯化钠。在一个实施例中，调配物为液体调配物。在一个实施例中，调配物在约6.2-6.4的pH下。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于向具有生长激素缺乏的个体一周投予一次的调配物。在另一实施例中，个体为成人。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏的成人。在另一实施例中，个体为儿童。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏的儿童。在另一实施例中，本发明涉及一种制造用于向具有生长激素缺乏的个体一周投予一次的药物调配物的方法，所述方法包含以下步骤：
a.通过使连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP连接而修饰所述生长激素；
b.在6.2-6.4的pH下混合步骤a.中的所述经修饰生长激素与所述缓冲液和所述张力剂；和
c.用所述调配物预填充注射器。
在一个实施例中，本发明涉及一种包含CTP修饰的多肽的用于向具有生长激素缺乏的个体一周投予一次的药物组合物，所述CTP修饰的多肽由生长激素和连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成。在一个实施例中，生长激素为人类生长激素。在另一实施例中，个体为成人。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏的成人。在另一实施例中，个体为儿童。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏的儿童。
在一个实施例中，本发明涉及一种包含本发明的药物调配物或本发明的药物组合物的每周一次剂型。
在一个实施例中，本发明涉及一种用本文提供的调配物填充注射器的方法，其包含以下步骤：
a.调配具有预定量的CTP修饰的hGH的所述CTP修饰的hGH的一周一次剂型；和
b.用所述调配物填充注射器。
本发明的其它特征和优势将根据以下实施方式实例和图式而变得显而易见。然而，应理解，实施方式和特定实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明方式给出，因为本领域的技术人员将由此实施方式而变得显而易知本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
以下图式形成本说明书的一部分且经包括以进一步展示本发明的某些方面，所述发明内容可通过参照这些图式中的一或多者以及本文中呈现的特定实施例的详细描述而更好地理解。所述专利或申请文件含有至少一个彩制图式。具有彩色图式的这一专利或专利申请具有彩色图示的此专利或专利申请公开案的复本将在请求和支付必需费用之后由专利局提供。
图1为说明MOD-4020(SEQ ID NO:36)、MOD-4021(SEQ ID NO:37)、MOD-4022(SEQID NO:38)MOD-4023(SEQ ID NO:39)和MOD-4024(SEQ ID NO:40)的分子量和标识的西方墨点法。PAGE SDS凝胶使用单克隆抗hGH抗体经印迹和染色。照片指示如同商业和野生型hGH，通过抗hGH抗体识别MOD-7020-4变异体。
图2为说明垂体切除的大鼠在投予本发明的GH-CTP多肽之后的重量增益的条形图。
图3包括两个流程：(1)CTP-hGH-CTP-CTP pCI-dhfr质体的图和(2)CTP-hGH-CTP-CTP的蛋白质结构式。
图4为显示大鼠中的单一静脉内或皮下剂量的CTP-hGH-CTP-CTP或GH(每剂量/途径的n＝3-6)之后的平均血浆CTP-hGH-CTP-CTP或GH浓度(pg/ml)的图。
图5为显示相比于每天GH注射(0.1毫克/千克/天)(每剂量的n＝10)，垂体切除的大鼠中的单一皮下剂量的CTP-hGH-CTP-CTP(0.4、0.8和4mg/Kg)之后的平均增量重量增益的图。
图6为显示与大鼠的体重增益相关的单次注射CTP-hGH-CTP-CTP之后的曲线下面积的图。
图7为显示相比于每天GH注射(0.1毫克/千克/天)(每剂量的n＝10)，垂体切除的大鼠中相隔4天的皮下剂量的CTP-hGH-CTP-CTP(0.4、0.8和4mg/Kg)之后的增量重量增益的图。
图8为显示垂体切除的大鼠在皮下注射CTP-hGH-CTP-CTP和商业hGH之后的hGH血清浓度的图。向垂体切除的大鼠皮下注射单一剂量的CTP-hGH-CTP-CTP(0.6或1.8mg/Kg)和Biotropin(0.35或1.05mg/Kg)以测定PK/PD概况。使用特异性ELISA试剂盒测量血清hGH后注射。
图9为显示垂体切除的大鼠在皮下注射CTP-hGH-CTP-CTP和商业hGH之后的IGF-1血清含量的图。向垂体切除的大鼠皮下注射单一剂量的CTP-hGH-CTP-CTP(0.6或1.8mg/Kg)和Biotropin(0.35或1.05mg/Kg)以测定PK/PD概况。使用特异性ELISA试剂盒(RocheDiagnostics)测量血清IGF-1后注射。
图10显示II期研究设计的图示。
图11显示第4每周剂量之后的IGF-1SDS-所有群体。
图12显示在向生长激素缺乏的成人皮下投予MOD-4023之后(阶段I；第4注射后)的IGF-1血浆浓度相对于基线的平均改变。
图13显示在4个月延长研究(52个患者)期间的平均IGF-1含量(在给药后第4天测定)。
图14为MOD-4023的II期临床研究的示意性图示。
图15为显示(A)；平均MOD-4023每周PK概况和(B)；平均hGH每天PK概况的图。
图16为显示MOD-4023小儿II期、6个月平均IGF-1SDS概况的图。
图17为显示在第2周期间在每一最终剂量下的MOD-4023小儿2期、IGF-1BP-3概况的图。
图18为显示MOD-4023小儿II期-6个月平均IGF-1BP-3概况的图。
图19为显示所有完成6m治疗的患者的6个月按年计算的高度速度的MOD-4023小儿II期HV结果的图。
图20为显示(A)；MOD-4023小儿II期预研究HV SDS结果和(B)；6个月HV SDS结果的图。
图21为显示每一最终剂量下的MOD-4023小儿II期-PD(IGF-1SDS)概况的图。
图22为显示Δ高度SDS的图。
图23为显示在最终剂量下相对于基线的MOD-4023小儿II期-IGF-1改变的图。
图24为显示在pH 6下在10mM柠檬酸盐，147mM NaCl中产生的非GMP和GMP批料的表。
图25A为显示-20℃下的克隆体2MOD-4023RP-HPLC稳定性的图。
图25B为显示5℃下的克隆体2MOD-4023RP-HPLC稳定性的图。
图26为显示在25℃下的克隆体2MOD-4023RP-HPLC稳定性的图。
图27A为显示在-20℃(RP-HPLC)下的克隆体28(Xcellerex)的稳定性的图。
图27B为显示在5℃(RP-HPLC)下的克隆体28(Xcellerex)稳定性的图。
图28A为显示在25℃(RP-HPLC)下的克隆体28(Xcellerex)稳定性的图。
图28B为显示在5℃(RP-HPLC)下的克隆体2和28的稳定性概况的比较的图。
图29为显示将从Xcellerex(XC)制造的MOD-4023转移到Rentschler(RB)的表。
图30A为显示Rentschler(RB)和Xcellerex(XCLX)之间的RP-HPLC稳定性结果差异-主峰的图。
图30B为显示GMP1(RB)的主峰稳定性结果的表。
图30C为显示XCLX的主峰稳定性结果(测试于RB下)的表。
图31A为显示Rentschler(RB)与Xcellerex(XCLX)之间的RP-HPLC稳定性结果差异-峰3的图。
图31B为显示GMP1(RB)的峰3稳定性结果的表。
图31C为显示XCLX的峰3稳定性结果(测试于RB下)的表。
图32A为显示Rentschler(RB)与Xcellerex(XCLX)之间的RP-HPLC稳定性结果差异-峰5的图。
图32B为显示GMP1(RB)的峰5稳定性结果的表。
图32C为显示XCLX的峰5稳定性结果(测试于RB下)的表。
图33A为显示在25℃下3个月之后的批料GMP Xcellerex的RP-HPLC的稳定性结果的图。在XC材料处未观测到峰7。
图33B为显示Rentschler处的批料GMP-1的RP-HPLC的稳定性结果的图。在XC材料处未观测到的峰7在25℃下2周之后出现。
图34为显示在25℃下3个月之后的GMP-1的RP-HPLC稳定性的图。箭头指向未在XC材料处观测到的新峰(7)。
图35A显示MOD-4023批料的IEF概况。在3.5到4.2的pI取值范围内存在类似带型。在一个XCLX批次中，在高pI边界中存在较少暗淡同功异型物。在RB批次中，在低pI边界中存在较多暗淡同功异型物。
图35B显示来自RB和XCLX(在25℃下3个月)的稳定性结果(IEF)。XCLX样品中的带更扩散。
图36A-D显示高温对峰％的效应(克隆体2)(图36A-主峰；图36D)。两个峰(3和5)的形成均为温度依赖性的且在高温下加速。(图36B和图36C)
图37A-D显示pH对峰％的效应(克隆体2)(图37A-主峰；图37D)。峰3：在pH＝4处培育至多5天和在pH＝12处培育至多2h之后，峰％无改变(图37B)。峰5：在pH＝4处培育至多6h之后，峰％无改变。但是，在6h之后，观测到峰％的急剧增加。在pH 12处培育至多2h-峰消失(图37C)。
图38显示Rentschler处的强制降解研究(克隆体28)。天然(上方)和加压(下方)MOD-4023原料药的缩放重叠。制备MOD-4023(CTP-hGH-CTP-CTP)原料药的加压样品(65℃下持续约三天)用于MOD-4023原料药中的相关形式5的分析，因为峰在未加压样品的LOQ下方。
图39显示关于RP-HPLC相关形式的pH效应。测试样品：RB-40mg/ml，pH＝5.9；RB-10mg/ml，pH＝6.2；XCLX-40mg/ml，pH＝6.2。
具体实施方式
本申请要求2013年10月21日提交的美国专利申请案公开号US-2014-0113860-A1的权益且要求2014年6月19日提交的美国专利申请案序号14/309,496的权益。这些申请案以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，本发明涉及一种包含缓冲液、张力剂和CTP修饰的多肽的药物调配物，所述多肽由生长激素和连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和两个连接到所述生长激素的羧基末端的绒膜促性腺激素CTP组成。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于向具有生长激素缺乏的个体一周投予一次的调配物。在另一实施例中，个体为成人。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏的成人。在另一实施例中，个体为儿童。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏的儿童。在另一实施例中，本发明涉及一种制造用于向具有生长激素缺乏的个体一周投予一次的药物调配物的方法，所述方法包含以下步骤：
a.通过使连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP连接而修饰所述生长激素；
b.在6.2-6.4的pH下混合步骤a.中的所述经修饰生长激素与所述缓冲液和所述张力剂；和
c.用所述调配物预填充注射器。
在一个实施例中，本发明涉及一种用本文提供的调配物填充注射器的方法，其包含以下步骤：
c.调配具有预定量的CTP修饰的人类生长激素(hGH)的所述CTP修饰的hGH的一周一次剂型；和
d.用所述调配物填充注射器。
在一个实施例中，本发明描述长效多肽以及产生和使用其的方法。在另一实施例中，长效多肽包含人类绒膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。在另一实施例中，CTP充当针对蛋白质或由此衍生的肽的降解的保护剂。在另一实施例中，CTP延长蛋白质或由此衍生的肽的循环半衰期。在一些实施例中，CTP增强蛋白质或由此衍生的肽的效能。
在另一实施例中，“CTP肽”、“羧基末端肽”、“CTP序列”和“绒膜促性腺激素C端肽”在本文中可互换地使用。在另一实施例中，羧基末端肽为全长CTP。在另一实施例中，羧基末端肽为截短CTP。每一可能性代表本发明的一个独立实施例。
在另一实施例中，“信号序列”和“信号肽”在本文中可互换地使用。在另一实施例中，当“序列”关于聚核苷酸时可指编码部分。每一可能性代表本发明的一个独立实施例。
在另一实施例中，“所关注的肽”和“所关注的多肽序列”在本文中可互换地使用。在另一实施例中，所关注的肽为全长蛋白质。在另一实施例中，所关注的肽为蛋白质片段。每一可能性代表本发明的一个独立实施例。
在另一实施例中，本发明提供一种包含由生长激素、连接到生长激素的氨基末端的单一绒膜促性腺激素羧基末端肽和连接到生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素羧基末端肽组成的多肽的药物调配物。在另一实施例中，本发明提供一种包含由生长激素、连接到生长激素的氨基末端的单一绒膜促性腺激素羧基末端肽、连接到生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素羧基末端肽和连接到一个绒膜促性腺激素羧基末端肽的氨基末端的信号肽组成的多肽的药物调配物。在另一实施例中，药物调配物进一步包含缓冲液和张力剂。在另一实施例中，缓冲液为10mM柠檬酸盐且张力剂为147mM NaCl。在一个实施例中，调配物在约6.0的pH下。在另一实施例中，调配物在约6.2的pH下。在另一实施例中，调配物在约6.4的pH下。在另一实施例中，调配物在约6.0-6.4的pH范围内。在一个实施例中，缓冲液为10mM柠檬酸盐，张力剂为147mM NaCl，且pH为6.0。在另一实施例中，调配物为液体调配物。
在另一实施例中，本文提供一种包含本文提供的药物调配物的每周一次剂型。
在另一实施例中，本发明提供包含由生长激素、连接到生长激素的氨基末端的单一绒膜促性腺激素羧基末端肽和连接到生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素羧基末端肽组成的多肽的药物组合物。在另一实施例中，本发明提供包含由生长激素、连接到生长激素的氨基末端的单一绒膜促性腺激素羧基末端肽、连接到生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素羧基末端肽和连接到一个绒膜促性腺激素羧基末端肽的氨基末端的肽组成的多肽的药物组合物。
在另一实施例中，相比于无CTP的相同生长激素，包含如本文所述的CTP的生长激素具有增强的体内生物活性。在另一实施例中，相比于无CTP的相同生长激素，包含至少一个连接到氨基末端的CTP和至少两个连接到羧基末端的CTP的生长激素具有增强的体内生物活性。在另一实施例中，相比于无CTP的相同生长激素，包含一个连接到氨基末端的CTP和两个连接到羧基末端的CTP的生长激素具有增强的体内生物活性。
在另一实施例中，提供包含至少两个连接到所关注的多肽序列的绒膜促性腺激素的羧基末端肽(CTP)序列的多肽，其中至少两个CTP序列的第一CTP序列连接到所关注的多肽序列的氨基末端且至少两个CTP序列的第二CTP序列连接到所关注的多肽序列的羧基末端。在另一实施例中，羧基末端肽(CTP)序列为人类绒膜促性腺激素。
在另一实施例中，个体为人类个体。在一个实施例中，人类个体为生长激素缺乏的。在一个实施例中，个体为生长激素缺乏的。在另一实施例中，个体为宠物。在另一实施例中，个体为哺乳动物。在另一实施例中，个体为农畜。在另一实施例中，个体为狗。在另一实施例中，个体为猫。在另一实施例中，个体为猴。在另一实施例中，个体为马。在另一实施例中，个体为母牛。在另一实施例中，个体为小鼠。在另一实施例中，个体为大鼠。在一个实施例中，个体为男性。在另一个实施例中，个体为女性。在另一实施例中，个体为生长激素缺乏(GHD)的成人。在另一实施例中，个体为青春期前生长激素缺乏(GHD)的儿童。如本文中所展示，各种剂量的MOD-4023(CTP-hGH-CTP-CTP)在青春期前儿童中提供良好匹配生长反应(参见实例10)。
在另一实施例中，短语“所关注的多肽序列”是指任何多肽序列，如包含生物活性的多肽序列。在另一实施例中，肽为糖基化的。在另一实施例中，肽为非糖基化的。受益于循环半衰期的延长的多肽的实例包括(但不限于)红细胞生成素(EPO)、干扰素、人类生长激素(hGH)和升糖素样肽-1(GLP-1)。在一个实施例中，多肽为生长激素(GH)。在另一实施例中，多肽为人类生长激素(hGH)。
在一个实施例中，如本文所述的CTP-生长激素-CTP-CTP的配置包含经由与至少一个CTP单元的连接子连接的生长激素或其活性片段。在一个实施例中，连接子为肽键。在另一实施例中，如本文所述的CTP-生长激素-CTP-CTP的配置包含经由与至少一个CTP单元的肽键连接的生长激素或其活性片段。在另一实施例中，如本文所述的CTP-生长激素-CTP-CTP包含经由与至少一个CTP单元的肽键连接的生长激素或其活性片段，所述CTP单元经由肽键连接至额外CTP单元。在另一实施例中，包含其生长激素片段和CTP单元和/或其片段的如本文所述的多肽经由肽键互连。在另一实施例中，一个核酸分子编码包含生长激素和/或其片段和CTP单元和/或其片段的如本文所述多肽。
在另一实施例中，羧基末端肽(CTP)经由连接子连接到所关注的多肽序列。在另一实施例中，至少一个CTP任选地经由连接子连接到所述所关注的多肽序列。在另一实施例中，将CTP序列连接到所关注的多肽序列的连接子为共价键。在另一实施例中，将CTP序列连接到所关注的多肽序列的连接子为肽键。在另一实施例中，将CTP序列连接到所关注的多肽序列的连接子为经取代肽键。在另一实施例中，羧基末端肽(CTP)序列包含选自SEQ ID NO:48中阐述的序列的氨基酸序列。
在另一实施例中，SEQ ID NO:48包含以下氨基酸(AA)序列：DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILQ(SEQ ID NO:48)。
在另一实施例中，人类绒膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)融合到蛋白质。在另一实施例中，人类绒膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)融合到所述蛋白质的肽。在一个实施例中，蛋白质或其肽为生长激素。在一个实施例中，蛋白质或其肽为人类生长激素。在另一实施例中，人类hCG的羧基末端肽(CTP)融合到糖蛋白。在另一实施例中，hCG的羧基末端肽(CTP)融合到糖蛋白激素。在另一实施例中，hCG的CTP融合到衍生自糖蛋白激素的肽。在一些实施例中，糖蛋白激素包含EPO、FSH或TSH和由此衍生的肽。
在一些实施例中，多肽的氨基末端处和多肽的羧基末端处的CTP序列均提供针对蛋白质的降解的加强保护。在一些实施例中，多肽的氨基末端处和多肽的羧基末端处的CTP序列均提供连接蛋白质的经延长半衰期。
在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、多肽的羧基末端处的CTP序列和在羧基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供针对蛋白质的降解的加强保护。在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、多肽的羧基末端处的CTP序列和在羧基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供连接蛋白质的经延长半衰期。在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、多肽的羧基末端处的CTP序列和在羧基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供连接蛋白质的经增强活性。
在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、多肽的羧基末端处的CTP序列和在氨基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供针对蛋白质的降解的加强保护。在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、多肽的羧基末端处的CTP序列和在氨基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供连接蛋白质的经延长半衰期。在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、多肽的羧基末端处的CTP序列和在氨基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供连接蛋白质的经增强活性。
在一些实施例中，生长激素的氨基末端处和生长激素的羧基末端处的CTP序列均提供针对生长激素的降解的加强保护。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的至少一个CTP序列和生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提供针对清除的加强保护。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的至少一个CTP序列和生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提供延长的清除时间。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的至少一个CTP序列和生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提高生长激素的Cmax。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的至少一个CTP序列和生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提高生长激素的Tmax。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的至少一个CTP序列和生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提高T1/2。
在一些实施例中，生长激素的氨基末端处和生长激素的羧基末端处的CTP序列均延长经修饰生长激素的半衰期。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的至少单一CTP序列和生长激素的羧基末端处的至少两个CTP序列为经修饰生长激素提供延长的半衰期。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的单一CTP序列和生长激素的羧基末端处的两个CTP序列为连接的生长激素提供延长的半衰期。在另一实施例中，生长激素的氨基末端处的单一CTP序列和生长激素的羧基末端处串列的两个CTP序列为经修饰生长激素提供延长的半衰期。
在一些实施例中，多肽的氨基末端处的CTP序列、生长激素的羧基末端处的CTP序列和在羧基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列提供针对生长激素的降解的加强保护。在一些实施例中，生长激素的氨基末端处的CTP序列、生长激素的羧基末端处的CTP序列和在羧基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列延长生长激素的半衰期。在一些实施例中，生长激素的氨基末端处的CTP序列、生长激素的羧基末端处的CTP序列和在羧基末端处与CTP序列串列连接的至少一个额外CTP序列增强生长激素的生物活性。
在一个实施例中，至少一个CTP的序列由选自由以下各者组成的群组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。在另一实施例中，本发明的羧基末端肽(CTP)肽包含如SEQ ID NO:17中阐述的氨基酸112到人类绒膜促性腺激素的位置145的氨基酸序列。在另一实施例中，本发明的CTP序列包含如SEQ ID NO:18中阐述的氨基酸118到人类绒膜促性腺激素的位置145的氨基酸序列。在另一实施例中，CTP序列也从位置112-118之间的任何位置开始且在人类绒膜促性腺激素的位置145处结束。在一些实施例中，CTP序列肽的长度为28、29、30、31、32、33或34个氨基酸且在CTP氨基酸序列的位置112、113、114、115、116、117或118处开始。
在另一实施例中，CTP肽为如美国专利第5,712,122号中所述，通过1-5个保守氨基酸取代不同于天然CTP的绒膜促性腺激素CTP的变异体。在另一实施例中，CTP肽为通过1个保守氨基酸取代不同于天然CTP的绒膜促性腺激素CTP的变异体。在另一实施例中，CTP肽为通过2个保守氨基酸取代不同于天然CTP的绒膜促性腺激素CTP的变异体。在另一实施例中，CTP肽为通过3个保守氨基酸取代不同于天然CTP的绒膜促性腺激素CTP的变异体。在另一实施例中，CTP肽为通过4个保守氨基酸取代不同于天然CTP的绒膜促性腺激素CTP的变异体。在另一实施例中，CTP肽为通过5个保守氨基酸取代不同于天然CTP的绒膜促性腺激素CTP的变异体。在另一实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少70％同源。在另一实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少80％同源。在另一实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少90％同源。在另一实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少95％同源。
在另一实施例中，本发明的CTP肽DNA序列与天然CTPDNA序列或其肽至少70％同源。在另一实施例中，本发明的CTP肽DNA序列与天然CTPDNA序列或其肽至少80％同源。在另一实施例中，本发明的CTP肽DNA序列与天然CTPDNA序列或其肽至少90％同源。在另一实施例中，本发明的CTP肽DNA序列与天然CTPDNA序列或其肽至少95％同源。
在一个实施例中，绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个经截短。在另一实施例中，两个绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列均经截短。在另一实施例中，绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个经截短。在另一实施例中，绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个经截短。在另一实施例中，所有绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列经截短。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的前10个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ IDNO:43的前11个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的前12个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的前13个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的前14个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的前15个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的前16个氨基酸。在一个实施例中，截短CTP包含SEQ ID NO:43的后14个氨基酸。
在一个实施例中，绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个为糖基化的。在另一实施例中，两个绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列均经为糖基化的。在另一实施例中，绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个为糖基化的。在另一实施例中，绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个为糖基化的。在另一实施例中，所有绒膜促性腺激素CTP氨基酸序列为糖基化的。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含至少一个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含2个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含3个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含4个糖基化位点。每一可能性代表本发明的一个独立实施例。
在一些实施例中，根据本发明的“同源性”也涵盖缺失、插入或取代变异体，包括其氨基酸取代，和其生物活性多肽片段。
在一些实施例中，根据本发明的教示利用人类生长激素(hGH)。在一些实施例中，CTP序列与hGH蛋白质的氨基和羧基末端两者的连接导致增加的效能(图2、3、5、7和9)。在一些实施例中，CTP序列与hGH蛋白质的氨基和羧基末端两者的连接导致延长的体内活性。在一个实施例中，本发明的CTP-hGH多肽阐述于SEQ ID NO:39-41中。
如本文所提供，在注射CTP-hGH在垂体切除的大鼠(分泌)中展示生长增益。如本文另外提供，在青春期前生长激素缺乏的儿童中展示与患者的追赶生长具有极好的相关性的生长增益(参见本文中的实例10)。
在一个实施例中，本文提供一种实现青春期前生长激素缺乏的儿童的正常生长恢复的方法，所述方法包含投予包含本文提供的CTP修饰的生长激素的药物组合物。在另一实施例中，本文提供一种实现青春期前生长激素缺乏的儿童的生长恢复的方法，所述方法包含投予包含本文提供的CTP修饰的生长激素的药物组合物。
在一个实施例中，短语“人类生长激素”(hGH)是指展现hGH活性(即刺激生长)的如Genbank寄存编号P01241(SEQ ID NO:47)中阐述的多肽。
在另一实施例中，“人类生长激素”(hGH)是指展现hGH活性(即刺激生长)的如Genbank寄存编号P01241中阐述的多肽。在另一实施例中，本发明的“GH”也指同源物。在另一实施例中，本发明方法和组合物的GH氨基酸序列与本文中阐述的GH序列至少50％同源，其使用国家的生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件，使用默认参数测定。在另一实施例中，同源性％为60％。在另一实施例中，同源性％为70％。在另一实施例中，同源性％为80％。在另一实施例中，同源性％为90％。在另一实施例中，同源性％为至少95％。在另一实施例中，同源性％大于95％。每一可能性代表本发明的一个独立实施例。
本发明的示例性CTP-GH多肽和CTP-hGH多肽阐述于SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41中。
在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的生长激素(GH)肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽的GH肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于刺激肌肉生长。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于刺激肌肉生长。
在一个实施例中，本发明提供一种减少个体中的生长激素的给药频率的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此减少个体中的生长激素的给药频率。
在另一实施例中，本发明提供一种提高个体中的生长激素的曲线下面积(AUC)的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此减少个体中的生长激素的给药频率。
在另一实施例中，本发明提供一种包含由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽的调配物，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，其中所述调配物具有增加的稳定性。在一个实施例中，调配物稳定至少一年。在另一实施例中，调配物稳定至少两年。
在一个实施例中，本发明提供一种治疗需要GH疗法的个体的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此减少个体中的生长激素的给药频率。
在另一实施例中，本发明提供一种增加个体中的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此增加个体中的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量。
在另一实施例中，本发明提供一种维持个体中的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此维持个体中的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量。在另一实施例中，IGF-1含量保持于界定范围内，其如本文另外提供。
在另一实施例中，本发明提供一种在界定范围内增加和维持个体中的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成的多肽，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此在界定范围内增加和维持个体中的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量。
在另一实施例中，界定范围为通过投予本文提供的CTP修饰的生长激素实现的治疗剂量范围。在另一实施例中，界定范围为在连续投予如本文另外提供的CTP修饰的生长激素之后维持IGF-1的正弦特性的Cmax和Ctrough的范围(参见实例15)。在另一实施例中，界定范围为在个体中具有极好的反应性且具有剂量修饰的最小需要的连续投予本文提供的CTP修饰的生长激素的治疗剂量范围。在另一实施例中，界定范围与被认为正常的个体中的IGF-1含量范围类似。在另一实施例中，界定范围为正常个体中的IGF-1含量/值的正常范围。在另一实施例中，当IGF-1SDS值在±2SDS内时，界定范围在正常范围内。
在另一实施例中，本发明的方法提供本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于刺激骨骼生长。
在另一实施例中，本发明的方法提供核酸序列，其编码本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于刺激骨骼生长。
在另一实施例中，本发明的经结合生长激素以与未修饰生长激素相同的方式使用。在另一实施例中，本发明的经结合生长激素具有增加的循环半衰期和等离子体滞留时间、减少的清除率和增加的体内临床活性。在另一实施例中，由于如本文所述的经结合生长激素的改进的特性，这些结合物比未修饰生长激素较不频繁地投予。在另一实施例中，如本文所述的经结合生长激素一周投予一次到每两周投予一次。在另一实施例中，如本文所述的经结合生长激素每两周投予一次到每三周投予一次。在另一实施例中，如本文所述的经结合生长激素一天投予一次到一周投予三次。在另一实施例中，减少的投予频率将导致改进的患者顺应性，导致改进的治疗结果，以及改进的患者生活质量。在另一实施例中，相比于连接到聚(乙二醇)的生长激素的常规结合物，已发现具有本发明的结合物的分子量和连接子结构的生长激素CTP结合物具有改进的效能、改进的稳定性、升高的AUC含量、增强的循环半衰期。在另一实施例中，相比于连接到聚(乙二醇)的生长激素的常规结合物，已发现具有本发明的结合物的分子量和连接子结构的生长激素具有改进的效能、改进的稳定性、升高的AUC含量、增强的循环半衰期。在另一实施例中，经结合生长激素的治疗有效量为体内可测量的预期生物活性所需的结合物的量。在另一实施例中，根据本发明的教示利用的生长激素展现增加的效能。在一些实施例中，CTP序列与生长激素的氨基和羧基末端两者的连接导致延长的体内活性。
在另一实施例中，经结合生长激素的治疗有效量根据如治疗的病况的精确类型、治疗的患者的病况以及组合物中的其它成分测定。在另一实施例中，经结合生长激素的治疗有效量为一周投予一次的每千克体重0.01到10μg。在另一实施例中，经结合生长激素的治疗有效量为一周投予一次的每千克体重0.1到1μg。在另一实施例中，包含经结合生长激素的药物组合物以有效地通过各种方法向人类患者投予的浓度调配。
在另一实施例中，生长激素为所属领域的技术人员已知的任何生长激素。在另一实施例中，生长激素为人类生长激素。在另一实施例中，生长激素为非人类生长激素。在另一实施例中，生长激素的核苷酸序列和/或氨基酸序列为基因库资料库中可获得的。在另一实施例中，生长激素为同源物。在另一实施例中，同源物也指缺失、插入或取代变异体，包括其氨基酸取代和其生物活性多肽片段。
在另一实施例中，生长激素为缺失外显子2、3、4的hGH的变异体或其任何组合。在另一实施例中，生长激素包含信号肽。在另一实施例中，生长激素包含信号裂解位点。在另一实施例中，包含通过本发明的CTP修饰的GH的多肽包含重组GH。
在另一实施例中，本发明的方法提供本发明的GH肽以用于维持肌肉质量。
在另一实施例中，本发明的方法提供本发明的GH以用于维持骨骼质量。
在另一实施例中，本发明的方法提供本发明的GH-CTP核酸序列以用于维持骨骼质量。
在另一实施例中，本发明的方法提供本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于治疗消耗病。
在另一实施例中，本发明的方法提供核酸序列，其编码本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于治疗消耗病。
在另一实施例中，本发明的方法提供本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于增加心脏功能。
在另一实施例中，本发明的方法提供核酸序列，其编码本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于增加心脏功能。
在另一实施例中，本发明的方法提供本文所述的GH肽，用于增加脂肪分解。
在另一实施例中，本发明的方法提供核酸序列，其编码本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于增加脂肪分解。
在另一实施例中，本发明的方法提供本文所述的CTP修饰的GH肽中的任一者，用于改进流体平衡。
在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为AAA72260的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为AAK69708的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为CAA01435的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为CAA01329的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为CAA00380的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为AAA72555的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为NP_000506.2的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为NP_072053.1的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为NP_072054.1的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为NP_072055.1的基因库氨基酸寄存序列。在另一实施例中，本发明的生长激素包含寄存编号为NP_072056.1的基因库氨基酸寄存序列。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进流体平衡。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于改进流体平衡。在一个实施例中，本发明的方法提供编码在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽的GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，用于改进流体平衡。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于改进流体平衡。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ IDNO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于改进流体平衡。
在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的GH肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽的GH肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于治疗骨质疏松。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸,所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于治疗骨质疏松。
在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的GH肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽的GH肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供在SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于抑制骨质疏松。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于抑制骨质疏松。
在另一实施例中，本发明的方法提供本发明的GH肽以用于改进运动能力。
在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的GH肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽的GH肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于改进肺功能。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的GH肽的核酸序列，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于改进肺功能。
在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的GH肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽的GH肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于改进免疫性。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，其在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，其在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQID NO:45的核酸，其在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于改进免疫性。
在另一实施例中，本发明的方法提供GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供GH肽，其在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于再生重要器官。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于再生重要器官。
在另一实施例中，本发明的方法提供本发明的GH肽以用于增加幸福感。
在另一实施例中，本发明的方法提供GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供GH肽，其在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:23中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:36中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:37中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:38中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:39中阐述的GH肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:40中阐述的GH肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:41中阐述的GH肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供SEQ ID NO:42中阐述的GH肽，其在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供通过如本文所提供的CTP修饰的GH肽，用于恢复REM睡眠。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的核酸序列，所述GH肽在N端上另外具有一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有两个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在一个实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:44的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含一个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQ ID NO:45的核酸，所述GH肽在N端上包含一个CTP氨基酸肽且在C端上包含两个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。在另一实施例中，本发明的方法提供编码GH肽的SEQID NO:46的核酸和N端上的一个CTP氨基酸肽和C端上的两个CTP氨基酸肽，用于恢复REM睡眠。
在另一实施例中，本发明的方法提供编码如本文所述的GH蛋白质的核酸序列。在另一实施例中，本发明的方法提供编码多肽的核酸序列，所述多肽包含通过CTP修饰的hGH，用于刺激肌肉生长、增加心脏功能、刺激骨骼生长、维持肌肉完整性、均衡肌肉代谢、诱发肌肉积聚、诱发重新肌肉积聚、增强骨骼负载、治疗与骨质疏松相关的症状、治疗消耗病、增加脂肪分解、改进流体平衡、治疗骨质疏松、改进肺功能、改进免疫性、再生重要器官、增加幸福感、恢复REM睡眠或其任何组合。
在一些实施例中，根据本发明的“同源性”也涵盖缺失、插入或取代变异体，包括其氨基酸取代，和其生物活性多肽片段。在一个实施例中，取代变异体为hGH的位置65的谷氨酰胺经缬氨酸取代的变异体[Gellerfors等人,《药学和生物医学分析杂志(J PharmBiomed Anal)》1989,7:173-83]。
在另一实施例中，如本文所述的编码生长激素的核酸分子编码所属领域的技术人员已知的生长激素的任何氨基酸序列。在另一实施例中，如本文所述的编码生长激素的核酸分子编码hGH。在另一实施例中，编码生长激素的核酸分子包含寄存编号为NM_000515.3的基因库核酸寄存序列。在另一实施例中，编码生长激素的核酸分子包含寄存编号为NM_022559.2的基因库核酸寄存序列。在另一实施例中，编码生长激素的核酸分子包含寄存编号为NM_022560.2的基因库核酸寄存序列。在另一实施例中，编码生长激素的核酸分子包含寄存编号为NM_022561.2的基因库核酸寄存序列。在另一实施例中，编码生长激素的核酸分子包含寄存编号为NM_022562.2的基因库核酸寄存序列。
在一个实施例中，同源物也指缺失、插入或取代变异体，包括其氨基酸取代和其生物活性多肽片段。
在另一实施例中，所关注的多肽序列为hGH。在另一实施例中，所关注的多肽序列为包括任何修饰形式的肽或蛋白质。
在另一实施例中，本发明的方法提供在N端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽且在C端上另外具有至少一个CTP氨基酸肽的hGH，用于治疗消耗病、AIDS、恶病体质或hGH缺乏。
在一个实施例中，本发明用于兽医学中。在一个实施例中，本发明提供家养哺乳动物的治疗，所述哺乳动物维持为人类伴侣(例如狗、猫、马)，具有显著商业价值(例如奶牛、肉牛、竞赛动物)，具有显著科学价值(例如濒危物种的捕获或自由样本)，或另外具有价值。
在一些实施例中，CTP序列修饰在允许使用较低剂量中有利。
在一些实施例中，如本文所用的“多肽”涵盖天然多肽(降解产物、以合成方式合成的多肽或重组多肽)和肽模拟物(通常为合成多肽)，以及类肽和半类肽，其为多肽类似物，在一些实施例中，具有使得多肽在身体中时更稳定或更能够渗透到细胞中的修饰。
在一些实施例中，修饰包括(但不限于)N末端修饰、C末端修饰、多肽键修饰(包括(但不限于)CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟化合物的方法在所属领域中是熟知的并且例如说明于《定量药物设计(Quantitative Drug Design)》,C.A.Ramsden Gd.,第17.2章,F.卓别林培格曼出版社(F.Choplin Pergamon Press)(1992)中，所述文献以引用的方式并入，就如同本文中充分阐述一般。下文提供关于这方面的其它细节。
在一些实施例中，多肽内的多肽键(-CO-NH-)经取代。在一些实施例中，多肽键经N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)取代。在一些实施例中，多肽键经酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在一些实施例中，多肽键经酮亚甲基键(-CO-CH2-)取代。在一些实施例中，多肽键经α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-，其中R是任何烷基，例如甲基)、卡巴键(carba bond)(-CH2-NH-)取代。在一些实施例中，多肽键经羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)取代。在一些实施例中，多肽键经硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在一些实施例中，多肽键经烯烃双键(-CH＝CH-)取代。在一些实施例中，多肽键经逆酰胺键(-NH-CO-)取代。在一些实施例中，多肽键经多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代，其中R为自然地呈现于碳原子上的“正常”侧链。在一些实施例中，这些修饰出现于沿多肽链的任一键处且甚至同时出现于若干(2-3个键)处。
在一个实施例中，用合成非天然酸取代多肽的天然芳族氨基酸(例如Trp、Tyr和Phe)，所述合成非天然酸为如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或邻甲基-Tyr。在一些实施例中，本发明的多肽包括一或多种经修饰的氨基酸或一或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施例中，“氨基酸(amino acid/amino acids)”理解为包括20种天然存在的氨基酸；通常经体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它非寻常氨基酸，包括(但不限于)2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施例中，“氨基酸”包括D-和L-氨基酸两者。
在一些实施例中，本发明的多肽用于需要多肽呈可溶形式的治疗剂中。在一些实施例中，本发明的多肽包括一或多种非天然或天然极性氨基酸，包括(但不限于)丝氨酸和苏氨酸，其由于其含羟基侧链而能够增加多肽溶解性。
在一些实施例中，本发明的多肽以线性形式利用，但所属领域的技术人员应了解，在环化不严重干扰多肽特征的情况下，也可利用环状形式的多肽。
在一些实施例中，本发明的多肽为生物化学合成的，如通过使用标准固相技术。在一些实施例中，这些生物化学方法包括排他性固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典溶液合成。在一些实施例中，当多肽相对较短(约5-15kDa)时和/或当其无法通过重组技术产生(即，并非由核酸序列编码)并且因此涉及不同化学反应时使用这些方法。
在一些实施例中，固相多肽合成程序为所属领域技术人员所熟知并且由JohnMorrow Stewart和Janis Dillaha Young,《固相多肽合成(Solid Phase PolypeptideSyntheses)》(第2版,Pierce Chemical Company,1984)进一步描述。在一些实施例中，合成多肽通过制备型高效液相色谱[Creighton T.(1983)《蛋白质，结构和分子原理(Proteins,structures and molecular principles.)》WH Freeman and Co.纽约]纯化且其组成可经由通过所属领域的技术人员已知的方法的氨基酸测序确认。
在一些实施例中，重组蛋白技术用于产生本发明的多肽。在一些实施例中，重组蛋白技术用于产生相对较长多肽(例如长于18-25个氨基酸)。在一些实施例中，重组蛋白技术用于产生大量本发明的多肽。在一些实施例中，重组技术由Bitter等人,(1987)《酶学方法》153:516-544，Studier等人(1990)《酶学方法》185:60-89，Brisson等人(1984)《自然》310:511-514，Takamatsu等人(1987)《欧洲分子生物学杂志》6:307-311，Coruzzi等人(1984)《欧洲分子生物学杂志》3:1671-1680和Brogli等人,(1984)《科学》224:838-843，Gurley等人(1986)《分子与细胞生物学》6:559-565和Weissbach与Weissbach,1988,《植物分子生物学方法》学术出版社,纽约,第VIII部分,第421-463页。
在一个实施例中，本发明的多肽使用本发明的编码多肽的聚核苷酸合成。在一些实施例中，编码本发明的多肽的聚核苷酸接合到表达载体中，包含转录控制顺式调控序列(例如启动子序列)。在一些实施例中，顺式调控序列适用于指导本发明的多肽的组成性表达。在一些实施例中，顺式调控序列适用于指导本发明的多肽的组织特异性表达。在一些实施例中，顺式调控序列适用于指导本发明的多肽的诱导型表达。
在一些实施例中，表达本发明的的多肽的聚核苷酸如SEQ ID NO:44、45和46中所阐述。
在一些实施例中，适合用于本发明的组织特异性启动子包括在特异性细胞群体中起作用的序列，实例包括(但不限于)启动子，如肝脏特异性白蛋白[Pinkert等人,(1987)《基因与发育(Genes Dev.)》1:268-277]、淋巴特异性启动子[Calame等人,(1988)《免疫学进展(Adv.Immunol.)》43:235-275]；尤其为T细胞受体启动子[Winoto等人,(1989)《欧洲分子生物学杂志》8:729-733]和免疫球蛋白；[Banerji等人(1983)《细胞(Cell)》33729-740]、神经元特异性启动子，如神经丝启动子[Byrne等人(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:5473-5477]、胰腺特异性启动子[Edlunch等人(1985)《科学》230:912-916]或乳腺特异性启动子，如乳清启动子(美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开第264,166号)。适合用于本发明的诱导型启动子包括例如四环素诱导型启动子(Srour,M.A.等人,2003.《血栓形成与止血(Thromb.Haemost.)》90:398-405)。
在一个实施例中，短语“聚核苷酸”是指以RNA序列、互补聚核苷酸序列(cDNA)、基因组聚核苷酸序列和/或复合聚核苷酸序列(例如上述的组合)形式分离并且提供的单链或双链核酸序列。
在一个实施例中，“互补聚核苷酸序列”是指由使用逆转录酶或任何其它RNA依赖型DNA聚合酶逆转录信使RNA产生的序列。在一个实施例中，所述序列可以随后使用DNA聚合酶体内或体外扩增。
在一个实施例中，“基因组聚核苷酸序列”是指由染色体衍生(分离)的序列并且因此其表示染色体的邻接部分。
在一个实施例中，“复合聚核苷酸序列”是指至少部分互补并且至少部分基因组的序列。在一个实施例中，复合序列可以包括用于编码本发明的多肽所需的一些外显子序列以及插入在其间的一些内含子序列。在一个实施例中，内含子序列可以具有任何来源，包括具有其它基因，并且通常将包括保守拼接信号序列。在一个实施例中，内含子序列包括顺式作用表达调控元件。
在一个实施例中，本发明的聚核苷酸另外包含编码信号肽的信号序列，用于分泌本发明的多肽。在一些实施例中，信号序列包括(但不限于)如SEQ ID NO:19中阐述的用于EPO的内源性信号序列或如SEQ ID NO:26中阐述的用于IFN-β1的内源性信号序列。在另一实施例中，信号序列在CTP序列的N端，所述CTP序列转而在所关注的多肽序列的N端；例如序列为(a)信号序列-(b)CTP-(c)所关注的序列-(d)任选地1个或更多个额外CTP序列。在另一实施例中，1个或更多个CTP序列插入所关注的多肽序列的信号序列与所关注的多肽序列自身之间，因此中断所关注的野生型序列。每一可能性代表本发明的一个独立实施例。
在另一实施例中，生长激素进一步包含信号肽。在一些实施例中，信号序列包括(但不限于)内源性信号序列。在一些实施例中，信号序列包括(但不限于)任何一或多种已知生长激素的内源性信号序列。在另一实施例中，本发明的多肽和方法提供另外具有包含以下氨基酸序列的信号肽的生长激素：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(SEQ ID NO:49)。
在一个实施例中，在表达和分泌之后，信号肽从前驱蛋白质裂解，产生成熟蛋白质。
在一些实施例中，本发明的聚核苷酸使用PCR技术，使用所属领域的技术人员已知的程序和方法制备。在一些实施例中，所述程序涉及接合两个不同DNA序列(参看例如《最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel等人编,John Wiley&Sons,1992)。
在一个实施例中，本发明的聚核苷酸插入到表达载体(即，核酸构筑体)中以使得能够表达重组多肽。在一个实施例中，本发明的表达载体包括使得此载体适合于原核生物中的复制和整合的额外序列。在一个实施例中，本发明的表达载体包括使得此载体适合于真核生物中的复制和整合的额外序列。在一个实施例中，本发明的表达载体包括是的此载体适合于原核生物和真核生物两者中的复制和整合的穿梭载体。在一些实施例中，克隆载体包含转录与翻译起始序列(例如启动子、强化子)和转录与翻译终止子(例如聚腺苷酸化信号)。
在一个实施例中，多种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统以表达本发明的多肽。在一些实施例中，这些宿主表达系统包括(但不限于)微生物，如经含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质体DNA或粘质体DNA表达载体转型的细菌；经含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转型的酵母；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或经含有多肽编码序列的重组质体表达载体(例如Ti质粒)转型的植物细胞系统。
在一些实施例中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统，如CHO细胞)来表达本发明的多肽。在一个实施例中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的聚核苷酸的表达载体是包含CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。根据一个实施例，在实例1和图3中描述pCI-dhfr载体的构筑。
在一些实施例中，在本发明的细菌系统中，可有利地取决于打算用于所表达的多肽的用途来选择多种表达载体。在一个实施例中，需要大量的多肽。在一个实施例中，需要指导高水平的蛋白质产物表达的载体，所述蛋白质产物可能与疏水性信号序列融合，所述疏水性信号序列将表达的产物指导到细菌的周质或容易纯化蛋白质产物的培养基中。在一个实施例中，某些融合蛋白经特定裂解位点工程改造以帮助回收多肽。在一个实施例中，适于所述操纵的载体包括(但不限于)pET系列的大肠杆菌(E.coli)表达载体[Studier等人,《酶学方法(Methods in Enzymol.)》185:60-89(1990)]。
在一个实施例中，使用酵母表达系统。在一个实施例中，如美国专利第5,932,447号中所公开，多种含有组成型或诱导型启动子的载体可用于酵母中。在另一实施例中，使用促进外来DNA序列整合到酵母染色体中的载体。
在一个实施例中，本发明的表达载体可进一步包括允许例如从单一mRNA(例如内部核糖体进入位点(IRES))翻译数种蛋白质的额外聚核苷酸序列和用于基因组整合启动子-嵌合多肽的序列。
在一些实施例中，哺乳动物表达载体包括(但不限于)pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，它们获自Invitrogen；pCI，它获自Promega；pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，它们获自Strategene；pTRES，它获自Clontech；和其衍生物。
在一些实施例中，本发明使用含有来自真核病毒(如逆转录病毒)的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施例中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且衍生自艾伯斯坦巴尔病毒(Epstein Bar virus)的载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE以及允许蛋白质在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、多角体蛋白启动子或显示为对于在真核细胞中的表达有效的其它启动子的指导下表达的任何其它载体。
在一些实施例中，重组病毒载体适用于本发明的多肽的体内表达，因为其提供如侧向感染和靶向特异性的优点。在一个实施例中，侧向感染为例如反转录病毒的生命周期中固有的且为单一感染细胞产生许多发芽且感染相邻细胞的后代病毒粒子的过程。在一个实施例中，结果为大面积变得快速感染，其中的大部分起初不被初始病毒粒子感染。在一个实施例中，产生不能够侧向扩散的病毒载体。在一个实施例中，如果所需目的为将指定基因仅引入局部数目的靶细胞中，那么此特征可为适用的。
在一个实施例中，各种方法可用于将本发明的表达载体引入细胞中。所述方法一般来说描述于Sambrook等人,《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,冷泉港实验室(Cold Springs Harbor Laboratory),New York(1989,1992)；Ausubel等人,《最新分子生物学实验方法汇编》,John Wiley&Sons,Baltimore,Md.(1989)；Chang等人,《体细胞基因疗法(Somatic Gene Therapy)》,CRC出版社(CRC Press),AnnArbor,Mich.(1995)；Vega等人,《基因靶向(Gene Targeting)》,CRC出版社,Ann ArborMich.(1995)；《载体：分子克隆载体和其用途的调查(Vectors:A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses)》,Butterworths,Boston Mass.(1988)；和Gilboa等人[《生物技术(Biotechniques)》4(6):504-512,1986]中，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和重组病毒载体感染。另外，关于正-负选择方法，参见美国专利第5,464,764和5,487,992号。
在一些实施例中，通过病毒感染引入核酸提供相较于其它方法，如脂质体转染和电穿孔的若干优点，因为可由于病毒的感染性质而获得较高转染效率。
在一个实施例中，应了解，本发明的多肽也可从采用上文描述的任何适合投予模式向个体投予的核酸构筑体表达(即，体内基因疗法)。在一个实施例中，核酸构筑体按需要经由适当基因运载工具/方法(转染、转导、同源重组等)和表达系统引入到适合细胞且接着经修饰细胞在培养物中扩增且返回到个体(即，离体基因疗法)。
在一个实施例中，使用植物表达载体。在一个实施例中，多肽编码序列的表达由多个启动子驱动。在一些实施例中，使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等人,《自然》310:511-514(1984)]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人,《欧洲分子生物学杂志》6:307-311(1987)]。在另一实施例中，使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚单位[Coruzzi等人,《欧洲分子生物学杂志》3:1671-1680(1984)；和Brogli等人,《科学》224:838-843(1984)]或热激启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人,《分子与细胞生物学》6:559-565(1986)]。在一个实施例中，构筑体使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转型、微注射、电穿孔和技术人员熟知的其它技术引入植物细胞中。参看例如Weissbach与Weissbach[《植物分子生物学方法》,学术出版社,纽约,第VIII部分,第421-463页(1988)]。本发明还可以使用所属领域中熟知的其它表达系统，例如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。
应了解，除含有用于插入编码序列(编码多肽)的转录与翻译的所需元件以外，本发明的表达构筑体也可包括经工程改造以使所表达多肽的稳定性、产生、纯化、产率或活性最优化的序列。
在一些实施例中，可以使用各种方法来将本发明的表达载体引入宿主细胞系统中。在一些实施例中，所述方法一般来说描述于Sambrook等人,《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室(Cold Springs HarborLaboratory),纽约(1989,1992)；Ausubel等人,《最新分子生物学实验方法汇编》,JohnWiley&Sons,Baltimore,Md.(1989)；Chang等人,《体细胞基因疗法(Somatic GeneTherapy)》,CRC出版社(CRC Press),Ann Arbor,Mich.(1995)；Vega等人,《基因靶向(GeneTargeting)》,CRC出版社,Ann Arbor Mich.(1995)；《载体：分子克隆载体和其用途的调查(Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses)》,Butterworths,Boston Mass.(1988)；和Gilboa等人[《生物技术(Biotechniques)》4(6):504-512,1986]中，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和重组病毒载体感染。另外，关于正-负选择方法，参见美国专利第5,464,764和5,487,992号。
在一些实施例中，经转型的细胞在允许表达高量重组多肽的有效条件下培养。在一些实施例中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。在一个实施例中，有效培养基是指其中细胞经培养以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施例中，培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷酸根来源以及适当盐、矿物质、金属和其它营养素(例如维生素)的水溶液。在一些实施例中，本发明的细胞可在常规发酵生物反应器、振荡烧瓶、试管、微量滴定培养皿和皮氏培养板中进行培养。在一些实施例中，培养在适于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。在一些实施例中，培养条件在所属领域的普通技术人员的专门知识内。
在一些实施例中，取决于用于生产的载体和宿主系统，所得本发明的多肽保持在重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间(例如大肠杆菌中的周质空间)中；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
在一个实施例中，在培养物中预定时间之后，进行重组多肽的回收。
在一个实施例中，本文所使用的短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的整体发酵培养基且不必隐含额外分离或纯化步骤。
在一个实施例中，本发明的多肽使用多种标准蛋白质纯化技术纯化，所述技术为如(但不限于)亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、逆相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、色谱焦聚和差示溶解。
在一个实施例中，为了有助于回收，所表达的编码序列可经工程改造以编码本发明的多肽和融合的可裂解部分。在一个实施例中，融合蛋白可以被设计成使得多肽可容易地通过亲和色谱法；例如通过固定于对可裂解部分具有特异性的柱上而分离。在一个实施例中，裂解位点在多肽与可裂解部分之间经工程改造且多肽可通过用特定裂解此位点处的融合蛋白的适当酶或试剂处理而从色谱柱释放[例如参见Booth等人,《免疫学快报(Immunol.Lett.)》19:65-70(1988)；和Gardella等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》265:15854-15859(1990)]。
在一个实施例中，本发明的多肽以“大体上纯的”形式回收。
在一个实施例中，短语“大体上纯的”是指允许在本文中所描述的应用中有效使用蛋白质的纯度。
在一个实施例中，本发明的多肽还可使用体外表达系统合成。在一个实施例中，体外合成方法在所属领域中是熟知的并且系统的组分是可商购的。
在一些实施例中，重组多肽经合成和纯化；可在体内或体外分析其疗效。在一个实施例中，进行使用重组DNA技术产生CTP修饰的GH。
在一些实施例中，重组多肽经合成和纯化；可在体内或体外分析其疗效。在一个实施例中，本发明的CTP修饰的重组GH的结合活性可使用各种分析来确定。
在一个实施例中，本发明包含CTP-GH-CTP多肽。在一个实施例中，重组DNA技术方法用于产生CTP-GH-CTP多肽。在一个实施例中，本发明包含CTP-GH-CTP-CTP多肽。在一个实施例中，重组DNA技术方法用于产生CTP-GH-CTP-CTP多肽，如实例1和图1中所示。在一个实施例中，在体内分析本发明的CTP-GH-CTP多肽或CTP-GH-CTP-CTP多肽的疗效。在一个实施例中，在体外分析本发明的CTP-GH-CTP或CTP-GH-CTP-CTP多肽的疗效。在一个实施例中，使用Nb2(促乳素依赖性大鼠淋巴瘤细胞系(ECACC细胞库))或FCD-P1鼠类细胞系(预先经人类生长激素受体转染)测量本发明的重组GH多肽的结合活性。在一个实施例中，GH与这些受体的结合诱发细胞增殖，其在一个实施例中通过作为GH活性的函数的MTT细胞染色水平测量。在一个实施例中，通过测量经处理的生长激素缺乏动物中随时间推移的重量增益推断体内活性。
在一个实施例中，本发明提供一种诱发个体的生长或重量增益的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的多肽，所述多肽包含生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP，由此诱发个体的生长或重量增益。
在另一实施例中，本发明提供一种诱发非人类个体的生长或重量增益的方法，其包含向所述非人类个体投予治疗有效量的包含由编码多肽的核酸组成的聚核苷酸的表达载体的步骤，所述多肽由非人类生长激素、连接到所述非人类生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述非人类生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此诱发非人类个体的生长或重量增益。
在另一实施例中，本发明提供一种诱发个体的重量损失或减少体脂的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的包含生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP的多肽，由此诱发所述个体的重量损失或减少体脂。在一个实施例中，所述个体为肥胖的。在另一实施例中，所述个体为超重的。
在另一实施例中，本发明提供一种减少非人类个体的体脂的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的包含聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸由非人类生长激素、连接到所述非人类生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述非人类生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此诱发非人类个体的生长或重量增益。
在另一实施例中，本发明提供一种减少个体的脂肪沉积物的方法。在另一实施例中，本发明提供一种增加个体的肌肉质量的方法。在另一实施例中，本发明提供一种促进个体的肌肉生长的方法。在另一实施例中，本发明提供一种增加肌肉:脂肪比率的方法。在另一实施例中，本发明提供一种减小身体质量指数(BMI)或克托莱指数(Quetelet index)的方法。
在另一实施例中，生长通过重量增益测量。在另一实施例中，生长通过高度增益测量。在另一实施例中，生长通过重量增益测量。在另一实施例中，生长通过肌肉质量增益测量。在另一实施例中，生长通过重量增益测量。在另一实施例中，生长通过骨骼质量增益测量。在另一实施例中，生长通过重量增益测量。在另一实施例中，生长通过肌肉质量增益测量。在另一实施例中，重量增益是由于骨骼和/或肌肉质量增益。在另一实施例中，生长通过所属领域的技术人员已知的任何已知量度测量。
在一些实施例中，本发明的人类生长激素多肽可用于治疗个体的与生长和重量相关的病况，如生长缺乏症、AIDS消耗、老化、HIV感染个体削弱的免疫功能、分解代谢疾病、手术恢复、充血型心肌病、肝移植、肝切除之后的肝再生、慢性肾衰竭、肾性骨营养不良、骨质疏松、软骨发育不全(achondroplasia)/季肋发育不全(hypochondroplasia)、骨骼发育不良、慢性发炎或营养障碍(如克罗恩氏病(Crohn's disease))、短肠综合症、幼年型慢性关节炎、囊肿性纤维化、男性不孕症、X-连锁低磷性佝偻病、唐氏综合症(Down's syndrome)、脊柱裂、努南综合症(Noonan Syndrome)、肥胖、肌肉强度削弱和纤维肌痛。在一些实施例中，本发明的干扰素多肽用于治疗个体的多种病况，如毛细胞白血病(HCL)、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma；KS)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性C型肝炎(CHC)、尖锐湿疣(condylomata acuminata；CA)、慢性B型肝炎、恶性黑素瘤、滤泡性非霍奇金淋巴瘤(follicular non-Hodgkin's lymphoma)、多发性硬化症、慢性肉牙肿病(chronicgranulomatous disease)、鸟型分枝杆菌复症(Mycobacterium avium complex；MAC)、肺纤维化骨质疏松骨质疏松。
在一个实施例中，可向个体提供本发明的多肽本身。在一个实施例中，本发明的多肽可作为药物组合物的一部分向个体提供，所述多肽在其中与药学上可接受的载剂混合。
在一个实施例中，“药物组合物”是指本文所述的活性成分中的一或多种与其它化学成分，如生理学上适合的载剂和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进向生物体投予化合物。
在一个实施例中，“活性成分”是指所关注的多肽序列，其对生物效应负责。
在一些实施例中，本发明的组合物中的任一种将包含至少两个以任何形式结合到所关注的蛋白质的CTP序列。在一个实施例中，本发明提供组合制剂。在一个实施例中，“组合制剂”尤其在如上文所定义的组合搭配物可独立地或通过使用与经区分量的组合搭配物的不同固定组合，即同步、同时、分开或依序地给药的意义上定义“多部分试剂盒”。在一些实施例中，多部分试剂盒的各部分然后可例如同步投予或按时间顺序错开，也就是说对于多部分试剂盒的任一部分在不同时间点并且时间间隔相等或不同。在一些实施例中，组合搭配物的总量的比率可以在组合制剂中投予。在一个实施例中，如所属领域的普通技术人员可容易进行，组合制剂可变化例如以便应对待治疗的患者亚群的需要或单一患者的需要，所述不同需要可以是由于具体疾病、疾病严重程度、年龄、性别或体重所致。
在一个实施例中，可互换地使用的短语“生理学上可接受的载剂”和“药学上可接受的载剂”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所投予的化合物的生物活性和性质的载剂或稀释剂。佐剂包括于这些短语下。在一个实施例中，包括于药学上可接受的载剂中的成分之一可为例如聚乙二醇(PEG)，一种在有机和水性介质中都具有广泛范围的溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等人(1979))。
在一个实施例中，“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的投予的惰性物质。在一个实施例中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于调配和投予药物的技术见于《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版中，所述出版物以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，适合的投予途径例如包括经口、经直肠、经粘膜、经鼻、经肠或非经肠传递，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
在一个实施例中，制剂以局部而非全身性方式，例如经由将制剂直接注射到患者身体的特定区域来投予。
在一个实施例中，其中药物调配物或药物组合物经由注射向个体投予，使用注射器或PEN装置这样做。
在另一实施例中，包含本发明的CTP修饰的GH的多肽以0.1-5ml溶液中的1-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含CTP修饰的GH的多肽以0.1-5ml溶液中的1-50微克的剂量投予。在另一实施例中，包含CTP修饰的GH的多肽以0.1-5ml溶液中的1-25微克的剂量投予。在另一实施例中，包含CTP修饰的GH的多肽以0.1-5ml溶液中的50-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含CTP修饰的GH的多肽以0.1-5ml溶液中的10-50微克的剂量投予。在另一实施例中，包含CTP修饰的GH的多肽以1ml溶液中的5毫克(mg)，或1ml溶液中的10mg，或1ml溶液中的20mg，或1ml溶液中的40mg的剂量投予。
在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽通过一周一次的肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射以0.1-5ml溶液中1-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽通过一周两次的肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射以0.1-5ml溶液中1-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽通过一周三次的肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射以0.1-5ml溶液中1-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽通过每两周一次的肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射以0.1-5ml溶液中1-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽通过每17天一次的肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射以0.1-5ml溶液中1-90微克的剂量投予。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽通过每19天一次的肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射以0.1-5ml溶液中1-90微克的剂量投予。在一个实施例中，投予是通过肌肉内(IM)注射。在一个实施例中，投予是通过皮下(SC)注射。在一个实施例中，投予是通过静脉内(IV)注射。
本发明涵盖剂量范围的各种实施例。在一个实施例中，本发明的多肽的剂量在0.05-80毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在0.05-50毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在0.1-20毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在0.1-10毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在0.1-5毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在0.5-5毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在0.5-50毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在5-80毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在35-65毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在35-65毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在20-60毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在40-60毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在45-60毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在40-60毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在60-120毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在120-240毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在40-60毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在240-400毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在45-60毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在15-25毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在5-10毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在55-65毫克/天范围内。
在一个实施例中，剂量为20毫克/天。在另一实施例中，剂量为30毫克/天。在另一实施例中，剂量为40毫克/天。在另一实施例中，剂量为50毫克/天。在另一实施例中，剂量为60毫克/天。在另一实施例中，剂量为70毫克/天。在另一实施例中，剂量为80毫克/天。在另一实施例中，剂量为90毫克/天。在另一实施例中，剂量为100毫克/天。
在一个实施例中，本发明的通过CTP修饰的GH的剂量在0.005-100毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.005-5毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.01-50毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.1-20毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.1-10毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.01-5毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.001-0.01毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.001-0.1毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.1-5毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.5-50毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.2-15毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在0.8-65毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在1-50毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在5-10毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在8-15毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在10-20毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在20-40毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在60-120毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在12-40毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在40-60毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在50-100毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在1-60毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在15-25毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在5-10毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在55-65毫克/周范围内。在另一实施例中，剂量在1-5毫克/周范围内。
在另一实施例中，给予个体的GH剂量为给予来自相同个体群体(例如儿童、老年人、男性、女性、GH缺乏、特定民族等)的参考个体的标准剂量的50％。在另一实施例中，剂量为给予来自特定个体群体的个体的剂量的30％。在另一实施例中，剂量为给予来自特定个体群体的个体的剂量的45％。在另一实施例中，剂量为给予来自特定个体群体的个体的剂量的100％。
在另一实施例中，剂量1-5毫克/周。在另一实施例中，剂量为2毫克/周。在另一实施例中，剂量为4毫克/周。在另一实施例中，剂量为1.2毫克/周。在另一实施例中，剂量为1.8毫克/周。在另一实施例中，剂量大致为本文所述的剂量。
在另一实施例中，剂量为每次投予1-5毫克。在另一实施例中，剂量为每次投予2毫克。在另一实施例中，剂量为每次投予4毫克。在另一实施例中，剂量为每次投予1.2毫克。在另一实施例中，剂量为每次投予1.8毫克。在一个实施例中，组合物一周投予一次。在另一实施例中，组合物两周投予一次。在另一实施例中，组合物每月投予。在另一实施例中，组合物每天投予。
在一个实施例中，通过CTP修饰的GH调配于液体调配物中。
在另一实施例中，通过CTP修饰的GH调配于鼻内剂型中。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH调配于可注射剂型中。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于0.0001mg到0.6mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于0.001mg到0.005mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于0.005mg到0.01mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于0.01mg到0.3mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于0.2mg到0.6mg范围内的剂量向个体投予。
在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于1-100微克范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于10-80微克范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于20-60微克范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于10-50微克范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于40-80微克范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于10-30微克范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于30-60微克范围内的剂量向个体投予。
在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于0.2mg到2mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于2mg到6mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于4mg到10mg范围内的剂量向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH以介于5mg与15mg范围内的剂量向个体投予。
在另一实施例中，通过CTP修饰的GH注射到肌肉中(肌肉内注射)。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH注射到皮肤以下(皮下注射)。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH注射到肌肉中。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH注射到皮肤以下。
在另一实施例中，本发明的方法包括增加使用GH疗法中的顺应性，其包含向有需要的个体提供通过CTP修饰的GH，由此增加使用生长激素疗法中的顺应性。
在另一实施例中，分子量低于50,000道尔顿的蛋白质药物，如通过本发明的CTP修饰的GH一般为在体内短时间存活的物质，具有几个小时的短循环半衰期。在另一实施例中，皮下投予途径一般提供较慢的到循环中的释放。在另一实施例中，本发明的CTP修饰的多肽延长分子量低于50,000道尔顿的蛋白质药物，如GH的半衰期。在另一实施例中，本发明的CTP修饰的多肽使得干扰素能够持续较长时段发挥其有益效应。
在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的CTP修饰的多肽的免疫原性等于经分离GH。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的CTP修饰的多肽的免疫原性与经分离GH类似。在另一实施例中，用CTP肽修饰如本文所述的GH降低GH的免疫原性。在另一实施例中，包含GH的CTP修饰的多肽如同经分离GH蛋白质一般具活性。在另一实施例中，包含GH的CTP修饰的多肽比经分离GH更具活性。在另一实施例中，包含GH的CTP修饰的多肽是生长激素针对降解的保护能力最大化，同时使生物活性的减少最小化。
在另一实施例中，本发明的方法包括增加罹患慢性疾病、需要GH疗法的个体的顺应性。在另一实施例中，本发明的方法通过如上文所描述地用CTP修饰GH使得GH的给药频率能够降低。在另一实施例中，术语顺应性包含粘着性。在另一实施例中，本发明的方法包括通过降低GH投予频率来增加需要GH疗法的患者的顺应性。在另一实施例中，GH投予频率的降低由于使得CTP修饰的GH更稳定的CTP修饰而实现。在另一实施例中，GH投予频率的降低作为增加生长激素的T1/2的结果而实现。在另一实施例中，GH投予频率的降低作为增加GH的清除时间的结果而实现。在另一实施例中，生长激素投予频率的降低作为增加生长激素的AUC量度的结果而实现。
在另一实施例中，本发明提供一种减少非人类个体的体脂的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的包含聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸由非人类生长激素、连接到所述非人类生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述非人类生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此诱发非人类个体的生长或重量增益。
在另一实施例中，本发明提供一种增加人类个体的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的多肽，所述多肽包含生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP，由此增加所述个体的IGF-1含量。
在另一实施例中，本发明提供一种增加非人类个体的胰岛素样生长因子(IGF-1)含量的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的包含聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸由非人类生长激素、连接到所述非人类生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述非人类生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成，且其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成，由此诱发非人类个体的生长或重量增益。
在一个实施例中，增加人类个体的IGF-1含量可有效治疗、预防或抑制1型糖尿病、2型糖尿病、肌肉萎缩性侧索硬化(ALS，也称为“鲁盖瑞氏病(Lou Gehrig's Disease)”)、重度烧伤和强直性肌肉萎缩症(MMD)。
在另一实施例中，通过CTP修饰的GH一天一次地向个体投予。在另一实施例中，包含通过CTP修饰的GH的多肽每两天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每三天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每四天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每五天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每六天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每周一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每7-14天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每10-20天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每5-15天一次地向个体投予。在另一实施例中，通过CTP修饰的GH每15-30天一次地向个体投予。
在另一实施例中，剂量在50-500毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在50-150毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在100-200毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在150-250毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在200-300毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在250-400毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在300-500毫克/天范围内。在另一实施例中，剂量在350-500毫克/天范围内。
在一个实施例中，剂量为20毫克/天。在一个实施例中，剂量为30毫克/天。在一个实施例中，剂量为40毫克/天。在一个实施例中，剂量为50毫克/天。在一个实施例中，剂量为0.01毫克/天。在另一实施例中，剂量为0.1毫克/天。在另一实施例中，剂量为1毫克/天。在另一实施例中，剂量为0.530毫克/天。在另一实施例中，剂量为0.05毫克/天。在另一实施例中，剂量为50毫克/天。在另一实施例中，剂量为10毫克/天。在另一实施例中，剂量为20-70毫克/天。在另一实施例中，剂量为5毫克/天。
在另一实施例中，剂量为1-90毫克/天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/2天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/3天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/4天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/5天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/6天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/周。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/9天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/11天。在另一实施例中，剂量为1-90毫克/14天。
在另一实施例中，生长激素剂量为10-50毫克/天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/2天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/3天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/4天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克毫克/5天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/6天。在另一实施例中，剂量10-50毫克/周。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/9天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/11天。在另一实施例中，剂量为10-50毫克/14天。
在一个实施例中，经口投予包含包括以下的单位剂型：片剂、胶囊、口含片、咀嚼片剂、悬浮液、乳液等。所述单位剂型包含安全并且有效量的所希望的一或多种化合物，在一个实施例中，其中的每一种是约0.7或3.5mg到约280mg/70kg，或在另一实施例中，是约0.5或10mg到约210mg/70kg。适用于制备用于经口投予的单位剂型的药学上可接受的载剂在所属领域中是熟知的。在一些实施例中，片剂通常包含常规药学上相容的佐剂作为惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、甘露糖醇、乳糖和纤维素；粘合剂，例如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，例如淀粉、海藻酸和交联羧甲纤维素；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施例中，助流剂，例如二氧化硅可以用以改进粉末混合物的流动特征。在一个实施例中，着色剂，例如FD&C染料可以为了外观而添加。甜味剂和调味剂，例如阿斯巴甜糖(aspartame)、糖精、薄荷醇、胡椒薄荷和水果调味剂是适用于咀嚼片剂的佐剂。胶囊通常包含一或多种上文公开的固体稀释剂。在一些实施例中，载剂组分的选择取决于次要考虑因素，如味道、成本和存放稳定性，所述次要考虑因素对于本发明的目的并不关键，并且可以容易由本领域的技术人员作出。
在一个实施例中，经口剂型包含预定释放曲线。在一个实施例中，本发明的经口剂型包含延长释放片剂、胶囊、口含片或咀嚼片剂。在一个实施例中，本发明的经口剂型包含缓慢释放片剂、胶囊、口含片或咀嚼片剂。在一个实施例中，本发明的经口剂型包含立即释放片剂、胶囊、口含片或咀嚼片剂。在一个实施例中，根据所属领域的技术人员已知的药物活性成分的所需释放曲线调配口服剂型。
在一些实施例中，经口组合物包含液体溶液、乳液、悬浮液等。在一些实施例中，适合于制备此类组合物的药学上可接受的载剂为所属领域中众所周知的。在一些实施例中，液体口服组合物包含约0.012％到约0.933％，或在另一实施例中，约0.033％到约0.7％的所希望的一或多种化合物。
在一些实施例中，适用于本发明的方法的组合物包含溶液或乳液，其在一些实施例中是水溶液或乳液，包含安全并且有效量的本发明化合物和任选的打算用于局部鼻内投予的其它化合物。在一些实施例中，组合物包含约0.01％到约10.0％，更优选地约0.1％到约2.0％w/v的主题化合物，其用于通过鼻内途径全身传递化合物。
在另一实施例中，药物组合物通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂而投予。在一些实施例中，液体调配物包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油剂等。在一个实施例中，药物组合物静脉内投予，并且因此以适用于静脉内投予的形式配制。在另一实施例中，药物组合物动脉内投予，并且因此以适用于动脉内投予的形式调配。在另一实施例中，药物组合物肌肉内投予，并且因此以适用于肌肉内投予的形式调配。
在另一实施例中，药物组合物局部投予到身体表面，并且因此以适用于局部投予的形式调配。合适的局部调配物包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。为了局部投予，本发明的化合物与其它适当治疗剂组合，以于生理学上可接受的稀释剂中在存在或不存在药物载剂下的溶液、悬浮液或乳液形式制备并且施用。
在一个实施例中，本发明的药物组合物通过所属领域中熟知的工艺，例如借助于常规混合、溶解、粒化、糖衣药丸制造、水磨、乳化、囊封、覆埋或冻干工艺而制造。
在一个实施例中，根据本发明使用的药物组合物使用一或多种包含赋形剂和助剂的生理学上可接受的载剂以常规方式调配，其促进活性成分加工为药学上可使用的制剂。在一个实施例中，调配取决于所选投予途径。
在一个实施例中，本发明的可注射剂以水溶液形式调配。在一个实施例中，本发明的可注射剂在生理学上相容的缓冲液中进行配制，所述缓冲液为如汉克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐缓冲液。在一些实施例中，为了经粘膜投予，适于待渗透的屏障的渗透剂用于调配物中。所述渗透剂一般来说是所属领域中已知的。
在一个实施例中，本文中所描述的制剂经调配用于非经肠投予，例如通过快速注射或连续输注。在一些实施例中，用于注射的调配物以单位剂型，例如以具有任选地添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器呈现。在一些实施例中，组合物是于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液，并且含有调配剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施例中，组合物还包含防腐剂，例如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，例如乙二胺四乙酸钠等；缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张力剂，例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露糖醇等；抗氧化剂，例如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香族试剂；粘度调节剂，例如聚合物，包括纤维素和其衍生物；和聚乙烯醇，以及酸和碱，用以按需要调节这些水性组合物的pH。在一些实施例中，组合物还包含局部麻醉剂或其它活性剂。组合物可按喷雾剂、雾剂、滴剂等形式使用。
在一些实施例中，用于非经肠投予的药物组合物包括呈水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，在一些实施例中，活性成分的悬浮液以适当油性或水基注射悬浮液形式制备。在一些实施例中，合适的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯；甘油三酯；或脂质体。在一些实施例中，水性注射悬浮液含有提高悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。在另一实施例中，悬浮液还含有合适的稳定剂或提高活性成分的溶解度的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。
在另一实施例中，活性化合物可按微脂粒、具体来说脂质体形式递送(参看Langer,《科学(Science)》249:1527-1533(1990)；Treat等人,《传染性疾病和癌症的疗法中的脂质体(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)》,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,第353-365页(1989)；Lopez-Berestein,同前,第317-327页；总体上参看同前)。
在另一实施例中，控制释放系统中传递的药物组合物经调配用于静脉内输注、可植入渗透泵、透皮贴片、注射器、脂质体或其它投予模式。在一个实施例中，使用泵(参看Langer,同前文献；Sefton,CRC临界基准(CRC Crit.Ref.)《生物医学工程(Biomed.Eng.)》14:201(1987)；Buchwald等人,《外科手术(Surgery)》88:507(1980)；Saudek等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》321:574(1989)。在另一实施例中，可以使用聚合材料。在另一实施例中，控制释放系统可接近治疗目标(即，脑)置放，由此仅需要一部分全身剂量(参见例如Goodson,《控制释放的医学应用(Medical Applications of ControlledRelease)》,前述,第2卷,第115-138页(1984)。其它控制释放系统论述在Langer的综述(《科学(Science)》249:1527-1533(1990)中。
在一些实施例中，活性成分呈在使用之前用适合媒剂(例如基于无菌无热原质水的溶液)复原的粉末形式。在一些实施例中，组合物经调配以用于雾化和吸入投予。在另一个实施例中，组合物含于连有雾化构件的容器中。
在一个实施例中，本发明的制剂使用例如常规栓剂基质(如可可脂或其它甘油酯)以经直肠组合物(如栓剂或保留灌肠剂)形式调配。
在一个实施例中，本发明的制剂调配于液体调配物中以用于经由注射器或笔装置注射。在一些实施例中，适于在本发明的情形下使用的药物组合物包括含有有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。在一些实施例中，治疗有效量意味着可有效预防、缓解或改善疾病症状或延长所治疗的个体的存活期的活性成分的量。
在一个实施例中，治疗有效量的确定完全在所属领域的技术人员的能力内。
在一个实施例中，本文提供的调配物还包含防腐剂，如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，如乙二胺四乙酸钠等；缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张力剂，如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露糖醇等；抗氧化剂，如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳族试剂；粘度调节剂，如聚合物，包括纤维素和其衍生物；和聚乙烯醇，以及酸和碱，用以按需要调节这些水性组合物的pH。组合物还包含局部麻醉剂或其它活性剂。组合物可按喷雾剂、雾剂、滴剂等形式使用。
可以充当药学上可接受的载剂或其组分的物质的一些实例是糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，例如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，例如TweenTM商标乳化剂；湿润剂，例如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原质水；等张生理盐水；和磷酸盐缓冲溶液。待与化合物结合使用的药学上可接受的载剂的选择基本上通过化合物待投予的方式来确定。如果主题化合物要进行注射，那么在一个实施例中，药学上可接受的载剂是具有血液相容的悬浮剂的无菌生理盐水，其pH已经被调节到约7.4。
另外，调配物进一步包含粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆(carbomer)、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、羟乙酸淀粉钠)、具有各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、用以防止吸收到表面的添加剂(例如白蛋白或明胶)、清洁剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基苯甲醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、粘度增加剂(例如卡波姆、胶态二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜糖、柠檬酸)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)、流动助剂(例如胶态二氧化硅)、塑化剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)、聚合物涂层(例如泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))、涂层和膜形成剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
用于糖浆、酏剂、乳液和悬浮液的载剂的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于悬浮液来说，典型悬浮剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如AvicelTM、RC-591)、黄蓍胶和海藻酸钠；典型湿润剂包括卵磷脂和聚氧化乙烯脱水山梨糖醇(例如聚山梨醇酯80)。典型防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一实施例中，经口液体组合物还含有一或多种上文公开的组分，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本文提供的调配物还包括将活性物质并入到聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的微粒状制剂之中或之上或并入到脂质体、微乳液、胶束、单层或多层微脂粒、红细胞血影或原生质球状体上。所述组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
本发明还包括微粒状组合物，其涂布有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)，并且化合物与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体偶合或与组织特异性受体的配体偶合。
在一些实施例中，化合物通过共价连接水溶性聚合物而修饰，所述水溶性聚合物为如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸。在另一个实施例中，经修饰的化合物在静脉内注射之后展现出的血液中半衰期大体上长于相应未经修饰的化合物。在一个实施例中，修饰还提高化合物于水溶液中的溶解度，消除聚集，增强化合物的物理和化学稳定性，并且极大地降低化合物的免疫原性和反应性。在一个实施例中，修饰还提高化合物于水溶液中的溶解度，消除聚集，增强化合物的物理和化学稳定性，并且极大地降低化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施例中，所要体内生物活性通过与未经修饰的化合物相比更低频率或以更低剂量投予所述聚合物-化合物诱导物而获得。
在一些实施例中，有效量或剂量的制备最初可根据体外分析来估计。在一个实施例中，剂量可以在动物模型中进行调配并且所述信息可用以更准确地确定人类中的适用剂量。
在一个实施例中，本文所述的活性成分的毒性和疗效可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。在一个实施例中，获自这些体外和细胞培养物分析和动物研究的数据可用以调配适用于人类的剂量范围。在一个实施例中，剂量取决于所用剂型和所用投予途径而变化。在一个实施例中，确切调配物、投予途径和剂量可由个别医生鉴于患者的病况来进行选择。[参看例如Fingl等人,(1975)“《治疗剂的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)》”,第1章第1页]。
在一个实施例中，取决于待治疗的病况的严重程度和反应性，给药可以是单一或多次投药，疗程持续数天到数周或直到实现治愈或实现疾病状态减弱为止。
在一个实施例中，待投予的组合物的量当然将取决于所治疗的个体、病痛的严重程度、投予方式、处方医生的判断等。
在一个实施例中，还制备包括本发明的制剂、于相容药物载剂中调配的组合物，将其放置于适当容器中，并且标记以用于治疗指定病况。
在另一实施例中，通过CTP修饰的GH经由全身性投予来投予。在另一实施例中，如本文所述的生长激素通过静脉内、肌肉内或皮下注射投予。在另一实施例中，CTP修饰的GH为与复合有机赋形剂和稳定剂，如非离子表面活性剂(即，表面活性剂)、各种糖、有机多元醇和/或人类血清白蛋白组合的冻干(即，冷冻干燥)制剂。在另一实施例中，药物组合物包含注射用无菌水中的如所描述的CTP修饰的冻干GH。在另一实施例中，药物组合物包含注射用无菌PBS中的如所描述的冻干生长激素。在另一实施例中，药物组合物包含注射用无菌0.9％NaCl中的如所描述的冻干生长激素。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物经另外调配以包含复合载剂，如人类血清白蛋白、多元醇、糖和阴离子表面活性稳定剂。参看例如WO 89/10756(Hara等人，含有多元醇和对羟基苯甲酸酯)。在另一实施例中，药物组合物包含如本文所述的生长激素且经另外调配以包含乳糖酸和乙酸盐/甘氨酸缓冲液。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物经另外调配以包含氨基酸，如增加干扰素组合物于水中的溶解性的精氨酸或谷氨酸。在另一实施例中，药物组合物包含如本文所述的CTP修饰的冻干GH且经另外调配以包含甘氨酸或人类血清白蛋白(HSA)、缓冲液(例如乙酸盐)和等张剂(例如NaCl)。在另一实施例中，药物组合物包含如本文所述的CTP修饰的冻干GH且经另外调配以包含磷酸盐缓冲液、甘氨酸和HSA。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物当置于pH在约4与7.2之间的缓冲溶液中时稳定。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物当置于pH在约6与6.4之间的缓冲溶液中时稳定。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物当置于pH为6.0的缓冲溶液中时稳定。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物当置于pH为6.2的缓冲溶液中时稳定。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物当置于pH为6.4的缓冲溶液中时稳定。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物用氨基酸，如稳定剂，且在一些情况下，盐(如果氨基酸不含带电侧链)稳定。在一个实施例中，药物组合物在室温下稳定。在另一实施例中，药物组合物在4℃下稳定。在另一实施例中，药物组合物在5℃下稳定。在另一实施例中，药物组合物在-20℃下稳定。在一个实施例中，药物组合物稳定至少三个月。在一个实施例中，药物组合物稳定至少六个月。在一个实施例中，药物组合物稳定至少一年。在一个实施例中，药物组合物稳定至少两年。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物调配于包含约0.3％与5重量％之间的稳定剂的液体组合物中，所述稳定剂为氨基酸。
在另一实施例中，包含如本文中所描的CTP修饰的GH的药物组合物提供给药准确性和产品安全性。在另一实施例中，包含如本文中所描述的CTP修饰的GH的药物组合物提供具生物活性的稳定液体调配物以用于可注射应用。在另一实施例中，药物组合物包含如本文所述的CTP修饰的非冻干GH。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物提供液体调配物，其允许在液体状态下储存较长时间段，有助于投予之前的储存和装运。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的可注射药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一实施例中，脂质微米粒子通过喷雾凝结的产生由Speiser(Speiser等人,《药物研究(Pharm.Res.)》8(1991)47-54)描述，接着为用于经口投予的脂质纳米丸粒(Speiser EP 0167825(1990))。在另一实施例中，所用的脂质为身体所充分耐受(例如甘油酯由存在于乳液中的脂肪酸组成用于非经肠营养)。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物呈脂质体形式(J.E.Diederichs等人,Pharm./nd.56(1994)267-275)。
在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含聚合微米粒子。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的可注射药物组合物包含聚合微米粒子。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含纳米粒子。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含脂质体。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含脂质乳液。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含微球。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含脂质纳米粒子。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含含两亲脂质的脂质纳米粒子。在另一实施例中，包含如本文所述的CTP修饰的GH的药物组合物包含含药物、脂质基质和表面活性剂的脂质纳米粒子。在另一实施例中，脂质基质的单甘油酯含量是至少50％w/w。
在一个实施例中，本发明的组合物呈现于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置为如FDA批准的试剂盒，其含有一或多个含有活性成分的单位剂型。在一个实施例中，包装例如包含金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施例中，包装或分配器装置附有投药说明书。在一个实施例中，包装或分配器附有与容器相联的布告，其呈由管制药物制造、使用或销售的政府机构指定的形式，所述布告反映了所述机构批准所述组合物形式用于人类或兽医学投予。在一个实施例中，所述布告是由美国食品与药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)批准以用于处方药物或批准的产品说明书的标签。
在一个实施例中，应了解，本发明的CTP修饰的GH可与其它活性剂一起提供给个体以实现与单独用每种药剂本身治疗相比改进的治疗效果。在另一实施例中，采取措施(例如给予和选择补充药剂)以使与组合疗法相关的不良副作用最小化。
所属领域的普通技术人员在参阅以下实例后将变得显而易知本发明的其它目标、优势和新颖特征，所述实例并不打算是限制性的。另外，如上文所描绘并且如以上权利要求书部分中所要求的本发明的各种实施例和方面中的每一者在以下实例中找到实验支持。
实例
一般来说，本文中所用的术语和本发明中所用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中有充分解释。参见例如《分子克隆实验指南》Sambrook等人(1989)；《最新分子生物学实验方法汇编》第I-III卷Ausubel,R.M编(1994)；Ausubel等人,《最新分子生物学实验方法汇编》,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,《分子克隆实践指南(A Practical Guide to MolecularCloning)》,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人,《重组DNA(RecombinantDNA)》Scientific American Books,New York；Birren等人(编)《基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series》第1-4卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)；如美国专利第4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057号中阐述的方法；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:ALaboratory Handbook》,第I-III卷Cellis,J.E.编(1994)；《动物细胞培养-基本技术手册(Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique)》Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；《免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)》第I-III卷Coligan J.E.编(1994)；Stites等人(编),《基础和临床免疫学(Basic and ClinicalImmunology)》(第8版),Appleton和Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),《细胞免疫学中的选择方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》W.H Freeman和同事,New York(1980)；可用的免疫检定广泛地描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利第3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521号；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》Gait,M.J.编(1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985)；《转录与翻译(Transcription and Translation)》Hames,B.D.和希金斯S.J.编(1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》Freshney,R.I.编(1986)；《固定化细胞和酶(ImmobilizedCells and Enzymes)》IRL Press,(1986)；《分子克隆实践指南(A Practical Guide toMolecular Cloning)》Perbal,B.(1984)和《酶学方法(Methods in Enzymology)》第1-317卷,Academic Press；《PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide To MethodsAnd Applications)》,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人,《蛋白质纯化和表征策略-实验室过程手册(Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual)》CSHL Press(1996)；其全部以引用的方式并入。其它通用参考文献提供于整个本文档中。
实例1
产生hGH构筑体
材料与方法
合成四种hGH克隆体(20kD蛋白质的变异体)。含有来自四种变异体的hGH序列的XbaI-Not I片段接合到预先用XbaI-NotI消化的真核表达载体pCI-dhfr中。制备来自4种克隆体(401-0、1、2、3和4)的DNA。还合成来自22kD蛋白质的另一部分hGH克隆体(1-242bp)(0606114)。引物是从Sigma-Genosys订购。用于产生本发明的hGH-CTP多肽的引物序列概述于下文表1中。
表1
构筑402-0-p69-1(hGH)SEQ ID NO:36：MOD-4020为制备用作下文描述的实验中的对照的野生型重组人类生长激素(无CTP)。
进行三个PCR反应。用引物25和引物32R和0606114(hGH的部分克隆体，1-242bp)的质体DNA作为模板进行第一反应；由于PCR扩增，形成245bp产物。
用引物33和引物4R和401-0-p57-2的质体DNA作为模板进行第二反应；由于PCR扩增，形成542bp产物。
用引物25和4R和前述两个反应的产物的混合物作为模板进行最后一个反应；由于PCR扩增，形成705bp产物且接合到TA克隆载体(Invitrogen，产品目录K2000-01)中。含有hGH-0序列的XbaI-NotI片段接合到真核表达载体pCI-dhfr中。载体经转染到DG-44CHO细胞中。细胞在无蛋白质培养基中生长。
构筑402-1-p83-5(hGH-CTP)-SEQ ID NO:37和402-2-p72-3(hGH-CTPx2)-SEQ IDNO:38：MOD-4021为融合到人类绒膜促性腺激素(CTP)的β链的C端肽的1个复本的重组人类生长激素。MOD-4021的CTP晶匣连接到C端(一个晶匣)。MOD-4022为融合到人类绒膜促性腺激素(CTP)的β链的C端肽的2个复本的重组人类生长激素。MOD-4022的两个CTP晶匣连接到C端(两个晶匣)。
以与构筑hGH-0相同的方式进行hGH-CTP和hGH-CTP-CTP的构筑。pCI-dhfr-401-1-p20-1(hGH*-ctp)和pCI-dhfr-401-2-p21-2(hGH*-ctp×2)用作第二PCR反应中的模板。
MOD-4021和MOD-4022表达于DG-44CHO细胞中。细胞在无蛋白质培养基中生长。MOD-4021的分子量为约30.5Kd，因为hGH具有22Kd的MW，而每一“CTP晶匣”为总分子量贡献8.5Kd(参见图1)。MOD-4022的分子量为约39Kd(参见图1)。
构筑402-3-p81-4(CTP-hGH-CTP-CTP)-SEQ ID NO:39和402-4-p82-9(CTP*hGH-CTP-CTP)-SEQ ID NO:40：MOD-4023为融合到人类绒膜促性腺激素(CTP)的β链的C端肽的3个复本的重组人类生长激素。MOD-4023的三个CTP晶匣连接到N端(一个晶匣)和C端(两个晶匣)两者。MOD-4024为重组人类生长激素，其融合到人类绒膜促性腺激素(CTP)的β链的C端肽的1个截短复本和2个完整复本。MOD-4024的截短CTP晶匣连接到N端且两个CTP晶匣连接到C端(两个晶匣)。
进行三个PCR反应。用引物25和引物35R和p401-3-p12-5或401-4-p22-1的质体DNA作为模板进行第一反应；由于PCR扩增，形成265或220bp产物。用引物34和引物37R和TA-hGH-2-q65-1的质体DNA作为模板进行第二反应；由于PCR扩增，形成695bp产物。用引物25和37R和前述两个反应的产物的混合物作为模板进行最后一个反应；由于PCR扩增，形成938或891bp产物且接合到TA克隆载体(Invitrogen，产品目录K2000-01)中。含有hGH序列的XbaI-Not I片段接合到我们的真核表达载体pCI-dhfr中。(图3)
MOD-4023和MOD-4024表达于DG-44CHO细胞中。细胞在无蛋白质培养基中生长。MOD-4023的分子量为约47.5Kd(参见图1)且MOD-4024的分子量为约43.25Kd(图1)。
构筑402-6-p95a-8(CTP-hGH-CTP)-SEQ ID NO:41：以与构筑hGH-3相同的方式进行hGH-6的构筑。pCI-dhfr-402-1-p83-5(hGH-ctp)用作第二PCR反应中的模板。
构筑402-5-p96-4(CTP-hGH)-SEQ ID NO:42：使用引物25和引物39R和pCI-dhfr-ctp-EPO-ctp(402-6-p95a-8)的质体DNA作为模板进行PCR反应；由于PCR扩增，形成763bp产物且接合到TA克隆载体(Invitrogen，产品目录K2000-01)。含有ctp-hGH序列的XbaI-Not I片段接合到我们的真核表达载体pCI-dhfr中以产生402-5-p96-4克隆体。
实例2
本发明的hGH-CTP多肽的体内生物活性测试
进行以下实验以测试与商业重组人类GH和MOD-4020相比的hGH-CTP多肽的潜在长效生物活性。
材料与方法
雌性垂体切除的大鼠(60-100g)接收21.7μg hGH-CTP多肽的每周皮下注射或对照商业rhGH的每天一次的5μg皮下注射。
在处理之前、在第一次注射之后24小时且接着每隔一天在所有动物中测量重量直到第21天研究结束。每个点表示组平均重量增益百分比((第0天重量-最后一天重量)/第0天重量)。平均重量增益相对于商业hGH的每天一次注射标准化。处理排程概述于表2中。
表2
结果
结果概述于图2中。这些结果显示相比于诱导100％重量增益的商业rhGH，MOD-4023(SEQ ID NO:39)和MOD-4024(SEQ ID NO:40)诱导超过120％重量增益。
结论
相比于以5μg的剂量每天投予一次，持续13天的以相同累积剂量注射的商业rhGH，21.7μg MOD-4023(SEQ ID NO:39)和MOD-4024(SEQ ID NO:40)的三个每周剂量(注射天数；1、7和13)在垂体切除的大鼠中诱导大30％的增加。
实例3
CTP修饰的GH的药物动力学研究
在史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)中进行单剂量药物动力学研究。所有动物实验是根据动物福利法案(Animal Welfare Act)、实验动物的护理和使用指南(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)且在Modigene,Biotechnology GeneralLtd的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees)的监督和批准下进行。大鼠单独或每笼两只地容纳于具有12h光/暗循环的房间中。任意提供水(城市供应)和非认证啮齿动物食物的获取。
为了比较大鼠中的CTP-hGH-CTP-CTP和GH的药物动力学，四组史泊格-多利大鼠(270-290g)，每组三到六只雄性大鼠。所述大鼠随机分配到四个处理组(参见表3)。对大鼠投予GH(50μg/kg，静脉内或皮下)或CTP-hGH-CTP-CTP(108μg/kg，静脉内或皮下)的单一皮下或静脉内注射液。除在异氟醚麻醉下采集的预剂量样品之外，在未麻醉动物中进行血液采集。在EDTA涂布的采血器(microtainer)中采集血液样品(大致0.25ml)用于在表11中概述的时间进行CTP-hGH-CTP-CTP血浆浓度的ELISA分析。在每一取样之后，用相同体积的无菌0.9％生理盐水替换血容量。样品储存于冰上至多1h，随后进行离心和血浆收获。血浆样品在分析之前储存于大致-20℃下。
表3.大鼠药物动力学研究的实验设计
#每一时间点3只大鼠。
专门用于检测人类生长激素的商业夹心ELISA试剂盒(Roche Diagnostics)用于评估大鼠血浆样品。此试剂盒借助于抗体夹心ELISA格式检测血浆中的人类生长激素。此试剂盒起初用于测量大鼠血浆中的CTP-hGH-CTP-CTP的浓度。对于这些血浆样品，使用CTP-hGH-CTP-CTP标准曲线(1.2-100ng/ml)且大鼠血浆中的CTP-hGH-CTP-CTP的浓度由此曲线内插。
通过使用建模程序WinNonlin(Pharsight，版本3.1)的非房室模型分析从血浆白蛋白融合生长激素或GH浓度/时间曲线获得标准药物动力学参数，包括清除率(CL或CL/F)、分布体积(Vd或Vd/F)、半衰期(t1/2)、血浆浓度相对于时间的曲线下面积(AUC)、最大观测血浆浓度(Cmax)和达到最大观测血浆浓度的时间(Tmax)。血浆CTP-hGH-CTP-CTP或GH浓度数据对于此分析均一地加权。对于静脉内数据使用对数线性梯形分析且对于皮下数据使用线性上/对数下(linear-up/-down)梯形方法计算AUC。单独地分析每一大鼠(除皮下白蛋白融合生长激素数据之外)或猴的血浆浓度曲线，且药物动力学参数的平均值±标准平均误差(S.E.M.)值报导于表4和图4中。
CTP-hGH-CTP-CTP为275个氨基酸和最多十二个O-连接碳水化合物的单链蛋白质。结构由连接到人类绒膜促性腺激素(hCG)的β链的C端肽(CTP)的三个复本的经修饰人类生长激素(Somatropin)组成；一个复本在N端处且两个副本(串列的)在C端处。人类生长激素包含191个氨基酸。CTP包含28个氨基酸和四个O-连接糖链。
实例4
SD大鼠中的CTP修饰的GH的药物动力学
评估CTP-hGH-CTP-CTP的药物动力学且相比于商业hGH(Biotropin)。
表4.在史泊格-多利大鼠中单剂量静脉内和皮下投予CTP-hGH-CTP-CTP和GH(Biotropin)之后的平均药物动力学参数。
数据统计分析
进行血清样品的分析以测定每一样品的特定浓度含量。使用WinNonLin非房室模型分析处理浓度和时间点数据。
测定的参数包括：AUC、MRT、t1/2、Cmax和Tmax。图4表明相比于大鼠中单次静脉内或皮下剂量的CTP-hGH-CTP-CTP或GH之后的GH浓度(pg/ml)，CTP-hGH-CTP-CTP血浆浓度的优良药物动力学概况(每剂量/途径的n＝3-6)。
在50μg/kg的单次皮下注射之后，来自SD大鼠血液的CTP-hGH-CTP-CTP的清除率显著慢于CTP-hGH-CTP和Biotropin。对应计算的半衰期时间和AUC为：
Biotropin T1/2 1.7h，AUC 41h*ng/mL
CTP-hGH-CTP T1/2 8.5h，AUC 424h*ng/mL
CTP-hGH-CTP-CTP T1/2 9.0h，AUC 680h*ng/mL
结论：从6种其它变异体以外选出CTP-hGH-CTP-CTP作为最终候选物。CTP-hGH-CTP-CTP展示就生物活性和药物动力学来说的优良性能。
实例5
单剂量/重复剂量的CTP修饰的GH的重量增益分析(WGA)
3-4周龄的垂体切除的(耳间方法)雄性大鼠获自CRL实验室。在3周的术后环境适应时段期间，大鼠每周两次地检查和称重以去除由与假操作大鼠类似的重量增益证明的认为具有不完全垂体切除术的动物。从研究去除垂体不完全切除的那些大鼠。在实验时，垂体切除的平均体重为70-90克。此为用于hGH的标准USP和EP生物分析。垂体切除的大鼠(去除脑下垂体的大鼠)失去其增重的能力。向这些大鼠注射hGH(和CTP-hGH-CTP-CTP)导致重量增益。基于沿所界定时间段测量的重量增益和注射的hGH的量，测定hGH(和CTP-hGH-CTP-CTP)的比活性。大鼠每隔4天、持续3周投予0.4、0.8和4mg/Kg的单一皮下剂量或0.6和1.8mg/Kg的重复皮下剂量。在第一次给药之前，此后每两天，或在死者的情况下，在死亡时，和处死之前随机化地测定所有动物的个别体重。
单剂量和重复剂量重量增益分析
比较垂体切除的大鼠中不同给药模式的CTP-hGH-CTP-CTP之后的全身生长反应结果展示于图5中。结果展示单次注射0.4和0.8毫克/千克/天剂量的hGH-CTP等效于每天4次注射0.1毫克/千克/天的Biotropin。hGH-CTP效应的峰是在2天之后。
图6另外表明与大鼠的体重增益相关的单次注射CTP-hGH-CTP-CTP之后的曲线下面积。因此，集合数据表明体重增益与累积AUC紧密相关。
如在图7中所展示，相隔4天投予的hGH-CTP构筑体与每天注射Biotropin促进相同重量增益。人体中的hGH的半衰期预期比大鼠好5×-指示关于一个单次注射的10天之后的人体中的潜在峰值效应。这些结果支持在人体中每周一次或每两周一次投予hGH-CTP构筑体CTP-hGH-CTP-CTP。
实例6
CTP修饰的GH的药效动力学/药物动力学研究
3-4周龄的垂体切除的(耳间方法)雄性大鼠获自CRL实验室。在3周的术后环境适应时段期间，大鼠每周两次地检查和称重以去除由与假操作大鼠类似的重量增益证明的认为具有不完全垂体切除术的动物。从研究去除垂体不完全切除的那些大鼠。在实验时，经垂体切除的大鼠和假大鼠的平均体重分别为70和150g。
大鼠经单次皮下投予CTP-hGH-CTP-CTP、媒剂、人类生长激素CTP-hGH-CTP-CTP或人类生长激素(20微克/大鼠)以每只大鼠0.2ml的注射体积皮下投予。GH的剂量为0.35和1.05μg/Kg，与CTP-hGH-CTP-CTP的对应0.6和1.8μg/Kg剂量中的GH的量等摩尔的生长激素的剂量。处理组概述于表5中。在注射之后，在表5中描述的时间获得用于IGF-1分析的血浆样品。使用商业ELISA(R&D systems)分析样品的IGF-1浓度。
表5.垂体切除的大鼠研究的治疗排程
对每一组的平均血清浓度相对于时间曲线进行非房室药物动力学分析。CTP-hGH-CTP-CTP Cmax显著高于Biotropin Cmax。CTP-hGH-CTP-CTP的终末半衰期比Biotropin高6倍。
表6：在垂体切除的大鼠中单次皮下注射之后的CTP-hGH-CTP-CTP和Biotropin的药物动力学参数估计
组 剂量 性别 Cmax Tmax AUC0-∞ AUC0-t CL/F T1/2
mg/kg ng/mL hr ng-h/mL ng-h/mL mL/h/kg h
CTP-hGH-CTP-CTP 1.8 M 2,150 8 37,713 37,695 0.928 6.86
0.6 M 681 8 11,505 11,489 3.042 6.8
hGH 1.05 M 1,078 0.5 3,541 3,540 9.884 1
0.35 M 439 0.5 1,279 1,279 27.36 1
AUC0-t和AUC0-∞极类似，表明取样的持续时间足以表征药物动力学特征曲线。CTP-hGH-CTP-CTP的AUC比Biotropin高10倍。此外，Cmax一般与剂量成比例且对于CTP-hGH-CTP-CTP，且其比Biotropin的Cmax高两倍。但是，如图8中所示，相比于Biotropin的0.5h，CTP-hGH-CTP-CTP的Tmax为8h，终末半衰期看起来不随着剂量水平变化。CTP-hGH-CTP-CTP的T1/2比Biotropin长6.8倍。
GH的间接效应主要通过胰岛素样生长因子-I(IGF-1)，回应于生长激素而从肝脏和其它组织分泌的激素介导。生长激素的大多数生长促进效应实际上是由于作用于靶细胞的IGF-1。因此，测量CTP-hGH构筑体CTP-hGH-CTP-CTP对垂体切除的大鼠中的IGF-1血清含量的效应。图9呈现在皮下注射CTP-hGH-CTP-CTP和商业hGH之后的垂体切除的大鼠中的IGF-1血清含量的结果。
向垂体切除的大鼠皮下注射单一剂量的CTP-hGH-CTP-CTP(0.6或1.8mg/Kg)和Biotropin(0.35或1.05mg/Kg)以测定PK/PD概况。使用特异性ELISA试剂盒(RocheDiagnostics)测量血清IGF-1后注射。
注射CTP-hGH-CTP-CTP之后的IGF-1的累积血清含量显著高于注射Biotropin之后。Cmax一般与剂量成比例且对于CTP-hGH-CTP-CTP，其比Biotropin的Cmax高3-4倍。相比于Biotropin的20-24h，CTP-hGH-CTP-CTP的Tmax为36-48h。总之，较高hGH含量和血清中的较长存在导致IGF-1含量的显著增加。
实例7
CTP修饰的GH的碳水化合物含量和唾液酸含量
O-聚糖的分析是基于Prozyme试剂盒。O-聚糖化学和酶促裂解自蛋白质且使用纸色谱与肽分离。通过连续酶促消化(外切糖苷酶)，接着相比于标准物进行HPLC分析来进行O-聚糖合并物的测序。
通过序列分析的糖基剖析(Glycoprofiling)
通过Ludger Ltd进行糖基剖析。经由重复三次的释放获取两个样品(EN648和RS0708)且也通过HPLC重复三次地分析每一释放。EN648和RS0708的一式三份300μg样品和柠檬酸盐/氯化钠缓冲液的单一100μl样品加上阳性对照胎球蛋白(250μg)和100μl水阴性对照使用10,000Da的分子量截止膜通过离心超过滤以用水置换缓冲液，接着在O-模式条件(60℃下6h)下通过肼解。释放的聚糖经再N-乙酰化且通过LudgerClean CEX滤筒净化。释放的聚糖的等分试样接着标记有2-氨基苯甲酰胺(2AB)，用Ludger Clean S滤筒净化且通过LudgerSep-N2HILIC-HPLC分析。
单糖含量
中性单糖的分析需要将聚糖水解为其组成单糖组分。通过Ludger Ltd对完好的糖蛋白样品进行水解。确切地说，50μg完好的糖蛋白经水解、2-AB(2-氨基苯甲酰胺)标记且在逆相HPLC柱上运行。此方法水解所有存在于糖蛋白上的聚糖，包括N和O连接型。
唾液酸分布
分析两个样品(EN648和RS0708)和缓冲液对照物。唾液酸分析需要单糖的轻度酸释放，接着进行DMB荧光团标记和LudgerSep-R1柱上的HPLC分析。对于每一分析，50μg完好的糖蛋白经酸水解。
CTP-hGH-CTP-CTP的糖基分析
表7.聚糖分析。结构分配和峰面积百分比是基于HPLC和酶阵列消化。
单糖剖面指示CTP-hGH-CTP-CTP糖蛋白样品主要含有O连接型聚糖。主要O聚糖峰为唾液酸化核心1(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc)。主要唾液酸为Neu5Ac且存在一些表明3-4％的二乙酰化唾液酸N-乙酰基-9-O-乙酰基神经氨酸(Neu5,9Ac2)和小于1％N-羟乙酰基神经氨酸的存在的次要峰。也存在少量Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAc。
实例8
恒河猴中的CTP修饰的GH的药物动力学/毒理动力学分析
对于每一动物产生血清浓度相对于时间的曲线。用WinNonlin专业版5.2.1(Pharsight Corporation,Mt View CA.)进行非房室分析。估计的药物动力学参数显示于下表8中：
表8：来自恒河猴中的单次皮下注射之后的非房室分析的CTP-hGH-CTP-CTP药物动力学参数(平均值±SD)的估计值
AUC0-t和AUC0-∞极类似，表明取样的持续时间足以表征药物动力学特征曲线。Cmax与剂量成比例。Tmax随后在较高剂量下。Tmax对于低剂量组中的所有动物为4小时且在高剂量组中为8或24小时。两个剂量组的终末半衰期类似。
AUC大致与剂量成比例，其中较高剂量处的略微较大比例AUC产生相比于较低剂量略微较低的CL/F和Vz/F的估计值。不可能说CL和Vz是否在较高剂量处较低或F是否在较低剂量处较低。在组之间存在重叠，因此可疑的是这表示CL/F和Vz/F的有意义的差异。
通过模型估计的药物动力学参数与来自非隔室分析的那些极类似。吸收和消除半衰期显示于下表9中：
表9：恒河猴中衍生自药物动力学建模的皮下注射之后的CTP-hGH-CTP-CTP吸收和消除半衰期的估计(平均值±SD)
剂量 T1/2abs(h) T1/2el(h)
1.8mg/kg 1.17±0.40 10.41±2.36
90mg/kg 6.49±1.87 7.26±1.85
数据指示消除速率在组之间相当类似，在较低剂量组中具有略微较长T1/2el。但是，相比于皮下投予1.8mg/kg之后，皮下投予90mg/kg之后的吸收慢5倍以上。如在非房室分析的情况下，建模指示高剂量下的随后Tmax。
尽管GH补充在治疗儿童和成人的GH缺乏中有效，经延长时间段每天注射的缺点限制医师将其用于某些患者群体并且增加给药误差风险、护理者数量、治疗成本和/非顺应性。在某些群体，如可能不理解不遵循指定GH给药方案的影响的身材矮小的儿童中尤其重要的是实现GH疗法的最优受益的顺应性的必要性。发现每天GH注射和后续顺应性的更合适的替代方案的问题在GH缺乏的儿童转变为持续需要GH治疗的成人时变得更重要。每天疗法的要求在很大程度上是由于重组GH的短血浆半衰期且已导致开发持续释放形式的GH(Reiter EO.Attire KM.,Mashing TJ.Silverman BL.Kemp SF.Neolith RB.Ford KM.和Sanger P.持续释放GH在治疗患有GH缺乏的未治疗小儿患者中的功效和安全性的多成员研究(A multimember study of the efficacy and safety of sustained release GH inthe treatment of naive pediatric patients with GH deficiency.)《临床内分泌学与代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)》86(2001),第4700-4706页)。
如本文所述的GH-CTP(重组人类生长激素-CTP融合蛋白)具有持续时间长于GH的大鼠中的药物动力学概况。此独特药物动力学概况允许间歇投予GH-CTP以在生长激素缺乏的大鼠中实现药效动力学效应，其分别如通过生长和血浆IGF-1含量的提高证明。
当在大鼠中皮下投予时，GH-CTP提供相比于GH优良的药物动力学概况。相比于GH的GH-CTP的血浆清除率中存在重大差异。确切地说，在皮下给药之后，GH-CTP以比GH慢6倍以上地清除血浆。在皮下投药之后，大鼠中的GH-CTP的终末半衰期和平均滞留时间比GH长大致6倍。另外，GH-CTP的皮下给药之后的Cl/F比GH低10倍。
致力于检查大鼠中的药物动力学优点是否转化为药效动力学效益，在等摩尔CTP-hGH-CTP-CTP和GH剂量下测试GH-CTP可在相比于每天较不频繁的给药方案的情况下在GH缺乏的垂体切除的大鼠中刺激生长的可能性。单次皮下注射GH-CTP促进增量重量增益，其等于4次每天连续注射GH。另外，GH-CTP的每四天投予排程显示相比于GH增强的体重增益。
在药效动力学上，垂体切除的大鼠中GH-CTP相对于GH的长循环时间产生在单次皮下注射之后在血浆中测量的延长的IGF-1反应。皮下投予单次剂量的GH-CTP在垂体切除的大鼠中以剂量依赖性方式增加循环IGF-1浓度。在最高白蛋白融合生长激素剂量下，IGF-1浓度在单次投予之后持续长达75小时升高到基线以上。因此，单次剂量的GH-CTP的提高的循环时间产生相比于单次剂量的GH重大的药效动力学改进，提高GH-CTP可在相比于标准GH治疗方案减少的给药频率下提供类似生长增强的可能性。
恒河猴中90mg/kg和大鼠中180mg/kg的单次CTP修饰的hGH剂量在两种物种中均良好地耐受。大鼠与灵长类动物之间的异速生长因数为大致×2，其是基于这些动物中的蛋白质的预期清除率。符合行业接受的外推法模型以用于物种之间的治疗蛋白质的半衰期增加(美国食品药物管理局指南(FDA Guidance))。灵长类动物中的90mg/kg具有比大鼠中的180mg/kg的CTP修饰的hGH略微较好的PK概况。因此，针对人类的异速生长外推法支持每周或每2周一次的注射。
本发明概念使用CTP-GH构筑体，相比于商业GH重组产品减少的给药频率。为批准用于小儿群体的GH的持续释放调配物；但是，与历史对照物的比较显示给予Nutropin的儿童中的1年和2年生长速率(1年生长速率为每年8.2±1.8cm)显著(p<0.001)低于用GH治疗的儿童(1年生长速率为每年10.1±2.8cm)(SilvermanBL等人《儿科内分泌学与代谢杂志(J.Pediatr.Endocrinol.Metab.)》15(2002),第715-722页)。皮下投予Nutropin的局部效应包括结节、红斑、注射位点处的疼痛、头痛和呕吐。大鼠和猴的临床前毒理学研究均显示皮下投予CTP-hGH-CTP-CTP不产生相比于媒剂的局部反应。鉴于较不频繁投予形式的GH的医疗需要，在这一研究中，在大鼠中的CTP-hGH-CTP-CTP的药理学特性表明此产物也关于毒理学和患者顺应性有利。CTP-hGH-CTP-CTP在大鼠中的持续活性载体其作为仅需要间歇投予而达到当前在每天给药的情况下实现的治疗效益的药剂的潜在效用。
实例9
长效CTP修饰型式的人类生长激素(hGH-CTP)在生长激素缺乏的成人II期临床试验中高效
进行随机化、开放标签、II期临床试验以评估在当前每天接受生长激素注射的患者中每周或每月两次注射的hGH-CTP的安全性、耐受性、药物动力学和药效动力学特性。在六个国家的多处进行试验。试验中的三个主要群体接收每周单次剂量的hGH-CTP，其含有生长激素缺乏的成年患者经七天的历程以每天注射形式接受的等效累积商业hGH剂量的30％、45％或100％(分别称为“30％”、“45％”和“100％”群体)。数据反映来自39位患者(每一群体中13位)的结果。每一群体中包括2位女性。
除三个主要群体以外，生长激素缺乏的成人登记于实验第四群体，其在正式II期试验之外进行。实验第四群体中的患者接受每两周一次的hGH-CTP单次注射，其含有生长激素缺乏的成年患者经两周时段以每天注射形式接受的累积商业剂量的50％。
接受hGH-CTP的每周单次注射的三个主要群体的功效由测量经七天时段(在研究中的最后一个治疗周期间)的所需治疗范围内的每天胰岛素样生长因子1(IGF-1)含量定义。所需治疗范围定义为在距正常群体中预期的平均IGF-1含量的+2标准差至-2标准差之间，通过年龄组和性别分层。另外，出于观测正常范围内的患者差异的目的，试验测量在+/-1.5标准差的更窄范围内的IGF-1含量。
结果：
表10含有男性的IGF-1的正常治疗范围(+/-2SD)内的平均天数％、较窄正常治疗范围(+/-1.5SD)内的平均天数％和平均Cmax(最高浓度含量)，其在最后一个治疗周期间测量，表示为距正常群体平均IGF-1含量的标准差。
表10：人类II期临床试验结果。
含有将通常指定为成年患者的初始治疗剂量的累积每周hGH剂量的50％的每周两毫克hGH-CTP具有定义为成人III期中的男性和女性的起始剂量的高可能性。
不存在安全性和/或耐受性问题的迹象，且未指示当以高剂量使用hGH-CTP时，在患者中诱导过多含量的IGF-1或甚至正常范围以上的含量。
II期IGF-1概述和观点
MOD-4023II期研究设计和目标：
完成证实CTP-hGH-CTP-CTP(MOD-4023)每周投予方案的两阶段II期研究(参见图10)。试验为在当前进行每天hGH治疗的生长激素缺乏(GHD)的患者中进行的切换研究，所述患者在其MOD-4023投予之前的每天治疗时考虑为经标准化，如通过正常范围(±2SDS)内的IGF-1SDS含量反映。研究的阶段I为通过第4剂量的MOD-4023之后的一周期间的完全药物动力学-药效动力学(PK-PD)分析支持的4周剂量发现研究(4次注射)。此部分的主要目标为鉴别IGF-1含量保持在界定范围内的治疗剂量范围。另一目标为评估3个不同剂量/乘数下的MOD-4023的PK-PD概况，且证实剂量依赖性反应。研究的第二阶段(阶段II)为16周MOD-4023治疗和剂量滴定时段。继续阶段II的所有患者以相同MOD-4023剂量水平(其个人、最佳化、每周累积r-hGH剂量的61.7％)开始，但可基于其监测的IGF-1含量修改其剂量。
在研究的第一部分，基于每周累积的hGH的百分比投予剂量以评估MOD-4023的每周方案之后的初始反应。举例来说：随机化到55％群体的每天接受1mg hGH的患者每周注射1毫克×7天×0.55剂量的MOD-4023。
结果
本研究的主要功效端点为在阶段I期间最后一次剂量投予之后处于正常范围内的IGF-1含量的平均时间间隔(以小时表示)。在最终分析中，所述周期间的大部分患者的IGF-1含量持续整周在正常范围内(表11)。在最终时间点在指定SDS范围内的患者被指定168小时的时间间隔。患者中没有一个在Cmax处超过+2SDS，指示不存在过度的IGF-1含量。85％的男性(28/33男性)具有在正常范围(±2SDS)内的平均IGF-1SDS(图11)。所有三个群体的处于±正常范围内的IGF-1含量的平均时间间隔不显示显著改变，因为所有平均时间间隔在彼此的1个标准差内。
表11：在阶段I期间在第4剂量投予之后处于±2SDS内的IGF-1的时间间隔
如所预期，投予每周hGH的37％导致在正常范围的下部部分的IGF-1SDS值和在正常范围内的较短持续时间。当投予较高剂量(每周累积hGH剂量的55％)时，观测到如通过正常范围内的持续时间反映的IGF-1含量的显著提高。
相比于基线的剂量依赖性IGF-1反应显示于图12中。图12中呈现的结果支持IGF-1含量以使得能够调节IGF-1每周概况的MOD-4023剂量依赖性方式增加的观点。另外，给药后120-168h相对于IGF-1值的基线的平均改变返回到基线值，表明IGF-1低谷含量在此标准化生长激素缺乏的成人(GHDA)群体中稳定而不具有退化(图12)。
表示每天治疗的标准化患者的平均IGF-1暴露的Cavg(AUC/时间)相比于相同患者的每周MOD-4023治疗(AUC 0-24/24h分别相对于AUC 0-168/168h)。累积每周hGH剂量的55-123.4％的每周剂量提供可比IGF-1暴露(如通过Cavg反映)，而对于用每周剂量的37％治疗的患者观测到减小的Cavg，其由于相对低的每周剂量而符合我们的期望(表12和13)。
表12：在MOD-4023投予之前向生长激素缺乏的成人皮下投予r-hGH之后的IGF-1的药效动力学参数的概述(阶段1；4周)
*平均值±标准差(N)。
表13：向生长激素缺乏的成人皮下投予MOD-4023之后的IGF-1的药效动力学参数的概述(阶段I；4周)
基于II期阶段I的PD分析，得出以下推论:1)尽管研究目标并非使患者IGF-1含量最佳化，即将IGF-1SDS值定向0(由于IGF-1SDS最佳化需要相对较长滴定时段)，仍可确立每周投予MOD-4023的治疗剂量范围：每天hGH的每周累积剂量的约56％-123％。2)每周MOD-4023投予之后的IGF-1概况相对平坦，如通过Cmax与Ctrough之间的相当小的差异反映。3)表示平均每周IGF-1暴露的Cavg(AUC 0-168/168h)与第4天的值相关。因此，MOD-4023投予后的第4天选择为IGF-1含量的监测日。
II期阶段II(4个月延长)结果和观点：
每周投予MOD-4023以在最优剂量下且持续较长时段将IGF-1维持在正常范围内的能力在研究的第二部分(阶段II-4个月延长时段；图10)期间得以解决。在这一研究中，来自第一阶段的相同患者群体经投予其hGH每周剂量的61.7％且每两周地监测IGF-1。如在注射后第4天测量，大部分患者在整个研究期间将IGF-1SDS值维持在正常范围内。展示低于正常范围的IGF-1含量的患者经进一步滴定且其MOD-4023剂量增加(与临床实践符合)。
少数具有低于正常范围的IGF-1SDS值的患者需要另外滴定但展示IGF-1SDS的显著改进，指示IGF-1概况可通过MOD-4023剂量递增/递减最佳化。如图13中所呈现和下文表14中所概述，需要极好的反应性和最小剂量改变。
表14：在阶段II期间的所需剂量改变的概述。
剂量改变数目 男性 女性
无剂量改变 (34个中的)22个 (8个中的)3个
1个剂量改变 (34个中的)6个 (8个中的)1个
2个剂量改变 (34个中的)3个 (8个中的)3个
3个剂量改变 (34个中的)3个 (8个中的)1个
基于第4天IGF-1SDS值(相关于Cavg)，对于个别患者观测到相比于研究的阶段I的IGF-1含量的显著改进。此观测进一步支持必需调节时段以达到最优IGF-1含量和概况的观点。已知女性对hGH置换处理(以及MOD-4023)较不敏感且通常需要较高剂量和较长滴定时段。另外，如在第4天测量的IGF-1SDS含量恒定地维持于4个月延长时段期间的正常范围内的类似值，指示可以每周方案投予MOD-4023。在连续投予MOD-4023之后，未在第4天观测到IGF-1含量的重大减少，指示沿着研究维持IGF-1的“正弦”特性的Cmax和Ctrough，再次证实MOD-4023的每周方案。
总之，MOD-4023应排除对于治疗GHD所需的现在的许多注射的需要。本研究的结果已展示MOD-4023可每周注射一次且达成评估的临床功效端点，同时维持有利的安全概况。需要较不频繁的注射的GH治疗方案可改进顺应性和潜在的总体结果。
因此，基于获得的IGF-1概况和II期安全性和耐受性结果，III期研究的推荐注射频率和剂量为：每周单次注射含有针对每一患者个性化的累积每周hGH剂量的61.7％的MOD-4023。
实例10
投予CTP修饰型式的人类生长激素(hGH-CTP)改进青春期前生长激素缺乏(GHD)的儿童的药物动力学
进行随机化、开放标签、II期临床试验以评估相比于可商购的标准每天重组人类生长激素的三种MOD-4023剂量的安全性、耐受性药物动力学和药效动力学特性。研究由6个月筛选和两个活性治疗周期组成：包括PK/PD取样的6个月治疗，接着为额外6个月连续重复给药时段，如图14中所概述。次要目标为评估青春期前生长激素缺乏(GHD)的儿童中的MOD-4023的三种不同剂量的药物动力学(PK)和药效动力学(PD)概况和基于安全性和功效选择用于后续3期研究的MOD-4023的最优剂量。
为了以渐进方式将未治疗患者引入分配的MOD-4023剂量(参见表15)，实施逐步剂量增加。所有患者经随机化而以低MOD-4023剂量(0.25mg/kg)接受持续2周的三个MOD-4023剂量中的一个开始的治疗。基于患者的剂量分配，这之后跟着剂量每两周增加到下一剂量水平，直到已达到最终分配的剂量。
表15：剂量群体
群体 MOD-4023/Genotropin剂量
1 0.25毫克MOD-4023蛋白质/千克/周，等效于每周0.18毫克hGH/千克注射。
2 0.48毫克MOD-4023蛋白质/千克/周，等效于每周0.35毫克hGH/千克注射。
3 0.66毫克MOD-4023蛋白质/千克/周，等效于每周0.48毫克hGH/千克注射。
4 Genotropin：0.034毫克/千克/天。
在目标剂量的第二剂量投予之后，如表16中所述地进行有限(基于群体)PK和PD取样。
表16：MOD-4023群体的剂量增加方案
分配到MOD-4023剂量群体的患者在群体内随机化到三组中的一个且进行有限PK/PD取样(每个患者4个样品，经一周的时段)(根据下表17)。
表17：MOD-4023群体PK和PD取样方案
分配到群体1的患者在第2剂量的MOD-4023之后经历有限PK/PD取样(V2a-g-第2周)且在第6周期间给药之后4天返回医疗中心进行单次问诊(V4h)。
分配到群体2的患者在第2周期间给药之后4天到医疗中心进行单次问诊(V2h)，在第4剂量的MOD-4023之后经历有限PK/PD取样(第4周：分配剂量水平下的第二剂量；V3a-g)且在第6周期间给药之后4天返回到医疗中心进行单次问诊(V4h)。
分配到群体3的患者在第2和4周期间给药之后4天到医疗中心进行单次问诊(V2h和V3h)且在第6剂量的MOD-4023之后经历有限取样(第6周：分配剂量水平下的第二剂量，V4a-g)。
在问诊2a和2h、3a和3h以及4a和4h处，患者经历身体检查、生命体征、AE、局部耐受性、伴随药物、葡萄糖代谢参数(空腹葡萄糖和胰岛素；HbA1C仅在V4处)、其它激素含量(TSH、fT4、T3、皮质醇)、常规安全性生物化学和血液学(问诊2a和2h、4a和4h)、患者的身高和体重、脂质代谢参数以及IGF-1和IGFBP-3血清含量。
分配到Genotropin群体(群体4)的患者在治疗的第2与第6周期间返回医疗中心进行访问2和4。进行以下程序：身体检查、生命体征、AE、局部耐受性、伴随药物、葡萄糖代谢参数(空腹葡萄糖和胰岛素；HbA1C仅在V4处)、其它激素含量(TSH、fT4、T3、皮质醇)、常规安全性生物化学和血液学、患者的身高和体重、脂质代谢参数、IGF-1和IGF-1BP-3血清含量(图17)。
另外，在第8Genotropin剂量(给药第2周的起始)之后，分配到Genotropin群体的患者随机化到三组中的一个且经历有限PK/PD取样(每个患者4个样品，经24小时的时段)(根据下表18)：
表18：Genotropin群体PK和PD取样方案(问诊2)
在研究的的前6周之后，所有患者在每月基础上(第10、14、18、22和26周)到医院问诊。分配到MOD-4023剂量群体(群体1-3)的患者被要求在MOD-4023给药之后4天返回以获得MOD-4023、IGF-1和IGFBP-3含量和进行常规安全性评估。另外，在5个月给药之后，分配到MOD-4023给药的患者被要求在给药之前的早晨数小时返回医疗中心以获得最低含量MOD-4023和PD(IGF-1和IGF-1BP-3)样品。分配到Genotropin剂量群体(群体4)的患者被要求在相关给药周期间的任一天返回。
结果：
所有患者的研究人口统计呈现于下表19中：
表19：阶段2试验基线人口统计：
以最终投予剂量向未治疗GHD投予的MOD-4023的平均PK概况提供于图15中，同时PK参数提供于下表20中：
表20：比较平均PK参数
如所预期，一周投予一次的MOD-4023展示延长的半衰期，其显示为相比于每天hGH高8倍。另外，观测到剂量依赖性反应，其如通过每一MOD-4023剂量的AUC值反映。
剂量依赖性反应维持于整个每周投予MOD-4023的前6个月中(数据未示出)。
为hGH活性的经证实替代标记物的IGF-1也以剂量依赖性含量增加(图23)，在所述周的大部分维持目标值(-2高度SD评分[SDS]以上)而无过度含量(>2SDS，图21)。IGF-1SDS含量在不达到2SDS以上的过度含量的情况下，在研究的前6个月期间继续以剂量依赖性方式适当地升高(图16)。
hGH处理组(群体4)也展示与在MOD-4023的两个最高群体的情况下所观测的趋势极类似的IGF-1SDS值的升高。此外，当MOD-4023投予在约第15周达到稳态值时，IGF-1BP-3值也以剂量依赖方式增加(分别地，图17和18)。总而言之，IGF-1和IGF1BP-3的两个药效动力学概况证实MOD-4023每周单次注射可替换类似剂量范围的7次每天注射。
在预剂量和每周给药MOD-4023或每天给药hGH之后6个月监测高度速度。对于所有群体，获得极好的生长反应而不具有不同群体之间的统计差异(表21和图19)，进一步证实如同每天hGH，每周注射MOD-4023可使得能够恰当生长。
表21 MOD-4023 6m按年计算的高度速度-所有完成6m治疗的患者
群体 剂量 N 平均值(CM) 标准差
群体1 0.25mg/kg/w MOD-4023 9 13.48 2.71
群体2 0.48mg/kg/w MOD-4023 9 12.25 2.64
群体3 0.66mg/kg/w MOD-4023 10 14.37 5.26
群体4 0.034μg/kg/d Genotropin 7 15.46 2.68
历史数据-每天hGH ～10
同时，也获得高度速度SDS的极好增加(表22、表23和图20)。最后，δ高度SDS展示与患者的追赶生长极好的相关性(图22)。
表22：MOD-4023小儿阶段2-预研究HV SDS结果
表23：MOD-4023小儿阶段2-6m HV SDS结果
结论
所有剂量提供良好追赶生长反应。初步统计分析指示群体之间不存在统计显著差异但存在一些关于每群体的患者的限制数目和相对重度GHD患者的限制。
实例11
MOD-4023的配方开发
蛋白质：MOD-4023为用于皮下投予的长效重组人类生长激素(hGH)。MOD-4023由融合到人类绒膜促性腺激素(hCG)的β链的C端肽(CTP)的三个复本的hGH组成；CTP包括四个O糖基化位点并因此，蛋白质为具有至多十二个O连接的碳水化合物的275个氨基酸的单链。蛋白质制造于来自生产克隆体的CHO细胞中。
生产克隆体：克隆体#2为用于早期毒理学研究，I期和II期(成人)的初始克隆体。此克隆体的DS和DP的稳定性数据在-20℃和5℃下可用至多2年。进行转化为新生产克隆体(克隆体#28)以改进产率和克隆体稳定性。克隆体#28DP支持儿童中的长期毒理学研究和II期，且将支持所有其它临床活动和商业制造。此克隆体的DP的稳定性数据在-20℃和5℃下可用至多1年。
制造CMO：通过Xcellerex(美国)在早期执行MOD-4023的制造且支持非临床研究直到II期。方法转移到Rentschler Biotechnologie(RB)(德国)。已在RB生产两个GMP批次。
额外信息
物理化学特性-
高度糖基化且带负电，pI＝3-4.5
密度：1.0216g/ml
可溶于水溶液中
DS和DP两者的液体调配物：10mM柠檬酸盐，147mM NaCl，pH 6。
DS的最终浓度：40mg/ml
DP的最终浓度：5、10、20和40mg/ml
一次包装-
2R小瓶(Schott)
塞子(West)
铝密封件(West)
未来一次包装-PEN装置
配方最佳化的目标
开发用于MOD-4023的稳定液体调配物：
1.第一目标：在小瓶中在5℃下的2年稳定性
2.第二目标：在滤筒中在5℃下的2年稳定性
所需的分析测试：
RP-HPLC(经验证的方法)
SEC-HPLC(经验证的方法)
CZE(TBD)(经确立的方法)
时间表：
基于稳定性数据，可采用25℃下的2w来预测5℃下的产物稳定性以使得能够对综合基质调配物研究进行初步评估。
稳定性数据
数据显示非GMP和GMP批料产生于10mM柠檬酸盐，147mM NaCl，pH 6中(图24)。数据也显示MOD-4023克隆体2在5℃下在20mg/m下稳定24个月且在5mg/ml与20mg/ml之间存在类似稳定性概况(参见图25A和25B)。此外，MOD-4023克隆体2在室温下稳定3个月(参见图26)。MOD-4023克隆体28在5℃下在20mg/ml或40mg/ml下稳定12个月；DP主峰规格>88％(图27A和图27B)。MOD-4023克隆体28在室温下稳定至少一个月(图28A)。
基于克隆体28与克隆体2(其在5℃下稳定24m)之间的相似性，预期在Xcellerex(XC)产生的克隆体28将在5℃下稳定24m；DP主峰规格>88％(图28B)。
制造MOD-4023
在T＝0处在Xcellerex(XC)与Rentschler(RB)DS之间的可比概况(图29)。图30-34显示XC与RB之间的稳定性差异。等电点聚焦(IEF)表明在3.5到4.2的pI取值范围内存在类似带型。在一个XC批次中，在高pI边界中存在较少暗淡同功异型物，且在RB批次中，在低pI边界中存在较多暗淡同功异型物(图35A)。另外，相比于RB样品，在XC样品中存在更多扩散带(图35B)。
额外观测显示两个峰(3和5-关于峰定义，参见下文)的形成均为温度依赖性的且在高温下加速(图36A-D))。另外，在pH＝4下培育至多5天和在pH＝12下培育至多2h之后，峰值3的％无改变(图37B、37D)且在pH＝4下培育至多6h之后，峰值的％无改变。但是，在6h之后，观测到峰％的急剧增加；在pH 12下培育至多2h-峰消失(图37A-D)。
RB下的强制降解研究(克隆体28)
制备MOD-4023原料药的加压样品(65℃下持续约三天)用于MOD-4023原料药中的相关形式5的分析，因为峰在未加压样品的LOQ下方。
为了测试RP-HPLC相关形式的pH效应，测试三种样品：
RB-40mg/ml，pH＝5.9。
RB-10mg/ml，pH＝6.2。
XC-40mg/ml，pH＝6.2。
结果提供于图38和39中。
相关形式峰(1-7)的分离和表征-M-扫描
峰1-脱去酰胺基的MOD-4023的氧化
峰2-MOD-4023的去酰胺
峰3-MOD-4023的部分氧化
峰5-MOD-4023.二硫化物的氨基酸残基167与168之间以及氨基酸残基171与172之间的肽键裂解
峰6和峰7-截短形式
结论(参见图24-39)
稳定性
克隆体2衍生的产物在5℃下稳定至多2年。
在XC下制造的克隆体28衍生的产物在5℃下稳定至少1年，概况与克隆体2类似。
在RB下制造的克隆体28衍生的产物具有改变的稳定性概况，具有加速产生的相关形式(主峰5)和产生的新峰(峰7)(先前未观测到)。
前述研究显示峰3和5具有与主峰类似的Mw且与抗hGH对应MOD-4023带反应。
峰3和5两者均为温度依赖性的(当温度增加时，峰的％增加)。
在-20℃和5℃下的培育期间未观测到HMW形式的百分比的改变。
不同温度(5、25、37、50和65℃)下的RB产物GMP1(在培育2周之后)的稳定性展示峰7形成在25℃和37℃下加速，但其未在50和65℃下观测到。
在65℃下培育RB样品10min，接着在25℃下培育根除峰7的产生(在25℃下2周之后)。
已参看附图描述本发明的优选实施例，应理解，本发明不限于精确实施例，且可由所属领域的技术人员在不脱离如所附权利要求书中界定的本发明的范围或精神的情况下在其中实现各种变化和修改。

Claims (31)

1.一种药物调配物，其包含缓冲液、张力剂和CTP修饰的多肽，所述多肽由生长激素和连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成。
2.根据权利要求1所述的药物调配物，其中所述缓冲液为10mM柠檬酸盐。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的药物调配物，其中所述张力剂为147mM氯化钠。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物为液体调配物。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物在约6.2-6.4的pH下。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的药物调配物，其中至少一个CTP的序列由选自由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的群组的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的药物调配物，其中所述至少一个CTP为糖基化的。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的药物调配物，其中所述至少一个CTP经截短。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的药物调配物，其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成。
10.根据权利要求9所述的药物调配物，其中所述信号肽的序列如SEQ ID NO:19中所阐述。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的药物调配物，其中至少一个CTP任选地经由连接子连接到所述生长激素。
12.根据权利要求11所述的药物调配物，其中所述连接子为肽键。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的药物调配物，其中所述多肽每周投予一次或每两周投予一次。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的调配物，其中所述个体为成人或儿童。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的调配物，其中所述生长激素为人类生长激素(hGH)。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的调配物，其用于一周一次地向具有生长激素缺乏的个体投予。
17.根据权利要求16所述的调配物，其中所述投予为静脉内或皮下投予。
18.一种制造根据权利要求1到16所述的用于一周一次向具有生长激素缺乏的个体投予的药物调配物的方法，所述方法包含以下步骤：
a.通过使连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP连接而修饰所述生长激素；
b.在6.2-6.4的pH下混合步骤a.中的所述经修饰生长激素与所述缓冲液和所述张力剂；以及
c.用所述调配物预填充注射器。
19.一种用根据权利要求1到16中任一项所述的调配物填充注射器的方法，其包含以下步骤：
a.调配具有预定量的CTP修饰的hGH的所述CTP修饰的hGH的一周一次剂型；和
b.用所述调配物填充所述注射器。
20.一种用于一周一次向具有生长激素缺乏的个体投予的药物组合物，其包含CTP修饰的多肽，所述CTP修饰的多肽由生长激素和连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒膜促性腺激素CTP组成。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中至少一个CTP的序列由选自由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的群组的氨基酸序列组成。
22.根据权利要求20到21中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一个CTP为糖基化的。
23.根据权利要求20到22中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一个CTP经截短。
24.根据权利要求20到23中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽任选地由连接到所述一个CTP的氨基末端的信号肽组成。
25.根据权利要求9所述的药物调配物，其中所述信号肽的序列如SEQ ID NO:19中所阐述。
26.根据权利要求20到24中任一项所述的药物组合物，其中至少一个CTP任选地经由连接子连接到所述生长激素。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述连接子为肽键。
28.根据权利要求20到27中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽每周投予一次或每两周投予一次。
29.根据权利要求20到28中任一项所述的药物组合物，其中所述个体为成人或儿童。
30.根据权利要求20到29中任一项所述的药物组合物，其中所述生长激素为人类生长激素(hGH)。
31.一种每周一次剂型，其包含根据权利要求1到15中任一项所述的药物调配物或根据权利要求20到30中任一项所述的药物组合物。
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