CN101891823B - 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种exendin-4及其类似物融合蛋白和相应的多核苷酸序列，载体，宿主细胞和药物组合物，其制备方法和应用。该融合蛋白是由exendin-4及其类似物与人免疫球蛋白IgG2-Fc通过特定的连接肽融合而成，具有更好的稳定性和延长的体内半衰期。可以通过局部给药、气雾剂、注射剂的方式施用。这种融合蛋白能够促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞的数量，促进胰岛素的分泌，提升机体对胰岛素的敏感性。用于治疗糖尿病和肥胖症以及通过降低血浆葡萄糖、抑制胃肠运动、胃排空而受益的其他疾病。

Description

一种Exendin-4及其类似物融合蛋白
技术领域
本发明涉及一种长效的Exendin-4及其类似物融合蛋白和相应的多核苷酸序列，载体，宿主细胞和药物组合物，其制备方法和应用。属于生物基因工程技术领域。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus)是一种严重危害人类健康的疾病，根据世界卫生组织最近统计，2000年全球糖尿病患者达到1.71亿，2030年预计全球患者将会达到3.66亿，导致全球每年有320万人死于糖尿病。截至2010年3月，我国的糖尿病患者已达1.35亿，居世界糖尿病大国之首，城市和乡村的发病率分别为11.4％和8.2％，并且发病年龄更趋于年轻化(Wenying Yang et al，N Engl JMed.2010；362(12)：1090-1101)。糖尿病是一种慢性的、终生性疾病，控制血糖水平需终生用药，而目前临床上使用的降糖药都有显著的低血糖副作用，因此寻找开发具有调节血糖水平的治疗药物，在有效地控制血糖的同时降低副作用已引起了人们的广泛关注。
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病。除碳水化合物外，还有蛋白质、脂肪代谢异常，久病可引起眼、肾、神经、心脏、血管等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷及衰竭。病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱，如酮症酸中毒、高渗性昏迷等。
糖尿病分为四型：1型糖尿病、2型糖尿病、其他特殊类型和妊娠期糖尿病，其中1型和2型糖尿病是糖尿病的两种主要形式，这两种糖尿病都以β细胞的质量减少及其功能的降低为特点。
1型糖尿病(又称青少年糖尿病)是一种通常在低龄时形成的复杂的T细胞依赖自身免疫性疾病(Juneja and Palmer，Autoimmunity.1999；29(1)：65-83)，是由胰岛β细胞的免疫性破坏造成相应的胰岛素缺乏和对外源性胰岛素的依赖。单核细胞对胰腺内分泌细胞及组织的病灶性浸润及其功能性β细胞质量的显著减少是诊断该疾病的组织病理学的特点，但就损伤的程度而言个体间差异显著。自身免疫性破坏使得T细胞浸润到胰岛，结果出现β细胞的凋亡。
胰岛素疗法是干预1型糖尿病的主要手段。虽然胰腺的胰岛移植是一个有效的治疗方法(Shapiro et al，N Engl J Med.2000；343(4)：230-238)，但由于胰岛来源有限而大大受限。另外，胰岛移植患者要终生使用免疫抑制剂。尽管胰岛素疗法运用于多数1型糖尿病患者，却无法根治糖尿病，这是由于胰岛素很难将血糖水平维持在一个狭窄的生理范围内并且既无法阻止糖尿病的发展也不能阻止严重的糖尿病的并发症的出现。
2型糖尿病是一种主要由于胰岛素抵抗伴随相对胰岛素不足，或胰岛素分泌缺陷伴有或不伴有胰岛素抵抗而导致慢性高血糖的代谢疾病，其以引起高血糖症的三个主要异常为特点：1)外周胰岛素抵抗；2)肝糖原的过量生成；3)胰腺β细胞功能障碍。2型糖尿病的发病年龄多在35岁以后，占糖尿病总人数的90％～95％。
2型糖尿病的基本治疗包括糖尿病教育、饮食控制、适度的体力锻炼及药物治疗。目前用于2型糖尿病的药物主要有磺脲类药物如甲磺丁脲、氯磺丙脲、格列本脲、格列吡嗪等，双胍类药物如甲福明(二甲双胍)等，α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)等，噻唑烷二酮类药物如曲格列酮、罗格列酮等，餐时血糖调节剂，胰岛素等，但这些治疗通常无法阻止血糖控制的长期下降和细胞的功能紊乱(Mathews et al，Diabet Med.1998；15(4)：297-303；Turner et al，JAMA.1999；281(21)：2005-2012)。对于大多数患者，从饮食和锻炼到单因素药物治疗，从联合治疗到最终胰岛素治疗成为不可避免的过程。而且上述药物在降血糖的同时均具有显著的低血糖副作用，这可能是上述治疗药物针对的仅仅是高血糖的症状而不是针对2型糖尿病病因的缘故，因此，研发一种针对糖尿病发病机制的新型降血糖药显得尤为重要。
随着细胞和分子生物学的发展，肠促胰素(Incretins)这层神秘的面纱被慢慢揭开，研究证实，肠促胰素是人体内一种肠源性激素，在进食后，该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。肠促胰素主要由胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)组成，其中GLP-1在糖尿病的发生发展中起着更为重要的作用。在众多降糖药物中，大家对这类改善β细胞功能的靶点降糖新药——胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的治疗前景表现出高度的认同。
GLP-1是由肠L-细胞分泌的一种含有37个氨基酸的内源性多肽，其活性形式为GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2(Mojsov S，J clin Invest.1987：79(2)：616-9)及DPP-IV抗性GLP-1。
GLP-1与GLP-1受体(GLP-1R)、G-蛋白偶联受体(GPCR)结合。GLP-1R主要在胰脏β细胞表达，在其他组织细胞也有一定程度的表达(如肺、心脏等)，并且与cAMP第二信使途径偶联引发其生物学作用——作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌(Druck D et al，Lancet 2006，368：1696)，并可刺激胰岛β细胞的增值和新生，抑制β细胞凋亡，增加β细胞数量(Giorgino F et al，Diab Res Clin Pract 2007，78：S59；Drucker D，Diabetes Care 2003，26：2929；I.Urusova IA et al，Trends in Endocrinol Metab 2004，15：27)，提升机体对胰岛素的敏感性。
此外，GLP-1还可用于胰岛α细胞，强烈地抑制胰高血糖素的释放，并作用于胰岛δ细胞，促进生长抑素的分泌，生长抑素又可作为旁分泌激素参与胰高血糖素的分泌。
GLP-1具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用，即只有在血糖水平升高的情况下，GLP-1才发挥降糖作用，而在血糖水平正常时，则不会使其进一步降低。GLP-1的这种葡萄糖浓度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障，从而免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。
GLP-1还具有减轻体重的功效，研究者认为，GLP-1是通过多种途径产生降低体重的作用，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空。此外，GLP-1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)，从而使人体产生饱胀感和食欲下降，所以也可作为控制体重的药物。还可用于通过降低血糖水平、抑制胃肠运动、胃排空而受益的其他疾病
根据这些特点，GLP-1类似物受到广泛的重视，期望能开发成治疗糖尿病和肥胖症的新一代药物。但是，大量的研究表明，GLP-1无法作为药物在临床中使用，原因是GLP-1非常不稳定，在人体内会迅速为二肽基肽酶(DPP-IV)所降解，US 7452966B2和CN 200480015953.X公开了用GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2治疗2型糖尿病的方法，主要由于DDP-IV的快速酶促失活(Drucker，Diebetes.1998；47(2)：159-169)和/或肾脏的清除(Montrose-Rafizadehet al，Endocrinology.1999；140(3)：1132-1140)，使得GLP-1类似物的循环半衰期(t1/2＜2分钟)非常短暂，因此，需要通过泵采用持续性的皮下灌流以维持体内GLP-1的功效(Toft-Neilsen et al，Diabetes Care.1999；22(7)：1137-1143)。
由诺和诺德公司研发的利拉鲁肽是GLP-1的类似物，通过对GLP-1的一个氨基酸进行更换，并增加一个短的脂肪酸侧链而制成，与内源性GLP-1有97％的同源性。具有改善HbA1c控制、减轻体重、降低心脏收缩压(SBP)、加强β细胞功能等功效以及其他一些次级功效。并且，由于利拉鲁肽能加强β细胞功能，因此，从理论上有可能延缓糖尿病病程的发展，但需每日注射1次(CarolynF Deacon，Vascular Health and Risk Management；2009：5199-211)。该产品已于2010年1月在欧洲和美国上市，预计2011年在中国上市。
毒蜥外泌肽-4(exendin-4)是一种含有39个氨基酸，能够刺激胰岛素分泌的肽激素。早年是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥(Gila monster)唾液中发现的一种激素物质，其氨基酸序列与GLP-1具有53％的同源性，是一种GLP-1受体的潜在激动剂(Joshua J.Neumiller，J Am PharmAssoc.2009；49(Suppl 1)：S16-S29)。与GLP-1相反，exendin-4在水溶液中能形成单体螺旋，这种螺旋由于疏水性C端的首尾相互作用，表现出罕见的热稳定性。由于GLP-1缺乏C端首尾的相互作用，其自身的柔韧性以及16位的甘氨酸残基被认为是降低单螺旋状态稳定性的因素。而exendin-4螺旋内部的稳定性可减少结合受体时的正位功效，稳定性因此大大提高。同时，由于对于二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的降解有较强的抵抗性，exendin-4在人体内的半衰期为2-3小时，远长于GLP-1的1-2分钟，因此，其稳定性和生物活性明显高于GLP-1，显示出较GLP-1更好的治疗效果。
2005年，Eli lilly和Amylin医药公司共同开发的艾塞那肽注射液
Figure BSA00000180056800041
(一种人工合成的exenatide-4)被FDA批准用于服用二甲双胍、磺脲类、噻唑烷二酮类、二甲双胍和磺脲类联用、二甲双胍和噻唑烷二酮类联用不能有效控制血糖的2型糖尿病患者的辅助治疗以改善血糖控制。
然而，由于exenatide-4的分子量小，能被肾脏快速清除，不能持续刺激GLP-1R，还是需要每天注射2次才能获得满意的治疗效果，给临床治疗带来诸多不便。因此，开发长效Exendin-4类药物将更有利于提高其治疗1型和2型糖尿病的效果。药物研发人员正在尝试改变其分子结构，使药物在降糖的同时还能延长其在体内的持续效果。
针对GLP-1或exendin-4体内半衰期短的现状，科研人员开发出了相应的融合蛋白，如WO 02/46227或WO 05/000892中描述的GLP-1白蛋白融合蛋白或GLP-1-IgG4融合蛋白，体外结合活性偏低，(Kim et al，Diabetes.2003；52(3)：751-759)，其功效不如exendin-4。理想的发明是在显著延长药物体内半衰期的同时维持exendin-4的降血糖作用，又能够增强机体对胰岛素的敏感性，这使得人们进行更多努力来研制在体内功效稳定的exendin-4及其类似物的长效因子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种exendin-4及其类似物融合蛋白和相应的多核苷酸序列，载体，宿主细胞和药物组合物，其制备方法和应用。本发明的exendin-4及其类似物融合蛋白是由exendin-4及其类似物通过连接肽(linker)与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成。用于治疗糖尿病和肥胖症以及通过降低血浆葡萄糖水平、抑制胃肠运动、胃排空而受益的其他疾病。由于exendin-4及其类似物半衰期短，需要每日注射维持疗效，在临床上受到一定的限制，为了更好的发挥该药的疗效，本申请人对其进行了进一步的研究，研制开发了本发明的exendin-4及其类似物融合蛋白，该融合蛋白具有更高的稳定性和更长的体内半衰期，能够根据体内葡萄糖水平的高低按需促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞的数量，进而促进胰岛素的分泌，并提升机体对胰岛素的敏感性，具有优异的降血糖效果和极低的低血糖风险，并能够减轻体重，同时还可能发挥降脂、降压作用，从而对心血管系统产生保护作用，还可通过作用于中枢增强歇息和记忆功能，保护神经系统。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了exendin-4及其类似物融合蛋白是由exendin-4及其类似物通过连接肽(linker)与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成。
作为融合蛋白一部分的exendin-4及其类似物选自exendin-4[SEQ IDNO：1]、GLP-1(7-36)NH2[SEQ ID NO：2]、DPP-IV抗性GLP-1及其衍生物和片段中的任意一种。
在此说明，在该设计中exendin-4及其类似物应该被理解为包含exendin-4、GLP-1(7-36)NH2、DPP-IV抗性GLP-1的任意衍生物或其片段，它们与其原始物具有相似的生物学效应。衍生物包括但不限于常规的氨基酸的替代，氨基酸位点直接的置换及化学的修饰等等。
所述的exendin-4及其类似物可以为SEQ ID NO：1所述的exendin-4序列及其衍生物和片段；
所述的的exendin-4衍生物一般优选为具有不超过6个不同于SEQ ID NO：1所示序列的多肽，甚至更优选为具有不超过5个不同于SEQ ID NO：1所示序列的多肽，最优选为具有不超过4，3，2或1个不同于SEQ ID NO：1所示序列的的多肽。
所述的exendin-4片段为SEQ ID NO：1所示序列N末端保留1-20氨基酸的多肽。
所述的exendin-4及其类似物优选为SEQ ID NO：1所示序列的exendin-4；
所述的exendin-4及其类似物可以为SEQ ID NO：2所述的GLP-1(7-36)NH2序列及其片段和衍生物；
所述的DPP-IV抗性GLP-1是GLP-1A8G。
作为融合蛋白一部分的exendin-4及其类似物包含式I的序列
His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Glu-Glu-Ala-Xaa-Xaa Xaa-Phe-Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
式I
其中：
第2位的Xaa是Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
第10位的Xaa是Leu，Ala，Ser，Leu，Ile，Glu或Lys；
第12位的Xaa是Lys，Leu，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；
第13位的Xaa是Gln，Thr，Ala，Val，Leu，Ile或Lys；
第14位的Xaa是Met，Tyr，Thr，Ala，Ser，Ile或Lys；
第16位的Xaa是Glu，Lys，Ala，Ser，Leu，Trp或Thr；
第17位的Xaa是Glu，Asp，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
第19位的Xaa是Val，Cys，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
第20位的Xaa是Arg，Thr，Tyr，Ser，Leu，Ile或Lys；
第21位的Xaa是Leu，Thr，Ala，Asp，Glu，His或Lys；
第24位的Xaa是Glu，Leu，Thr，Ala，Ser，Lys或Ile；
第27位的Xaa是Lys，Ala，Ser，Leu，Thr，Ile或Lys；
第28位的Xaa是Asp，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
第30位的Xaa是Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Arg；
第31位的Xaa是Pro，Val，Ser，Ala，Leu，Ile或Lys；
第32位的Xaa是Ser，Thr，Glu，Ser，Asp，Lys或Ile；
第33位的Xaa是Thr，Ser，Ala，Met，Leu，Ile或Lys；
第34位的Xaa是Gly，Thr，Met，Ser，Ile，Leu或Lys；
第35位的Xaa是Ala，Thr，Ala，Glu，Leu，Ile或Phe；
第36位的Xaa是Pro，Ala，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；
第37位的Xaa是Pro，Thr，Ser，Ala，His，Lys或Ile；
第38位的Xaa是Pro，Thr，Val，Ser，Leu，Lys或Ile；
第39位的Xaa是Ser，Tyr，Ala，Leu，Ser，Ile或Lys；
作为融合蛋白一部分的连接肽选自：
1)富含甘氨酸的肽；
2)具有序列包含(Gly)m-Xaa-(Gly)n的肽，其中m是3-8的整数，n是3-8的整数，Xaa是Gly，Ser，Ala，Thr的任意一种。
其中，m优选为4-6的整数，n优选为4-6的整数。
肽接头优选为
序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly[SEQ ID NO：3]；
序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly[SEQ ID NO：3]；
序列Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly[SEQ ID NO：3]；
序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly[SEQ ID NO：3]。
作为融合蛋白一部分的IgG的Fc来源于人，可以选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种，优选为人IgG2。
所述的IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。
本发明一方面提供了编码所述的融合蛋白的多核苷酸序列。
本发明一方面提供了包含多核苷酸序列的载体。
本发明一方面提供了经所述的载体转染的宿主细胞，所述的宿主细胞可为CHO细胞和NS0细胞。
本发明一方面提供了一种exendin-4及其类似物融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括转录和翻译所述的多核苷酸，经ProteinA方法纯化的步骤。
本发明的融合蛋白在宿主细胞中表达后，可以采用多种蛋白质纯化方法，并且这些方法是本领域公知的，所选择的纯化步骤取决于生产过程和产生的特定的融合蛋白。例如，可以使用蛋白A或蛋白G亲和基质有效纯化包含Fc片段的融合蛋白，可以使用低或高pH缓冲液从亲和基质上洗脱融合蛋白。
表征本发明exendin-4融合蛋白的方法包括：SDS-PAGE、免疫印染、等电聚焦电泳、凝胶色谱、基质辅助的激光解析/电离质谱(MALDI-TOF)、液相色谱/质谱联用(LC-MS)。
本发明一方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有exendin-4及其类似物融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。
本文所用的术语“药学上可接受的|”是指当分子本体和组合物适当地施用于动物和人时，他们不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。本文所用的“赋形剂”应当与本发明的融合蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。
本发明的融合蛋白可以与一种或多种赋形剂进行制剂化。可以以溶液制剂或能够用合适的稀释剂重构的冻干粉针剂配制本发明的融合蛋白。
本发明的活性融合蛋白可以与药用缓冲液组合，并且调节pH以提供可接受的稳定性和适于肠胃外给药的pH值；可以添加一种或多种可药用的抗微生物剂；可以添加一种或多种可药用盐溶液以调节离子强度或张力；可以添加一种或多种赋形剂已进一步调节制剂的等渗性，如甘油等。
作为制剂辅料的填充剂可以是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄耆胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。
本发明的融合蛋白的可药用盐形式在本发明范围内。常用于形成酸加成盐的酸为无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸及有机酸，例如对甲苯磺酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸等。
碱加成盐包括从无机碱，例如铵、碱或碱土金属氢氧化物衍生的盐等。在制备本发明的盐溶液中用到的碱也包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化按、碳酸钾等。
本发明一方面提供了所述药物组合物的施用方式，可以通过局部、气雾剂、注射剂的方式施用；所述的注射方式可为腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射和静脉注射。
该融合蛋白降糖的有效剂量取决于许多因素，其中包括但不限于受试者性别、体重和年龄、施用途径和生物利用率等。
本发明一方面提供了一种exendin-4及其类似物融合蛋白在制备治疗糖尿病以及肥胖症的药物中的应用。
本发明的融合蛋白具有生物学活性。生物学活性是指该融合蛋白质体内结合并激活GLP-1受体并引起反应的能力。反应包括但不限于胰岛素的分泌、胰高血糖素的抑制、抑制食欲、体重减轻、诱导过饱感觉、抑制胰腺β细胞凋亡、诱导胰腺β细胞增殖及新生。实施例4(1)中提供了融合蛋白与人类GLP-1受体相互作用并将其活化的能力和诱导胰岛细胞分泌胰岛素的的体外实验。实施例4(2)中提供了Ob/ob肥胖型糖尿病小鼠体内降糖活性数据和C57/B6食源性肥胖及胰岛素抵抗小鼠模型的体内降糖活性数据。
本发明的exendin-4及其类似物融合蛋白在治疗糖尿病方面具有显著的效果：通过促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞的数量，促进胰岛素的分泌，提升机体对胰岛素的敏感性，从而有效控制2型甚至1型糖尿病的血糖水平，达到长效治疗的效果。本发明的融合蛋白通过作用于“GLP-1”受体而发挥生物学作用，可用于治疗糖尿病及肥胖症。
附图说明
图1为exendin-4融合蛋白的双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果
图2为exendin-4融合蛋白的免疫鉴别图谱
图3为exendin-4融合蛋白的等电聚焦电泳图谱
图4为exendin-4融合蛋白的凝胶色谱图谱
图5为体外活性实验：HEK-293稳定细胞表达人源GLP-1受体cAMP浓度比例试验
图6体内活性实验：ob/ob小鼠肥胖糖尿病模型
图7体内活性实验：小鼠食源性肥胖胰岛素抵抗模型
具体实施方式
本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、exendin-4融合蛋白表达基因合成及载体构建
Exendin-4融合蛋白的DNA构建是通过连接酶链反应基因合成的，其蛋白的序列组成如下：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGAGGGGV
ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKV
SNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*[SEQ ID NO：4]
该融合蛋白含有编码exendin-4和人IgG2-Fc融合蛋白的载体。IgG2-Fc区含有IgG2恒定重链的CH2和CH3部分。将IgG分泌先导肽序列SP-IgGH与exendin-4融合以便引导合成的融合蛋白分泌到培养液中。编码SP-IgGH/exendin-4/IgG2融合蛋白的cDNA是通过PCR合成的，并将其连接到编码人IgG2-Fc(CH2-CH3)的PCR扩增的cDNA上，然后插入pHT112载体的Hind III和NotI位点之间，构建pHT112-SP-IgGH/exendin-4/IgG2-Fc载体。可分泌的exendin-4/IgG2-Fc含有IgG2恒定重链(CH2和CH3)。SP-IgGH分泌引导肽序列与exendin-4序列融合引导合成的蛋白分泌到细胞培养液中。图1显示pHT112-SP-IgGH/exendin-4/IgG2-Fc载体被双内切酶HindIII和NotI切后，在琼脂糖凝胶电泳的显示结果。内切酶HindIII和NotI切出DNA片段是880碱基对，包含SP-IgGH/exendin-4/IgG2-Fc。
实施例2、exendin-4融合蛋白工程细胞株构建、表达和纯化
1、exendin-4融合蛋白工程细胞株构建
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养于含10％(体积百分比)胎牛血清(FCS)的DMEM(购自Invitrogen公司)完全培养液中，转染前一天均匀铺于6孔板，每孔3×105。转染方法参照LIPOFECTAMINE 2000说明书要求。转染48h后，细胞置于选择培养基(MSX 25uM)加压培养一周左右，空细胞基本死亡，存活的细胞接种于96孔板(50个/孔)继续加压培养。细胞长出克隆后，ELISA检测培养上清中蛋白的表达量，选出高表达的孔，转入24孔板扩大培养。ELISA再次检测培养上清蛋白表达量，选出高表达的几株细胞，继续扩大培养，逐步驯化悬浮培养，建立种子细胞库，并进行亚克隆，建立工作细胞库。
2、exendin-4融合蛋白的纯化
取解冻CHO工程细胞株接种于25cm2T形瓶中，每瓶含5mL细胞悬液，振荡培养4-5天后扩增至三角瓶中，培养7-10天，分离含有融合蛋白的细胞培养液分别经Protein A亲和层析介质(MabSuReTM，GE公司)、阴离子层析介质(QSepherose FF，GE公司)、阳离子层析介质(SP Sepherose FF，GE公司)纯化，然后用G-25凝胶过滤柱置换至制剂缓冲液中，保存待用。
实施例3  exendin-4融合蛋白的结构分析
1、免疫印染(Western Blot)分析
纯化的融合蛋白经非还原型SDS电泳后，用转膜装置(GE公司)将电泳条带转至甲醇活化的PVDF膜上(电流：25mA，时间：2h)。PVDF膜上在5％的脱脂奶中封闭2h，之后放入稀释好的添加碱性磷酸酶标记的抗IgG2抗体孵育1h，用TBST洗膜1h，每洗5min换新鲜TBST，洗完后加入CDP-star发光检测底物，压胶片曝光显影。结果见附图2，融合蛋白对IgG2型抗体显阳性。
2、等电聚焦电泳分析
纯化融合蛋白用快速电泳系统(Phast System，GE)进行等电聚焦电泳分析，选用pH 3-10的预制胶，聚焦电泳结束后预制胶用考马斯溶液进行染色。结果见附图3。融合蛋白主带的等电点为5.8，与理论值相近。
3、凝胶色谱分析纯化
纯化融合蛋白用凝胶色谱分析(色谱柱TSK3000sw)，上样量为10ug。结果见附图4，融合蛋白在凝胶色谱上表现为单一、对称的色谱峰，保留时间为8.5min。
实施例4.Exendin-4融合蛋白的生物活性
1、Exendin-4融合蛋白的体外活性：
A、Exendin-4融合蛋白人源GLP-1受体的HEK-293细胞分泌cAMP实验
HEK-293细胞中表达人GLP-1受体(293-hGLP1)中使用了一个基于细胞的检测，以确定本发明LAX09(即SEQ ID NO：4所示的exendin-4融和蛋白，下同)的体外效力。将含10％FBS的DMEM培养基加入到96黑色透明孔板中，将药物浓度为0.01nM至1000nM的Exendin-4和LAX09分别加入到培养基中。孵育30分钟，细胞被裂解，采用商业化测量工具包(Cisbio)测量细胞内cAMP的浓度，见下表1。
表1  人源GLP-1受体表达细胞cAMP浓度比值测试
Figure BSA00000180056800111
LAX09的EC50约为4.5nM，而Exendin-4的EC50约为2.5nM，比较接近。因此，表明本发明的LAX09能够产生与Exendin-4相近的激活GLP-1受体的能力。如图5所示。
2、Exendin-4融合蛋白的体内活性：
A、Ob/ob小鼠肥胖糖尿病模型
Ob/ob雄性小鼠肥胖型糖尿病模型，是一种常见的糖尿病模型。Ob/ob小鼠因为缺乏leptin基因，导致饮食过量，体重急剧增加，导致高血糖，甚至在标准饮食的条件下，血糖可以高达400mg/dL左右(正常值大约为250-500mg/dL)。选择12-16周龄的Ob/ob雄性小鼠随机分成3组，每组4只，按剂量10mg/kg，分别静脉注射生理盐水、exendin-4肽和LAX 09，24小时内跟踪其血糖的变化。
注射生理盐水组血糖浓度没有明显变化，表明其没有明显的降糖效果；而注射Exendin-4肽或LAX09组血糖从350-400mg/dL降至100mg/dL。虽然二者降糖的幅度类似，Exendin-4肽的降糖效果只能维持几个小时，而LAX09可以持续降糖超过24小时，如附图6所示。
B、小鼠食源性肥胖胰岛素抵抗模型
C57/B6雄性小鼠在高脂肪食品喂养六周以上的条件下形成肥胖症，胰岛素抵抗，和血糖升高的症状，是另一种常用的糖尿病模型。该模型的优势是血糖只是轻微超高，比较稳定，而且类似于常见的人类2型糖尿病。
选择14-16周龄的C57/B6雄性小鼠，随机分成两组，每组4只，分别注射LAX09和生理盐水，检测其30天内血糖浓度的变化。
在该模型中，注射生理盐水组的血糖浓度无明显变化，说明生理盐水对食源性肥胖胰岛素抵抗不起作用；单次注射LAX09(10mg/kg)把血糖从约200mg/dL持续降低到100mg/dL，而且周期持续至少一周(见附图7)。LAX降糖效果随着时间有所减弱，分析认为是与该药物血液浓度随着时间降低。因为是单次注射，LAX09在血液中的浓度是随着时间的推移，根据药代动力学，逐渐下降。
Figure ISA00000180057000011
Figure ISA00000180057000021
Figure ISA00000180057000031
Figure ISA00000180057000041

Claims (11)

1.一种exendin-4融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由exendin-4通过连接肽与免疫球蛋白IgG2的Fc部分融合而成；
所述exendin-4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.多核苷酸序列，其编码如权利要求1所述的exendin-4融合蛋白。
3.一种载体，其包含如权利要求2所述的多核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为CHO细胞。
6.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为NS0细胞。
7.一种制备权利要求1所述的exendin-4融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)exendin-4融合蛋白表达基因合成及载体构建；
(2)exendin-4融合蛋白工程细胞株构建；
(3)exendin-4融合蛋白的纯化。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1中的exendin-4融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物通过气雾剂、注射剂的方式施用。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射和静脉注射的方式施用。
11.权利要求1所述的exendin-4融合蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
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