CZ306180B6 - GLP-1 fúzní proteiny - Google Patents

GLP-1 fúzní proteiny Download PDF

Info

Publication number
CZ306180B6
CZ306180B6 CZ2003-1602A CZ20031602A CZ306180B6 CZ 306180 B6 CZ306180 B6 CZ 306180B6 CZ 20031602 A CZ20031602 A CZ 20031602A CZ 306180 B6 CZ306180 B6 CZ 306180B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
glp
xaa
glu
gly
lys
Prior art date
Application number
CZ2003-1602A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20031602A3 (cs
Inventor
Wolfgang Glaesner
Radmila Micanovic
Sheng-Hung Rainbow Tschang
Original Assignee
Eli Lilly And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22954069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ306180(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Eli Lilly And Company filed Critical Eli Lilly And Company
Publication of CZ20031602A3 publication Critical patent/CZ20031602A3/cs
Publication of CZ306180B6 publication Critical patent/CZ306180B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/26Glucagons
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04Anorexiants; Antiobesity agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/605Glucagons
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76Albumins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76Albumins
    • C07K14/765Serum albumin, e.g. HSA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K19/00Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62DNA sequences coding for fusion proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/30Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/31Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/70Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Vynález se týká sloučenin podobných glukagonu typu 1 fúzovaných na proteiny, které mají za účinek prodloužení poločasu životnosti peptidů in vivo. Heterologní fúzní protein obsahuje první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina, schopná vázat se na GLP-1 receptor a indukovat signalizaci přes tento receptor, a druhý polypeptid je vybraný z lidského albuminu, analogů lidského albuminu, a fragmentů lidského albuminu, a kde C-zakončení prvního polypeptidu je fúzováno na N-zakončení druhého polypeptidu, přičemž fúzní protein je biologicky aktivní a má delší poločas životnosti v plazmě než samotná GLP-1 sloučenina. Tyto fúzní proteiny mohou být použity pro léčbu diabetu mellitu nezávislého na inzulinu, stejně jako řady dalších chorob.

Description

GLP-1 fúzní proteiny
Oblast techniky
Vynález se týká peptidů podobných glukagonu, včetně jejich analogů a derivátů, fúzovaných na proteiny, které umožňují prodloužit poločas životnosti peptidů in vivo. Tyto fúzní proteiny se dají použít pro léčbu diabetes mellitus, který není závislý na inzulínu, stejně jako jiných nemocí.
Dosavadní stav techniky
Peptid podobný glukagonu typu 1 (dále GLP podle anglického názvu „Glucagon-Like Peptide“) (GLP-1) obsahuje 37 aminokyselin, a je vylučován L-buňkami střeva odezvou na příjem potravy. Bylo zjištěno, že stimuluje vylučování inzulínu (inzulinotropní účinky), čímž způsobuje spotřebovávání glukózy buňkami a snižuje koncentraci glukózy v krevním séru (viz, např., Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research, 40:333-343 (1992)). Nicméně je GLP-1 málo aktivní. Následné endogenní štěpení mezi šestým a sedmým místem způsobuje vznik účinnějšího biologicky aktivního GLP-1 (7-37)OH peptidů. Je známo velké množství typů analogů a derivátů GLP-1 a jsou zde citovány jako „sloučeniny GLP-1“. Mezi tyto GLP-1 analogy patří exendiny, což jsou peptidy, které se nacházejí v jedu korovce podezřelého (jedovatá ještěrka z jihozápadu USA). Exendiny mají sekvenční homologii s přírodním GLP-1 a mohou vazbou s receptorem GLP-1 iniciovat signální převáděcí kaskádu odpovědnou za řadu dějů připisovaných GLP-1 (7-37)OH.
Sloučeniny GLP-1 mají souvislost s řadou fyziologicky významných dějů. Tak například se zjistilo, že GLP-1 stimuluje uvolňování inzulínu, snižuje vylučování glukagonu, inhibuje vyprazdňování žaludku a zvyšuje využívání glukózy (Nauck, M. A. a kol. (1993) Diabetologia 36:741744, Gutniak, M. a kol (1992) New England J. of Med. 326:1316-1322, Nauck, M. A. a kol. (1993) J. Clin Invest. 91:301-307).
GLP-1 je nejslibnější pro léčbu diabetes mellitus, který není závislý na inzulínu (NIDDM). Na trhu je řada orálních léčiv pro léčbu rezistence vůči inzulínu, spojené s NIDDM. S postupem nemoci však musí pacient přejít na léčbu, která stimuluje uvolňování inzulínu, a připadne i na léčbu, která vyžaduje injekční podávání inzulínu. Současné účinné látky, které stimulují uvolňování inzulínu, však mohou způsobovat hypoglykémii, stejně jako ji způsobuje podávání inzulínu. Činnost GLP-1 je nicméně regulována hladinou glukózy v krvi. Když hladina klesne na určitou prahovou úroveň, GLP-1 není účinný. Z tohoto důvodu s léčbou pomocí GLP-1 není spojeno žádné riziko hypoglykémie.
Nicméně byla účinnost terapie pomocí GLP-1 peptidů dosud omezena jejich rychlým vyloučením a krátkým poločasem životnosti. Například GLP-1 (7-37) má sérový poločas životnosti jen 3 až 5 minut. Když je GLP-1 (7-36) amid podáván subkutánně, má dobu účinnosti kolem 50 minut. Dokonce analogy a deriváty, které jsou odolné proti endogennímu štěpení proteázou, nemají poločas životnosti tak dlouhý, aby nebylo nutné opakovat podávání v průběhu 24 hodin. Rychlé vyloučení terapeutického činidla je pro pacienta nepohodlné v případech, kdy je žádoucí udržovat v krvi vysokou hladinu účinné látky v prodlouženém časovém intervalu, dokud není podání účinné látky nutné zopakovat. Dále dlouhodobě účinná sloučenina je zejména důležitá pro diabetické pacienty, jejichž léčebný režim vyžaduje pouze podávání orálních léčiv. Tito pacienti se velmi obtížně přizpůsobují režimu, který vyžaduje vícenásobné podávání injekcí s léčivem.
- 1 CZ 306180 B6
Podstata vynálezu
Tento vynález překonává problémy spojené s podáváním sloučeniny, která má krátký plazmatický poločas životnosti. Sloučeniny podle vynálezu obsahují GLP—1 sloučeniny fúzované na jiné proteiny s dlouhým poločasem oběhu, jako je Fc podíl imunoglobulinu nebo albuminu.
Obecně se s malými terapeutickými peptidy špatně manipuluje, neboť i drobné změny v jejich struktuře mohou ovlivnit jejich stabilitu a/nebo biologickou aktivitu. To zejména platí pro GLP-1 sloučeniny, které jsou právě ve vývoji. Například GLP-1 (7-37)OH má tendenci ke změně konformace z primárně alfa-helixové struktury na primárně beta-vrstvenou strukturu. Z této betavrstvené formy vzniká agregovaný materiál, o kterém se má za to, že je neaktivní. Je proto překvapující, že bylo možno vyvinout biologicky aktivní GLP-1 fúzní proteiny s prodlouženým poločasem. Bylo to zvláště neočekávané, uvážíme-li už jen samotnou obtížnost práce s GLP1(7-37)OH a relativně velké rozměry fúzované části vůči malému připojenému GLP-1 peptidů.
Sloučeniny podle vynálezu obsahují heterologní fúzní protein, obsahující první polypeptid s Nzakončením a C-zakončením fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina, schopná vázat se na GLP 1 receptor a indukovat signalizaci přes tento receptor, a druhý polypeptid je vybraný ze skupiny, do které patří a) lidský albumin, b) analogy lidského albuminu a c) fragmenty lidského albuminu, a kde C zakončeni prvního polypeptidu je fúzováno na N-zakončení druhého polypeptidu, přičemž fúzní protein je biologicky aktivní a má delší poločas životnosti v plazmě než samotná GLP-1 sloučenina.
Výhodně je C-zakončení prvního polypeptidu fúzováno na N-zakončení druhého polypeptidu přes peptidový linker. Je výhodné, aby byl peptidový linker zvolen ze skupiny, do které patří a) peptid bohatý na glycin, b) peptid, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, kde n je 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, a c) peptid, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
Je obecně výhodné, aby GLP-1 sloučenina, která je částí heterologního fúzního proteinu, neměla víc než šest aminokyselin lišících se od odpovídajících aminokyselin ve sloučeninách GLP-1 (737)OH, GLP-1(7-36)OH nebo ExendinM. Je ještě výhodnější, aby GLP-1 sloučenina neměla více než pět aminokyselin, lišících se od odpovídajících aminokyselin ve sloučeninách GLP-1 (737)OH, GLP-1 (7-36)OH nebo Exendin-4. Nej výhodnější je, aby GLP-1 sloučenina neměla více než 4, 3 nebo 2 aminokyseliny, lišící se od odpovídajících aminokyselin ve sloučeninách GLP1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendin-4.
Tento vynález také obsahuje polynukleotidy, kódující zde popsané heterologní fúzní peptidy, vektory obsahující tyto polynukleotidy a hostitelské buňky transfektované nebo transformované zde popsanými vektory. Je zde také obsažen způsob výroby heterologního fúzního proteinu, při kterém se provádějí kroky transkripce a translace zde popsaného nukleotidu za podmínek, ve kterých se heterologní fúzní protein exprimuje v detekovatelném množství.
Tento vynález také obsahuje způsob normalizace hladiny krevní glukózy u savců, kteří to potřebují, při kterém se podává terapeuticky účinné množství zde popsaného heterologního fúzního proteinu.
-2CZ 306180 B6
Objasnění výkresů
Vynález bude blíže vysvětlen prostřednictvím konkrétních příkladů provedení znázorněných na výkresech, na kterých představuje obr. 1 Sekvence aminokyseliny IgGl Fc zahrnující ohybovou oblast, CH2 a CH3 domény.
obr. 2 Sekvence aminokyseliny albuminu lidského séra.
obr. 3 A. SDS-PAGE gel a imunoblot stejného gelu, ilustrující molekulární hmotnost fúzních proteinů IgGl-Fc a GLP-l-Fc (pás 1, standardy molekulové hmotnosti; pás 2, čištěný Fc; pás 3, transfektované médium Mock; pás 4, Val8-GLP-1-Fc; pás 5, Exendin-4Fc). B. SDS-PAGE gel a imunoblot stejného gelu, které ilustrují molekulární hmotnost fúzních proteinů lidského HSA a GLP-l-HSA (pás 1, standardy molekulové hmotnosti; pás 2, čištěný HSA; pás 3, transfektované médium Mock; pás 4, Val8-GLP-1-HSA; pás 5, Val8-GLP-l-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA).
obr. 4 SDS-PAGE gel čištěného Fc, albumin, a GLP-1 fúzní proteiny (Pás 1, standardy molekulové hmotnosti; Pás 2, čištěný Fc; Pás 3, Val8-GLP-1-Fc; Pás 4, Exendin-4-Fc; Pás 5, standard molekulové hmotnosti; Pás 6, Val8-GLP-1-HSA; Pás 7, Exendin-4-HSA; Pás 8, Exendin-4-[Gly-G!y-Gly-Gly-Ser]3-HSA).
obr. 5 Expresní klonující vektor obsahující Fc oblasti znázorněné na obr. 1.
obr. 6 Expresní klonující vektor obsahující albuminovou sekvenci znázorněnou na obr. 2.
obr. 7 Expresní klonující vektor obsahující DNA, kódující 15 aminokyselinový linker, fúzovaný v rámci, a 5' albuminovou sekvenci, znázorněnou na obr. 2.
obr. 8 Aktivita GLP-1 fúzních proteinů na dávku in vitro.
obr. 9 Farmakokinetiká GLP-1 Fc a HSA fúzních proteinů.
obr. 10 Glukodynamická odezva Exendin-Fc u dvou normálních vyhladovělých psů.
obr. 11 Inzulinotropní odezva na Exendin-Fc u dvou normálních vyhladovělých psů.
obr. 12 DNA sekvence zahrnující lidskou IgGl Fc oblast.
obr. 13 DNA sekvence zahrnující protein lidského albuminu.
Příklady uskutečnění vynálezu
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu zahrnují GLP-1 sloučeninu fúzovanou na lidský albumin, analog lidského albuminu, fragment lidského albuminu, Fc část imunoglobulinu, analog Fc části imunoglobulinu nebo fragment Fc části imunoglobulinu. C-zakončení sloučeniny GLP1 může být fúzováno přímo, nebo fúzováno přes peptidový linker, na N-zakončení albuminu nebo Fc protein. Tyto heterologní fúznLproteiny jsou biologicky aktivní a mají prodloužený poločas životnosti v porovnání s nativním GLP-1.
Je výhodné, když GLP-1 sloučeniny, které tvoří část heterologního fúzního proteinu, zahrnují polypeptidy, které mají od dvaceti pěti do cca třiceti devíti přírodně se vyskytujících aminokyselin nebo aminokyselin nevyskytujících se v přírodě, které mají dostatečnou homologii k nativnímu GLP-1 (7-37)OH, tak aby projevovaly inzulinotropní aktivitu navázáním na GLP-1 receptor na β-buňkách pankreatu. GLP-1 sloučenina obvykle zahrnuje polypeptid, který má aminokyseli novou sekvenci GLP-1 (7-37)OH, analog GLP-1 (7-37)OH, fragment GLP-1(7-37)OH nebo fragment analogu GLP-1 (7-37)OH. GLP-1 (7-37)OH má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1:
8 9 10 11 12 13 14 15 1617
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe29 30 31 32 33 34 35 3637
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 1)
Jak je v oboru zvykem, bylo amino zakončení GLP-1 (7-37)OH označeno číslem 7 a karboxylové zakončení číslem 37. Další aminokyseliny v polypeptidu jsou číslovány postupně, jak je znázorněno v SEQ ID NO: 1. Například pozice 12 je fenylalanin a pozice 22 je glycin.
GLP-1 sloučeniny rovněž zahrnují „GLP-1 fragmenty.“ Tento GLP-1 fragment je polypeptid získaný odstraněním jedné nebo více aminokyselin z N-zakončení a/nebo C- zakončení GLP1(7-37)OH nebo jejich analogu nebo derivátu. Názvosloví použité pro popis GLP-1 (7-37)OH je rovněž použitelné pro GLP-1 fragmenty. Například GLP-1 (9-36)OH označuje GLP-1 fragment získaný odstraněním dvou aminokyselin z N-zakončení a jedné aminokyseliny z C-zakončení. Aminokyseliny ve fragmentu jsou označeny stejným číslem, jako odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)OH. Například N-zakončení glutamové kyseliny kyselina v GLP-1 (9-36)OH je v pozici 9; pozice 12 je obsazena fenylalaninem; a pozice 22 je obsazena glycinem, stejně jako v GLP-1 (7-37)OH. Pro GLP-1 (7-36)OH je glycin v pozici 37 na GLP-1 (7-37)OH odstraněn.
GLP-1 sloučeniny rovněž zahrnuji polypeptidy, v nichž je přidána jedna nebo více aminokyselin k N-zakončení a/nebo C-zakončení GLP-1 (7-37)OH, nebo jeho fragmenty nebo analogy. Je výhodné, když GLP-1 sloučeniny tohoto typu mají až cca třicet devět aminokyselin. Aminokyseliny v „rozšířené“ GLP-1 sloučenině jsou přiřazovány ke stejným číslům, jako odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)OH. Například N-zakončení aminokyseliny GLP-1 sloučeniny získané přidáním dvou aminokyselin k N-zakončení GLP1(7-37)OH je v pozici 5; a C-zakončení aminokyseliny GLP-1 sloučeniny získané přidáním jedné aminokyseliny k C-zakončení GLP1(7-37)OH je v pozici 38. V obou těchto „rozšířených“ GLP-1 sloučeninách, jako je GLP-1(737)OH, je tedy pozice 12 obsazena fenylalaninem a pozice 22 je obsazena glycinem. Aminokyseliny 1-6 rozšířené GLP-1 sloučeniny jsou výhodně stejné nebo dochází ke konzervativní substituci aminokyseliny v odpovídající pozici GLP-1 (1-37)OH. Aminokyseliny 38M5 rozšířené GLP-1 sloučeniny jsou výhodně stejné nebo dochází ke konzervativní substituci aminokyseliny v odpovídající pozici glukagonu nebo Exendinu-4.
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu zahrnuji „GLP-1 analogy.“ GLP-1 analog má dostatečnou homologii s GLP-1 (7-37)OH nebo fragmentem GLP-1 (7-37)OH, takže tento analog má inzulinotropní aktivitu. Výhodně má GLP-1 analog sekvenci aminokyseliny GLP-1 (7-37)OH nebo jeho fragmentu, modifikovaného tak, že jedna, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin se liší od aminokyselin v odpovídající pozici GLP-1 (7-37)OH nebo fragmentu GLP-1 (7-37)OH. V názvosloví, které je zde použito pro označení GLP-1 sloučenin, substituující aminokyselina a její pozice je určována před hlavní strukturou. Například Glu22-GLP-1(7-37)OH označuje GLP-1 sloučeninu, v níž byl glycin, který se normálně nachází v pozici 22 sloučeniny GLP-1 (7-37)OH, nahrazen kyselinou glutamovou; Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH označuje GLP-1 sloučeninu v níž
-4CZ 306180 B6 byl alanin, který se normálně nachází v pozici 8, resp. glycin, který se normálně nachází v pozici 22 na GLP-1(7-37)OH, zaměněn valinem, resp. kyselinou glutamovou.
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu rovněž zahrnují „GLP-1 deriváty.“ GLP-1 derivát je definován jako molekula, která má sekvenci aminokyseliny GLP-1 nebo analogu GLP-1, ale navíc má chemickou modifikaci jedné nebo více postranních skupin aminokyselin, α-uhlíkových atomů, koncové aminoskupiny nebo koncové skupiny karboxylové kyseliny. Chemická modifikace zahrnuje, ale ne výlučně, přidávání chemických skupin, vytváření nových vazeb a odstraňování chemických skupin. Modifikace postranních skupin aminokyselin zahrnuje, ale ne výlučně, acylaci ε-aminoskupin lysinu, N-alkylaci argininu, histidinu nebo lysinu, alkylaci karboxylové skupiny glutamové nebo asparagové kyseliny a deamidaci glutaminu nebo asparaginu. Modifikace koncové aminoskupiny zahrnuje, ale ne výlučně, desamino, N-nižší alkyl, N-di-nižší alkyl a Nacyl modifikaci. Modifikace koncové karboxylové skupiny zahrnuje bez omezení amid, nižší alkylamid, dialkylamid a nižší alkylester modifikaci. Nižší alkyl je Q-C4 alkyl. Dále jedna nebo více postranních skupin nebo koncových skupin může být chráněna chránícími skupinami, které jsou známé odborníkům průměrně zkušeným v oboru proteinové chemie. α-Uhlík aminokyseliny může být mono- nebo dimethylovaný.
Kterákoliv GLP-1 sloučenina může být částí heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu, jelikož GLP-1 sloučenina sama o sobě je schopna se navázat a indukovat vznik signálu přes GLP-1 receptor. Vazba GLP-1 receptoru a přenos signálu může být posouzen testy in vitro, které jsou popsány v patentu EP 619 322 a patentu US 5 120 712.
Řada účinných GLP-1 fragmentů, analogů a derivátů je v oboru známa a jakýkoliv z těchto analogů a derivátů může být rovněž částí heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu. Ve vynálezu jsou poskytnuty některé příklady nových GLP-1 analogů, stejně jako GLP-1 analogů a derivátů známých v oboru.
Některé GLP-1 analogy a GLP-1 fragmenty známé v oboru zahrnují například GLP-l(7-34) a GLP-l(7-35), GLP-l(7-36), Gln9-GLP-1 (7-37) , D-Gln9-GLP-1 ( 7-37 ) , Thr16-Lys18GLP-l(7-37), a Lys18-GLP-l(7-37). GLP-1 analogy jako je GLP-l(7-34) a GLP-1 (7-35) jsou popsány v patentu US 5 118 666. Rovněžjsou známy biologicky zpracované formy GLP-1, které mají inzulinotropní vlastnosti, jako je GLP-l(7-36). Jiné známé biologicky účinné GLP-1 sloučeniny jsou popsány v patentu US 5 977 071, Hoffmann a kol., patentu US 5 545 618, Buckley a kol., a Adelhorst a kol., J. Biol. Chem. 269:6275 (1994).
Výhodná skupina GLP-1 analogů je sestavena z GLP-1 analogů vzorce 1 (SEQ ID NO: 2)
8 9 10 11 12 13 14 15 1617
His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 3839
Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa40 41 42 43 4445
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
Vzorec I (SEQ ID NO: 2)
-5CZ 306180 B6 kde:
Xaa v pozici 8 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ue, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 9 je Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 11 je Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 14 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 16 je Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp nebo Lys;
Xaa v pozici 17 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 18 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr nebo Lys;
Xaa v pozici 19 je Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin nebo Lys;
Xaa v pozici 20 je Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr nebo Lys;
Xaa v pozici 21 je Glu, Asp, nebo Lys;
Xaa v pozici 22 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 23 je Gin, Asn, Arg, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 24 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 25 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 26 je Lys, Arg, Gin, Glu, Asp nebo His;
Xaa v pozici 27 je Leu, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 30 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 31 je Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 32 je Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 33 je Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 34 je Asn, Lys, Arg, Glu, Asp nebo His;
Xaa v pozici 35 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa v pozici 36 je Gly, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His;
Xaa v pozici 37 je Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
Xaa v pozici 38 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His, neboje odstraněna;
Xaa v pozici 39je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His, neboje odstraněna;
Xaa v pozici 40 je Gly, Asp, Glu, nebo Lys neboje odstraněna;
Xaa v pozici 41 je Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
Xaa v pozici 42 je Ser, Pro, Lys, Glu nebo Asp, neboje odstraněna;
Xaa v pozici 43 je Ser, Pro, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
Xaa v pozici 44 je Gly, Pro, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
a Xaa v pozici 45 je Ala, Ser, Val, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
s podmínkou, že pokud je aminokyselina v pozici 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, nebo 44 odstraněna, potom jsou odstraněny i všechny aminokyseliny po této aminokyselině následující.
Je výhodné, aby GLP-1 sloučenina vzorce I obsahovala méně než šest aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)OH nebo Exendin-4. Je výhodnější, aby se méně než pět aminokyselin lišilo od odpovídající aminokyseliny v GLP—1 (7—37)OH nebo Exendin—4. Je ještě výhodnější, aby se méně než čtyři aminokyseliny lišily od odpovídající aminokyseliny v GLP1(7-37)OH nebo Exendin-4.
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu zahrnují deriváty vzorce 1, jako je jejich C-l-6-ester, nebo amid, nebo C-l-6-alkylamid, nebo C-l-6-dialkylamid. Mezinárodní patentová publikace WO 99/43 706 popisuje deriváty GLP-1 sloučenin vzorce I a je zde celá zahrnuta odkazem. Sloučeniny vzorce 1 odvozené, jak je popsáno v mezinárodní patentové publikaci WO 99/43 706, a neodvozené jsou také zahrnuty v tomto vynálezu.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce II (SEQ ID NO: 3):
-6CZ 306180 B6
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
Vzorec II (SEQ ID NO: 3) kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, a-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, He, Ser nebo Thr;
Xaa v pozici 9 je: Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu nebo His;
Xaa v pozici 11 je: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His;
Xaa v pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr;
Xaa v pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu nebo Ala;
Xaa v pozici 18 je: His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala nebo Lys;
Xaa v pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys;
Xaa v pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu, Gin nebo Arg;
Xaa v pozici 24 je: Glu, Arg, Ala nebo Lys;
Xaa v pozici 26 je: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu nebo His;
Xaa v pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys;
Xaa v pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His;
Xaa v pozici 31 je: Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp nebo Lys;
Xaa v pozici 33 je: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly nebo Glu;
Xaa v pozici 34 je: Glu, Lys nebo Asp;
Xaa v pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His nebo Glu;
Xaa v pozici 36 je: Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu nebo His;
R v pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, neboje odstraněn.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce III (SEQ ID NO: 4):
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa- -Xaa· -Glu- -Gly-Xaa- -Xaa· -Thr· -Ser· -Asp· -Xaa· -Ser-
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser· -Tyr- -Leu- -Glu-Xaa- -Xaa· -Xaa· -Xaa· -Lys· -Xaa- -Phe-
29 30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
Vzorec III (SEQ ID NO: 4)
-7 CZ 306180 B6 kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin,· desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, a-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr;
Xaa v pozici 11 je: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His;
Xaa v pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr;
Xaa v pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu, nebo Ala;
Xaa v pozici 22: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys;
Xaa v pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin;
Xaa v pozici 24 je: Glu, His, Ala nebo Lys;
Xaa v pozici 25 je: Asp, Lys, Glu nebo His;
Xaa v pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys;
Xaa v pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His;
Xaa v pozici 33 je: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly nebo Glu;
Xaa v pozici 34 je: Glu, Lys nebo Asp;
Xaa v pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His nebo Glu;
Xaa v pozici 36 je: Arg, Glu nebo His;
R v pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, neboje odstraněn.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO: 5):
8 9 10 11 12 13 14 15 1617
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe29 30 31 32 33 34 35 3637
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-R
Vzorec IV (SEQ ID NO: 5) kde:
Xaa v pozici 7 je: L—histidin, D—histidin, desaminohistidin, 2—aminohistidin, β—hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Met nebo Thr;
Xaa v pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr;
Xaa v pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu nebo Ala;
Xaa v pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys;
Xaa v pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin;
Xaa v pozici 26 je: Asp, Lys, Glu nebo His;
Xaa v pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His;
Xaa v pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His nebo Glu;
R v pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro neboje odstraněn.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce V (SEQ ID NO: 6):
-8CZ 306180 B6
8 9 10 11 12 13 14 15 1617
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Glu-Phe29 30 31 32 33 34 35 3637
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
Vzorec V (SEQ ID NO: 6) kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, a-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, He, Ser nebo Thr;
Xaa v pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys;
Xaa v pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin;
Xaa v pozici 24 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys;
Xaa v pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His;
R v pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro neboje odstraněn.
Mezi výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce I, Π, Π1, IV a V patři GLP-1 analogy nebo fragmenty GLP-1 analogů, kde analogy nebo fragmenty obsahují jinou aminokyselinu než alanin v pozici 8 (analogy pozice 8). Je výhodné, aby tyto analogy pozice měly jednu nebo více dalších změn v pozicích 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31,33, 34, 35, 36 a 37 ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1 (7-37)OH. Je také výhodné, aby tyto analogy měly 6 nebo méně změn ve srovnání s odpovídajícími aminokyselinami nativního GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1 (7-36)OH. Ještě výhodnější analogy mají 5 nebo méně změn ve srovnání s odpovídajícími aminokyselinami v nativním GLP-1 (7-37)OH nebo GLP-1 (7-36)OH nebo mají 4 nebo méně změn ve srovnání s odpovídajícími aminokyselinami v nativním GLP-1 (7-37)OH nebo GLP1(7-36)OH. Je ještě výhodnější, když tyto analogy mají 3 nebo méně změn ve srovnání s odpovídajícími aminokyselinami v nativním GLP-1(7-37)OH nebo GLP1(7-36)OH. Nejvýhodněji mají tyto analogy 2 nebo méně změn ve srovnání s odpovídajícími aminokyselinami v nativním GLP-1(7-37)OH.
Bylo zjištěno, že sloučeniny vzorce II, III, IV a V mají menší sklon ke shlukování a vytváření nerozpustné formy. To je důležité také v kontextu fúzního proteinu, kde si relativně malý GLP-1 peptid si musí udržet účinnou konformaci, přestože je fúzován na mnohem větší protein. Výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce II, III, IV a V obsažené ve fúzních proteinech podle vynálezu zahrnují GLP-1 analogy nebo fragmenty GLP-1 analogů, ve kterých jsou glycin v pozici 22 a zejména alanin v pozici 8 nahrazeny jinou aminokyselinou.
Když je v pozici 22 asparagová kyselina, glutamová kyselina, arginin nebo lysin, v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin nebo methionin a ještě výhodněji valin nebo glycin. Když je v pozici 22 sulfonová kyselina, jako je kyselina cysteová, v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin nebo methionin a ještě výhodněji valin nebo glycin.
Jiné výhodné GLP—1 sloučeniny zahrnuji GLP—1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO:5) kde analogy mají sekvenci GLP-1 (7-37)OH, s výjimkou toho, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo methionin a ještě výhodněji valin nebo glycin a
-9CZ 306180 B6 v pozici 30 je kyselina glutamová, kyselina asparagová, serin, nebo histidin a ještě výhodněji kyselina glutamová.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO:5) kde analogy mají sekvenci GLP-1 (7-37)OH s výjimkou toho, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo methionin a ještě výhodněji valin nebo glycin a v pozici 37 je histidin, lysin, arginin, threonin, serin, glutamová kyselina, asparagová kyselina, tryptofan, tyrosin, fenylalanin aještě výhodněji histidin.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO: 5) kde analogy mají sekvenci GLP-1(7-37)OH s výjimkou toho, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo methionin aještě výhodněji valin nebo glycin, a v pozici 22 je glutamová kyselina, lysin, asparagová kyselina nebo arginin aještě výhodněji glutamová kyselina nebo lysin, a v pozici 23 je lysin, arginin, glutamová kyselina, asparagová kyselina a histidin aještě výhodněji lysin nebo glutamová kyselina.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce V (SEQ ID NO: 6) kde analogy mají sekvenci GLP-1(7-37)OH s výjimkou toho, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo methionin aještě výhodněji valin nebo glycin a v pozici 22 je glutamová kyselina, lysin, asparagová kyselina nebo arginin aještě výhodněji kyselina glutamová nebo lysin, a v pozici 27 je alanin, lysin, arginin, tryptofan, tyrosin, fenylalanin nebo histidin aještě výhodněji alanin.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnuji GLP-1 analogy vzorce II, kde analogy mají sekvenci GLP-1(7-37)OH s výjimkou toho, že aminokyselina v pozici 8 a jeden, dva nebo tři aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z pozice 9, pozice 11, pozice 12, pozice 16, pozice 18, pozice 22, pozice 23, pozice 24, pozice 26, pozice 27, pozice 30, pozice 31, pozice 33, pozice 34, pozice 35, pozice 36, a pozice 37, se liší od aminokyseliny na odpovídající pozici nativního GLP-1(737)OH.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce II zahrnují: Val8-GLP-1(7-37)OH, Gly8-GLP-1(737)OH, Glu22-GLP-1(7-37)OH, Asp22-GLP-1(7-37)OH, Arg22-GLP-1(7-37)OH, Lys22 GLP1(737)OH, Cys22-GLP-1(7-37)OH, Val-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Asp22-GLP-1(737)OH, Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Cys22-GLP-1(737)OH, Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Arg22-GLP-1(737)OH, Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Cys22-GLP-1(7-37)OH, Glu22-GLP-1(7-36)OH, Asp22-GLP-1(7-36)OH, Arg22-GLP-1(7-36)OH, Lys22-GLP-1(7-36)OH, Cys22-GLP-1(736)OH, Val8-Glu22-GLP1(7-36)OH, Val8-Asp22-GLP-1(7-36)OH, Val8-Arg22-GLP-1(736)OH, Val8-Lys22-GLP-1(7-36)OH, Val8-Cys22-GLP-1(7-36)OH, Gly8-Glu22-GLP-1(736)OH, Gly8—Asp22—GLP—1(7—36)OH, Gly8Arg22-GLP-l(7-36)OH, Gly8-Lys22—GLP-1 (736)OH, Gly8-Cys22-GLP-1(7-36)OH, Lys2-GLP-1 (7-37)OH, Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH, His24-GLP-1(7-37)OH, Val8-His24-GLP-1(7-37)OH, Gly8His24-GLP-1(7-37)OH, Lys24-GLP-1(7-37)OH, Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH, Gly-Lys23GLP-1(7-37)OH, Glu30-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu30-GLP1(7-37)OH, Asp30-GLP-1(7-37)OH, Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Asp30-GLP-l(737)OH, Gln30-GLP-1(7-37)OH, Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Gln30-GLP-1(7-37)OH, Tyr30-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH, Ser30GLP-1(7-37)OH, Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Ser30-GLP-1(7-37)OH, His30-GLP-l(737)OH, Val8-His30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-His30-GLP-1(7-37)OH, Glu34-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu34-GLP-1(7-37)OH, Ala34-GLP-1(7-37)OH, Val8Ala34-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Ala34GLP-l(7-37)OH, Gly34-GLP-1(7-37)OH, Val8-Gly34GLP-1(7-37)OH, Gly8-Gly34-GLP-1(7-37)OH, Ala35-GLP-l(7-37) OH, Val8-Ala35-GLP1(7-37)OH, Gly8-Ala35-GLP-1(7-37)OH, Lys35-GLP-1(7-37)OH, Val8-Lys35-GLP-1(737)OH, Gly8-Lys35-GLP-1(7-37)OH, His35-GLP-1(7-37)OH, Val8-His35-GLP-1(7-37)OH, Gly8-His35-GLP-1(7-37)OH, Pro35-GLP-1(7-37)OH, Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH, Gly8- 10CZ 306180 B6
Pro35-GLP-1(7-37)OH, Glu35-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu35GLP-l(7-37) OH, Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH, Val8-His37-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22Lys23-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22--Glu23-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-Ala27-GLP-l(l31)OH, Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH, Val8-His37-GLP-1(7-37)OH, Gly8-His37-GLP1(7-37)OH, Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH, Val8Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH, a Gly8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH.
Jiná výhodná skupina GLP-1 analogů a derivátů použitelných v tomto vynálezu je tvořena molekulami vzorce VI (SEQ ID NO: 7)
Ri-X-Glu-GlylO-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-SerSer-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-ZPhe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2
Vzorec VI (SEQ ID NO: 7) kde:
Ri je vybrán ze skupiny zahrnující L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, alfa-fluormethylhistidin, a alfa-methylhistidin;
X je vybrán ze skupiny zahrnující Ala, Gly, Val, Thr, lie a alfa-methyl-Ala;
Y je vybrán ze skupiny sestávající z Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly;
Z je vybrán ze skupiny sestávající z Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly; a
R2 je Gly-OH.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin použitelná v tomto vynálezu je popsána ve WO 91/11 457 a sestává se v podstatě z GLP-l(7-34), GLP-l(7-35), GLP-l(7-36), nebo GLP-1(737), nebo jejich amidových forem, a jejich farmaceuticky přijatelných soli, které mají alespoň jednu modifikaci, vybranou ze skupiny zahrnující:
(a) záměnu glycinu, šeřinu, cysteinu, threoninu, asparaginu, glutaminu, tyrosinu, alaninu, valinu, isoleucinu, leucinu, methioninu, fenylalaninu, argininu nebo D-lysinu za lysin v pozici 26 a/nebo pozici 34; nebo záměnu glycinu, šeřinu, cysteinu, threoninu, asparaginu, glutaminu, tyrosinu, alaninu, valinu, isoleucinu, leucinu, methioninu, fenylalaninu, lysinu, nebo D-argininu za arginin v pozici 36;
(b) záměnu oxidačně rezistentní aminokyseliny za tryptofan v pozici 31;
(c) záměnu aspoň jedné z těchto látek: tyrosin za valin v pozici 16; lysin za serin v pozici 18; kyselina asparagová za kyselinu glutamovou v pozici 21; serin za glycin v pozici 22; arginin za glutamin v pozici 23; arginin za alanin v pozici 24; a glutamin za lysin v pozici 26; a (d) záměnu aspoň jedné z těchto látek: glycin, serin, nebo cystein za alanin v pozici 8; kyselina asparagová, glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin, nebo fenylalanin za kyselinu glutamovou v pozicí 9; serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin, nebo fenylalanin za glycin v pozici 10; a kyselina glutamová za kyselinu asparagovou v pozici 15; a
- 11 CZ 306180 B6 (e) záměnu glycinu, šeřinu, cysteinu, threoninu, asparaginu, glutaminu, tyrosinu, alaninu, valinu, isoleucinu, leucinu, methioninu nebo fenylalaninu, nebo D nebo N-acylované nebo alkylované formy histidinu za histidin v pozici 7; přičemž v záměnách (a), (b), (d) a (e) mohou být substituované aminokyseliny připadne v D-formě a aminokyseliny substituované v pozici 7 mohou být případně v N-acylované nebo N-alkylované formě.
Protože enzym dipeptidyl—peptidáza IV (DPP IV) může být odpovědný za pozorovanou rychlou deaktivaci podávaného GLP-1, [viz např. Mentlein, R. a kol., Eur. J. Biochem., 214:829-835 (1993)], jsou v kontextu fúzních proteinů výhodné GLP-1 analogy a deriváty, které jsou chráněny proti činnosti DPP IV, a ještě výhodnější jsou fúzní proteiny, kde GLP-1 sloučeninou je Gly8GLP-1(7-37)OH, Val8-GLP-1(7-37)OH, a-methyl-Ala8-GLP-l(7-37)OH, nebo Gly8-Gln21GLP-1(7-37)OH.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin, použitelných v tomto vynálezu, sestává ze sloučenin podle vzorce VII (SEQ ID NO: 8), chráněného v patentu US 5 512 549, který je zde výslovně začleněn odkazem.
R^Ala-Glu-Gly10Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala30Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R3
R2
Vzorec VII (SEQ ID NO: 8) kde
R1 je vybrán ze skupiny, sestávající z 4-imidazopropionylu, 4-imidazoacetylu nebo 4-imidaζο-α,α-dimethylacetylu;
R2 je vybrán ze skupiny sestávající z Cň-Cio nerozvětveného acylu, neboje odstraněn;
R3 je vybrán ze skupiny sestávající z Gly-OH nebo NH2; a Xaa je Lys nebo Arg.
Ještě výhodnější sloučeniny vzorce IV, použitelné v tomto vynálezu, jsou ty, ve kterých Xaa je Arg a R2 je C6-C]o nerozvětvený acyl. Ještě výhodnější sloučeniny vzorce IV použitelné v tomto vynálezu, jsou ty, ve kterých Xaa je Arg, R2 je C6-C|0 nerozvětvený acyl, a R3 je Gly-OH. Jiné velmi výhodné sloučeniny vzorce IV, použitelní v tomto vynálezu, jsou ty, ve kterých Xaa je Arg, R2 je C6-Cio nerozvětvený acyl, R3 je Gly-OH, a R1 je 4-imidazopropionyl. Zejména výhodná sloučenina vzorce IV, použitelná v tomto vynálezu, je ta, ve které Xaa je Arg, R2 je Cg nerozvětvený acyl, R3 je Gly-OH, a R1 je 4-imidazopropionyl.
Výhodně tyto GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy, kde základní řetězec těchto analogů nebo fragmentů obsahuje aminokyselinu jinou než alanin v pozici 8 (analogy pozice 8). Základní řetězec může rovněž zahrnovat L-histidin, D-histidin, nebo modifikované formy histidinu, jako je desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, a-fluormethylhistidin nebo α-methylhistidin v pozici 7. Je výhodné, aby tyto analogy pozice 8 obsahovaly jednu nebo více dalších změn na pozicích 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 a 37 ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1 (7-37)OH. Je ještě výhodnější, aby tyto analogy pozice 8 obsahovaly jednu nebo více dalších změn na pozicích 16, 18, 22, 25 a 33 ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1 (7-37)OH.
-12CZ 306180 B6
Ve výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1 (7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 12 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu nebo tyrosinu. Je ještě výhodnější, když se kromě záměny v pozici 12 aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce ještě výhodnější, když se kromě záměny v pozicích 12 a 8 aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1 (7-37)OH, kde je aminokyselina v pozici 16 vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu, isoleucinu, leucinu, fenylalaninu, nebo tyrosinu. Je ještě výhodnější, když se kromě záměny v pozicích 16, aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je zvláště výhodné, když se kromě záměny v pozicích 16 a 8 aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je také výhodné, když se kromě záměny v pozicích 16 a 8 aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je také výhodné, když se kromě záměny v pozicích 16 a 8 aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1 (7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 18 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu, tyrosinu, fenylalaninu, lysinu, leucinu nebo isoleucinu, výhodně tryptofanu, tyrosinu a isoleucinu. Je ještě výhodnější, když se kromě záměny v pozicích 18 aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je zvláště výhodné, když se kromě záměny v pozicích 18 a 8 aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když se kromě záměny v pozicích 18 a 8 aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 18 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedeni je GLP-1 analogem GLP-1 (7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 19 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu nebo fenylalaninu, výhodně tryptofanu. Je výhodnější, když kromě záměny v pozicích 19 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je zvláště výhodné, když se kromě záměny v pozicích 19 a 8 aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 19 a 8 se aminokyselina v pozici 30 náhrad kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když se kromě záměny v pozicích 19 a 8 aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 20 je fenylalanin, tyrosin nebo tryptofan. Je výhodnější, když se kromě záměny v pozici 20 aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je zvláště výhodné, když se kromě záměny v pozicích 20 a 8 aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když se kromě záměny v pozicích 20 a 8 aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když se kromě záměny v pozicích 20 a 8 aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 25 je vybrána ze skupiny sestávající z valinu, isoleucinu a leucinu, výhodně valinu. Je výhodnější, když kromě záměny v pozici 25 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je zvláště výhodné, když se kromě záměny v pozicích 25 a 8 aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když se kromě záměny v pozicích 25 a 8 aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když se kromě záměny v pozicích 25 a 8 aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1 (7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 27 je vybrána ze skupiny sestávající z isoleucinu nebo alaninu. Je výhodnější, když se kromě
- 13 CZ 306180 B6 záměny v pozici 27 aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je zvláště výhodné, když kromě záměny v pozicích 27 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 27 a 8 se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 27 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1 (7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 33 je isoleucin. Je výhodnější, když kromě záměny v pozici 33 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo methioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 33 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Rovněž je výhodné, když kromě záměny v pozicích 33 a 8 se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 33 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
GLP-1 sloučeniny mají modifikace na jedné nebo více následujících pozicích: 8, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 a 37. Tyto GLP-1 sloučeniny vykazují účinnost ve srovnání s GLP-1 (737)OH a zahrnují sekvenci aminokyseliny vzorce IX (SEQ ID NO: 12)
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-SerXaai8-Xaai9-Xaa20-Glu-Xaa22“Gln-Ala-Xaa25“Lys-Xaa27~
Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
Vzorec IX (SEQ ID NO: 12) kde:
Xaa? je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa8 je: Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr;
Xaa]2 je: Phe, Trp nebo Tyr;
Xaaj6 je: Val, Trp, Ile, Leu, Phe nebo Tyr;
Xaal8 je: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
Xaal9 je: Tyr, Trp nebo Phe;
Xaa20 je: Leu, Phe, Tyr nebo Trp;
Xaa22 je: Gly, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa25 je: Ala, Val, Ile nebo Leu;
Xaa27 je: Glu, Ile nebo Ala;
Xaa30 je: Ala nebo Glu
Xaa33 je: Val, nebo lie; a
Xaa37 je: Gly, His, NH2, neboje odstraněna.
Některé výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce IX zahrnuji GLP-1 (7-37)OH, GLP-1 (7-36)NH2, Gly8-GLP-1(7-37)OH, Gly8-GLP-1(7-36)NH2, Val8-GLP-1(7-37)OH, Val8-GLP-1(736)NH2, Leu8-GLP-1(7-37)OH, Leu8-GLP-1(7-36)NH2, Ile8-GLP-1(7-37)OH, Ile8-GLP-1(736)NH2, Ser8-GLP-1(7-37)OH, Ser8-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-GLP-1(7-37)OH, Thr8-GLP1(7-36)NH2, Val8-Tyrl2-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyrl2-GLP-1(7-36)NH2, Val8-Tyr16-GLP1(7-37)OH, Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH2, Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-GLP1(7-36)NH2, Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2, Val8-Asp22-GLP1(7—37)OH, Val8-Asp22-GLP-I(7-36)NH2, Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-ASp22-GLP1(7-36)NH2, Val-Lys22A3LP-l(7-37)OH, Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2, Gly8-Lys22-GLP1(7-37)OH, Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2, Leu8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Leu8-Glu22-GLP
- 14CZ 306180 B6
1(7-36)NH2, lle8-Glu22-GLP-l(7-37)OH, lle8-Glu22-GLP-l(7-36)NH2, Leu8-ASp22-GLP1(7-37)OH, Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2, Ile8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Ile8-Asp22-GLP-1(736)NH2, Leu8-Lys22-GLP-1(7-37)OH, Leu8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2, Ile8-Lys22-GLP-1(737)OH, Ile8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Ser8-Glu22-GLP-1(736)NH2, Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Thr8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-Asp22-GLP-1(737)OH, Ser8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Thr8-Asp22-GLP-1(736)NH2, Ser8-Lys22-GLP-1(7-37)OH, Ser8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-Lys22-GLP-1(737)OH, Thr8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2, Glu22-GLP-1(7-37)OH, Glu22-GLP-1(7-36)NH2, Asp22-GLP-1(7-37)OH, Asp22-GLP-1(7-36)NH2, Lys22-GLP-1(7-37)OH, Lys22-GLP-1(736)NH2, Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu30-GLP1(7-37)OH, Val8-Glu30-GLP-l(7-36)NH2, Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu30-GLP1(7-36)NH2, Leu8-Glu3O-GLP-l (7-37)OH, Leu8-Glu30-GLP-l(7-36)NH2, Ile8-Glu30-GLP1(7-37)OH, Ile8-Glu30-GLP-l(7-36)NH2, Ser8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Ser8-Glu30-GLP-l(736)NH2, Thr8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Thr8-Glu30-GLP-l(7-36)NH2, Val8-His37-GLP-1(737)OH, Val8-His37-GLP-1(7-36)NH2, Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH, Gly8-His37-GLP-1(736)NH2, Leu8-His37-GLP-1(7-37)OH, Leu8-His37-GLP-1(7-36)NH25, Ile8-His37-GLP-1(737)OH, Ile8-His37-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-His37-GLP-1(7-37)OH, Ser8-His37-GLP-1(736)NH2, Thr8-His37-GLP-1(7-37)OH, Thr8-His37-GLP-1(7-36)NH2.
Některé výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce IX, které mají vícenásobné záměny, zahrnují GLP1(7-37)OH, kde v pozici 8 je valin nebo glycin, v pozici 22 je kyselina glutamová, v pozici 16 je tyrosin, leucin nebo tryptofan, v pozici 18 je tyrosin, tryptofan nebo isoleucin, v pozici 25 je valin a v pozici 33 je isoleucin. Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnuji následující sloučeniny: Val8Tyr12-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr12-Phe19-GLP-1(737)OH, Val8-Tyrl6-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Trp'6-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Leu16Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Ilel6-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(737)OH, Val8-Trpl8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyrl8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Phe18Glu22-GLP-1(7-37)OH, a Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH.
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu také zahrnují exendinové sloučeniny. Exendin-3 a Exendin-4 jsou biologicky aktivní peptidy, poprvé izolované z jedu ještěrek Helodermatidae a bylo ukázáno, že vážou GLP-1 receptor a stimuluji produkci H+ závislou na cAMP v parietálních buňkách savců. Exendin-3 a Exendin-4jsou oba peptidy z 39 aminokyselin, kteréjsou přibližně z 53 % homologními s GLP-1. Působí jako účinný agonista aktivity GLP-1. Za povšimnutí stojí, že v Nkoncové části je zkrácený derivát Exendinu, známý jako Exendin(9-39 aminokyselin), inhibitorem Exendinu-3, Exendinu-4 a GLP-1.
Exendinová sloučenina obvykle obsahuje polypeptid, který má sekvenci aminokyselin Exendinu3, Exendinu-4 nebo jejich analogů nebo fragmentů. Exendin-3 a Exendin-4 jsou popsány patentu US 5 424 286.
Exendin-3 má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 9:
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser
-15 CZ 306180 B6
19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 3839
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser
41 42 43 4445
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9)
Exendin-4 má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 10:
8 9 10 11 12 13 14 15 1617
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 3839
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser
41 42 43 4445
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10)
Mezi GLP-1 sloučeniny také patří fragmenty Exendinu, jsou polypeptidy získané po zkrácení jedné nebo více aminokyselin z N-zakončení a/nebo C-zakončení Exendinu nebo analogu Exendinu. Dále mezi GLP-1 sloučeniny patří exendinové polypeptidy, ve kterých byla jedna nebo více aminokyselin přidána k N-zakončení a/nebo C-zakončení Exendinu nebo jeho fragmentů. Exendinové sloučeniny tohoto typu mají až cca čtyřicet pět aminokyselin.
Mezi GLP-1 sloučeniny také patři „analogy Exendinu“. Analog Exendinu má dostatečnou homologii s Exendinem-4. Exendinem-3 nebo jejich fragmenty, a to takovou, že tento analog má inzulinotropní účinnost. Účinnost exendinových fragmentů a/nebo analogů se dá posoudit použitím testů in vitro, jako jsou ty, které jsou popsány v EP 619 322 a patentu US 5 120 712.
Výhodně má exendinový analog sekvenci aminokyselin Exendinu-4 nebo jeho fragmentu, modifikovanou tak, aby jedna, dvě, tři čtyři nebo pět aminokyselin lišilo od aminokyselin v odpovídající pozici Exendinu-4 nebo fragmentu Exendinu-4. V názvosloví, které je zde použito pro označování exendinových sloučenin, se substituující aminokyselina a její pozice je uvedena před výchozí strukturou. Například Val8-Exendin-4 znamená exendinovou sloučeninu, v niž byl glycin, který je normálně v pozici 8 Exendinu-4, zaměněn valinem.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin sestává z GLP-l/Exendin^l analogů vzorce Vlil (SEQ ID NO: 11).
- 16CZ 306180 B6
8 9 10 11 12 13 14 15 1617
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 2728
Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe
30 31 32 33 34 35 3637
Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-R
Vzorec VIII (SEQ TD NO: 11) kde:
Xaa v pozici 7 je: L—histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, nebo Val;
Xaa v pozici 16 je: Leu nebo Val;
Xaa v pozici 18 je Lys nebo Ser;
Xaa v pozici 19 je: Gin nebo Tyr;
Xaa v pozici 20 je: Met nebo Leu;
Xaa v pozici 22 je: Glu nebo Gin;
Xaa v pozici 23 je: Glu, nebo Gin;
Xaa v pozici 25 je: Val nebo Ala;
Xaa v pozici 26 je: Arg nebo Lys;
Xaa v pozici 27 je Leu nebo Glu;
Xaa v pozici 30 je: Glu nebo Ala;
Xaa v pozici 33 je: Val nebo Lys;
Xaa v pozici 34 je: Asn nebo Lys;
Xaa v pozici 36 je: Gly nebo Arg;
Xaa v pozici 37 je: Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, neboje odstraněn.
Účinnost 18 různých druhů, které spadají do této skupiny, je uvedena v tabulce 6.
Další exendinové analogy, které jsou použitelné pro tento vynález, jsou popsány v mezinárodní patentové publikaci PCT WO 99/25 728 (Beeley a kol.), WO 99/25 727 Beeley a kol.), WO 98/05 351 (Young a kol.), WO 99/40 788 (Young a koL), WO 99/07 404 (Beeley a kol.) a WO 99/43 708 (Knudsen a kol.).
Fúzní proteiny GLP-1 podle tohoto vynálezu mohou zahrnovat glykosylovaná místa. Glykosylace je chemická modifikace, v niž jsou sacharidové skupiny přidány k proteinu na určitých místech. Glykosylace proteinů hraje roli při zajištění správného náboje, konformace a stability zrajícího proteinu a může zaměřit protein na buněčný povrch a způsobit připadnou sekreci proteinu. Nejdůležitější je, že glykosylace ovlivňuje rychlost vyloučení pro mnoho proteinů in vivo. Sacharidy mohou být O-vázané nebo N-vázané. Obecně O-vázané sacharidy jsou navázány ke kyslíku hydroxylové skupiny šeřinu a threoninu, a N-vázané sacharidy jsou navázány k amidovému dusíku asparaginu. Smluvní místo pro N-glykosylaci je Asn XI X2, kde XI je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Pro a X2 je Ser nebo Thr.
GLP-1 sloučeniny obvykle nejsou glykosylované in vivo; nicméně je zajímavé, že GLP-1 fúzní proteiny podle vynálezu, mezi které patři GLP-1 sloučenina s prodloužením C-zakončení fúzovaným na Fc sekvenci, je glykosylovaný na posledním šeřinu v prodloužení C-zakončení (SSGAPPPS*) a na threoninu v pozici 11 v N-koncové oblasti Fc (AEPKSCDKTHT*CPPC.„).
- 17CZ 306180 B6
Heterologní Fc fúzní proteiny:
Výše popsané GLP-1 sloučeniny mohou být nafúzovány přímo nebo přes peptidový linker k Fc části imunoglobulinu.
Imunoglobuliny jsou molekuly obsahující polypeptidové řetězce, spojené disulfidovými vazbami, které obvykle mají dva lehké řetězce a dva těžké řetězce. V každém řetězci má jedna doména (V) variabilní sekvenci aminokyselin v závislosti na specifičnosti molekuly protilátky. Jiné domény (C) mají do značné míry konstantní sekvenci, která je u molekul tohoto typu běžná.
Fc část imunoglobulinu, tak jak se zde používá, má význam obecně spojovaný s tímto termínem v oblasti imunologie. Přesněji řečeno tento termín znamená fragment protilátky, která se získává odstraněním dvou regionů, které vážou antigen (Fab fragmenty), z protilátky. Jedním ze způsobů, jak odstranit Fab fragmenty, je natrávit imunoglobulin papainovou proteázou. Fc část je tedy vytvořena z přibližně stejně velikých fragmentů z konstantních oblastí obou těžkých řetězců, které jsou spojeny nekovalentními interakcemi a disulfidickými vazbami. Fc část může obsahovat ohybové oblasti a prodlužovat se přes CH2 a CH3 domény k C-zakončení protilátky. Příklady ohybových oblastí pro lidské a myší imunoglobuliny lze nalézt v publikaci Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman and Co., 1992, a informace z nich jsou zde zahrnuty odkazem. Fc část může dále obsahovat jednu nebo více glykosylačních míst. Na obrázku 1 je ukázána sekvence aminokyselin reprezentativního Fc proteinu, který obsahuje ohybovou oblast, CH2 a CH3 domény a jedno N-glykosylační místo v pozici 82.
Existuje pět typů lidských imunoglobulinových Fc regionů s různými efektorovými a farmakokinetickými vlastnostmi: IgG, IgA, IgM, IgD a IgE. IgG je nejrozšířenější imunoglobulin v séru. IgG také má ze všech imunoglobulinů v séru nejdelší poločas životnosti (23 dní). Na rozdíl od ostatních imunoglobulinů je IgG účinně recirkulován a následně vázán na Fc receptor. Existují čtyři podtřídy IgG: Gl, G2, G3, a G4, z nichž každá má různé efektorové funkce. Gl, G2, a G3 může vázat Clq a fixovat komplement, zatímco G4 nemůže. Přestože G3 je schopen vázat Clq účinněji než Gl, Gl je účinnější při zprostředkování komplementem řízené lýzy buňky. G2 fixuje komplement velmi neúčinně. Vazebné místo Clq v IgG je umístěno na oblasti karboxylového zakončení CH2 domény.
Všechny IgG podtřídy jsou schopné navazovat se na Fc receptory (CD16, CD32, CD64), přičemž s Gl a G3 jsou účinnější než G2 a G4. Vazná oblast Fc receptoru IgG je tvořena rezidu umístěnými jednak v ohybové oblasti a také v oblasti karboxylového zakončení CH2 domény.
IgA může existovat v monomemí a dimerní formě držící pohromadě J-řetězcem. IgA je druhým nejrozšířenějším Ig v séru, ale má poločas životnosti pouze 6 dnů. IgA má tři efektorové funkce. Váže se k IgA specifickému receptoru na makrofágy a eosinofily, které se podílí na fagocytóze a degranulaci. IgA může také fixovat komplement přes jinou neznámou alternativní cestu.
IgM je exprimován jako pentamer nebo hexamer, držící pohromadě J-řetězcem. IgM má poločas životnosti 5 dnů. Váže se slabě na Clq přes vazné místo lokalizované v jeho CH3 doméně. IgD má poločas životnosti v séru 3 dny. Je nejasné, jaké efektorové funkce náležejí tomuto Ig. IgE je monomemí Ig a má poločas životnosti 2,5 dne. IgE se váže na dva Fc receptory spouští degranulaci a výsledkem je uvolnění prozánětlivých účinných látek.
V závislosti na požadovaném efektu in vivo mohou heterologní fúzní proteiny podle vynálezu obsahovat jakýkoliv shora popsaný isotyp nebo mohou obsahovat změněné Fc regiony, u kterých byl změněn komplement a/nebo vazebné funkce Fc receptoru. Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu tedy mohou obsahovat celou Fc část imunoglobulinu, fragmenty Fc Části imunoglobulinu nebo jejich analogy fúzované na GLP-1 sloučeninu.
- 18CZ 306180 B6
Fúzní proteiny podle vynálezu mohou sestávat z proteinů s jedním řetězcem nebo víceřetězcové polypeptidy. Dva nebo více Fc fúzní proteiny mohou být vyráběny tak, že interagují pomocí disulfidové vazby, která se přirozeně tvoří mezi Fc oblastmi. Tyto multimery mohou být homogenní s ohledem na GLP-1 sloučeninu nebo mohou obsahovat jiné GLP-1 sloučeniny fúzované na N-zakončení Fc části fůzního proteinu.
Bez ohledu na konečnou strukturu fúzního proteinu, Fc nebo Fc podobné oblasti musí sloužit k prodloužení poločasu životnosti v plazmě GLP-1 sloučeniny fúzované na N-zakončení. Fúzovaná GLP-1 sloučenina musí dále udržovat určitou biologickou aktivitu. Zvětšení poločasu se dá dokázat použitím metody popsané v Přikladu 7, v němž se srovnává poločas životnosti fúzního proteinu s poločasem životnosti samotné GLP-1 sloučeniny. Biologická aktivita se dá zjistit pomocí in vitro a in vivo metod známých v oboru. Reprezentativní biologické testy jsou popsány jako Příklady 6, 8 a 9.
Vzhledem k tomu, že Fc oblast IgG vyrobená proteolýzou má stejný poločas životnosti in vivo jako intaktní IgG molekula a Fab fragmenty rychle degradují, má se za to, že příslušná sekvence, prodlužující poločas životnosti, sídlí v CH2 a/nebo CFL doménách. Dále bylo ukázáno v literatuře, že rychlosti katabolismu IgG variant, které neváží Fc receptor s vysokou afinitou nebo Clq, jsou neodlišitelné od rychlostí vyloučení hlavního standardního typu protilátky, což indikuje, že katabolické místo je odlišné od míst zahrnutých v Fc receptoru nebo Clq vazbě. [Wawrzynczak a kol., (1992) Molecular Imunology 29:221], Studie zaměřené na rozpoznání míst mutageneze, při které se používá murin IgG 1 Fc regionu, navrhly, aby místo IgGl Fc regionu, které kontroluje rychlost katabolismu, bylo lokalizováno na mezičlánku CH2-CH3 domény.
Na základě těchto studií mohou být Fc regiony za účelem optimalizace poločasu životnosti fúzovaných proteinů modifikovány na katabolickém místě. Je výhodné, aby Fc region, používaný pro heterologní fúzní proteiny podle vynálezu byl odvozen od IgGl nebo IgG4 Fc regionu. Je ještě výhodnější, aby Fc region byl IgG4 nebo odvozen od IgG4. Výhodně obsahuje IgG Fc region CH2 i CH3 regiony včetně ohybového regionu.
Heterologní fúzní proteiny s albuminem:
GLP-1 sloučeniny popsané shora mohou být fúzovány přímo nebo přes peptidový linker na albumin nebo na jeho analog, fragment nebo derivát.
Obecně mohou být albuminové proteiny upravující část fúzovaných proteinů podle vynálezu odvozeny od albuminu klonovaného od libovolného druhu. Nicméně pro snížení nebezpečí, že se fúzovaný protein stane imunogenní u lidí, je výhodnější použít lidský albumin a fragmenty a jeho analogy. Albumin lidského séra (HSA) sestává z jednoho neglykosylovaného polypeptidového řetězce o 585 aminokyselinách se vzorcem o molekulární hmotnosti 66 500. Sekvence aminokyselin lidské HSA je znázorněna na obrázku 2. [Viz Meloun a kol. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens a kol. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn a koi. (1981) Nucleic Acids Research 9:61026114; Minghetti a koi. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747], Byly popsány různé polymorfní varianty a stejně tak analogy a fragmenty albuminu. [Viz Weitkamp a koL, (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219]. Například v EP 322 094 vynálezci objevili různé kratší, formy HSA. Některé z těchto fragmentů zahrnují HSA(l-373), HSA(l-388), HSA(l-389), HSA(l-369) a HSA(1-419) a fragmenty mezi 1-369 a 1-419. EP 399 666 přináší objev fragmentů albuminu, které zahrnují HSA(1-177) a HSA(l-200) a fragmenty mezi HSA(1-177) a HSA(l-200).
Obecně se přijímá, že heterologní fúzní proteiny podle vynálezu zahrnují GLP-1 sloučeniny, které jsou s jakýmkoliv albuminovým proteinem, včetně fragmentů, analogů a derivátů, v kterých je tento fúzovaný protein biologicky aktivní a má delší poločas životnosti v plazmě než samotná GLP—1 sloučenina. Proto není nutné, aby měla albuminová část fúzního proteinu poločas životnosti v plazmě stejný jako nativní lidský albumin. Fragmenty, analogy a deriváty jsou známy nebo mohou být generovány tak, aby měly delší poločas životnosti nebo měly délku poločasu
- 19CZ 306180 B6 životnosti mezi poločasem životnosti nativního lidského albumin a diskutované GLP-1 sloučeniny.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu zahrnují proteiny, které mají konzervativní aminokyselinovou substituci v GLP-2 sloučenině a/nebo Fc nebo albuminové části fúzního proteinu. „Konzervativní substituce“ je nahrazení aminokyseliny jinou aminokyselinou, která má stejný čistý elektrický náboj a přibližně stejnou velikost a tvar. Aminokyseliny s alifatickými nebo substituovanými alifatickými aminokyselinovými postranními řetězci mají přibližně stejnou velikost, když celkový počet uhlíků heteroatomů v jejich postranním řetězci se neliší o víc než asi čtyři. Mají přibližně stejný tvar, pokud se počet větví jejich postranního řetězce neliší o více než jednu. Aminokyseliny s fenylovými nebo substituovanými fenylovými skupinami se považují za přibližně stejně veliké a stejného tvaru. Kromě specificky zde vytvořených, konzervativní substituce se provádějí s přirozeně se vyskytujícími aminokyselinami.
Výraz „aminokyselina“, který se zde používá je míněn v nej širším smyslu a zahrnuje přirozeně se vyskytující aminokyseliny, stejně jako nepřirozeně se vyskytující aminokyseliny, včetně analogů a derivátů aminokyselin. Posledně uvedené zahrnují molekuly obsahující aminokyselinovou skupinu. Odborník v oboru tak z pozice této nejširší definice zaznamená, že uvedení aminokyseliny zde zahrnuje například přirozeně se vyskytující proteogenní L-aminokyseliny; D-aminokyseliny; chemicky modifikované aminokyseliny, jako jsou analogy a deriváty aminokyselin; přirozeně se vyskytující neproteogenní aminokyseliny, jako je norleucin, (3-alanin, omitin, GABA atd.; a chemicky připravené sloučeniny s vlastnostmi, o nichž je v oboru známo, že jsou charakteristické pro aminokyseliny. Výraz „proteogenní“, jak se zde užívá, znamená, že aminokyselina může být zabudována v peptidu, polypeptidu nebo proteinu v buňce metabolickou cestou.
Zabudování nepřírodních aminokyselin, včetně syntetických nenativních aminokyselin, substituovaných aminokyselin nebo jedné nebo více D-aminokyselin do heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu může být v mnoha ohledech výhodné. Peptidy obsahující D-aminokyseliny atd. vykazují zvýšenou stabilitu in vitro nebo in vivo ve srovnání s jejich protějšky obsahujícími L-aminokyseliny. Proto může být konstrukce peptidů apod. zahrnující D-aminokyseliny zvláště užitečná, pokud se požaduje větší intracelulární stabilita. Konkrétněji, D-peptidy apod. jsou rezistentní vůči endogenním peptidázám a proteázám, čímž uskutečňují zlepšenou biologickou dostupnost molekule a prodlouženou dobu životnosti in vivo, pokud se takové vlastnosti požadují. Navíc D peptidy apod. nemohou být efektivně zpracovány pro hlavní histokompatibilní komplex třídy Π-omezení prezentace pomocným T-buňkám, a jsou tedy méně schopny vyvolat humorální imunitní odpověď v celém organismu.
Kromě strukturální/funkční analýzy různých peptidů zahrnutých v tomto vynálezu, existuje řada faktorů, které mohou být zohledněny při výběru aminokyselin pro substituci. Jeden z faktorů, který může být zohledněn při provádění těchto změn je hydropatický index aminokyselin. Význam hydropatického indexu aminokyselin při interaktivní biologické funkci proteinu byl diskutován Kytem a Doolittlem (1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132). Přijímá se, že relativní hydropatický charakter aminokyselin přispívá k sekundární struktuře výsledného proteinu. To má dále vliv na interakci proteinu s molekulami, jako jsou enzymy, substráty, receptory, Ugandy, DNA, protilátky, antigeny atd. Ke každé aminokyselině je následujícím způsobem přiřazen hydropatický index založený na její hydrofobnosti a charakteristice nábojů: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamát / glutamin / aspartát / asparagin (-3,5); lysin (-3,9); a arginin (-4,5).
Jak je v oboru známo, určité aminokyseliny v peptidu, polypeptidu nebo proteinu se dají nahradit jinými aminokyselinami, které mají podobný hydropatický index nebo ohodnocení za vzniku výsledného peptidu apod. S podobnou nebo zlepšenou biologickou účinností. Pro provádění těchto změn je výhodné, aby byly vzájemně zaměňovány aminokyseliny, které mají hydropatické indexy v rámci hodnot ±2. Výhodnější substituce jsou ty, ve kterých mají aminokyseliny hydro
-20CZ 306180 B6 patické indexy v rozmezí ±1. Nej výhodnější substituce jsou ty, ve kterých aminokyseliny mají hydropatické indexy v rozmezí ±0,5.
Podobně mohou být aminokyseliny substituovány na základě hydrofilnosti. Patent US 4 554 101 vysvětluje, že největší lokální průměrná hydrofilnost proteinu určená na základě hydrofilnosti v něm sousedících aminokyselin koreluje s biologickou vlastností proteinu. Aminokyselinám jsou přiřazeny následující hodnoty hydrofilnosti následujícím způsobem: arginin/lysin (+3,0); aspartát/glutamát (+3,0±l); serin (+0,3); asparagin/glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (-0,4); prolin (-0,5+1); alanin/histidin (-0,5); cystein (-1,0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin/isoleucin (1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); a tryptofan (-3,4). Jedna aminokyselina v peptidů, polypeptidu nebo proteinu tedy může být substituována jinou aminokyselinou, která má podobný index hydrofilnosti a stále produkuje výsledný peptid apod., který má podobnou biologickou účinnost, tj. stále si zachovává správnou biologickou funkci. Při provádění takových změn se mohou výhodně navzájem substituovat aminokyseliny, které mají hydropatické indexy v rozmezí hodnot ±2, výhodnější jsou ty, které mají hodnoty v rozmezí ±1, a nejvýhodnější jsou ty, které mají hodnoty v rozmezí ±0,5.
Jak bylo výše nastíněno, substituce aminokyselin v fúzovaných proteinech podle vynálezu může být založena na relativní podobnosti substituentech v postranních řetězcích aminokyselin, například jejich hydrofobnosti, hydrofilnosti, náboji, velikosti atd. Dále mohou být substituce založeny na sekundární strukturní podobnosti. Například helikální aminokyselina může být nahrazena aminokyselinou, která zachovává helikální strukturu. Exemplární substituce, které zohledňují různá výše zmíněná kritéria za účelem uskutečnění konzervativních změn aminokyseliny vedoucích ke skrytým změnám v aktuálních peptidech apod., mohou mít vhodné substituenty vybrány z jiných členů třídy, k níž přirozeně se vyskytující aminokyselina náleží.
Aminokyseliny mohou být rozděleny do následujících čtyř skupin: (1) kyselé aminokyseliny; (2) bazické aminokyseliny; (3) neutrální polární aminokyseliny a (4) neutrální nepolární aminokyseliny.
Obecné způsoby výroby heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu.
Ačkoliv heterologní fúzní proteiny podle vynálezu mohou být vyrobeny různými způsoby, výhodné jsou způsoby, které využívají rekombinační techniky. Pro účely tohoto vynálezu, jak je zde vysvětleno a chráněno, jsou dále definovány obecné termíny a zkratky pro molekulární biologii. Termíny a zkratky použité v tomto dokumentu mají svůj normální význam, pokud není uvedeno jinak. Například „°C“ znamená stupně Celsia; „mmol“ znamená milimol nebo milimoly; „mg“ znamená miligramy; „pg“ znamená mikrogramy; „ml“ znamená mililitry a ,,μΐ znamená mikrolitry. Zkratky aminokyselin jsou uvedeny v 37 C.F.R. § 1.822 (b) (2) (1994).
„Párové báze“ nebo „bp“ jak je zde používáno, znamená DNA nebo RNA. Zkratky A,C,G a T odpovídají 5'-monofosfátovým formám deoxyribonukleosidům deoxyadenosinu, deoxycytidinu, deoxyguanosinu a thymidinu, když se objeví v DNA molekulách. Zkratky U,C,G a A odpovídají 5'-monofosfátovým formám ribonukleosidů uridinu, cytidinu, guanosinu a adenosinu, když se objeví v RNA molekulách. V dvoj řetězcové DNA, jsou párové báze spojeny vždy A s T nebo C s G. V DNA/RNA, heteroduplexní párové báze může znamenat spojení A s U nebo C s G. (Viz definice „komplementární“, dále.) „Digesce“ nebo „Restrikce“ DNA znamená katalytické rozštěpení DNA restrikčním enzymem, který působí jen v některých sekvencích DNA („sekvenčně specifické endonukleázy“). Různé zde používané restrikční enzymy jsou obchodně dostupné a jejich reakční podmínky, kofaktory a jiné požadavky byly použity způsobem známým běžně zkušenému odborníkovi v oboru. Vhodné pufry a množství substrátu pro konkrétní restrikční enzymy jsou specifikovány výrobcem nebo se mohou snadno nalézt v literatuře.
-21 CZ 306180 B6 „Ligace“ znamená způsob výroby fosfodiesterových vazeb mezi dvěma dvouvláknovými fragmenty nukleových kyselin. Pokud není jinak ustanoveno, ligace se dá dosáhnout s použitím známých pufrů a podmínek s použitím DNA ligáz, jakoje T4 DNA ligáza.
„Plasmid“ znamená extrachromozomální (obvykle) samoreplikující se genetický prvek. Plasmidy jsou obvykle označovány malým písmenem „p“, následovaným písmeny a/nebo číslicemi. Zde uvedené výchozí plasmidy jsou dostupné obchodně, obecně a neomezeně dostupné nebo mohou být konstruovány z dostupných plasmidů v souladů s publikovanými postupy. Navíc plasmidy ekvivalentní těm, které jsou zde popsány, jsou v oboru známé a jsou běžně zkušenému odborníku v oboru zřejmé.
„Klonovací vektor rekombinační DNA“, jak se zde používá, znamená jakékoli autonomně se replikující činidlo, které zahrnuje, ale neomezuje se plasmidy a fágy, a zahrnuje molekulu DNA, ke které může být nebo bylo přidáno jeden nebo více dalších segmentů DNA.
„Expresní vektor rekombinační DNA“, jak se zde používá, znamená jakýkoliv klonovací vektor rekombinační DNA, ve kterém byl zabudován promotor pro řízení transkripce vložené DNA.
„Transkripce“ znamená způsob, ve kterém se informace obsažená v nukleotidové sekvenci DNA přenáší do komplementární sekvence RNA.
„Transfekce“ znamená vložení expresního vektoru do hostitelské buňky, ať už jsou nebo nejsou nějaké kódovací sekvence ve skutečnosti exprimovány. Odborníkům v oboru je známo mnoho způsobů transfekce, například společné srážení s fosforečnanem vápenatým, liposomová transfekce a elektroporace. Úspěšná transfekce se obecně rozpoznává tehdy, když se v hostitelské buňce objeví jakákoliv indikace, že se s vektorem provádí změna.
„Transformace“ znamená zavedení DNA do organismu, tak aby DNA byla replikovatelná, buď jako extrachromozomální element, nebo chromozomální integrací. Způsoby transformace bakteriálních a eukaryotických hostitelů jsou dobře známy v oboru, mnoho z těchto způsobů, jako je nástřik do jádra, splynutí protoplastů nebo působení vápníku za použití chloridu vápenatého, je popsáno v J. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, (1989). Obecně se při zavádění DNA do kultivačního substrátu používá termín transformace na rozdíl od terminu transfekce.
„Translace“, jak se zde používá, znamená proces, při kterém se používá genetická informace messenger-RNA (mRNA), aby se upřesnila a nasměrovala syntéza řetězce polypeptidu.
„Vektor“ znamená sloučeninu nukleové kyseliny, použitou pro transfekci a/nebo transformaci buněk při genové manipulaci, která nese polynukleotidové sekvence odpovídající příslušným molekulám proteinu, které jsou-li kombinovány s vhodnými řídicími sekvencemi, propůjčují specifické vlastnosti hostitelské buňce, která je transfektována a/nebo transformována. Vhodnými vektory jsou plasmidy, viry a bakteriofágy. Umělé vektory jsou konstruovány štěpením a opětným spojováním DNA molekul z různých zdrojů, přičemž se užívá restrikčních enzymů a ligáz. Termín „vektor“, jak se zde používá, zahrnuje klonující vektory rekombinační DNA a expresní vektory rekombinační DNA.
„Komplementární“ nebo „Komplementarita“, jak se zde používá, znamená párové báze (puriny a pyrimidiny), které se spojují vodíkovými vazbami do dvouřetězcové nukleové kyseliny. Komplementární jsou následující párové báze: guanin a cytosin; adenin a thymin; a adenin a uracil.
„Hybridizace“, jak se zde používá, znamená proces, při kterém se řetězec nukleové kyseliny spojuje s komplementárním řetězcem pomocí párování bází. Podmínky používané při hybridizaci dvou neidentických, ale velmi podobných komplementárních nukleových kyselin, se mění v zá
-22 CZ 306180 B6 vislosti na stupni komplementarity těchto řetězců a jejich délce. Tyto techniky a podmínky pro jejich provádění jsou dobře známé odborníkům s praxí v oboru.
„Izolovaná sekvence aminokyseliny“ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyseliny, konstruovanou nebo syntetizovanou, která je pozičně odlišná od v přírodě se vyskytující sekvence.
„Izolovaná sloučenina DNA“ znamená jakoukoliv sekvenci DNA, konstruovanou nebo syntetizovanou, která je pozičně odlišná od přirozené pozice v DNA genomu.
„Izolovaná sloučenina nukleové kyseliny“ znamená jakoukoliv sekvenci RNA nebo DNA, bez ohledu na způsob konstrukce či syntézy, která je pozičně odlišná od své přirozené pozice.
„Primer“ znamená fragment nukleové kyseliny, který funguje jako iniciační substrát pro enzymatické nebo syntetické prodlužování.
„Promotor“ znamená sekvenci DNA, která usměrňuje transkripci z DNA na RNA.
„Sonda“ znamená sloučeninu nukleové kyseliny nebo její fragment, která se hybridizuje s jinou sloučeninou nukleové kyseliny.
„Přesnost“ hybridizačních reakci je snadno stanovitelná odborníkem v oboru a obecně se zjišťuje empirickým výpočtem, závislým na délce sondy, teplotě promývání a koncentraci soli. Obecně vyžadují delší sondy vyšší teploty pro správnou teplotní hybridizaci, a kratší sondy potřebují nižší teplotu. Hybridizace obecně závisí na schopnosti denaturované DNA znovu hybridizovat, když jsou v médiu přítomny komplementární řetězce pod svou poloviční teplotou denaturace. Čím vyšší je stupeň požadované homologie mezi sondou a hybridizovatelnou sekvencí, tím vyšší teplota se dá použít. Jako výsledek je třeba uvést, že vyšší relativní teploty mají tendenci dělat reakci přesnější, zatímco nižší teploty méně. Pro uvedení dalších podrobností a vysvětlení přesnosti hybridizace viz Ausubel a kol., Current Protocols in Molekular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.
„Přesné podmínky“ nebo „vyšší přesnost podmínek“, jak jsou zde popsány, mohou být stanoveny tím, že (1) využívají malou iontovou sílu a vysokou teplotu pro promývání, například 15 mmol chlorid sodný / 1,5 mmol citrát sodný / 0,1% dodecylsulfát sodný při 50 °C; (2) využívají během hybridizace denaturační činidlo, jako je formamid, například 50% (obj./obj.) formamid s 0,1% albuminem bovinního séra / 0,1% fikol / 0,1% polyvinylpyrrolidon / 50 mmol pufr s pyrofosforečnanem sodným při pH 6,5 s 750 mmol chlorid sodný / 75 mmol citrát sodný při 42 °C; nebo (3) využívá 50% formamid, 5X SSC (750 mmol chlorid sodný, 75 mmol citrát sodný), 50 mmol fosforečnan sodný (pH 6,8), 0,1% difosforečnan sodný , 5X Denhardtův roztok, DNA ze spermatu lososa upraveného ultrazvukem (50 pg/ml), 0,1% SDS, a 10% dextransulfát při 42 °C s promytím při 42 °C v 0,2X SSC (30 mmol sodný chlorid sodný / 3 mmol citrát sodný) a 50% formamidem při 55 °C, následovaným intenzivním promytím s pomoci 0,1 X SSC obsahujícího EDTA při 55 °C.
„Středně přesné podmínky“ jsou popsány v Sambrook a kol. [Molekular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, (1989)], a zahrnují použití promývacích roztoků a hybridizačních podmínek (tj. teploty, iontové síly a % SDS) méně přísných, než bylo popsáno dříve. Příkladem těchto podmínek je inkubace přes noc při 37 °C v roztoku, který obsahuje: 20% formamid, 5X SSC (750 mmol chlorid sodný, 75 mmol citrát sodný), 50 mmol fosforečnan sodný při pH 7,6, 5X Denhardtův roztok, 10% dextransulfát a 20 mg/ml denaturovaného rozrušeného DNA lososího spermatu, po niž následuje promytí v IX SSC při přibližně 37 až 50 °C. Odborník v oboru snadno rozpozná, jak nastavit teplotu, iontovou sílu atd. pokud je nutné přizpůsobit různé faktory, jako je délka sondy a podobně.
-23 CZ 306180 B6 „PCR“ znamená známou polymerázovou řetězovou reakci, která využívá teplotně stabilní polymerázu DNA.
„Vedoucí sekvence“ znamená sekvenci aminokyseliny, která může být enzymaticky nebo chemicky odstraněna, aby se dal vyrobit požadovaný polypeptid, o který nám jde.
„Vylučovací signální sekvence“ znamená aminokyselinovou sekvenci, obecně přítomnou na Nkoncové oblasti většího polypeptidu, která funguje jako iniciátor spojení tohoto polypeptidu membránovými kompartmenty buňky, jako je endoplazmatické retikulum a sekreci tohoto polypeptidu přes plazmovou membránu.
Konstrukce DNA kódující heterologní fúzní proteiny podle vynálezu:
Standardní albuminové a imolunoglobulinové proteiny lze získat z mnoha zdrojů. Tyto proteiny lze například získat z cDNA knihovny, připravené z tkáni a buněk, které exprimují mRNA, o niž nám jde, v detekovatelném množství. Knihovny lze prohledávat pomocí sond, vyrobených s použitím známých DNA nebo proteinových sekvencí pro nalezení sekvence pro konkrétní protein, který nás zajímá. Například konstantní regiony lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinu jsou popsány v Adams a kol. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet a kol. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby a kol. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6027-6031; Rice a kol. (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 7 9:7862-7862; Falkner a kol. (1982) Nature 298:286-288 a Morrison a kol. (1984) Ann. Rev. Imunol. 2:239-256. Některé odkazy popisující albuminové proteiny a DNA sekvence jsou obsaženy v Meloun a kol. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens a kol. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn a koi. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114 a Minghetti a koi. (1986) J. Biol. Chern. 261:6747.
Screening cDNA neboli genomové knihovny s vybranou sondou může být prováděno za použití standardních postupů, které jsou popsány v Sambrook a kol., Molekular Cloning: A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Alternativním prostředkem pro izolaci genů kódujících albuminový nebo imunoglobulinový protein, je způsob PCR [Sambrook a koL, supra; Dieffenbach a kol., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. PCR primery lze konstruovat na základě publikovaných sekvencí.
Obecně mohou standardní sekvence s plnou délkou klonované z konkrétních druhů sloužit jako matrice pro vytvoření analogů, fragmentů a derivátů, které si udržují schopnost přenášet delší poločas životnosti na GLP-1 sloučeniny, které jsou části fúzovaných proteinů. Je výhodné, aby Fc a albuminové části heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu byly odvozeny od nativní lidské sekvence za účelem snížit riziko potenciální imunogenicity fúzovaných proteinů u lidí.
Zejména je výhodné, aby imunoglobulinová část fúzního proteinu podle vynálezu obsahovala pouze Fc fragment imunoglobulinu. V závislosti na tom, zdaje požadována konkrétní efektorová funkce, a na strukturních vlastnostech fúzního proteinu, může Fc fragment obsahovat pantovou oblast spolu s CH2 a CH3 doménami nebo některé jejich další kombinace. Tyto Fc fragmenty mohou být konstruovány s použitím PCR technik s příměry určenými k hybridizaci sekvencí, odpovídajících požadovanému konci fragmentu. Pokud jsou podobně požadovány fragmenty albuminu, mohou být navrženy PCR primery komplementární s interními albuminovými sekvencemi. Mohou být rovněž navrženy PCR primery, které tvoří místa pro restrikční enzymy, aby se usnadnilo klonování do expresního vektoru.
DNA kódující GLP-1 sloučeniny podle vynálezu může být vyrobena mnoha různými způsoby, včetně způsobů klonování, které byly popsány výše, stejně jako chemickou syntézou DNA. Chemická syntéza může být atraktivní, je-li délka kódovaného peptidů malá. Pro GLP-1 byla publikována aminokyselinová sekvence, stejně jako sekvence preproglukagonového genu. [Lopez a kol. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci., USA 80:5485-5489; Bell a kol. (1983) Nature, 302:716
-24CZ 306180 B6
718; Heinrich, G. a koi. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181; Ghiglione, M. a koi. 91984) Diabetologia 27:599-600]. Primery tedy tnohou být vytvořeny pro PCR nativní GLP-1 sloučeniny a jejich fragmenty.
Gen kódující fúzovaný protein může být konstruován ligací DNA kódující GLP-1 sloučeninu s DNA kódující albumin nebo Fc protein. Gen kódující GLP-1 sloučeninu a gen kódující albumin nebo Fc protein mohou být rovněž připojeny přes DNA kódující linkerový peptid.
Funkce a stabilita in vivo heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu může být zlepšena přidáním malých peptidových linkerů pro prevenci potenciálních nežádoucích interakci domén. Ačkoliv tyto linkery mohou mít potenciálně jakoukoliv délku a obsahovat jakoukoliv kombinaci aminokyselin, je výhodné, když jejich délka není větší, než jaká je nezbytná pro prevenci nežádoucích interakcí domén a/nebo optimalizaci biologické aktivity a/nebo stability. Obecně by linkery neměly obsahovat aminokyseliny s extrémně velkými postranními řetězci nebo aminokyseliny, způsobilými zavést signifikantní sekundární strukturu. Je výhodné, aby linker byl bohatý na serin-glycin a měl délku kratší než 30 aminokyselin. Je výhodnější, když linker má délku kratší než 20 aminokyselin. Je ještě výhodnější, když má linker délku kratší než 15. Výhodný linker obsahuje opakování sekvence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Je výhodné, když má mezi 2 až 6 opakování této sekvence. Je dokonce ještě výhodnější, když má mezi 3 a 4 opakováními této sekvence.
DNA kódující standardní typ GLP-1, albuminu a Fc polypeptidu a jejich fragmenty, může být mutována buď před ligací, nebo v kontextu cDNA, kódující celý fúzovaný protein. V oboru je známo mnoho mutagenních technik. Například, mutagenní metoda PCR využívá protažení překrývaného řetězce, aby se vytvořily specifické mutace bázi za účelem změny specifických aminokyselinových sekvencí v odpovídající protein. Tato PCR mutageneze vyžaduje použití čtyř primerů, dvou v přední orientaci (primery A a C) a dvou v zadní orientaci (primery B a D). Mutovaný gen se zesiluje ze vzorku standardního typu ve dvou různých krocích. První reakce zesiluje gen pro každou polovinu zvlášť, že se provádí reakce A s B a zvláštní reakce C s D, kde B a C primery jsou zaměřeny na oblast genu, který má být mutován. Když se tyto primery srovnají s cílovou oblastí, obsahují nesprávně sdružené báze, které se mají změnit. Jakmile jsou reakce A s B a C s D dokončeny, jsou reakční produkty izolovány a smíchány pro použití jako vzorek pro reakci A s D. Výtěžkem této reakce je potom plně mutovaný produkt.
Jakmile byl vyroben gen kódující celý fúzovaný protein, může být klonován do vhodného expresního vektoru. Specifické strategie, kterou mohou být použity k vytvoření GLP-1 fúzovaných proteinů podle vynálezu jsou popsány v příkladu 1.
Obecné způsoby rekombinanční exprese heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu:
Hostitelské buňky se transfektují nebo transformují zde popsanými expresními nebo klonujícími vektory pro výrobu heterologního fúzního proteinu a kultivovány v běžném živném roztoku upraveném pro indukci promotorů, výběr transformantů nebo zesílení genů kódujících požadované sekvence. Kultivační podmínky, jako jsou prostředí, teplota, pH a podobně, mohou být zvoleny i středně zkušeným odborníkem v oboru bez nadměrného počtu experimentů. Obecně lze principy, postupy a praktické techniky pro maximalizováni výtěžků buněčných kultur nalézt v publikaci Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) a Sambrook a koL, supra. Způsoby transfekce jsou známy odborníkům v oboru, například CaPO4 a elektroporace. Obecné aspekty systému transformace hostitelských buněk savců byly popsány v patentu LIS 4 399 216. Transformace do produktu je obvykle prováděna podle metody Solingen a kol., J Bact. 130(2): 946-7 (1977) a Hsiao a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 76 (8): 3829-33 (1979). Rovněž mohou být použity další způsoby pro zavádění DNA do buňky, jako je jaderná mikroinjekce, elektroporace, fúze bakteriálního protoplastu s intaktní buňkou nebo polykationty, například, polybren nebo polyomithin. Pro různé techniky transformace buněk savců viz Keown a kol., Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) a Mansour a koi., Nature 336(6197): 348-52 (1988).
-25 CZ 306180 B6
Vhodné hostitelské buňky pro klonování a expresi nukleových kyselin (např. DNA) ve vektorech zde zahrnují prokaryota, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Mezi vhodná prokaryota patří (aniž by byl výčet těchto prokaryot na tyto buňky omezen) eubakterie, jako jsou gramnegativní nebo grampozitivní organismy, například Enterobacteriace jako je E. coli. Různé kmeny E. coli jsou běžně dostupné, jako například E. coli K12 kmen MM294 (ATCC 3 1.446); E. coli XI 776 (ATCC 3 1.537); E. coli kmen W3 110 (ATCC 27.325) a K5 772 (ATCC 53.635). Mezi jiné vhodné prokaryotické hostitelské buňky patří Enterobacteriaceae jako je Escherichia, např. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebisella, Próteus, Salmonella, např. Salmonella typhimurium, Serratia, např. Serratia marcescens a Shigella, stejně jako Bacilli jako je B. subtilis a B. licheniformis (např. B. licheniformis 4 1 P popsaný v DD266,7 10, publikovaný 12. dubna 1989), Pseudomonas jako je P. aeruginosa a Streptomyces. Tyto příklady se spíše dají považovat za ilustrativní, než za omezující. Zejména výhodný jako hostitel nebo základní hostitel je kmen W3110, protože se jedná o nejběžnější hostitelský kmen pro fermentaci produktů rekombinační DNA. Hostitelská buňka s výhodou vylučuje minimální množství proteolytických enzymů. Například, proto aby se dosáhlo genetické mutace v genech kódujících proteiny, endogenní vůči hostiteli, může být modifikován kmen W3 110, přičemž příklady těchto hostitelů zahrnují E. coli W3110 kmen 1A2, který má kompletní genotyp ronA; E. coli W3 110 kmen 9E4, který má kompletní genotyp ton4 ptr3; E. coli W3110 kmen 27C7 (ATCC 55, 244), který má kompletní genotyp tonA, ptr3 phoA El 5 (argF-lac) 169 degP ompT /can'; E. coli W3110 kmen 40B4, což je kmen 37D6 s deleční mutací degP nerezistentní vůči kanamycinu; a E. coli kmen, který má mutovanou periplasmickou proteázu, popsanou v patentu US 4 946 783, vydaném 7. srpna 1990. Alternativně jsou vhodné způsoby klonování in vivo, např. PCR nebo jiné reakce polymeráz nukleových kyselin.
Vhodnými klonujícími nebo expresními hostiteli pro vektory fúzovaných proteinů jsou kromě prokaryot eukaryotické mikroby, jako jsou vláknité houby nebo kvasinky. Nejběžněji používaným nižším eukaryotickým hostitelským mikroorganismem je Saccharomyces cerevisiae. Mezi jiné patři Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); EP 139,383 publikovaný 2. květen 1995]; hostitelé rodu Muyveromyces [patent US 4 943 529; Fleer a koL, Bio/Technology 9(10): 968-75 (1991)] jako je např. K lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt a kol., J. Bacteriol. 154(2): 737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K wickeramii (ATCC 24,178), K waltii (ATCC 56,500), K, drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg a koL, Bio/Technology 8(2): 135-9 (1990)]; K. thermotoierans a K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070) [Sreekrishna a koL, J. Basic Microbiol. 28(4): 265-78 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa [Case a kol., Proc. Natl. Acad Sci. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces jako je Schwanniomyces occidentulis (EP 394 538 publikováno 31. října 1990) a vláknité houby jako jsou např. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00 357 publikováno 10. ledna 1991) a Aspergillus hostitel jako je A. nidulans [Ballance a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilbum a kol., Gen 26(2-3): 205-21 (1983); Melton a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81(5): 1470—4 (1984)] a A. niger [Kelly and Hyneš, EMBO J. 4(2): 475—9 (1985)]. Methylotrofní kvasinky jsou zvoleny mezi rody, mezi které patří Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis a Rhodotoruia. Seznam specifických druhů, který je příkladem této třídy kvasinek lze nalézt v publikaci C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269(1982).
Vhodné hostitelské buňky pro expresi fúzovaných proteinů podle vynálezu jsou odvozeny od vícebuněčných organismů. Příklady buněk bezobratlých jsou buňky hmyzu, jako je Drosophila S2 a Spodoptera Sp, Spodoptera high5 nebo rostlinné buňky. Příklady vhodných savčích hostitelských buněčných linií jsou vaječníky čínského křečka (CHO) a COS buňky. Konkrétnějšími příklady jsou linie CV1 z opičích ledvin, transformovaná SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linie z ledvin lidských embryí [293 nebo 293 buňky subklonované pro růst v suspenzní kultuře, Graham a kol., J. Gen Virol., 36(1): 59-74 (1977)]; buňky vaječníku čínského křečka/-DHFR [CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]; buňky myší (sertoli) [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; lidské plicní buňky (W138. ATCC CCL 75);
-26CZ 306180 B6 lidské jatemí buňky (Hep G2, HB 8065) a tumor myší prsní žlázy (MMT 060562, ATCC CCL51). Domníváme se, že výběr vhodné hostitelské buňky je pro odborníka v oboru snadný.
Fúzní protein podle vynálezu může být rekombinačně vyroben buď přímo, nebo jako protein, který má signální sekvenci nebo jiné další sekvence, které tvoří specifické štěpné místo na Nzakončení zralého fúzního proteinu. Obecně může být signální sekvence složkou vektoru nebo může být částí DNA kódující fúzovaný protein, která je zavedena do vektoru. Signální sekvencí může být prokaryotická signální sekvence vybraná například ze skupiny, do které patří alkalická fosfatáza, penicillináza, Ipp nebo tepelně stabilní enterotoxinové II zavaděče. Pro vylučování kvasinek může být signální sekvencí např. zavaděč kvasinkové invertázy, zavaděč alfa faktoru (včetně zavaděčů Saccharomyces a Kluyveromyces α-faktoru, přičemž posledně zmíněný zavaděč je popsaný v patentu US 5 010 182) nebo zavaděč kyselé fosfatázy, zavaděč glukoamylázy C. albicans (EP 362,179) nebo signál, popsaný v publikaci WO 90/13 646. Při expresi savčích buněk mohou být použity pro kontrolu vylučování proteinu savčí signální sekvence, jako jsou signální sekvence z vylučovaných polypeptidu stejných nebo příbuzných druhů, stejně jako vylučovací zavaděče virů.
Expresní i klonovací vektory obsahují sekvenci nukleové kyseliny, která umožňuje, aby se vektor replikoval v jedné nebo více vybraných hostitelských buňkách. Takové sekvence jsou dobře známy pro různé bakterie, kvasinky a viry. Pro většinu gramnegativních bakterií je vhodný počátek replikace z plasmidu pBR322, počátek z plasmidu 2u je vhodný pro kvasinky a pro klonující vektory v savčích buňkách jsou vhodné počátky z různých virů (SV40, polyoma, adenovirus, VSV nebo BPV).
Expresní a klonovací vektory obvykle obsahují selekční gen, rovněž označovaný jako volitelný marker. Typické selekční geny kódují proteiny, které (a) dodávají rezistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, např. ampicilinu, neomycinu, methotrexátu nebo tetracyklinu, (b) vyrovnávají autotrofní nedostatky nebo (c) dodávají nepostradatelné živiny, které nejsou dostupné v komplexním médiu např. gen kódující D-alanin racemázu pro mikroorganismy Bacillus.
Příkladem vhodných volitelných markérů pro savčí buňky jsou ty, které jsou schopné rozpoznat buňky způsobilé převzít nukleovou kyselinu kódující fúzovaný protein, jako je DHFR nebo thymidinkináza. Pokud je použit standardní typ DHFR, je vhodnou hostitelskou buňkou buněčná linie CHO s nedostatečnou aktivitou DHFR, vyrobená a šířená, jak je popsáno [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. Vhodným selekčním genem pro použití v kvasinkách je trpí gen přítomný v kvasinkovém plasmidu YRp7 [Stinchcomb a koL, Nature 282(5734): 39 43 (1979); Kingsman a kol., Gene 7 (2): 141-52 (1979); Tschumper a kol., Gen 10 (2): 157-66 (1980)]. Tento trpí gen uskutečňuje selekční marker pro a mutovaný kmen kvasinek, u kterých chybí schopnost růstu v tryptofanu, například, ATCC č. 44076 nebo PEPCI [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)].
Expresní a klonovací vektory obvykle obsahují promotor operabilně napojený na sekvenci nukleové kyseliny kódující fúzovaný protein, aby řídil syntézu mRNA. Promotory rozpoznávané řadou potenciálních hostitelských buněk jsou dobře známy. Mezi promotory vhodné pro použití s prokaryotickými hostiteli patří β-laktamáza a laktózové promotorové systémy [Chang a kol., Nature 275 (5681): 617-24 (1978); Goeddel a kol., Nature 281 (5732) 544-8 (1979)], alkalická fosfatáza a tryptofan (up) promotorovy systém [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8(18): 4057-74 (1980); EP 36 776 publikovaný 30. září 1981], a hybridní promotory, jako je tento promotor [deBoer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1) : 21-5 (1983)]. Promotory pro použití v bakteriálních systémech také obsahuji sekvenci Shine-Dalgamo (S. D.) operabilně navázanou na DNA kódující fúzovaný protein.
Mezi příklady vhodných promotorových sekvencí pro použití s kvasinkovými hostiteli patří 3fosfoglycerátkináza [Hitzeman, a kol,, J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-80 (1980)] nebo jiné glykolytické enzymy [Hess a koL, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry
-27CZ 306180 B6
17(23): 49007 (1978)], jako jsou enoláza, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza pyruvátdekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfátisomeráza, 3-fosfoglycerátmutáza, pyruvátkináza, triosofosfátisomeráza, fosfoglukózoisomeráza a glukokináza.
Dalšími kvasinkovými promotory, které jsou indukovatelnými promotory, které mají další výhody spočívající v transkripci, řízenou růstovými podmínkami, jsou promotorové regiony pro alkoholdehydrogenázu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradativní enzymy spojené s metabolismem dusíku, metalothionein, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu a enzymy zodpovědné za využití maltosy a galaktózy. Vhodné vektory a promotory použitelné pro expresi kvasinek jsou dále popsány v EP 73 657. Transkripce mRNA kódující fúzovaný protein z vektorů v savčích hostitelských buňkách může být řízena například promotory, získanými z genomů virů, jako jsou virus polyom, virus drůbeží chřipky, adenovirus (jako je Adenovirus 2), virus bovinního papilomu, virus ptačího sarkomu, cytomegalovirus, retrovirus, virus hepatitidy B a Simian Virus 40 (SV40), z heterologních savčích promotorů např. aktinový promotor nebo imunoglobulinový promotor a promotory vzniklé tepelným šokem, za podmínky, že takové promotory jsou kompatibilní se systémy hostitelské buňky.
Transkripce polynukleotidu, kódujícího fúzovaný protein vyššími eukaryoty, může být zvýšena vložením zesilovací sekvence do vektoru. Zesilovače jsou elementy DNA působící cis mechanismem, obvykle od 10 do 300 bp, které působí na promotor tak, že zvyšují jeho transkripci. Ze savčích genů je známo mnoho zesilovacích sekvencí (globin, elastáza, albumin, α-ketoprotein a inzulín). Obvykle se v tomto případě použije zesilovač z viru eukaryotických buněk. Mezi příklady patří zesilovač SV40 na posledním replikačním místě (bp 100-270), raný zesilovač promotoru cytomegaloviru, zesilovač polyomu na posledním místě replikačního počátku a zesilovače adenoviru. Zesilovač může být zapojen do vektoru v pozici 5' nebo 3' kódovací sekvence fúzního proteinu, aleje výhodně umístěn na místě 5' od promotoru.
Expresní vektory používané v eukaryotických hostitelských buňkách (kvasinky, houby, hmyz, rostliny, zvířata, člověk nebo buňky s jádrem od jiných mnohobuněčných organismů) také obsahují sekvence nutné pro ukončení transkripce a pro stabilizaci mRNA. Takové sekvence ale jsou všeobecně dostupné z 5' a případně 3' netranslatovaných regionů eukaryot nebo DNA nebo cDNA virů. Tyto regiony obsahují nukleotidové segmenty transkribované jako polyadenylované fragmenty v netranslatované části mRNA kódující fúzovaný protein.
Z kultivačního média nebo lyzátů hostitelských buněk mohou být získány různé formy fúzovaných proteinů. Pokud jsou vázány na membránu, mohou z ní být uvolněny s použitím vhodného roztoku detergentu (např. Triton-X 100) nebo enzymatickým štěpením. Buňky využívané při expresi fúzního proteinu mohou být porušeny různými fyzikálním nebo chemickými prostředky, jako je cyklus zmrazování a rozmrazování, působení ultrazvuku, mechanické rozrušení nebo činidla pro lýzi buněk.
Čištění heterologních fúzních proteinů podle vynálezu:
Jakmile jsou heterologní fúzní proteiny podle vynálezu exprimovány v odpovídající hostitelské buňce, je možné izolovat a čistit analogy. Vhodnými čisticími procedurami jsou: frakcionace na karboxymethylcelulóze; gelová filtrace například na Sephadexu G-75; aniontová výměna v pryskyřici, například na DEAF nebo Mono-Q; kationtová výměna například na CM nebo Mono-S; protein A sefaróza pro odstranění kontaminantů, například IgG; kovové chelatační kolony, které vážou epitopem značené formy polypeptidu; HPLC s reverzní fází; chromatofokusace; silikagel; srážení ethanolem a srážení síranem amonným.
Pro čištění proteinů může být použita řada způsobů a tyto metody jsou známy v oboru a jsou popsány například v Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) a Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Vybraný(é) čisticí krok(y) závisí na povaze vybraného způsobu výroby a konkrétním vyráběném fúzním proteinu. Napří
-28CZ 306180 B6 klad, fúzní proteiny obsahující Fc fragment mohou být účinně čištěny s použitím matrice afinity Protein A nebo Protein G. Pro eluci fúzního proteinu z afinitní matrice lze použít pufry s nízkým nebo vysokým pH. Mírné eluční podmínky napomáhají předcházení nevratné denaturace fúzního proteinu. Rovněž mohou být použity pufry obsahující imidazol. Příklad 3 popisuje některé úspěšné čisticí protokoly pro fúzní proteiny podle vynálezu.
Charakterizace heterologních fúzních proteinů podle vynálezu:
Pro charakterizaci fúzních proteinů podle vynálezu existuje řada způsobů. Mezi tyto způsoby patří: SDS-PAGE spojená s metodami barvení proteinu nebo imunobloting s použitím anti-IgG nebo anti-HSA protilátky. Jiné způsoby zahrnují matricí asistovaná laserová desorpce/ionizační hmotnostní spektrometrie (MALDI-MS), kapalinová chromatografíe/hmotnostní spektrometrie, isoelektrická fokusace, analytická výměna aniontů, chromatofokusace a cirkulámí dichroismus, což je pouze stručný výčet. Reprezentativní množství heterologních fúzovaných proteinů bylo charakterizováno s použitím metody SDS-PAGE spojené s imunoblotingem, stejně jako hmotnostní spektrometrií (viz příklady 4 a 5 a obr. 3 a 4).
Například tab. 3 (viz příklad 5) ilustruje výpočet molekulární hmotnosti reprezentativního počtu fúzních proteinů a stejně tak hmotnost stanovenou hmotnostní spektrometrii. Kromě toho obr. 3 a 4 ilustrují molekulární hmotnosti reprezentativního počtu fúzních proteinů, jak byly stanoveny metodou elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (SDS PAGE). Všechny zkoušené heterologní fúzní proteiny byly okamžitě exprimovány a průběžně vylučovány. Aby byly získány proteiny s přesným N-zakončením, byla štěpena signální sekvence IgK.
Dále ilustruje tabulka 3, že v některých případech je hmotnost stanovená hmotnostní spektrometrií větší než očekávaná. To je důsledkem glykosylace Fc části a prodlouženi C-zakončeni. Enzymatická digesce fúzovaných proteinů následovaná HPLC s reverzní fází a hmotnostní spektrometrií může identifikovat peptidové frakce, které obsahují sacharidové skupiny. Tyto frakce pak mohou být N-koncovými aminokyselinami, sekvencovanými, aby se identifikovalo potenciální glykosylační místo. Například, charakterizace Exendinu-4-Fc (SEQ ID NO: 29) ukazuje, že serin v pozici 39 a threonin v pozici 50 má glykosylovanou O-vazbu a asparagin v pozici 122 má glykosylovanou N-vazbu.
Reprezentativní počet GLP-1 fúzovaných proteinů byl zkoušen také na aktivitu. Pro detekci GLP-1 aktivity in vitro a in vivo existuje řada metod (viz příklady 6, 7, 8 a 9). Tabulka 4 (příklad 6) ilustruje aktivitu GLP-1 receptoru spojený s několika GLP-1 fůzemi. Čísla jsou vyjádřena relativně vůči aktivitě, spojené s Val8-GLP-1(7-37)OH. Všechny testované fúzní proteiny měly aktivitu GLP-1 receptoru. Nízká hodnota aktivity in vitro neznamená nutně slabý efekt in vivo. Vzhledem k výraznému zvýšení poločasu životnosti u těchto fúzovaných proteinů, neznamená malá aktivita in vitro obecně předpověď malé účinnosti in vivo. Obrázek 7 a příklad 7 ilustrují prodloužený poločas životnosti, spojený s fúzovanými proteiny podle vynálezu. Například, Val8-GLP-1-Fc má poločas životnosti u opic přibližně 45 hodin, Val8-GLP-1-HSA má poločas životnosti u opic přibližně 87hodin, Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl má poločas životnosti po podávání IV u psů přibližně 55 hodin a Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl má poločas životnosti po podáváni subkutánně u psů přibližně 38 hodin.
Směsi podle vynálezu:
Podstatným znakem léčivých proteinových přípravků je také fyzikální stabilita. GLP-1 sloučeniny je těžké vyrobit a formulovat v důsledku strukturálních změn, které se objevuji v průběhu výroby. Například některé GLP-1 sloučeniny mají obecně sklon ke shlukování. Navíc bylo ukázáno, že některé GLP-1 sloučeniny konvertují z rozpustné a účinné α-helixové formy na nerozpustnou a potenciálně neúčinnou formu β-vrstvovou. Fúze GLP-1 sloučenin na velké proteiny jako je Fc region IgG nebo albuminu nepřispívá jen z prodloužení poločasu životnosti GLP-1
-29CZ 306180 B6 sloučeniny, ale také přispívá k fyzikální a konformační stabilitě GLP-1 sloučeniny. Například, Val8-GLP-1-Linker-HSA v PBS je stabilní při 37 °C po dobu přibližně až 30 dnů.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu mohou být formulovány s jednou nebo více přísadami. Účinné fúzní proteiny podle vynálezu mohou být kombinovány s farmaceuticky přijatelným pufrem a pH upraveným na takovou hodnotu, která zajistí přijatelnou stabilitu a pH přijatelné pro podávání, jako je parenterální podávání.
Případně může být přidán jeden nebo více farmaceuticky přijatelných antimikrobiálních prostředků. Výhodnými farmaceuticky přijatelnými mikrobiálními prostředky jsou meta-kresol a fenol. Pro upravení iontové síly a tonicity může být přidána jedna nebo více farmaceuticky přijatelných solí. Pro další úpravu izotonicity přípravku může být přidána jedna nebo více přísad. Příkladem přísady, která upravuje izotonicitu je glycerin. Farmaceuticky přijatelné znamená, že tento prostředek je vhodný pro podávání lidem nebo jiným živočichům, a tak neobsahuje toxické prvky nebo nežádoucí kontaminanty a neruší v nich účinnost aktivních sloučenin.
V tomto vynálezu se dá použít farmaceuticky přijatelná solná forma heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu. Běžně používanými kyselinami pro výrobu adičních solí s kyselinami jsou anorganické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a podobně, dále organické kyseliny, jako je ptoluensulfonová kyselina, methansulfonová kyselina, kyselina šťavelová, />-bromfenylsulfonová kyselina, kyselina uhličitá, kyselina jantarová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina octová a podobně. Výhodné adiční soli s kyselinami jsou ty, které tvoří minerální kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková a bromovodíková.
Mezi adiční soli s bázemi patří ty, které jsou odvozeny od anorganických bází, jako jsou hydroxidy, uhličitany, hydrogenuhličitany amonné, alkalické nebo kovů alkalických zemin a podobně. Zásady používané pro výrobu soli podle vynálezu zahrnují hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amonný, uhličitan draselný a podobně.
Podávání směsí:
Podávání může uskutečněno jakoukoliv cestou, o niž je i středně zkušenému lékaři známo, že je účinná. Metody podávání mohou být vnější a vnitřní. Parenterálním podáváním se obecně v lékařské literatuře rozumí injekce dávky do těla sterilní stříkačkou nebo jiným mechanickým zařízením, jako je infuzní pumpa. Periferní parenterální cesty zahrnují intravenózní, intramuskulámí, subkutánní a intraperitoneální cesty podávání.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu mohou být rovněž podávány orálně, rektálně, nasálně, nižšími dýchacími cestami, což jsou neparenterální cesty. Mezi těmito neparenterálními cestami se upřednostňují nižší dýchací cesty a orální cesta.
Fúzní proteiny podle vynálezu mohou být použity pro léčbu řady nemocí a chorobných stavů. Fúzní proteiny podle vynálezu primárně projevují svůj biologický účinek působením na receptor, o kterém se zde mluví jako o „GLP-1 receptoru“. Subjekty s nemocemi a/nebo stavy pak odpovídají na stimulaci GLP-1 receptoru nebo na podávání GLP-1 sloučeniny příznivě a mohou tak být léčeny pomocí GLP-1 fúzovaných proteinů podle vynálezu.
O těchto subjektech se hovoří jako o těch, které „potřebují léčbu GLP-1 sloučeninami“ nebo „potřebuji stimulaci GLP-1 receptoru“. Mezi tyto subjekty patří subjekty s diabetem, který nevyžaduje léčbu inzulínem, diabetes, který vyžaduje léčbu inzulínem (viz WO 00/16 797), infarkt myokardu (viz WO 98/08 531), obezita (viz WO 8/19698), katabolické změny po chirurgickém zásahu (viz patent US 6 006 753), funkční dyspepsie a syndrom dráždivého tračníku (viz WO 99/64 060). Mezi subjekty rovněž patří ty, které potřebují profylaktickou léčbu GLP-1 sloučeninami, např. subjekty, u nichž je nebezpečí, že se u nich vyvine diabetes nezávislý na inzulínu (viz
-30CZ 306180 B6
WO 00/07 617). Mezi subjekty, u kterých je riziko rozvinutí diabetů nezávislého na inzulínu, patří subjekty s porušenou tolerancí glukózy nebo s poruchou glykémie, subjekty, jejichž tělesná hmotnost je o přibližně 25 % nad normální tělesnou hmotnosti odpovídající výšce a tělesné stavbě subjektu, dále subjekty s částečnou pankreatektomií, subjekty, u nichž jeden nebo oba rodiče měli diabetes nezávislý na inzulínu, subjekty s těhotenským diabetem a subjekty s akutní nebo chronickou pankreatitidou.
„Účinné množství“ GLP-1 sloučeniny je množství, které má za následek požadovaný léčebný a/nebo profylaktický účinek, aniž by způsobil nežádoucí vedlejší účinky při podávání subjektu, který potřebuje stimulaci GLP-1 receptoru. „Požadovaný terapeutický účinek“ představuje jeden nebo více následujících jevů: 1) zlepšení příznaků spojených s nemocí nebo chorobným stavem, 2) zdržení nástupu příznaků spojených s nemocí nebo chorobným stavem; 3) prodloužení délky života v porovnání s absencí léčby; a 4) vyšší kvalita života v porovnání s absencí léčby. Například „účinné množství“ GLP-1 sloučeniny pro léčbu diabetů je množství, které může mít za následek lepší řízení koncentrace krevní glukózy v porovnání s absencí léčby, v důsledku čehož dojde k opožděnému nástupu komplikací diabetů, jako je retinopatie, neuropatie nebo nemoci ledvin. „Účinné množství“ GLP-1 sloučeniny pro prevenci diabetů je množství, které zpomalí v porovnání s absencí léčby, nástup vyšších hladin krevní glukózy, které vyžadují léčbu pomocí antihypoglykemických léčiv, jako jsou sulfonylmočoviny, thiazolidindiony, inzulín a/nebo bisguanidiny.
Dávka fúzního proteinu, která je dostatečná pro normalizaci hladiny glukózy, závisí na mnoha faktorech, mezi něž patří, aniž by na ně byly omezeny, pohlaví subjektu, váhu a věk, závažnost neschopnosti regulovat krevní glukózu, způsob podávání a biologická dostupnost, farmakokinetický profil fúzního proteinu, účinnost a formulace.
Tento vynález zahrnuje GLP-1 sloučeniny, které mají zlepšené biochemické a biofyzikální vlastnosti díky tomu, že jsou fúzovány na albuminový protein, albuminový fragment, albuminový analog, Fc protein, Fc fragment, nebo Fc analog. Tyto heterologní proteiny mohou být úspěšně exprimovány v hostitelské buňce, přičemž zachovávají signální aktivitu spojenou s aktivací GLP-1 receptoru a mají prodloužený poločas životnosti.
Příklady uskutečnění vynálezu
Následující příklady jsou uváděny za tím účelem, aby byl popsán tento vynález. Rozsah tohoto vynálezu se neomezuje na tyto příklady. Odborník v oboru rozpozná, že konkrétní popsaná reakční činidla, zařízení a postupy jsou pouze ilustrativní a nejsou míněny tak, že by měly omezovat v nějakém směru rozsah vynálezu jakýmkoliv způsobem.
Příklad 1: Konstrukce DNA kódující heterologní fúzní proteiny
Příklad la Konstrukce DNA kódující Val8-GLP-l(7-37)Fc:
Podíl Fc lidského IgG 1 byl izolován z knihovny cDNA a obsahoval plný pantový region a CH2 a CH3 domény. Fragment obsahující 696 párových bází tohoto Fc podílu lidského IgGl byl subklonován do míst Nhel a Eco47III savčího expresního vektoru pJB02, aby se vytvořil pJB02/Fc (viz obr. 5). DNA kódující IgK sekreční signální sekvenci fúzovanou na Val8-GLP-l(7-37) byla vytvořena in vitro hybridizací čtyř překrývajících se a komplementárních oligonukleotidů:
-31 CZ 306180 B6
5'-CTAGCCACCAT-GAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTT
CCAGGTTCCACTGGTGACCAGTG - 3' [SEQ ID NO :12]
5'- GAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGAGGGCCAGGCCGCCAAGGA GTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGAAGAGGC - 3' [SEQ ID NO:13]
5'- TGAAGGTGCCCTCCACGTGGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTA
CCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGG - 3' [SEQ ID NO:14]
5'- GCCTCTTCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCCTGGCCCTCCAGA
TAGGAGGACACGTCGGAGG -3' [SEQ ID NO:15]
Hybridizační reakce byla provedena za použití ekvivalentních množství každého oligonukleotidu (při konečné koncentraci 1 pm/μΐ každého oligonukleotidu). Směs oligonukleotidů byla zahřívána 5 min při 100 °C v ligačním pufru (50 mmol Tris-HCI, pH 7,5, 10 mmol MgCl2 10 mmol DTT, 1 mmol ATP, 25 pg/ml albumin bovinního séra), a potom ochlazován po dobu nejméně 2 hodin na 30 °C.
Výsledný hybridizační produkt byl ligován po dobu 2 hodin při pokojové teplotě nebo přes noc při 16 °C k pJB02/Fc hlavnímu řetězci vektoru, který byl natráven pomocí Nhel a Eco47III. Produkty ligace byly pak použity, aby se transformovaly vhodné modré buňky XL-1 (Stratagen). Rekombinantní plasmidy byly vyšetřovány na přítomnost peptidů kódujícího inserty natrávením klonů pomocí Ncol (kódující sekvence Kozak a první Met signálního peptidů) a sekvencovány. Výsledný expresní plasmid, použitý pro transfekční testy byl označen pJB02-V8-GLP-l-Fc (Obr. 5).
Příklad 1b Konstrukce DNA kódující Val8-GLP-1(7-37)HSA:
Plasmid HSA/pcDNA3.1GS byl získán od fy Invitrogen (katalogové číslo H-M12523MpcDNA3.1/GS) a použit jako šablona pro izolaci cDNA kódující albumin lidského séra (HSA). cDNA HSA byla připravena s použitím PCR, kde byly z konce 5' odstraněny DNA kódující hlavní sekvenci, stejně jako pro-peptid se šesti aminokyselinami. Navíc byly přidány stop kodony přímo na konec 3' HSA kódovací sekvence. Nakonec byla na koncích 5' a 3' vytvořena místa restrikčních enzymů, aby bylo usnadněno klonování. DNA sekvence HSA přítomná v původním vektoru získaném od fy Invitrogen obsahovala samostatnou bázi změněnou v regionu 3' genu (pozice 667) ve srovnání s nativní lidskou sekvencí. Tato změna má za následek kodon pro Asn namísto Asp. Použitím dříve diskutované PCR mutagenní metody s překryvem řetězců byl tedy kodon zaměněn tak, aby kódoval Asp na této pozici. Výsledný HSA kódující DNA byl klonován na Nhel a HindlII místa pJB02, aby vznikl pJB02-HSA (Obr. 6).
Hlavní sekvence IgK fúzovaná na Val8-GLP-l(7-37) sekvenci byla vytvořena tak, jak bylo uvedeno v Přikladu la. Tato DNA byla ligována na Nhel a Fspl místa pJB02-HSA, aby vznikl pJB02-Val8-GLP-l-HSA.
-32CZ 306180 B6
Příklad 1c Konstrukce DNA kódující Val8-GLP-l(7-37)-linker-HSA:
Vektor pJB02-HSA byl připraven tak, jak bylo uvedeno v příkladu 1b. DNA kódující linkerovou sekvenci [GGGGS]3 byla ligována v rámci na 5' konec HSA kódující DNA, aby vznikl pJB025 linker-HSA (obr. 7). DNA kódující hlavní sekvenci IgK a fúzovaná na sekvenci Val8-GLP-1(737) a 5' část linkerové sekvence byla vytvořena tak, jak bylo uvedeno v příkladu la. Tato DNA byla ligována na Nhel a BspEI místa pJB02, aby vznikl pJB02-Va!8-GLP-l-linker-HSA.
Vektor pJB02-HSA byl připraven tak, jak bylo uvedeno v příkladu 1b. DNA kódující linkerovou ίο sekvenci [GGGGS]3 byla ligována v rámci na 5' konec HSA kódující DNA, aby vznikl pJB02linker-HSA (Obr. 7). DNA kódující hlavní sekvenci IgK a fúzovaná na sekvenci Val8-GLP-1(737) a 5' část linkerové sekvence byla vytvořena tak, jak bylo uvedeno v příkladu la. Tato DNA byla ligována na Nhel a BspEI místa pJB02, aby vznikl pJB02-Val8-GLP-l-linker-HSA.
Příklad Id Konstrukce DNA kódující Exendin-4-Fc:
Plasmid pJB02/Fc byl připraven tak, jak je popsáno v příkladu la. DNA kódující IgK signální sekvenci, fúzovanou na Exending-4, byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících překrýva20 jících se a komplementárních oligonukleotidů:
5' - CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG GGTTCCAGGTTCCACCGGTCAC - 3' [SEQ ID NO:16]
5' - GGAGAGGGAACCTTCACCAGCGACCTGAGCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGT
GAGACTG - 3' [SEQ ID NO:17]
5' - TTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGAGGACCAAGCAGCGGAGCCCCTCCTCCT
AGO - 3' [SEQ ID NO:18]
5' - GAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCA TGGTGG - 3' [SEQ ID NO:19]
5' - CTCCTCCTCCATCTGCTTGCTCAGGTCGCTGGTGAAGGTTCCCTCTCCGTGA CCGGTG - 3' [SEQ ID NO:20]
5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTTGGTCCTCCGTTCTTCAGCCACTCGAT GAACAGTCTCACGGC - 3' [SEO ID NO:211
Hybridizační reakce byla provedena tak, jak je popsáno v příkladu la. Hybridizovaný produkt byl 25 ligován na pJB02 vektor, který byl natráven pomocí Nhel a Eco47III, jak je popsáno v příkladu la, aby vznikl pJB02-ExendinM-Fc.
-33 CZ 306180 B6
Příklad le Konstrukce DNA kódující Exendin-4-HSA:
Plasmid pJB02-HSA byl připraven tak, jak je popsáno v příkladu lb. DNA kódující IgK signální sekvenci, fúzovanou na Exendin-4, byla vytvořena in vitro hybridizaci stejných překrývajících se a komplementárních oligonukleotidů, jako jsou popsány v příkladu Id. Hybridizační reakce byly rovněž prováděny, jak je popsáno shora. DNA byla klonována na unikátní Nhel a Fspl místa v pJB02-HSA, aby vznikl pJB02-Exendin-4HSA.
Příklad If Konstrukce DNA kódující Exendin-4-linker-HSA:
Plasmid pJB02-linker-HSA byl konstruován tak, jak je popsáno v Přikladu 1c. DNA kódující IgK signální sekvenci, fúzovanou na Exendin-4 a 5' část linkerové sekvence, byla vytvořena jako v příkladu Id. Tato DNA byla klonována na unikátní Nhel a BspEI místa v pJB02-linker-HSA, aby vznikl pJB02-Exendin-4-linker-HSA.
Příklad Ig Konstrukce DNA kódující ValB-GLP-l/C-Ex-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin-4-Fc byl připraven tak, jak je popsáno v Příkladu Id. Rxendin-4 kódující DNA byl odstraněn z vektoru pomocí Agel a Eco471II. Val8-GLP-1/C-Ex kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících překrývajících se a komplementárních oligonukleotidů.·
5' -CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGA
GGGCCAGGCCGCCA - 3' [SEQ TD NO:22]
5' - AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGG
AGCCCCTCCTCCTAGC - 3' [SEQ ID NO:23]
5' - CTCCAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCAC
GTGA - 3' [SEQ ID NO:24]
5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGA
TGAATTCCTTGGCGGCCTGGCC - 3' [SEQ ID NO:25]
Hybridizační reakce byla provedena tak, jak je popsáno v příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován na místě Exendinu-4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresním vektoru, aby vznikl pJB02Val8-GLP-1/C-Ex-Fc.
Příklad Ih Konstrukce DNA kódující Val8-Glu22-GLP-1-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin-4-Fc byl připraven, jak je popsáno v příkladu Id. Exendin-4 kódující DNA byla odstraněna z vektoru pomocí Agel a Eco47III. Val8-Glu22-GLP-l kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících překrývajících se a komplementárních oligonukleotidů:
-34CZ 306180 B6
5' -CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGA
GGAGCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:26]
5' - AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC - 3' [SEQ ID NO:27]
5' - GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCC
TGCTC - 3' [SEQ ID NO:28]
5' - CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCT
CCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:29]
Hybridizační reakce byla prováděna, jak je popsáno v příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován v místě Exendin—4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresního vektoru, aby vznikl pJB02-Val85 Glu22-GLP-1-Fc.
Příklad li Konstrukce DNA kódující Val8-Glu22-GLP-l/CEx-Fc:
io Plasmid pJB02-ExendinM-Fc byl připraven, jak je popsáno v Příkladu Id. Exendin-4 kódující DNA byla vyseknuta z vektoru pomocí Agel a Eco47IIL Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizací následujících překrývajících se a komplementárních oligonukleotidů:
5’ - CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGA
GGAGCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:30]
5' - AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGGA
GCCCCTCCTCCTAGC - 3' [SEQ ID NO:31]
5' - CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCC
TCCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:32]
5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGA
TGAATTCCTTGGCGGCCTGCTC - 3' [SEQ ID NO:33]
Hybridizační reakce byla provedena tak, jak je popsáno v příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován v miste Exendinu-4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresním vektoru, aby vznikl pJB02-Val8Glu22-GLP-I/C-Ex-Fc.
-35 CZ 306180 B6
Příklad lj: Konstrukce DNA kódující Gly8-GAP-1-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin—4-Fc byl připraven, jak je popsáno v příkladu Id. Exendin-4 kódující DNA byla odstraněna z vektoru pomocí Agel aEco47III. Gly8-GLP-1 kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících překrývajících se a komplementárních oligonukleotidů:
5' - CCGGTCACGGCGAGGGCACCTTCACTAGTGACGTGTCCTCCTATCTGGA
GGGCCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:34]
5' - AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC - 3' [SEQ ID NO:35]
5' - CTCCAGATAGGAGGACACGTCACTAGTGAAGGTGCCCTC
GCCGTGA - 3' [SEQ ID NO:36]
5’ - GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGC
CTGGCC - 3' [SEQ ID NO:37]
Hybridizační reakce byla provedena tak, jak bylo popsáno v příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován v miste Exendinu-4 v expresním vektoru pJB02-Exendin—4-Fc, aby vznikl pJB02Gly8-GLP-1-Fc.
Příklad 2: Exprese heterologních fúzních proteinů
Exprese fúzovaných proteinů kódovaných DNA, konstruovanými v příkladu 1, byla provedena přechodnými transfektními buňkami HEK 293EBNA (jak přisedlé, tak v suspenzi). Buňky byly spočítány a naočkovány 24 hodin před transfekcí. Transfekční koktejl byl připraven smíšením transfekčního činidla FuGene™6 (Roche Molecular Biochemicals, katalogové č. 1814443) s OptiMEM (Gibco/BRL) a inkubován při pokojové teplotě 5 min, načež byla přidána DNA a koktejl byl inkubován dalších 15 min. Bezprostředně před transfekci bylo na desku naneseno čerstvé kultivační médium. Další detaily transfekce jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.
Tabulka 1: Činidla použitá při transientní transfekci buněk 293EBNA
Tkáňová kultivační nádoba Počet naočkovaných buněk DNA (pg) FuGene (pl) OptiMEM médium (ml) Objem kult, média (ml)
35 mm 5 · 105 1,5 9 0,102 2
100 mm 2 106 12 73 0,820 10
700 cm2 (RB) 2 107 65 400 4,0 100
-36CZ 306180 B6
Tabulka 2: Složení média
Růstové a transfekčni médium Kultivační médium
DMEM F12 3:1 Báze Hybritech
5 % FBS 1 mmol Ca2+
20 mmol HEPES 20 mmol HEPES
2 mmol L-glutamin 1 pg/ml Nuselin (lidský inzulín)
50 pg/ml geneticin (G418 NEO) 1 pg/ml lidský transferrin
50 pg/ml tobramycin 50 pg/ml tobramycin
Při transfekcích malého rozsahu (35mm až 10mm nádoby) byly buňky propláchnuty PBS a převedeny do kultivačního média 24 hodin po transfekci, přičemž bylo médium shromažďováno a vyměňováno za čerstvé každé 24 hodin po několik dnů. V případě transfekci velkého rozsahu (700 cm2 válcová baňka) byly válcové baňky vypláchnuty PBS 48 hodin po transfekci a buňky byly převedeny do výtěžkového média. Médium bylo shromažďováno a vyměňováno za čerstvé každých 24 hodin po nejméně 10 po sobě následujících dnů. Obvykle bylo pro následné čištění proteinu použito 10 sklizní.
Příklad 3: Čištěni heterologních fúzních proteinů
Příklad 3a Čištění Val8-GLP-1-Fc
Přibližně 4,5 litru u stálého média (při hladině exprese fúzních proteinů přibližně 20 pg/ml) z transfekce velkého rozsahu bylo filtrováno za použití filtračního systému CUNO a koncentrováno na 250 ml s použitím filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem a s 10K filtrační membránou. Val8-GLP-1-Fc byly zachyceny na koloně 5 ml HiTrap protein A v Ix PBS s hodnotou pH 7,4 při průtoku 2 ml/min a eluovány 50 mmol kyseliny citrónové s hodnotou pH 3,3. Frakce (1 ml) byly shromažďovány ve zkumavkách obsahujících 4 ml lx PBS a 100 μΐ 1 M Tris s hodnotou pH 8.
Frakce obsahující fúzní protein, jak byl stanoven pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a HPLC s reverzní fázi na Zorbax C8, byly shromážděny a naneseny na kolonu Superdex 75 60/60 v Ix PBS s hodnotou pH 7,4 s průtokem 10 ml/min. Pozitivní frakce (20 ml/zkumavka) byly shromážděny a spojeny. Spojené frakce byly potom podrobeny chromatografii s C4 reverzní fází v 0,1% TFA ve vodě při průtoku 3 ml/min. Val8-GLP-1-Fc byl eluován s gradientem od 5% B (0,1% TFA v acetonitrilu) do 100% B v průběhu 70 min. Eluované frakce (3 ml/zkumavka) byly shromážděny. Acetonitril byl odstraněn vakuovým sušením a byl přidán 1 ml Η2Ο. Vyčištěný vzorek (přibližně 32 ml) byl dvakrát dialyzován 4 litry lx PBS pH 7,4.
Dialyzovaný vzorek byl poté filtrován za použití filtrační jednotky MILLEX-GV 0,22 pm a koncentrace byla stanovena za použití absorpce při 280 nm.
Příklad 3b Čištění Val8-GLP-1-HSA nebo Val8-GLP-1-Linker-HSA
Přibližně 6,5 litrů u stálého média (stupeň exprese fúzovaných proteinů přibližně 10 pg/ml) bylo filtrováno za použití filtračního systému CUNO a koncentrováno na 380 ml za použití filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem pomocí 10 K filtrační membrány.
-37CZ 306180 B6
Fúzní protein byl zachycen za použití 50 ml Q kolony s rychlým tokem (Pharmacia) v 20 mmol Tris s hodnotou pH 7,4 při průtoku 5 ml/min. Protein byl eluován s tímto gradientem: od 0% do 50% 20 mmol Tris s hodnotou pH 7,4, 1 mol NaCl v 10 CV, potom na 100% B v 2 CV.
Frakce obsahující fúzní protein byly spojeny a podrobeny C4 chromatografií s reverzní fází v 0,1% TFA ve vodě při průtoku 5 ml/min. Fúzní protein byl eluován s gradientem od 20% B (0,1% TFA v acetonitrilu) do 90% B v průběhu 120 min. Frakce (3,5 ml/zkumavka) byly shromážděny. Acetonitril byl odstraněn vakuovým sušením.
Přibližně 9 ml shromážděného vzorku bylo zředěno pomocí Ix PBS s hodnotou pH 7,4 na 40 ml a dialyzováno s 4 litry lx PBS pH 7,4 přes noc. Vzorek byl filtrován a koncentrace byla stanovena za použití absorpce při 280 nm.
Příklad 3c Čištění Exendinu—4-Fc:
Přibližně 4 litry u stálého média (stupeň exprese fúzních proteinů přibližně 8 pg/ml) bylo filtrováno za použití filtračního systému CUNO a koncentrováno na 250 ml za použití filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem pomocí 30 K filtrační membrány.
Exendin-4-Fc byl zachycen 5 ml kolony HiTrap proteinu A v lx PBS o pH 7,4 při průtoku 2 ml/min a eluován v 50 mmol kyseliny citrónové s hodnotou pH 3,3. Frakce obsahující fúzní protein byly shromážděny, filtrovány a dialyzovány s 4 litry Ix PBS přes noc. Dialyzovaný vzorek byl potom nanesen na kolonu Superdex 75 60/60 v Ix PBS s hodnotou pH 7,4, 0,5 mol NaCl při průtoku 10 ml/min. Frakce (20 ml/zkumavka) obsahující fúzní protein byly shromážděny, spojeny a koncentrovány na přibližně 1 mg/ml. Koncentrované vzorky byly potom filtrovány za použití 0,22 pm filtrační jednotky MILLEX-GV.
Příklad 3d Čištění Exendin-4-HSA a Exendin-4-linker-HSA:
Přibližně 1,1 litru u stálého média (stupeň exprese fúzních proteinů přibližně 6 μg/ml) bylo filtrováno za použití filtračního systému CUNO a koncentrováno na 175 ml za použití filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem pomoci 30 K filtrační membrány.
Fúzní protein byl zachycen s použitím 5 ml kolony HiTrap-sepharose (Pharmacia) v 20 mmol Tris s hodnotou pH 7,4 při průtoku 2 ml/min. Protein byl eluován s gradientem od 0% do 50% 20 mmol Tris s hodnotou pH 7,4, 1 mol NaCl v 12 CV a potom na 100% B v 4 CV.
Frakce obsahující fúzní protein byly spojeny a podrobeny C4 chromatografií s reverzní fází v 0,1% TFA ve vodě při průtoku 5 ml/min. Fúzní protein byl eluován s gradientem od 10% B (0,1% TFA v acetonitrilu) do 100% B v průběhu 70 min. Frakce (10 ml/zkumavka) obsahující fúzní protein byly shromážděny. Acetonitril byl odstraněn za použití vakuové sušičky.
Přibližně 8 ml spojených vzorků bylo dialyzováno s 4 litry lx PBS pH 7,4 přes noc. Vzorek byl filtrován a koncentrace byla stanovena za použití absorpce při 280 nm. Dialyzovaný vzorek byl potom nanesen na kolonu Superdex 200 26/60 v Ix PBS s hodnotou pH 7,4, 0,5 M NaCl při průtoku 2 ml/min. Frakce (3 ml/zkumavka) obsahující fúzní protein byly shromážděny, spojeny, koncentrovány a filtrovány.
-38CZ 306180 B6
Příklad 4: Charakterizace fúzních proteinů metodou elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (SDS PAGE):
Pro analýzu čištěného fúzního proteinu a kondicionovaného média z buněk transfektovaných různými expresními vektory fúzních proteinů bylo použito SDS-PAGE s následným imunoblotingem. SDS-PAGE byl proveden v systému Novex Powerease 500 s použitím Novex 16% Trisglycinových předem vyrobených gelů (EC6498), provozního pufru (10 x, LC2675) a vzorkového pufru (L 2676). Vzorky byly redukovány s 50 mmol DTT a zahřívány 3 až 5 min při 95°C před naplněním.
Po použití SDS-PAGE gelu byla použita voda a transferový pufr (IX Tris-Glycin Seprabuff (Owl Scientific kat. č. ER26-S) s 20% methanolem) pro vymytí SDS z gelů. Bylo použito transferové zařízení Novex s PVDF (BioRad, Cat. No. 162-0174) a nitrocelulózové membrány (BioRad, kat. č. 1703965 nebo 1703932). Transfer byl proveden při pokojové teplotě po dobu 90 min při 30-35 V. Membrány byly uzavřeny v IX PBS s 0,1% Tween-20 (Sigma, Cat. No. P7949) a 5% mléce (BioRad, Cat. No. 170-6404) po dobu 1 až 12 hodin při 4 °C. Protilátky byly zředěny v IX PBS +5% mléka a bloty byly inkubovány v těchto roztocích po dobu 1 až 2 h při 4 °C. Mezi inkubacemi byly bloty promyty čtyřikrát po dobu 5 min, pokaždé s IX PBS a 0,2% Tween-20 při pokojové teplotě. PBS byl vyroben z buď z GIBCO 10X PBS (kat. č. 70011), aby vznikla konečná směs 1 mmol hydrogenfosforečnanu draselného, 3 mmol dihydrogenfosforečnanu sodného, 153 mmol chloridu sodného s hodnotou pH 7,4, nebo s PBS získaným od Sigma (kat. č. 10003), což poskytlo 120 mmol NaCl, 2,7 mmol KC1 a 10 mmol fosforečnanu s hodnotou pH 7,4 při 25 °C.
Primární protilátky byly buď polyklonální kozí anti-IgGl, nebo králičí anti-HSA. Sekundární protilátky byly buď anti-kozí IgG HRP, nebo anti—králičí TgG HRP. Sekundární protilátka byla zředěna 1:5000. Pro vyvíjení blotů by použit ECL systém (Amersham Pharmacia Biotech, kat. č. RN2108 a kat. č. RPN1674H).
Obr. 3A porovnává čištěný Fc protein s ustáleným médiem z pJB02-Val8-GLP-l-Fc a pJB02Exendin-4-Fc transfektovaných buněk. Snížení mobility odpovídá zvýšené velikosti způsobené GLP-1 částí fúzního proteinu. Obr. 3B podobně porovnává čištěný HSA s ustáleným médiem z buněk transfektovaných pJB02-Val8-GLP-l-HSA, pJB02-Val8-GLP-l-Linker-HSA, pJB02Exendin-4-HSA, nebo pJB02-Exendin-4-Linker-HSA. Obr. 4 ukazuje přípravu čištěných fúzních proteinů.
Příklad 5: Charakterizace fúzních proteinů s použitím hmotnostní spektrometrie:
Všechny pokusy byly prováděny na hmotnostním spektrometru Micromass TofSpec 2E vybaveném elektronikou pro vyrovnání časové prodlevy, reflektronem (použitém při analýze 0-8000 Da peptidového rozpětí), lineárním detektorem (použitém během analýzy při vysoké hmotnosti a dobrém signálu) a postakceleračním detektorem (neboli P.A.D., použitém při analýze při vysoké hmotnosti a mimořádně slabém signálu). Délka efektivní cesty zařízení v lineárním režimu je 1,2 metru, v reflektronovém režimu je 2,3 metru. Pro detekci v lineárním a reflektronovém režimu byly použity dva duální mikrokanálové deskové detektory. Byl použit dusíkový laser firmy Laser Science Inc. VSL-3371 pracující na 337 nm při 5 laserových záblescích za sekundu. Všechna data byla získána za použití 2GHz 8bitového interního digitalizačního zařízení a najedno spektrum bylo zprůměrováno přes 50 laserových záblesků.
Zařízení pracovalo v lineárním režimu pro analýzu GLP-1 fúzních proteinů, o které se jedná. Lineární detektor je zařízení detekující ionty, které putují světelnou trubicí zařízení MALDIToF—MS. Měří četnost iontů v čase a posílá signál do digitalizačního zařízení ke konverzi. Digitalizační zařízení je analogově/digitální převodník, který umožňuje přenos signálu z hmotnostního spektrometru do počítače, kde je převeden do použitelného m/z spektra.
-39CZ 306180 B6
Jako ionizační matrice byl použit rekrystalizovaný nasycený roztok kyseliny sinapové (zředěné v 50/50 Acn / H2O a 0,1% TFA). Kyselina sinapová je vhodnou matrici pro proteiny nad 10 kDa. Aby bylo dosaženo přesného změření hmotnosti analyzovaných vzorků, byly pro vnější a vnitřní kalibrační soubory použity referenční proteiny s vhodnou hmotností. Všechny vzorky byly analyzovány za použití vzorku o zředění 1:2 vůči matrici. Zařízení bylo nejprve nastaveno na následující podmínky pro lineární detektor:
Napětí zdroje: 2 0,0 keV Extrakční napětí: 2 0,0 keV Fokusové napětí: 16,0 keV Lineární detektor: 3,7 keV
P.A.D.: (mimo provoz)
Napětí pulsů: 3,0 keV
Hrubý laser: 50
Jemný laser: 50
Tato nastavení byla upravována (dle potřeby) tak, aby bylo dosaženo nej lepšího poměru signál/šum a nejvyššího rozlišení. Tabulka 3 poskytuje vlastnosti různých GLP-1 fúzních proteinů.
Tabulka 3
Fúzní protein Očekávaná hmotnost (kDa) Hmotnost stanovená hmotnostní spektrometrií (kDa)
Val8-GLP-l-IgGl 59,08 61,94
Val8-Glu22-GLP-l-IgGl 59,23 63,61
Gly8-GLP-l-IgGl 59, 00 62,93
Val8-GLP-l-CEx-IgGl 60,45 65,1-65,6
Val8-Glu22-GLP-l-CEx-IgGl 60, 69 65,86
Exendin-4-IgGl 60, 69 65,86
Val8-GLP-1-Linker-HSA 70,70 69,89, 70,74
Exendin-4-HSA 70,56 70, 62
Exendin-4-Línker-HSA 71,56 71, 62
CEx znamená C-koncové prodloužení a představuje sekvenci Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-ProSer.
Linkerem je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.
Příklad 6: Aktivita heterologních fúzních proteinů:
Schopnost fúzních proteinů podle vynálezu aktivovat GLP-1 receptor byla posouzena za použití in vitro testů, jaké jsou popsány v EP 619 322 Gelfand a kol. a v patentu US 5 120 712. Aktivita těchto sloučenin vůči aktivitě Val8-GLP-1(7-37)OH je uvedena v tabulce 4. Obr. 8 představuje křivku odezvy in vitro na dávky na fúzní proteiny Val8-GLP-1 a Exendin-4. Dále tabulky 5a a 5b ukazují in vitro aktivitu velké skupiny GLP-1 analogů, které mohou být fúzovány na Fc nebo albuminový protein za účelem výroby biologicky aktivních fúzních proteinů. Tato aktivita se porovnává s GLP-1 (7-37)OH.
-40CZ 306180 B6
Tabulka 4: In vitro aktivita GLP-1 fúzních proteinů
Fúzní protein Aktivita in vitro (% Val8-GLP-1)
Vals-GLP-l-IgGl 1
Exendin-4-IgGl 240
Val8-GLP-1-Linker-HSA 0,2
Exendin-4-HSA 20
Exendin-4-Linker-HSA 90
Exendin-4 500
Val8-Glu22-GLP-l-IgGl 3,7
Gly -GLP-l-IgGl 3,3
Val8-GLP-l-CEx-IgGl 3, 3
Val8-Glu22-GLP-l-CEx-IgGl 29
Gly8- Glu22-GLP-l-C2-IgGl 75
Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl 150
Exendin-4-C2-IgGl 250
Exendin-4-Linker-IgGl 330
Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-HSA 4
Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgG4 80
CEx znamená C-koncové prodlouženi a představuje sekvenci Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-ProSer.
Linkerem je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser— Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.
C2 je Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Gly-Ala.
Aminokyselinové sekvence fúzních proteinů, které jsou popsány v tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny od SEQ ID NO: 13 po SEQ ID NO: 31.
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-albuminu lidského séra je uvedena pod SEQ ID NO: 13.
-41 CZ 306180 B6
HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GDAHKSEVAH RFKDLGEENF KALVLIAFAQ 61 YLQQCPFEDH VKLVNEVTEF AKTCVADESA ENCDKSLHTL FGDKLCTVAT LRETYGEMAD
121 CCAKQEPERN ECFLQHKDDN PNLPRLVRPE VDVMCTAFHD NEETFLKKYL YEIARRHPYF 181 YAPELLFFAK RYKAAFTECC QAADKAACLL PKLDELRDEG KASSAKQRLK CASLQKFGER 241 AFKAWAVARL SQRFPKAEFA EVSKLVTDLT KVHTECCHGD LLECADDRAD LAKYICENQD 301 SISSKLKECC EKPLLEKSHC IAEVENDEMP ADLPSLAADF VESKDVCKNY AEAKDVFLGM 361 FLYEYARRHP DYSVVLLLRL AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAKVFDEFKP LVEEPQNLIK 421 QNCELFEQLG EYKFQNALLV RYTKKVPQVS TPTLVEVSRN LGKVGSKCCK HPEAKRMPCA 481 EDYLSVVLNQ LCVLHEKTPV SDRVTKCCTE SLVNRRPCFS ALEVDETYVP KEFNAETFTF 541 HADICTLSEK ERQIKKQTAL VELVKHKPKA TKEQLKAVMD DFAAFVEKCC KADDKETCFA 601 EEGKKLVAAS QAALGL [SEQ ID NO: 13]
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-Linker-albumin lidského séra je uvedena pod SEQ ID NO: 14.
HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSDAHK SEVAHRFKDL
GEENFKALVL IAFAQYLQQC PFEDHVKLVN EVTEFAKTCV ADESAENCDK SLHTLFGDKL
121 CTVATLRETY GEMADCCAKQ EPERNECFLQ HKDDNPNLPR LVRPEVDVMC TAFHDNEETF
181 LKKYLYEIAR RHPYFYAPEL LFFAKRYKAA FTECCQAADK AACLLPKLDE LRDEGKASSA
241 KQRLKCASLQ KFGERAFKAW AVARLSQRFP KAEFAEVSKL VTDLTKVHTE CCHGDLLECA
301 DDRADLAKYI CENQDSISSK LKECCEKPLL EKSHCIAEVE NDEMPADLPS LAADFVESKD
361 VCKNYAEAKD VFLGMFLYEY ARRHPDYSVV LLLRLAKTYE TTLEKCCAAA DPHECYAKVF
421 DEFKPLVEEP QNLIKQNCEL FEQLGEYKFQ NALLVRYTKK VPQVSTPTLV EVSRNLGKVG
481 SKCCKHPEAK RMPCAEDYLS WLNQLCVLH EKTPVSDRVT KCCTESLVNR RPCFSALEVD 541 ETYVPKEFNA ETFTFHADIC TLSEKERQIK KQTALVELVK HKPKATKEQL KAVMDDFAAF 601 VEKCCKADDK ETCFAEEGKK LVAASQAALG L [SEQ ID NO: 14]
Aminokyselinová sekvence Gly8—Glu22—GLP—1—CEx—Linker—albumin lidského séra je uvedena pod SEQ ID NO: 15.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSDAHKS
EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA DESAENCDKS
121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLQH KDDNPNLPRL VRPEVDVMCT
181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA ACLLPKLDEL
241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC
301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL
361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSVVL LLRLAKTYET TLEKCCAAAD
421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NL1KQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE
481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR
541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK
601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO: 15]
-42CZ 306180 B6
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-albumin lidského séra je uvedena pod SEQ ID NO: 16.
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSD AHKSEVAHRF KDLGEENFKA
LVLIAFAQYL QQCPFEDHVK LVNEVTEFAK TCVADESAEN CDKSLHTLFG DKLCTVATLR
121 ETYGEMADCC AKQEPERNEC FLQHKDDNPN LPRLVRPEVD VMCTAFHDNE ETFLKKYLYE
181 IARRHPYFYA PELLFFAKRY KAAFTECCQA ADKAACLLPK LDELRDEGKA SSAKQRLKCA
241 SLQKFGERAF KAWAVARLSQ RFPKAEFAEV SKLVTDLTKV HTECCHGDLL ECADDRADLA
301 KYICENQDSI SSKLKECCEK PLLEKSHCIA EVENDEMPAD LPSLAADFVE SKDVCKNYAE
361 AKDVFLGMFL YEYARRHPDY SVVLLLRLAK TYETTLEKCC AAADPHECYA KVFDEFKPLV
421 EEPQNLIKQN CELFEQLGEY KFQNALLVRY TKKVPQVSTP TLVEVSRNLG KVGSKCCKHP
481 EAKRMPCAED YLSVVLNQLC VLHEKTPVSD RVTKCCTESL VNRRPCFSAL EVDETYVPKE
541 FNAETFTFHA DICTLSEKER QIKKQTALVE LVKHKPKATK EQLKAVMDDF AAFVEKCCKA
601 DDKETCFAEE GKKLVAASQA ALGL [SEQ ID NO: 16]
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-Linker-albumin lidského séra je uvedena pod SEQ ID NO: 17.
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSDAHKS 61 EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA DESAENCDKS
121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLQH KDDNPNLPRL VRPEVDVMCT 181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA ACLLPKLDEL 241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC 301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL 361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSVVL LLRLAKTYET TLEKCCAAAD 421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE 481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR 541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK 601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO: 17]
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-Cex-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 18
HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF 61 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV 181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 18]
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-Cex-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 19.
HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR
-43 CZ 306180 B6
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 19]
Aminokyselinová sekvence Val8-Glu22-GLP-l-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO:20.
HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF 61 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV 181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 20]
Aminokyselinová sekvence Val8-Glu22-GLP-l-CEx-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 21.
HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 21]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-C2-lgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 22.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL 61 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 22]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 23.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 23]
Aminokyselinová sekvence Gly8—Glu22—GLP—1—CEx—Linker—IgG4 je uvedena pod SEQ ID NO: 24.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAESKYG 61 PPCPSCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE
121 VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP 181 REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS 241 FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK [SEQ ID NO: 24]
-44CZ 306180 B6
Aminokyselinová sekvence Gly1 * * * * * * 8-Glu22-GLP-l-CEx-2Linker-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 25.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG
GGGSGGGGSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD
121 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN
181 KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
241 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 301 GK [SEQ ID NO: 25]
Aminokyselinová sekvence Gly8--Glu22-GLP-l-2Linker-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 26.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG
SAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV
121 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE
181 KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
241 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
[SEQ ID NO: 26]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-2CEx-IgGI je uvedena pod SEQ ID NO: 27.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSS SGAPPPSAEP KSCDKTHTCP
PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA
121 KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
181 VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY
241 SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 27]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-l-CEx-Linker-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 28.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAVK EFIAWLIKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 28]
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-IgG 1 je uvedena pod SEQ ID NO: 29.
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
121 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 29]
-45 CZ 306180 B6
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-C2-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 30.
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 30]
Aminokyselinová sekvence ExendinM-Linker-IgG 1 je uvedena pod SEQ ID NO: 31.
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 31]
Tabulka 5a: Aktivita GLP-1 analogů in vitro
GLP-1 sloučenina
GLP-1(7-37)OH
Val8-GLP-1(7-37)OH
Gly8-Hisn-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Alan-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Lys11-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Tyr12-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Glu16-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Ala16-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Tyrl6-GLP-l(7-37)OH
Val8-Lys20-GLP-l (7-37) OH
Gln22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Ala22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Ser22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Asp22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Lys22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Pro22-GLP-1 (7-37)OH
Val8-His22-GLP-1 (7-37) OH
Val8-Lys22-GLP-1 (7-36)NH2
Val8-Glu22-GLP-1 (7-36) NH2
Aktivace GLP-1 recept©ru
1,0
0,47 (n = 6)
0,282
0,021
0,001
0,81
0, 047
0,112
1,175
0,33
0,42
0,56
0,50
0,40
1,29
0,58
0,01
0,14
0,53
1,0
-46CZ 306180 B6
Gly8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,07
Val8-Lys23-GLP-1 (7-37) OH 0,18
Val8-His24-GLP-1 (7-37) OH 0,007
Val8-Lys24-GLP-1 (7-37) OH 0,02
Val8-HiS26-GLP-l (7-37) OH 1,6
Val8-Glu26-GLP-1 (7-37) OH 1,5
Val8-His27-GLP-1 (7-37) OH 0,37
Val8-Ala27-GLP-1 (7-37) OH 0,47
Gly8-Glu30-GLP-l (7-37) OH 0,29
Val8-Glu30-GLP-l (7-37) OH 0,29
Val8-Asp30-GLP-l (7-37) OH 0,15
Val8-Ser30-GLP-l (7-37) OH 0,19
Val8-His30-GLP-l (7-37) OH 0,19
Val8-Glu33-GLP-1 (7-37) OH 0,039
Val8-Ala33-GLP-1 (7-37) OH 0,1
Val8-Gly33-GLP-1 (7-37) OH 0,01
Val8-Glu34-GLP-1 (7-37) OH 0,17
Val8-Pro35-GLP-1 (7-37) OH 0,094
Vai8 -HiS35-GLP-l (7-3' 1) OH 0,41
Val8-Glu35-GLP-1 (7-37) OH 0, 15
Val8-Glu36-GLP-1 (7-37) OH 0,11
Val8-HiS36-GLP-l (7-37) OH 0,22
Val8-His37-GLP-1 (7-37) OH 0,33
Val8-Leu16-Glu26-GLP-1 (7-37) OH 0,23
Val8-Lys22-Glu30-GLP-l (7-37) OH 0,37
Val8-Lys22-Glu23-GLP-1 (7-37) OH 0,35
Val8-Glu22-Ala27-GLP-1 (7-37) OH 1,02
Val8-Glu22-Lys23-GLP-1 (7-37) OH 1,43
Val8-Lys33-Val34-GLP-1 (7-37) OH 0,08
Val8-Lys33-Asn34-GLP-1 (7-37) OH 0,09
Val8-Gly34-Lys35-GLP-1 (7-37) OH 0,34
Val8-Gly36-Pro37-GLP-1 (7-37 ') nh2 0,53
-47CZ 306180 B6
Tabulka 5b: Aktivita GLP-1 analogů in vitro
Sloučenina GLP-1 Aktivace GLP-1 receptoru
GLP-1(7-37)OH 1.0
VaV-GLP-l (7-37)OH 0.47
Glya-GLP-1(7-37)OH 0.80
VaP-TyriJ-GLP-1 (7-37) OH 0.80
VaP-Tyru-GLP-1 (7-36)NH2 0.52
Valb-Trp“-GLP-1 (7-37) OH 0.52
Vai“-Leu^-GLP-1 (7-37) OH 0.52
VaP-Vali6-GLP-l (7-3 7) OH 0.52
VaP-Tyrlb-GLP-1 (7-37) OH 1.18
Gly-Glu^-GLP-1(7-37)OH 1.03
VaP-Leu^-GLP-1 (7-37)OH 0.24
Vai * - Tyr - Tyr16 -GLP-1(7 -3 7) OH 0.70
VaP-Trp^-Gltt2*-GLP-1 (7-37) OH 0.80
VaP - Tyr12-Glu^-GLP-1 (7-37) OH 1.27
ValB-Tyr1”-Phe^-GLP-1 (7-37) OH 1.32
'VaP-Tyr^-Glu^-GLP-l (7-37) OH 1.69, 1.79
VaP-Trp^-Glu24-GLP-1 (7-37) OH 2.30, 2.16
VaP-Leu^-Glu^-GLP-l (7-37) OH 2.02
VaP-Ile^-Glu^-GLP-l (7-37) OH 1.55
VaP-Pheu-Glt?2-GLP-1 (7-37) OH 1.08
VaP-Trp^-Glu^-GLP-1 (7-37) OH 1.50, 3.10
VaP-Tyru-Glu^-GLP-l (7-37)OH 2.40, 2.77
VaP-Phe1B-GlP2-GLP-l (7-37)OH 0.94
VaiB-Ilei8-Glu2J-GLP-l (7-37) OH 1.88
Val8-LysIa-Gl·u^-GL·P-l(7-37)OH 1.18
VaP-Trpitf-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1.50
Val^-Phe^-Glu^-GLP-l (7-37) OH 0.70
Vap-Phe^-Glu^-GLP-I (7-37)OH 1.27
-48CZ 306180 B6
Val“-Glu“-Leu2*-GLP-1 (7-37) OH 1.32
VaV-Glu^-Ile^-GLP-l (7-37)OH 1.46
ValB-Glu22-Val2b-GLP-l (7-37) OH 2.21, 1.36
Val^-Glu^-Tle^-GLP-l (7-37) OH 0.94
ValB-Glu^-Ala2'-GLP-l(7-37)OH 1.03
ValB-Glu“-Ile5i-GLP-l(7-37)OH 2.21, 1.79, 1.60
Vai8 - Asp3 -11 e11 - Tyr18 - G1 u22 GLP-1(7-37)OH 2.02
Vai8 -Tyrib - TrpiS - Glu2z -GLP -1 (7 37)OH 1.64
Valb-Trpu-Glu“-ValZb-Ile33- GLP-1(7-37JOH 2.35
vYP-Trp^Glu^-Ile^-GLP-l (7- 37) OH 1.93
Valb -Glu22 - Val2b -1 le33 -GLP -1 (7 37)OH 2.30, 2.73, 3.15
Var-Trp^-Glu^-Val^-GLP-l (737) OH 2.07
Vai8 - Cysib-Lys2b-GLP -1 (7 - 3 7) OH 1.97
Vai8 - Cys16 - Lys26 - Arg3* - GLP -1(7 37) OH 2.4,1.9
-49CZ 306180 B6
Tabulka 6: Aktivita analogů GLP/Exendinu
Peptidová sekvence In Vitro aktivita (% Vala“GLP1(7-37) OH)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2 6.21
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPP PS-NH2 6.75,3,25
HVEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIAWLVKGRG 2.86
HVEGTFTSDVSSYLEEEAVRLFIAWLVKGRG 1.47
HVEGTFTSDLS KQMEGQAAKEFIAWLVKGRG 0.11
HVEGTFTSDVSKQMEGQAAKEFIAWLVKGRG 0.04
HGEGTFTSDLS KQMEGQAAKEFIEWLKNGGP- NH2 1.44
HGEGTFTSDLSKQMEEEAAKEFIEWLKNGGP-NH2 2.80
HGEGTFTSDVSSYLEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2 5.40
HGEGTFTSDLSSYLEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2 5.07
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS -NH2 3.30
HAEGTFTSDVSKQLEEEAAKEFIAWLVKGRG 2.15
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLKNGGP-NH2 2.36
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIAWLVKGRG 3.25
HVEGTFTSDVSSYLEEEAAKEFIAWLVKGRG 1.00
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGRG 0.20
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 1.00
HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 2.12
Příklad 7: Farmakokinetika Val8-GLP-l-IgGl a Val8-GLP-1-HSA in vivo:
Farmakokinetická studie Val8-GLP-l-IgGl a Val8 GLP-l-HSA byla provedena u opic rodu cynomologus. Opicím bylo dávkováno 5,6 nmol/kg buďto čištěného Val8-GLP-l-IgGl/nebo 10 Val8-GLP-1-HSA. Sloučeniny byly podávány ve formě intravenózních bolusů. Před dávkováním a v časech 0,083, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 a 216 hodin po dávkování byla odebrána krev do zkumavek obsahujících EDTA. Koncentrace imunoreaktivního Val8GLP-1 v plazmě byla stanovena s použitím radioimunologických testů, které využívají polyklonální antisérum, které má primární specifitu pro region N-zakončení (7-16) Val8-GLP-l(7-37).
Obr. 9 zobrazuje koncentraci Val8-GLP-1-Fc a Val8-GLP-1-Linker-HSA v plazmě po podání jediné intravenózní dávky dvěma opicím rodu cynomologus. Fc fúzní proteiny měly poločas životnosti přibližně 45 hodin a albuminový fúzní protein měl poločas životnosti přibližně 87 hodin.
-50CZ 306180 B6
Příklad 8: Farmakodynamika Exendinu-4-IgG 1 in vivo:
Předmětem studie byli dva normální samci psů beagle s trvale zavedenou kanylou, poté, co přes noc hladověli. Byly otevřeny arteriální a venózní vaskulámí přístupové cesty a perkutánně do hlavové žíly byl zaveden a stabilizován katétr. Zvířata byla umístěna v klecích a jejich katétr byl napojen na otočný upevňovací systém. Katétrem hlavové žíly byl injekčně intravenózně (l,0nmol/kg) vstříknut roztok obsahující fúzní protein Exendin-4-IgG 1 (11,8 pM). Katétr byl pak vyčištěn 10 ml roztoku chloridu sodného. Po dvou hodinách byla aktivována hyperglykemická svorka (150 mg/dl) a pokračovalo se tři hodiny. Během této pětihodinové periody byly odebírány vzorky arteriální krve pro stanovení koncentrace fúzního proteinu, glukózy a inzulínu v plazmě.
Výsledky této studie byly porovnány s výsledky podobné dříve provedené studie, ve které každé zvíře obdrželo bolus roztoku chloridu sodného (subkutánně) a o tři hodiny později byla zvířata testována s použitím tříhodinové hyperglykemické svorky (150 mg/dl).
V obou uvedených studiích byla koncentrace glukózy v plazmě stanovena Beckmanovým glukózovým analyzátorem. Koncentrace inzulínu v plazmě byly stanoveny zaměstnanci firmy Lineo Research, lne., za použiti soupravy R1A vyvinuté v jejích laboratořích. Výsledky jsou znázorněny na obrázcích 10 a 11.
Příklad 9: Farmakokinetika Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl
Dvěma skupinám tří normálních samců psa beagle byla podána subkutánně (SC) nebo intravenózně (IV) dávka 0,1 mg/kg Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl. Koncentrace Gly8-Glu22GLP-l-CEx-Linker-IgGl v plazmě a imunoreaktivita byly stanoveny radioimunologickým testem ve vzorcích shromažďovaných 30 minut před dávkováním až 216 hodin po dávkování ve skupinách IV a SC. Tyto koncentrace byly poté použity pro stanovení zde uváděných farmakokinetických parametrů. Střední doba vyloučení poloviny dávky při intravenózním podávání Gly8Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl byla přibližně 55 hodin a celková doba vyloučení z těla bylo 1,5 ml/h/kg. Střední doba vyloučeni poloviny dávky při subkutánním podávání Gly8-Glu22GLP-l-CEx-Linker-IgGl byla přibližně 38 hodin.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Heterologní fúzní protein obsahující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina, schopná vázat se na GLP-1 receptor a indukovat signalizaci přes tento receptor, a druhý polypeptid je vybraný z
    a) lidského albuminu,
    b) analogů lidského albuminu, a
    c) fragmentů lidského albuminu, a kde C-zakončení prvního polypeptidu je fúzováno na N-zakončení druhého polypeptidu, přičemž fúzní protein je biologicky aktivní a má delší poločas životnosti v plazmě než samotná GLP-1 sloučenina.
  2. 2. Heterologní fúzní protein podle nároku 1, kde C—zakončení prvního polypeptidu je fúzováno na N—zakončení druhého polypeptidu přes peptidový linker.
    -51 CZ 306180 B6
  3. 3. Heterologní fúzní protein podle nároku 2, kde peptidový linker je vybraný z:
    a) peptidů bohatého na glycin,
    b) peptidu, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, kde n je 1,2, 3, 4, 5 nebo 6, a
    c) peptidu, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
  4. 4. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina obsahuje sekvenci vzorce 1 [SEQ ID NO: 2].
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617
    His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa
    18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728
    Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe
    29 30 31 32 33 34 35 36 37 3839
    Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    40 41 42 43 4445
    Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    Vzorec I (SEQ ID NO: 2) kde:
    Xaa na pozici 8 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 9 je Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 11 je Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, lie, Val, Glu, Asp neboLys;
    Xaa na pozici 14 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp neboLys;
    Xaa na pozici 16 je Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp neboLys;
    Xaa na pozici 17 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp neboLys;
    Xaa na pozici 18 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr neboLys;
    Xaa na pozici 19 je Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin nebo Lys;
    Xaa na pozici 20 je Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr nebo Lys;
    Xaa na pozici 21 je Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 22 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 23 je Gin, Asn, Arg, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 24 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 25 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 26 je Lys, Arg, Gin, Glu, Asp nebo His;
    Xaa na pozici 27 je Leu, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 30 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 31 je Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 32 je Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 33 je Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 34 je Asn, Lys, Arg, Glu, Asp nebo His;
    Xaa na pozici 35 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 36 je Gly, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His;
    Xaa na pozici 37 je Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
    Xaa na pozici 38 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His, neboje odstraněna;
    Xaa na pozici 39 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His, neboje odstraněna;
    Xaa na pozici 40je Gly, Asp, Glu nebo Lys, neboje odstraněna;
    -52CZ 306180 B6
    Xaa na pozici 41 je Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
    Xaa na pozici 42je Ser, Pro, Lys, Glu nebo Asp, neboje odstraněna;
    Xaa na pozici 43 je Ser, Pro, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
    Xaa na pozici 44 je Gly, Pro, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna;
    a Xaa na pozici 45 je Ala, Ser, Val, Glu, Asp nebo Lys, neboje odstraněna s podmínkou, že když je aminokyselina na pozici 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 nebo 44 odstraněna, potom jsou odstraněny i všechny aminokyseliny po této aminokyselině následující.
  5. 5. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoli z předchozích nároků, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 6 aminokyselin, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(737)OH, GLP-1 (7-36)OH nebo ExendinuM.
  6. 6. Heterologní fúzní protein podle nároku 5, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 5 aminokyselin, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
  7. 7. Heterologní fúzní protein podle nároku 6, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 4 aminokyseliny, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)0H, GLP-1 (7-36)OH nebo Exendinu-4.
  8. 8. Heterologní fúzní protein podle nároku 7, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 3 aminokyseliny, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
  9. 9. Heterologní fúzní protein podle nároku 8, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1 (7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
  10. 10. Použití heterologního fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 k výrobě prostředku pro léčbu pacientů, kteří mají diabetes mellitus nezávislý na inzulínu.
  11. 11. Použití heterologního fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 k výrobě prostředku pro léčbu pacientů, kteří jsou obézní.
CZ2003-1602A 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny CZ306180B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25195400P 2000-12-07 2000-12-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20031602A3 CZ20031602A3 (cs) 2006-04-12
CZ306180B6 true CZ306180B6 (cs) 2016-09-14

Family

ID=22954069

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003-1602A CZ306180B6 (cs) 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny
CZ2014-740A CZ308214B6 (cs) 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2014-740A CZ308214B6 (cs) 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny

Country Status (29)

Country Link
US (1) US7271149B2 (cs)
EP (2) EP1724284B1 (cs)
JP (2) JP2004528014A (cs)
KR (2) KR20080085082A (cs)
CN (2) CN1483041A (cs)
AT (2) ATE437891T1 (cs)
AU (2) AU2002226897B2 (cs)
BR (1) BR0116024A (cs)
CA (2) CA2716959A1 (cs)
CY (2) CY1108485T1 (cs)
CZ (2) CZ306180B6 (cs)
DE (2) DE60139430D1 (cs)
DK (2) DK1355942T3 (cs)
EA (1) EA005584B1 (cs)
EC (1) ECSP064643A (cs)
ES (2) ES2328510T3 (cs)
HR (1) HRP20030455A2 (cs)
HU (2) HU230603B1 (cs)
IL (3) IL155812A0 (cs)
MX (1) MXPA03005036A (cs)
NO (3) NO331273B1 (cs)
NZ (1) NZ525577A (cs)
PL (2) PL393178A1 (cs)
PT (2) PT1724284E (cs)
SI (2) SI1355942T1 (cs)
SK (2) SK288342B6 (cs)
UA (2) UA93662C2 (cs)
WO (1) WO2002046227A2 (cs)
ZA (1) ZA200303642B (cs)

Families Citing this family (343)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6444788B1 (en) 1999-03-15 2002-09-03 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1276756A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE424413T1 (de) * 2000-06-16 2009-03-15 Lilly Co Eli Analoge des glucagon-ähnlichen peptids-1
US7408041B2 (en) 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US20060057651A1 (en) 2000-12-08 2006-03-16 Bowdish Katherine S Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
WO2002059280A2 (en) 2000-12-08 2002-08-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chronic lymphocytic leukemia cell line and its use for producing an antibody
EP1351984A2 (en) * 2000-12-13 2003-10-15 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2002317599B2 (en) 2001-07-31 2008-04-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services GLP-1 exendin-4 peptide analogs and uses thereof
BR0212080A (pt) * 2001-08-23 2006-04-04 Lilly Co Eli composto de glp-1, método de estimulação de receptor de glp-1 em um indivìduo necessitando de tal estimulação, e, uso de um composto de glp-1
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
MXPA04003553A (es) * 2001-10-18 2004-07-22 Bristol Myers Squibb Co Mimeticos del peptido-1 similares aglucagon humano y su uso en tratamiento de diabetes y condiciones relacionadas.
US20080194481A1 (en) * 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
EP2277889B1 (en) 2001-12-21 2014-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and interferon beta
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
BR0306706A (pt) * 2002-01-08 2007-03-27 Lilly Co Eli peptìdeo glp-1 estendido, métodos de estimulação do receptor de glp-1 em um indivìduo necessitando de normalização de glicose sanguìnea, de tratamento de um indivìduo profilaticamente para diabetes independente de insulina, de redução ou de manutenção do peso corporal, de tratamento da obesidade, e de tratamento de doenças, em um indivìduo necessitando do mesmo, uso de um composto de glp-1, processo de preparação de uma formulação farmacêutica, e, formulação farmacêutica
US20030191056A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
AU2003239895C1 (en) * 2002-05-24 2010-01-07 Medtronic, Inc. Methods and DNA constructs for high yield production of polypeptides
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
EP1545608A4 (en) * 2002-06-28 2006-09-13 Centocor Inc CH1-DELETED MAMMED MUICETIC BODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND APPLICATIONS
CN1694895A (zh) * 2002-08-30 2005-11-09 比奥雷克西斯药物公司 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
EP1688148A1 (en) * 2002-12-03 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
WO2004050115A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
MXPA05006994A (es) 2002-12-27 2005-10-18 Diobex Inc Composiciones y metodos para la prevencion y el control de hipoglucemia inducida por insulina.
US7655618B2 (en) 2002-12-27 2010-02-02 Diobex, Inc. Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
CA2512676A1 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Niigata Tlo Corporation Vector for gene therapy and method of quantifying target protein in mammal or cultured cells with the administration of the vector for gene theraphy
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1591451A4 (en) * 2003-02-06 2009-09-02 Univ Keio peptide conjugate
WO2004093823A2 (en) * 2003-03-19 2004-11-04 Eli Lilly And Company Polyethelene glycol link glp-1 compounds
BRPI0408978B8 (pt) 2003-04-08 2021-07-27 Novo Nordisk As processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica
WO2004089985A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S Stable pharmaceutical compositions
EP1633384B1 (en) 2003-05-15 2012-03-14 Trustees Of Tufts College Stable analogs of glp-1
EP1641483B1 (en) * 2003-06-12 2008-02-13 Eli Lilly And Company Fusion proteins
EP2368909A1 (en) * 2003-06-12 2011-09-28 Eli Lilly and Company GLP-1 analog fusion proteins
WO2005027978A2 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
JP2007537981A (ja) 2003-09-19 2007-12-27 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規の血漿タンパク質親和性タグ
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) * 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
MXPA05007210A (es) * 2003-11-13 2006-02-10 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Complejo de proteina que usa un fragmento de inmunoglobulina y metodo para la preparacion del mismo.
US20090238838A1 (en) * 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
MXPA06005581A (es) 2003-11-20 2006-08-11 Novo Nordisk As Formulaciones de peptidos que contienen propilenglicol que son optimas para la produccion y uso en dispositivos de inyeccion.
ATE498404T1 (de) 2003-12-09 2011-03-15 Novo Nordisk As Regulierung der nahrungspräferenz mit glp-1- agonisten
CN1893980A (zh) * 2003-12-18 2007-01-10 诺沃挪第克公司 与白蛋白样物质相连的新glp-1类似物
US20060252693A1 (en) * 2004-01-29 2006-11-09 Wolfgang Glaesner Glucagon-like peptide-1 analogs
CN1980687B (zh) * 2004-02-09 2015-05-13 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
NZ548612A (en) * 2004-02-09 2009-11-27 Human Genome Sciences Inc Albumin fusion proteins comprising tandem GLP-1
CA2849552A1 (en) * 2004-02-11 2005-08-25 Amylin Pharmaceuticals, Llc Hybrid polypeptides with selectable properties
CA2555894A1 (en) 2004-02-11 2005-08-25 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Pancreatic polypeptide family motifs and polypeptides comprising the same
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
WO2005097175A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Centocor, Inc. Human glp-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
DK1759001T3 (da) 2004-04-21 2011-08-01 Enobia Pharma Inc Konjugat til tilførsel til knogler og fremgangsmåde til fremstilling deraf ved at målrette proteiner til knoglen
CA2565300A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins
EP2316446A1 (en) 2004-06-11 2011-05-04 Novo Nordisk A/S Counteracting drug-induced obesity using GLP-1 agonists
WO2006037810A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Novo Nordisk A/S Protracted glp-1 compounds
EP1799711B1 (en) 2004-10-07 2012-06-20 Novo Nordisk A/S Protracted exendin-4 compounds
AU2005311099B2 (en) * 2004-12-02 2012-02-02 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and GLP-1 or PYY
JP2008525477A (ja) * 2004-12-22 2008-07-17 セントカー・インコーポレーテツド Glp−1アゴニスト、組成物、方法および使用
DE602005015257D1 (cs) * 2004-12-22 2009-08-13 Lilly Co Eli
US20090286723A1 (en) * 2005-02-11 2009-11-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid Polypeptides with Selectable Properties
US20090016959A1 (en) * 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
JP5755398B2 (ja) * 2005-03-18 2015-07-29 ノヴォ ノルディスク アー/エス 伸長されたglp−1化合物
TWI362392B (en) 2005-03-18 2012-04-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
BRPI0520168A2 (pt) * 2005-03-28 2009-04-22 Centocor Inc mimeticorpos de glp-1 humanos, composiÇÕes, mÉtodos e usos
DK2650020T3 (en) * 2005-05-06 2017-01-16 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40 immunoglobulin fusion protein and methods for applications.
MX2007014052A (es) * 2005-05-13 2008-02-05 Lilly Co Eli Compuestos glp-1 pegilados.
WO2007012188A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Qinghua Wang GLP/1/EXENDM 4 IgG Fc FUSION CONSTRUCTS FOR TREATMENT OF DIABETES
CA2616551A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-15 Amprotein Corporation Chimeric therapeutic agents
EP1924293A4 (en) * 2005-08-06 2008-12-24 Qinghua Wang COMPOSITION AND METHOD FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF DIABETES TYPE I
KR101399178B1 (ko) * 2005-08-11 2014-06-18 아스트라제네카 파마수티컬스 엘피 선별가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드
EP2045265B1 (en) * 2005-09-22 2012-11-21 Biocompatibles Uk Ltd. GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) fusion polypeptides with increased peptidase resistance
EP1942115A4 (en) * 2005-10-26 2009-03-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd AGGLUTINABLE GLP-1 ANALOGUE AND PROLONGED RELEASE PHARMACEUTICAL COMPOSITION
EP1965823B1 (en) * 2005-11-04 2016-05-18 Glaxosmithkline LLC Methods for administering hypoglycemic agents
US8039432B2 (en) 2005-11-09 2011-10-18 Conjuchem, Llc Method of treatment of diabetes and/or obesity with reduced nausea side effect
CN1962695B (zh) * 2005-11-09 2011-08-31 浙江德清安平生物制药有限公司 类胰高血素肽-1融合蛋白及其制备和用途
US20080280328A1 (en) * 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬
JP5096363B2 (ja) 2005-12-16 2012-12-12 ネクター セラピューティックス Glp−1のポリマ複合体
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
JP2009525946A (ja) 2005-12-20 2009-07-16 デューク・ユニヴァーシティ 増強された薬理学的性質を有する活性物質を送達するための方法および組成物
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
EP1984403A2 (en) * 2006-01-12 2008-10-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to ox-2/cd200 and uses thereof
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US7553941B2 (en) * 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
CN101003574B (zh) * 2006-02-21 2010-12-15 大连帝恩生物工程有限公司 长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用
CA2648936C (en) 2006-04-20 2013-07-09 Amgen Inc. Glp-1 compounds
ATE444741T1 (de) 2006-05-10 2009-10-15 Biocompatibles Uk Ltd Glp-1 peptide enthaltende kugelförmige mikrokapseln, deren produktion und deren verwendung
BRPI0712559A2 (pt) 2006-05-26 2012-11-20 Amylin Pharmaceuticals Inc composiÇÕes e mÉtodos para o tratamento de insuficiÊncia cardÍaca congestiva
CA2654055A1 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EA200970131A1 (ru) * 2006-07-18 2009-08-28 Сентокор, Инк. Миметические антитела для glp-1 человека, композиции, способы и применения
ATE524493T1 (de) * 2006-07-24 2011-09-15 Biorexis Pharmaceutical Corp Exendin-fusionsproteine
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
MX2009001691A (es) * 2006-08-31 2009-02-25 Hoffmann La Roche Metodo para produccion del factor de crecimiento i tipo insulina.
MX2009002547A (es) * 2006-09-06 2009-06-19 Phasebio Pharmaceuticals Inc Composiciones terapeuticas de peptido de fusion.
PE20080840A1 (es) * 2006-09-13 2008-08-27 Smithkline Beecham Corp Metodos para administrar agentes hipoglucemiantes de larga duracion
TWI428346B (zh) * 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
US20090098130A1 (en) * 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
RU2432361C2 (ru) * 2007-01-05 2011-10-27 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Соединения агонисты рецептора глюкагоноподобного белка-1 (glp-1r)
AU2011254001B2 (en) * 2007-01-05 2012-08-02 Covx Technologies Ireland Limited Glucagon-like protein-1 receptor (GLP-1R) agonist compounds
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP1975176A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-01 Biocompatibles UK Limited Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CA2683610C (en) 2007-04-23 2013-01-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof
JP2009019027A (ja) * 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
BRPI0814645A2 (pt) 2007-07-25 2015-01-27 Alexion Pharma Inc Métodos e composições para tratar de doença autoimune.
ES2646614T3 (es) 2007-08-03 2017-12-14 Eli Lilly And Company Uso de un compuesto de FGF 21 y un compuesto de GLP 1 para el tratamiento de la obesidad
JP5476304B2 (ja) 2007-09-05 2014-04-23 ノボ・ノルデイスク・エー/エス グルカゴン様ペプチド−1誘導体及びそれらの医薬用途
EP2190460B1 (en) 2007-09-05 2014-12-17 Novo Nordisk A/S Peptides derivatized with a-b-c-d- and their therapeutical use
EP2190873B1 (en) * 2007-09-05 2015-07-22 Novo Nordisk A/S Truncated glp-1 derivatives and their therapeutical use
CN101868246A (zh) * 2007-09-21 2010-10-20 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
US20090181037A1 (en) * 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
KR20100132535A (ko) 2008-03-31 2010-12-17 글락소 그룹 리미티드 약물 융합체 및 컨주게이트
ES2375606T3 (es) * 2008-04-03 2012-03-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Ensayo de factor de crecimiento tipo insulina pegilado.
CN101328221B (zh) * 2008-04-14 2011-03-23 中国药科大学 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途
EP2307038A4 (en) 2008-06-27 2013-03-27 Univ Duke ELASTIC PEPTIDES COMPREHENSIVE THERAPEUTIC AGENTS
TWI388570B (zh) 2008-07-23 2013-03-11 Hanmi Science Co Ltd 包含具有三個官能端的非肽醯聚合物的多肽複合物
RU2526804C2 (ru) 2008-08-06 2014-08-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Конъюгированные белки с пролонгированным действием in vivo
US20100075897A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Jinan University Method for sustainedly releasing bioactive peptides and application thereof
EP2346906A4 (en) 2008-10-15 2013-04-24 Angiochem Inc CONJUGATES FROM GLP-1 AGONISTS AND THEIR USE
CA2745448C (en) 2008-12-05 2018-09-18 Carolyn Enever Methods for selecting protease resistant polypeptides
US9914754B2 (en) 2008-12-05 2018-03-13 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
HRP20170478T1 (hr) 2008-12-10 2017-05-19 Glaxosmithkline Llc Farmaceutski pripravci albiglutida
WO2010084173A1 (en) 2009-01-22 2010-07-29 Novo Nordisk Health Care Ag Stable growth hormone compounds
CN102317315A (zh) 2009-02-11 2012-01-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体和缀合物
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
CA2756853A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Christopher Herring Drug fusions and conjugates
ES2729261T3 (es) 2009-04-20 2019-10-31 Angiochem Inc Tratamiento del cáncer de ovario utilizando un agente anticancerígeno conjugado con un análogo de Angiopep-2
RU2012103240A (ru) 2009-07-02 2013-08-10 Ангиокем Инк. Мультимерные пептидные конъюгаты и их применение
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US12203113B2 (en) 2009-07-09 2025-01-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP2461831B1 (en) 2009-08-06 2018-11-21 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
KR101943420B1 (ko) 2009-08-14 2019-04-17 파세비오 파마수티컬스 인코포레이티드 변형된 혈관활성 장 펩티드
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN101993496B (zh) * 2009-08-20 2013-06-05 重庆富进生物医药有限公司 双重调节血糖血脂融合蛋白及其制法和用途
EP2483308A1 (en) 2009-09-30 2012-08-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates with extended half life
KR101229610B1 (ko) * 2009-10-09 2013-02-05 한남대학교 산학협력단 Glp-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물
WO2011050052A2 (en) 2009-10-20 2011-04-28 Georgia State University Research Foundation, Inc. Protein agent for diabetes treatment and beta cell imaging
CA2776241A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
CN102070717B (zh) * 2009-11-19 2013-04-10 东莞太力生物工程有限公司 融合蛋白及其制备方法、编码该蛋白的dna序列、表达载体、宿主细胞、含有该蛋白的药物组合物
NZ601034A (en) 2009-12-08 2013-07-26 Teva Pharma Bche albumin fusions for the treatment of cocaine abuse
EP2525834B1 (en) 2010-01-22 2019-07-17 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
MX338357B (es) 2010-01-22 2016-04-13 Novo Nordisk Healthcare Ag Compuestos estables de la hormona de crecimiento.
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
CN101875700B (zh) * 2010-04-09 2012-09-26 无锡和邦生物科技有限公司 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
CN102939304B (zh) 2010-04-09 2017-04-19 阿尔布麦狄克斯公司 白蛋白衍生物和变体
US9168288B2 (en) 2010-04-09 2015-10-27 Mount Sinai Hospital Methods for treating disorders of the gastrointestinal tract using a GLP-1 agonist
AU2011245980A1 (en) 2010-04-30 2012-11-08 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Peptide for improving in vivo stability of physiologically active substance or the like and physiologically active substance with improved in vivo stability
EP2566502A4 (en) 2010-05-04 2013-10-09 Glaxosmithkline Llc METHODS OF TREATING OR PREVENTING CARDIOVASCULAR DISORDERS AND PROVIDING CARDIOVASCULAR PROTECTION
WO2011153642A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Angiochem Inc. Leptin and leptin analog conjugates and fusion proteins and uses thereof
CN101891823B (zh) * 2010-06-11 2012-10-03 北京东方百泰生物科技有限公司 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白
US9234023B2 (en) * 2010-06-24 2016-01-12 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
AU2011274229A1 (en) 2010-07-02 2013-01-10 Angiochem Inc. Short and D-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof
CN102311501A (zh) * 2010-07-08 2012-01-11 天津药物研究院 含有glp-1或其类似物的融合蛋白、制备方法及其应用
CN101906158B (zh) * 2010-07-14 2013-10-23 中国药科大学 一种聚乙二醇化降糖多肽及其制法和用途
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN102532323B (zh) * 2010-12-09 2014-07-23 天津药物研究院 一种多肽复合物、药物组合物、其制备方法和应用
WO2012080471A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Novo Nordisk A/S Solid compositions comprising a glp-1 agonist and a salt of n-(8-(2-hydroxybenzoyl)amino)caprylic acid
CN102533655A (zh) * 2010-12-21 2012-07-04 青岛黄海制药有限责任公司 高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法
JP6055779B2 (ja) 2010-12-27 2016-12-27 アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド ナトリウム利尿ペプチドを含む組成物およびその使用方法
CN103415621A (zh) 2011-01-14 2013-11-27 雷德伍德生物科技股份有限公司 醛标记免疫球蛋白多肽及其使用方法
CN103402542B (zh) 2011-02-28 2017-05-03 独立行政法人国立循环器病研究中心 恶性肿瘤转移抑制用药物
CN103732628B (zh) 2011-03-03 2017-06-23 酵活有限公司 多价杂多聚体骨架设计和构建体
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
CA2832811A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Novo Nordisk A/S Double-acylated glp-1 derivatives
CA2873553C (en) 2011-06-06 2020-01-28 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
KR20140068861A (ko) * 2011-06-28 2014-06-09 인히브릭스 엘엘씨 Wap 도메인 융합 폴리펩티드 및 이의 이용 방법
KR20210032558A (ko) 2011-06-28 2021-03-24 인히브릭스, 인크. 세르핀 융합 폴리펩타이드 및 이의 이용 방법
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2726502A1 (en) 2011-07-01 2014-05-07 Bayer Intellectual Property GmbH Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
JP2014529293A (ja) 2011-07-08 2014-11-06 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングBayer Intellectual Property GmbH レラキシンを放出する融合タンパク質およびその使用
WO2013027680A1 (ja) 2011-08-19 2013-02-28 独立行政法人国立循環器病研究センター ナトリウム利尿ペプチド受容体gc-aアゴニスト及びgc-bアゴニストを組み合わせてなる悪性腫瘍の増悪防止用医薬
WO2013027823A1 (ja) * 2011-08-25 2013-02-28 三菱化学メディエンス株式会社 グルカゴン様ペプチド-1の測定方法及びそれに使用するキット
CN107266558A (zh) 2011-09-06 2017-10-20 诺沃—诺迪斯克有限公司 Glp‑1衍生物
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
HK1200842A1 (en) 2011-11-18 2015-08-14 Albumedix Ltd Proteins with improved half-life and other properties
JP2015500823A (ja) 2011-12-09 2015-01-08 ノヴォ ノルディスク アー/エス Glp−1アゴニスト
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
EP3683228A3 (en) 2012-01-26 2020-07-29 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
ES2664328T3 (es) 2012-03-16 2018-04-19 Albumedix A/S Variantes de albúmina
DK2827845T3 (en) 2012-03-22 2019-04-01 Novo Nordisk As COMPOSITIONS INCLUDING A PROCEDURE AND PREPARING THEREOF
DK2827885T3 (en) 2012-03-22 2018-10-08 Novo Nordisk As COMPOSITIONS OF GLP-1 PEPTIDES AND PREPARATION THEREOF
SG11201406671RA (en) 2012-04-19 2014-11-27 Opko Biolog Ltd Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
WO2013171570A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Glaxo Group Limited Polypeptide loaded poca nanoparticles for oral administration
JP6195911B2 (ja) 2012-05-17 2017-09-13 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドExtend Biosciences, Inc 向上した薬物送達のための担体
CN112142855A (zh) * 2012-05-18 2020-12-29 爱德迪安(北京)生物技术有限公司 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
CA2869786A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Alkermes, Inc. Fusion polypeptides comprising mucin-domain polypeptide linkers
EP2863895B1 (en) 2012-06-20 2021-04-14 Novo Nordisk A/S Tablet formulation comprising a peptide and a delivery agent
IN2015DN01115A (cs) 2012-07-13 2015-06-26 Zymeworks Inc
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
AR092862A1 (es) * 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR094821A1 (es) * 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
KR20150082422A (ko) 2012-11-08 2015-07-15 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 알부민 변이체
BR122020018510B1 (pt) 2012-11-20 2023-03-14 Opko Biologics Ltd Método para aumentar incrementalmente o tamanho hidrodinâmico de um fator de coagulação ativado viia
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
MX360317B (es) 2012-12-21 2018-10-29 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 funcionalizada.
EP2945703A4 (en) 2013-01-15 2016-08-31 Teva Pharma ALBU-BCHE FORMULATIONS, PREPARATION THEREOF AND USES THEREOF
US9580486B2 (en) * 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
CN105120887A (zh) 2013-04-05 2015-12-02 诺和诺德保健股份有限公司 生长激素化合物制剂
KR102272671B1 (ko) 2013-05-02 2021-07-06 노보 노르디스크 에이/에스 Glp-1 화합물의 경구 투여
US10093745B2 (en) 2013-05-29 2018-10-09 The Regents Of The University Of California Anti-CSPG4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
CN104277112B (zh) * 2013-07-04 2018-01-26 嘉和生物药业有限公司 长效降血糖融合蛋白
UY35686A (es) * 2013-07-31 2015-01-30 Amgen Inc Construcciones del factor de diferenciación de crecimiento 15 (gdf-15)
CN103408669B (zh) * 2013-08-01 2016-01-20 江苏泰康生物医药有限公司 Glp-1类似物融合蛋白,及其制备方法和用途
CN104371019B (zh) 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
HK1226084A1 (zh) * 2013-08-16 2017-09-22 Medimmune Limited 用於治疗糖尿病的gip和glp-1受体双重激动剂
AU2014331909B2 (en) 2013-10-10 2020-03-12 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. TM4SF1 binding proteins and methods of using same
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
CA2941958A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of the binding domain of a subunit of a multi-subunit structure for targeted delivery of pharmaceutically active entities to the multi-subunit structure
EP3080152A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
EP3080150B1 (en) 2013-12-13 2018-08-01 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
TW201609799A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 雙重glp-1/gip受體促效劑
WO2015086733A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3127923B1 (en) * 2014-03-31 2021-08-18 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重glp-1/昇糖素受體激動劑之艾塞那肽-4衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自exendin-4之雙重glp-1/升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽-4(Exendin-4)之肽類雙重GLP-1/升糖素受體促效劑
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
NO2776305T3 (cs) 2014-04-23 2018-01-27
CA2947982C (en) 2014-05-08 2022-11-29 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
CN104558198A (zh) * 2014-07-25 2015-04-29 成都贝爱特生物科技有限公司 GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途
CN104257696B (zh) * 2014-09-04 2017-08-25 西安国誉生物科技有限公司 一种降糖稳糖酵母菌粉及其制备方法和应用
PL3189072T3 (pl) 2014-09-05 2019-04-30 Univ Copenhagen Analogi peptydowe gip
WO2016055610A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Novo Nordisk A/S Stable glp-1 based glp-1/glucagon receptor co-agonists
CN104327187B (zh) * 2014-10-11 2018-06-08 上海兴迪金生物技术有限公司 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
JP6946182B2 (ja) 2014-10-22 2021-10-06 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドExtend Biosciences, Inc 治療用ビタミンdコンジュゲート
US20190119353A1 (en) * 2014-11-06 2019-04-25 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
MX389350B (es) 2014-12-05 2025-03-19 Alexion Pharma Inc Fosfatasas alcalinas recombinantes y usos de las mismas para el tratamiento de convulsiones.
EP3230311B1 (en) * 2014-12-08 2022-01-26 1Globe Biomedical Co., Ltd. Soluble universal adcc-enhancing synthetic fusion gene and peptide technology and its use thereof
WO2016118577A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
CA2973883A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
US10688156B2 (en) 2015-02-09 2020-06-23 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
JP6731953B2 (ja) 2015-02-11 2020-07-29 ジーエムエーエックス バイオファーム エルエルシー. Glp−1r抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤
CA2981517A1 (en) * 2015-04-01 2016-10-06 The Scripps Research Institute Methods and compositions related to gpcr agonist polypeptides
US10851144B2 (en) 2015-04-10 2020-12-01 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
CA2989400A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Angiochem Inc. Ang1005 for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis
WO2016203482A2 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重glp-1/升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽(exendin-4)衍生物
CA2993358A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
MX2018001825A (es) 2015-08-20 2018-05-07 Albumedix As Variantes y conjugados de albumina.
US10501546B2 (en) 2015-09-04 2019-12-10 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
CN105367664B (zh) * 2015-11-04 2019-09-20 成都贝爱特生物科技有限公司 激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备及其用途
CN114835795A (zh) * 2015-11-16 2022-08-02 Ubi蛋白公司 用于延长蛋白质半衰期的方法
AU2016358324B2 (en) 2015-11-24 2021-03-11 Transfert Plus, S.E.C. Peptide compounds and peptide conjugates for the treatment of cancer through receptor-mediated chemotherapy
EP3426286A4 (en) 2016-03-08 2019-12-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. PROCESS FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIA IN CHILDREN
WO2017173413A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
US10898549B2 (en) 2016-04-01 2021-01-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
CN109071634A (zh) 2016-04-26 2018-12-21 R.P.谢勒技术有限责任公司 抗体偶联物及其制备和使用方法
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
EP3481855B1 (en) 2016-07-11 2023-09-06 OPKO Biologics Ltd. Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same
CN106046176B (zh) * 2016-08-16 2019-09-10 中国药科大学 一种高活性长效降糖融合蛋白及其制备方法与医药用途
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
WO2018045872A1 (zh) * 2016-09-06 2018-03-15 中国药科大学 一种多肽及其用途
CN106279400A (zh) * 2016-09-06 2017-01-04 中国药科大学 P8降糖肽的设计及其用途
CN109200273B (zh) * 2017-07-04 2021-02-19 中国药科大学 一种多肽用于制备预防或治疗脂肪肝病药物的用途
CN110582301A (zh) * 2016-12-14 2019-12-17 利甘达尔股份有限公司 用于核酸和蛋白质有效负载递送的方法和组合物
CN106519016A (zh) * 2016-12-20 2017-03-22 中国药科大学 降糖调脂肽——Progly肽的设计及其用途
CN107033234B (zh) * 2017-01-03 2018-06-26 北京凯因科技股份有限公司 酰化的glp-1衍生物
JP2020505029A (ja) * 2017-01-25 2020-02-20 メディミューン,エルエルシー リラキシン融合ポリペプチドおよびその使用
KR20190129058A (ko) 2017-03-31 2019-11-19 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 성인 및 청소년에서 저포스파타제증 (hpp)을 치료하는 방법
CN108727486A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 长效神经生长因子、制备方法及其组合物
US20200157151A1 (en) 2017-05-24 2020-05-21 Transfert Plus, S.E.C. Peptide compounds, conjugate compounds and uses thereof for treating inflammatory diseases
CA3064510A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 University Of Copenhagen Long-acting gip peptide analogues
SG11202000940XA (en) 2017-08-24 2020-02-27 Novo Nordisk As Glp-1 compositions and uses thereof
WO2019067499A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. BIOMARKER SIGNATURE FOR PREDICTING A TUMOR RESPONSE TO ANTI-CD200 THERAPY
EA202090971A1 (ru) 2017-11-21 2020-08-07 Эли Лилли Энд Компани Способы применения и композиции, содержащие дулаглутид
CN116143939A (zh) * 2017-11-24 2023-05-23 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白
CN115109166B (zh) * 2017-11-24 2025-07-18 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
US11752173B2 (en) 2017-12-19 2023-09-12 Beijing Jiyuan Biological Technology Co., Ltd. FGF21 and GLP1 double gene-modified mesenchymal stem cell and use in treating a metabolic disease
CN113603794B (zh) * 2018-01-11 2024-01-16 安源医药科技(上海)有限公司 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
WO2019140021A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Eli Lilly And Company Combination therapy
CN110092835A (zh) * 2018-01-30 2019-08-06 上海惠盾生物技术有限公司 一种glp-1类似物-col3a1融合蛋白
RS64643B1 (sr) 2018-02-02 2023-10-31 Novo Nordisk As Čvrste kompozicije koje sadrže glp-1 agonist i so n-(8-(2-hidroksibenzoil)amino)kaprilne kiseline i lubrikant
EP3773684A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
EP3774862B1 (en) 2018-04-05 2022-06-08 Sun Pharmaceutical Industries Limited Novel glp-1 analogues
PE20201350A1 (es) 2018-04-09 2020-11-30 Amgen Inc Proteinas de fusion del factor de diferenciacion de crecimiento 15
WO2019200594A1 (zh) 2018-04-19 2019-10-24 杭州先为达生物科技有限公司 酰化的glp-1衍生物
WO2020033867A2 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurofibromatosis type 1 and related conditions with alkaline phosphatase
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
SG11202103990QA (en) 2018-10-22 2021-05-28 Janssen Pharmaceutica Nv Glucagon like peptide 1 (glp1)-growth differentiation factor 15 (gdf15) fusion proteins and uses thereof
CN112912099A (zh) * 2018-10-24 2021-06-04 夏尔-Nps医药品有限公司 Glp-2融合多肽和用于治疗和预防胃肠病症的用途
SG11202105586YA (en) 2018-12-03 2021-06-29 Antag Therapeutics Aps Modified gip peptide analogues
WO2020118843A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 四川利通科创生物医药科技有限公司 一种glp-1突变体及其制备方法和用途
BR112021011595A2 (pt) 2018-12-21 2021-11-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co Proteína biespecífica
CA3056663C (en) 2019-04-05 2022-10-18 Jeffrey S. RIESMEYER Use of dulaglutide in reducing risk of cardiovascular events in patients with type 2 diabetes mellitus
CN110151980B (zh) * 2019-06-30 2022-12-09 中国药科大学 Glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用
IL320038A (en) 2019-11-25 2025-06-01 Alkermes Inc Substituted macrocyclic compounds compositions comprising same and uses thereof
TWI878456B (zh) 2020-02-18 2025-04-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Glp-1組成物及其用途
JPWO2021167107A1 (cs) 2020-02-22 2021-08-26
CA3190396A1 (en) * 2020-08-24 2022-03-03 James M. Wilson Viral vectors encoding glp-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases in felines
US12122817B2 (en) * 2020-09-22 2024-10-22 Serpentide Inc. Long-lasting GLP1 analogue drug for type-2 diabetes
CN115925995A (zh) * 2020-09-30 2023-04-07 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物和使用方法
CN114685644A (zh) * 2020-12-29 2022-07-01 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种人glp-1多肽变体及其应用
WO2022173987A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
TW202305012A (zh) 2021-03-22 2023-02-01 日商肽夢想股份有限公司 c-Met 蛋白質結合肽複合物
IL307225A (en) 2021-03-22 2023-11-01 Peptiaid Inc A peptide and a preparation containing a peptide
AU2022241762A1 (en) 2021-03-24 2023-09-14 Mural Oncology, Inc. Upar antibodies and fusion proteins with the same
CN113150172B (zh) * 2021-04-28 2023-09-22 中国药科大学 Glp-1r/gipr双靶点激动剂融合蛋白及其制备方法与应用
JP2024523280A (ja) 2021-06-18 2024-06-28 ペプチドリーム株式会社 Ghr結合ペプチドおよびそれを含む組成物
JPWO2023022234A1 (cs) 2021-08-19 2023-02-23
US20240390508A1 (en) 2021-08-21 2024-11-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Human transferrin receptor binding peptide-drug conjugate
CA3229962A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Peptidream Inc. Human transferrin receptor-binding antibody-peptide conjugate
EP4410816A1 (en) 2021-09-30 2024-08-07 PeptiDream Inc. Peptide
CN113801853B (zh) * 2021-11-19 2022-03-15 山东兴瑞生物科技有限公司 Exendin-4融合基因修饰的MSC及其应用
EP4337244A4 (en) * 2022-03-25 2025-03-12 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions of polypeptide conjugates and methods of using them
AU2023246202A1 (en) 2022-03-30 2024-10-17 Peptidream Inc Peptide complex having trkb binding activity
KR20240163717A (ko) 2022-03-30 2024-11-19 베이징 큐엘 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 폴리펩티드 접합체의 액체 약학 조성물 및 그의 사용 방법
EP4541805A1 (en) 2022-06-15 2025-04-23 PeptiDream Inc. Peptide and peptide-containing agent
CN114774496B (zh) * 2022-06-21 2022-10-04 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法
CN120037358A (zh) 2022-06-23 2025-05-27 广州银诺医药集团股份有限公司 一种改进的glp-1受体激动剂的融合蛋白的联合疗法
AU2023353057A1 (en) 2022-09-30 2025-05-01 Extend Biosciences, Inc. Long-acting parathyroid hormone
WO2024123812A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Shattuck Labs, Inc. Fusion proteins for the treatment of cardiometabolic diseases
WO2024252336A1 (en) 2023-06-07 2024-12-12 Peptidream Inc. Peptide compositions targeting glypican-3 and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000069911A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5766883A (en) * 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
FR2650598B1 (fr) * 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ES2161883T3 (es) * 1994-04-22 2001-12-16 Corixa Corp Compuestos y metodos para la estimulacion y aumento de las respuestas inmunes protectoras y la produccion de il-2.
US5990077A (en) * 1995-04-14 1999-11-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 and its therapeutic use
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
AR008077A1 (es) * 1996-07-26 1999-12-09 Talarico Salinas Laura Beatriz Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector.
JP2001501593A (ja) 1996-08-08 2001-02-06 アミリン・ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド 胃腸運動を調節するための方法
DE69737479D1 (de) * 1996-08-30 2007-04-26 Novo Nordisk As Glp-1 derivate
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
US6190909B1 (en) * 1997-04-17 2001-02-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TH2-specific gene
EP0887061A1 (en) * 1997-06-28 1998-12-30 The Procter & Gamble Company Faecal collector
AU749914B2 (en) 1997-08-08 2002-07-04 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
EP1032587B2 (en) 1997-11-14 2013-03-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
NZ504258A (en) 1997-11-14 2002-12-20 Amylin Pharmaceuticals Inc Exendin 3 and 4 agonist compounds for the treatment of diabetes
ATE366115T1 (de) 1998-02-13 2007-07-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Inotropische und diuretische effekte von exendin und glp-1
WO1999043708A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
DE69942307D1 (de) * 1998-02-27 2010-06-10 Novo Nordisk As N-terminal veränderte glp-1 abkömmlinge
WO1999043341A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives with helix-content exceeding 25 %, forming partially structured micellar-like aggregates
EP1060191B1 (en) * 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S Derivatives of glp-1 analogs
DK1088084T3 (da) * 1998-06-15 2007-01-29 Gtc Biotherapeutics Inc Erythropoietin analog-humant serumalbumin fusionsprotein
AU775076B2 (en) * 1998-12-10 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6514500B1 (en) * 1999-10-15 2003-02-04 Conjuchem, Inc. Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!}
EP1276756A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2277889B1 (en) * 2001-12-21 2014-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and interferon beta

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000069911A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Knudsen LB et al. Potent derivatives of glucagon-like peptide-1 with pharmacokinetic properties suitable for once daily administration. J. Med. Chem., 2000, 43(9), 1664-9. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2689702A (en) 2002-06-18
KR100942864B1 (ko) 2010-02-17
EA005584B1 (ru) 2005-04-28
NO20032565L (no) 2003-08-01
HUP0302529A2 (hu) 2003-10-28
IL184429A (en) 2010-04-15
EP1724284A2 (en) 2006-11-22
JP2011006447A (ja) 2011-01-13
BR0116024A (pt) 2005-12-13
KR20040038901A (ko) 2004-05-08
IL155812A (en) 2009-09-22
ES2328510T3 (es) 2009-11-13
HUP1300326A2 (en) 2003-10-28
CA2434237C (en) 2012-05-15
HU230603B1 (hu) 2017-03-28
MXPA03005036A (es) 2003-09-05
AU2002226897B2 (en) 2007-10-25
KR20080085082A (ko) 2008-09-22
US20040053370A1 (en) 2004-03-18
UA81897C2 (uk) 2008-02-25
HK1061411A1 (en) 2004-09-17
US7271149B2 (en) 2007-09-18
NO20032565D0 (no) 2003-06-05
CY1109377T1 (el) 2014-07-02
EP1724284A3 (en) 2007-04-18
CZ308214B6 (cs) 2020-03-04
HRP20030455A2 (en) 2004-08-31
CN1483041A (zh) 2004-03-17
ATE406384T1 (de) 2008-09-15
NO20111369L (no) 2003-08-01
PT1724284E (pt) 2009-09-30
NO331273B1 (no) 2011-11-14
SK288342B6 (en) 2016-03-01
CZ2014740A3 (cs) 2006-04-12
ZA200303642B (en) 2004-08-12
CZ20031602A3 (cs) 2006-04-12
UA93662C2 (uk) 2011-03-10
ECSP064643A (es) 2009-07-25
SK288088B6 (sk) 2013-06-03
IL184429A0 (en) 2007-10-31
CA2716959A1 (en) 2002-06-13
CA2434237A1 (en) 2002-06-13
EP1355942B1 (en) 2008-08-27
PL209550B1 (pl) 2011-09-30
DK1724284T3 (da) 2009-11-02
ES2311560T3 (es) 2009-02-16
DE60139430D1 (de) 2009-09-10
PL393178A1 (pl) 2011-02-14
SI1355942T1 (sl) 2009-02-28
SK6702003A3 (en) 2004-08-03
JP2004528014A (ja) 2004-09-16
EA200300644A1 (ru) 2003-12-25
IL155812A0 (en) 2003-12-23
CY1108485T1 (el) 2014-04-09
CN101712722A (zh) 2010-05-26
HU229218B1 (en) 2013-09-30
DK1355942T3 (da) 2008-11-17
NZ525577A (en) 2005-05-27
SI1724284T1 (sl) 2009-12-31
DE60135581D1 (de) 2008-10-09
NO20101602L (no) 2003-08-01
PT1355942E (pt) 2008-11-21
ATE437891T1 (de) 2009-08-15
EP1724284B1 (en) 2009-07-29
WO2002046227A3 (en) 2003-04-24
NO332221B1 (no) 2012-07-30
PL366208A1 (en) 2005-01-24
WO2002046227A2 (en) 2002-06-13
HUP0302529A3 (en) 2009-03-30
EP1355942A2 (en) 2003-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7271149B2 (en) GLP-1 fusion proteins
US20070161087A1 (en) Glp-1 fusion proteins
AU2002226897A1 (en) GLP-1 fusion proteins
JP4629047B2 (ja) Glp−1アナログ複合タンパク質
EP1641483B1 (en) Fusion proteins
AU2007231863A1 (en) GLP-1 Fusion Proteins
HK1061411B (en) Glp-1 fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20211129