JPWO2007049695A1 - 凝集性ｇｌｐ−１アナログおよび徐放性医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、高い凝集会合性を有するＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩、並びにこれを用いた糖尿病、高血糖症、若しくはそれらに起因する糖尿病性合併症、または肥満症の予防または治療のために使用される医薬品組成物を提供する。

Description

本発明は、糖尿病、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症の予防または治療のための医薬品として有用な、凝集性ＧＬＰ−１アナログ、及びこれを含有する医薬組成物に関する。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、食物摂取に応答して、アミノ酸１６０残基のプログルカゴンから小腸Ｌ−細胞のプロセッシング酵素により生成し、分泌されるペプチドである。プログルカゴンのアミノ酸番号７２−１０８からなるペプチド（ＧＬＰ−１（１−３７）に相当）のほか、当該ペプチドのＮ末端部の１−６位を取り除いたＧＬＰ−１（７−３７）および３６位のＣ末端がアミド化されているＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂は、膵臓ベータ細胞に作用し、インスリン分泌を促進し、血清中グルコース量を減少させることが知られている（非特許文献１）。この作用は血糖値が低い時には見られないことから低血糖のリスクが低いこと、さらに、ＧＬＰ−１にはインスリンを産生するベータ細胞の増殖、前駆細胞からの分化誘導作用、グルカゴン分泌抑制作用、胃排出遅延作用あるいは摂食抑制作用などがあることが知られており（非特許文献１）、糖尿病治療薬としての利用への期待が高い。しかし、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）による分解と腎からの排泄により、ＧＬＰ−１の血中半減期は数分と短く、糖尿病医薬として使用するためには頻回投与が必要になる。生物活性を維持し、ＤＰＰＩＶ耐性を付与した様々なＧＬＰ−１類縁体、誘導体（アナログ）（例えば［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）など）が報告されている（特許文献１〜８）が、腎排泄は回避できないため血中滞留性の延長は大きくない。

また、ＧＬＰ−１アナログの徐放製剤の報告もある（特許文献９）が、放出期間は1日以下と短い。
国際公開ＷＯ９１／１１４５７号パンフレット 特開平１１−３１０５９７号公報 国際公開ＷＯ９９／４３７０５号パンフレット 国際公開ＷＯ００／６９９１１号パンフレット 国際公開ＷＯ９５／３１２１４号パンフレット 国際公開ＷＯ００／０７６１７号パンフレット 国際公開ＷＯ０３／１０３５７２号パンフレット 国際公開ＷＯ９７／２９１８０号パンフレット 特開平７−２６９５号公報 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第４０巻、第３３３−３４３頁、１９９２年

糖尿病、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症から選択される疾患の予防または治療のために使用される医薬品として有用な、長期間の徐放を可能にするために、これまでにない会合凝集性を有する高活性な徐放用凝集性ＧＬＰ−１アナログ、並びにこれを含有する糖尿病、高血糖症若しくはこれらに起因する糖尿病性合併症、または肥満症の予防薬または治療薬を提供することにある。

本発明者は、かかる課題を解決する為に、生物活性を低下させずに会合凝集性を向上させた変異体の探索を鋭意検討したところ、ヒトＧＬＰ−１およびそのアナログの３０位のアラニンをアルギニンに置換したＧＬＰ−１アナログにこれまでにない会合凝集性を見出し、さらにこれを凝集させたものが長期間の放出挙動を示すことを見出すことにより本発明を完成させた。

すなわち、本発明の１つの側面によれば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１アナログの３０位のアラニン（Ａｌａ³⁰）がＬｙｓ（Ｌｙｓ³⁰）またはアルギニン（Ａｒｇ³⁰）である、ＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩が提供される。

本発明の別の側面によれば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１アナログの３０位のアラニン（Ａｌａ³⁰）がアルギニン（Ａｒｇ³⁰）に置換されている、請求項１に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩が提供される。

本発明の更なる別の側面によれば、糖尿病、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症から選択される疾患の予防または治療のために使用され、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１アナログの３０位のアラニン（Ａｌａ³⁰）がアルギニン（Ａｒｇ³⁰）に置換されているＧＬＰ−１アナログ（［Ａｒｇ³⁰］−ＧＬＰ−１アナログ）が提供される。本発明の［Ａｒｇ³⁰］−ＧＬＰ−１アナログは、天然型ヒトＧＬＰ−１（７−３７）の生物活性を有し、且つ凝集性を有するアナログであり、好ましくは、in vitro生物活性が天然型ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と同等以上であるアナログであり、更に好ましくは凝集性評価試験においてモノマー残存率が２０％以下のアナログである。

ここで、置換されるＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アナログは、特に限定はされないが、哺乳動物由来、特にヒト由来のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（ｈＧＬＰ−１）またはそのアナログが好ましい。また、プログルカゴンの任意の断片であってインクレチン活性を有するタンパク質またはペプチド、およびその断片の配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドであってもよい。ＧＬＰ−１アナログとしては、特に限定はされないが、例えば、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）ＮＨ₂、ＧＬＰ−１（７−３７）ＮＨ₂、およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂などの配列に１若しくは数個（例えば１〜４個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。

当該ＧＬＰ−１アナログとして好ましくは、体内のＤＰＰＩＶなどの代謝酵素に対する耐性やその他の安定性などを付与するために天然或いは非天然型のアミノ酸変異が導入されたアナログが好ましい。これらの変異を導入するアミノ酸配列の部位としては、７位、８位、９位、１０位、１５位、１６位、１８位、２１位、２２位、２３位、２４位、２６位、３１位、３４位、３５位、３６位などのアミノ酸が置換されたＧＬＰ−１アナログが知られており（ＷＯ９８／１９６９８、ＷＯ９１／１１４５７、ＷＯ００／３４３３１など）、本発明のＧＬＰ−１アナログもこれらのアミノ酸配列のうち一つ又は二つ以上他の天然或いは非天然型のアミノ酸に置換されていてもよい。代謝が抑制されたアナログとしては、８位のＡｌａがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ，Ｓａｒ，Ｄ−アラニン、β−アラニン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、Ｎ−エチル−Ｄ−アラニン、Ｎ−メチル−グリシン、２−メチル−アゼチジン−２−カルボン酸、α−メチル−（Ｌ）−プロリン、２−メチルピペリジン−２−カルボン酸、イソバリン、１−アミノシクロプロパンカルボン酸、１−アミノシクロブタンカルボン酸、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、１−アミノシクロヘキサンカルボン酸、１−アミノシクロヘプタンカルボン酸、１−アミノシクロオクタンカルボン酸などの天然または非天然アミノ酸で置換されたものが好ましく、特に、８位のＡｌａがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、または、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）で置換されたものがより好ましい。

当該ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アナログとしては、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｓｅｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｓｅｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｖａｌ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｖａｌ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｌｅｕ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｌｅｕ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｉｌｅ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｉｌｅ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｔｈｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｔｈｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ａｉｂ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ａｉｂ^8、35］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂などが挙げられ、好ましくは、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）および［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ａｉｂ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ａｉｂ^8、35］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂が挙げられる。

本発明のある態様においては、本発明に係るＧＬＰ−１アナログは、アミノ酸配列は、［Ｇｌｙ⁸］−［Ａｒｇ³⁰］−ＧＬＰ−１（７−３７）であり、以下の配列：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号１）
で表される。

本発明の別の側面によれば、上記のＧＬＰ−１アナログを含有する医薬組成物が提供される。本発明の一つの側面において、上記のＧＬＰ−１アナログは会合凝集化していてもよい。この会合凝集化は、例えば、振盪や攪拌といった物理的ストレスや結晶化、非晶質化などに用いる一般的手法によって達成されうる。

また、上記のＧＬＰ−１アナログと金属イオンを共存させることによっても達成されうる。従って、本発明のＧＬＰ−１アナログは、会合凝集体または金属イオンを含む金属錯体を形成していてもよい。上記金属イオンは、例えば、亜鉛、銅、鉄、マンガン、カルシウム、ニッケル、アルミニウム、ナトリウムおよびカリウムから選択される。本発明のＧＬＰ―１アナログは、後述の実施例において示すとおり天然型と比べて顕著に少量の金属イオンで凝集体を形成することができ、徐放化医薬組成物として好ましい性質を有する。

本発明のある態様において、上記医薬組成物は、糖尿病（インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）またはインスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病））、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症から選択される疾患の予防または治療のために使用されうる。また、本発明の別の態様において、上記の医薬組成物は徐放性医薬組成物として使用されうる。

本発明のさらに別の側面によれば、上記のＧＬＰ−１アナログの有効治療量を患者に投与することを含む、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）などの糖尿病、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症から選択される疾患の予防または治療方法が提供される。

本発明のＧＬＰ−１アナログは、従来のＧＬＰ−１アナログでは得られない凝集性を有し、本発明のＧＬＰ−１アナログの凝集会合体を用いることで、従来のＧＬＰ−１アナログでは達成できなかった、長期間の徐放を示す糖尿病、高血糖症、若しくはそれらに起因する糖尿病性合併症、または肥満症の予防薬または治療薬を提供することが可能である。

ＷＴ−ＧＬＰ−１の攪拌前後のＣＤスペクトルの測定結果を示すものである。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）の攪拌前後のＣＤスペクトルの測定結果を示すものである。 インビトロにおけるＺｉｎｃ／ＧＬＰ−１錯体からのＧＬＰ−１の放出の変化を示すものである。 ＧＬＰ−１アナログ（ペプチド３）の攪拌前後のＣＤスペクトルの測定結果を示すものである。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）の振盪による凝集物の凍結乾燥粉末の走査型電子顕微鏡写真である。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）の振盪による凝集物のインビトロにおける放出の変化を示すものである。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）およびＷＴ−ＧＬＰ−１に種々濃度の塩化亜鉛を添加した際の溶解度変化を示すものである。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）亜鉛塩の凍結乾燥粉末の走査型電子顕微鏡写真である。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）亜鉛塩の凍結乾燥粉末の走査型電子顕微鏡写真である。 ＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩の凍結乾燥粉末の走査型電子顕微鏡写真である。 ＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩の凍結乾燥粉末の走査型電子顕微鏡写真である。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）亜鉛塩粉末およびＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩粉末のインビトロにおける放出の変化を示すものである。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）亜鉛含有溶液を中性緩衝液に滴下した際の外観である。 本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）亜鉛含有溶液を中性緩衝液に滴下し固体化させたもののインビトロにおける放出の変化を示すものである。

発明の実施の形態

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明は、高活性で長期間の徐放を可能にするこれまでにない凝集会合性を有する徐放用凝集性ＧＬＰ−１アナログに関する。

本発明に係るペプチドまたはタンパク質の合成は、通常用いられる、固相法、液相法による化学合成法でも、大腸菌や動物細胞を宿主として製造される組み換え培養法でも良い。Ｃ末端はカルボン酸体でもアミド体でも良いが安定性の点からアミド体の方が好ましい。

本ＧＬＰ−１アナログを用いた徐放製剤を調製するには、会合凝集化させることが好ましい。例えば、単独、あるいは、金属イオン等の沈殿剤共存下で会合凝集化させればよい。凝集方法としては、特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ等中性ｐＨの緩衝液にＧＬＰ−１アナログを溶解し（例えば１ｍｇ／ｍＬ濃度）攪拌する方法、酸性条件下（ｐＨ４以下）の溶媒にＧＬＰ−１アナログを溶解してｐＨを中性付近に戻し攪拌する方法、あるいは、酸性条件下（ｐＨ４以下）の溶媒にＧＬＰ−１アナログと金属イオンを溶解、ｐＨを中性付近に戻し攪拌する方法が挙げられる。酸性ｐＨではＧＬＰ−１アナログの溶解度が上がる為、より高い濃度まで溶解でき、沈殿させやすい利点がある。

「医薬として許容される塩」とは、ＧＬＰ−１アナログと、医薬品の製造に使用可能である酸または塩基とを接触させることにより製造される、医薬品として使用されうる塩である。ここで、当該塩基は、ＧＬＰ−１アナログを会合凝集化する際に用いられる金属イオンを与える化合物（例えば、塩化亜鉛、酸化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化第二鉄、塩化カルシウム、酸化カルシウム、酢酸カルシウム、臭化カルシウム、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、硫酸カルシウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、水酸化カリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウムなど）であってもよい。

ＧＬＰ−１アナログを会合凝集化する際に用いられる金属イオンとしては、亜鉛、銅、鉄、マンガン、カルシウム、ニッケル、アルミニウム、ナトリウム、カリウムが挙げられるが特に亜鉛が好ましい。対イオンは製剤の安定化を促進するものを選択すればよい。

凝集方法や金属イオン等の沈殿剤で会合凝集化させる方法としてはまた、結晶化や非晶質化に一般的に用いられる方法、例えば冷却法、貧溶媒法、蒸発法、溶媒媒介転移法、蒸気平衡法などが挙げられる。

また、本発明のＧＬＰ−１アナログを薬物担体に封入することでさらに長期間の徐放製剤が得られる。薬物を担持させるには、公知の各種の方法を用いることができ、例えば、エマルジョン法でポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を始めとしたこれらの共重合体等の生分解性ポリマーと共にマイクロスフィア化すれば良い。

あるいは、金属イオン等の沈殿剤共存のＧＬＰ−１アナログ酸性溶液で皮下や局所に投与し、皮下などの投与部位で沈殿、徐放化させることも出来る。また、この酸性溶液のＧＬＰ−１アナログ濃度や添加する金属イオン等の濃度を適宜調節することによって徐放速度や期間の制御を達成することも出来る。

また、本発明のＧＬＰ−１アナログを水溶性高分子にコンジュゲートして、血中滞留性を改善させることも可能であるし、コンジュゲート自体を皮下投与、あるいはコンジュゲート架橋体を皮下に投与することで、皮下、あるいは血中から本発明のＧＬＰ−１アナログを徐放させることも可能である。

本発明のＧＬＰ−１アナログは、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る塩、希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。希釈剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、デキストロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール等が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、非経口的に全身又は局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、投与経路、投与頻度によって異なる。副作用（悪心、嘔吐等）の発生を抑制しつつ薬効を得るための血中濃度として、２ｐＭから１０００ｐＭ、好ましくは、１０ｐＭから４００ｐＭ、さらに好ましくは２０ｐＭから２００ｐＭが想定されるので、当該血中濃度となるように投与量を調整することが好ましい。

本発明のＧＬＰ-１アナログまたは医薬として許容されるその塩を医薬として投与する場合、糖尿病用医薬としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日あたり、５μｇ〜５００ｍｇの範囲であるが、上記範囲未満の用量で足りる場合もあり、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。

本発明を適用することができる糖尿病性合併症は特に限定されず、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性動脈硬化症、糖尿病性心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性足病変などが挙げられる。

本発明により、従来の方法では得られない、長期間の持続性糖尿病医薬を提供することが可能である。

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ＧＬＰ−１アナログの生物活性
本発明に係るＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１；配列番号１）及び天然型のＧＬＰ−１（７−３７）（ＷＴ−ＧＬＰ−１；配列番号２）を固相合成法により得た（ペプチド研究所社及び島津製作所製）。

９６ウェルプレートに１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種後３日間培養したヒトＧＬＰ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ発現ＨＥＫ２９３細胞を、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＢＭＸで３０分間処理し、次に試料を最終濃度１×１０^-7〜３．８×１０^-13ｍｏｌ／Ｌで添加し３０分間反応させた後、細胞を溶解した。細胞溶解液中のｃＡＭＰ濃度は、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。各資料の配列を表１に示し、各試料のｃＡＭＰ産生のＥＣ５０値を表２に示す。

本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）は、ＷＴ−ＧＬＰ−１とほぼ同等の活性を維持していた。
〔実施例２〕ＧＬＰ−１アナログの凝集性評価
実施例１のＧＬＰ−１アナログ及びＷＴ−ＧＬＰ−１を１ｍｇ／ｍＬ濃度でＰＢＳに溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣでモノマー量を測定した。同溶液４５０μＬを攪拌子と共にガラスバイヤルに入れ、室温にて２０時間スターラで攪拌した。攪拌後３５０ｎｍの吸光度を測定し（ＤＵ６４０、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、遠心後の上清についてＲＰ−ＨＰＬＣによるモノマー定量、ＣＤ測定を行った（Ｊ−７２５、Ｊａｓｃｏ．Ｃｏ．社製）。

ＲＰ−ＨＰＬＣ条件
システム： ＮａｎｏＳｐａｃｅ ＳＩ−２（資生堂製）
カラム： Ｃａｐｃｅｌｌ ＰＡＫ Ｃ１８，１ｍｍＸ７５ｍｍ（資生堂製）
流速： ０．１ｍＬ／分
検出： ＵＶ（２１５ｎｍ／２８０ｎｍ）
溶出液Ａ： 水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９４９／５０／１
溶出液Ｂ： 水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝５０／９４９／１
溶出方法： 溶出液Ａ／溶出液Ｂ＝８０／２０から２０／８０のグラジエント
ＣＤスペクトルを図１および図２に、結果を表３に示す。

本発明のＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）は、目視で容易に白濁が確認され、３５０ｎｍの吸光度（濁度）の上昇及び沈殿によるモノマー残存率の低下が認められた。ペプチド１はＷＴ−ＧＬＰ−１に比較して、著しく凝集性が増加していることが確認された。
〔実施例３〕ＧＬＰ−１アナログ凝集体の徐放性評価
ＧＬＰ−１アナログの定量はＲＰ−ＨＰＬＣを用いた。

システム： Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９０／２４８７
カラム： ＹＭＣ−ＯＤＳ Ａ，２．０ｍｍＸ２５０ｍｍ（ＹＭＣ）
流速： １ｍＬ／分
検出： ＵＶ（２１５ｎｍ／２８０ｎｍ）
溶出液Ａ： 水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９４９／５０／１
溶出液Ｂ： 水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝４９／９５０／１
溶出方法： 溶出液Ａ／溶出液Ｂ＝６５／３５から０／１００のグラジエント
〔実施例３−１〕Ｚｉｎｃ／ＧＬＰ−１の調製
ＷＴ−ＧＬＰ−１とＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１）各４００μｇを、２ｍｇ／ｍＬ塩化亜鉛を含有する１ｍＭ ＨＣＬ溶液（２００μＬ、ｐＨ＝２．８）にそれぞれ溶解させた。各１００μＬをＥ−ｔｕｂｅに添加、１ｍＭ ＨＣＬ溶液で希釈して１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。２０μＬ ＰＢ（ｐＨ＝８．９，１００ｍＭ）を添加することにより、Ｚｉｎｃ／ＧＬＰ−１の錯体が形成した。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上澄みを除去し、Ｚｉｎｃ／ＧＬＰ−１錯体を得た。
〔実施例３−２〕インビトロにおけるＺｉｎｃ／ＧＬＰ−１錯体からのＧＬＰ−１の放出テスト
３７℃においてＰＢＳ（０．５ｍＬ，ｐＨ＝７．４）をＺｉｎｃ／ＧＬＰ−１の錯体を含有しているＥ−ｔｕｂｅに添加した。一定時間ごとにＥ−ｔｕｂｅを遠心し、上澄みをサンプリングし、新たに０．５ｍＬのＰＢＳを添加した。０．２Ｍ ＨＣｌ（２０μＬ）を２００μＬのサンプルに対して添加し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより定量を行った。結果を図３に示す。

ＷＴ−ＧＬＰ−１は、１４日目まで放出したのに対し、ペプチド１の放出速度はＷＴ−ＧＬＰ−１より遅く、２３日目で５５％程度であった。Ｚｉｎｃ／ペプチド１錯体は、Ｚｉｎｃ／ＷＴ−ＧＬＰ−１の錯体よりもより長い徐放性能を示した。
〔比較例１〕ＧＬＰ−１アナログの凝集性評価
ＧＬＰ−１アナログ（ペプチド３；配列番号３）を固相合成法により得た（島津製作所製）。

ペプチド３について実施例２に示した方法と同様に凝集性を評価した。

ＣＤスペクトルを図４に、結果を表５に示す。

ペプチド３は、ペプチド１と同程度の等電点を有するが、ＷＴ−ＧＬＰ−１と比較して、凝集性の増加は認められなかった。
［実施例４］ＧＬＰ−１アナログの凝集体の調製及び徐放性評価
本発明に係るＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１；配列番号１）を固相合成法により得た（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＰＥＰＴＩＤＥ ＣＯＭＰＡＮＹ，ＩＮＣ．製）。

ＧＬＰ−１アナログの定量はＲＰ−ＨＰＬＣ（分析条件を以下に記した）を用いた。

システム： Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４８７
カラム： Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ１８−Ｃ（３μｍ） ３．０ｍｍ×５０ｍｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）
流速： ０．７５ｍＬ／分
検出： ＵＶ（２８０ｎｍ）
溶出液Ａ： ０．０１％ｗ／ｖＴＦＡ含有ＭｉｌｌｉＱ水
溶出液Ｂ： ０．０１％ｗ／ｖＴＦＡ含有アセトニトリル
溶出方法： 溶出液Ａ／溶出液Ｂ＝８０／２０から５０／５０のリニアーグラジエント
〔実施例４−１〕ＧＬＰ−１アナログ凝集体の調製
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に２０ｍｇのペプチド１を１ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解し、同溶液を１ｍＬずつ２０本のエッペンドルフチューブに分注した。２０本のうち１本についてＲＰ−ＨＰＬＣでペプチド濃度を測定した。１９本について、室温にて２４時間シェイカーで振盪した。振盪後の溶液は明らかに白濁していた。振盪後、遠心操作（１０，０００ｇ、３分）およびデカンテーションによって白色沈殿物と上清を分離した。上清についてＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチド濃度を測定したところ、振盪前の濃度に対して０．６％（６μｇ／ｍＬ）であり、９９．４％が凝集したことが示唆された。回収した白色沈殿物はＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄操作を行った後、ひとつに集めた。洗浄液はデカンテーションによって除去し、凍結乾燥することでＧＬＰ−１アナログ凝集体の白色粉末を得た。得られた白色粉末の重量測定を行ったところ１４．０ｍｇであった。得られた粉末の走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。ＧＬＰ−１アナログ凝集体は、およそ５０から６００μｍほどの粉末でその断面は層状の構造を有していた。
〔実施例４−２〕インビトロにおけるＧＬＰ−１アナログ凝集体の溶出速度評価
実施例４−１で得られたＧＬＰ−１アナログ凝集体の白色粉末をおよそ０．５ｍｇずつ８本の透析チャンバー（ＥａｓｙＳｅｐ：ＭＷＣＯ１４，０００、トミー精工社製）に秤取した。１本はスタンダードとして冷凍保存し、残り７本には１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、粉末をＶｏｒｔｅｘミキサーでよく分散した後、透析膜のキャップを取り付け、キャップを下側に向けた状態にした。分散した粉末が容器上部の壁面につかないようによく振ってから、フローターに装着し、１Ｌの０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３７℃で平衡透析を行った。３時間、１日、２日、１週、２週、３週、４週後に透析チャンバーを回収し、遠心操作によってＧＬＰ−１アナログ凝集体の沈殿物と上清を分離し、デカンテーションによって上清を除去した。回収した沈殿物は凍結乾燥した。

スタンダードおよび凍結乾燥したサンプルに、１２０μｌの０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０含有０．０５Ｎ塩酸、４０μｌのＤＭＳＯ、４０μｌのアセトニトリルを添加することで溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチド量を測定した。

透析チャンバー内に残存していたペプチド量をスタンダードに対する１００分率として算出し時間に対してプロットした結果を図６に示す。

ＧＬＰ−１ペプチド凝集体の溶出は、３７℃、ＰＢＳ中において非常に遅く、ほぼ０次的な溶出パターンを示し、４週間での溶出量はおよそ３５％程度であった。
〔実施例５〕ＧＬＰ−１アナログ亜鉛塩粉末の調製及び徐放性評価
本発明に係るＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１；配列番号１）は実施例４で得たもの、天然型のＧＬＰ−１（７−３７）（ＷＴ−ＧＬＰ−１；配列番号２）は実施例１で得たものを用いた。

ＧＬＰ−１アナログの定量は実施例４で示した方法で行った。

ＧＬＰ−１アナログ亜鉛塩中の亜鉛含量定量は以下に示すＺｉｎｃｏｎ法によって行った。
Ｚｉｎｃｏｎ法
１３．５８ｍｇの塩化亜鉛（ＭＷ１３６．３）を２４．９１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解することで、４ｍＭ塩化亜鉛スタンダードを調製した。塩化亜鉛スタンダードをＭｉｌｌｉＱ水で希釈することで２倍希釈列６列を調製した。次に１３．２１ｍｇのＺｉｎｃｏｎ（ＭＷ４６２．４）を２８５．７μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、これをＭｉｌｌｉＱ水で５０倍に希釈することで２ｍＭＺｉｎｃｏｎスタンダードを調製した。

２０μｌの塩化亜鉛スタンダードの希釈列それぞれに９６０μｌの１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）および２０μｌのＺｉｎｃｏｎスタンダードを添加して、よく混合後３０分間室温で静置した。これらのサンプルについて分光光度計で６１７ｎｍの吸光度を測定し、その吸光度を塩化亜鉛濃度に対してプロットしたもの検量線として用いた。

亜鉛濃度未知の亜鉛塩サンプルは検量範囲に入るような濃度で１０ｍＭ塩酸に溶解し、２０μｌの濃度未知溶液に９６０μｌの１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）および２０μｌのＺｉｎｃｏｎスタンダードを添加して、よく混合後３０分間室温で静置した。分光光度計で６１７ｎｍの吸光度を測定し、先に作成した検量線によって亜鉛濃度定量を行った。
〔実施例５−１〕ＧＬＰ−１アナログ亜鉛塩の調製条件検討
ペプチド１およびＷＴ−ＧＬＰ−１を１ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。また塩化亜鉛を０．１ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。１ＭＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ'−［２−エタンスルホン酸］）緩衝液（ｐＨ７．４）を別に調製した。ペプチド水溶液にＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭｉｌｌｉＱ水、塩化亜鉛水溶液の順に添加することで、最終容量で１ｍＬ、最終濃度で１００μｇ／ｍＬペプチド、１００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、塩化亜鉛はペプチドモル数に対して種々の比率（Ｚ／Ｐ＝０−３０）になるようにサンプルを調製した。これらを室温（２５℃）で１８時間静置した。この混合物を遠心（１０，０００ｇ、３分間）し、上清中のペプチド濃度をＲＰ−ＨＰＬＣによって定量した。結果を図７に示す。

ペプチド１の亜鉛塩は、ＷＴ−ＧＬＰ−１と比較して少ない塩化亜鉛添加量において生成し、その緩衝液（ｐＨ７．４）中での溶解度は、フリー体（塩化亜鉛添加前）と比較して著しく低くなっていた。最も溶解度が低くなっていたペプチドに対する亜鉛添加比は、ペプチド１でＺ／Ｐ＝１付近、ＷＴ−ＧＬＰ−１でＺ／Ｐ＝１５−３０であった。そのときのペプチド１亜鉛塩の溶解度はＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩と比較して低いことが示唆された。
〔実施例５−２〕徐放性評価のためのペプチド１亜鉛塩の調製
ペプチド１を５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。また塩化亜鉛を１ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を別に調製した。ペプチド水溶液にＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭｉｌｌｉＱ水、塩化亜鉛水溶液の順に添加することで、最終容量で３０ｍＬ、最終濃度で１ｍｇ／ｍＬペプチド、１００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、塩化亜鉛はペプチド１に対してＺ／Ｐ＝１になるようにサンプルを調製した。この溶液を室温（２５℃）で１８時間静置した。静置後の溶液は明らかに白濁していた。遠心操作（１０，０００ｇ、３分）およびデカンテーションによって白色沈殿物と上清を分離した。上清についてＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチド濃度を測定したところ、塩化亜鉛未添加の場合の濃度に対して１．６％であり、９８．４％が亜鉛塩として沈殿したことが示唆された。回収した白色沈殿物はＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄操作を行った後、洗浄液はデカンテーションによって除去し、凍結乾燥することでペプチド１亜鉛塩の白色粉末を得た。得られた白色粉末の重量測定を行ったところ２３．１ｍｇであった。白色粉末中の亜鉛含量は０．８％ｗ／ｗであった。得られた粉末の走査型電子顕微鏡写真を図８に示す。ペプチド１亜鉛塩は、およそ１５０から１０００μｍほどの粉末で表面形状観察から２００ｎｍ程度の微粒子の集合体であることが示唆された。
〔比較例２〕徐放性評価のためのＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩の調製
ＷＴ−ＧＬＰ−１を５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。また塩化亜鉛を１ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を別に調製した。ペプチド水溶液にＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭｉｌｌｉＱ水、塩化亜鉛水溶液の順に添加することで、最終容量で３０ｍＬ、最終濃度で１ｍｇ／ｍＬペプチド、１００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、塩化亜鉛はＷＴ−ＧＬＰ−１に対してＺ／Ｐ＝１５になるようにサンプルを調製した。この溶液を室温（２５℃）で１８時間静置した。静置後の溶液は明らかに白濁していた。遠心操作（１０，０００ｇ、３分）およびデカンテーションによって白色沈殿物と上清を分離した。上清についてＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチド濃度を測定したところ、塩化亜鉛未添加の場合の濃度に対して４．３％であり、９５．７％が亜鉛塩として沈殿したことが示唆された。回収した白色沈殿物はＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄操作を行った後、洗浄液はデカンテーションによって除去し、凍結乾燥することでＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩の白色粉末を得た。得られた白色粉末の重量測定を行ったところ２１．９ｍｇであった。白色固体中の亜鉛含量は１．８％ｗ／ｗであった。得られた粉末の走査型電子顕微鏡写真を図９に示す。ＷＴ−ＧＬＰ−１亜鉛塩は、およそ２００から６００μｍほどの粉末でその断面は層状の構造を有しており、実施例５−２のペプチド１亜鉛塩粉末とは明らかに異なる固体構造を有していることが示唆された。
〔実施例５−３〕インビトロにおけるＧＬＰ１アナログ亜鉛塩の溶出速度評価
実施例５−２および比較例２で得られたＧＬＰ１アナログ亜鉛塩の白色粉末をそれぞれおよそ０．５ｍｇずつ８本の透析チャンバー（ＥａｓｙＳｅｐ：ＭＷＣＯ１４，０００）に秤取した。それぞれについて１本はスタンダードとして冷凍保存し、残り７本には１ｍＬの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を添加し、粉末をＶｏｒｔｅｘミキサーでよく分散した後、透析膜のキャップを取り付け、キャップを下側に向けた状態にした。分散した粉末が容器上部の壁面につかないようによく振ってから、フローターに装着し、１Ｌの０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に対して３７℃で平衡透析を行った。３時間、１日、２日、１週、２週、３週、４週後に透析チャンバーを回収し、遠心操作によってＧＬＰ１アナログ亜鉛塩の沈殿物と上清を分離し、デカンテーションによって上清を除去した。回収した沈殿物は凍結乾燥した。

スタンダードおよび凍結乾燥したサンプルに、１２０μｌの０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０含有０．０５Ｎ塩酸、４０μｌのＤＭＳＯ、４０μｌのアセトニトリルを添加することで溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチド量を測定した。

透析チャンバー内に残存していたペプチド量をスタンダードに対する１００分率として算出し時間に対してプロットした結果を図１０に示す。

ＧＬＰ１アナログ亜鉛塩の溶出は、３７℃、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中において２相性を示し、１日以内で３０％程度が溶出し、その後４週間はほぼ０次的な溶出パターンであった。
〔実施例６〕ＧＬＰ−１アナログ亜鉛含有溶液のｐＨ変動による固体化挙動及び徐放性評価
本発明に係るＧＬＰ−１アナログ（ペプチド１；配列番号１）は実施例４で得たものを用いた。

ＧＬＰ−１アナログの定量は実施例４で示した方法で行った。
〔実施例６−１〕ＧＬＰ−１アナログ亜鉛含有溶液のｐＨ変動による固体化挙動
ペプチド１を１５０ｍｇ／ｍＬになるように１０ｍＭ塩酸に溶解した。また塩化亜鉛を１５ｍｇ／ｍＬになるように１０ｍＭ塩酸に溶解した。ペプチド水溶液に１０ｍＭ塩酸、塩化亜鉛塩酸溶液の順に添加することで、最終容量で５０μＬ、最終濃度で１０ｍｇ／ｍＬ（１％ｗ／ｖ）および１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ｗ／ｖ）ペプチド、１０ｍＭ塩酸、塩化亜鉛はペプチドモル数に対してＺ／Ｐ＝１になるようにサンプルを調製した。これらのペプチド１亜鉛含有溶液を５０μｌずつ２ｍＬの５００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）にゆっくり滴下して外観を観察した。結果を図１１に示す。

ペプチド１の亜鉛含有塩酸溶液は、緩衝液によって中性（ｐＨ７．４）になることによって速やかに自発的に白色固体となった。ペプチド濃度が１％ｗ／ｖと１０％ｗ／ｖでは前者ではフワフワした微細な粒子状になったのに対して、後者では一塊の固体となった。このことからペプチド１亜鉛含有塩酸溶液を中性環境に投与した場合（例えば生体の皮下や局所など）、ｐＨ変動に伴い自発的に固体を形成し、またペプチド濃度によって粒子サイズの異なる固体化挙動が生じることが示唆された。
〔実施例６−２〕インビトロにおけるＧＬＰ−１アナログ亜鉛含有溶液の溶出速度評価
１ｍＬの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を１４本の透析チャンバー（ＥａｓｙＳｅｐ：ＭＷＣＯ１４，０００）に分注した。ここに実施例６−１と同様の方法で得られたペプチド１の１％ｗ／ｖおよび１０％ｗ／ｖ亜鉛含有溶液をそれぞれ７本ずつ、前者は１００μｌ、後者は１０μｌ（それぞれペプチド量として１ｍｇ）ずつ、ゆっくり滴下したところ、自発的な固体化挙動が観察された。またＨＥＰＥＳ緩衝液を分注していない透析チャンバーにそれぞれのＧＬＰ−１アナログ亜鉛含有溶液を１００μｌおよび１０μｌ分注し、スタンダードとして冷凍保存した。それぞれ７本のサンプルについてＶｏｒｔｅｘミキサーで軽く分散した後、透析膜のキャップを取り付け、キャップを下側に向けた状態にした。分散した粉末が容器上部の壁面につかないように振ってから、フローターに装着し、２Ｌの０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に対して３７℃で平衡透析を行った。３時間、１日、２日、１週、２週、３週、４週後に透析チャンバーを回収し、遠心操作によってＧＬＰ１アナログ亜鉛塩の沈殿物と上清を分離し、デカンテーションによって上清を除去した。回収した沈殿物は凍結乾燥した。

スタンダードおよび凍結乾燥したサンプルに、１２０μｌの０．０５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０含有０．０５Ｎ ＨＣｌ、４０μｌのＤＭＳＯ、４０μｌのアセトニトリルを添加することで溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチド量を測定した。

透析チャンバー内に残存していたペプチド量をスタンダードに対する１００分率として算出し時間に対してプロットした結果を図１２に示す。

亜鉛溶液から自発的に固体化したペプチド１亜鉛塩の溶出は、３７℃、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中において２相性を示し、１日で２０％程度の溶出し、その後４週間はほぼ０次的は溶出パターンであり、溶出量は１％ｗ／ｖ溶液では５０％程度、１０％ｗ／ｖでは２５％程度であった。実施例６−１の結果と併せて、ペプチド１亜鉛含有溶液は、中性環境で固体化した場合そのペプチド濃度によって固体化挙動および溶出速度が異なった。

Claims (11)

1. グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１アナログの３０位のアラニン（Ａｌａ³⁰）がＬｙｓ（Ｌｙｓ³⁰）またはアルギニン（Ａｒｇ³⁰）であるＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩。
2. グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１アナログの３０位のアラニン（Ａｌａ³⁰）がアルギニン（Ａｒｇ³⁰）に置換されている、請求項１に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩。
3. 置換されているＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｓｅｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｓｅｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｖａｌ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｖａｌ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｌｅｕ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｌｅｕ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｉｌｅ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ｉｌｅ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ｔｈｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ａｉｂ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、［Ａｉｂ8、³⁵］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂および［Ｔｈｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂から選択される、請求項１に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩。
4. アミノ酸配列が、
   Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号１）
   で表される、請求項１に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩。
5. 会合凝集化した、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩。
6. 亜鉛、銅、鉄、マンガン、カルシウム、ニッケル、アルミニウム、ナトリウムおよびカリウムから選択される１種以上の金属イオンを含む、請求項５に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−１アナログ、または医薬として許容されるその塩を含有する医薬組成物。
8. 会合凝集化したＧＬＰ−１アナログまたは医薬として許容されるその塩が、亜鉛、銅、鉄、マンガン、カルシウム、ニッケル、アルミニウム、ナトリウムおよびカリウムから選択される１種以上の金属イオンの添加により調製される、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 糖尿病、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症から選択される疾患の予防または治療のために使用される、請求項７または８に記載の化合物を含む医薬組成物。
10. 糖尿病がインスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）またはインスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）である、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−１アナログまたは医薬として許容されるその塩の有効治療量を患者に投与することを含む、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）などの糖尿病、高血糖症、およびそれらに起因する糖尿病性合併症、ならびに肥満症から選択される疾患の予防または治療方法。

Images