ES2597962T3 - Proteína de fusión de exendin-4 y su análogo, método de preparación y uso de la misma - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión, que se obtiene por fusión de una hormona peptídica con una proteína de transporte a través de un enlazador, en donde la hormona peptídica es exendin-4 o el análogo de exendin-4, y la hormona peptídica está capacitada para rebajar la glucosa en sangre; la proteína de transporte es el fragmento Fc de la inmunoglobulina IgG2; la proteína de fusión está capacitada para rebajar la glucosa en sangre; el análogo de exendin-4 es un péptido que tiene 6 o menos diferencias de sitios de aminoácido con SEQ ID Núm. 1; el enlazador es un péptido que tiene la secuencia mostrada por (Gly)mXaa-(Gly)n, en la que, m es un número entero comprendido entre 3 y 8, n es un número entero comprendido entre 3 y 8, Xaa es uno cualquiera seleccionado en el grupo consistente en Gly, Ser, Ala y Thr.
Description
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expresan receptor de GLP-1 (según se ha descrito en la referencia WO/2007/017892), para determinar la concentración molar del producto de efecto corriente abajo (el segundo cAMP mensajero) y el rendimiento in vitro de la LAX09 de la presente invención (es decir, la proteína de fusión de exendin-4 obtenida según se ha descrito con anterioridad y mostrada por SEQ ID Núm. 4, como en lo que sigue). Se añadió substrato de DMEM que contenía el 10% en volumen de FBS en una placa de 96 pocillos transparentes negros, y exendin-4 y LAX09 con una concentración de medicamento de 0,01 nM a 1000 nM en substrato, respectivamente; tras incubación durante 30 minutos, la célula se desintegró y se comprobó la concentración de cAMP intracelular mediante un kit comercial (Cisbio), cuyo resultado se ha mostrado en la Tabla 1.
Tabla 1. Prueba de relación de concentración de cAMP en células que expresan el receptor de GLP-1 humano
- Concentración de medicamento (nM)
- 0,01 0,1 1 10 100 1000
- Concentración de cAMP
- Exendin-4 2 5 48 135 155 140
- LAX09
- 2 5 31 115 155 153
El EC50 de LAX90 es aproximadamente 4,5 nM, y el EC50 de exendin-4 es aproximadamente 2,5 nM; los dos casos son cercanos. Por lo tanto, la LAX09 en la presente invención podría producir un nivel de activación de receptor de GLP-1 similar a la exendin-4. Según se ha mostrado en la Figura 5.
B. Prueba de combinación de LAX09 con línea de células de diseño de CHO que expresan GLP-1 R humano
Se llevó a cabo una prueba sobre la combinación de la actividad de LAX09 con la línea de células de diseño de CHO (CHO-hGLPIR, como en lo que sigue) que podía expresar persistentemente el receptor de GLP-1 humano, para determinar la bioactividad de la muestra purificada de la LAX09 de la invención.
Prueba de combinación de la línea celular de CHO-hGLP1R: Se realizó una cepa de diseño de CHO que expresa establemente el GLP-1R humano en suspensión de células individuales, y se ajustó la densidad celular a 10.000.000 células/ml mediante PBS; la muestra de LAX09 se diluyó según un gradiente de concentración diferente. En cada viral se mezclaron 20 µl de suspensión celular con muestras de 20 µl con diferentes concentraciones respectivamente, y se incubaron a 4 ºC durante 30 minutos. Tras lavado con PBS, se añadieron anticuerpos de cadena γ de inmunoglobulina humana etiquetados con fluoresceína FITC, y se incubó a 4 ºC durante 30 minutos. Después del lavado con PBS, se añadió el 1% de paraformaldehído en PBS, se mezcló uniformemente y se cargó la muestra, se leyó la intensidad de fluorescencia media de la muestra de cada concentración en la zona seleccionada en la citometría de flujo. Según se ha mostrado en la Tabla 2.
Tabla 2. Prueba sobre combinación de actividad de LAX09 con células que expresan receptor de GLP-1 humano
- Concentración de masa de LAX09 (µg/ml)
- 0 0,098 0,246 0,614 1,536 3,84 9,6 24 60
- Intensidad de fluorescencia media
- 10,19 14,12 17,53 21,78 38,01 57,03 81,54 94,81 121,98
2. Actividad in vivo de la proteína de fusión de exendin-4
A. Modelo diabético obeso de ratón KK-Ay
Prueba hipoglucémica de inyección única: Los ratones modelo diabético KK-Ay (adquiridos en Beijing HFK Bioscience Co., Ltd., igual que en lo que sigue), fueron aleatorizados en 4 grupos que incluían un grupo de control de PBS y tres grupos experimentales de diferentes gradientes de proteína de fusión de exendin-4 (LAX 09). Tras ayunar durante 2 h, los animales fueron inyectados con el medicamento a través de la vena caudal, con un volumen de 200 µl/animal, a continuación se determinó la glucosa en sangre de los ratones a los 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min y 240 min, habiéndose mostrado el resultado en la Figura 6. La LAX09 tuvo el mejor efecto hipoglucémico a razón de 1 mg/kg, siendo controlada la glucosa en sangre del ratón bajo 10 mmol/l.
Prueba de tolerancia oral a la glucosa: Los ratones modelo diabético KK-Ay fueron aleatorizados en 4 grupos, que incluían un grupo de control de PBS y tres grupos experimentales de diferentes gradientes de proteína de fusión (LAX 09) de exendin-4. Tras un ayuno de 16 h, los animales fueron inyectados con el medicamento subcutáneamente, con un volumen de 200 µl/animal; 6 h más tarde, se administró glucosa a través del tubo gástrico de acuerdo con su peso corporal (1 mg/g), y a continuación se determinó la glucosa en sangre de los ratones a los 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min y 240 min, habiéndose mostrado el resultado en la Figura 7; los ratones del grupo de 1 mg/kg y del grupo de 0,1 mg/kg tienen la misma buena capacidad de mantener la glucosa en sangre normal.
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Experimento de administración de larga duración: Los ratones modelo diabético KK-Ay fueron aleatorizados en 2 grupos, que incluían un grupo de PBS y un grupo experimental de 1 mg/kg de proteína de fusión (LAX 09) de exendin-4. El medicamento se administró dos veces por semana, y los ratones se hicieron ayunar durante 6 horas cada miércoles y fueron testados en cuanto a glucosa rápida en sangre, mientras que se registró su toma de alimento y su variación de peso.
El resultado ha sido mostrado en la Figura 8; la glucosa rápida en sangre de los ratones del grupo experimental es significativamente diferente a la del grupo de PBS; la toma de alimento se rebajó, según se muestra en la Figura 9, y el peso se redujo significativamente según se muestra en la Figura 10. Transcurridas 24 horas desde la medicación, el resultado de la prueba de tolerancia oral a la glucosa ha sido mostrado en la Figura 11. Transcurridas 49 horas después de la medicación, el resultado de la prueba de tolerancia oral a la glucosa ha sido mostrado en la Figura 12. Todos estos resultados demuestran una eficacia significativa de la proteína de fusión de exendin-4.
B. Modelo diabético obeso de ratón db-db
Prueba hipoglucémica de inyección única: ratones del modelo diabético db/db con una edad de 5-6 semanas fueron aleatorizados en 4 grupos, que incluían un grupo de control de PBS y tres grupos experimentales de diferentes gradientes de proteína de fusión (LAX 09) de exendin-4. Tras ayudar durante 2 h, los animales fueron inyectados con el medicamento a través de la vena caudal, con un volumen de 200 µl/animal, y a continuación se determinó la glucosa en sangre de los ratones a los 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min y 240 min, habiéndose mostrado el resultado en la Figura 13; el grupo de 1 mg/kg y el grupo de 0,1 mg/kg tuvieron el mejor efecto hipoglucémico.
Ejemplo 5
Conforme al procedimiento de muestra usado en los ejemplos 1-4, se preparó y se determinó la eficacia in vivo e in vitro de la proteína de fusión según la Tabla 3.
Tabla 3. Proteína de fusión y su bioactividad relativa
- Secuencia de la proteína de fusión
- Secuencia de la hormona peptídica Secuencia del péptido enlazador Secuencia de proteína de transporte Bioactividad relativa* (%)
- SEQ ID Núm. 5
- SEQ ID Núm. 6 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 99
- SEQ ID Núm. 7
- SEQ ID Núm. 8 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 98
- SEQ ID Núm. 9
- SEQ ID Núm. 10 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 97
- SEQ ID Núm. 11
- SEQ ID Núm. 12 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 96
- SEQ ID Núm. 13
- SEQ ID Núm. 14 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 95
- SEQ ID Núm. 15
- SEQ ID Núm. 16 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 94
- SEQ ID Núm. 17
- SEQ ID Núm. 18 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 93
- SEQ ID Núm. 19
- SEQ ID Núm. 20 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 92
- SEQ ID Núm. 21
- SEQ ID Núm. 2 SEQ ID Núm. 3 IgG2-Fc 91
- SEQ ID Núm. 22
- SEQ ID Núm. 1 SEQ ID Núm. 3 IgG4-Fc 75
- * La bioactividad relativa se define como la relación relativa entre la reducción de glucosa rápida en sangre (en comparación con el grupo de control del ensayo) de la proteína de fusión determinada mediante experimento de administración prolongada (ratón modelo diabético KK-Ay) entre el modelo diabético obeso de ratón KK-Ay y el valor correspondiente de la proteína de fusión purificada obtenida en el ejemplo 2.
Específicamente, la administración de largo plazo se realiza conforme al protocolo siguiente: los ratones modelo diabético KK-Ay son aleatorizados en un grupo de control de ensayo (inyectados solamente con PBS) y el grupo experimental (inyectados con 1 mg/kg de la proteína de fusión de la Tabla 3). El medicamento se administra dos veces por semana; después de 2 semanas, los ratones se hicieron ayunar durante 6 h y se comprobaron en cuanto a glucosa en sangre en ayunas, y se calculó el descenso de la glucosa en sangre de un grupo experimental restando la glucosa en sangre en ayunas del grupo experimental de la del grupo de control de ensayo.
En donde, SEQ ID Núm. 6 es diferente de los sitios de aminoácido de SEQ ID Núm. 1 y 2, y tiene la secuencia de fórmula I; SEQ ID Núm. 8 es diferente de SEQ ID Núm. 1 en 3 sitios de aminoácido, y tiene la secuencia de fórmula I; SEQ ID Núm. 10 es diferente de SEQ ID Núm. 1 en 4 sitios de aminoácido, y tiene la secuencia de fórmula I; SEQ ID Núm. 14 es la secuencia de aminoácido de GLP-1A8G; SEQ ID Núm. 16 es diferente de SEQ ID Núm. 2 en 3 sitios de aminoácido; SEQ ID Núm. 18 es diferente de SEQ ID Núm. 2 en 3 sitios de aminoácido; SEQ ID Núm. 20
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