CN104487082A - 长效胃泌酸调节素变体及其生产方法 - Google Patents

长效胃泌酸调节素变体及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)修饰的双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂及其生产和使用方法。在一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。

Description

长效胃泌酸调节素变体及其生产方法
技术领域
本发明涉及绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)修饰的双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂及其生产和使用方法。
背景技术
胃泌酸调节素(OXM)是在食物摄入后通过肠L细胞分泌到血流内的37aa肽，其诱导脑中的饱腹感。OXM也是双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。它涉及食物摄入调节，并且显示抑制食物摄入并降低啮齿类动物和人两者中的体重。然而，OXM具有相对极短的半衰期，并且需要超生理剂量的重复每日施用，以便在人中实现药理学效应。因此，存在延长OXM的血清半衰期以使得其以后更顺应在动物和人受试者中的预防和治疗目的的必要。
本发明利用基于肽的技术用于延长蛋白质和肽特别是OXM的血清半衰期。该技术基于天然肽，hCG的β链的C末端肽(CTP)。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在另一个实施例中，本发明提供了产生CTP修饰的多肽的方法，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤。
在一个实施例中，本发明提供了延长双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的生物半衰期的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此改善所述激动剂的生物半衰期。
在另一个实施例中，本发明提供了改善双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端的步骤，由此改善所述激动剂的曲线下面积(AUC)。
在一个实施例中，本发明提供了降低GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的给药频率的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低所述激动剂的给药频率。
在另一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽用于诱导受试者中的葡萄糖耐受的用途，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽用于预防通过受试者的不希望的重量增加的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，获得重量增加的危险是由于心理病症，或是由于通过受试者的获得重量的遗传倾向。在另一个实施例中，心理病症是抑郁症、焦虑症或创伤后应激障碍(PTSD)。
在另一个实施例中，本发明提供了包含CTP修饰的多肽的组合物用于预防、降低或抑制受试者中的食物摄入的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的肥胖的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
在另一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的II型糖尿病的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
在一个实施例中，本发明提供了CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的代谢障碍的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
本发明的其他特征和优点根据下述详述例子和附图将变得显而易见。然而，应当理解详述和具体例子在指示本发明的优选实施例的同时，仅给出作为举例说明，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰根据该详述对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
下述附图构成本说明书的一部分，并且包括以进一步证实本公开内容的某些方面，本发明通过参考与本文呈现的具体实施例的详述组合的这些附图中的一个或多个可得到更好理解。
图1显示了纯化的OXM-CTP变体的PAGE和蛋白质印迹(WB)分析：OXM-CTP-CTP-CTP、OXM-CTP 4X、OXM-CTP 5X。A.OXM样品和OXM-CTP变体(10和2μg蛋白质/泳道)的考马斯染色。B.使用抗OXM的OXM-CTP变体的WB分析。
图2显示了来自OXM-CTP变体的纯化过程的样品的PAGE分析：CTP-OXM-CTP、CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP和CTP-CTP-OXM。
图3显示了OXM肽和OXM-CTP变体在SD-1大鼠中的三次序贯实验的PK概况。
图4显示了如在C57BL/6小鼠中测量的OXM肽和OXM-CTP变体的葡萄糖耐受测试的结果。
图5显示了如在C57BL/6小鼠中测量的OXM肽和OXM-CTP变体的急性食物摄入的结果。A.与媒介物比较在接受处理的小鼠中累积的食物摄入百分比。B.关于经过研究的各个时间间隔的食物摄入百分比。
具体实施方式
在一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在另一个实施例中，该激动剂是蛋白质、多肽或肽。在另一个实施例中，该肽是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，CTP修饰的多肽包括包含少于50个氨基酸的肽和至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，所述绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该肽的氨基末端或羧基末端。在另一个实施例中，该肽是胃泌酸调节素(OXM)。
胃泌酸调节素肽可用于治疗代谢障碍例如糖尿病和肥胖。然而，由于肽的短半衰期及其在体内的低稳定性，需要超生理剂量的每日重复施用以便实现在人中的药理学效应。如下文证实的(参见实例)，与天然OXM相比较，本发明的所有OXM-CTP变体均在大鼠中证实优良的药代动力学概况，伴随在暴露中的大量增加和延长的半衰期。令人惊讶的是，与CTP-OXM-CTP-CTP变体相比较，OXM-CTP-CTP变体证实优良的PK参数，所述CTP-OXM-CTP-CTP变体融合至3个CTP拷贝，一个在N末端中并且两个在C末端中串联。
在SC施用后，2个和3个CTP与OXM的C末端的融合导致与天然肽半衰期相比较相似的增加倍数(分别为21.6和21)(参见本文实例3)。因此，预期四个和五个CTP与OXM的C末端的融合不显著延长半衰期超过20倍。然而，对于OXM-4CTP变体证实OXM半衰期的令人惊讶的显著增加(即50倍)，并且OXM-5CTP变体具有在暴露中的30倍增加，如通过曲线下面积(AUC)参数反映的(参见本文实例3)。
因此，在一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素(OXM)肽和附着至所述胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在一个实施例中，如本文描述的CTP修饰的OXM包含经由在其氨基末端或羧基末端上的肽键连接到至少一个CTP单元的全长OXM或其活性片段，在其氨基末端上没有CTP。在另一个实施例中，如本文描述的CTP修饰的OXM包含经由在其羧基末端上的肽键连接到至少一个CTP单元的全长OXM或其活性片段，在其氨基末端上没有CTP。在另一个实施例中，如本文描述的CTP修饰的OXM包含经由在其氨基末端上的肽键连接到至少一个CTP单元的全长OXM或其活性片段，在其羧基末端上没有CTP。在另一个实施例中，本发明提供了编码如本文上文所述的经改造的OXM的核酸分子，在一个实施例中，所述经改造的OXM包含附着至其羧基末端或其氨基末端的至少一个CTP。
在另一个实施例中，CTP序列包含：DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:1)。在另一个实施例中，CTP序列包含：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:2)。在另一个实施例中，CTP序列包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的序列的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明的羧基末端肽(CTP)肽包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸112到第145位的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸118到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。在另一个实施例中，CTP序列还从人绒毛膜促性腺激素的第112-118位之间的任何位置开始并终止于第145位。在一些实施例中，CTP序列肽长28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且在CTP氨基酸序列的第112、113、114、115、116、117或118位处开始。
因此，在一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸112到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸113到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸114到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸115到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸116到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸117到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2中所示。
在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸112到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸113到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸114到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸115到第145位的氨基酸序列，如SEQ IDNO:1中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸116到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸117到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1中所示。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包含从人绒毛膜促性腺激素的氨基酸118到第145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1中所示。
在一个实施例中，截短的CTP包含SSSSKAPPPSLP(SEQ ID NO:3)。在另一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:3的前10个氨基酸。在另一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:3的前11个氨基酸。
在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前14个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前13个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前12个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前11个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前10个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前9个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的前8个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的前7个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的前6个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的前5个氨基酸。
在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，如全文以引用的方式并入本文的美国专利号5,712,122中所述，所述绒毛膜促性腺激素CTP的变体与天然CTP相差1-5个保守氨基酸置换。在另一个实施例中，CTP肽是与天然CTP相差1个保守氨基酸置换的绒毛膜促性腺激素CTP的变体。在另一个实施例中，CTP肽是与天然CTP相差2个保守氨基酸置换的绒毛膜促性腺激素CTP的变体。在另一个实施例中，CTP肽是与天然CTP相差3个保守氨基酸置换的绒毛膜促性腺激素CTP的变体。在另一个实施例中，CTP肽是与天然CTP相差4个保守氨基酸置换的绒毛膜促性腺激素CTP的变体。在另一个实施例中，CTP肽是与天然CTP相差5个保守氨基酸置换的绒毛膜促性腺激素CTP的变体。
在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少70％同源。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少80％同源。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少85％同源。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少90％同源。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少95％同源。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少98％同源。
在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTPDNA序列或其肽至少70％同源。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽至少80％同源。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽至少85％同源。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTPDNA序列或其肽至少90％同源。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽至少95％同源。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽至少98％同源。
在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个是截短的。在另一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的两个是截短的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的三个是截短的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的四个是截短的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的五个是截短的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的两个或更多个是截短的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的全部是截短的。
在一个实施例中，至少一个CTP经由接头附着至激动剂多肽。在另一个实施例中，至少一个CTP经由接头附着至激动剂多肽。在另一个实施例中，接头是肽键。
在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个是糖基化的。在另一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的两个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的三个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的四个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的五个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的两个或更多个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的全部是糖基化的。
在一个实施例中，本发明的CTP序列包含至少一个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含两个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含三个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包含四个糖基化位点。在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的一个或多个是完全糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的一个或多个是部分糖基化的。在一个实施例中，部分糖基化的指示CTP糖基化位点之一是糖基化的。在另一个实施例中，CTP糖基化位点中的两个是糖基化的。在另一个实施例中，CTP糖基化位点中的三个是糖基化的。
在一些实施例中，CTP序列修饰在允许使用较低剂量中是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许更少剂量中是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许安全、长效效应中是有利的。
在一些实施例中，如本文使用的“多肽”、“经改造的胃泌酸调节素”或“蛋白质”包含天然多肽(降解产物、以合成方法合成的多肽或重组多肽)和拟肽(通常为以合成方法合成的多肽)，以及其为多肽类似物的类肽和半类肽，在一些实施例中，所述多肽类似物具有致使包含胃泌酸调节素的多肽在人或动物受试者中甚至更稳定或更能够穿透到细胞内的修饰。
在一些实施例中，修饰包括但不限于C末端修饰，多肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH，主链修饰和残基修饰。用于制备拟肽化合物的方法是本领域众所周知的，并且例如在Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)中具体说明，所述参考文献以引用方式并入，如同在本文中完全阐述一样。这方面的进一步细节在下文提供。
在一些实施例中，该多肽内的多肽键(-CO-NH-)被替代。在一些实施例中，多肽键被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)替代。在一些实施例中，多肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)替代。在一些实施例中，多肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)替代。在一些实施例中，多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)替代，其中R是任何烷基，例如甲基、carba键(-CH2-NH-)。在一些实施例中，多肽键被羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)替代。在一些实施例中，多肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)替代。在一些实施例中，多肽键被烯属双键(-CH＝CH-)替代。在一些实施例中，多肽键被反向酰胺键(retro amide bond)(-NH-CO-)替代。在一些实施例中，多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)替代，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。在一些实施例中，这些修饰在沿多肽链的任何键上发生，并且在一个实施例中，同时在几个(2-3个)键上发生。
在一个实施例中，该多肽的天然芳香族氨基酸例如Trp、Tyr和Phe被置换为合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(naphthylelanine)(Nol)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或o-甲基-Tyr。在一些实施例中，本发明的多肽包括一个或多个经修饰的氨基酸或者一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施例中，“氨基酸”或“氨基酸序列”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；这些氨基酸通常在体内进行翻译后修饰，包括例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其他罕见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施例中，“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
在一个实施例中，本发明的多肽用于治疗剂中，所述治疗剂要求多肽包含处于可溶形式的胃泌酸调节素。在一些实施例中，本发明的多肽包括一个或多个非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于由于其含羟基侧链，能够增加多肽可溶性的丝氨酸和苏氨酸。
在另一个实施例中，本发明的经改造的胃泌酸调节素肽例如通过使用标准固相技术生物化学合成。在一些实施例中，这些生物化学方法包括专有的(exclusive)固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典溶液合成。
在一个实施例中，重组蛋白质技术用于生成本发明的经改造的胃泌酸调节素肽。在一些实施例中，重组蛋白质技术用于生成相对长的多肽(例如长于18-25个氨基酸)。在一些实施例中，重组蛋白质技术用于生成大量本发明的经改造的胃泌酸调节素肽。在一些实施例中，重组技术通过下述描述：Bitter等人，(1987)Methods in Enzymol.153:516-544；Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185:60-89；Brisson等人(1984)Nature 310:511-514；Takamatsu等人(1987)EMBO J.6:307-311；Coruzzi等人(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli等人，(1984)Science 224:838-843；Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,第421-463页，所述参考文献全文以引用的方式并入本文。
在另一个实施例中，CTP修饰的多肽包括包含少于50个氨基酸的肽和至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，所述绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该肽的氨基末端或羧基末端。在一个实施例中，本文提供的CTP修饰的多肽包括包含少于40个氨基酸的肽和至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，所述绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该肽的氨基末端或羧基末端。在另一个实施例中，本文提供的CTP修饰的多肽包括包含少于30、20或10个氨基酸的肽。在一个实施例中，包含少于50个氨基酸的肽是GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，包含少于50个氨基酸的肽是OXM。
在另一个实施例中，OXM包含下述氨基酸(AA)序列：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO:30)。在另一个实施例中，OXM由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成。在另一个实施例中，OXM包含CAS编号62340-29-8中所示的氨基酸序列，或由CAS编号62340-29-8中所示的氨基酸序列组成。
在另一个实施例中，OXM是人OXM或任何哺乳动物OXM。在另一个实施例中，OXM也被称为胰高血糖素-37或生物活性的肠胰高血糖素。在另一个实施例中，OXM是双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，术语OXM包括OXM的生物活性片段。在另一个实施例中，生物活性OXM从SEQ ID NO:30的氨基酸30延伸到氨基酸37。在另一个实施例中，生物活性OXM从SEQ ID NO:30的氨基酸19延伸到氨基酸37。在另一个实施例中，本发明的OXM对应于两个C末端氨基酸从其中缺失的八肽。在另一个实施例中，本发明的OXM对应于如本文描述的保留OXM活性的SEQ ID NO:30的任何片段。
在一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素，一个CTP在胃泌酸调节素肽的羧基末端上并且一个CTP在胃泌酸调节素肽的氨基末端上。在另一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素肽的羧基末端上的胃泌酸调节素。在另一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素，两者均在胃泌酸调节素肽的氨基末端上。在另一个实施例中，三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素，一个CTP在胃泌酸调节素肽的氨基末端上并且两个CTP在胃泌酸调节素肽的羧基末端上。在另一个实施例中，三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素肽的羧基末端。在另一个实施例中，四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素肽的羧基末端。在另一个实施例中，五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素肽的羧基末端。在另一个实施例中，1-10个CTP附着至胃泌酸调节素的氨基末端或羧基末端。在另一个实施例中，1-10个CTP附着至胃泌酸调节素的氨基末端。在另一个实施例中，1-10个CTP附着至胃泌酸调节素的羧基末端。
在另一个实施例中，本文提供的是产生CTP修饰的多肽的方法，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素(OXM)肽和附着至所述胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的步骤。
在一个实施例中，本文提供的是延长包含少于50个氨基酸的肽的生物半衰期的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此改善该激动剂的生物半衰期。
在一个实施例中，本文提供的是延长双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的生物半衰期的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此改善该激动剂的生物半衰期。
在另一个实施例中，本文提供的是延长胃泌酸调节素的生物半衰期的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素的氨基末端或羧基末端的步骤，由此改善胃泌酸调节素的生物半衰期。
在一个实施例中，本文提供的是改善包含少于50个氨基酸的肽的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该激动剂的羧基末端的步骤，由此改善该激动剂的曲线下面积(AUC)。
在一个实施例中，本文提供的是改善双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该激动剂的羧基末端的步骤，由此改善该激动剂的曲线下面积(AUC)。
在另一个实施例中，本文提供的是改善胃泌酸调节素的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至胃泌酸调节素的羧基末端的步骤，由此改善胃泌酸调节素的曲线下面积(AUC)。
在一个实施例中，术语胃泌酸调节素还包括已知胃泌酸调节素的同系物。在一个实施例中，同系物是功能同系物。在另一个实施例中，术语“功能的”指本文提供的同系物、肽或蛋白质具有的抑制食欲的能力。该术语还指本文提供的同系物、肽或蛋白质具有的延长另一种蛋白质或肽的生物半衰期的能力。在另一个实施例中，本文提供的同系物、肽或蛋白质的生物半衰期(T1/2)指蛋白质、肽或同系物的量的一半降解或不存在于受试者中的生物介质中花费的时间。在另一个实施例中，生物介质是血清、脑脊髓液、组织、粘膜等等。
在一个实施例中，根据本发明的同源性还包含缺失、插入或置换变体，包括其氨基酸置换及其生物活性多肽片段。在一个实施例中，本文提供的变体包含保守置换，或者不显著改变胃泌酸调节素的三维结构的缺失、插入或置换。在另一个实施例中，缺失、插入或置换不改变胃泌酸调节素的目的功能，在一个实施例中，所述目的功能是与特定结合配偶体结合。
在一个实施例中，胃泌酸调节素与受体结合并介导食欲抑制。在另一个实施例中，该受体是双重GLP-1/胰高血糖素受体。在另一个实施例中，该受体是GLP-1受体。在另一个实施例中，该受体是胰高血糖素受体。在另外一个实施例中，该受体是本领域已知的与胃泌酸调节素结合的任何受体。
在另一个实施例中，本发明包括胃泌酸调节素的同系物。在一个实施例中，本发明提供了OXM同系物，在一个实施例中，所述OXM同系物指SEQID NO:30的肽的肽同系物。
在另一个实施例中，本发明包括具有食欲抑制活性的胃泌酸调节素的同系物。在另一个实施例中，本发明包括具有功能结合的胃泌酸调节素的同系物。在另一个实施例中，本发明包括具有食欲抑制和活性的如本文描述的胃泌酸调节素的同系物。在另一个实施例中，本发明包括具有功能结合的如本文描述的胃泌酸调节素的同系物。在另一个实施例中，本发明还包含例如如使用美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation)(NCBI)的BlastP软件，使用缺省参数测定的，与胃泌酸调节素至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源的多肽的同系物。
在一个实施例中，本文提供的是包含本文提供的CTP修饰的多肽的药物组合物。
应当理解包含如本文描述的元素或步骤的本发明的组合物和方法在另一个实施例中，可由这些元素或步骤组成，或在另一个实施例中，基本上由这些元素或步骤组成。在一些实施例中，术语“包含”指包括所示活性剂例如CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂，以及包括其他活性剂，以及如制药工业中已知的药学或生理学可接受的载体、赋形剂、润肤剂、稳定剂等。在一些实施例中，术语“基本上由……组成”指其中仅活性成分为所示活性成分的组合物，然而，可包括其他化合物，所述其他化合物用于使制剂稳定、保存等，但不直接涉及所示活性成分的疗效。在一些实施例中，术语“基本上由……组成”可指促进活性成分的释放的组分。在一些实施例中，术语“由……组成”指含有活性成分和药学可接受的载体或赋形剂的组合物。
应当理解包含如本文描述的元素或步骤的本发明的组合物和方法在另一个实施例中，可由这些元素或步骤组成，或在另一个实施例中，基本上由这些元素或步骤组成。在一些实施例中，术语“包含”指包括所示活性剂例如CTP修饰的胃泌酸调节素，以及包括其他活性剂，以及如制药工业中已知的药学或生理学可接受的载体、赋形剂、润肤剂、稳定剂等。在一些实施例中，术语“基本上由……组成”指其中仅活性成分为所示活性成分的组合物，然而，可包括其他化合物，所述其他化合物用于使制剂稳定、保存等，但不直接涉及所示活性成分的疗效。在一些实施例中，术语“基本上由……组成”可指促进活性成分的释放的组分。在一些实施例中，术语“由……组成”指含有活性成分和药学可接受的载体或赋形剂的组合物。
在一个实施例中，本发明提供了包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至三个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至四个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至五个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至三个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至四个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至五个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至四个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至五个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至四个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至五个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至五个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至五个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至六个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至七个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至八个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至九个CTP的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是包含胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至十个CTP的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至三个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至三个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至三个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的两个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至三个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的两个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的三个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至四个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的三个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的四个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至五个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的四个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的五个至十个CTP组成的多肽。
在一个实施例中，本发明提供了基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至六个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至七个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至八个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至九个CTP组成的多肽。在另一个实施例中，本文提供的是基本上由胃泌酸调节素和附着至该胃泌酸调节素的羧基末端的五个至十个CTP组成的多肽。
在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其氨基末端上没有CTP的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其氨基末端上缺乏CTP的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其羧基末端上具有至少一个CTP和在其氨基末端上没有CTP的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其羧基末端上具有如本文描述的CTP数目和在其氨基末端上没有CTP的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。
在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其氨基末端上没有CTP的胃泌酸调节素。在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其氨基末端上缺乏CTP的胃泌酸调节素。在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其羧基末端上具有至少一个CTP和在其氨基末端上没有CTP的胃泌酸调节素。在另一个实施例中，本文提供的是包含下述、基本上由下述组成或由下述组成的多肽：在其羧基末端上具有如本文描述的CTP数目和在其氨基末端上没有CTP的胃泌酸调节素。
在一个实施例中，CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含本文进一步提供的SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。在另一个实施例中，CTP修饰的多肽的氨基酸序列选自：本文进一步提供的SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
在另一个实施例中，本发明提供了编码如上文描述的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，多核苷酸包含本文进一步提供的SEQ ID NO:8、14、20、22、24、26或28。在另一个实施例中，多核苷酸选自本文进一步提供的SEQID NO:98、14、20、22、24、26或28。
在一个实施例中，本文提供的是包含本文提供的多核苷酸的表达载体。在另一个实施例中，本文提供的是包含表达载体的细胞。在另一个实施例中，本文提供的是包含表达载体的组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了包含如本文描述的表达载体的细胞。在另一个实施例中，本发明提供了包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽包含下述或由下述组成：GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本发明提供了包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。
在另一个实施例中，本发明提供了包含如本文描述的表达载体的组合物。在另一个实施例中，本发明提供了包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽包含下述或由下述组成：GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本发明提供了包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由该激动剂和附着至该激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，该激动剂是多肽或肽。在另一个实施例中，该肽是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本发明提供了包含如本文描述的细胞的组合物。在另一个实施例中，该细胞是真核细胞。在另一个实施例中，该细胞是原核细胞。
在一个实施例中，本发明提供了GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，本发明提供了如上文描述的重组胃泌酸调节素。在一个实施例中，本发明提供了如上文描述的经改造的胃泌酸调节素。在一个实施例中，如上文描述的经改造的胃泌酸调节素被称为CTP修饰的胃泌酸调节素。
在一个实施例中，附着至胃泌酸调节素的羧基末端的CTP串联附着至羧基末端。在一个实施例中，附着至胃泌酸调节素的氨基末端的CTP串联附着至氨基末端。
在一个实施例中，与非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相比较，如本文描述的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有等价或改善的生物活性。在另一个实施例中，与非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相比较，如本文提供的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有等价或改善的药理学测量。在另一个实施例中，与非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相比较，如本文提供的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有等价或改善的药物代谢动力学。在另一个实施例中，与非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相比较，如本文提供的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有等价或改善的药效学。
在另一个实施例中，术语“CTP肽”、“羧基末端肽”和“CTP序列”在本文中可互换使用。在另一个实施例中，羧基末端肽是全长CTP。每种可能性代表本发明的分开实施例。
在另一个实施例中，信号肽附着至CTP的氨基末端，如全文以引用的方式并入本文的US 7,553,940中所述。
在其他实施例中，术语经改造的胃泌酸调节素指成熟胃泌酸调节素的氨基酸序列。在其他实施例中，术语经改造的胃泌酸调节素指包括其信号序列或信号肽的胃泌酸调节素的氨基酸序列。
在另一个实施例中，“信号序列”和“信号肽”在本文中可互换使用。在另一个实施例中，当提及多核苷酸分子时，“序列”可指编码部分。每种可能性代表本发明的分开实施例。
在另一个实施例中，与不含至少一个CTP的相同GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相比较，包含如本文描述的至少一个CTP的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有增强的体内生物活性。在一个实施例中，增强的生物活性起源于经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的更长半衰期，同时维持至少一些生物活性。在另一个实施例中，增强的生物活性起源于由CTP修饰产生的增强的生物活性。在另一个实施例中，增强的生物活性起源于CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的更长半衰期和增强的功能性。
在一个实施例中，在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端处的至少一个CTP序列提供了增强的不受GLP-1/胰高血糖素受体激动剂降解的保护。在另一个实施例中，在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端处的至少一个CTP序列提供了增强的不受清除的保护。在另一个实施例中，在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端处的至少一个CTP序列提供了延长的清除时间。在另一个实施例中，在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端处的至少一个CTP序列增强其Cmax。在另一个实施例中，在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端处的至少一个CTP序列增强其Tmax。在另一个实施例中，在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端处的至少一个CTP序列延长其T1/2。
在另一个实施例中，本发明的缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂以与未经修饰的缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相同的方式使用。在另一个实施例中，本发明的缀合的胃泌酸调节素以与未经修饰的缀合的胃泌酸调节素相同的方式使用。在另一个实施例中，本发明的缀合的胃泌酸调节素具有在体内增加的循环半衰期和血浆停留时间、减少的清除率和增加的临床活性。在另一个实施例中，由于如本文描述的缀合的胃泌酸调节素的改善特性，该缀合物比相同胃泌酸调节素的未经修饰的形式更不频繁地施用。
在另一个实施例中，减少的施用频率导致改善的治疗策略，在一个实施例中，所述改善的治疗策略导致改善的患者依从，从而导致改善的治疗结果，以及改善的患者生活质量。在另一个实施例中，与常规的胃泌酸调节素缀合物相比较，已发现具有如本文描述的缀合物的分子量和接头结构的缀合物具有改善的效力、改善的稳定性、升高的AUC水平和增强的循环半衰期。
在另一个实施例中，本发明进一步提供了包含CTP修饰的多肽的药物组合物，所述CTP修饰的多肽由GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至胃泌酸调节素的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。
在另一个实施例中，本发明进一步提供了包含CTP修饰的多肽的药物组合物，所述CTP修饰的多肽由胃泌酸调节素和附着至胃泌酸调节素的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。
在另一个实施例中，本文提供的是包含如本文提供的缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的组合物。在另一个实施例中，本文提供的是包含如本文提供的缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物。在另一个实施例中，本文提供的是包含治疗有效量的如本文提供的缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物。在一个实施例中，根据诸如被治疗的具体病症、被治疗的患者的病症以及组合物中的其他成分的因素，来决定缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的治疗有效量。
在另一个实施例中，本文提供的是包含如本文提供的缀合的胃泌酸调节素的组合物。在另一个实施例中，本文提供的是包含如本文提供的缀合的胃泌酸调节素的药物组合物。在另一个实施例中，本文提供的是包含治疗有效量的如本文提供的缀合的胃泌酸调节素的药物组合物。在一个实施例中，根据诸如被治疗的具体病症、被治疗的患者的病症以及组合物中的其他成分的因素，来决定缀合的胃泌酸调节素的治疗有效量。
在一个实施例中，本发明的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有治疗用途。在另一个实施例中，本发明的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂具有预防用途。
在另一个实施例中，本发明的CTP修饰的胃泌酸调节素具有治疗用途。在另一个实施例中，本发明的CTP修饰的胃泌酸调节素具有预防用途。
在一个实施例中，本文提供的是降低受试者中的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的给药频率的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的给药频率。在另一个实施例中，CTP序列修饰在允许使用较低剂量中是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许更少剂量中是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许安全、长效效应中是有利的。
在另一个实施例中，本文提供的是降低受试者中的胃泌酸调节素的给药频率的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该胃泌酸调节素的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低该胃泌酸调节素的给药频率。在另一个实施例中，CTP序列修饰在允许使用较低剂量中是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许更少剂量中是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许安全、长效效应中是有利的。
在一个实施例中，本文提供的是降低受试者中的胆固醇的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该胃泌酸调节素的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低受试者中的胆固醇。
在另一个实施例中，本文提供的是降低受试者中的甘油的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至该胃泌酸调节素的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低受试者中的甘油。
在一个实施例中，本发明提供了长效OXM。在一个实施例中，本发明的长效OXM维持未经修饰的OXM的生物活性。在另一个实施例中，本发明的长效OXM包含OXM生物活性。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含降低消化分泌物。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含降低并延迟胃排空。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含小肠中的进食动力模式的抑制。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含通过五肽胃泌素刺激的酸分泌的抑制。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含胃生长抑素释放的增加。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含增强肽YY的效应。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含胃促生长素释放的抑制。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含氨基比林累积和cAMP产生的刺激。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含结合GLP-1受体。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含通过活化腺苷酸环化酶刺激H+产生。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含抑制组胺刺激的胃酸分泌。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含抑制食物摄入。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含刺激胰岛素释放。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含抑制外分泌胰液分泌。
在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含通过迷走神经间接机制抑制胰液分泌。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含降低通过小肠的水合矿物质(hydromineral)转运。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含刺激葡萄糖摄入。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含控制/刺激生长抑素分泌。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含食物摄入和体重增加两者中的降低。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含肥胖中的降低。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含食欲抑制。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含厌食症的诱导。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含降低超重和肥胖受试者中的体重。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含诱导脂肪激素瘦素和脂联素水平的变化。在另一个实施例中，本发明的长效OXM的生物活性包含增加能量消耗加上减少超重和肥胖受试者中的能量摄入。
因此，在一个实施例中，本发明提供了通过施用本发明的CTP修饰的OXM来实现上述OXM生物活性中的任一种的方法。在另一个实施例中，本发明进一步提供了用于降低受试者中的食物摄入、降低体重或两者的方法，所述方法包括给受试者施用CTP修饰的胃泌酸调节素肽的步骤。在另一个实施例中，受试者具有糖尿病。在另一个实施例中，受试者是超重的。在另一个实施例中，受试者是肥胖的。
在一个实施例中，当与本文提供的方法相关使用时，术语“降低、减少、下降等”指由先前测量或测定的水平或者由正常水平的100％降低。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低89-99％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低79-88％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低69-78％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低59-68％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低49-58％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低39-48％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低29-38％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低19-28％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低9-18％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低5-8％。在另一个实施例中，降低是由先前测定的水平降低1-4％。
OXM-CTP变体的体内生物活性在两种动物模型中进行评价，在小鼠中的IPGTT，其评估OXM在葡萄糖施用后诱导葡萄糖耐受的能力，和在消瘦大鼠中的食物摄入抑制，其评价OXM抑制动物的食物消耗的能力。证实OXM-CTP变体：CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP-CTP-CTP和OXM-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP诱导葡萄糖耐受，如通过与媒介物组相比较血糖AUC的20-30％降低反映的(参见本文实例4)。这些结果指示由于CTP融合物对于OXM与其受体结合的潜在立体干扰，OXM-CTP变体的生物活性在体内不被抑制。通过这些变体诱导的葡萄糖的显著降低与其改善的PK概况关联。因此，在一个实施例中，本文提供的是诱导受试者中的葡萄糖耐受的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此诱导受试者中的葡萄糖耐受，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素(OXM)肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在另一个实施例中，本文提供的是诱导受试者中的葡萄糖耐受的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此诱导受试者中的葡萄糖耐受，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽用于诱导受试者中的葡萄糖耐受的用途，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在一个实施例中，所述双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽在制备用于诱导受试者中的葡萄糖耐受的药剂中的用途，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在一个实施例中，所述双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在一个实施例中，本文提供的是增加受试者中的胰岛素敏感性的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此增加受试者中的胰岛素敏感性，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在一个实施例中，本文提供的是降低受试者中的胰岛素抗性的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此降低受试者中的胰岛素抗性，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在一个实施例中，本文提供的是增加受试者中的胰岛素敏感性并降低受试者中的胰岛素抗性的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此增加受试者中的胰岛素敏感性并降低受试者中的胰岛素抗性，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
评估OXM-CTP变体OXM-3CTP、OXM-4CTP和OXM-5CTP抑制食物摄入的能力。天然OXM仅在施用后的前一小时抑制食物摄入，然而，与OXM相比较，所有变体均体现大量延长的改善的食物摄入中的抑制。OXM-5CTP的累积食物抑制令人惊讶地持续至少141小时，从而突出了该变体延长的半衰期(参见本文实例5)。
因此，在一个实施例中，本文提供的是诱导受试者中的食物摄入抑制的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此诱导受试者中的食物摄入抑制，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素(OXM)肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在另一个实施例中，本文提供的是诱导受试者中的食物摄入抑制的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此诱导受试者中的食物摄入抑制，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
在另一个实施例中，本文提供的是预防、降低或抑制受试者中的食物摄入的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此预防、降低或抑制通过受试者的食物摄入，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，预防、降低或抑制通过受试者的食物摄入降低受试者发展不希望的重量增加的机会。在另一个实施例中，预防、降低或抑制受试者中的食物摄入降低受试者发展肥胖的机会。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽用于预防通过受试者的不希望的重量增加的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽在制备用于预防通过受试者的不希望的重量增加的药剂中的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是预防、降低或抑制受试者中的食物摄入的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此预防、降低或抑制通过受试者的食物摄入，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素(OXM)肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，预防、降低或抑制通过受试者的食物摄入降低受试者发展不希望的重量增加的机会。在另一个实施例中，预防、降低或抑制受试者中的食物摄入降低受试者发展肥胖的机会。
在另一个实施例中，本文提供的是预防通过受试者的不希望的重量增加的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此预防受试者中的重量增加，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，重量增加导致或造成受试者的肥胖。在另一个实施例中，获得重量增加的危险是由于心理病症，或是由于通过受试者获得重量的遗传倾向。在另一个实施例中，心理病症是抑郁症、焦虑症或创伤后应激障碍(PTSD)。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽用于预防通过受试者的不希望的重量增加的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽在制备用于预防通过受试者的不希望的重量增加的药剂中的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是预防通过受试者的不希望的重量增加的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物的步骤，由此预防受试者中的重量增加，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素(OXM)肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，重量增加导致或造成受试者的肥胖。在另一个实施例中，获得重量增加的危险是由于心理病症，或是由于通过受试者获得重量的遗传倾向。在另一个实施例中，心理病症是抑郁症、焦虑症或创伤后应激障碍(PTSD)。
在另一个实施例中，本文提供的是治疗受试者中的肥胖的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物，由此治疗受试者中的肥胖，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在另一个实施例中，受试者遗传上倾向于肥胖。在另一个实施例中，治疗肥胖的方法导致受试者中的体重降低。在另一个实施例中，体重中的降低是由于体脂降低。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的肥胖的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽在制备用于治疗受试者中的肥胖的药剂中的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是治疗受试者中的肥胖的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物，由此治疗受试者中的肥胖，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在另一个实施例中，受试者遗传上倾向于肥胖。
在一个实施例中，本文提供的是治疗受试者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物，由此治疗受试者中的II型糖尿病，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的II型糖尿病的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽在制备用于治疗受试者中的II型糖尿病的药剂中的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在一个实施例中，本文提供的是治疗受试者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物，由此治疗受试者中的II型糖尿病，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
在另一个实施例中，本文提供的是治疗受试者中的代谢障碍的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物，由此治疗受试者中的代谢障碍，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至该GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的代谢障碍的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是CTP修饰的多肽在制备用于治疗受试者中的代谢障碍的药剂中的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。在一个实施例中，所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
在另一个实施例中，本文提供的是治疗受试者中的代谢障碍的方法，所述方法包括给受试者施用有效剂量的包含CTP修饰的多肽的组合物，由此治疗受试者中的代谢障碍，所述CTP修饰的多肽包含胃泌酸调节素肽和附着至该胃泌酸调节素肽的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
在另一个实施例中，代谢障碍是糖尿病酮症酸中毒、或糖尿病或本领域已知的任何葡萄糖相关代谢障碍。在另一个实施例中，代谢障碍起因于受试者中的胰岛素缺失和葡萄糖过多。
在另一个实施例中，使用编码本发明多肽的多核苷酸分子合成本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂变体。在另一个实施例中，将编码本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的多核苷酸分子连接到表达载体内，所述表达载体包含顺式调节序列(例如启动子序列)的转录控制。在另一个实施例中，顺式调节序列适合于指导本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的组成型表达。在另一个实施例中，顺式调节序列适合于指导本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂肽的组织特异性表达。在另一个实施例中，顺式调节序列适合于指导本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂变体的诱导型表达。
在一个实施例中，适用于本发明的组织特异性启动子包括在一个或多个特异性细胞群中起作用的序列。例子包括但不限于启动子例如肝特异性的白蛋白[Pinkert等人，(1987)Genes Dev.1:268-277]，淋巴样特异性启动子[Calame等人，(1988)Adv.Immunol.43:235-275]；特别是T细胞受体[Winoto等人，(1989)EMBO J.8:729-733]和免疫球蛋白[Banerji等人(1983)Cell33729-740]的启动子；神经元特异性启动子例如神经丝启动子[Byrne等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477]，胰腺特异性启动子[Edlunch等人(1985)Science 230:912-916]或乳腺特异性启动子例如乳清启动子(美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。适用于本发明的诱导型启动子包括例如四环素诱导型启动子(Srour,M.A.,等人，2003.Thromb.Haemost.90:398-405)。
在一个实施例中，短语“多核苷酸分子”指单链或双链核酸序列，其以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如上述的组合)的形式分离并提供。
在一个实施例中，“互补多核苷酸序列”指起因于使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶的信使RNA逆转录的序列。在一个实施例中，该序列可随后使用DNA聚合酶在体内或在体外扩增。
在一个实施例中，“基因组多核苷酸序列”指源自(分离自)染色体的序列，并且因此它代表染色体的连续部分。
在一个实施例中，“复合多核苷酸序列”指至少部分互补和至少部分基因组的序列。在一个实施例中，复合序列可包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及插入其间的一些内含子序列。在一个实施例中，内含子序列可具有任何来源，包括其他基因，并且通常包括保守剪接信号序列。在一个实施例中，内含子序列包括顺式作用表达调节元件。
在一个实施例中，在表达和分泌后，信号肽从前体经改造的胃泌酸调节素肽中切割，从而导致成熟的经改造的胃泌酸调节素肽。
在一个实施例中，使用PCR技术或者本领域技术人员已知的任何其他方法或操作，来制备本发明的多核苷酸。在一些实施例中，该操作涉及两种不同DNA序列的连接(参见例如“Current Protocols in Molecular Biology”,Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons,1992)。
在一个实施例中，将编码本文提供的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的本发明多核苷酸插入表达载体(即核酸构建体)内，以允许重组多肽的表达。在一个实施例中，本发明的表达载体包括致使该载体适合于在原核生物中的复制和整合的另外的序列。在一个实施例中，本发明的表达载体包括致使该载体适合于在真核生物中的复制和整合的另外的序列。在另一个实施例中，本发明的表达载体包括致使该载体适合于在原核生物和真核生物两者中的复制和整合的穿梭载体。在一些实施例中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)以及转录和翻译终止子(例如多腺苷酸化信号)。
在一个实施例中，各种原核或真核细胞可用作宿主表达系统，以表达本文提供的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，这些包括但不限于微生物，例如用含有多肽编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体例如Ti质粒转化的植物细胞系统。
在一个实施例中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统例如CHO细胞)，以表达本文提供的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。在另一个实施例中，胃泌酸调节素通过添加至少一个CTP进行修饰，如本文进一步提供的。在另一个实施例中，在哺乳动物细胞中用于表达本发明的多核苷酸的表达载体是pCI-dhfrr载体。根据一个实施例，pCI-dhfrr载体的构建在下文实例的材料与方法中描述。
在一个实施例中，在本发明的细菌系统中，许多表达载体可有利地根据所表达多肽预期的用途加以选择。在一个实施例中，大数量的多肽是希望的。在一个实施例中，指导蛋白质产物的高水平表达的载体是希望的，所述蛋白质产物可能作为具有疏水信号序列的融合物表达，所述疏水信号序列指导所表达产物进入蛋白质产物在其中容易纯化的细菌的胞质或培养基。在一个实施例中，某些融合蛋白改造为具有特异性切割位点，以帮助多肽的回收。在一个实施例中，适于此类操作的载体包括但不限于大肠杆菌(E.coli)表达载体的pET系列[Studier等人，Methods in Enzymol.185:60-89(1990)]。
在一个实施例中，使用酵母表达系统。在一个实施例中，如全文以引用的方式并入本文的美国专利申请号：5,932,447中公开的，许多含有组成型或诱导型启动子的载体可用于酵母中。在另一个实施例中，使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体内的整合的载体。
在一个实施例中，本发明的表达载体还可包括另外的多核苷酸序列，其允许例如由单一mRNA例如内部核糖体进入位点(IRES)翻译几种蛋白质和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列。
在一个实施例中，哺乳动物表达载体包括但不限于可得自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可得自Promega的pCI，可得自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可得自Clontech的pTRES及其衍生物。
在一个实施例中，含有来自真核病毒例如逆转录病毒的调节元件的表达载体用于本发明中。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施例中，来源于牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且来源于EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE以及任何其他载体，所述任何其他载体允许蛋白质在下述启动子的指导下表达：SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对于在真核细胞中的表达有效的其他启动子。
在一个实施例中，重组病毒载体可用于本发明的胃泌酸调节素肽的体内表达，因为它们提供诸如横向感染和靶向特异性的优点。在一个实施例中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，并且是通过其单个受感染细胞产生许多子代病毒粒子的过程，所述子代病毒粒子出芽并感染邻近细胞。在一个实施例中，结果是大面积变得被快速感染，其中大多数最初未由原始病毒颗粒感染。在一个实施例中，产生不能横向传播的病毒载体。在一个实施例中，如果希望的目的是将特定基因引入仅局限数目的靶向细胞，则该特征可以是有用的。
在一个实施例中，各种方法可用于将本发明的表达载体引入细胞内。此类方法一般在下述中描述：Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)；Chang等人，Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)；Vega等人，Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,BostonMass.(1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4(6):504-512,1986]，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和由重组病毒载体感染。此外，关于阳性-阴性选择方法，参见以引用的方式并入本文的美国专利号5,464,764和5,487,992。
在一个实施例中，通过病毒感染引入核酸提供超过其他方法例如脂转染和电穿孔的几个优点，因为由于病毒的传染特性，可获得更高的转染效率。
应当理解本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或胃泌酸调节素肽也可由核酸构建体表达，所述核酸构建体采用任何合适的施用模式(例如皮下施用、经口施用、鼻内施用、阴道(venal)内施用或体内基因疗法)施用于个体。在一个实施例中，经由适当的基因递送媒介物/方法(转染、转导、同源重组等)和根据需要的表达系统将核酸构建体引入合适的细胞内，并且随后经修饰的细胞在培养中扩增并送回个体内(即先体外后体内基因疗法)。
在一个实施例中，使用植物表达载体。在一个实施例中，多肽编码序列的表达通过许多启动子驱动。在一些实施例中，使用病毒启动子例如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等人，Nature 310:511-514(1984)]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人，EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一个实施例中，使用植物启动子例如RUBISCO的小亚基[Coruzzi等人，EMBO J.3:1671-1680(1984)；和Brogli等人，Science 224:838-843(1984)]或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人，Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施例中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和技术人员众所周知的其他技术，将构建体引入植物细胞内。参见例如Weissbach&Weissbach[Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII，第421-463页(1988)]。本领域众所周知的其他表达系统例如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统也可通过本发明使用。
应当理解除含有插入的编码序列(编码多肽)转录和翻译的必需元件之外，本发明的表达构建体还可包括经改造为优化所表达多肽的稳定性、生产、纯化、得率或活性的序列。
在一个实施例中，经转化的细胞在有效条件下培养，所述有效条件允许表达大量重组经改造的胃泌酸调节素肽。在另一个实施例中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施例中，有效培养基指细胞在其中培养以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施例中，培养基通常包括具有可同化碳源、氮源和磷酸盐源，以及适当的盐、矿物质、金属及其他营养素例如维生素的水性溶液。本发明的细胞可在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和皮氏培养皿中进行培养。在另一个实施例中，培养在适合于重组细胞的温度、pH和含氧量下进行。在另一个实施例中，培养条件的测定在本领域普通技术人员的专业知识内。
在一个实施例中，取决于用于生产的载体和宿主系统，所得的本发明的经改造的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂，或在另一个实施例中，所得的CTP修饰的胃泌酸调节素肽在用于CTP的糖基化发生的重组细胞内表达，分泌到发酵培养基内，或保留在哺乳动物细胞的外表面上。
在一个实施例中，在培养预定时间后，实现重组经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或胃泌酸调节素的回收。
在一个实施例中，短语“回收重组经改造的胃泌酸调节素”指收集含有多肽的完整发酵培养基，并且无需暗示另外的分离或纯化步骤。
在一个实施例中，本文提供的经改造的胃泌酸调节素或其变体使用各种标准蛋白质纯化技术进行纯化，例如但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、色谱聚焦和差异溶解。
为了促进回收，所表达的编码序列可进行改造，以编码本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或胃泌酸调节素和融合的可切割部分。此外，融合蛋白可设计为使得多肽可通过亲和色谱法容易地分离；例如通过固定在对于可切割部分特异性的柱上分离。可切割位点在经改造的胃泌酸调节素和可切割部分之间进行改造，并且多肽可通过用适当的酶或试剂处理从色谱柱中释放，所述酶或试剂在该位点处特异性切割融合蛋白[例如，参见Booth等人，Immunol.Lett.19:65-70(1988)；和Gardella等人，J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。
在一个实施例中，本文提供的经改造的胃泌酸调节素以“基本上纯的”形式取回。
在一个实施例中，短语“基本上纯的”指允许蛋白质在本文描述的应用中有效使用的纯度。
本文提供的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或胃泌酸调节素还可使用体外表达系统进行合成。在另一个实施例中，体外合成方法是本领域众所周知的，并且系统的组分是商购可得的。
在一个实施例中，将重组经改造的胃泌酸调节素肽合成并纯化；它们的治疗效果可或在体内或在体外进行测定。本发明的重组经改造的胃泌酸调节素肽的结合活性可使用如本领域技术人员已知的各种测定法来确定。
在另一个实施例中，本发明的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或经改造的胃泌酸调节素可本身提供给个体。在一个实施例中，本发明的经改造的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或胃泌酸调节素可作为药物组合物的一部分提供给个体，它在所述药物组合物中与药学可接受的载体混合。
在另一个实施例中，“药物组合物”指本文描述的活性成分中的一种或多种与其他化学组分例如生理学合适的载体和赋形剂的制备物。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施用。
在另一个实施例中，“活性成分”指负责生物效应的目的多肽序列。
在另一个实施例中，可互换使用的短语“生理学可接受的载体”和“药学可接受的载体”指这样的载体或稀释剂，其对生物体不引起显著刺激并且不取消所施用化合物的生物活性和特性。在这些短语下包括佐剂。在一个实施例中，在药学可接受的载体中包括的成分之一可以是例如聚乙二醇(PEG)，在有机介质和水性介质两者中具有广泛范围的溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等人(1979))。
在另一个实施例中，“赋形剂”指加入药物组合物以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。在一个实施例中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物配制和施用的技术在以引用的方式并入本文的"Remington’sPharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA，最新版本中发现。
本发明考虑了各种剂量范围的实施例。在一个实施例中，本发明的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量在0.005-100mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.005-5mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.01-50mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.1-20mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.1-10mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.01-5mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.001-0.01mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.001-0.1mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.1-5mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.5-50mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.2-15mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.8-65mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在1-50mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在5-10mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在8-15mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在10-20mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在20-40mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在60-120mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在12-40mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在40-60mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在50-100mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在1-60mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在15-25mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在5-10mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在55-65mg/天的范围内。
在另一个实施例中，剂量在50-500mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在50-150mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在100-200mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在150-250mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在200-300mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在250-400mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在300-500mg/天的范围内。在另一个实施例中，剂量在350-500mg/天的范围内。
在一个实施例中，剂量为20mg/天。在一个实施例中，剂量为30mg/天。在一个实施例中，剂量为40mg/天。在一个实施例中，剂量为50mg/天。在一个实施例中，剂量为0.01mg/天。在另一个实施例中，剂量为0.1mg/天。在另一个实施例中，剂量为1mg/天。在另一个实施例中，剂量为0.530mg/天。在另一个实施例中，剂量为0.05mg/天。在另一个实施例中，剂量为50mg/天。在另一个实施例中，剂量为10mg/天。在另一个实施例中，剂量为20-70mg/天。在另一个实施例中，剂量为5mg/天。
在一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为1-5mg/天。在一个实施例中，CTP修饰的胃泌酸调节素的剂量为1-3mg/天。在另一个实施例中，CTP修饰的胃泌酸调节素的剂量为2mg/天。
在另一个实施例中，剂量为1-90mg/天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/2天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/3天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/4天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/5天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/6天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/周。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/9天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/11天。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/14天。
在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂剂量为10-50mg/天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/2天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/3天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/4天。在另一个实施例中，剂量为10-50微克mg/5天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/6天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/周。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/9天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/11天。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/14天。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以鼻内剂型配制。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以可注射剂型配制。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.0001mg至0.6mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.001mg至0.005mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.005mg至0.01mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.01mg至0.3mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.2mg至0.6mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂在其氨基末端上不含CTP。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以鼻内剂型配制。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以可注射剂型配制。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.0001mg至0.6mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.001mg至0.005mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.005mg至0.01mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.01mg至0.3mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.2mg至0.6mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂在其氨基末端上不含CTP。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为1-100微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为10-80微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为20-60微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为10-50微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为40-80微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为10-30微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为30-60微克的剂量施用于受试者。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为1-100微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为10-80微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为20-60微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为10-50微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为40-80微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为10-30微克的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为30-60微克的剂量施用于受试者。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.2mg至2mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为2mg至6mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为4mg至10mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为5mg至15mg的剂量施用于受试者。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为0.2mg至2mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为2mg至6mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为4mg至10mg的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽以范围为5mg至15mg的剂量施用于受试者。
在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的65％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的55％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的45％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的10％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的25％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的35％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂施用的激动剂的量的75％。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的剂量为使得它含有使用非CTP修饰的激动剂施用的激动剂的量的100％。然而，即使剂量含有与非CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂相同量的激动剂，它对于受试者仍是有利的，因为由于其与正常激动剂相比较增加的半衰期，它将更不频繁地施用。
在另一个实施例中，缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的治疗有效量为50-500IU/kg体重，每天施用一次。在另一个实施例中，缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的治疗有效量为150-250IU/kg体重，每天施用一次。在另一个实施例中，包含缀合的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物以对于通过各种方法对人患者的施用有效的强度进行配制。
在一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的CTP修饰的多肽施用的量有效使受试者中的循环GLP-1/胰高血糖素受体激动剂活性达到20-30IU/dL。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的CTP修饰的多肽施用的量有效使受试者中的循环GLP-1/胰高血糖素受体激动剂活性达到25-50IU/dL。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的CTP修饰的多肽施用的量有效使受试者中的循环GLP-1/胰高血糖素受体激动剂活性达到50-100IU/dL。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的CTP修饰的多肽施用的量有效使受试者中的循环GLP-1/胰高血糖素受体激动剂活性达到100-200IU/dL。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的CTP修饰的多肽施用的量有效使受试者中的循环GLP-1/胰高血糖素受体激动剂活性达到10-50IU/dL。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的CTP修饰的多肽施用的量有效使受试者中的循环GLP-1/胰高血糖素受体激动剂活性达到20-100IU/dL。
在一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂在每周一次的基础上施用于受试者。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂每周两次施用于受试者。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂在隔周一次(每两周一次)的基础上施用于受试者。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂每月两次施用于受试者。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂每月一次施用于受试者。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂在每天一次的基础上施用于受试者。在另一个实施例中，CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂每两天施用于受试者。
在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每三天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每四天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每五天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每六天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每7-14天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每10-20天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每5-15天一次施用于受试者。在另一个实施例中，包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽每15-30天一次施用于受试者。
在另一个实施例中，本发明的方法包括增加在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂疗法使用中的顺应性，包括给有此需要的受试者提供包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素肽(CTP)的多肽，由此增加在GLP-1/胰高血糖素受体激动剂疗法使用中的顺应性。
在另一个实施例中，本发明的方法包括增加患有慢性病的患者的顺应性，所述慢性病需要GLP-1/胰高血糖素受体激动剂疗法。在另一个实施例中，本发明的方法通过如上所述用CTP修饰GLP-1/胰高血糖素受体激动剂允许降低GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的给药频率。
在另一个实施例中，术语顺应性包含坚持。在另一个实施例中，本发明的方法包括通过降低GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的施用频率，增加需要GLP-1/胰高血糖素受体激动剂疗法的患者的顺应性。在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的施用频率的降低由于CTP修饰而实现，所述CTP修饰致使CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂更稳定。在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的施用频率的降低由于增加GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的T1/2而实现。在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的施用频率的降低由于增加GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的清除时间或降低清除率而实现。
在另一个实施例中，本发明提供了降低GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的清除率的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附着至GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的清除率。
在另一个实施例中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的施用频率的降低由于增加GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的AUC测量而实现。
在一个实施例中，经口施用包括包含片剂、胶囊、锭剂、咀嚼片、悬浮液、乳状液等等的单位剂型。此类单位剂型包含安全有效量的本发明的所需GLP-1/胰高血糖素受体激动剂，在一个实施例中，所述剂量各自为约0.7或3.5mg至约280mg/70kg，或在另一个实施例中，所述剂量各自为约0.5或10mg至约210mg/70kg。适合于制备用于口服施用的单位剂型的药学可接受的载体是本领域众所周知的。在另一个实施例中，片剂通常包括常规药学相容的佐剂作为惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂例如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂例如淀粉、海藻酸和交联羧甲纤维素(croscarmelose)；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施例中，助流剂例如二氧化硅可用于改善粉末混合物的流动特征。在一个实施例中，着色剂例如FD&C染料可加入用于外观。甜味剂和调味剂例如阿斯巴甜、糖精、薄荷脑、薄荷和水果香料是咀嚼片的有用佐剂。胶囊通常包含上文公开的一种或多种固体稀释剂。在另一个实施例中，载体组分的选择取决于次级考虑如味道、成本和保存稳定性，所述次级考虑对于本发明的目的不是关键的，并且可由本领域技术人员容易地作出。
在一个实施例中，经口剂型包含预定释放概况。在一个实施例中，本发明的经口剂型包含延长释放片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片。在一个实施例中，本发明的经口剂型包含缓慢释放片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片。在一个实施例中，本发明的经口剂型包含直接释放片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片。在一个实施例中，经口剂型根据如本领域技术人员已知的药物活性成分的所需释放概况进行配制。
在一些实施例中，口服组合物包含液体溶液、乳状液、悬浮液等等。在一些实施例中，适合于制备此类组合物的药学可接受的载体是本领域众所周知的。在一些实施例中，液体经口组合物包含约0.001％至约0.933％的所需的一种或多种化合物，或在另一个实施例中，约0.01％至约10％的所需的一种或多种化合物。
在一个实施例中，用于本发明的方法中的组合物包含溶液或乳状液，在一些实施例中，所述溶液或乳状液是包含安全有效量的本发明的化合物和任选的预期用于局部鼻内施用的其他化合物的水性溶液或乳状液。在另一个实施例中，该组合物包含约0.001％至约10.0％w/v的主题化合物，更优选约00.1％至约2.0的主题化合物，其用于通过鼻内途径的化合物的全身递送。
在另一个实施例中，将包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽注射到肌肉内(肌内注射)。在另一个实施例中，将包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽注射到皮肤下(皮下注射)。在另一个实施例中，将包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽注射到肌肉内。在另一个实施例中，将包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和至少一个CTP单元的多肽注射到皮肤内。在另一个实施例中，如本文描述的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂经由全身施用进行施用。在另一个实施例中，如本文描述的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂通过静脉内注射进行施用。在另一个实施例中，施用可以是肠胃外、经肺、经口、局部、真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、经鼻、眼内、眼、硬膜外、经颊、直肠、经粘膜、肠内或肠胃外递送，包括髓内注射以及鞘内或直接心室内施用。
在另一个实施例中，制剂以与全身方式不同的局部方式，例如经由制备物直接注射到患者身体的特定区域内进行施用。
在一个实施例中，施用途径可以是肠内的。在另一个实施例中，途径可以是结膜、经皮、皮内、动脉内、阴道、直肠、瘤内、parcanceral、经粘膜、肌内、血管内、心室内、颅内、鼻内、舌下或其组合。
在另一个实施例中，药物组合物通过液体制备物的静脉内、动脉内或肌内注射进行施用。在一些实施例中，液体制剂包括溶液、悬浮液、分散体、乳状液、油等等。在一个实施例中，药物组合物进行静脉内施用，并且因此以适合于静脉内施用的形式进行配制。在另一个实施例中，药物组合物进行动脉内施用，并且因此以适合于动脉内施用的形式进行配制。在另一个实施例中，药物组合物进行肌内施用，并且因此以适合于肌内施用的形式进行配制。
此外，并且在另一个实施例中，将药物组合物局部施用于身体表面，并且因此以适合于局部施用的形式进行配制。合适的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等等。对于局部施用，本发明的化合物与另外的适当的一种或多种治疗剂组合，制备并且作为在含或不含药学载体的生理学可接受的稀释剂中的溶液、悬浮液或乳状液施加。
在一个实施例中，本发明的药物组合物通过本领域众所周知的过程，例如借助于常规混合、溶解、粒化、糖丸制备、水飞、乳化、封装、诱陷或冻干过程进行制造。
在一个实施例中，使用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理学可接受的载体(其促进活性成分加工成可在药学上使用的制备物)，以常规方式配制依照本发明使用的药物组合物。在一个实施例中，制剂取决于所选择的施用途径。
在一个实施例中，本发明的注射剂在水性溶液中配制。在一个实施例中，本发明的注射剂在生理学相容的缓冲液例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理学盐缓冲液中配制。在一些实施例中，对于经粘膜施用，适合于待穿透的屏障的穿透剂用于制剂中。此类穿透剂是本领域一般已知的。
在一个实施例中，本文描述的制备物配制用于例如通过弹丸注射或持续输注的肠胃外施用。在一些实施例中，用于注射的制剂以单位剂型呈现，例如在安瓿或多剂量容器中伴随任选的添加的防腐剂呈现。在一些实施例中，组合物是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且含有配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施例中，该组合物还包含防腐剂，例如苯扎氯铵和硫柳汞等等；螯合剂例如依地酸钠及其他；缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张度剂例如氯化钠、氯化钾、丙三醇、甘露醇及其他；抗氧化剂例如抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、偏亚硫酸氢钠(sodium metabisulfote)及其他；芳香剂；粘度调整剂例如聚合物包括纤维素及其衍生物；和聚乙烯醇以及根据需要调整这些水性组合物的pH的酸和碱。在一些实施例中，该组合物还包含局部麻醉药或其他活性成分。该组合物可用作喷雾剂、薄雾、滴剂等等。
在一个实施例中，用于肠胃外施用的药物组合物包括以水溶性形式的活性制备物的水性溶液。另外，活性成分的悬浮液可制备为适当的基于油或水的注射悬浮液。在一些实施例中，合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。在一些实施例中，水性注射悬浮液含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。在另一个实施例中，该悬浮液还含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
在另一个实施例中，活性化合物可在囊泡特别是脂质体(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等人，Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss,NewYork，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同前，第317-327页；J.E.Diederichs和al.,Pharm./nd.56(1994)267-275)中递送。
在另一个实施例中，在控制释放系统中递送的药物组合物配制用于静脉内输注、可植入的渗透泵、经皮贴剂、脂质体或其他施用模式。在一个实施例中，使用泵(参见Langer，同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88:507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施例中，可使用聚合物材料。在另外一个实施例中，控制释放系统可放置在治疗靶即脑附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。其他控制释放系统在通过Langer(Science249:1527-1533(1990)的综述中讨论。
在另一个实施例中，活性成分采取粉末形式用于在使用前由合适的媒介物(例如基于无菌、无热原水的溶液)重构。在一些实施例中，组合物配制用于雾化和吸入施用。在另一个实施例中，组合物包含在具有附加的雾化工具的容器中。
在一个实施例中，使用例如常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯，在直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂中配制本发明的制备物。
在一个实施例中，适用于本发明的上下文中的药物组合物包括其中活性成分以有效实现预期目的的量包含的组合物。在另一个实施例中，治疗有效量意指有效预防、减轻或改善疾病症状或者延长被治疗受试者的存活的活性成分的量。
在一个实施例中，治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力内。
可充当药学可接受的载体或其组分的一些物质例子是糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂例如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇例如丙二醇、丙三醇、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂例如TweenTM牌乳化剂；湿润剂例如十二烷基硫酸钠；着色剂；调味剂；制片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲溶液。待与化合物结合使用的药学可接受的载体的选择基本上通过施用化合物的方式进行确定。如果主题化合物要被注射，则在一个实施例中，药学可接受的载体是其pH已调整至约7.4的无菌生理盐水，伴随血液相容的悬浮剂。
此外，该组合物还包含粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉乙醇酸钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCI、乙酸盐、磷酸盐)、防止吸附至表面的添加剂例如白蛋白或明胶、去污剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁羟茴醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、粘度增加试剂(例如卡波姆、二氧化硅胶体、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、流动助剂(例如二氧化硅胶体)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物涂层(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺(poloxamine))、涂布和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
用于糖浆剂、酏剂、乳状液和悬浮液的通常载体组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于悬浮液，通常的悬浮剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如AvicelTM，RC-591)、黄蓍胶和海藻酸钠；通常的湿润剂包括卵磷脂和聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如聚山梨醇酯80)。通常的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一个实施例中，口服液体组合物还含有一种或多种组分例如上文公开的甜味剂、调味剂和着色剂。
该组合物还包括将活性材料掺入聚合物化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂之内或之上，或掺入脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球)之上。此类组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放率和体内清除率。
本发明还包含的是由聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)和化合物涂布的微粒组合物，所述化合物偶联至针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体或者偶联至组织特异性受体的配体。
在一个实施例中，通过水溶性聚合物(例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸)的共价附着修饰化合物。在另一个实施例中，经修饰的化合物显示出在静脉内注射后在血液中比相应的未经修饰的化合物显著更长的半衰期。在一个实施例中，修饰还增加化合物在水性溶液中的溶解度，消除聚集，增强化合物的物理和化学稳定性，并极大降低化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施例中，与未经修饰的化合物相比，通过更不频繁或以更低剂量施用此类聚合物-化合物加合物来实现所需体内生物活性。
有效量或剂量的制备最初可由体外测定进行估计。在一个实施例中，剂量可在动物模型中配制，并且此类信息可用于更精确地测定在人中的有用剂量。
在一个实施例中，本文描述的活性成分的毒性和治疗效果可通过标准药学操作在体外、在细胞培养物或实验动物中进行测定。在一个实施例中，得自这些体外和细胞培养测定以及动物研究的数据可用于配制用于人中的一系列剂量。在一个实施例中，剂量根据采用的剂型和利用的施用途径而改变。在一个实施例中，确切制剂、施用途径和剂量可通过个别医生考虑到患者的病症加以选择[参见例如Fingl等人，(1975)"The Pharmacological Basis ofTherapeutics"，第1章，第1页]。
在一个实施例中，取决于待治疗病症的严重性和应答性，给药可以是单一或多次施用，其中治疗过程从几天持续到几周或直至实现治愈或达到疾病状态的缩小。
在一个实施例中，待施用的组合物的量将取决于被治疗的受试者、疾病的严重性、施用方式、开处方医生的判断等。
在一个实施例中，还制备包括在相容的药学载体中配制的本发明制备物的组合物，将所述组合物置于适当容器中，并且标记用于治疗所示病症。
在另一个实施例中，如本文描述的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂或其变体(CTP修饰的)形式是与复合有机赋形剂和稳定剂例如非离子型表面活性试剂(即表面活性剂)、各种糖、有机多元醇和/或人血清白蛋白组合的冻干(即冷冻干燥)制备物。在另一个实施例中，药物组合物包含在无菌注射用水中的如所述的冻干的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，药物组合物包含在无菌注射用PBS中的如所述的冻干的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施例中，药物组合物包含在无菌注射用0.9％NaCl中的如所述的冻干的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。
在另一个实施例中，药物组合物包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和复合载体例如人血清白蛋白、多元醇、糖和阴离子型表面活性稳定剂。在另一个实施例中，药物组合物包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂以及乳糖酸和乙酸盐/甘氨酸缓冲液。在另一个实施例中，药物组合物包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和氨基酸，例如精氨酸或谷氨酸盐，所述氨基酸增加干扰素组合物在水中的溶解度。在另一个实施例中，药物组合物包含如本文描述的冻干的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和甘氨酸或人血清白蛋白(HSA)、缓冲剂(例如乙酸盐)和等渗剂(例如NaCl)。在另一个实施例中，药物组合物包含如本文描述的冻干的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和磷酸盐缓冲液、甘氨酸和HSA。
在另一个实施例中，当置于pH约4至7.2的缓冲溶液中时，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物是稳定的。在另一个实施例中，包含CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物在pH约4至8.5的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包含CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物在pH约6至7的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包含CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物在pH约6.5的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物用氨基酸作为稳定剂进行稳定，并且在一些情况下，用盐(如果氨基酸不含荷电侧链)进行稳定。
在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物是液体组合物，所述液体组合物包含其为氨基酸的按重量计约0.3％至5％的稳定剂。
在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物提供了给药准确度和产品安全。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物提供了用于可注射应用中的生物活性、稳定的液体制剂。在另一个实施例中，药物组合物包含如本文描述的非冻干的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。
在另一个实施例中，包含本文提供的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物提供了液体制剂，从而允许在液体状态中贮存长时间段，以促进在施用前的贮存和运送。
在另一个实施例中，包含本文提供的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的可注射的药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施例中，通过喷雾凝结的脂质微粒的产生通过Speiser(Speiser和al.,Pharm.Res.8(1991)47-54)进行描述，随后为用于口服施用的脂质纳米丸剂(nanopellet)(Speiser EP 0167825(1990))。在另一个实施例中，使用的脂质通过身体良好耐受(例如由脂肪酸组成的甘油酯，所述脂肪酸存在于乳状液中用于肠胃外营养)。
在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含聚合物微粒。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含纳米颗粒。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含脂质体。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含脂质乳状液。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含微球体。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包含脂质纳米颗粒。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包括包含两亲脂质的脂质纳米颗粒。在另一个实施例中，包含如本文描述的CTP修饰的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的药物组合物包括包含药物、液体基质和表面活性剂的脂质纳米颗粒。在另一个实施例中，脂质基质具有至少50％w/w的甘油单酯含量。
在一个实施例中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置例如FDA批准的试剂盒中，所述包装或分配器装置包含含有活性成分的一种或多种单位剂型。在一个实施例中，该包装例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。在一个实施例中，包装或分配器装置伴随施用说明书。在一个实施例中，包装或分配器伴随以由管理药剂制造、使用或销售的政府机构开出形式的与容器相关的通知，所述通知反映组合物的形式或者人或兽医学施用通过机构批准。在一个实施例中，此类通知是通过美国食品和药物管理局批准用于处方药物的标签或批准的产品插页。
在一个实施例中，应当理解本发明的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂可连同另外的活性剂提供给个体，以实现与用每种试剂单独的治疗相比较的改善疗效。在另一个实施例中，采取措施(例如互补试剂的给药和选择)以避免与组合疗法相关的不良副作用。
在一个实施例中，术语“约”意指在数量项中加上或减去5％，或在另一个实施例中，加上或减去10％，或在另一个实施例中，加上或减去15％，或在另一个实施例中，加上或减去20％。
在一个实施例中，术语“受试者”指需要就病症或其后遗症进行治疗或者对病症或其后遗症敏感的哺乳动物包括人。受试者可包括犬、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠以及人。术语“受试者”不排除在所有方面正常的个体。
应当理解，在一个实施例中，如本文描述的CTP修饰的多肽的治疗和预防方法可通过如本文描述的CTP修饰的多肽的用途替代，用于实现如本文描述的治疗和预防方法和/或如本文描述的CTP修饰的多肽在制备用于实现如本文描述的治疗和预防方法的药剂中的用途。
在检查下述实例后，本发明的另外的目的、优点和新型特点对于本领域普通技术人员将变得显而易见，所述实例不预期是限制性的。另外，如上文描述和如下文权利要求部分中请求保护的本发明的各种实施例和方面各自在下述实例中找到实验支持。
实例
材料与方法：
质粒构建
基于OXM氨基酸序列(登记#NP_002045)和CTP氨基酸序列(登记#NP_149032)，在真核生物表达载体(pCI-dhfrr)中构建七个OXM质粒。
这些质粒的示意性呈现显示于表1中。质粒构建的详述如下。
表1：质粒的示意性描述
质粒变体描述 核酸序列
1 OXM-CTP-CTP SEQ ID NO:20
2 CTP-OXM-CTP SEQ ID NO:8
3 CTP-CTP-OXM SEQ ID NO:22
4 CTP-OXM-CTP-CTP SEQ ID NO:14
5 OXM-CTP-CTP-CTP SEQ ID NO:24
6 OXM-CTP-CTP-CTP-CTP SEQ ID NO:26
7 OXM-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP SEQ ID NO:28
在用于DG44表达系统的密码子使用优化后，合成OXM变体CTP-OXM-CTP(0.5C CTP-OXM-CTP,GenArt,GA#0804377)的核酸序列。分离含有0.5C CTP-OXM-CTP序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得601-0-p142-1克隆。
CTP-OXM-CTP的构建
使用下述引物以便合成601-6-p149-1(CTP-OXM-CTP)。
引物255'CTCTAGAGGACATGGCCAC 3'(SEQ ID NO:4)。
引物85R 5'CTGGCTGTGCTGGGGCAGAATGGGTGT 3’(SEQ ID NO:5)。
引物865'CCCCAGCACAGCCAGGG 3’(SEQ ID NO:6)。
引物74R 5'GCGGCCGCATCCAGACCT 3'(SEQ ID NO:7)。
进行三次PCR反应。第一反应用引物25和引物85R以及402-3-p81-4(CTP-hGH-CTP-CTP)的质粒DNA作为模板进行；由于PCR扩增，形成～181bp产物。第二反应用引物86和引物74R以及601-0-p142-1(0.5CCTP-OXM-CTP)的质粒DNA作为模板进行；由于PCR扩增，形成～224bp产物。末次反应用引物25和74R以及前两次反应产物的混合物作为模板进行；由于PCR扩增，形成～391bp产物并连接到TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)内。分离含有CTP-OXM-CTP序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入我们的真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得601-6-p149-1克隆。
编码CTP-OXM-CTP的核酸序列如下：
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagcacagccagggcaccttcaccagcgactacagcaagtacctggacagcagaagggcccaggacttcgtccagtggctgatgaacaccaagaggaacaggaacaacatcgcttcctctagctccaaggcccctccaccctctctgcctagcccctctcggctgcctggcccatccgacacaccaatcctgccacagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:8)。
编码CTP-OXM-CTP的氨基酸序列如下：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:9)。
CTP-OXM-CTP-CTP的构建
使用下述引物以便合成601-3-p158-2(CTP-OXM-CTP-CTP)：
引物255'CTCTAGAGGACATGGCCAC 3'(含有XbaI的限制位点)(SEQ ID NO:10)。
引物87R 5'GCTGGAGCTAGCGATGTTGTTCCTGTTCC 3'(含有OXM的3'末端和CTP的5'末端)(SEQ ID NO:11)。
引物885'ACATCGCTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3'(含有OXM的3'末端和CTP的5'末端)(SEQ ID NO:12)。
引物74R 5'GCGGCCGCATCCAGACCT 3'(含有NotI的限制位点)(SEQ ID NO:13)。
进行三次PCR反应。第一反应用引物25和引物87R以及601-6-p149-1(CTP-OXM-CTP-CTP)的质粒DNA作为模板进行；由于PCR扩增，形成～290bp产物。第二反应用引物88和引物74R以及402-3-p81-4(CTP-hGH-CTP-CTP)的质粒DNA作为模板进行；由于PCR扩增，形成～200bp产物。末次反应用引物25和74R以及前两次反应产物的混合物作为模板进行；由于PCR扩增，形成～450bp产物并连接到TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)内。分离含有CTP-OXM-CTP-CTP序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入我们的真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得601-3-p158-2克隆。
编码CTP-OXM-CTP-CTP的核酸序列如下：
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagcacagccagggcaccttcaccagcgactacagcaagtacctggacagcagaagggcccaggacttcgtccagtggctgatgaacaccaagaggaacaggaacaacatcgctagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:14)。
编码CTP-OXM-CTP-CTP的氨基酸序列如下：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ IDNO:15)。
OXM-CTP-CTP的构建
使用下述引物以便合成601-2-p160-2(OXM-CTP-CTP)：
引物755'CTCCCAGTTCAATTACAGCT 3'(含有XbaI限制位点前pCI-dhfr的序列)(SEQ ID NO:16)。
引物89R 5'GCTGTGAGCGCTGCCCTCCTGCAG 3'(含有OXM的5'末端)(SEQ ID NO:17)。
引物905'GCGCTCACAGCCAGGGCACCTTC 3'(含有OXM的5'末端)(SEQ ID NO:18)。
引物74R 5'GCGGCCGCATCCAGACCT 3'(含有NotI的限制位点)(SEQ ID NO:19)。
进行三次PCR反应。第一反应用引物75和引物89R以及601-0-p142-1(0.5C CTP-OXM-CTP)的质粒DNA作为模板进行；由于PCR扩增，形成～175bp产物。第二反应用引物90和引物74R以及601-3-p158-2(CTP-OXM-CTP-CTP)的质粒DNA作为模板进行；由于PCR扩增，形成～200bp产物。末次反应用引物25和74R以及前两次反应产物的混合物作为模板进行；由于PCR扩增，形成～391bp产物并连接到TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)内。分离含有OXM-CTP-CTP序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入我们的真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得601-2-p160-2克隆。
编码OXM-CTP-CTP的核酸序列如下：
tctagaggacatggccacagggagcaggaccagcctgctgctggctttcggcctgctgtgtctgccatggctgcaggagggcagcgctcacagccagggcaccttcaccagcgactacagcaagtacctggacagcagaagggcccaggacttcgtccagtggctgatgaacaccaagaggaacaggaacaacatcgctagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:20)
编码OXM-CTP-CTP的氨基酸序列如下：
LEDMATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:21)
CTP-CTP-OXM的构建
在用于DG44表达系统的密码子使用优化后，合成OXM变体(CTPx2-OXM,GenArt,GA#1067101)的核酸序列。将该片段插入Excellgene真核生物表达载体内，以获得p162克隆。
编码CTPx2-OXM的核酸序列如下：
ctatagggcgaattgaaggaaggccgtcaaggccgcatgagctctctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagcacagccagggcaccttcaccagcgactacagcaagtacctggacagcagaagggcccaggacttcgtccagtggctgatgaacaccaagaggaacaggaacaacatcgcttgatgaaggtctggatgcggccgcggtaccctgggcctcatgggccttcctttcactgcccgctttccag(SEQ ID NO:22)。
编码CTPx2-OXM的氨基酸序列如下：
OXM-CTPx3的构建：
在用于DG44表达系统的密码子使用优化后，合成OXM变体(OXM-CTPx3,GenArt,GA#1017864)的核酸序列。分离含有OXM-CTPx3序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入我们的真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得pCI-dhfr-OXM-ctpx3-p216-4克隆。
编码OXM-CTPx3的核酸序列如下：
tctagactcgagcgatcgccatggccaccggctctaggacctccctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccctggctgcaggaaggcagcgctcactcccagggcaccttcacctccgactactccaagtacctggactctcggagagcccaggacttcgtgcagtggctgatgaacaccaagcggaaccggaacaatatcgcctcctcaagctccaaggcacctccaccttccctgcctagcccttccagactccctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:24)。
编码OXM-CTPx3的氨基酸序列如下：
OXM-CTPx4的构建：
在用于DG44表达系统的密码子使用优化后，合成OXM变体(OXM-CTPx4,GenArt,GA#1115769)的核酸序列。分离含有OXM-CTPx4序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得pCI-dhfr-OXM-ctpx4-p254-3克隆。
编码OXM-CTPx4的核酸序列如下：
tctagactcgagcgatcgccatggctaccggctccagaacctctctgctgctggccttcggcctgctgtgtctgccttggctgcaagagggcagcgctcattcccagggcaccttcacctccgactactccaagtacctggactctcgcagagcccaggacttcgtgcagtggctgatgaacaccaagcggaaccggaacaatatcgcctcctccagctccaaggcccctcctccatctctgccatcccccagtagactgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggccccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactcccattctgccacagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:26)
编码OXM-CTPx4的氨基酸序列如下：
OXM-CTPx5的构建：
在用于DG44表达系统的密码子使用优化后，合成OXM变体(OXM-CTPx5,GenArt,GA#1115770)的核酸序列。分离含有OXM-CTPx5序列的XbaI–NotI片段。将该片段插入真核生物表达载体pCI-dhfr内，以获得pCI-dhfr-OXM-ctpx5-p255-1克隆。
编码OXM-CTPx5的核酸序列如下：
ctctagactcgagcgatcgccatggctaccggctccagaacctctctgctgctggccttcggcctgctgtgtctgccttggctgcaagagggcagcgctcattcccagggcaccttcacctccgactactccaagtacctggactctcgcagagcacaggacttcgtgcagtggctgatgaacaccaagcggaaccggaacaatatcgcctcctccagctccaaggcccctcctccatctctgccatcccccagtagactgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:28)。
编码OXM-CTPx5的氨基酸序列如下：
OXM-CTP变体的表达、纯化和表征
将所有七种OXM-CTP变体在XLG的CHO表达细胞系(Excellgene公司，瑞士)中瞬时表达并产生。使用OXM ELISA试剂盒(Bachem目录#S-1393.0001)测定OXM-CTP收获物的浓度水平。收获物使用DEAE柱、随后为作为第二纯化步骤的Jacalin柱进行纯化。最终级分针对10mM缓冲液柠檬酸盐，147mM NaCl，pH 6进行透析。使用1.9＝1mg/ml的消光系数，通过在280nm处的吸光度测定纯化变体的浓度。1.9是对于OXM肽理论计算的消光系数。因为CTP肽在280nm处不吸收，所以对于OXM-CTP变体应用相同消光系数。化学合成(Almac公司，爱尔兰)OXM天然肽，并且通过氨基酸分析测定其肽含量。
OXM-CTP变体的药物代谢动力学(PK)概况
如下评价OXM肽和OXM-CTP变体的药物代谢动力学概况。雄性Sprague-Dawley(SD)-1大鼠皮下(SC)或静脉内(IV)施用天然OXM(n＝6,230μg/kg)，变体CTP-OXM-CTP、CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP和CTP-CTP-OXM(n＝6,230μg/kg)或者变体#OXM-CTP-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP(n＝6,153μg/kg)的单个剂量。3个动物/组的群组在交替时间点放血。使用商业ELISA试剂盒(Bachem，目录#S-1393.0001)分析OXM血清浓度。研究设计概括于表2中。将该研究分成3个序贯实验，实验#1(组1-4)、实验#2(组5-9)和实验#3(组10-13)。
表2：PK研究设计的概括。
C57BL/6小鼠中的IPGTT研究
禁食过夜的小鼠就葡萄糖进行测量(剂量前葡萄糖)。紧接着，它们用测试物品之一进行IP注射。注射后十五或120分钟，测量葡萄糖水平(葡萄糖的零时间)，随后为经由IP注射的葡萄糖施用(1.5g/kg)。进行在10、20、30、60、90、120和180分钟时的另外的葡萄糖测量。使用手提式血糖仪通过尾静脉取样测量血糖水平。
C57BL/6小鼠中的食物摄入研究
在注射前至少一周，将小鼠称重并转移至小型笼用于适应环境(一只小鼠/笼)。在适应环境期间，它们每天进行处理并接受两次媒介物注射，以使在研究期间的应激降到最低。在实验前一天，使小鼠禁食。在禁食后十七小时，在早期光照阶段(900–1000小时)，将小鼠再次称重(在IP注射前)，随后为1700nmol/kg(10μl/1g小鼠)OXM肽或OXM-CTP变体OXM-CTPX3、OXM-CTPX4和OXM-CTPX5的单次IP注射。在注射后，将小鼠送回其居住笼(1只小鼠/笼)，并且提供预称重量的食物。注射后0、1、2、4、6、8、21、32和44、55、68、80、93和141小时，通过称重食物来测量食物摄入。在实验结束时，将大鼠再次称重。
结果
实例1：CTP修饰的OXM的构建
通过遗传改造，使CTP肽cDNA融合至人OXM cDNA，生成如表1中详述的七种不同的OXM-CTP变体。验证质粒的核苷酸序列，并且将质粒瞬时转染到XLG的CHO表达细胞系(Excellgene公司，瑞士)内。OXM-CTP变体分泌到生长培养基内，收集收获物并测定OXM-CTP水平。
实例2：OXM-CTP变体的表达、纯化和表征
就OXM-CTP变体的分泌水平测量生产培养基(收获物)。分泌水平概括于表3中。考虑到重组肽的标准瞬时转染表达水平，获得的分泌水平很高。
表3：OXM-CTP分泌水平的概括。
根据材料与方法中所述的方法纯化收获物。通过SDS-PAGE(考马斯染色(图1A)和抗OXM蛋白质印迹分析(图1B))分析变体OXM-CTPX3、OXM-CTPX4和OXM-CTPX5的最终样品。对于变体CTP-OXM-CTP、CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP和CTP-CTP-OXM，通过考马斯染色和蛋白质印迹分析两者分析来自纯化过程的样品(图2)。如预期的，OXM-CTP变体显示与融合至肽的CTP盒数目相关的大小差异。相对高分子量是可能存在CTP肽上的潜在丝氨酸位点上的O-聚糖链的高占据的指示。OXM肽不与抗OXM抗体反应，可能是由于转移小尺寸肽中的技术困难。考马斯染色显示OXM-CTP变体是高度纯化的并主要含有高形式。
实例3：OXM-CTP变体的药物代谢动力学(PK)概况
在雄性SD-1大鼠中分析与OXM-CTP变体相比较OXM肽的药物代谢动力学概况。动物施用有天然OXM或OXM-CTP变体CTP-OXM-CTP、CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP、CTP-CTP-OXM(230μg/kg肽)或者变体OXM-CTPX3、OXM-CTPX4和OXM-CTPX5(153μg/kg肽)的单次IV(实验1，图3A)或单次SC(实验2和3，图3B-3C)注射。使用商业ELISA分析在所示时间点OXM或OXM-CTP变体的血清浓度。PK概况显示于图3中，并且常规非区室PK参数概括于表4中。CTP肽对OXM的添加导致对于各种OXM-CTP变体，天然OXM的半衰期从0.22小时延长到2.7-10小时(表4，SC施用；实验2和3)。
以三种不同方式将两个CTP拷贝加入OXM肽，以产生变体CTP-OXM-CTP、OXM-CTP-CTP和CTP-CTP-OXM。当CTP串联加入OXM的C末端时，接受血清半衰期的最显著延长；变体OXM-CTP-CTP具有4.76小时的T1/2。与两个CTP的融合相比较，三个CTP与OXM C末端的融合不导致延长的半衰期。令人惊讶的是，四个和五个CTP拷贝对OXM c末端的添加使T1/2延长高达10小时(表4)。
如通过AUC参数反映的暴露得到最多增加，对于变体OXM-CTP-CTP(实验2)为～17倍，并且对于变体OXM-CTPX4和OXM-CTPX5(实验3)为～30倍。这些结果指示在四个或五个CTP拷贝对OXM肽的添加后，存在优良的延长效应。
如由实验1和2计算的生物利用度对于CTP-OXM-CTP-CTP得到增加，但对于CTP-OXM-CTP和CTP-CTP-OXM未发现显著改善(表4)。
表4：如在三次不同实验中测定的，OXM肽和OXM-CTP变体的常规非区室PK参数。
在显示T1/2和AUC∞的倍数增加的各组之间的比较证实与其他变体相比较，OXM-CTPx4和OX-CTPx5在这些参数中是优良的(表5)。
表5：如由实验1-3计算的，与OXM肽相比较，OXM-CTP变体的PK参数的增加倍数。
实例4：CTP修饰的OXM诱导葡萄糖耐受
在C57BL/6小鼠中进行的IPGTT研究证实OXM经由刺激胰岛素分泌来增强葡萄糖清除。IP葡萄糖耐受测试(IPGTT)评估OXM的葡萄糖降低效应。为了评估OXM或OXM-CTP变体的体内活性，应用IPGTT模型。禁食过夜的C57BL/6小鼠用OXM肽或OXM-CTP变体进行IP注射，随后为葡萄糖(1.5g/kg)的IP注射，并且通过血糖仪从尾静脉测量血糖水平(图4)。在两个序贯实验中评价OXM-CTP变体；实验1用于变体CTP-OXM-CTP、CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP、CTP-CTP-OXM(图4A和4C)，并且实验2用于变体OXM-CTP-CTP-CTP、OXM-CTPX4和OXM-CTPX5(图4B和4D)。在葡萄糖IP注射前15分钟或2小时(OXM肽和变体OXM-CTPX4)IP施用OXM(100nmol/kg)或OXM-CTP变体(100nmol/kg)，并且葡萄糖耐受的诱导与媒介物(缓冲液)组相比较。与100nmol/kg OXM肽(其对计算的AUC具有低影响)相比较，如通过与媒介物组相比较血糖AUC的20-30％降低反映的，对于OXM-CTP变体CTP-OXM-CTP-CTP、OXM-CTP-CTP、OXM-CTPX3、OXM-CTPX4和OXM-CTPX5测量到显著效应(图4，实验1的1％和实验2的6.7％的降低)。令人惊讶的是，CTP-OXM-CTP导致增加的葡萄糖水平，而CTP-CTP-OXM对葡萄糖耐受具有较小影响。即使在葡萄糖前120分钟施用时，OXM-CTPX4也诱导葡萄糖耐受活性，而OXM肽活性不再明显。这个结果与该变体的改善的药物代谢动力学概况一致。
实例5：CTP修饰的OXM降低食物摄入
在单次SC药物施用后，在C57BL/6小鼠中进一步评估OXM和OXM-CTP变体的药理学活性。在该研究中，测量对食物摄入的急性作用。雄性C57BL/6小鼠(n＝4/组)施用OXM肽(2000nmol/kg)或OXM-CTP(1700nmol/kg)变体：OXM-CTPX3、OXM-CTPX4或OXM-CTPX5的单次SC施用。每天测量食物摄入，共6天。OXM和所有测量的OXM-CTP变体均导致食物摄入的显著降低，如在注射后1小时和2小时测量的，如图6中所示，对于OXM和OXM-CTP变体处理的小鼠为34-51％(与媒介物相比较)食物摄入。OXM肽效应在注射后4小时取消，而所有其他OXM-CTP变体均有效至少24小时。对于变体OXM-CTPX5发现最显著的效应，与媒介物相比较，所述变体OXM-CTPX5使食物摄入降低5天。对于经过实验的各个时间点，与媒介物相比较的食物摄入百分比呈现于图6B中。天然OXM的效应在一小时后消失，OXM-4/5CTP维持抑制2小时，并且OXM-5CTP维持抑制约80小时(3天)。值得注意的是，变体OXM-CTPx5在急性食物摄入研究中的优越性与其改善的PK概况关联。令人惊讶的是，尽管变体OXM-CTPx4证实改善的PK概况，具有约10小时的T1/2，它的效应不像OXM-CTPx5或OXM-CTPx3持续得那么久。
已参考附图描述本发明的优选实施例，应当理解本发明并不限于精确实施例，并且各种变化和修饰可通过本领域技术人员在其中实现，而不背离如所附权利要求中限定的本发明的范围或精神。

Claims (119)

1.一种CTP修饰的多肽，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
2.根据权利要求1所述的CTP修饰的多肽，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中至少一个CTP是糖基化的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中至少一个CTP是截短的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂多肽。
7.根据权利要求6所述的CTP修饰的多肽，其中所述接头是肽键。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂，一个CTP在所述激动剂的氨基末端上并且两个CTP在所述激动剂的羧基末端上。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂，一个CTP在所述激动剂的羧基末端上并且一个CTP在所述激动剂的氨基末端上。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽在所述激动剂的羧基末端上附着至所述激动剂。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽在所述激动剂的氨基末端上附着至所述激动剂。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的CTP修饰的多肽，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的CTP修饰的多肽。
17.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-15中任一项所述的CTP修饰的多肽。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列包含SEQ ID NO:8、14、20、22、24、26或28。
19.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求17-18中任一项所述的多核苷酸。
20.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求19所述的表达载体。
21.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求19所述的表达载体。
22.一种产生CTP修饰的多肽的方法，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤。
23.根据权利要求22所述的CTP修饰的多肽，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端。
25.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端。
26.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂，一个CTP在所述激动剂的氨基末端上并且两个CTP在所述激动剂的羧基末端上。
27.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端。
28.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂，一个CTP在所述激动剂的羧基末端上并且一个CTP在所述激动剂的氨基末端上。
29.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽在所述激动剂的羧基末端上附着至所述激动剂。
30.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽在所述激动剂的氨基末端上附着至所述激动剂。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
32.根据权利要求22-31中任一项所述的方法，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
33.根据权利要求22-32中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是糖基化的。
34.根据权利要求22-33中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是截短的。
35.根据权利要求22-34中任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述接头是肽键。
37.一种延长双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的生物半衰期的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此改善所述激动剂的生物半衰期。
38.根据权利要求37所述的CTP修饰的多肽，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是糖基化的。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是截短的。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述接头是肽键。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的方法，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
45.一种改善双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述激动剂的羧基末端的步骤，由此改善所述激动剂的曲线下面积(AUC)。
46.根据权利要求45所述的CTP修饰的多肽，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
47.根据权利要求45-46中任一项所述的方法，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是糖基化的。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是截短的。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述接头是肽键。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的方法，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
53.一种降低双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的给药频率的方法，所述方法包括使至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的氨基末端或羧基末端的步骤，由此降低所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂的给药频率。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
55.根据权利要求53-54中任一项所述的方法，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是糖基化的。
57.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，其中至少一个CTP是截短的。
58.根据权利要求53-57中任一项所述的方法，其中至少一个CTP经由接头附着至所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述接头是肽键。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
61.CTP修饰的多肽用于诱导受试者中的葡萄糖耐受的用途，所述CTP修饰的多肽包含双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
63.根据权利要求61-62中任一项所述的用途，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是糖基化的。
65.根据权利要求61-64中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是截短的。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的用途，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂多肽。
67.根据权利要求66所述的用途，其中所述接头是肽键。
68.根据权利要求61-67中任一项所述的用途，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
69.CTP修饰的多肽用于预防通过受试者的不希望的重量增加的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
70.根据权利要求69所述的用途，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
71.根据权利要求69-70中任一项所述的用途，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是糖基化的。
73.根据权利要求69-72中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是截短的。
74.根据权利要求69-73中任一项所述的用途，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
75.根据权利要求74所述的用途，其中所述接头是肽键。
76.根据权利要求69-75中任一项所述的用途，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
77.根据权利要求69-76中任一项所述的用途，其中所述重量增加导致所述受试者中的肥胖。
78.根据权利要求69-77中任一项所述的用途，其中所述重量增加是由于心理病症，或是由于通过所述受试者的重量增加的遗传倾向。
79.根据权利要求78所述的用途，其中所述心理病症是抑郁症、焦虑症或创伤后应激障碍(PTSD)。
80.包含CTP修饰的多肽的组合物用于预防、降低或抑制受试者中的食物摄入的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。
81.根据权利要求80所述的用途，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
82.根据权利要求80-81中任一项所述的用途，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
83.根据权利要求80-82中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是糖基化的。
84.根据权利要求80-83中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是截短的。
85.根据权利要求80-84中任一项所述的用途，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
86.根据权利要求85所述的用途，其中所述接头是肽键。
87.根据权利要求80-86中任一项所述的用途，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
88.根据权利要求80-87中任一项所述的用途，其中预防、降低或抑制通过所述受试者的食物摄入降低所述受试者发展不希望的重量增加的机会。
89.根据权利要求80-87中任一项所述的用途，其中预防、降低或抑制通过所述受试者的食物摄入降低所述受试者发展肥胖的机会。
90.CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的肥胖的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
91.根据权利要求90所述的用途，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
92.根据权利要求90-91中任一项所述的用途，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是糖基化的。
94.根据权利要求90-93中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是截短的。
95.根据权利要求90-94中任一项所述的用途，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
96.根据权利要求95所述的用途，其中所述接头是肽键。
97.根据权利要求90-96中任一项所述的用途，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
98.根据权利要求90-97中任一项所述的用途，其中所述受试者遗传上倾向于肥胖。
99.根据权利要求90-98中任一项所述的用途，其中所述治疗肥胖的方法导致所述受试者中的体重降低。
100.根据权利要求90-99中任一项所述的用途，其中所述治疗肥胖的方法导致所述受试者中的体脂降低。
101.CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的II型糖尿病的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
102.根据权利要求101所述的用途，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
103.根据权利要求101-102中任一项所述的用途，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
104.根据权利要求101-103中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是糖基化的。
105.根据权利要求101-104中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是截短的。
106.根据权利要求101-105中任一项所述的用途，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
107.根据权利要求106所述的用途，其中所述接头是肽键。
108.根据权利要求101-107中任一项所述的用途，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
109.根据权利要求101-108中任一项所述的用途，其中所述受试者遗传上倾向于肥胖。
110.CTP修饰的多肽用于治疗受试者中的代谢障碍的用途，所述CTP修饰的多肽包含GLP-1/胰高血糖素受体激动剂和附着至所述激动剂的氨基末端或羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽。
111.根据权利要求110所述的用途，其中所述GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素。
112.根据权利要求110-111中任一项所述的用途，其中至少一个CTP的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
113.根据权利要求110-112中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是糖基化的。
114.根据权利要求110-113中任一项所述的用途，其中至少一个CTP是截短的。
115.根据权利要求110-114中任一项所述的用途，其中至少一个CTP经由接头附着至所述激动剂。
116.根据权利要求115所述的用途，其中所述接头是肽键。
117.根据权利要求110-116中任一项所述的用途，其中所述CTP修饰的多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9、15、21、23、25、27或29。
118.根据权利要求110-117中任一项所述的用途，其中所述代谢障碍是糖尿病酮症酸中毒、糖尿病或其组合。
119.根据权利要求110-118中任一项所述的用途，其中所述代谢障碍起因于所述受试者中的胰岛素缺失和葡萄糖过多。
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