JP4629047B2 - Ｇｌｐ−１アナログ複合タンパク質 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ペプチドの生体内での半減期の延長に効果を有するタンパク質と融合させた、グルカゴン様ペプチドアナログに関する。これらの融合タンパク質は、糖尿病だけでなく他の様々な状況や疾患の処置にも使用することができる。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）アナログ及びその誘導体は、ＩＩ型糖尿病の処置への臨床試験で有望な結果を示している。ＧＬＰ−１にはインシュリン分泌の刺激やグルカゴン分泌の抑制、胃排出の抑制、胃運動や腸運動の抑制、及び体重減少の誘導といった数多くの生物学的効果がある。ＧＬＰ−１の重要な特性は、例えばインシュリン治療やインシュリンの発現増加に作用するような一部の経口治療を用いた際に見られる低血糖症に付随したリスク無しにインシュリン分泌を刺激することができる点である。

ＧＬＰ−１（１−３７）は活性が乏しいうえ、自然に生じる２種類の切断されたペプチド、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ及びＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２は生体内で速やかに排除され生体内半減期が著しく短いため、ＧＬＰ−１ペプチドを用いた治療の有用性はこれまで制限があった。内因的に生成されたジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）がＮ末のヒスチジンとアラニン残基を除去することによって循環しているＧＬＰ−１ペプチドを不活性化すること、そしてこれが、半減期が短い主な理由であることが知られている。

ＧＬＰ−１ペプチドの除去半減期を延ばすため、または、生物活性を維持する一方でペプチドの体内からのクリアランスを緩和するための様々な取り組みが行なわれてきた。一つの取り組みは、ＧＬＰ−１ペプチドを免疫グロブリンのＦｃ部分への融合することに関するものである。免疫グロブリンは一般的に生体内での循環半減期が長い。例えば、ＩｇＧ分子の半減期はヒトでは２３日にも及ぶことがある。免疫グロブリンのＦｃ部分は、この生体内での安定性の原因の一部である。ＧＬＰ−１−Ｆｃ 融合タンパク質は、ＧＬＰ−１分子の生物活性を保つ一方で、免疫グロブリンのＦｃ部分によって付与された安定性を利用している。

ＧＬＰ−１治療へのこの取り組みは実行可能であるが（国際公開特許第０２／４６２２７号参照）、様々な融合タンパク質を長期間に渡って繰返し投与する際の抗原性に関する一般的な懸念がある。一旦診断されたら生涯処置を続けなければならない糖尿病患者へのＧＬＰ−１−Ｆｃ融合治療は、この点が特に懸念される。加えて、Ｆｃ融合タンパク質治療は、Ｆｃ部分に不必要なエフェクター機能が残っていないかという懸念にもなりえる。

本発明は、長期間に渡って繰返し投与した後の免疫反応を誘発するリスクが軽減されエフェクター機能を有しない特定のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を同定することによって、免疫抗原性の可能性に関わる問題とＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の投与に付随するエフェクター活性に関する問題の克服を探るものである。これら特定の融合タンパク質では、この分子のＦｃ部分だけでなくＧＬＰ−１タンパク質部分の様々な位置での置換が行なわれている。本出願に記載の置換は、効力の増大、生体内での安定性の向上、エフェクター機能の排除、免疫系の適応要素によってこの分子が認識される可能性の減少を提供する。

本発明の化合物は、ＧＬＰ−１アナログを含む異種融合タンパク質を含み、前記ＧＬＰ−１アナログは、
ａ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
（配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙとＶａｌから選択される）、
ｂ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
（配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙとＶａｌから選択される）、
ｃ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
（配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙとＶａｌから選択される）、
ｄ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
（配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙとＶａｌから選択される）、
ｅ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
（配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙとＶａｌから選択される）、
ｆ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
（配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙとＶａｌから選択される）
から成るグループから選択された配列を含み、

Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１６−
Ｘａａ_１７−Ｘａａ_１８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘａａ_８０−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−
Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ_２３０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）

（配列中、１６番目のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＧｌｕであり、
１７番目のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＡｌａであり、
１８番目のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、またはＡｌａであり、
８０番目のＸａａは、Ａｓｎ、または Ａｌａであり、
２３０番目のＸａａは、Ｌｙｓ、または欠損である）、

以上のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を含む免疫グロブリンのＦｃ部分と融合されている。

本発明のＧＬＰ−１アナログタンパク質のＣ−末端とＦｃ部分のＮ−末端の異種融合タンパク質は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の配列をもつグリシンに富んだペプチドリンカーの１回、１．５回、または２回繰返しを介して互いに融合されることが好ましい。

本発明の異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞だけでなく、異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。また、本出願で考察されるインシュリン依存型糖尿病患者及び非依存型患者、肥満、そしてその他の様々な疾患および症状への、異種融合タンパク質の投与を含む処置方法も本発明に含まれる。

本発明の異種融合タンパク質はＧＬＰ−１アナログタンパク質とＦｃ部分を含む。ＧＬＰ−１アナログタンパク質とＦｃ部分は、ネイティブのＧＬＰ−１配列とヒトＩｇＧ４配列にそれぞれ置換を含むが、この置換は、ネイティブＧＬＰ−１またはＦｃ配列と融合させていないＧＬＰ−１アナログと比較して、このタンパク質に効力の増大と生体内での安定性を与え、同時にヒトにおいて長期間の繰返し投与の後に抗体形成を誘導する可能性を減少させる。

ネイティブＧＬＰ−１は生体内で分子から最初の６アミノ酸が切断されるプロセスを受ける。従って、当該分野の慣例によって、ＧＬＰ−１のアミノ末端は７番とし、カルボキシ末端を３７番となっている。ポリペプチドの他のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるように連続で番号付けされている。例えば、８番目はアラニンで、２２番目はグリシンである。プロセッシングされたペプチドは更に生体内でＣ−末端のグリシン残基が取り除かれアミド基に置換されるといった修飾が行なわれる可能性がある。従ってＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨとＧＬＰ−１（７−３６）アミドは、二つの野生型分子を表す。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、
^７Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−^１０Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−^１５Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−^２０Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−
^２５Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−^３０Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−^３５Ｇｌｙ−Ａｒｇ−^３７Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
である。

異種融合タンパク質のＧＬＰ−１アナログタンパク質は、野生型ＧＬＰ−１（７−３７）に関して第８番、２２番、及び３６番の位置に主要な置換が含まれている。第８番の位置の置換は、内因性のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）がアナログを不活性化する率を下げる。ＤＰＰ−ＩＶは、野生型ＧＬＰ−１を２番目と３番目のアミノ酸の間（第８番と９番の間）で切断し、その結果として分子の活性が落ちる。従って、本発明の異種融合タンパク質はＤＰＰ−ＩＶ耐性である。第２２番の位置の置換は、分子の凝集を緩和して分子の効力を高める。融合タンパク質全体の場合と同様に、第８番と２２番で変更があるアナログの第３６番の位置の置換は、融合タンパク質が繰返し長期間ヒトに投与した後に中和免疫反応を誘発するリスクを緩和する。

液性免疫および細胞性免疫双方の発生の中心イベントは、Ｔ−ヘルパー（Ｔ_Ｈ）細胞の活性化とクローン増殖である。Ｔ_Ｈ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）存在下でクラスＩＩ主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）分子に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体と、プロセスされた抗原ペプチドとの相互作用によって開始される。Ｔ_Ｈ細胞と抗原の相互作用は、休止Ｔ_Ｈ細胞を細胞周期に移行するように誘導（Ｇ_０期からＧ_１期への移行）する生化学的なイベントのカスケードである。活性化したＴ細胞は細胞周期を進め、増殖し、免疫記憶細胞やエフェクター細胞へと分化する。

次の配列は、エピトープの可能性を確認するために解析された。
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）

この配列は、ネイティブ配列の後にグリシンに富むリンカー配列の２コピー、その後ろにヒトＩｇＧ４由来のＦｃ領域の最初の１０アミノ酸が続くＧＬＰ−１アナログ配列を、第８番と２２番の位置で変更した配列である。本明細書で使用しているエピトープとは、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を指す。エピトープは、タンパク質全体を抗原とした際に抗体反応を誘発するタンパク質の部分と定義される。このパターンに含まれる情報を得るため、エピトープマッピングに伴う配列の９アミノ酸ウィンドーのスライドによるスキャンが高度統計解析法とあわせて用いられた。配列の解析とＴ細胞に提示された際に免疫反応を誘発する見込みが高いペプチドの同定にはエピマトリックス（ＥｐｉＭａｔｒｉｘ^ＴＭ）という専売ソフトウェアパッケージが用いられた。クラスＩＩＭＨＣ受容体相互作用の解析には非常に一般的な８つのアレルが用いられた。用いられたアレルは、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、および ＤＲＢ１＊１５０１である。

強力なエピトープが、ＧＬＰ−１アナログタンパクのＣ末端とリンカーの始めの連結部に位置することが予測された。このエピトープの配列は、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）で、ＤＲＢ１＊０８０１と相互作用する。本発明には、このエピトープがＧＬＰ−１アナログのＣ末端を以下の配列、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、および Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の１つのいずれかに変化することによって排除されうるという発見を含む。

本発明の異種融合タンパク質はヒトＩｇＧ４由来のＦｃ部分を含むが、ヒトの野生型配列と比較すると１ヶ所かそれ以上の置換基を含んでいる。本出願で用いる場合、免疫グロブリンのＦｃ部分とは免疫学の領域で一般的に用いられている用語の意味を持つ。特に、この用語は抗体の二つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を含まない抗体断片を指す。Ｆｃ部分は、非共有作用とジスルフィド結合を介して結合する抗体の両方のＨ鎖の定常部からなっている。Ｆｃ部分はヒンジ領域とＣＨ２およびＣＨ３ドメインから抗体のＣ末端まで渡る部分を含む場合がある。Ｆｃ部分には、更に、１以上の糖修飾部位が含み得る。

ヒト免疫グロブリンには異なるエフェクター機能と薬物動態学的特性をもつ５つのタイプがある。ＩｇＧは５つのタイプの中で最も安定で、ヒトの血清中半減期は約２３日である。ＩｇＧには４つのサブクラス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４）があり、それぞれ異なるエフェクター機能と呼ばれる生物学的機能があることが知られている。エフェクター機能は、一般的にＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用か、Ｃ１ｑとの結合および補体結合によって仲介される。補体因子への結合は補体を介した細胞の分解を引き起こすことができるのに対し、ＦｃγＲへの結合は、抗体依存細胞を介した細胞溶解を引き起こすことができる。異種Ｆｃ融合タンパク質を設計するにあたり、ここではＦｃ部分は単に半減期を延ばす能力のために利用されているため、他のエフェクター機能を最小限にすることが重要である。従って、ＦｃγＲと補体因子の結合能が他のＩｇＧサブタイプと比べて低いことから、本発明の異種融合タンパク質はヒトＩｇＧ４由来なのである。しかし、ＩｇＧ４ はヒトにおいて標的細胞を枯渇させると示されている[アイゼック（Ｉｓｓａｃｓ）ら、（１９９６）臨床および実験免疫学（Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０６：４２７−４３３）]。本発明の異種融合タンパク質はインシュリンの発現を誘導するために膵臓のベータ細胞を標的とすることから、Ｆｃ融合タンパク質にＩｇＧ４由来の領域を利用する場合、膵臓ベータ細胞上に存在するＧＬＰ−１受容体と融合タンパク質の相互作用を通じて膵臓ベータ細胞に対する免疫反応を惹起する可能性がある。従って、本発明の融合タンパク質の一部であるＩｇＧ４のＦｃ領域にはエフェクター機能を除去する置換を含む。本発明の融合タンパク質のＩｇＧ４のＦｃ部分には、第２３３番残基のグルタミン酸からプロリンへ、第２３４番残基のフェニルアラニンからアラニンまたはバリンへ、および第２３５番残基のロイシンからアラニンまたはグルタミン酸への置換が１ヶ所かそれ以上含まれている（ＥＵ番号）、[カバットＥ．Ａ．（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．）ら（１９９１）、免疫学的のためのタンパク質配列、第五版（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５^ｔｈ Ｅｄ．）米国健康福祉サービス部門（Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）、ＮＩＨ出版部（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）ｎｏ． ９１−３２４２]。これらの残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の第１６、１７、１８の位置に相当する。更に、ＩｇＧ４のＦｃ領域のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で第８０番の位置に相当する第２９７番残基（ＥＵ番号））のアスパラギンからアラニンへの置換によるＮ結合型糖鎖の付加部位が除去は、異種融合タンパク質の場合において残りのエフェクター効果の除去を確実にするもう一つの手段である。

加えて、本発明の異種融合タンパク質のＩｇＧ４のＦｃ部分は、Ｈ鎖二量体の形成を安定化させ半量体のＩｇＧ４−Ｆｃ鎖の形成を防ぐ置換を含んでいる。本発明の異種融合タンパク質は、ジスルフィド結合と種々の非共有作用によって互いに結合し、二量体として存在するのが望ましい。野生型ＩｇＧ４は、第２２４番残基（ＥＵ番号）から始まるＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）モチーフを含む。ＧＬＰ−１アナログ−Ｆｃ鎖の単量体では、このモチーフは別のＧＬＰ−１アナログ−Ｆｃ鎖の相当のモチーフと共にジスルフィド結合を形成する。しかし、モチーフにセリンが存在した場合、融合タンパク質の単鎖が形成されることになる。本発明は、第２２８番残基（ＥＵ番号）の位置がプロリン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７では１１番アミノ酸残基）に置換されるというような、ＩｇＧ４配列が更に変更された異種Ｆｃ融合タンパク質を含む。

ネイティブ分子に存在するＣ末端のリジン残基は、本出願で考察している異種融合タンパク質であるＩｇＧ４派生物のＦｃ部分では欠失している可能性がある（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の第２３０番の位置、除去されたリジンはｄｅｓ−Ｋと示されている）。リジンがＣ末のコドンにコードされている一部の細胞タイプ（例えばＮＳＯ細胞）で発現された融合タンパク質は、一部の分子でＣ末端アミノ酸がリジンで、一部はリジンが欠失しており、不均一である。この欠失は、一部のタイプのほ乳類細胞で発現される際のプロテアーゼの作用によるものである。従って、この不均一を回避するため、Ｆｃ融合体発現構築体は、リジンに対するＣ末端のコドンが欠けていることが好ましい。

本出願で考察されるＧＬＰ−１アナログタンパク質のＣ末端アミノ酸は、グリシンに富んだリンカー配列を介してＩｇＧ４のＦｃアナログ部分のＮ末端と融合されることが好ましい。本発明の異種融合タンパク質の生体内機能と安定性は、望ましくないドメインの相互作用の潜在的な可能性を防ぐための短いペプチドリンカーの付加によって至適化することが可能である。更に、グリシンに富むリンカーには多少の構造的柔軟性を与えるため、ＧＬＰ−１アナログタンパク質は膵臓のベータ細胞のような標的細胞上のＧＬＰ−１受容体と効果的に相互作用することができる。しかし、これらのリンカーは融合タンパク質が生体内で抗原となるリスクを著しく高める可能性がある。従って、望ましくないドメイン相互作用の防止、および／または生物活性の至適化、および／または安定性に必要な最低限の長さであることが好ましい。グリシンに富むリンカーの好ましい配列は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）から成る。本発明の異種融合タンパク質にはこのリンカーが複数コピーで用いられている可能性があるが、長期間の繰返し投与に付随する免疫抗原性のリスクを最小化するため、このリンカーはシングルコピーで用いられるのが好ましい。

本発明において好ましいＧＬＰ−１−Ｆｃ異種融合タンパク質は、次のタンパク質、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｎ２９７Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｎ２９７Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｎ２９７Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｎ２９７Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｎ２９７Ａ）、およびＧｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｎ２９７Ａ）、また以上全てのＶａｌ^８型およびｄｅｓ−Ｋ型を含む。

本出願で特定の異種融合タンパク質を指す名称は以下のように定義される。融合タンパク質のＧＬＰ−１部分における特定の置換は、置換された特定のアミノ酸の後にアミノ酸残基の番号を用いて表される。ＧＬＰ−１（７−３７）は、第７番のヒスチジンで始まり、第３７番のグリシンンで終わる成熟融合タンパク質のＧＬＰ−１部分を表す。Ｌは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の配列のリンカーを指す。Ｌの直前の番号は、ＧＬＰ−１部分をＦｃ部分から隔てるリンカーの数を指す。１．５Ｌと特定されたリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の配列を指す。ＩｇＧ４はヒトＩｇＧ４のＦｃ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で特定された配列のアナログを指す。異種融合タンパク質のＩｇＧ４のＦｃ部分における置換は括弧内に示される。野生型アミノ酸は一般的な略語の後にＥＵ番号システムを用いてＩｇＧ４配列全体の位置関係で位置番号を付し、その後ろに、その位置で置換されたアミノ酸を一般的な略語で特定する。

本発明の異種融合タンパク質は様々な異なる手法で作製が可能であるが、融合タンパク質のサイズ故に、組換え法が好ましい。本出願で公開、請求した本発明の目的のために、次の一般的な分子生物学用語と略語は以下のように定義される。

本出願で「塩基対」または「ｂｐ」と用いられるのはＤＮＡまたはＲＮＡを示す。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの略語は、ＤＮＡ分子において使われた場合に、デオキシリボヌクレオシドの５'リン酸型の（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）グアノシン、（デオキシ）チミジンにそれぞれ該当する。Ｕ、Ｃ、Ｇ、およびＡの略語は、ＲＮＡ分子において使われた場合に、リボヌクレオシドの５'リン酸型のウリジン、シチジン、グアノシン、アデノシンをそれぞれ該当する。ＤＮＡの二重鎖において、塩基対はＡとＴ、またはＣとＧの組み合わせを指す。ＤＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖の塩基対は、ＡとＵ、またはＣとＧの組み合わせを指す。（以下の「相補」の定義参照）

ＤＮＡの「消化」および「制限」は、ＤＮＡの特定の配列でのみ働く制限酵素を用いたＤＮＡの触媒的な開裂を指す（「配列特異的エンドヌクレアーゼ」）。本出願で用いられた様々な制限酵素は商業的に入手可能で、反応条件や補助因子、その他の必要条件は、当該分野での普通の技術のひとつとして知られる方法を用いた。特定の制限酵素の適切なバッファーと基質の量は、製造会社によって特定されているか、または文献で容易に見つかるものである。

「ライゲーション」は二つの二重鎖核酸断片の間のホスホジエステル結合の形成の過程を指す。別途規定しない限りは、ライゲーションはＴ４リガーゼといったＤＮＡリガーゼを用いて既知のバッファーおよび条件を用いて行ない得る。

「プラスミド」は染色体外（通常）自己複製遺伝要素を指す。

本出願で用いられる「組換えＤＮＡクローニングベクター」とは、プラスミドやファージを含むがこれらに限定されない、１つかそれ以上の付加的なＤＮＡ断片を追加できるかまたは既に追加されているＤＮＡ分子を含むあらゆる自律複製因子を指す。

本出願で用いられる「組換えＤＮＡ発現ベクター」とは、挿入されたＤＮＡの転写をコントロールするプロモーターが組込まれた、あらゆる組換えＤＮＡクローニングベクターを指す。

「転写」は、ＤＮＡの核酸配列に含まれる情報が相補的なＲＮＡ配列に写し取られる過程を指す。

「形質移入」は、コードされている配列の如何、発現の如何に関わらず、宿主細胞による発現ベクターの取込みを指す。例えば、カルシウムリン酸沈澱法、リポソーム移入法、電気穿孔法といった数多くの形質移入法が一般的な熟練技術者に知られている。移入の成功は、一般的に宿主細胞内でベクターの何らかの作用を指標に確認される。

「形質転換」は、ＤＮＡが複製されるように、染色体外因子として、または染色体への組み込みのいずれかによる生物へのＤＮＡの導入を指す。バクテリアや真核宿主の形質転換法が当該分野で周知であり、Ｊ．サムブルック（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９８９）にまとめられた、核注入法、プロトプラスト融合、または塩化カルシウムを用いたカルシウム処理によるものといった多くの手法がある。一般的に、酵母にＤＮＡを導入する際の形質転換という用語は、形質移入に相対して用いられる。

本出願で用いられる「翻訳」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の遺伝情報がポリペプチド鎖の合成を特定し、指令する過程を指す。

「ベクター」は細胞の形質移入および／または形質転換に用いられる核酸化合物を指し、遺伝子操作において適切なタンパク質分子に対応する適切な制御配列と組み合わせたポリヌクレオチド配列を持ち、形質移入および／または形質転換された宿主細胞に特定の特性を与える。プラスミド、ウィルス、およびバクテリアファージは適したベクターである。人工ベクターは、異なる供与源から制限酵素やリガーゼを用いてＤＮＡ分子を切断、結合することによって構築される。本出願で用いられる「ベクター」という用語は、組換えＤＮＡクローニングベクター、および組換えＤＮＡ発現ベクターを含む。

本出願で用いられる「相補的」または「相補性」とは、核酸二重鎖において水素結合を介して会合する塩基対（プリンとピリミジン）を指す。次の塩基対が相補的である。グアニジンとシトシン、アデニンとチミジン、アデニンとウラシル。

「プライマー」は、酵素的または合成的な伸長の開始基質として機能する核酸断片を指す。

「プロモーター」は、ＤＮＡからＲＮＡの転写を指示するＤＮＡ配列を指す。

「プローブ」は、他の核酸化合物とハイブリダイズする核酸化合物または核酸断片を指す。

「リーダー配列」は、興味のある望ましいポリペプチドを生成するために酵素的に、または化学的に除去され得るアミノ酸配列を指す。

「分泌シグナル配列」は、一般的にＮ末端領域に存在し、プリペプチドと小胞体のような細胞膜区画との会合の開始や、細胞膜を通じたポリペプチドの分泌に機能する長いポリペプチドアミノ酸配列を指す。

野生型ＩｇＧ４タンパク質は様々な出所から得られる。例えば、興味のあるｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現している細胞からｃＤＮＡライブラリーを調整し、そのｃＤＮＡライブラリーからそれらのタンパク質を得ることができる。ライブラリーは、興味のある特定の発表されたＤＮＡまたはタンパク質配列を用いて設計されたプローブでスクリーニングすることができる。例えば、免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖の定常部は、アダムズ（Ａｄａｍｓ）ら（１９８０）生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９：２７１１−２７１９、ゴーエット（Ｇｏｕｇｈｅｔ）ら（１９８０）生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９：２７０２−２７１０、ドルビー（Ｄｏｌｂｙ）ら（１９８０）全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）７７：６０２７−６０３１、ライス（Ｒｉｃｅ）ら（１９８２）全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）７９：７８６２−７８６２、フォークナー（Ｆａｌｋｎｅｒ）ら（１９８２）ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）２９８：２８６−２８８、および モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら（１９８４）年刊免疫学概説（Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２：２３９−２５６、といった文献の中で述べられている。

選択されたプローブを用いたｃＤＮＡライブラリー、またはゲノミックライブラリーのスクリーニングは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー研究所出版部（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）刊（１９８９）に述べられているような標準的な手法を用いて行われる。免疫グロブリンタンパク質をコードする遺伝子を単離する別の方法は、ＰＣＲ法を用いるものである［サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述；ディーフェンバック（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）ら、ＰＣＲプライマー：実験マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー研究所出版部（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）刊（１９９５）］。ＰＣＲプライマーは、発表された配列に基づいて設計することができる。

本発明の融合タンパク質の一部であるＧＬＰ−１アナログにより長い血漿半減期を付与することができるＩｇＧ４のＦｃアナログ断片を作製するための全長の野生型配列は、一般的に、ある特定のライブラリーからクローニングしてテンプレートとすることができる。ＩｇＧ４のＦｃアナログ断片は、望まれる断片の末端に対応する配列にハイブリダイズするように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ技術を利用して作成することができる。ＰＣＲプライマーは発現ベクターにクローニングできるように制限酵素サイトを設けるよう設計することもできる。

本発明のＧＬＰ−１アナログをコードするＤＮＡは、化学合成ＤＮＡだけでなく上述したクローニング手法を含む様々な手法で作成することができる。化学合成は短いコードペプチドの場合であれば魅力的であるかもしれない。ＧＬＰ−１のアミノ酸配列も、プレプログルカゴン遺伝子の配列も既に公表されている［ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら（１９８３）全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）８０：５４８５−５４８９、ベル（Ｂｅｌｌ）ら（１９８３）ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）３０２：７１６−７１８、ハインリックＧ．（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ， Ｇ．）ら（１９８４）内分泌学誌（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）１１５：２１７６−２１８１、ギグリオン（Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ， Ｍ．）ら（１９８４）糖尿病学誌（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）２７：５９９−６００］。従って、本出願で述べられているＧＬＰ−１アナログをコードするＤＮＡを作成するために、プライマーはネイティブ配列に基づいて設計できる。

融合タンパク質をコードする遺伝子は、本出願で述べられたＩｇＧＦｃタンパク質をコードするＤＮＡに、ＧＬＰ−１アナログをコードするＤＮＡをインフレームでライゲーションすることによって構築することができる。野生型ＧＬＰ−１とＩｇＧ４のＦｃ断片をコードするＤＮＡには、ライゲーションの前、または融合タンパク質全体をコードするｃＤＮＡに対して、のいずれかで変異を導入することができる。様々な変異誘発技術が当該分野において周知である。ＧＬＰ−１アナログをコードする遺伝子と、ＩｇＧ４のＦｃアナログタンパク質をコードする遺伝子は、グリシンに富むリンカーペプチドをコードするＤＮＡを介してインフレームで結合することもできる。本発明のうちの、ある好ましい異種融合タンパク質の一つである、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４ （Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，ｄｅｓ Ｋ） をコードする好ましいＤＮＡ配列は、以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０として提供される。
ＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）

宿主細胞は、本出願で述べている異種融合タンパク質の生成のための発現ベクターまたはクローニングベクターで形質移入または形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、もしくは望ましい配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に変更を加えた通常の栄養培地で培養された。例えば培地、温度、ｐＨ、またそれに類する培養条件は、熟練技術者により過度の実験なしに選択される。一般的に、細胞培養の生産性を最大化する原理、プロとコール、および実地の技術は、ほ乳類細胞のバイオテクノロジー：実践的アプローチ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｍ．バトラー（Ｍ． Ｂｕｔｌｅｒ）編（ＩＲＬ 出版（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９９１）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前述）に記載されている。また例えばカルシウムリン酸沈澱法や電気穿孔法といった形質移入手法は、熟練した当該分野の技術者に普通に知られている。ほ乳類細胞を用いた宿主系の形質転換についての一般的な側面は、米国特許第４，３９９，２１６号で述べられている。酵母への形質転換は一般的には、ヴァン・ゾーリンゲン（ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ） 等 細菌学誌（Ｊ Ｂａｃ）１３０（２）： ９４６−７（１９７７）、およびシャオ（Ｈｓｉａｏ）等、全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）７６（８）：３８２９−３３（１９７９）の方法に従って行なわれた。一方、例えば核マイクロインジェクション手法や電気穿孔法、バクテリアプロトプラストの無処理細胞との融合、ポリブレンやポリオミチンといったポリカチオンなど、細胞へＤＮＡを導入するためのその他の方法も用いられる。ほ乳類細胞の形質転換の様々な技術については、キーオン（Ｋｅｏｗｎ）ら、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１８５：５２７−３７（１９９０）、およびメンサー（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）３３６（６１９７）：３４８−５２（１９８８）を参照のこと。

本出願のベクターで核酸（例えばＤＮＡ）をクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞には、酵母または高等真核細胞がある。

糸状菌または酵母のような真核微生物は、融合タンパク質ベクターのクローニングや発現宿主として適している。サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母）は、一般に用いられる下等真核宿主微生物である。その他には、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、出芽酵母） [ビーチ（Ｂｅａｃｈ）およびナース（Ｎｕｒｓｅ）、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）２９０：４０−３（１９８１）、欧州特許第１３９，３８３号、１９９５年５月２日公表］、クルイヴェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主[米国特許第４，９４３，５２９号、フリーア（Ｆｌｅｅｒ）等、バイオテクノロジー誌（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９（１０）：９６８−７５（１９９１）］ の例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、キラー酵母）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４）[ドゥ・ルーヴェンコート（ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ）等、細菌学誌（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１５４（２）：７３７−４２（１９８３） ］、Ｋ．フィアジリス（Ｋ． ｆｉａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィッケラミ（Ｋ ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（Ｋ ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６．９０６）[ヴァン・デン・バーグ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ）等、バイオテクノロジー誌（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）８（２）：１３５−９（１９９０）］、Ｋ．テルモトイエランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｉｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルシアヌス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ、キラー酵母）、ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ、アルカン資化酵母）（欧州特許第４０２，２２６号）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、メタノール資化酵母）（欧州特許第１８３，０７０号） [スリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）等、基礎微生物学誌（Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２８（４）：２６５−７８（１９８８）］、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、アカパンカビ）[ケイス（Ｃａｓｅ）等、米国科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ）７６（１０）：５２５９−６３（１９７９）］、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）のシュワニオマイセス・オシデントゥリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔｕｌｉｓ）（欧州特許第３９４，５３８号、１９９０年１０月３１日公表）、および、例えば糸状菌類のニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（国際公開第９１／００３５７号、１９９１年１月１０日公表）、そしてアスペルジラス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主のＡ．ニドゥランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）[バランス（Ｂａｌａｎｃｅ）等、生物化学生物物理学研究コミュニケーション誌（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．）１１２（１）：２８４−９（１９８３）、Ｔｉｌｂｕｒｎ等、遺伝子誌（Ｇｅｎｅ）２６（２−３）：２０５−２１（１９８３）、イェルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）等、米国科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）８１（５）：１４７０−４（１９８４）］、およびＡ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）[ケリー（Ｋｅｌｌｙ）およびハインズ（Ｈｙｎｅｓ）、欧州分子生物学機構会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．）４（２）：４７５−９（１９８５）］がある。メタノール資化性酵母はハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、および属ロドトルイア属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｉａ）から選択された。この種類の酵母の具体例としての特定種のリストは、 Ｃ．アントニー（Ｃ． Ａｎｔｏｎｙ）、メタノール資化性微生物の生化学（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ）２６９（１９８２）に見出され得る。

本発明の融合タンパク質の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物由来の細胞である。例えば、植物細胞だけでなく、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ショウジョウバエ）Ｓ２細胞やスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の スポドプテラ・ハイ５（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｈｉｇｈ５）細胞といった昆虫細胞を含む。有用なほ乳類細胞系統の例としては、ＮＳＯ骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２細胞、およびＣＯＳ細胞がある。より特異的な例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）で形質転換したサル腎臓のＣＶ１細胞系、ヒト胎児の腎臓細胞系[懸濁培養での増殖性でサブクローンした２９３または２９３ 細胞、グレアム（Ｇｒａｈａｍ）等、総合ウィルス学誌（Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．）３６（１）：５９−７４（１９７７）］、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ[ＣＨＯ細胞、ウーラオプ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、米国科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）７７（７）：４２１６−２０（１９８０）］、マウスセルトリー細胞[ＴＭ４，マザー（Ｍａｔｈｅｒ）、生殖生物学誌（Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．）２３（１）：２４３−５２ （１９８０）］、ヒト肺細胞（Ｗ１３８細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ＨＢ ８０６５）、およびマウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）がある。本発明のＦｃ融合タンパク質を生成するのに好ましい細胞系はＮＳＯ骨髄腫細胞系で、欧州培養細胞コレクション（ＥＣＡＣＣ，カタログ番号８５１１０５０３）から得ることができ、ガルフレＧ．（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ．）とミルステインＣ．（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．）[（１９８１）酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７３（１３）：３−４６、およびモノクローナル抗体の調整：戦略と過程（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）ニューヨークアカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．）刊、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）］の文献で述べられている。

本発明の融合タンパク質は、組み替えで直接、もしくは成熟融合タンパク質のＮ末端で特異的な切断部位を生じるようなシグナル配列またはその他の付加配列をもつタンパク質として生成することができる。一般的に、シグナル配列はベクターの構造要素であったり、ベクターに挿入された融合タンパク質をコードするＤＮＡの一部分であったりする。酵母での分泌のためのシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー配列、アルファーファクターリーダー配列（サッカロマイセス属および クルヴェロマイセス属のｃｃファクターリーダー配列を含む。後者は米国特許第５，０１０，１８２号で述べられている］、もしくは酸性フォスファターゼリーダー配列、Ｃ．アルビカンスのグルコアミラーゼリーダー配列（欧州特許第３６２，１７９号）、または国際公開特許第９０／１３６４６号で述べられているシグナル配列がある。ほ乳類細胞での発現では、例えば同種または類縁の種の分泌ペプチドのシグナル配列やウィルスの分泌リーダー配列といった、ほ乳類のシグナル配列がタンパク質の分泌の指示に用いられる。

発現ベクターとクローニングベクターは共に、一つ以上の選ばれた宿主細胞内でベクターの複製が可能となるような核酸配列を含んでいる。発現ベクターおよびクローニングベクターには、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいるのが普通である。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えば、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンといった抗生物質や毒素への耐性を与える、（ｂ）栄養欠乏症を補う、または（ｃ）例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしている。

ほ乳類細胞の適切な選択マーカーとして適切なものの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのように、融合タンパク質をコードする核酸の取込み能がある細胞の識別が出来るようにするものである。野生型ＤＨＦＲが採用された場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損しているＣＨＯ細胞系であり、その調整と増殖については以下の文献に述べられている[ウーラオプ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、米国科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）７７（７）： ４２１６−２０（１９８０）］。酵母で用いる適切な選択遺伝子は、酵母のＹＲｐ７ プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である[スティンチコーム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）等、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）２８２ （５７３４）：３９−４３（１９７９）、キングズマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）等、遺伝子誌（Ｇｅｎｅ）７（２）：１４１−５２（１９７９）、チャンパー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）等、遺伝子誌（Ｇｅｎｅ）１０（２）：１５７−６６（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ． ４４０７６ または ＰＥＰＣ１[ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、遺伝学誌（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）８５：２３−３３（１９７７）］のようなトリプトファン中での増殖が出来ない酵母変異株への選択マーカーとなる。

発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常融合タンパク質をコードしている核酸配列に、ＲＮＡ合成指示の機能を果たすように操作可能なように連結されたプロモーターを含んでいる。様々な考えうる宿主細胞に認識されるプロモーターは、よく知られている。酵母宿主へ用いる適切な促進配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター[ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）等、生物化学誌（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）２５５（２４）：１２０７３−８０（１９８０）］や、エノラーゼ、グリセルアルデヒド三リン酸デハイドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホグルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルコキナーゼといった、その他の解糖系の酵素[ヘス（Ｈｅｓｓ）等、応用酵素誌（Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．）７：１４９（１９６８）、ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）、生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１７（２３）：４９００−７（１９７８）］がある。その他の酵母のプロモーターで、増殖条件による転写コントロールの更なる利点がある誘導性のプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関わる分解酵素であるメタロチオネイン、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトース利用に関わる酵素のプロモーター領域がある。酵母での発現に用いる適切なベクターとプロモーターは欧州特許第７３，６５７号で更に述べられている。融合タンパク質をコードしているｍＲＮＡのほ乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば宿主細胞系と用意されたプロモーターに互換性がある、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシのパピローマウィルス、鳥の肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、およびサルウィルス４０（ＳＶ４０）といったウィルスゲノムから得られるプロモーターや、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモータといった異種のほ乳類プロモーター、またヒートショックプロモーターによって制御されうる。

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって高めることができる。エンハンサーは通常約１０から３００ ｂｐで、プロモーター上で作用して転写を増やす、ＤＮＡのシス作用性要素である。ほ乳類遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−ケトタンパク質、およびインシュリン）から多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウィルスからのエンハンサーの一つが使われる。実施例は、複製オリジン後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０番塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製オリジンの後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、融合タンパク質コード配列の５’もしくは３’の位置でベクターにスプライスされてもよいが、プロモーターから５’側に位置するのが好ましい。

真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、もしくはその他の多細胞生物由来の核のある細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終了およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含んでいる。そのような配列は、一般的に真核生物かウィルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの、５’、時には３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチド部分を含む。

様々な種類の融合タンパク質が、培養液や宿主細胞溶菌液から回収される。もし膜に結合していれば、適切な界面活性剤（例えば、トライトン−Ｘ１００（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００））を用いて膜から遊離させることができる。融合タンパク質の発現に利用された細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械破壊、または細胞溶解剤といった様々な物理的、または化学的手段によって破壊される。

いったん本発明の異種融合タンパク質が適切な宿主細胞で発現されれば、アナログタンパク質は分離、精製される。以下の過程は、適当な精製過程の具体例である。カルボキシメチルセルロースによる分画、セファデックスＧ−２５といったゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）やモノ−Ｑ（Ｍｏｎｏ−Ｑ）といった陰イオン交換樹脂、ＣＭやモノ−Ｓ（Ｍｏｎｏ−Ｓ）などの陽イオン交換、エピトープタグ型のポリペプチドを結合させるメタルキレートカラム、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、シリカゲル、エタノール沈澱、および硫安沈澱。

タンパク質精製の様々な方法が利用されてよい。また、そのような方法は当該技術分野において周知であり、例えばドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１８２：８３−９（１９９０）、およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、タンパク質精製：原理と実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、ニューヨーク、スプリンガーフェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ）刊（１９８２）に記述されている。精製の段階は、用いた生成の過程や生成された融合タンパク質固有の性質によって選択される。例えば、Ｆｃ断片を含む融合タンパク質は、プロテインＡかプロテインＧのアフィニティーマトリックスを用いて効果的に精製できる。アフィニティーマトリックスからの融合タンパク質の溶出には、低ｐＨ、または高ｐＨバッファーを用いることができる。融合タンパク質の不可逆的な変性を防ぐうえで、穏やかな溶出条件が助けになる。

本発明の異種融合タンパク質は、一つかそれ以上の添加剤と共に調整されてよい。本発明の融合タンパク質は、医薬上許容できるバッファーと組み合わされ、許容できる安定性を与え、腸管外投与のような投与に許容できるｐＨに調節され得る。任意で、医薬上許容できる一つかそれ以上の抗菌剤が添加されてよい。メタクレゾールおよびフェノールは、医薬上許容できる望ましい微生物剤である。医薬上許容できる一つかそれ以上の塩が、イオン強度または張性を調節するために加えられてよい。製剤の等張性を調節するため、更に一つかそれ以上の添加剤が加えられてよい。グリシンは等張性を調節する添加剤の例である。医薬上許容できるという意味は、ヒトもしくは動物への投与に適しており、従って有害な要素や望ましくない夾雑物を含まず、有効化合物の活性を妨げないという意味である。

本発明の異種融合タンパク質は、液剤、または適当な希釈で再構成できる凍結乾燥粉末として製剤することができる。凍結乾燥された剤形は、融合タンパク質が安定する方法の一つであり、溶液のｐＨを維持する緩衝能の有無に関わらず、再構成した製品の安定性は、指定された一般に用いられている有効期限を越える。本出願で考察された異種融合タンパク質を含む凍結乾燥する前の液剤が実質的に等張で、再構成後の溶液を等張にできれば好ましい。

本発明の異種融合タンパク質の医薬上許容できる塩のタイプは、本発明の範囲に含まれている。酸付加塩を形成するのに一般的に利用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸といった無機酸や、ｐ-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ブロモフェニールスルホン酸、炭酸、安息香酸、酢酸などといった有機酸である。好ましい酸付加塩は、塩酸や臭化水素酸のような無機酸である。

塩基付加塩には、アンモニウム、またはアルカリ、または水酸化アルカリ土類金属、炭酸塩、炭酸水素塩などのような無機塩基由来のものがある。このような塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどの本発明の塩を調整するのに有用である。

本発明の異種融合タンパク質には生物活性がある。生物活性とは、融合タンパク質が生体内でＧＬＰ−１受容体に結合して活性化し、反応を誘導する能力を指す。ＧＬＰ−１によって誘導される反応とは、インシュリンの分泌、グルカゴンの抑制、食欲の抑制、体重減少、満腹感の誘導、アポトーシスの抑制、膵臓のベータ細胞増殖の誘導、膵臓のベータ細胞分化の誘導を含むが、これらに限定されない。代表的な数のＧＬＰ−１融合タンパク質が生体内同様に生体外でも活性が試験された。実施例１および実施例２は、融合タンパク質のヒトＧＬＰ−１受容体との相互作用と活性化能に基づいた生体外活性を示す。双方一連の試験は、ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞が用いられた。ＧＬＰ−１受容体は、環状ＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）により制御されるレポーター遺伝子の発現誘導によって、細胞がアデニリルシクラーゼの活性化することによって活性化される。実施例１（表１）はレポーター遺伝子がベータラクタマーゼの場合、実施例２（表２）はレポーター遺伝子がルシフェラーゼの場合のデータを示す。実施例３は、本発明の異種融合タンパク質の一つをラットに投与後のデータを示す。データは全体として、融合タンパク質がＧＬＰ−１受容体に結合し、活性化できるということ示し、生体外ではＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨより効果があるようにみえる。加えて、ラットでのデータは、融合タンパク質が生体内で活性であり、ネイティブＧＬＰ−１より半減期が長いことを示した。

異種融合タンパク質は、通常の技術を有する医師に効果があると知られているあらゆる経路を通じて投与されてよい。末梢腸管外経路はそのうちの一つである。腸管外投与は一般的に滅菌注射器やその他のインフュージョンポンプといった医療機器によって、製剤を体内に注射することとして医学文献上理解されている。末梢腸管外経路は、静脈、筋肉内、皮下、腹腔内経路の投与が含まれる。

本発明の異種融合タンパク質は、非腸管外経路である経口、直腸、鼻腔、または下部呼吸器経路による投与にも従うことができる。これらの非腸管外経路のうち、下部呼吸器経路および経口経路が好ましい。

本発明の融合タンパク質は、広範囲の疾患や症状の処置に用いることが出来る。本発明の融合タンパク質は、「ＧＬＰ−１受容体」と呼ばれる受容体に作用することによって、その生物学的効果を主に発揮する。そのために、ＧＬＰ−１受容体の刺激、またはＧＬＰ−１化合物の投与が好ましく反応する疾患および／また症状を伴う患者は、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質によって処置できる。これらの対象は「ＧＬＰ−１化合物による処置が必要である」、または「ＧＬＰ−１受容体刺激が必要である」と表現される。これには、インシュリン比依存性糖尿病、インシュリン依存性糖尿病、脳卒中（国際公開特許第００／１６７９７号参照）、心筋梗塞（国際公開特許第９８／０８５３１号参照）、肥満（国際公開特許第９８／１９６９８号参照）、外科手術後の異化作用の変化（米国特許第６，００６，７５３号参照）、機能性消化不良および過敏性腸症候群（国際公開特許第９９／６４０６０号参照）の患者が含まれる。また、ＧＬＰ−１化合物による予防処置が必要な、例えばインシュリン非依存性糖尿病の発症の恐れのある患者（国際公開特許第００／０７６１７号参照）も含まれる。インシュリン非依存性糖尿病を発症する危険があるのは、耐糖能障害もしくは空腹時血糖異常の患者、患者の身長と体格に対して標準より約２５％体重が多い患者、膵臓部分切除を行なった患者、一人以上の両親にインシュリン非依存性糖尿病がある患者、妊娠性糖尿病の病歴がある患者、および急性または慢性的な膵炎に罹ったことのある患者である。

本出願で述べられたＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の効果的な量は、ＧＬＰ−１受容体刺激が必要な患者に投与した場合に、容認できない副作用を伴わずに治療効果および／また予防効果が望ましい結果になる量である。「望ましい治療効果」とは、以下の一つ以上を満たすものである；１）疾患または症状に関連する症候の回復、２）疾患または症状に関連した症候開始の遅延、３）処置しなかった場合と比較して寿命が延びること、４）処置しなかった場合と比較したクオリティー・オブ・ライフの向上。例えば、糖尿病の処置に対するＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の「効果的な量」は、処置しなかった場合と比較して血糖制御の向上をもたらし、その結果網膜障害、神経障害または腎臓病といった糖尿病合併症の発症を遅延させる量である。糖尿病予防におけるＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の「効果的な量」は、処置しなかった場合と比較して、スルホニル尿素、チアゾリジン誘導体、インシュリンおよび／またビスグアニジンといった血糖降下薬による処置が必要な高血糖レベルの発症を遅らせる量である。

患者の血糖の正常化に効果的な融合タンパク質の用量は、例えば患者の性別、体重、年齢、血糖制御不能の重症度、投与の経路、および生物活性、融合タンパク質の薬物動態学的特性、効力、剤形を含むが、これに限定されない、数々の因子に依存する。用量は、０．０１から１ ｍｇ／体重ｋｇの範囲でよいが、０．０５から０．５ ｍｇ／体重ｋｇの範囲である事が好ましい。

本発明の融合タンパク質が、２週間に一度、もしくは１週間に一度いずれかで投与されるのが好ましい。処置される疾患によって、１週間に２、３回といったより頻繁に融合タンパク質の投与が必要になる場合もある。

ここで、以下の実施例を非限定的な実施例としてのみ参照し、本発明を説明する。

実施例１−生体外におけるＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ
ＣＲＥ−ＢＬＡＭシステムを用いたヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、ポリ−ｄ−リジンコーティングされた底面が透明な黒い９６穴プレートに、１ウェルあたり１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１００ μｌ中、２０，０００から４０，０００細胞の密度で播種した。播種翌日、培地を除き、血漿を含まないＤＭＥＭ培地８０ μｌを添加した。播種後３日目に、用量反応曲線を得るために、異なる濃度の様々なＧＬＰ−１−Ｆｃ異種融合タンパク質を含む０．５％ＢＳＡ含有血漿不含ＤＭＥＭ培地２０ μｌをそれぞれのウェルに加えた。通常、３ｎｍｏｌから３０ｎｍｏｌまでの異種ＧＬＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む１４個の希釈物を用いて、ＥＣ_５０値を決定する用量反応曲線を作成した。融合タンパク質とのインキュベーション５時間後、β−ラクタマーゼ基質２０ μｌ（ＣＣＦ２／ＡＭ，パンヴェラ社（ＰａｎＶｅｒａ ＬＬＣ））を加え、１時間インキュベートを続け、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ（蛍光プレートリーダー）上で蛍光を測定した。このアッセイについては、ズロカーニック（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ）等、（１９９８）サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７８：８４−８８で更に述べられている。種々のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質をテストし、ＥＣ_５０値を表１に示した。この値は、全実験で、内部標準として行なったＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの結果に対する相対値としてもとめた。

実施例２−生体外におけるＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ
ＣＲＥ−ルシフェラーゼ系を用いたヒトＧＬＰ−１受容体を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、９６穴プレートに１ウェルあたり低血清ＤＭＥＭ Ｆ１２培地８０ μｌ中、３０，０００細胞の密度で播種した。播種翌日、０．５％ＢＳＡに溶解したテストタンパク質を２０μｌの一定分量で混合し、細胞と共に５時間インキュベートした。通常、３ｐｍｏｌから３ｎｍｏｌを含む１２個の希釈物を各テストタンパク質用に５倍濃度で調整し、細胞に添加し、ＥＣ_５０値を決定する用量反応曲線を作成した。インキュベーション後、ルシフェラーゼ試薬１００ μｌをそれぞれのプレートに直接加え、２分間穏やかに混合した。プレートをＴＲＩＬＵＸ社のルミノメーターに置き、ルシフェラーゼ発現の結果により生じる発光を測定した。種々のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質をテストし、ＥＣ_５０値を表２に示した。この値は、全実験で、内部標準として行なったＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの結果に対する相対値としてもとめた。以下でテストした融合タンパク質は二量体であるため、値をモル濃度にして２倍の違いを考慮して補正した。

実施例３−ラットにおける静脈内糖負荷試験
Ｆｃ融合タンパク質、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｌ−ＩｇＧ４ （Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を、ラットにおける静脈内糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）にて評価した。３グループそれぞれには、少なくともラット４匹が含まれている。グループＩには溶媒を投与し（表３）、グループＩＩ にはＧｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、１．７９ ｍｇ／ｋｇを一回の皮下注射にて投与し（表４）、グループＩＩＩにはＧｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｌ−ＩｇＧ４ （Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、０．１７９ ｍｇ／ｋｇを一回の皮下注射にて投与した（表５）。ラットを、第一日目の朝、皮下注射した。初回の注射から２４時間後、ラットの体重１グラムあたり１ μＬのグルコース（Ｄ５０）をボーラス投与した。血液試料を、グルコースボーラス投与２、４、６、１０、２０および３０分後に採取した。

実施例４−カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ）への一回の皮下注射後の薬物動態学的調査
雄のカニクイザルにＦｃ融合タンパク質、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）を０．１ ｍｇ／ｋｇ皮下注射（ＳＣ）した際の薬物動態（ＰＫ）を明らかにするために試験を行った。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）抗体はＧＬＰの中間部分に特異的である。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、Ｎ末端特異的な捕捉抗体、およびＦｃ特異的な検出抗体を用いる。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、双方から得られた血漿濃度の結果を、この薬物動態パラメーター値の決定に用いた。

薬物動態（ＰＫ）パラメーター値の代表例を、表６に要約した。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による皮下注射単回用量の薬物動態（ＰＫ）は、平均Ｃ_ｍａｘが４４６．７ ｎｇ／ｍＬであって、対応する平均Ｔ_ｍａｘが１７．３時間である。平均消失半減期は約７９．３時間（３．３日）である。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法による薬物動態（ＰＫ）は、平均Ｃ_ｍａｘが２９２．２ ｎｇ／ｍＬであって、対応する平均Ｔ_ｍａｘは１６．７時間である。平均除去半減期は約５１．６時間（２．２日）である。

ａ：観察された最大血漿濃度
ｂ：最大血漿濃度が観察された時間
ｃ：血漿濃度−時間曲線の０から無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ）
ｄ：除去半減期
ｅ：生物学的利用能に対する全身クリアランス
ｆ：生物学的利用能に対する分布容積
ＳＤ：標準偏差

実施例５−反復皮下注射後の潜在的な抗体形成の評価
カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の所定の血清試料を、Ｇｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）に対する抗体形成を直接吸着法による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法を用いてテストした。マイクロタイタープレートを０．１ μｇ／ｍＬの濃度のＧｌｙ^８−Ｇｌｕ^２２−Ｇｌｙ^３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）でコーティングした。サル血清試料をブロッキング溶液で５０倍、５００倍、１０００倍および５０００倍に希釈して、ウェル当たり０．０５ ｍＬで約１時間インキュベートした。二次抗体、ヤギ抗ヒトＦａｂ'２ペルオキシダーゼ結合抗体（ヒトとの交差反応性は７５％）を、ブロッキング溶液にて１０，０００倍に希釈され、ウェル当たり０．０５ｍＬで約１時間インキュベートした。テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）基質を用いた発色を、４５０ｎｍ−６３０ｎｍの吸光度で測定した。２回の計測値を平均した。ＧＬＰ−１抗体をポジティブコントロールに用い、検出に用いる二次抗体にはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ結合抗体を用いた。抗体形成の可能性を評価するため、血清試料を、投薬前、２回目の投薬の２４時間後、１回目、２回目の皮下注射投薬１６８時間後に採取した。Ｇ８Ｅ２２−ＣＥＸ−Ｌ−ｈＩｇＧ４に対する抗体力価の有無は、投薬前の血清とポジティブコントロールの比較によって解釈された。該当結果は、表７に示す。

実施例６−絶食状態および段階的な静脈グルコース点滴中のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙｓ）への一回の皮下注射後の薬物動態学的調査
段階１（研究第１日）で、溶媒の皮下注射を行った。次いで、５、１０、および２５ ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの段階的な静脈グルコース（２０％グルコース）点滴を溶媒注射後直ちに行った。段階２（研究第２日）では、ＧＬＰ−１融合タンパク質（０．１ ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を行った。段階３では、ＧＬＰ−１融合タンパク質の注射後、およそ９６時間の段階的な静脈グルコース点滴を行った。

段階的な静脈グルコース点滴の処置を、前夜１６時間の絶食後の鎮静剤を施したサルに行った。双方の静脈グルコース点滴について、ベースラインを定めるため、ベースライン試料を２０分間１０分ごとに採取した。ステップアップグルコース点滴を、開始２０分目に５ ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの速度で始め、その後１０ ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ、および２５ ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎで点滴した。それぞれの点滴速度を、２０分間行った。血液試料を、グルコース、インシュリン、グルカゴンの測定のために１０分間隔で採取した。段階１および３の点滴開始前２０分、１０分、０分、およびグルコース点滴後１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分に、血液を約１．０ ｍＬ採取した。

このデータを表８に示す。

グルカゴンレベルは、溶媒およびＧＬＰ−１融合タンパク質投与サル間において統計的相違は無かった。

実施例７−絶食状態および段階的な静脈グルコース点滴中のラットへの３つの異なる投薬量による一回の皮下注射後の薬物動態学的調査
カニューレを常置したラットは、溶媒コントロール（生理食塩水）もしくは３つの処置グループの一つ（ＧＬＰ−１融合タンパク質、０．０１７９ ｍｇ／ｋｇ、０．１７９ ｍｇ／ｋｇ、または １．７９ ｍｇ／ｋｇ）のいずれかに割り当てられた。ＧＬＰ−１融合タンパク質および溶媒を、皮下注射にて投与した。処置２４時間後、前夜絶食させた（１６時間）ラットを、段階的静脈グルコース点滴試験の対象とした。段階的グルコース点滴を、ベースラインの生理食塩水期間（２０分）、その後それぞれ５および１５ ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの２回の３０分間のグルコース点滴段階で構成した。血漿試料を、グルコース点滴前（ベースライン）２０分、１０分、０分、およびグルコース点滴後１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分に採取した。

このデータを表９に示す。

Claims (4)

1. ＧＬＰ−１アナログを含む異種融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ−１アナログは、
   ａ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
   Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
   Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
   Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
   Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
   （配列中、Ｘａａ_８はＧｌｙである）、
   を含み、前記ＧＬＰ−１アナログは、
   Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
   Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１６−
   Ｘａａ_１７−Ｘａａ_１８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
   Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
   Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
   Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−
   Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
   Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
   Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
   Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘａａ_８０−
   Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−
   Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−
   Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−
   Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
   Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−
   Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
   Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
   Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
   Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−
   Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−
   Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
   Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
   Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
   Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
   Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−
   Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−
   Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
   Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ_２３０
   （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
   （配列中、１６番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、
   １７番目のＸａａは、Ａｌａであり、
   １８番目のＸａａは、Ａｌａであり、
   ８０番目のＸａａは、Ａｓｎであり、
   ２３０番目のＸａａは、欠損である）、
   上記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を含む免疫グロブリンのＦｃ部分と融合されており、該異種融合タンパク質はさらに以下の配列のペプチドリンカーを含み、
   Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、
   ここで、ペプチドリンカーのＮ−末端のグリシンが、前記ＧＬＰ−１アナログのＣ−末端のグリシン残基と直接融合しており、ペプチドリンカーのＣ−末端のセリンが前記Ｆｃ部分のＮ−末端のアラニンと直接融合している、異種融合タンパク質。
2. 請求項１に記載の異種融合タンパク質を含有する、医薬組成物。
3. インスリン非依存性糖尿病を処置するための、請求項１に記載の異種融合タンパク質を含有する、医薬組成物。
4. 体重過多の患者において肥満を処置するためのまたは体重減少を誘導するための、請求項１に記載の異種融合タンパク質を含有する、医薬組成物。