CN104327187B - 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白 - Google Patents

一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白及其制备方法和用途。本发明提供一种重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白,所述重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白包括两个结构功能区域,分别为重组GLP‑1片段和人免疫球蛋白的Fc片段,所述重组GLP‑1片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所提供的重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白,与原形GLP‑1分子同源性达到97%,且依然保持了优良的生物学活性和动物学活性。

Description

一种重组人GLP-1 -Fe融合蛋白

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种重组人GLP-I-Fc融合蛋白及其制备方 法和用途。

背景技术

[0002] 重组人胰高血糖素样肽-1类似物(GLP-I),该多肽由31个氨基酸组成,能够刺激胰 岛细胞产生胰岛素,从而达到控制血糖的目的。胰高血糖素样肽-I (GLP-I)可促进胰岛素释 放,降低血浆中的胰高血糖素水平,降低胃排空的速率,促进饱食感并刺激胰岛的生物合成 和辟田胞的增殖,可用于2型糖尿病的治疗。在我国2型糖尿病发病广泛,如果不及时加以治 疗,容易转变成1型糖尿病,给患者和国家造成很大负担,因此开发这类药物的需求极为迫 切。

[0003] 目前商品化的GLP-I药物有美国礼来公司的艾塞纳肽(百泌达)和丹麦诺和诺德公 司的利拉鲁肽(诺和力),两者都已经在我国获得进口注册。两种药物都具有降血糖和减轻 体重的作用,可广泛用于2型糖尿病的治疗。但是由于半衰期短,艾塞纳肽和利拉鲁肽都需 要每天多次给药治疗,才能达到控制血糖的目的。所以,为了增加体内半衰期,使GLP-I长效 化已经成为国内外研究的热点,目前研究的GLP-I及类似物长效化的方法主要有三种(1) PEG化长效,代表为Nove Nordisk公司(丹麦诺和诺德公司)研发的每周一次皮下注射的长 效GLP-I类似物索玛鲁肽;(2)白蛋白融合蛋白,代表为专利CN10665538A;⑶抗体的Fe片段 融合蛋白,代表为专利CN1802386B。

[0004] 此外,礼来公司的GLP-I-Fc (LY2189265)目前正在美国三期临床阶段。根据临床实 验的数据报道,LY2189265能够有效增加GLP-I的半衰期,使得原来的每天给药变成了每周 一次给药,提高了病人的依从性。在LY2189265中,为了延长GLP-I分子的半衰期,礼来公司 尝试把GLP-I与人的抗体Fe片段融合,GLP-I-Fc分子的半衰期明显增加,从原形的数分钟提 高到将近4天,每周给药一次即可达到治疗2型糖尿病的目的。礼来公司的专利CN1802386B, 对GLP-I分子(7-37)的三个氨基酸位点进行了突变,分别是第8位Ala改为Gly,第22位Gly改 为Glu,第36位Arg改为Gly,这样与改构后的分子与天然分子的同源性只有90%。由于2型糖 尿病患者需要长期用药,加上GLP-I-Fc具有半衰期延长的特点,使其在体内作用的时间也 较原形GLP-I分子大大延长,使用同源性低的GLP-I分子与抗体Fe片段融合,有可能会因抗 原改变而增加患者产生特异性抗体的风险。

发明内容

[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种重组人GLP-I-Fc融合 蛋白及其制备方法和用途,并进一步提供包含所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白的药物组合 物,用于解决现有技术中的问题。

[0006] 为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种重组人GLP-I-Fc融合 蛋白,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白包括两个结构功能区域,分别为重组GLP-I片段和人免 疫球蛋白的Fe片段,所述重组GLP-I片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0007] 优选的,所述重组GLP-I片段和人免疫球蛋白的Fe片段之间还包括连接肽。

[0008] 更优选的,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白从N端到C端依次包括重组GLP-I片段、连 接肽、人免疫球蛋白的Fe片段。

[0009] 更优选的,所述连接肽的氨基酸数量为多2个,所述连接肽由甘氨酸(Gly)和丝氨 酸(Ser)组合而成,采用以G4S (即氨基酸序列GGGGS)为单位的多单位连接实现。

[0010] 更优选的,所述连接肽的氨基酸数量为6-36个。

[0011] 更优选的,所述连接肽的氨基酸数量为21-31个。

[0012] 更优选的,所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3-8所示。

[0013] 进一步优选的,所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N〇:7所示。

[0014] 优选的,所述人免疫球蛋白的Fe片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性 Fc0

[0015] 进一步优选的,所述人免疫球蛋白的Fe片段的氨基酸序列如SEQ ID N〇:9所示。

[0016] 进一步优选的,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :10-15 所示。

[0017] 本发明第二方面提供一种多核苷酸,所述多核苷酸编码所述重组人GLP-I-Fc融合 蛋白。

[0018] 进一步优选的,所述多核苷酸的多核苷酸序列如SEQ ID No: 18-23所示。

[0019] 本发明第三方面提供含有所述的多核苷酸的表达载体。

[0020] 优选的,所述表达载体选自DHFR系统的表达载体和/或GS系统的表达载体。

[0021] 进一步优选的,DHFR系统的表达载体如pIRES-DHFR,GS系统的表达载体如 peel2·4〇

[0022] 本发明第四方面提供一种重组的宿主细胞,所述宿主细胞含有所述的表达载体、 或者染色体中整合有所述的多核苷酸。

[0023] 宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高 等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属,鼠伤寒沙门菌、李斯特 细菌;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf 9的昆虫细胞;CHO、C0S、293细胞、或Bowes黑 素瘤细胞的动物细胞等。

[0024] 优选的,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

[0025] 更优选的,所述宿主细胞选自CH0-DXB11,CH0-DG44,CHO-S,CH0-K1中的一种或多 种的组合。

[0026] 进一步优选的,所述宿主细胞为CH0-DXB11细胞。

[0027] 本发明第五方面提供所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白的制备方法,包括如下步骤:

[0028] 1)将重组人GLP-I-Fc融合蛋白的编码序列克隆至表达载体中;

[0029] 2)将表达载体转染宿主细胞,培养并筛选出阳性细胞簇;

[0030] 3)使用步骤2所得细胞表达、纯化后,即得所述融合蛋白。

[0031] 优选的,所述表达载体选自DHFR系统的表达载体和/或GS系统的表达载体,所述宿 主细胞选自CHO-DXB11,CH0-DG44,CHO-S,CH0-K1中的一种或多种的组合。

[0032] 进一步优选的,所述DHFR系统的表达载体如pIRES-DHFR,GS系统的表达载体如 peel2.4,所述宿主细胞为CH0-DXB11细胞。

[0033] 本发明第六方面提供所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白在制备或筛选治疗肿瘤的 药物或制剂中的用途。

[0034] 本发明第七方面提供一种药物组合物,含有所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白及至少 一种药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、增稠剂等,并可被制备成如片剂、胶囊、粉 末、糖浆、溶液或悬浮液等各种本领域的药剂类型。

[0035] 本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白,与原形GLP-I分子同源性达到97%,且 依然保持了优良的生物学活性和动物学活性。此外,本发明发明人通过构建对应的连接肽 和人免疫球蛋白的Fc序列,进一步优化了融合蛋白的生物学活性和动物学活性。本发明所 获得的重组人GLP-I-Fc融合蛋白与在我们宿主CHO细胞中表达LY2189265相同序列的蛋白 (Wolfgang Glaesner et al,Engineering and characterization of the Iong-actingglucagon-like peptide-1 analogue LY2189265,an Fcfusion protein,Diabetes Metab Res Rev 2010; 26 :287-296)对比,细胞学活性提高了3倍,动物学活性也有显著提 高,能有效控制小鼠的体重和血糖水平。

附图说明

[0036] 图1显示为本发明db/db小鼠体内药效学实验小鼠血糖浓度变化示意图;

[0037] 图2显示为本发明db/db小鼠体内药效学实验小鼠体重示意图。

具体实施方式

[0038] 本发明发明人在天然的GLP-I分子(7-37)上只对第8位进行了突变,将Ala改为 Gly,通过不同长度的柔性连接肽与修饰后的人IgG4的Fc片段融合,形成GLP-I分子与天然 分子的同源性为97%、且具有优良的细胞学活性和动物学活性的GLP-I-Fc融合蛋白,在此 基础上完成了本发明。

[0039] 本发明提供一种具有高细胞学活性和高动物学活性的重组人GLP-I-Fc融合蛋白, 所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白包括两个结构功能区域,分别为重组GLP-I片段和人免疫球 蛋白的Fc片段,所述重组GLP-I片段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0040] 本发明发明人在天然的GLP-I分子(7-37)上只对第8位进行了突变,将Ala改为 Gly。原形GLP-I的第一个氨基酸编号为7 (第7位),则第8位的氨基酸(实际对应为第二个氨 基酸)更改为Gly,具体序列如SEQ ID No: 1所示:

[0041] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG (SEQ ID No:l)

[0042] 在本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白中,重组GLP-I片段和人免疫球蛋白 的Fc片段之间还包括连接肽。优选的,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白从N端到C端依次包括 重组GLP-I片段、连接肽、人免疫球蛋白的Fc片段。

[0043] 在本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白中,连接肽可以是本领域的各种连接 肽,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。优选的,所述连接肽由甘氨酸(Gly)和丝氨 酸(Ser)组合而成,所述由甘氨酸(;Gly)和丝氨酸(Ser)组合的连接肽并非Gly和Ser的任意 组合,而是普遍采用以G4S(即氨基酸序列GGGGS)为单位的多单位连接实现,此类连接肽的 设计原则已经是本领域人员的公知技术。具体可参见CN 102875683 B,CN 102875683 B,申 请号201110193210.3等现有技术。连接肽的氨基酸数量为多2个,更优选的为6-36个,进一 步优选为21-31个。

[0044] 在本发明一优选实施例中,连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No: 3-8所示。

[0045] 在本发明一最优实施例中,连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N〇:7所示。

[0046] 在本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白中,人免疫球蛋白的Fc片段为本领域 的不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。由于与 GLP-I通过柔性连接肽相连的Fc片段来源于免疫球蛋白IgG的恒定区,它在消灭病原体的免 疫防御中起重要作用。在四种人IgG亚型中,IgGl和IgG2,IgG3,IgG4均可以与GLP-I或其变 构体通过柔性连接肽结合。Fc融合主要是为了增加它的体内循环半衰期和降低生产成本, 而Fc介导的“抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用”(antibody-dependent ce 11-mediated cytotoxicity,ADCC)功能是不必要的,甚至可能产生有害副作用。为了得到不具ADCC效应 子功能的非裂解性Fc,本发明发明人对人的IgG4的Fc片段(P01861_IGHG4)三个位点进行了 修饰,第一个修饰是Fc氨基酸序列按照EU编号系统的S228P,此修饰可以稳固链间二硫键的 结构从而达到稳定二聚体结构的作用;第二个修饰是EU编号系统的L235E,此修饰彻底消除 Fc片段Fe R的结合,从而将ADCC降到最低。第三个修饰是EU编号系统的L445P,这个修饰使 IgG4的Fc的C端氨基酸序列与IgGl和IgG2的Fc的C端氨基酸序列相同,从而增加C端氨基酸 序列的均一性。我们这个修饰后的Fc序列命名为“IgG4(S228P,L235E,L445P)”,其中IgG4后 面括号中的氨基酸根据EU编号。

[0047] 在本发明一优选实施例中,人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:9 所示。

[0048] 在本发明一优选实施例中,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 10-15所示。

[0049] 本发明还提供一种多核苷酸,所述多核苷酸编码所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白。

[0050] 在本发明一优选实施例中,所述多核苷酸的多核苷酸序列如SEQ ID No: 18-23所 不。

[0051] 本发明还提供含有所述的多核苷酸的表达载体,所述载体可以为真核细胞或原核 细胞蛋白表达载体等本领域各种表达载体,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。优 选为真核细胞表达载体,进一步优选为DHFR系统的表达载体和/或GS系统的表达载体。

[0052] 在本发明一优选实施例中,DHFR系统的表达载体如pIRES-DHFR,GS系统的表达载 体如 peel2.4。

[0053] 本发明还提供一种重组的宿主细胞,所述宿主细胞含有所述的表达载体、或者染 色体中整合有所述的多核苷酸,所述宿主细胞可选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或哺 乳动物细胞等本领域各种宿主细胞,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。优选为哺 乳动物细胞,进一步优选为选自CH0-DXB11,CH0-DG44,CHO-S,CH0-K1中的一种或多种的组 合的宿主细胞。

[0054] 在本发明一优选实施例中,所述宿主细胞为CH0-DXB11细胞。

[0055] 本发明还提供所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白的制备方法,包括如下步骤:

[0056] 1)将重组人GLP-I-Fc融合蛋白的编码序列克隆至表达载体中;

[0057] 本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白的制备方法中,重组人GLP-I-Fc融合蛋 白的编码序列的制备方法并没有特殊限制,可使用基因合成法等本领域技术人员所熟知的 技术进行制备;编码序列克隆至表达载体中的方法没有特殊限制,可使用本领域的各种克 隆方法,具体可使用的方法如:在编码序列两端设计与表达载体多克隆位点所对应的酶切 位点,酶切后将编码序列连接至表达载体中;所述表达载体优选为DHFR系统的表达载体和/ 或GS系统的表达载体,在本发明一优选实施例中,所述DHFR系统的表达载体如pIRES-DHFR, GS系统的表达载体如peel2.4;

[0058] 2)将表达载体转染宿主细胞,培养并筛选出阳性细胞簇;

[0059] 本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白的制备方法中,将表达载体转染宿主细 胞的方法并没有特殊限制,可使用本领域的各种转染方法,具体可使用的转染方法如:使用 DNA转染试剂将表达载体转染宿主细胞;所述宿主细胞选自CHO-DXBl I,CH0-DG44,CHO-S, CHO-Kl中的一种或多种的组合,在本发明一优选实施例中,所述宿主细胞为CH0-DXB11细 胞;所述培养并筛选出阳性细胞簇的方法并没有特殊限制,本领域技术人员可根据所选用 的宿主细胞,选择合适的培养和筛选方法,在本发明一优选实施例中,培养并筛选出阳性细 胞簇的方法具体为:传代培养大约3周后,通过测定融合蛋白的表达量,从而筛选出阳性细 胞形成细胞簇,所述通过测定融合蛋白的表达量具体方法为:通过针对GLPl的点印迹、 western blotting免疫印迹法和针对Fc片段的Elisa方法进行检测,从而测定融合蛋白的 表达量。此外,通过针对GLPl的western blotting免疫印迹法,亦证实了GLPl蛋白的正确表 达。

[0060] 3)使用步骤2所得细胞表达、纯化后,即得所述融合蛋白。

[0061] 本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白的制备方法中,细胞表达的方法只要不 对本发明的发明目的产生限制即可,本领域技术人员可根据实际所使用的宿主细胞,选择 合适的表达条件,进行蛋白表达。所述细胞表达的方法具体为:将筛选出的阳性细胞簇进行 无血清驯化,然后接种至摇瓶中摇床培养,将所得培养液离心取上清液进行蛋白纯化。

[0062] 本发明所提供的重组人GLP-1-Fc融合蛋白的制备方法中,对于融合蛋白的纯化方 法并没有具体限制,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。融合蛋白的纯化方法已经 是本领域的现有技术,融合蛋白的纯化主要采用层析的方法纯化,例如使用阴离子交换层 析或阳离子交换层析或采用凝胶过滤层析,或采用疏水层析,反相层析,还可以使用羟基磷 灰石吸附层析,金属螯合层析等,本领域技术人员可对上述所有纯化步骤进行适当的选择 和组合,最终使蛋白纯度达到基本均一。此外,利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体 或配体的亲和层析柱如重组的 的耐碱型的MabSelectSure对表达的融合蛋白进行纯化亦可被用来纯化所述融合蛋白。在 本发明一优选实施例中,纯化具体为通过膜过滤、亲和层析柱和凝胶过滤层析进行纯化。

[0063] 本发明还提供所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白在制备或筛选治疗肿瘤的药物或 制剂中的用途。所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白具有高细胞学活性和高动物学活性。

[0064] 本发明还提供一种药物组合物,含有所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白及至少一种药 学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、增稠剂等,并可被制备成如片剂、胶囊、粉末、糖 浆、溶液或悬浮液等各种本领域的药剂类型。

[0065] 本发明所提供的重组人GLP-I-Fc融合蛋白,与原形GLP-I分子同源性达到97%,且 依然保持了优良的生物学活性和动物学活性。此外,本发明发明人通过构建对应的连接肽 和人免疫球蛋白的Fe序列,进一步优化了融合蛋白的生物学活性和动物学活性。本发明中 所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白的生物学活性是指GLP-I-Fc在体内结合并激活GLP-I受体 并引起反应的能力。此反应包括胰岛素的分泌,胰高血糖素的抑制等,本发明采用的体外活 性检测是使用过表达的人类GLP-I受体HEK293细胞,在使用GLP-I-Fc后,这些细胞GLP-I受 体的活化引起腺苷酸环化酶的活化,该酶的活化又诱导由环Amp应答元件驱动的报告基因 的表达。本发明中,GLP-I-Fc的生物学活性是通过EC50值即引起50%最大效应的浓度值来 表征的,动物学活性是通过小鼠的体重和血糖水平表征的。

[0066] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0067] 在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中 另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

[0068] 当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。

[0069] 除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998!METHODS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin (P.M.ffassarman and A.P.Wolffe,eds.) ,Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY,Vol.119,Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。

[0070] 实施例I

[0071] 重组人GLP-I-Fc融合蛋白的编码序列

[0072] I. GLP-I的氨基酸构成

[0073] 天然的GLP-I及其任何改构的GLP-I分子均可通过不同的柔性连接肽与不同的Fc 片段,如IgGl,IgG2,IgG3,IgG4及改构的等连接形成融合蛋白,这些融合蛋白均有生物学活 性和长效性。

[0074] 天然的GLP-I的氨基酸序列如下:

[0075] HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID No:25)。

[0076] 本发明的融合蛋白分子是在原形GLP-I分子基础上进行过修饰的变异体,具体为 在原形GLP-I分子的31个氨基酸基础上进行了两种不同修饰的变异体,其名称和分子结构 分别为:

[0077] 分子名称:Gl (31个氨基酸的GLP-I分子中有1个氨基酸修饰)

[0078] 修饰:Gly8-GLP-1 (7-37),原形GLP-I的第一个氨基酸编号为7 (第7位),则第8位的 氨基酸(实际对应为第二个氨基酸)更改为Gly。具体序列如SEQ ID No: 1所示:

[0079] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG (SEQ ID No:l)

[0080] 分子名称:G3 (31个氨基酸的GLP-I分子中有3个氨基酸修饰)

[0081] 修饰:Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37),原形GLP-I的第一个氨基酸编号为7,则第 8,22,36位的氨基酸分别更改为Gly,Glu,Gly。具体序列如SEQ ID No:2所示:

[0082] HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAffLVKGGG (SEQ ID No:2)

[0083] 2.柔性连接肽序列

[0084] 此处连接肽氨基酸数目从2个到31个,主要为甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)相互组 合。

[0085] 含有6个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGS (SEQ ID No: 3),命名为“L1” ;

[0086] 含有11个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGS(SEQ ID No:4),命名为“L2”;

[0087] 含有16个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:5),命名为 “L3” ;

[0088] 含有21个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:6),命 名为“L4”;

[0089] 含有26个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No: 7),命名为“L5”;

[0090] 含有31个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:8),命名为“L6”。

[0091] 为了和礼来的 LY2189265 比较,参考文献(Wolfgang Glaesner et al, Engineering and characterization of the Iong-actingglucagon-1 ike peptide-1 analogue LY2189265,an Fcfusion protein,Diabetes Metab Res Rev 2010;26:287-296)报导,构建了 LY2189265连接肽序列,此序列为GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID No :17),命 名为“LY”。

[0092] 柔性连接肽L5为优选方案。实验表明用此柔性连接肽表达的GLP-I-Fc检测生物学 活性最尚。

[0093] 3.IgG4 的 Fc 片段

[0094] 对人的IgG4的Fc片段(P01861_IGHG4)三个位点进行了修饰,第一个修饰是Fc氨基 酸序列按照EU编号系统的S228P,第二个修饰是EU编号系统的L235E,第三个修饰是EU编号 系统的L445P。我们这个修饰后的Fc序列命名为“IgG4(S228P,L235E,L445P)”,具体序列如 SEQ ID No:9所示:

[0095] SKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID No :9)

[0096] 4.融合蛋白的氨基酸序列

[0097] 不同的GLP-I与柔性连接肽和IgG4_Fc所形成的蛋白的氨基酸序列分别为:

[0098] 命名:Gl-Ll-IgG4(S228P,L235E,L445P),具体序列如SEQIDNo:10所示:

[0099] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No:10)

[0100] 命名:Gl-L2-IgG4(S228P,L235E,L445P),具体序列如SEQIDNo:ll所示:

[0101] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No:II)

[0102] 命名:Gl-L3-IgG4(S228P,L235E,L445P),具体序列如SEQIDNo:12所示:

[0103] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No:I2)

[0104] 命名:Gl-L4-IgG4(S228P,L235E,L445P),具体序列如SEQIDNo:13所示:

[0105] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No:I3)

[0106] 命名:Gl-L5-IgG4(S228P,L235E,L445P),具体序列如SEQIDNo:14所示:

[0107] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID No:14)

[0108] 命名:Gl-L6-IgG4(S228P,L235E,L445P),具体序列如SEQIDNo:15所示:

[0109] HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEF EGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No:15)

[0110] 命名:G3-LY-IgG4(S228P,L234A,L235A),即LY2189265,具体序列如SEQIDNo:16 所示:

[0111] HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID No:16)

[0112] 实施例2

[0113] 在CH0-DXB11细胞中表达融合蛋白:

[0114] 将本发明不同的重组GLP-I-Fc融合蛋白和LY2189265的编码序列(SEQ ID No: 18-24)克隆至含有IRES-DHFR的表达载体序列中,表达载体在CMV启动子的驱动下表达融合蛋 白。

[0115] Gl-Ll-IgG4(S228P,L234A,L235A)的编码序列如SEQIDNo:18所示:

[0116] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgtggaggat ccggtggcggttcctctaagtacgggcccccttgccctccttgcccagctcctgaatttgagggcggacccagcgtg ttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgt gtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccca gagaggaacagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaa gagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcc tcgcgagccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcg tgaagggcttctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacc ccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaggaagg caacgtgttcagetgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccg gcaaa (SEQ ID No:18)

[0117] Gl-L2-IgG4(S228P,L234A,L235A)的编码序列如SEQIDNo:19所示:

[0118] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgtggaggat ccggtggcggttccggtggaggcggaagctctaagtacgggcccccttgcccteettgcccagctcctgaatttgag ggcggacccagcgtgtteetgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctg cgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacg ccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggat tggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaa ggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgt ccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaac aactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagag cagatggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccc tgagcctgagccccggcaaa (SEQ ID No:19)

[0119] Gl-L3-IgG4(S228P,L234A,L235A)的编码序列如SEQIDNo:20所示:

[0120] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgtggaggat ccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcatctaagtacgggcccccttgccctccttgccca gctcctgaatttgagggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaac ccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcg tggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgacc gtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcga aaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatga ccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagcaac ggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagact gaccgtggacaagagcagatggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccact acacccagaagtccctgagcctgagccccggcaaa (SEQ ID No :20)

[0121] Gl-L4-IgG4(S228P,L234A,L235A)的编码序列如SEQIDNo:21所示:

[0122] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgtggaggat ccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaggaggcggtggctcttctaagtacgggccccct tgccctccttgcccagctcctgaatttgagggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccct gatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaatt ggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctacagagtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcct gcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacacactgcctccaa gccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgacatcgccgtg gaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattctt cctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgagg ccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaaa(SEQ ID No:21)

[0123] Gl-L5-IgG4(S228P,L234A,L235A)的编码序列如SEQIDNo:22所示:

[0124] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgtggaggat ccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaggaggcggtggctctggaggtggtggaagttct aagtacgggcccccttgccctccttgcccagctcctgaatttgagggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaa gcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccg aggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaac agcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggt gtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgt acacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccc tccgacatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacag cgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaggaaggcaacgtgttcagctgca gcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaaa (SEQID No: 22)

[0125] Gl-L6-IgG4(S228P,L234A,L235A)的编码序列如SEQIDNo:23所示:

[0126] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaaggacaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgtggaggat ccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaggaggcggtggctctggaggtggtggaagtggt ggcggcggttcgtctaagtacgggcccccttgccctccttgcccagctcctgaatttgagggcggacccagcgtgtt cctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgt cccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccaga gaggaacagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaaga gtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctc gcgagccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtg aagggcttctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccc ccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaggaaggca acgtgttcagetgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc aaa (SEQ ID No: 23)

[0127] G3-LY-IgG4(S228P,L234A,L235A),即LY2189265,的编码序列如SEQIDNo:24所 示:

[0128] atggagtggtcctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggagtccacagccatggtgaagggacctttac cagtgatgtaagttcttatttggaagagcaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggcggtggaggag gcggtggctctggaggtggtggaagtggtggcggcggttcggctgaatctaagtacgggcccccttgccctccttgc ccagctcctgaagctgcaggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagcag aacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacg gcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctg accgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcat cgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagaga tgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgacatcgccgtggaatgggagagc aacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcag actgaccgtggacaagagcagatggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaacc actacacccagaagtccctgagcctgagcctgggctaatag (SEQ ID No :24)

[0129] 将本发明不同的GLP-I-Fc融合蛋白和LY2189265的编码序列(SEQ ID No: 18-24) 两端设计了NheI和MluI两个酶切位点,分别与表达载体上的NheI和Mlu頂每切位点连接,实 现目标蛋白编码DNA片段与表达载体的连接,获得质粒DNA。

[0130] 转染CHO-DXBl 1细胞在6孔板进行,CHO-DXBl 1空白细胞以1:10传代至6孔板内,用 含10%胎牛血清(FBS)和IXHT (HT Supplement,HT培养基添加剂,gibco公司产品)的DMEM培 养基进行培养。当细胞融合率达到90%时进行转染试验。首先移除细胞培养液,向每个孔里 加2毫升新鲜10%FBS+1X HT的DMEM培养液。14微克质粒DNA稀释至150微升DMEM培养基,12 微升Lipofectamine试剂稀释至150微升DMEM培养基,将DNA和Lipofectamine试剂混合后室 温静置20分钟,然后均匀加入6孔板的细胞培养液中,然后放入37度细胞培养箱进行培养, 每孔加入量为300微升。6小时后移除培养液,换成2毫升新鲜FBS+HT培养基。24小时后,用胰 酶消化细胞后用新鲜FBS+HT培养基悬浮,以1: 5稀释到两个T25方瓶中继续培养。培养24小 时后用无HT的10 %FBS的DMEM培养基继续培养,每2-3天进行一次换液,大约3周后阳性细胞 形成细胞簇,此时进行针对Fc片段的ELISA检测。ELISA检测具体方法为:用0.05M PH9碳酸 盐包被缓冲液将抗人的IgG抗体稀释至抗体浓度为1〜10yg/ml (抗体采购Sigma公司,货号 18885);每个96孔板的反应孔中加0. Iml,4 °C过夜;次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液I3BST 洗3次,每次3分钟(简称洗涤,下同);加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔 中,置37°C孵育1小时,然后洗涤;洗涤后于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液(采购 于康为世纪公司)0.1ml,37°C10〜30分钟,最后于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml终止反应, 酶标仪读数OD 450nm的值(取OD值多0.15继续传代)。同时用稀释法将细胞传代到96孔板 中,2-3周后,单克隆可以从96板中挑选出来,传代到T25中加压培养。首先用含有IOOnM的 MTX的10 %FBS的DMEM培养液加压培养,大约2周细胞适应IOOnM的MTX后,细胞冻存,然后继 续以250nM,500nm,IOOOnM的MTX压力继续培养,同时用点印迹,WB (western blotting)和针 对Fe片段的Elisa方法进行筛选。点印记和WB的一抗选用抗GLPl的单抗(Sigma采购),二抗 选用带有辣根过氧化氢酶标记的山羊抗小鼠单抗(碧云天公司采购),针对Fc片段的Elisa 方法与上文相同,具体实验步骤和方法亦可参考分子克隆实验指南,最终挑选出3-6株细胞 进行无血清驯化。

[0131] 表达不同GLP-I-Fc融合蛋白的细胞株能够适应在无血清培养基中悬浮培养后,以 2*105密度传代至IL摇瓶中,温度37C,5%的⑶2环境中,120RPM摇床培养至密度达到4*106, 将温度降低至32C,每天补充葡萄糖、氨基酸等养料,5-6天后细胞活率降低至80-85%停止 培养。将细胞液2000RCF离心取出细胞后,再5000RCF离心取上清进行蛋白纯化。

[0132] 实施例3

[0133] 融合蛋白的分离纯化:

[0134] 含有 GLP-I-Fc 和 LY2189265 融合蛋白(61-1^1-1864、61-1^2-1864、61-1^3-1864、61-L4-IgG4、Gl-L5-IgG4、Gl-L6-IgG4、G3-LY-IgG4)的细胞培养液 OiLP-I-Fc表达量约lmg/ml) 2L,0.22微米硝酸纤维素膜深层过滤,IOkD截留分子量PVDF膜平板错流超滤浓缩至200ml, GE公司rProteinA FF亲和层析柱纯化,50mM梓檬酸缓冲液pH3.3洗脱,每收集IOml洗脱液添 加Iml IM Tris pH8.5中和。收集洗脱液通过GE公司S印hacryl S-200 HR纯化,得到最终样 品,产品质量分别为:61-1^1-186420011^、61-1^-186420011^、61-1^3-186420011^、61-1^4-186420011^、61-1^5-186420011^、61-1^6-186420011^、63-1^-186420011^。进行~端测序以及分析 检测,N端测序结果均显示序列为“HGEGTF”,表明各GLP-I-Fc融合蛋白(61-1^1-1864、61-1^-IgG4、Gl-L3-IgG4、Gl-L4-IgG4、Gl-L5-IgG4、Gl-L6-IgG4、G3-LY-IgG4)均读框无误。

[0135] 实施例4

[0136] 体外受体GLP-I激活实验:

[0137] 利用Gl和不同的柔性连接肽融合IgG4(S228P,L235E,L445P)片段,其中柔性连接 肽我们选择了LI,L2,L3,L4,L5,L6,在CHO-DXBl 1细胞中表达出了包括类似LY2189265共7种 融合蛋白并用此方法进行生物学活性分析,融合蛋白编号为61-1^4(3,61-1^4(3,61-1^-Fc,G1-L4-Fc,G1-L5-Fc,G1-L6-Fc,LY2189265。具体检测方法为:使用过表达的人类 GLP-I 受体HEK293细胞进行体外活性检测(具体检测方法参照Wolfgang Glaesner ect; Engineering and characterization of the long-acting glucagon-like peptide-1 analogue LY2189265,an Fe fusion protein;Diabetes Metab Res Rev 2010;26:287-296.;中的方法),在使用重组GLP-I-Fc和LY2189265后,这些细胞GLP-I受体的活化引起腺 苷酸环化酶的活化,该酶的活化又诱导由环Amp应答元件驱动的报告基因的表达,通过EC50 值即引起50 %最大效应的浓度值来表征GLP-I-Fc和LY2189265的活性,具体结果如表1所 示:

[0138] 表1

Figure CN104327187BD00151

[0140] 从结果分析得出,G1-L5-FC所表现出的细胞学活性最高,S卩EC50值最低,尤其是相 比较LY2189265活性提高了 3倍以上。

[0141] 实施例5

[0142] db/db小鼠体内药效学实验:

[0143] 给五周龄的db/db小鼠(初始平均体重为35g,初始平均血糖浓度为12nmol/L,每个 实验小组5只个小鼠)皮下分别注射lOnmol/kg的G1-L5-FC和LY2189265及相同体积的生理 盐水,每7天检测一次血糖及体重,检测后继续注射lOnmol/kg的G1-L5-FC和LY2189265及相 同体积的生理盐水,持续观察28天小鼠的血糖变化及体重变化,判断G1-L5-FC和LY2189265 的体内药效,具体实验数据结果如1和图2所示。从实验数据可以看出,G1-L5-FC和 LY2189265在db/db小鼠体内都可以产生维持血糖平衡的药效,但是G1-L5-FC相比 LY2189265在同样剂量下控制血糖的水平更好(p〈0.02),在控制体重方面两者区别不大,长 期给药都可以产生降低体重的效果。

[0144] 综上所述,本发明所提供的GLP-I-Fc融合蛋白的细胞学活性和动物体内生物学活 性相对于现有的GLP-I-Fc融合蛋白均有很大的提高。为了验证我们的融合蛋白分子的生物 学活性,我们同时构建了表达LY2189265的相同序列细胞株,从而获得与LY2189265序列相 同的融合蛋白样品。通过与LY2189265的比较,我们惊喜的发现与LY2189265 (Wolfgang Glaesner et al,Engineering and characterization of the Iong-actingglucagon- like peptide-1 analogue LY2189265,an Fcfusion protein,Diabetes Metab Res Rev 2010; 26:287-296)对比,本发明所提供的重组GLP-I-Fc融合蛋白的细胞学活性提高了3倍, 动物学活性也有显著提高。

[0145] 综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

[0146] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因 此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (12)

1. 一种重组人GLP-I-Fc融合蛋白,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白包括两个结构功能区 域,分别为重组GLP-I片段和人免疫球蛋白的Fc片段,所述重组GLP-I片段的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1所示,所述人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示,所述重 组GLP-I片段和人免疫球蛋白的Fc片段之间还包括连接肽,所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:7或SEQ ID No:8所示,所述重组人GLP-I-Fc融合蛋白从N端到C端依次包括重组GLP-1片段、连接肽、人免疫球蛋白的Fc片段。
2. 如权利要求1所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白,其特征在于,所述人免疫球蛋白的Fc 片段为不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc。
3. 如权利要求1所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白,其特征在于,所述重组人GLP-I-Fc融 合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 14、15所示。
4. 一种多核苷酸,所述多核苷酸编码如权利要求1-3任一权利要求所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白。
5. 如权利要求4所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸的多核苷酸序列如SEQ ID No: 22、23 所示。
6. —种表达载体,含有如权利要求4-5任一权利要求所述的多核苷酸。
7. 如权利要求6所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体选自DHFR系统的表达载体 和/或GS系统的表达载体。
8. 如权利要求7所述的表达载体,其特征在于,DHFR系统的表达载体为pIRES-DHFR,GS 系统的表达载体为peel2.4。
9. 一种重组的宿主细胞,所述宿主细胞含有如权利要求6-8任一权利要求所述的表达 载体、或者染色体中整合有权利要求4-5任一权利要求所述的多核苷酸。
10. 如权利要求9所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞选自(^0-01811,〇10-DG44,CHO-S,CHO-Kl中的一种或多种的组合。
11. 如权利要求1-3任一权利要求所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋白的制备方法,包括如 下步骤: 1) 将重组人GLP-I-Fc融合蛋白的编码序列克隆至表达载体中; 2) 将表达载体转染宿主细胞,培养并筛选出阳性细胞簇; 3) 使用步骤2所得细胞表达所述融合蛋白,纯化后即得所述融合蛋白。
12. —种药物组合物,含有如权利要求1-3任一权利要求所述的重组人GLP-I-Fc融合蛋 白及至少一种药学可接受的载体,所述药物组合物可被制备成片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液 或悬浮液的药剂类型。
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