JP5653214B2 - 細胞膜透過性ペプチド - Google Patents
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Description
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜7個のリシンおよびアルギニンから選択される塩基性アミノ酸が別のリシンおよびアルギニンから選択される塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞膜透過性を有するペプチド。
(D)(A)または(B)の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、かつ細胞膜透過性を有するペプチド。
<方法>
HeLa細胞を、10% FBSを含むDMEM培地中で96ウェルガラスボトムプレートに0.2ml播種し、37℃で48〜72時間培養して底面に細胞を接着させた。200μlPBSで3回洗浄後、アミノ末端にフルオレセイン標識した配列番号1〜6のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)を終濃度5μM、および終濃度10% FBSを含むDMEM培地50μlを各ウェルに加えた。CO2インキュベーターにて3時間インキュベーションした後、10% FBSを含むDMEM培地で3回洗浄し、50μlの溶解溶液(10mM Tris−HCl、5mM EDTA、100mM NaCl、1% SDS、100μg/mlプロテイナーゼK)を加え、室温で1時間インキュベーションし、細胞および細胞に取り込まれたペプチドを分解した。分解溶液は全量を回収し、蛍光強度測定装置(HORIBA FLUOROMAX−3)で細胞に取り込まれたフルオレセイン量を励起波長494nm、蛍光波長512nmで測定した。
各ウェルに添加した量に対する細胞に取り込まれたフルオレセイン量を図1に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。配列番号6のランダムペプチドがほとんど細胞に取り込まれなかった、すなわち細胞膜透過性ペプチドでなかったのに対し、本発明のペプチドである配列番号1〜5のペプチドのフルオレセイン標識体は配列番号6のランダムペプチドの10倍以上の効率で細胞内に取り込まれた。
<方法>
HeLa細胞を、10% FBSを含むDMEM培地中で96ウェルガラスボトムプレートに0.2ml播種し、37℃で48〜72時間培養して底面に細胞を接着させた。200μlPBSで3回洗浄後、アミノ末端にフルオレセイン標識した配列番号1〜6のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)を終濃度5μM、およびローダミン標識ヒトインスリン終濃度100μg/ml)で含む10% FBSを含むDMEM培地50μlを各ウェルに加えた。CO2インキュベーターにて3時間インキュベーションした後、10%FBSを含むDMEM培地で3回洗浄した後、50μlの溶解溶液(10mM Tris−HCl、5mM EDTA、100mM NaCl、1% SDS、100μg/mlプロテイナーゼK)を加え、室温で1時間インキュベーションし、細胞および細胞に取り込まれたローダミン標識インスリンを分解した。分解溶液は全量を回収し、蛍光強度測定装置で細胞に取り込まれたローダミン標識インスリン量を励起波長555nm、蛍光波長580nmで測定した。
各ウェルに添加した量に対する細胞に取り込まれたローダミン標識インスリン量を図2に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。ローダミン標識インスリンのみ、または配列番号6のランダムな配列を持つペプチドと共に細胞に添加した場合、ほとんど細胞に取り込まれなかったのに対し、本発明のペプチドである配列番号1〜5のペプチドを添加したものでは、ランダムペプチドである配列番号6のペプチドを用いた場合に比べ50倍以上の効率でローダミン標識インスリンが細胞内に取り込まれた。
<方法>
HeLa細胞を10% FBSを含むDMEM培地中で96ウェルガラスボトムプレートに0.2ml播種し、37℃で48〜72時間培養して底面に細胞を接着させた。200μl PBSで3回洗浄後、アミノ末端にフルオレセイン標識した配列番号1〜6で示されるペプチド(シグマジェノシス社委託合成)を終濃度1μMおよび蛍光ポリスチレンビーズ(モルキュラープローブ製Fluorospheres Carboxylated Microbeads 0.1μm)終濃度1μl/ウェル、および10% FBSを含むDMEM培地50μlを各ウェルに加えた。CO2インキュベーターにて3時間インキュベーションした後、10% FBSを含むDMEM培地で3回洗浄した後、50μlの溶解溶液(10mM Tris−HCl、5mM EDTA、100mM NaCl、1% SDS、100μg/mlプロテイナーゼK)を加え、室温で1時間インキュベーションし、細胞を分解した。分解溶液は全量を回収し、蛍光強度測定装置で細胞に取り込まれた蛍光ポリスチレンビーズ量を励起波長580nm、蛍光波長605nmで測定した。
各ウェルに添加した量に対する細胞に取り込まれた蛍光ポリスチレンビーズ量を図3に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。蛍光ポリスチレンビーズのみ、または細胞膜透過性ペプチドでない配列番号6のランダムペプチドと共に細胞に添加した場合、ほとんど細胞に取り込まれなかったのに対し、本発明のペプチドである配列番号1〜5のペプチドを添加したものでは、添加した量の0.7%以上の蛍光ポリスチレンビーズが回収された。
<方法>
インスリン(WAKO社)粉末を1.5mlチューブ(エッペンドルフ社)に一定量計りとり、0.1N HClに溶解した後、同量の0.1N NaOHを加えインスリン溶液を作製した。インスリン溶液単独、または全アミノ酸配列がL体の配列番号1のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)をPBSに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(1IU/kg)、それぞれのペプチド0.5mMの40μl混合溶液を調製した。24時間絶食した体重約200gのSD系雄性ラットにペントバルビタール50mg/kgを腹腔内注射することにより麻酔した後、頸部を切開し気管を露出した。ポリエチレンチューブ(INTRAMEDIC PE205,Clay Adams)を気管に挿入し、次に食道を一部切開し同径のチューブを食道の切開部から後鼻孔へむけて慎重に組織に傷をつけぬよう挿入した。後鼻孔へ挿入するチューブの先端を予め脱脂綿と接着剤で密栓した。薬液の漏れを防ぐために口腔に開いている上顎部の鼻口蓋管を合成接着剤(第一三共株式会社製“アロンアルファA”)で閉じた。そして、調製したインスリン、ペプチド混合液またはインスリンのみを投与前および投与後5、10、15、30、60、120、180、240分後に頸静脈より0.25mlを採血し、血糖値測定装置“ノボアシストプラス”(ノボ社)を用いて血糖値の測定を行った。残りの血液は遠心分離により血漿を分離させ、血漿中インスリン濃度をEIAキット(レビス社)により測定した。生物学的利用能(バイオアベイラビリティ)はインスリン皮下投与時との比較により算出した。
投与後の血中グルコース濃度推移を図4に血中インスリン濃度推移を図5に示す。それぞれの値は3連または6連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。インスリンのみを経鼻投与したラットでは血中のインスリン濃度上昇はほとんど確認できないのに対し、インスリンと共に配列番号1のペプチドを投与したラットでは投与直後よりインスリンの血中移行が認められた。またインスリンの血中移行に伴う薬理活性である血糖値の低下も認められ、血中のインスリン濃度に対応する血糖値低下が確認された。
<方法>
実施例4と同様の方法にてインスリンを調整し、インスリン溶液単独、あるいは全アミノ酸配列がL体の配列番号1、配列番号7(オリゴアルギニン)または配列番号8(ペネトラチン)のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)をPBSに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(1IU/kg)、それぞれのペプチド0.5mMの40μl混合溶液を調製した。それぞれの混合溶液を実施例4に記載と同じ方法でラットに投与し、経時的に採血、測定を行い、血漿中のインスリン濃度を測定し、インスリン皮下投与時との比較により生物学的利用能(バイオアベイラビリティ)を算出した。
3連で行った評価におけるインスリン単独、あるいは配列番号1,7または8のペプチドとインスリンの混合液を投与した場合のバイオアベイラビリティの平均値および標準誤差を図6に示す。配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する本発明の細胞膜透過性ペプチドは、配列番号7または8の既知の細胞膜透過性ペプチドに対して、有意に高いバイオアベイラビリティを示した。
<方法>
氷冷下、ヒト天然型インターフェロンβ(東レ株式会社製“フエロン”)にTween20添加PBSを1ml加え、6,000,000IU/mlとし、この溶液を100μl分取し、Tween20添加PBSを566μl加えて900,000IU/ml溶液とした。インターフェロンβ単独、あるいは全アミノ酸配列がL体の配列番号1または4のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)をPBSに溶解し、前述のインターフェロンβ溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインターフェロンβ(0.18×106IU/kg)、それぞれのペプチド0.5mMの40μl混合溶液を調製し、実施例4に記載の方法と同じ方法で評価を行った。血漿中インターフェロンβ濃度は“ヒトインターフェロンβELISAキット”(株式会社鎌倉テクノサイエンス)により測定した。
投与後の血漿中インターフェロンβ濃度推移を図7に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。インターフェロンβのみを経鼻投与したラットでは血中のインターフェロンβ濃度上昇は低かったのに対し、インターフェロンβと共に配列番号1または4のペプチドを投与したラットでは投与直後よりインターフェロンβの血中移行が認められた。
<方法>
エキセンジン4(シグマジェノシス社委託合成)単独、または全アミノ酸配列がL体の配列番号1または配列番号4のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)をPBSに溶解し、前述のエキセンジン4溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてエキセンジン4(0.25mg/kg)、それぞれのペプチド0.5mMの40μl混合溶液を調製し、実施例4に記載の方法と同じ方法で評価を行った。血漿中エキセンジン4濃度は抗エキセンジン4モノクローナル抗体を固相に、ビオチン標識抗エキセンジン4ポリクローナル抗体およびストレプトアビジン−HRPを検出に用いる、サンドイッチ法ELISA(酵素免疫測定法)により測定した。
投与後の血漿中エキセンジン4濃度推移を図8に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。エキセンジン4のみを経鼻投与したラットでは血中のエキセンジン4濃度の上昇はほとんど見られなかったのに対し、エキセンジン4と共に配列番号1または4のペプチドを投与したラットでは投与直後よりエキセンジン4の血中移行が認められた。
<方法>
実施例4と同様の方法でインスリン溶液を調製した。インスリン単独、または全アミノ酸配列がL体の配列番号1または4のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)をPBSに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(50IU/kg)、それぞれのペプチド0.5mMの500μl混合溶液を調製した。24時間絶食した体重約200gのSD系雄性ラットにペントバルビタールナトリウム50mg/kgを腹腔内注射することにより麻酔した後、正中線に沿って開腹し、腸管を露出した。回盲接合部から2−3cm回腸よりの部分からシリコンチューブを、およびその上部約10cmの部分からゾンデを挿入し、さらに内側6cmの部分に縫合糸を通した。ゾンデから、あらかじめ37℃に加温したpH7.4のリン酸生理緩衝液(PBS)20mlを流速5ml/minで流し込んで内容物を排出させた後、シリコンチューブに栓をして、ゾンデからあらかじめ37℃に加温したPBSを1ml投与し、30分貯留させた。投与後は速やかにゾンデに栓をして、腸管を腹腔内に戻して切開部をクリップで閉じ安静にした。貯留後、ゾンデおよびシリコンチューブの栓をはずし、ループ内にあらかじめ37℃に加温したPBS20mlを流速5ml/minで流し込んで内容物を排出させた後、あらかじめ縫合糸を通した6cmの部分を結紮してループを作成した。このループ内にインスリン溶液単独、またはインスリンおよび配列番号1または配列番号4のペプチド混合溶液0.5mlを投与し、腸管を腹腔内に戻し、切開部をクリップで閉じ安静にした。実験中のラットは、温水循環ポンプにより37℃に加温したホットプレート上に背位で固定し体温調節を行った。投与前および投与後5、10、15、30、60、120、180分後に頸静脈より0.25mlを採血し、血糖値測定装置“ノボアシストプラス”(ノボ社)を用いて血糖値の測定を行った。残りの血液は遠心分離により血漿に分離し、酵素免疫測定法によりインスリン濃度を定量した。同量のインスリン溶液のみを皮下に投与したラットについても、同様にして採血、測定を行なった。
投与後の血中グルコース濃度推移を図9に血中インスリン濃度推移を図10に示す。それぞれの値は3連〜6連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。コントロールのインスリン単独の投与時と比較して、配列番号1または4のペプチドとインスリンを併用投与することにより、血中インスリン濃度の明らかな上昇、および血糖値の明らかな低下が認められた(図9および図10)。
<方法>
実施例4と同様の方法でインスリン単独、またはインスリンおよび配列番号1のペプチド、または5%(w/v)のタウロデオキシコール酸溶液を鼻腔投与した。15分後、鼻腔を10mlの37℃に加温したPBSで2ml/minで洗浄した。洗浄溶液は回収し、溶液中に漏洩したLDHをLDH活性測定キット(Pointe scientific社)で測定した。
洗浄溶液のLDH活性を図11に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。5% タウロデオキシコール酸ナトリウムと比較し、配列番号1のペプチドとインスリン混合溶液を投与したマウス鼻腔からのLDH放出は有意に低く、PBSやインスリン単独を投与した場合と同程度に低かった。
<方法>
配列番号1,6,9〜11のアミノ末端未標識ペプチド(シグマジェノシス社委託合成)を用いる以外は実施例2と同様の方法によりHeLa細胞へのインスリン移行促進性評価を行った。CO2インキュベーターでのインキュベーション時間は5時間とし、蛍光強度測定装置で細胞に取り込まれたローダミン標識インスリン量を測定した。
各ウェルに添加した量に対する細胞に取り込まれたローダミン標識インスリン量を図13に示す。それぞれの値は3連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。細胞膜透過性ペプチドでないことが確認されている配列番号6または11のランダムペプチドを細胞に共添加した場合には添加した量の0.05%以下のローダミン標識インスリンしか細胞に取り込まれなかったのに対し、本発明の細胞膜透過性ペプチドである配列番号1または配列番号9または10のペプチドを共添加したものでは、添加したローダミン標識インスリンの0.7%以上が細胞に取り込まれた。
<方法>
実施例4と同様の方法にてインスリンを調整し、インスリン溶液単独、または全アミノ酸配列がL体の配列番号1,9,10のペプチド(シグマジェノシス社委託合成)をPBSに溶解し、前述のインスリン溶液と合わせ、それぞれの投与実験においてインスリン(1IU/kg)、それぞれのペプチド0.5mMの40μl混合溶液を調製した。それぞれの混合溶液を実施例4に記載と同じ方法でラットに投与し、経時的に採血、測定を行い、血漿中のインスリン濃度を測定し、血中濃度(μU/ml)と時間(分)の推移を元にAUC(薬物血中濃度−時間曲線下面積)を算出した。
3連または6連で行った評価におけるインスリン単独、および、配列番号1、配列番号9または10のペプチドとインスリンの混合液を投与した場合のAUCの平均値および標準誤差を図14に示す。配列番号1,9,10の細胞膜透過性ペプチドとインスリンを併用投与した場合は、インスリン単独を投与した場合に対して、有意に高いインスリンの鼻腔吸収性を示した。
<方法>
実施例2と同様の方法を用いて配列番号6,12〜30のアミノ末端にフルオレセイン標識したペプチド(シグマジェノシス社委託合成)を用いてHeLa細胞へのインスリン移行促進性評価を行った。CO2インキュベーターでのインキュベーション時間は5時間とし、蛍光強度測定装置で細胞に取り込まれたローダミン標識インスリン量を測定した。また、実施例1と同様の方法で細胞に取り込まれたフルオレセイン量を測定した。
<結果>
各ウェルに添加した量に対する細胞に取り込まれたフルオレセイン量を図15に示す。それぞれの値は2連で行った評価の平均値と標準誤差を示す。配列番号6で示すランダムな配列を持つペプチドでは、添加したフルオレセイン量の0.2%程度しか細胞内に取り込まれなかったのに対し、配列番号12〜30で示される本発明の細胞膜透過性ペプチドでは、いずれも0.8%以上が細胞内に取り込まれた。
配列番号6 ランダムペプチド
配列番号7 オリゴアルギニン
配列番号8 ペネトラチン
配列番号9〜10 本発明の細胞膜透過性ペプチド
配列番号11 ランダムペプチド2
配列番号12〜30 本発明の細胞膜透過性ペプチド
Claims (8)
- 以下の(A)、(B)または(D)の細胞膜透過性ペプチド。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜7個のリシンおよびアルギニンから選択される塩基性アミノ酸が別のリシンおよびアルギニンから選択される塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞膜透過性を有するペプチド。
(D)(A)または(B)の逆配列で表されるアミノ酸配列からなり、かつ細胞膜透過性を有するペプチド。 - 前記(B)のペプチドが配列番号2〜4,9〜10,13のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の細胞膜透過性ペプチド。
- 前記(D)のペプチドが配列番号5または14で表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の細胞膜透過性ペプチド。
- 配列番号12,15〜30のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、細胞膜透過性ペプチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチドと親水性生理活性物質を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチドと親水性生理活性物質を含む、経口投与用医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞膜透過性ペプチドと親水性生理活性物質を含む、経鼻投与用医薬組成物。
- 親水性生理活性物質がペプチド、タンパク質または核酸である、請求項5〜7のいずれかに記載の医薬組成物。
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