WO2015060673A1 - 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

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    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating and preventing prostatic hyperplasia. More specifically, the present invention relates to a composition for treating and preventing prostatic hyperplasia as a composition comprising a peptide derived from telomerase.
  • Prostate hyperplasia is the most common disease of male senile disease, accompanied by lower urinary tract symptoms. Related symptoms begin to appear at age 40, but most often cause clinical symptoms in the late 50s. Prostatic hyperplasia can lead to sexual dysfunction due to deterioration of quality of life and thus affect sexual function by treatment and surgery.
  • Hyperplasia caused by prostatic hyperplasia depends on male hormones.
  • male hormones are not only necessary for normal cell proliferation of the prostate but also inhibit apoptosis of cells.
  • the most widely known endogenous cause of prostatic hyperplasia is known to correlate with age.
  • the prostate grows with age and must be accompanied by normal testicular function.
  • the prostate is a male hormone-dependent organ.
  • Testosterone plays an important role in the growth, differentiation and function of the prostate.
  • Dihydrotestosterone (DHT) which is metabolized by 5-alpha-reductase, Plays an important role in regulating gene expression.
  • Exogenous factors involved in prostate growth include male hormones, estrogens, and glucocorticoids, as well as substances associated with endocrine enzymes originating from the diet and surrounding environment. The physiological effects of these exogenous elements are manifested through various types of peptidic growth regulators.
  • Prostatic hyperplasia occurs as a histological change from early 20's to late 40's, when male hormones and estrogens work together to induce prostatic hyperplasia. As the age increases, the estrogen / DHT ratio increases, leading to an increase in prostate hypertrophy.
  • the prostate gland grows up to the early 20s and maintains its size until the 50s. To maintain such a balance, the prostate gland is involved in very complex interactions such as endogenous growth regulators and delivery pathways, cell cycle regulation and cell division and apoptosis. Depends. Modification of such cell cycle regulatory factors can lead to prostate hyperplasia.
  • prostatic hyperplasia can have a significant effect on prostatic hyperplasia.In patients with a family history, the probability of developing prostatic hyperplasia has been reported to increase by about 60%. Treatment with 5 ⁇ -reductase inhibitors in patients with a family history has been reported. The effect is reported to be low. This is presumably due to the androgen independent path.
  • Sulpiride is a type 2 dopamine receptor antagonist and is mainly used to treat depression.
  • Dopamine is an intermediate product of the synthesis of adrenalin and noradrenalin and is an inhibitory neurotransmitter.
  • Sulphide inhibits the binding of dopamine receptors, which also inhibits the release of prolactin, a dopaminergic effect, and increases the concentration of prolactin in the blood. Increased prolactin from continuous sulfide administration leads to hyperprolactinemia.
  • prolactin is involved in the proliferation of the prostate gland and is involved in the development and regulation of prostate cancer and BPH. Prolactin is also known to have a synergistic effect on the proliferation of the prostate in combination with androgens. Another mechanism is that prolactin acts as a stress hormone, increasing the expression of the 5 ⁇ -reductase enzyme, leading to prostate proliferation. Prolactin is a type of nonsteroidal factors involved in prostate enlargement and prostatic hyperplasia. Prolactin content increases with age, while testosterone levels decrease. This is reported to be important for the mechanism by which prolactin induces prostate enlargement in humans as they age. It is known that prolactin is involved in the proliferation and differentiation of the prostate gland in rats and humans. It is believed that prolactin is induced through signal transduction pathways through receptors.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of diligent efforts to develop a composition for treating and preventing prostatic hyperplasia with excellent effects while minimizing side effects.
  • peptides derived from telomerase can have an excellent effect on the treatment and prevention of compositions for the treatment and prevention of enlarged prostate.
  • An object of the present invention is to provide a composition having an effect on the treatment and prevention of the composition for the treatment and prevention of enlarged prostate.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter, "PEP1”, “GV1001”, or “GV”), having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence
  • PEP1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • GV1001 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a composition for treating and preventing prostatic hyperplasia comprising a peptide or a peptide thereof.
  • the fragment may be a fragment consisting of three or more amino acids.
  • the peptide may contain 0.01 mg to 1 mg, preferably 0.56 mg dose (corresponding to 4 nmol peptide / kg body weight).
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the composition may be a food composition.
  • a method for treating and preventing prostatic hyperplasia characterized in that the above-mentioned compositions for treating and preventing prostatic hyperplasia are administered to a subject in need thereof.
  • the composition may be administered three times a week.
  • a composition comprising a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 1 (PEP1) or a peptide which is a peptide or a fragment having a sequence having 80% homology with the sequence according to the present invention is effective in the treatment and prophylaxis of prostate hyperplasia with little side effects. Has an excellent effect.
  • 1 is a photograph of a process of separating the target organ to observe the tissue weight of the experimental group.
  • FIG. 2 shows electrophoresis showing the results of experiments using RT-PCR on the expression of 5 ⁇ -reductase in the ventral prostate of each experimental group in the experiment to verify the effect of PEP1 on the treatment of prostatic hyperplasia. It is a photograph.
  • Figure 3 is a graph showing the results of measuring the seminal vesicle (seminal vesicle) in each group in the experiment for verifying the effect of PEP1 on the treatment of prostatic hyperplasia.
  • Figure 4 is a graph showing the results of measuring the prostate (prostate) weight in each group in the experiment for verifying the effect of PEP1 on the treatment of prostatic hyperplasia.
  • FIG. 5 is a graph showing the degree of cell proliferation in the parenchymal cell line (WPMY-1) of PEP1 treated prostatic hyperplasia animal model.
  • Figure 6 is a graph showing the degree of cell proliferation in epithelial cell line (RWPE-1) of PEP1 treated prostatic hyperplasia animal model.
  • Figure 7 is a graph showing the measurement of the binding capacity of PEP1 to the androgen receptor in the parenchymal cell line (WPMY-1) of an enlarged prostate animal model using PEP1-FITC (fluorescent conjugate (conjugate)).
  • FIG. 8 is a graph showing the measurement of the binding capacity of PEP1 to the androgen receptor in the epithelial cell line (RWPE-1) of an enlarged prostate animal model using a PEP1-FITC (phosphor) conjugate (conjugate).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • FIG. 10 is a tissue immunostaining photograph showing the results of experiments measuring the effect of PEP1 on the expression of Ki67 (MKI67), a factor that increases when prostatic hyperplasia is induced in an animal model of prostatic hyperplasia.
  • Ki67 Ki67
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of staining epithelial cells of tissues by H & E staining in an experiment that observed the effect of PEP1 on prostatic hyperplasia-associated tissue cells in an animal model of prostatic hyperplasia.
  • FIG. 12 is a photograph showing the results of staining epithelial cells of the tissue by Masson's trichrome staining in the experiment to observe the effect of PEP1 on prostatic hypertrophy-related tissue cells in an animal model of prostatic hyperplasia.
  • Figure 13 is a graph showing the observation of the weight change of the animal model in the experiment that observed the effect of PEP1 on the body weight in an enlarged prostate animal model.
  • FIG. 14 is a graph illustrating the change in the prostate weight of the animal model in the experiment of observing the effect of PEP1 on the prostate weight in the enlarged prostate animal model.
  • FIG. 15 is a graph illustrating the change in the weight of the seminal vesicles in the animal model in the experiment in which the effect of PEP1 on the seminal vesicle weight in the prostate hypertrophy animal model.
  • the present invention may be variously modified and may have various embodiments.
  • the present invention will be described in more detail. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, it should be understood to include all transformations, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
  • the detailed description of the related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
  • Telomere is a genetic material repeatedly present at the end of a chromosome and is known to prevent damage to the chromosome or binding to another chromosome. Each time a cell divides, the telomeres become slightly shorter. After a certain number of cell divisions, the telomeres become very short, and the cells stop dividing and die. On the other hand, elongation of telomeres is known to prolong cell life. For example, cancer cells secrete an enzyme called telomerase, which prevents telomeres from shortening, so that cancer cells can continue to proliferate without dying. The present inventors have confirmed that the peptide derived from telomerase is effective in the treatment and prevention of prostatic hyperplasia and have completed the present invention.
  • a peptide of SEQ ID NO: 1, a peptide that is a fragment of SEQ ID NO: 1, or a peptide having a sequence homology of at least 80% with the peptide sequence is selected from telomerase, specifically human ( Homo sapiens ) telomerase. Peptides derived.
  • Peptides disclosed herein can include peptides having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% homology.
  • the peptides disclosed herein, peptides or fragments thereof comprising SEQ ID NO: 1 and one or more amino acids, two or more amino acids, three or more amino acids, four or more amino acids, five or more amino acids, six or more amino acids Or peptides with seven or more amino acids changed.
  • amino acid changes belong to a property that allows the physicochemical properties of the peptide to be altered.
  • amino acid changes can be made, such as improving the thermal stability of the peptide, altering substrate specificity, changing the optimal pH, and the like.
  • amino acid includes not only the 22 standard amino acids that are naturally incorporated into the peptide, but also D-isomers and modified amino acids. Accordingly, in one aspect of the invention the peptide may be a peptide comprising D-amino acids. Meanwhile, in another aspect of the present invention, the peptide may include a non-standard amino acid or the like which has been post-translational modified.
  • post-translational modifications include phosphorylation, glycosylation, acylation (including, for example, acetylation, myristoylation and palmitoylation), alkylation ), Carboxylation, hydroxylation, glycation, biotinylation, ubiquitinylation, changes in chemical properties (e.g., beta-elimination deimidization) , Deamidation) and structural changes (eg, formation of disulfide bridges). It also includes changes in amino acids, such as changes in amino groups, carboxy groups or side chains, caused by chemical reactions that occur during the linkage with crosslinkers to form peptide conjugates.
  • Peptides disclosed herein can be wild-type peptides identified and isolated from a natural source.
  • the peptides disclosed herein may be artificial variants, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or inserted compared to peptides that are fragments of SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid changes in the wild type polypeptide as well as in artificial variants include conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding and / or activity of the protein.
  • conservative substitutions include basic amino acids (arginine, lysine and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine, valine and methionine), aromatic amino acids (phenylalanine, Tryptophan and tyrosine), and small amino acids (glycine, alanine, serine and threonine). Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art.
  • the most common exchanges are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, and Asp / Gly, and vice versa.
  • Other examples of conservative substitutions are shown in the following table.
  • Substantial modifications in the biological properties of the peptide include (a) their effect on maintaining the structure of the polypeptide backbone, eg, a sheet or helical conformation, within the substitution region, (b) the charge of the molecule at the target site. Or their effect in maintaining hydrophobicity, or (c) their effect in maintaining the bulk of the side chains, is carried out by selecting significantly different substitutions. Natural residues are divided into the following groups based on common side chain properties:
  • hydrophobic norleucine, met, ala, val, leu, ile
  • Non-conservative substitutions will be made by exchanging a member of one of these classes for another class. Any cysteine residue that is not involved in maintaining the proper conformation of the peptide can generally be substituted with serine to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent abnormal crosslinking. Conversely, cysteine bond (s) can be added to the peptide to improve its stability.
  • Another type of amino acid variant of the peptide is a change in the glycosylation pattern of the antibody.
  • change is meant the deletion of one or more carbohydrate residues found in the peptide and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the peptide.
  • N-linked refers to a carbohydrate moiety attached to the side chain of an asparagine moiety.
  • Tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for enzymatic attachment of carbohydrate moieties to asparagine side chains.
  • O-linked glycosylation means attaching one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose or xylose to hydroxyamino acids, most commonly serine or threonine, but 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine You can also use
  • glycosylation sites to the peptide is conveniently performed by changing the amino acid sequence to contain one or more of the above mentioned tripeptide sequences (for N-linked glycosylation sites). Such changes may also be made by adding or replacing one or more serine or threonine residues with the sequence of the original antibody (for O-linked glycosylation sites).
  • a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide which is a fragment of SEQ ID NO: 1, or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence according to an aspect of the present invention has low intracellular toxicity and stability in vivo. This has the advantage of being high.
  • SEQ ID NO: 1 in the present invention is a telomerase-derived peptide consisting of 16 amino acids as follows.
  • a prostate hypertrophy treatment and prevention composition comprising a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence, or a fragment thereof as a active ingredient
  • a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence, or a fragment thereof as a active ingredient
  • composition according to one aspect of the present invention can be applied to all animals including humans, dogs, chickens, pigs, cattle, sheep, guinea pigs or monkeys.
  • the composition is a prostatic hyperplasia treatment comprising a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof peptide as an active ingredient And it provides a preventive pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be administered orally, rectal, transdermal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intramedullary, intradural or subcutaneous.
  • Formulations for oral administration may be, but are not limited to, tablets, pills, soft or hard capsules, granules, powders, solutions or emulsions.
  • Formulations for parenteral administration may be, but are not limited to, injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches or sprays.
  • compositions according to one aspect of the invention may include additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as needed.
  • additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as needed.
  • Pharmaceutical compositions according to one aspect of the invention may be prepared by conventional methods in the art.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, pathology and severity of the subject to be administered, the route of administration or the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of one skilled in the art and its daily dosage is, for example, 0.01 ⁇ g / kg / day to 10 g / kg / day, specifically 0.1 ⁇ g / kg / day to 1 g / kg Per day, more specifically 1 ⁇ g / kg / day to 0.1 g / kg / day, even more specifically 1 ⁇ g / kg / day to 10 mg / kg / day, preferably 1 ⁇ g / kg / day to It may be 1 mg / kg / day, preferably 0.005 mg / kg to 0.05 mg / kg, most preferably 0.01 mg / kg / day, if the difference in effect depending on the dose can be adjusted appropriately. In adults, administration of 0.1 mg to 1 mg, preferably
  • the pharmaceutical composition according to an aspect of the present invention may be administered once to three times a day, but is not limited thereto.
  • the concentration of peptides in the compositions disclosed herein can be routinely determined as known in the art.
  • the composition according to one aspect of the present invention comprises a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 0.01 g / L to 1 kg / L peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof, Specifically, it may include 0.1g / L to 100 / L, more specifically, 1g / L to 10g / L, but if it shows a difference in effect depending on the dose, it may be appropriately adjusted.
  • the above range is not only suitable for showing the intended effect of the present invention, it can satisfy both the stability and safety of the composition, it may be appropriate to include in the above range in terms of cost-effectiveness.
  • the composition comprises a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a prostate hypertrophy treatment comprising a peptide which is at least 80% sequence homology with the amino acid sequence or a peptide which is a fragment thereof.
  • a prophylactic food composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a prostate hypertrophy treatment comprising a peptide which is at least 80% sequence homology with the amino acid sequence or a peptide which is a fragment thereof.
  • the formulation of the food composition according to one aspect of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, formulated into tablets, granules, powders, solutions, solid preparations, and the like.
  • Each formulation may be appropriately selected and formulated by those skilled in the art according to the formulation or purpose of use, in addition to the active ingredient, and may be synergistic when applied simultaneously with other raw materials.
  • Preferred embodiments of the invention include the most optimal mode known to the inventors for carrying out the invention. Variations of the preferred embodiments may become apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The inventors expect those skilled in the art to make appropriate use of such variations, and the inventors expect the invention to be practiced in a manner different from that described herein. Accordingly, the invention includes all modifications and equivalents of the subject matter referred to in the appended claims, as permitted by patent law. Moreover, any combination of the abovementioned elements within all possible variations is included in the invention unless expressly stated to the contrary or apparently contradictory in context. While the invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments, those skilled in the art will understand that various changes in form and detail may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the following claims .
  • PEP1 The peptide of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as "PEP1") was prepared according to the solid phase peptide synthesis known in the art. Specifically, peptides were synthesized by coupling amino acids one by one from the C-terminus through Fmoc solid phase synthesis (SPPS) using ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon, Korea). As follows, the first amino acid at the C-terminus of the peptides was attached to the resin. For example:
  • Coupling reagent is HBTU [2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] / NMM [4-Methylmorpholine] It was. Fmoc removal was performed using piperidine in DMF in 20% of DMF.
  • Each peptide was synthesized by repeating a process of reacting the amino acids with each other, washing with a solvent, and then deprotecting the amino acid using the state in which the amino acid protecting group was bound to the solid support.
  • the synthesized peptide was separated from the resin and then purified by HPLC, and confirmed by MS and lyophilized.
  • DHT 5- ⁇ -dihydrotestosterone
  • sulfide administered at a dose of 40 mg / kg in rats for 30 days inhibits type 2 dopamine receptors, increases prolactin levels in the body, induces hyperprolactinemia, activates 5 ⁇ -reductase, and reacts with testosterone to generate synergy ( Synergistic) effect.
  • DHT produced by hyperprolactinemia is known to cause more weight gain in the lateral limbs of the dorsal, ventral and lateral limbs of the prostate.
  • PEP1 alone or in combination with the test substance prepared from Example 1 for the prostatic hypertrophy-inducing animal was carried out as follows. Mature Sprague-Dawley male rats (6 weeks old) were distributed at the Cheil Experimental Animal Center and allowed to breed for 1 week (approximately 7 weeks old, 49 days old). Sulpiride (40 mg / kg) was administered orally once daily for 30 days to induce prostatic hyperplasia. All experiments were performed according to previous studies (Van Coppenolle et al., 2001). Test substance administration began at 10 am daily for all animals. After administration of the test substance, the general condition and specific symptoms of the animals were observed every day. In addition, the weight of all animals was measured and recorded before administration of the test substance.
  • test substance sulfide was purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) and used for the test. To induce prostatic hypertrophy due to hyperprolactinemia, the researchers administered 40 mg / kg of sulfide intraperitoneally once daily for 60 days. Sulphide was prepared prior to daily test substance administration by first dissolving in 0.1N HCl solution and neutralizing it to pH 7.0 using 0.1 N sodium hydroxide (NaOH) solution. In the co-administration group, the sulfide was intraperitoneally administered, followed by administration of PEP1 and finasteride prepared according to Example 1, respectively. PEP1 (0.01, 0.1, 1 and 10 mg / kg) was prepared at daily use and injected subcutaneously.
  • Finasteride was prepared daily using 15% Ethanol / Corn oil (v / v) as a vehicle. The dose of test substance was calculated by measuring body weight daily at 0.5 ml / kg. As shown in Table 2 below, seven groups were administered to evaluate the efficacy of PEP1 on prostatic hyperplasia.
  • Prepuce separation (PPS) milk for all animals. After examination of radish, gland penis (Gp), seminal vesicles and coagulating glands (SV), ventral prostate (VP), copper's glands (CpG), and levator ani plus bulbocavernosus muscle (LABC) Byproducts of the back were separated in sequence. Each detailed separation process was carried out in accordance with the OECD protocol.
  • Separation of the glans Gp is taken along the line of separation of the foreskin by holding the glans with tweezers as shown in FIG.
  • the bladder is separated from the abdominal muscle layer, and the bladder is exposed to the SV while exposing the left and right lobes of the lungs covered by the fat layer, and the fat is separated from the left and right lobes of the lungs with fine tweezers.
  • SV seminal vesicle
  • a paper towel is placed under the seminal vesicle (SV) to distinguish muscles, fat layers and glands as shown in FIG. 1. It is clamped to the base of the seminal vesicle (SV), which is connected to the urethra, to prevent leakage of fluid during resection of the seminal vesicle. After removing the fat, clean up the relevant appendages, remove the clamps, put the seminal vesicles on the plate and weigh them.
  • Table 3 shows the effect of peptide PEP1 on the testicular weight, prostate weight, prostate index of the experimental group.
  • the prostate indices shown in Table 3 are calculated by the formula of Body weight / Final Prostate weight.
  • Table 3 The results of Table 3 are graphed, that is, after the administration of sulfide, PEP1 and finasteride (5 mg / kg) were administered to the animals with prostatic hyperplasia, respectively. ), The weight of the seminal vesicles was significantly reduced compared to the control group (see FIG. 3). In addition, as a result of co-administration of sulfide and PEP1, it was confirmed that the weight of the prostate was significantly reduced in experimental animals in which prostatic hypertrophy was induced by sulfide similarly to seminal vesicles (see FIG. 4). p-values are less than 0.05.
  • Testosterone when injected into the body, becomes a form of DHT due to 5 ⁇ -reductase, which promotes prostate cell proliferation, which causes prostatic hyperplasia (BPH).
  • BPH prostatic hyperplasia
  • the PEP1 administration experiment prepared from Example 1 for the cell proliferation inhibitory effect of the prostate cell line was performed as follows.
  • Cell lines were obtained from the prostatic parenchymal cell line (WPMY-1) and epithelial cell line (RWPE-1) obtained from an enlarged prostate animal model.
  • WPMY-1 prostatic parenchymal cell line
  • RWPE-1 epithelial cell line
  • DHT produced by 5 ⁇ -reductase binds to androgen receptors to promote prostate cell proliferation, thereby leading to prostatic hyperplasia (BPH).
  • BPH prostatic hyperplasia
  • the parenchymal cell line (WPMY-1) and epithelial cell line (RWPE-1) of the prostate are divided into the target groups to be tested by the anti-androgen receptor and its isotype control, and then with each antibody PEP1-FITC (fluorescein isothiocyanate) conjugate was added to the experimental group incubated for 1 hour, and a competitive test was conducted. The result was measured as a fluorescence value. Fluorescence values were measured using flow-cytometry.
  • the anti-androgen receptor isotype control antibody was first reacted (competition with the antibody) against the parenchymal cell line (WPMY-1) and the epithelial cell line (RWPE-1), respectively, (right peak), the anti-androgen receptor antibody was reacted first.
  • the fluorescence values were determined by dividing (in the case of competition with the antibody) (peak at the center) and when neither antibody was added nor FITC was bound (leftmost peak) (see FIGS. 7 and 8).
  • PEP1 binds to the anti-androgen receptor when the anti-androgen receptor isotype control antibody competes, the fluorescence expression rate of the PEP1-FITC conjugate is increased (the peak of the histogram graph is pushed to the right).
  • Competing with anti-androgen receptor antibodies resulted in a decrease in the binding rate of PEP1 to anti-androgen receptors, resulting in a decrease in fluorescence expression (peaks on the histogram graph are pushed to the left). Therefore, in view of the action of PEP1 which prevents DHT from inducing prostatic hyperplasia by binding to anti-androgen receptor, it is believed that PEP1 is effective in prostatic hyperplasia by directly binding to androgen receptor.
  • Injectable testosterone enanthate TE, purchased from EVER Pharma Hena GmbH, Germany
  • estradiol valerate available from estradiol valerate, EVER, from Pharma Hena GmbH, Germany
  • 50 mg and 0.5 mg 50 mg and 0.5 mg, respectively, in 70 ⁇ l volumes
  • the mixture was mixed into a micro-osmotic pump (Alzet pump, purchased from DURECT Corporation, USA), anesthetized the mouse, and transplanted into the back.
  • the pump is designed to slowly release hormones to the mouse for 28 days (2 weeks) at 0.11 ⁇ l per hour using osmosis.
  • Testosterone and finasteride were used as test materials. Prepared animal models were subcutaneously subcutaneously daily for 250 ⁇ g for PEP1 prepared from Example 1 and 2500 ⁇ g for finasteride (purchased in DMSO or cyclodextrin, Sigma Aldrich, USA) per head per subject (25 g rat model). 2 weeks after the injection of the test substance (4 weeks after the pump implantation into the animal model), blood was collected from the orbital vein, centrifuged at 14000 rpm, 4 ° C. for 30 minutes, and serum was separated. Frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C or fixed to fixed solution. Dividing the experimental group for the experimental results is shown in Table 5 below.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • Ki67 MKI67, essential protein for cell proliferation
  • Prostatic hyperplasia is known to be caused by abnormal proliferation of stromal cells and epithelial cells that make up the prostate gland. Based on this fact, a histological analysis of an enlarged prostate animal model was performed to investigate the effect of PEP1 on prostate tissue in prostatic hypertrophy. H & E staining was used to see general tissue changes, and Masson's trichrome staining was performed to confirm the inflammatory response. As a result, the thickening of the epithelial cells was observed throughout the prostate tissue in the group that caused the enlargement of the prostate compared to the control group, but in the group treated with PEP1, the epithelial cell array was found in most cases.
  • PEP1 is believed to have the effect of healing changes in tissues associated with prostatic hypertrophy, resembling normal tissues without prostatic hyperplasia.
  • Prostatic hyperplasia can also be seen as an increase in the weight of the prostate and seminal vesicles. Based on this fact, we examined the weight, prostate weight, and seminal vesicle weight in the prostatic hypertrophy-induced animal model to investigate the effect of PEP1 on the weight of the prostate and seminal vesicles, which are the organs in which symptoms of prostatic hyperplasia are directly observed. The measurement results are shown graphically by group in Table 5 (see FIGS. 13, 14 and 15). Although there was no change in body weight, the prostate weight, which was significantly increased in the hormone-administered group, was significantly decreased in the PEP1-treated group, which was similar to that of the group treated with finasteride.
  • PEP1 As the degree of decrease was observed, the decrease in the group receiving PEP1 was more significant. In the case of seminal vesicles, the weight-reduced tendency was decreased in the PEP1-treated group compared to the hormone-treated group. Therefore, PEP1 is believed to be effective in the substantial weight loss of organs in which symptoms of prostatic hyperplasia are directly present.
  • PEP1 was observed in vitro and in vivo in experiments with a prostatic hypertrophy-induced animal model, resulting in a therapeutic effect on prostatic hypertrophy-related triggers, hormone receptors and direct genital organs (organs). It showed a positive effect. Therefore, the treatment, improvement and prevention of enlarged prostate using PEP1 is considered to be effective, and furthermore, the possibility of developing as an effective treatment and treatment method for enlarged prostate is considered to be high.

Abstract

본 발명은 전립선 비대증 치료 및 예방을 위한 조성물 및 이를 사용한 전립선 비대증 치료방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하는 조성물로서 전립선 비대증 치료 및 예방에 효과적인 조성물 및 이를 사용한 전립선 비대증 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 조성물은 전립선 비대증의 치료 및 예방에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물
본 발명은 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하는 조성물로서 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
전립선 비대증은 남성 노인성 질환 중 가장 흔한 질병으로 하부요로증상을 수반한다. 관련된 증상은 40세부터 나타나기 시작하나 대부분 50세 후반부터 임상적인 증상을 일으킨다. 전립선 비대증은 삶의 질적 저하에 따른 성기능장애를 유발할 수 있으며 그에 따른 치료 및 수술요법에 의해 성기능에 영향을 미친다.
전립선 비대증의 원인에 의한 과다증식(hyperplasia)는 남성호르몬에 의존한다. 특히 남성호르몬은 전립선에 대하여 정상적인 세포증식에 필요할 뿐만 아니라 세포의 자연사멸(apoptosis)를 억제하기도 한다. 가장 널리 알려진 전립선 비대증의 내인성 원인으로는 나이와 상관성이 있는 것으로 알려지고 있다. 전립선은 나이가 증가할수록 커지며, 정상적인 고환의 기능이 수반되어야 한다. 전립선은 남성호르몬 의존적인 기관으로 테스토스테론(testosterone)은 전립선의 성장, 분화, 기능에 중요한 역할을 하며, 5-alpha-reductase에 의해 대사되어 생성된 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)은 전립선의 성장과 유전자의 발현을 조절하는데 중요한 역할을 한다.
전립선 성장에 관여하는 외인적 요인으로는 남성호르몬, 에스트로겐(estrogen), 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 등이 있으며, 식생활 양식 및 주위 환경 등에서 기원하는 내분비 효소들과 연관된 물질들이 있다. 이들 외인적 요소의 생리학적 효과는 다양한 종류의 펩티드성 성장 조절 인자들을 경유하여 나타난다.
전립선 비대증은 20대 초반에서 40대 후반까지 조직학적 변화로 발생하는데 이때 남성호르몬과 에스트로겐이 같이 상승작용을 하여 전립선 비대증을 유발한다. 연령이 증가할수록 에스트로겐/DHT 비율이 증가하며 이에 따라 전립선 비대가 증가된다고 한다.
또한 통상적으로 전립선은 20대 초반까지 성장한 후 50대까지 그 크기를 유지하는데, 이와 같은 균형을 유지하기 위해서는 내인성 성장조절 인자와 전달경로, 세포주기 조절 및 세포분열과 세포사멸 등 매우 복잡한 상호작용에 의존한다. 이와 같은 세포주기 조절 인자에 변형이 생길 경우 전립선 비대증이 유발될 수 있다.
전립선 비대증에는 여러 가지 인자 중 유전적 요인도 매우 크게 작용할 수 있는데, 가족력이 있는 환자군에서는 전립선 비대증이 나타날 확률은 약 60%이상 증가된다고 보고되어 있으며, 가족력이 있는 환자군에서 5α-reductase억제제에 의한 치료 효과가 낮은 것으로 보고되어 있다. 이것은 안드로겐 비의존성 경로에 의한 것으로 추정된다.
전립선비대증 치료방법으로는 수술적인 치료법 이외에 내과적 치료법이 실시되고 있는데, 내과적 치료법으로는 환자의 나이, 임상적 경과 등의 요인에 따라 약물 치료가 이루어지고 있다.
최근 우리나라를 비롯한 전세계적으로 전립선 비대증 환자의 증가 추세가 현저하고 젊은 환자의 발병률도 증가하고 있어 다양한 종류의 약물이 치료법으로 시도되고 있으나 부작용문제로 인하여 사용에 제한이 있었다.
설피리드(Sulpiride)는 2형 도파민 수용체 안타고니스트(type 2 dopamine recpector antagonist)로서 주로 우울증 치료제로 이용된다. 도파민은 아드레날린(adrenalin)과 노라드레날린(noradrenalin)의 합성시 생기는 중간 산물로서 억제성 신경전달물질이다. 설피리드는 도파민의 수용체 결합을 저해하여 도파민 효과(dopaminergic effect)인 프로락틴(prolactin)의 분비를 억제하는 기능도 함께 저해되면서 혈액 내 프로락틴의 농도가 올라가게 된다. 지속적인 설피리드투여로 인한 프로락틴의 증가는 고프로락틴혈증 (Hyperprolactinemia)를 유도하게 된다.
프로락틴은 전립선의 증식과 관련되며, 전립선암 및 BPH의 발달 및 조절에 관련된다는 것이 보고되고 있다. 또한 프로락틴은 안드로겐(androgen)과 병용하여 전립선의 증식에 상승효과를 나타낸다고 알려져 있다. 또다른 기전으로는 프로락틴이 스트레스 호르몬으로 작용하여 5α-reductase 효소의 발현을 증가시켜 전립선의 증식을 유도한다고 알려져있다. 프로락틴은 비스테로이드성 인자(nonsteroidal factors)의 일종으로 전립선의 증대에 관여하며 전립선 비대증 유발에도 관여한다. 프로락틴 함량은 나이가 듬에 따라 증가하며, 반면에 테스토스테론 레벨은 감소한다. 이것은 나이가 듬에 따라 사람에게서 프로락틴이 전립선 비대를 유도하는 기전에 매우 중요한 것으로 보고되고 있다. 랫(rat) 및 인간에서 프로락틴이 전립선의 증식 및 분화에 관여한다는 것이 알려져 있다. 이에 따르면 프로락틴이 수용체를 통해 신호 전달 경로(signal transduction pathways)를 경유하여 유발된다고 여겨진다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
KR 2011-0062943 A
KR 2011-0057049 A
EP 1020190 A3
[비특허문헌]
MCCONNELL, John D., et al. 'The effect of finasteride on the risk of acute urinary retention and the need for surgical treatment among men with benign prostatic hyperplasia', New England Journal of Medicine, 1998, Vol.338, No.9, pp.557-563.
이에 본 발명자들은 부작용을 최소화하면서도 효과가 우수한 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물 치료 및 예방용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드가 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물 치료 및 예방에 탁월한 효과를 가질 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물 치료 및 예방에 효과를 가지는 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에 따르면 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(이하, "PEP1", "GV1001", 또는 "GV"), 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물에 있어서, 상기 펩티드를 0.01mg 내지 1mg, 바람직하게는 0.56mg 용량(4nmol peptide/kg body weight에 해당) 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 언급된 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증을 치료 및 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 전립선 비대증을 치료 및 예방하는 방법에 있어서, 상기 조성물 투여는 주 3회 투여하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1(PEP1)의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드를 포함하는 조성물은 부작용이 적으면서도 전립선 비대증의 치료 및 예방에 우수한 효과를 가진다.
도 1은 실험군의 조직 무게 관찰을 위해 측정 대상 기관을 분리하는 과정에 대한 사진이다.
도 2는 PEP1의 전립선 비대증 치료에 미치는 영향을 검증하기 위한 실험에서 각 실험군의 복측 전립선(ventral prostate)에서 5α-reductase의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 이용하여 측정한 실험 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 3은 PEP1의 전립선 비대증 치료에 미치는 영향을 검증하기 위한 실험에서 각 군에서의 정낭(seminal vesicle) 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 PEP1의 전립선 비대증 치료에 미치는 영향을 검증하기 위한 실험에서 각 군에서의 전립선(prostate) 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 PEP1을 처리한 전립선 비대증 동물모델의 실질세포주 (WPMY-1)에서 세포 증식의 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 PEP1을 처리한 전립선 비대증 동물모델의 상피세포주 (RWPE-1)에서 세포 증식의 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 PEP1-FITC(형광 결합체(conjugate))를 사용하여 전립선 비대증 동물모델의 실질세포주 (WPMY-1)에서 안드로겐 수용체에 대한 PEP1의 결합능력을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 PEP1-FITC(형광체)결합체(conjugate)를 사용하여 전립선 비대증 동물모델의 상피세포주 (RWPE-1)에서 안드로겐 수용체에 대한 PEP1의 결합능력을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 전립선 비대증이 유발되었을 때 증가하는 인자인 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현에 주는 영향을 측정한 실험 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 10은 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 전립선 비대증이 유발되었을 때 증가하는 인자인 Ki67(MKI67)의 발현에 주는 영향을 측정한 실험 결과를 나타낸 조직 면역염색(immunostain) 사진이다.
도 11은 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 전립선 비대증 관련 조직 세포에 주는 영향을 관찰한 실험에서 조직의 상피 세포를 H&E 염색법으로 염색하여 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 전립선 비대증 관련 조직 세포에 주는 영향을 관찰한 실험에서 조직의 상피 세포를 Masson's trichrome 염색법으로 염색하여 결과를 나타낸 사진이다.
도 13은 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 체중에 주는 영향을 관찰한 실험에서 동물 모델의 체중 변화를 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 전립선 무게에 주는 영향을 관찰한 실험에서 동물 모델의 전립선 무게의 변화를 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 PEP1이 전립선 비대증 동물모델에서 정낭 무게에 주는 영향을 관찰한 실험에서 동물 모델의 정낭 무게의 변화를 관찰하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드가 전립선비대증의 치료 및 예방에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.
표 1
Figure PCTKR2014010035-appb-T000001
펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다. 본 발명에서의 서열번호 1은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
서열번호 1: EARPALLTSRLRFIPK
본 발명의 일측면에서는 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 를 유효 성분으로 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.01 ㎍/kg/일 내지 10 g/kg/일, 구체적으로는 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 더 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 0.1 g/kg/일, 보다 더 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 바람직하게는 1 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 바람직하게는 0.005mg/kg 내지 0.05mg/kg, 가장 바람직하게는 0.01 mg/kg/일이 될 수 있으며, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 성인의 경우, 1회 투여 시 0.1mg 내지 1mg, 바람직하게는 0.4 mg 내지 0.6 mg의 투여, 특히 0.56mg의 투여가 바람직하다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 개시된 조성물에 있어서 펩티드의 농도는 당업계에 공지된 바에 따라 통상적으로 결정될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01g/L 내지 1kg/L, 구체적으로 0.1g/L 내지 100/L, 더 구체적으로 1g/L 내지 10g/L의 함량으로 포함할 수 있으나 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드의 합성
서열번호 1의 펩티드(이하 "PEP1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토 그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.
펩티드 PEP1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.
4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.
5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제조하였다.
실시예 2: 전립선 비대증 유발 동물 실험을 통한 PEP1의 전립선 비대증에 대 한 효능 확인
1) 전립선 비대증 유발 실험 동물의 준비
안드로겐으로서 주로 체내에 작용하는 호르몬은 테스토스테론이다. 그러나 전립선의 발달에 관여하는 안드로겐중 가장 영향력있는 호르몬은 5-α-dihydrotestosterone (DHT)로서 테스토스테론과 5-α-reductase 효소가 결합하면서 생성된다. 렛(rat)에서 설피리드를 30일간 40mg/kg의 용량으로 투여하면 2형 도파민 수용체를 저해하여 체내의 프로락틴 농도를 높혀 고프로락틴혈증을 유도하여 5α-reductase를 활성화 시키며 테스토스테론과의 반응하여 시너지(상승) 효과를 나타낸다. 고프로락틴혈증에 의해서 생성된 DHT는 전립선의 등측(dorsal), 복측(ventral), 측면(lateral) 사지(lobe)중 측면 사지에 상대적으로 더 많은 무게증가를 일으킨다고 알려져 있다. 이 사실에 기초하여 다음과 같이 전립선 비대증 유발 동물에 대한 실시예 1로부터 준비된 PEP1 단독 또는 시험물질과의 병용투여 실험이 진행 되었다. 성숙한 Sprague-Dawley male rats (6주령)를 제일실험동물센터에서 분양 받아 1주간 순화 사육한 후(약 7주령, 49일령) 시험에 사용하였다. 전립선 비대증을 유도하기 위해 설피리드(sulpiride) (40mg/kg)를 매일 1회 30일간 경구 투여하였다. 모든 실험은 선행 연구결과에 따라 수행하였으며 (Van Coppenolle 등, 2001). 시험물질 투여는 모든 동물에 대하여 매일 오전 10시에 투여를 시작하였다. 시험물질 투여 후 매일 동물의 일반상태 및 특이증상 등을 관찰하였다. 또한 시험물질 투여 전 모든 동물의 체중을 측정한 후 기록하였다.
2) 시험물질 및 투여용량
시험물질인 설피리드는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 시험에 이용하였다. 본 연구진은 고프로락틴혈증에 의한 전립선 비대를 유도하기 위해 설피리드 40 mg/kg를 1일 1회 60일간 연속하여 복강투여 하였다. 설피리드는 0.1N 농도 염산(HCl)용액에 먼저 용해시킨 후 0.1 N 농도 수산화 나트륨(NaOH)용액을 사용하여 pH 7.0 으로 중화시키는 방법으로 매일 시험물질 투여 전에 제조 하였다. 병용투여군 에서는 설피리드를 복강 투여한 후 실시예 1에 따라 제조된 PEP1 및 피나스테리드(finasteride)를 각각 투여하였다. PEP1 (0.01, 0.1, 1 및 10 mg/kg)은 매일 사용시 제조하여 피하주사 하였다. 피나스테리드는 15% 에탄올/옥수수기름(Ethanol/Corn oil) (v/v)을 전달체(vehicle)로 하여 매일 제조하였다. 시험물질의 투여 용량은 0.5 ml/kg로 매일 체중을 측정하여 산출하였다. 하기의 표 2에 나타낸 바와 같이 7개의 군에 PEP1의 전립선 비대증에 대한 효능을 알아보기 위해 투여하였다.
표 2
Figure PCTKR2014010035-appb-T000002
1) 전립선 비대증 유발 실험 동물에 대한 PEP1 및 시험물질 투여 실험 후 동물의 조직 채취, 보관 및 무게 측정
시험물질을 60일간 투여한 후 24시간에 모든 동물은 에테르(ether)로 마취한 후 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청(serum)을 분리하였다. 분리한 혈청은 호르몬(hormone) 분석을 위하여 -80℃에서 보관하였다.
모든 동물에 대하여 귀두포피분리(prepuce separation, PPS) 유. 무를 검사한 후, 귀두(gland penis, Gp), 정낭(seminal vesicles and coagulating glands, SV), 복측 전립선(ventral prostate, VP), 코퍼샘(cowper's glands, CpG) 및 LABC(levator ani plus bulbocavernosus muscle)등의 부생식선을 순서대로 분리하였다. 각각의 세부 분리 과정은 OECD protocol에 따라 실시하였다.
귀두(Gp)의 분리는 도 1 에서 나타낸 바와 같이 핀셋으로 귀두부위를 잡고 포피의 분리선을 따라 자른다. 또한 폐의 경우는 도 1 에서 나타낸 바와 같이 복부 근육층으로부터 방광을 분리한 후 지방층에 의해 감싸진 폐의 좌우엽을 노출시키면서 방광을 SV를 향해 드러낸 후 미세한 핀셋으로 폐의 좌우엽으로부터 지방을 분리하고 양손에 미세한 핀셋으로 폐의 왼쪽 lobe를 요도로부터 부드럽게 잡아당겨 가위로 제거한 후 겸자(forcep)로 폐의 우엽을 잡고 요두부로부터 폐의 좌엽을 노출시켜 잘라낸다. 응고선을 포함한 SV의 경우는 도 1에서 나타낸 바와 같이 근육, 지방층 및 낭들(glands)을 구분하기 위해 정낭(SV) 아래에 종이 타월을 올려놓는다. 요도와 연결된 수정관이 위치한 정낭(SV)의 기저(base)에 클램프(clamp)로 고정하여 정낭을 절제하는 동안 액이 누출되는 것을 방지한다. 그 후 지방을 제거한 후 관련 부속기관을 정리하고 클램프를 제거한 후 정낭을 접시에 올려놓고 무게를 측정한다.
2) PEP1의 투여가 전립선 비대증 유발 실험 동물의 5α-reductase mRNA 발현에 미치는 영향
설피리드및 시험물질을 각각 병용하여 60일간 투여한 후 복측 전립선을 적출하여 5α-reductase의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다. 상세하게는 복측 전립선(ventral prostate, 25mg) 으로부터 전체 RNA(total RNA)를 분리하여 DEPC-treated water를 가하여 재현탁(resuspend) 시켰다. 그 후 광학스펙트로미터(spectrophotometer)를 이용하여 RNA를 정량 하였다. 첫 번째 가닥(strand) cDNA를 Torres 및 Ortega (2004)등의 방법에 의해 합성하였다. PCR 프로파일은 변성(denaturing) 94℃ (30sec), 어닐링(annealing) 55℃ (30sec), 연성(extension) 72℃ (30sec), 사이클 횟수 30~35회로 하였다. 이 때, 정량을 위한 전기 영동시 대조군으로 발현량이 약물들에 의해 잘 변하지 않는 GAPDH를 사용하였다. 그 결과 설피리드 투여에 의해 증가된 5α-reductase의 발현이 PEP1 투여군에서 용량-의존적으로 억제효과가 나타났으며, 고용량(GV 10, PEP1을 10mg투여한 군)군에서는 피나스테리드 보다 억제효과가 높게 나타났다(도 2 참조). 따라서 PEP1은 용량 의존적으로 전립선 비대증에 대하여 5α-reductase 억제(inhibition)에 의한 치료 또는 개선효과를 나타낼 것으로 여겨진다.
3) PEP1의 투여가 전립선 비대증 유발 실험 동물의 장기에 미치는 영향
하기의 표 3에는 펩티드 PEP1이 실험군의 정낭 무게, 전립선무게, 전립선 지수(prostate index)에 미치는 영향을 나타내었다. 표 3에 나타낸 전립선 지수는 체중(Body weight)/최종 전립선 무게(Final Prostate weight) 의 계산식에 의해 계산된 것이다.
표 3
Figure PCTKR2014010035-appb-T000003
표 3의 결과를 그래프로 나타낸, 즉 설피리드를 투여한 후 전립선 비대증이 유발된 동물에 PEP1 및 피나스테리드 (5 mg/kg)를 각각 투여하여 정낭의 무게를 관찰한 결과 PEP1을 고농도 (10mg/kg)로 투여한 경우 정낭의 무게가 대조군에 비해 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 또한, 설피리드와 PEP1을 병용 투여한 결과에서도 정낭과 유사하게 설피리드에 의해 전립선 비대증이 유발된 실험 동물에서 전립선 무게가 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 4참조). p값은 0.05이하면 유의함을 나타낸다.
따라서, 실시예 2의 결과를 통하여 설피리드에 의해 전립선 비대증이 유발된 동물에 대한 PEP1의 투여는 농도 의존적으로 5α-reductase의 발현 감소, 정낭 무게감소, 전립선 무게감소의 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이는 PEP1의 투여가 5α-reductase 발현 및 생식기 무게로 나타나는 전립선 비대증 질환 증상 치료 및 개선에 효과적인 것으로 여겨질 수 있다.
실시예 3: DHT에 의한 전립선 실질세포 및 상피세포의 증식 변화 확인을 통 한 PEP1의 전립선 비대증에 대한 효능 확인
1) 실험 세포 준비 및 실험 진행 방식
테스토스테론은 체내에 주입되면 5α-reductase로 인해 DHT의 형태가 되어 전립선 세포 증식을 촉진하고 이로 인해 전립선 비대증 (BPH)을 유발한다. 이 사실에 기초하여 다음과 같이 전립선 세포주의 세포 증식 억제효과에 대한 실시예 1로부터 준비된 PEP1 투여 실험이 진행 되었다. 세포주는 전립선 비대 동물모델에서 얻은 전립선의 실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1)를 사용하였다. 실험방법은 WPMY-1 (2.5X103 cells)와 RWPE-1 (1X104 cells)를 96 well에 시딩 (seeding) 하고, 표 4 와 같은 실험 군을 대상으로 증식 변화를 확인하였다. 증식 변화 확인은 배양액 흡입 (suction) 후, CCK-8 solution을 각 well에 10 μL씩 넣어준 후, 1-4 hr동안 450 nm로 광학 밀도 (optical density)를 측정하는 방식으로 진행하였다.
2) 측정 결과 및 효능 확인
DHT를 처리하지 않은 그룹들 (1-3 그룹) 사이에는 PEP1을 투여하지 않은 그룹 (1 그룹)과 투여한 (2 및 3 그룹) 그룹에서 눈에 띄는 차이가 실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1) 모두에게서 보이지 않음을 알 수 있었다. DHT를 처리한 그룹들 (4-6 그룹) 사이에는 PEP1을 투여하지 않은 그룹 (4 그룹)과 투여한 (5 및 6 그룹) 그룹에서 유의한 차이를 보였으며, PEP1을 처리한 그룹에서 확연한 증식 억제 효과가 있음을 보였다 (표 4 및 도 5, 6 참조). 따라서, DHT에 의한 전립선 비대증에 영향을 주는 전립선 세포 증식 억제에 PEP1이 효과가 있을 것으로 여겨진다.
[표 4]
세포주 그룹별 처리 내용
표 4
Figure PCTKR2014010035-appb-T000004
실시예 4: PEP1의 안드로겐 수용체 결합 능력 확인 및 전립선 비대증 억제기 전 확인
1) 실험 세포 준비 및 실험 진행 방식
5α-reductase로 인해 생성된 DHT는 Androgen receptor에 결합하여 전립선 세포 증식을 촉진하고 이로 인해 전립선 비대증 (BPH)을 유발한다. 이 사실에 기초하여 다음과 같이 전립선 세포주의 세포 증식 억제효과에 대한 실시예 1로부터 준비된 PEP1 투여 실험이 진행 되었다. 세포주는 전립선 비대 동물모델에서 얻은 전립선의 실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1)를 사용하였다. 전립선의 실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1)를 항안드로겐 수용체(anti-androgen receptor)와 그의 이소타입 대조군(isotype control)으로 실험할 대상군으로 각각 나눈 후 각각의 항체와 함께 1시간 동안 배양한 실험군에 PEP1-FITC(fluorescein isothiocyanate) 결합체를 넣어 경쟁 테스트(competitive test)를 진행하고 그 결과를 형광값으로 측정하였다. 형광값 측정은 유세포(flow-cytometry)분석법을 사용하였다.
2) 측정 결과 및 효능 확인
실질 세포주 (WPMY-1)와 상피 세포주 (RWPE-1) 각각에 대하여 항안드로겐 수용체 이소타입 대조군 항체를 먼저 반응 시킨(항체와 경쟁시킨) 경우(가장 오른쪽 피크), 항안드로겐 수용체 항체를 먼저 반응 시킨(항체와 경쟁시킨) 경우(중앙에 위치한 피크) 및 두 항체 모두 넣지 않고 FITC도 결합시키지 않은 경우(가장 왼쪽 피크)로 나누어 그 형광 값을 측정하였다(도 7 및 도 8 참조). 항안드로겐 수용체 이소타입 대조군 항체와 경쟁한 경우 PEP1가 항안드로겐 수용체와 결합(binding)하므로 PEP1-FITC 결합체의 형광 발현율이 증가된 결과가 나타났다(히스토그램 그래프의 피크가 오른쪽으로 밀림). 항안드로겐 수용체 항체와 경쟁한 경우 PEP1의 항안드로겐 수용체와의 결합력이 감소하여 형광 발현율이 감소한 결과가 나타났다(히스토그램 그래프의 피크가 왼쪽으로 밀림). 따라서, DHT가 항안드로겐 수용체와 결합하여 전립선 비대증을 유도하는 것을 막는 PEP1의 작용을 볼 때, PEP1이 안드로겐 수용체와 직접 결합 함으로써 전립선 비대증에 효과가 있을 것으로 여겨진다.
실시예 5: 전립선 비대증 유발 동물 모델을 통한 PEP1의 전립선 비대증에 대 한 생체 내 효과 확인
1) 실험 동물의 준비
본 실시예는 6-8주령 수컷 C57BL/6(n=10/group) 마우스를 이용하였으며, 마우스는 서울대학교 의과대학 실험 동물실 SPF(specific pathogen free)구역에서 사육하였다. 주사용 테스토스테론 인안테이트(testosterone enanthate, TE, EVER Pharma Hena GmbH, Germany에서 구입)와 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate, EVER, Pharma Hena GmbH, Germany에서 구입)를 각각 50mg, 0.5mg씩 70μl 볼륨에 맞춰 섞어 마이크로-삼투압 펌프(micro-osmotic pump, Alzet pump, DURECT Corporation, USA에서 구입)에 넣은 뒤 마우스를 마취하고 등에 이식(transplant)하였다. 펌프는 삼투현상을 이용하여 시간당 0.11μl씩 28일(2주)간 서서히 호르몬을 마우스로 방출하도록 고안되었다
2) 시험물질 및 투여용량
시험물질로는 테스토스테론 및 피나스테리드를 사용하였다. 준비된 동물 모델들에 개체(25g 쥐 모델 기준)당 머리쪽(head)에 실시예 1로부터 준비된 PEP1의 경우 250μg을, 피나스테리드의 경우 2500μg(in DMSO 또는 cyclodextrin, Sigma Aldrich, USA에서 구입)을 매일 피하투여(주사) 하였으며, 시험물질 주입으로부터 2주 후(동물 모델에 펌프 이식으로부터 4주 후) 혈액을 안와 정맥에서 채취하여 14000rpm, 4℃, 30분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였고, 전립선을 적출하여 액체 질소에 얼려 -70℃에 보관하거나 고정액에 고정하였다. 실험결과를 위한 실험군을 나누면 아래의 표 5과 같다.
표 5
Figure PCTKR2014010035-appb-T000005
3) 전립선 비대증 유발 인자들의 감소 측정
전립선 비대증 유발에 의해 전립선 조직에서는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen, replication에 필수 단백질) 및 Ki67(MKI67, 세포 증식에 필수 단백질)의 발현이 증가한다. 이 사실에 기초하여 PEP1이 전립선 비대증 유발 쥐 모델에서 PCNA 및 Ki67의 발현을 억제하는 효과를 측정하였다. PCNA는 전립선 조직에서 추출한 세포에서 얻은 단백질을 2D-겔(gel) 전기영동을 사용하여 발현을 측정하였고, Ki67은 면역염색검정법(immunostain)을 사용하여 조직에서 발현 정도를 측정하였다. 측정 결과 전립선 비대증이 유발된 동물의 전립선 조직에서 증가되었던 PCNA와 Ki67의 발현이 PEP1의 처리에 의해 억제됨을 확인하였다(도 9 및 도 10 참조). 따라서, PEP1은 전립선 비대증 유발 인자들의 발현을 억제하여 전립선 비대증 치료 및 개선에 효과가 있는 것으로 여겨진다.
4) 전립선 비대증 유발 관련 조직의 변화 측정
전립선 비대증은 전립선 샘을 구성하고 있는 실질세포(stromal cell)와 상피세포(epithelial cell)의 이상 증식에 의해 유발 되는 것으로 알려져 있다. 이 사실에 기초하여 PEP1이 전립선 비대증 대상의 전립선 조직에 변화를 가져오는 것을 알아보기 위하여 전립선 비대증 유발 동물 모델을 대상으로 한 조직학적 분석을 수행하였다. 일반적인 조직의 변화를 보기 위하여 H&E 염색법을 사용하고, 염증반응 정도를 확인하기 위하여 Masson's trichrome 염색을 수행하여 핵 모양을 더 뚜렷이 확인하였다. 분석 결과, 대조군(control)에 비해서 전립선 비대증을 유발한 군에서는 상피세포의 층이 두꺼워 지는 현상이 전립선 조직 전반에 걸쳐서 나타나는 것을 확인할 수 있었으나, PEP1을 투여한 군에서는 대부분의 경우 상피세포의 배열이 대조군과 유사하게 일렬로 고르게 배열되어 있으며 이들 세포들이 모여서 만드는 상피의 두께 또한 전립선 비대증 유발군에 비해 상대적으로 얇은 것을 확인할 수 있었다(도 11 및 도 12 참조). 따라서, PEP1은 전립선 비대증 유발 관련 조직의 변화를 전립선 비대증이 나타나지 않은 정상 조직과 유사하게 되돌려 치유하는 효과가 있는 것으로 여겨진다.
5) 전립선 비대증 관련 장기(organ)의 변화 측정
전립선 비대증은 전립선과 정낭(seminal vesicle)의 무게 증가로도 알 수 있다. 이 사실에 기초하여 PEP1이 전립선 비대증의 증상이 직접 나타나는 장기인 전립선과 정낭의 무게에 주는 영향을 알아보기 위하여 전립선 비대증 유발 동물 모델을 대상으로 체중, 전립선무게, 정낭무게를 측정하였다. 측정 결과를 표 5에서의 군별로 그래프로 나타내었다(도 13, 14 및 15 참조). 전체적인 체중의 변화는 나타나지 않았으나, 호르몬을 투여한 군에서 현저하게 증가되었던 전립선 무게가 PEP1을 투여한 군에서 유의하게 감소하였으며, 이는 기존의 전립선 비대증 치료제인 피나스테리드를 투여한 군과 비교하여 볼 때도 유사한 감소 정도를 보이므로 PEP1을 투여한 군의 감소가 유의 하다는 것을 더 확인할 수 있었다. 정낭의 경우에도 호르몬을 투여한 군에 비해서 PEP1을 투여한 군에서 무게가 감소하는 경향을 보였다. 따라서, PEP1은 전립선 비대증의 증상이 직접 나타나는 장기의 실질적인 무게감소에도 효과가 있는 것으로 여겨진다.
상기 실시예들에서 PEP1은 전립선 비대증 유발 동물 모델을 통한 실험들에서 체외(in vitro) 및 체내(in vivo)에서 관찰한 결과 전립선 비대증 관련 유발 인자, 호르몬 수용체 및 직접적인 생식기(장기)에 치료적으로 긍정적인 효과를 보이는 것으로 나타났다. 따라서 PEP1을 이용한 전립선 비대증 치료 및 개선, 예방은 효과적으로 여겨지며, 나아가 전립선 비대증의 효과적인 치료제 및 치료방법으로서의 개발 가능성이 높은 것으로 여겨진다.
Figure PCTKR2014010035-appb-I000001

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드를 0.01mg 내지 1mg 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드를 0.56mg 포함하는 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증을 치료 및 예방하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물을 1회 투여 시 0.005mg/kg 내지 0.05mg/kg을 투여하는 전립선 비대증을 치료 및 예방하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 조성물을 총 치료기간 12 주 동안 매 2 주 간격으로 한 차례씩 총 7 차례 즉, 0 주, 2 주, 4 주, 6 주, 8 주, 10, 12 주에 1회씩 투여하며, 1회 투여 시 0.56mg 용량(4nmol peptide/kg body weight에 해당)을 투여하는 전립선 비대증을 치료 및 예방하는 방법.
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